CN113416253B

CN113416253B - 分离的抗原itpripl1结合蛋白及其用途

Info

Publication number: CN113416253B
Application number: CN202110566040.2A
Authority: CN
Inventors: 许杰; 邓守言; 王运刚; 王一婷; 宋腾; 贺芳
Original assignee: Fudan University
Current assignee: Shanghai Baiquan Biotechnology Co ltd; Fudan University
Priority date: 2021-05-24
Filing date: 2021-05-24
Publication date: 2022-12-13
Anticipated expiration: 2041-05-24
Also published as: CN113416253A

Abstract

本申请公开了一种分离的抗原ITPRIPL1结合蛋白，其能够与抗原ITPRIPL1中如SEQ ID NO:25所示的氨基酸序列结合。所述分离的抗原ITPRIPL1结合蛋白包含氨基酸序列SEQ ID NO:5或14中任一项所示的VH中的HCDR1、HCDR2和HCDR3；且其包含氨基酸序列SEQ ID NO:6或15中任一项所示的VL中的LCDR1、LCDR2和LCDR3。

Description

分离的抗原ITPRIPL1结合蛋白及其用途

技术领域

本申请涉及生物医药领域，尤其涉及一种分离的抗原ITPRIPL1结合蛋白及其用途。

背景技术

ITPRIPL1编码蛋白为肌醇1,4,5-三磷酸受体相互作用蛋白样1(Inositol 1,4,5-trisphosphate receptor-interacting protein-like 1)，目前未见到关于ITPRIPL1功能的报道。根据UniProtKB数据库的注释，人类的ITPRIPL1包括555个氨基酸，分为胞外区(1-103氨基酸)、跨膜区(104-124氨基酸)、胞内区(125-555氨基酸)。

T细胞是适应性免疫反应的关键效应细胞，在消除病原体和自身免疫性疾病中具有许多重要作用。T细胞有几个亚群，每个亚群具有不同的功能。在T细胞表面上发现的TCR(T细胞受体)是由α和β多肽链组成的异二聚体(构成大约95％的TCR群体)，或者是γ和δ多肽链。每种多肽均包含恒定(C)和可变(V)区域。恒定区锚定在细胞膜中，而可变区在细胞外延伸并负责结合抗原。TCR的细胞质短尾缺乏转导信号的能力。细胞内信号传导由CD3蛋白复合物启动，该复合物包含细胞内免疫受体酪氨酸激活基序(ITAM)。

CD3(分化簇3)T细胞共受体是一种蛋白质复合物，由四个不同的链组成。在哺乳动物中，复合物包含一条CD3γ(γ)链，一条CD3δ(δ)链和两条CD3ε(ε)链。这些链与TCR和ζ链(zeta链)相关，在T淋巴细胞中产生激活信号。TCR，ζ链和CD3分子一起构成TCR复合物。CD3γ，CD3δ和CD3ε链是包含单个细胞外免疫球蛋白结构域的免疫球蛋白超家族的高度相关的细胞表面蛋白。TCR不能结合游离的表位/抗原，相反，TCR会结合酶切的与主要组织相容性复合物(MHC)相关的较大多肽的片段，这与人的人类白细胞抗原(HLA)系统同义。这种相互作用发生在被称为免疫突触的空间中。I类MHC分子在人体所有有核细胞上表达，并向细胞毒性T细胞呈递抗原，这些细胞毒性T细胞上的CD8稳定MHC/TCR相互作用。细胞毒性T细胞的活化随后导致靶细胞的破坏。在巨噬细胞，B细胞和树突状细胞上发现II类MHC。这些免疫细胞将抗原呈递给辅助性T细胞，并带有稳定MHC/TCR相互作用的CD4。MHC II类和TCR之间的相互作用最终导致抗体介导的免疫反应。其他共刺激分子，例如CD45，CD28和CD2有助于免疫突触中的T细胞活化并启动TCR信号体的形成，TCR信号体是负责细胞内信号传导的大分子蛋白质复合物。目前未见ITPRIPL1作为CD3ε配体的报道。

轴突导向因子semaphorin是一个至少包含20个成员的大家族,它的成员都是分泌型或与膜结合的蛋白。作为SEMA3亚群的一种蛋白，SEMA3G被报道结合NRP2、PlexinA4、PlexinD1，并可调节淋巴管的形成与向淋巴内皮细胞释放反向引导信号。根据HumanProtein Atlas数据库的注解，SEMA3G主要表达于血管内皮细胞与调节性T细胞(Treg)上(Protein Sci.2018；27:233-244)。

目前研究发现ITPRIPL1蛋白表达在肿瘤细胞，且可作为配体结合CD3E和SEMA3G，从而抑制T细胞对肿瘤细胞的杀伤。因此，本领域的技术人员致力于开发一种可以结合ITPRIPL1靶向性抗体用于肿瘤的免疫治疗。

发明内容

为实现上述目的，本申请提供了一种分离的抗原ITPRIPL1结合蛋白，其能够与抗原ITPRIPL1中如SEQ ID NO:25所示的氨基酸序列结合。

在某些实施方式中，其包含氨基酸序列SEQ ID NO:5和14中任一项所示的重链可变区VH中的HCDR1、HCDR2和HCDR3；且其包含氨基酸序列SEQ ID NO:6和15中任一项所示的轻链可变区VL中的LCDR1、LCDR2和LCDR3。

在某些实施方式中，其中所述HCDR1的氨基酸序列如SEQ ID NO:7所示，所述HCDR2的氨基酸序列如SEQ ID NO:8所示，且所述HCDR3的氨基酸序列如SEQ ID NO:9所示。

在某些实施方式中，其中所述LCDR1的氨基酸序列如SEQ ID NO:10或16中的任一项所示，所述LCDR2的氨基酸序列为KV，且所述LCDR3的氨基酸序列如SEQ ID NO:11或17中的任一项。

在某些实施方式中，其包括抗体重链恒定区，且所述抗体重链恒定区源自人IgG重链恒定区。

在某些实施方式中，其包括抗体轻链恒定区，且所述抗体轻链恒定区包括人Igκ恒定区。

在某些实施方式中，其包含抗体重链HC，且所述HC包含SEQ ID NO:3或12中任一项所示的氨基酸序列。

在某些实施方式中，其包含抗体轻链LC，且所述LC包含SEQ ID NO:4或13中任一项所示的氨基酸序列。

在某些实施方式中，其包括抗体或其抗原结合片段，其中所述抗原结合片段包括Fab，Fab’，F(ab)2、Fv片段、F(ab’)2，scFv和/或di-scFv。

在某些实施方式中，所述ITPRIPL1蛋白包含人ITPRIPL1蛋白。

在某些实施方式中，所述人ITPRIPL1蛋白包含如SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列。

另一方面，本申请还提供了嵌合抗原受体，其包含本申请中所述的分离的抗原ITPRIPL1结合蛋白。

另一方面，本申请还提供了免疫耦联物，其包含本申请中所述的分离的抗原ITPRIPL1结合蛋白。

另一方面，本申请还提供了分离的一种或多种核酸分子，其编码本申请中所述的分离的抗原ITPRIPL1结合蛋白或所述的嵌合抗原受体。

另一方面，本申请还提供了载体，其包含本申请中所述的核酸分子。

另一方面，本申请还提供了细胞，其包含本申请中所述的核酸分子或所述的载体。

另一方面，本申请还提供了药物组合物，其包含本申请中所述的分离的抗原ITPRIPL1结合蛋白、所述的嵌合抗原受体、所述的免疫耦联物，以及任选地药学上可接受的佐剂。

另一方面，本申请还提供了制备本申请中所述的分离的抗原ITPRIPL1结合蛋白的方法，所述方法包括在使得本申请中所述的分离的抗原ITPRIPL1结合蛋白表达的条件下，培养本申请所述的细胞。

另一方面，本申请还提供了本申请中所述的分离的抗原ITPRIPL1结合蛋白、所述的嵌合抗原受体、所述的免疫耦联物、和/或所述的药物组合物在制备药物中的用途，所述药物用于预防、缓解和/或治疗肿瘤。

在某些实施方式中，所述肿瘤包括淋巴瘤。

本申请创造性地开发了可以结合ITPRIPL1靶向性抗体，能够以高亲和力结合上述靶蛋白并且中和其功能，抑制其与一个或多个配体的结合，从而达到解除肿瘤细胞免疫逃逸功能的作用，促进免疫细胞在体内外对肿瘤细胞的杀伤；本申请提供的抗体可作为有效成分制备用于治疗肿瘤的药物，为肿瘤的治疗提够了新的有效方案。同时本发明还提供了具有优良中和功能的抗体对应的线性表位、施用抗体的生物标志物。

以下将结合附图对本申请的构思、具体结构及产生的技术效果作进一步说明，以充分地了解本申请的目的、特征和效果。

附图说明

图1显示的是本申请中ITPRIPL1与受体蛋白CD3E或SEMA3G特异结合的曲线图。其中，图1A为ITPRIPL1与CD3E的结合曲线，图1B为ITPRIPL1与SEMA3G的结合曲线。

图2显示的是本申请中过表达ITPRIPL1的细胞与游离ITPRIPL1蛋白对PBMC杀伤肿瘤细胞的抑制作用结果图。其中，图2A为未加入PBMC的圈门设定，图2B为加入PBMC时对该圈门的验证，图2C为未染Annexin V与PI的野生型HCT116细胞，图2D为双染Annexin V与PI的未加入PBMC的野生型HCT116细胞，图2E为双染Annexin V与PI的加入PBMC的野生型HCT116细胞，图2F为双染Annexin V与PI的未加入PBMC的ITPRIPL1过表达HCT116细胞，图2G为双染Annexin V与PI的加入PBMC的ITPRIPL1过表达HCT116细胞，图2H为双染Annexin V与PI的未加入PBMC的ITPRIPL1敲除HCT116细胞，图2I为双染Annexin V与PI的加入PBMC的ITPRIPL1敲除HCT116细胞，图2J为不同ITPRIPL1表达情况下PBMC杀伤率变化。

图3显示的是本申请中鼠杂交瘤抗体与ITPRIPL1结合的结果图。其中，图3A为1微克每毫升的100株杂交瘤抗体与1微克每毫升ITPRIPL1反应的ELISA结果图，图3B为1微克每毫升的挑选出的9株杂交瘤抗体与1微克每毫升ITPRIPL1反应的ELISA结果图。图3C为13B7抗体与ITPRIPL1的结合曲线图。

图4显示的是本申请中流式细胞分析技术检测各鼠杂交瘤抗体与内源性高表达ITPRIPL1的Jurkat细胞结合情况的结果图。其中,图4A为Jurkat细胞圈门设定，图4B为各杂交瘤抗体结合率统计结果，图4C-4L为不同的杂交瘤抗体2E7、5E5、13B7、13F7、15C9、16E1、18B12、18G5、19B11及20E3与Jurkat细胞结合的流式细胞分析结果。

图5显示的是本申请中流式细胞分析技术检测鼠杂交瘤13B7抗体与表达ITPRIPL1的多种肿瘤细胞的结合结果图。其中,图5A为HCT116未加入抗体对照，图5B为HCT116加入抗体组，图5C为A549未加入抗体对照，图5D为A549加入抗体组，图5E为MC38未加入抗体对照，图5F为MC38加入抗体组，图5G为MC38-ITPRIPL1稳转株未加入抗体对照，图5H为MC38-ITPRIPL1稳转株加入抗体组，图5I为Jurkat未加入抗体对照，图5J为Jurkat加入抗体组，图5K为Raji未加入抗体对照，图5L为Raji加入抗体组，图5M为13B7抗体与表达ITPRIPL1的不同肿瘤细胞结合率的统计结果图。

图6显示的是本申请中流式细胞分析技术检测不同浓度的鼠杂交瘤13B7抗体与内源性高表达ITPRIPL1的Jurkat细胞的结合结果图。其中，图6A为圈门设定，图6B为阴性对照，图6C-图6H分别为0.0625/0.125/0.25/0.5/1/2微克每毫升的13B7抗体结合时的结合率，图6I为各组结合率的数据统计结果。

图7显示的是本申请中免疫蛋白印迹法分析13B7抗体与ITPRIPL1的结合结果图。其中，用内源性高表达ITPRIPL1的Jurkat细胞、内源性表达ITPRIPL1的HCT116细胞与不表达ITPRIPL1的MC38细胞进行Western Blot实验，用13B7抗体进行孵育。

图8显示的是本申请中不同鼠杂交瘤抗体阻断ITPRIPL1与不同蛋白结合的结果图。其中，图8A显示的不同鼠杂交瘤抗体阻断ITPRIPL1与CD3E结合的结果图，图8B显示的不同鼠杂交瘤抗体阻断ITPRIPL1与SEMA3G结合的结果图。

图9显示的是本申请中鼠杂交瘤单克隆抗体与ITPRIPL1结合的ELISA结果图。

图10显示的是本申请中流式细胞分析技术检测不同鼠杂交瘤单克隆抗体与内源性高表达ITPRIPL1的Jurkat细胞结合的结果图。

图11显示的是本申请中不同鼠杂交瘤单克隆抗体阻断ITPRIPL1与不同蛋白结合的统计结果图。其中，图11A显示的是不同鼠杂交瘤单克隆抗体阻断ITPRIPL1与CD3E结合的结果图，图11B显示的是不同鼠杂交瘤抗体阻断ITPRIPL1与SEMA3G结合的统计图。

图12显示的是本申请中ITPRIPL1抗原结合区域鉴定结果图。其中，图12A-12M依次为抗体18B12、18B12D1A6、13B7、13B7A6H3、16E1、18G5、20E3、16E1D8H1、5E5、2E7、19B7、13F7、18G5F3F4与来自ITPRIPL1蛋白的不同肽段结合的统计结果图。

图13显示的是本申请中不同鼠杂交瘤单克隆抗体促进PBMC对内源性高表达ITPRIPL1的Raji细胞杀伤的细胞流式分析检测结果图。其中，图13A-B为圈门设定，图13C为Raji细胞自身凋亡对照，图13D为加入PBMC与阴性血清的杀伤情况，图13E-图13N分别为加入PBMC时加入0.5微克每毫升的13B7A6H3单克隆抗体、2微克每毫升的13B7A6H3单克隆抗体、0.5微克每毫升的16E1D8C4单克隆抗体、2微克每毫升的16E1D8C4单克隆抗体、0.5微克每毫升的18G5F3E5单克隆抗体、2微克每毫升的18G5F3E5单克隆抗体、0.5微克每毫升的18B12D1单克隆抗体、2微克每毫升的18B12D1单克隆抗体、0.5微克每毫升的18B12D1A6单克隆抗体、2微克每毫升的18B12D1A6单克隆抗体的检测结果。

图14显示的是本申请中不同鼠杂交瘤单克隆抗体促进PBMC对内源性高表达ITPRIPL1的Raji细胞杀伤的细胞流式分析检测结果统计图。

具体实施方式

在本申请中，除非另有说明，否则本申请中使用的科学和技术名词具有本领域技术人员所通常理解的含义。并且，本文中所用的蛋白质和核酸化学、分子生物学、细胞和组织培养、微生物学、免疫学相关术语和实验室操作步骤均为相应领域内广泛使用的术语和常规步骤。同时，为了更好地理解本发明，下面提供相关术语的定义和解释。

在本申请中，术语“分离的”通常指从天然状态下经人工手段获得的或者人工合成的。如果自然界中出现某一种“分离”的物质或成分，那么可能是其所处的天然环境发生了改变，或从天然环境下分离出该物质，或二者情况均有发生。例如，某一活体动物体内天然存在某种未被分离的多聚核苷酸或多肽，而从这种天然状态下分离出来的高纯度的相同的多聚核苷酸或多肽即称之为分离的。术语“分离的”不排除混有人工或合成的物质，也不排除存在不影响物质活性的其它不纯物质。

在本申请中，术语“抗体”通常指免疫球蛋白或其片段或其衍生物，涵盖包括抗原结合位点的任何多肽，无论其是在体外还是体内产生的。该术语包括但不限于多克隆的、单克隆的、单特异性的、多特异性的、非特异性的、人源化的、单链的、嵌合的、合成的、重组的、杂化的、突变的和移植的抗体。基本的4链抗体单元是由两个相同的轻(L)链和两个相同的重(H)链组成的异四聚体糖蛋白。例如，IgM抗体由5个基本的异四聚体单元与另外一个称为J链的多肽组成，而IgA抗体包括2-5个可以与J链相结合聚合形成多价组合的基本4链单元。就IgG而言，4链单元一般为约150,000道尔顿。每个L链通过一个共价二硫键与H链连接，而两个H链通过一个或多个取决于H链同种型的二硫键相互连接。每个H和L链还具有间隔的链内二硫化桥键。每个H链在N末端具有可变结构域/可变区(VH)，对于α和γ链各自继之以三个恒定结构域/恒定区(CH)、对于μ和ε同种型继之以四个CH结构域。每个L链在N末端具有可变结构域/可变区(VL)，在其另一端具有恒定结构域/恒定区(CL)。VL与VH对应，CL与重链的第一恒定结构域(CH1)相对应。

在本申请中，术语“轻链可变区”通常指抗体轻链的氨基末端结构域。轻链可变区称为“VL”。这些结构域通常是抗体轻链中变化最大的部分(相对于相同类型的其它抗体)，可以包括互补决定区(CDR)或高变区(HVR)和框架区(FR)。

在本申请中，术语“重链可变区”通常指抗体重链的氨基末端结构域。重链可变区称为“VH”。这些结构域通常是抗体重链中变化最大的部分(相对于相同类型的其它抗体)，可以包括互补决定区(CDR)或高变区(HVR)和框架区(FR)。

在本申请中，术语“互补决定区”或术语“CDR”通常是指共同界定了抗原结合蛋白(例如，天然免疫球蛋白，嵌合抗体或人源化抗体)结合位点的可变区域的结合亲和力和特异性的氨基酸序列(参见例如，Chothia等，J.Mol.Biol.196：901-917(1987)；Kabat等，美国健康和人类服务部NIH出版物(U.S.Deptof Health and Human Services NIHPublication)No.913242(1991))。通常，抗体包括六个CDR；VH中三个(HCDR1、HCDR2、HCDR3)，和在VL中三个(LCDR1、LCDR2、LCDR3)。仅由重链组成的天然存在的骆驼抗体在缺乏轻链的情况下也能够保持功能正常且稳定。参见，例如,Hamers-Casterman et al.,Nature363:446-448(1993)；Sheriff et al,Nature Struct.Biol.3:733-736(1996)。基于不同的指派系统获得的同一抗体的可变区的CDR的边界可以有所差异。即不同指派系统下定义的同一抗体可变区的CDR序列有所不同。例如，对使用Kabat和Chothia编号的CDR区域在不同指派系统定义下的残基范围可以是不同的。因此，在涉及用本发明定义的具体CDR序列限定抗体时，所述抗体的范围还涵盖了这样的抗体，其可变区序列包含所述的具体CDR序列，但是由于应用了不同的方案(例如不同的指派系统规则或组合)而导致其所声称的CDR边界与本申请中提供的具体CDR序列不同。本申请抗体的CDR可以根据本领域的任何方案或其组合人工地评估确定边界，除非另有说明，否则在本发明中，术语“CDR”或“CDR序列”涵盖以上述任一种方式确定的CDR序列。

在本申请中，术语“载体”通常指可将编码某蛋白的多聚核苷酸插入其中并使蛋白获得表达的一种核酸运载工具。载体可通过转化、转导或转染宿主细胞，使其携带的遗传物质元件在宿主细胞内表达得以表达。举例来说，载体包括：质粒；噬菌粒；柯斯质粒；人工染色体如酵母人工染色体(YAC)、细菌人工染色体(BAC)或P1来源的人工染色体(PAC)；噬菌体如λ噬菌体或M13噬菌体及动物病毒等。

在本申请中，术语“细胞”通常可以是或已经是核酸分子或载体的接受者的单个细胞、细胞系或细胞培养物。细胞可以包括本申请所述的核酸分子或本发明所述的载体。细胞可以包括单个细胞的后代。由于天然、偶然或有意的突变，后代可以不一定与原始母细胞完全相同(在总DNA互补体的形态上或在基因组上)。细胞可包括用本申请所述的载体在体外转染的细胞。

在本申请中，术语“药物组合物”通常指涉及适合施用于患者、例如人患者的组合物。例如，本申请所述的药物组合物，其可以包含本申请所述的分离的抗原结合蛋白、本申请所述的载体和/或本申请所述的细胞，以及任选地药学上可接受的佐剂。此外，所述药物组合物还可以包含一种或多种(药学上有效的)载剂、稳定剂、赋形剂、稀释剂、增溶剂、表面活性剂、乳化剂和/或防腐剂的合适的制剂。例如，组合物的可接受成分在所用剂量和浓度下对接受者无毒。本申请的药物组合物包括但不限于液体、冷冻和冻干组合物。

在本申请中，术语“药学上可接受的佐剂”通常指与药物给药相容的任何和所有的溶剂、分散介质、包衣、等渗剂和吸收延迟剂等。通常安全、无毒，且既不是生物学上也非其它方面不合需要的。

以下将结合实施例对本申请作进一步地说明，应理解这些实施例仅作为例证的目的，本申请可以通过许多不同形式的实施例来得以体现，本申请的保护范围并非仅限于文中提到的实施例。

实施例1 ITPRIPL1与受体蛋白CD3E或SEMA3G结合的检测

酶联免疫吸附剂测定(ELISA)证实ITPRIPL1蛋白分别与CD3ε胞外区蛋白以及SEMA3G胞外区蛋白存在浓度依赖的直接结合，使用ELISA专用板(costar，ME，美国)。首先用0.03125/0.0625/0.125/0.25/0.5/1/2微克每毫升的ITPRIPL1重组蛋白(cusabio，武汉，中国)或2微克每毫升的SEMA3G蛋白(cusabio，武汉，中国)各溶于100微升ELISA包被液(Solarbio，北京，中国)包板，阴性对照采用不含蛋白的100微升包被液包板。四度包被过夜。PBST清洗后用100微升5％溶于PBS的BSA(VWR，PA，美国)进行封闭，温箱37度封闭90分钟。PBST清洗后，再以用1微克每毫升CD3ε胞外区蛋白质片段(义翘神州，北京，中国)与不同浓度的ITPRIPL1蛋白或0.03125/0.0625/0.125/0.25/0.5/1/2微克每毫升的ITPRIPL1重组蛋白与相同浓度的SEMA3G蛋白进行孵育结合，该CD3ε蛋白以及ITPRIPL1蛋白均带有hFc标签，温箱37度结合60分钟。PBST清洗后，用PBS稀释的特异性抗人Fc段抗体(Abcam，MA，美国)进行孵育结合，温箱37度结合30分钟。PBST清洗后，配置显色液(Invitrogen，CA，美国)，每孔100微升，置于温箱反应5-30分钟，再予以50微升终止液(生工，上海，中国)，置于酶标仪(赛默飞，MA，美国)下450nm显色读数。

图1为ELISA实验结果，图中各阳性组已扣除空白包被、封闭并加入相应配体蛋白的阴性对照在显色后的OD450读数。其中图1A为ITPRIPL1与CD3E的结合曲线，图1B为ITPRIPL1与SEMA3G的结合曲线。图1A显示不同浓度的ITPRIPL1结合CD3E(1ug/mL)随着ITPRIPL1的浓度的增高而升高，图1B显示ITPRIPL1(2ug/mL)与不同浓度的SEMA3G结合的能力随着SENA3G的浓度的增高而升高，表明ITPRIPL1与受体蛋白CD3E及SEMA3G具有特异结合的能力。该结果表明，ITPRIPL1纯化蛋白分别与CD3胞外区纯化蛋白以及SEMA3G胞外区蛋白存在浓度依赖的直接结合。

实施例2：过表达ITPRIPL1显著降低人外周血单核细胞对肿瘤细胞的杀伤

1.构建HCT116-ITPRIPL1稳转株与HCT116-ITPRIPL1敲除细胞

将构建的全长ITPRIPL1-Flag质粒(SEQ ID NO.1所示)以及空载pcDNA3.1质粒分别转染至HCT116细胞(ATCC，VA，美国)，置于培养箱中培养24-48小时后，加入1000微克每毫升的遗传霉素(Geneticin，G418)(Gibco，CA，美国)进行筛选，10-14天后至未转染组细胞全部死亡后，即得HCT116-ITPRIPL1稳转株细胞。

将HCT116细胞(ATCC，VA，美国)以合适的密度(第二日生长至密度约30-40％左右)铺置于24孔板(康宁，NY，美国)中，次日消化计数，先以GFP对照慢病毒(吉满，上海，中国)数量梯度以感染细胞，48小时后换液，72小时后镜下观察GFP荧光以确定最佳病毒细胞感染比，以探索MOI值。确定MOI值后，重新铺板，以含有杀稻瘟菌素抗性的Cas9系统慢病毒(吉满，上海，中国)以MOI值感染HCT116细胞，48小时后换液，72小时后加入浓度梯度的杀稻瘟菌素(Invivogen，CA，美国)以筛选10-14天，最终筛选所得的细胞系即含有Cas9系统的HCT116细胞。再将含有Cas9系统的HCT116细胞于24孔板中铺板计数，以含有嘌呤霉素抗性的特定切割ITPRIPL1的sgRNA的慢病毒以MOI值进行感染，48小时后换液，72小时后进入浓度梯度的嘌呤霉素(Invivogen，CA，美国)进行筛选10-14天，即得HCT116-ITPRIPL1敲除细胞系。

2.流式细胞术证明过表达ITPRIPL1可抑制PBMC对肿瘤细胞的杀伤。而敲降肿瘤细胞表达的ITPRIPL1可显著增加该杀伤

提前24小时用1ug/mL的Anti-CD3/CD28(Invitrogen，CA，美国)将复苏的PBMC细胞激活。将PBMC细胞、HCT116-ITPRIPL1稳转株细胞及HCT116-ITPRIPL1敲除细胞计数，分别调整细胞数为1x10⁶/毫升，各加入100微升至96孔板(赛默飞，MA，美国)中，混合后置于培养箱中共孵育6小时。取出96孔板，将各孔细胞置于EP管(Axygen，CA,美国)中，400rcf离心5分钟后弃去上清。用500微升细胞染色缓冲液(Invitrogen，CA，美国)重悬洗涤细胞，重复离心与洗涤。用细胞染色缓冲液按1:20稀释CD45-APC抗体(Invitrogen，CA，美国)，各EP管加入200微升混合液重悬，室温孵育30分钟。400rcf离心5分钟后弃去上清，用1毫升binding buffer(碧云天，上海，中国)重悬清洗细胞；重复离心与洗涤。设置各实验组和对照组(由不加入PBMC的自身凋亡组作为对照组，由1：1加入了PBMC的各组细胞作为实验组)，依据条件分别加入100微升binding buffer，5微升Annexin V-FITC(碧云天，上海，中国)与10微升PI(碧云天，上海，中国)，室温孵育15分钟，再各自加入400微升binding buffer，转移至流式管(Falcon，NY，美国)中上机(美天旎，科隆，德国)测试，结果如图2所示，该结果表明ITPRIPL1过表达抑制了PBMC对肿瘤细胞的杀伤作用，而敲除ITPRIPL1则解除了该抑制效果。

实施例3：鼠杂交瘤抗体能特异性地结合ITPRIPL1

1.制备ITPRIPL1小鼠杂交瘤抗体

(1)将人类ITPRIPL1-Fc重组蛋白(如SEQ ID NO.2所示)作为免疫原，对C57BL/6小鼠进行免疫，进行多次免疫以增强效果：

1)初次免疫，抗原50μg/只，加福氏完全佐剂皮下多点注射，间隔3周；

2)第二次免疫，剂量途径同上，加福氏不完全佐剂，间隔3周；

3)第三次免疫，剂量同上，不加佐剂，腹腔注射间隔3周；

4)加强免疫，剂量50μg，腹腔注射。最后一次注射3天后采血测其效价。

(2)检测免疫效果达到要求后，再进行多次累积方式取血、分离多克隆抗体，并进行多克隆抗体纯化，具体实验步骤包括：

1)准备蛋白G sepharose CL-4B亲和柱。准备10mL蛋白G sepharose CL-4B填料，在真空瓶中将等体积的填料和TBS缓冲溶液混合，搅拌。抽真空15分钟以除去填料中的气泡。将蛋白G sepharose CL-4B填料缓慢加入玻璃柱中，利用泵控制填充速度为1mL/分-2mL/分，避免柱干，利用10倍于床体积并经过预冷的TBS缓冲溶液平衡柱子；

2)制备多克隆抗体。将多克隆抗体放入冰水或4℃冰箱中缓慢解冻以避免蛋白质的聚集。加入固体叠氮化钠至浓度为0.05％，4℃，15,000×g离心5分钟，移出澄清的多克隆抗体再经过滤器过滤除去多余的脂；

3)亲和层析。将抗体用TBS缓冲溶液以1：5的比例进行稀释，再用过滤器进行过滤。以每分钟0.5mL的速度将多克隆抗体上到柱上，为保证多克隆抗体与填料的结合，需连续上柱2次并保留上样流出液。用TBS缓冲溶液清洗柱子至Aλ280nm<0.008后加Ph 2.7洗脱缓冲溶液，以0.5mL/min的速度洗脱至所有蛋白均流下来。用已经加入100μL中和缓冲溶液的1.5mL EP管分管收集洗脱液，混匀后用pH试纸检查洗脱液的pH，pH低于7时利用中和缓冲液调至约pH7.4以防止抗体的变性。在柱中加入10mL、pH1.9的洗脱缓冲溶液，按上述方法收集洗脱液至Aλ280nm<0.008。利用分光光度计测定各管中蛋白质的含量。

2.酶联免疫吸附剂测定(ELISA)对各杂交瘤抗体与ITPRIPL1的结合验证

为验证各杂交瘤抗体对ITPRIPL1的结合力，采取酶联免疫吸附剂测定(ELISA)证实各抗体与ITPRIPL1蛋白的直接结合。使用ELISA专用板(costar，ME，美国)。首先用100微升(1微克每毫升)的ITPRIPL1重组蛋白(cusabio，武汉，中国)ELISA包被液(Solarbio，北京，中国)包板，阴性对照采用不含TPRIPL1重组蛋白的100微升包被液包板。四度包被过夜。PBST清洗后用100微升5％溶于PBS的BSA(VWR，PA，美国)进行封闭，温箱37℃封闭90分钟。PBST清洗后，温箱37℃结合60分钟。PBST清洗后，用PBS稀释的特异性抗鼠Fc段抗体(康臣，上海，中国)进行孵育结合，温箱37度结合30分钟。PBST清洗后，配置显色液(Invitrogen，CA，美国)，每孔100微升，置于温箱反应5-30分钟，再予以50微升终止液(生工，上海，中国)，置于酶标仪(赛默飞，MA，美国)下450nm显色读数。

图3为该ELISA实验结果。左上图为所有100株所得的抗体与ITPRIPL1蛋白结合的ELISA结果，右上图为从左上图结果挑选9株结合较好的抗体的单独重复实验结果。下图为13B7抗体的浓度依赖的结合曲线。实验表明，各抗体与ITPRIPL1结合力的强弱各不相同，表明抗体之间的异质性，而13B7为结合力最强的抗体。上述结果证明各杂交瘤能与ITPRIPL1有结合力各不相同的结合。

2.流式细胞术(FACS)对各杂交瘤抗体与ITPRIPL1的结合验证

为进一步验证各杂交瘤抗体对ITPRIPL1的结合力，采取流式细胞术(FACS)证实各抗体与ITPRIPL1蛋白的直接结合。将内源性高表达ITPRIPL1的Jurkat细胞(ATCC，VA，美国)计数，调整细胞数为1x10⁶/毫升，各加入100微升至96孔板(赛默飞，MA，美国)中，向每孔中分别加入终浓度为1微克每毫升的杂交瘤抗体或对照血清，培养箱孵育30分钟。取出96孔板，将各孔细胞置于EP管(Axygen，CA,美国)中，400rcf离心5分钟后弃去上清。用500微升细胞染色缓冲液(Invitrogen，CA，美国)重悬洗涤细胞，重复离心与洗涤。用细胞染色缓冲液按1:500稀释抗鼠Fc段-Alexa Fluor488抗体(Invitrogen，CA，美国)，各EP管加入200微升混合液重悬，室温孵育30分钟。400rcf离心5分钟后弃去上清，用1毫升细胞染色缓冲液重悬清洗细胞；重复离心与洗涤。各自加入300微升细胞染色缓冲液，转移至流式管(Falcon，NY，美国)中上机(美天旎，科隆，德国)测试。

图4为该FACS实验结果，该实验显示各抗体与ITPRIPL1结合力的强弱各不相同，表现了抗体之间的异质性，其中13B7为结合力最强的抗体。

实施例4 13B7抗体能够以高亲和力特异性地结合ITPRIPL1

1.流式细胞术(FACS)验证13B7抗体对ITPRIPL1表达量不同的细胞结合

为进一步验证13B7对ITPRIPL1的结合力，采取流式细胞术(FACS)证实13B7抗体与ITPRIPL1表达量不同的各类细胞直接结合。将内源性ITPRIPL1表达量不同的细胞，即HCT116(ATCC，VA，美国)、A549(ATCC，VA，美国)、MC38(Kerafast，MA，美国)、Jurkat(ATCC，VA，美国)、Raji细胞(ATCC，VA，美国)以及MC38-ITPRIPL1稳转株细胞计数，调整细胞数为1x10⁶/毫升，各加入100微升至96孔板(赛默飞，MA，美国)中，向每孔中分别加入终浓度为1微克每毫升的13B7抗体，培养箱孵育30分钟。取出96孔板，将各孔细胞置于EP管(Axygen，CA,美国)中，400rcf离心5分钟后弃去上清。用500微升细胞染色缓冲液(Invitrogen，CA，美国)重悬洗涤细胞，重复离心与洗涤。用细胞染色缓冲液按1:500稀释抗鼠Fc段-AlexaFluor 488抗体(Invitrogen，CA，美国)，各EP管加入200微升混合液重悬，室温孵育30分钟。400rcf离心5分钟后弃去上清，用1毫升细胞染色缓冲液重悬清洗细胞；重复离心与洗涤。各自加入300微升细胞染色缓冲液，转移至流式管(Falcon，NY，美国)中上机(美天旎，科隆，德国)测试。

图5为该FACS实验结果，该实验结果显示各细胞系与13B7抗体的结合力强弱与各细胞系表达ITPRIPL1蛋白的情况基本一致，表明13B7抗体能与表达ITPRIPL1的细胞系上的ITPRIPL1特异地结合。

2.流式细胞术(FACS)验证13B7抗体能浓度依赖地结合Jurkat细胞

为验证13B7对ITPRIPL1的结合力，采取流式细胞术(FACS)验证13B7抗体存在与Jurkat细胞的浓度依赖的结合。将内源性高表达ITPRIPL1的Jurkat细胞计数，调整细胞数为1x10⁶/毫升，各加入100微升至96孔板(赛默飞，MA，美国)中，向每孔中分别加入终浓度为0.0625/0.125/0.25/0.5/1/2微克每毫升的13B7抗体，培养箱孵育30分钟。取出96孔板，将各孔细胞置于EP管(Axygen，CA,美国)中，400rcf离心5分钟后弃去上清。用500微升细胞染色缓冲液(Invitrogen，CA，美国)重悬洗涤细胞，重复离心与洗涤。用细胞染色缓冲液按1:500稀释抗鼠Fc段-Alexa Fluor 488抗体(Invitrogen，CA，美国)，各EP管加入200微升混合液重悬，室温孵育30分钟。400rcf离心5分钟后弃去上清，用1毫升细胞染色缓冲液重悬清洗细胞；重复离心与洗涤。各自加入300微升细胞染色缓冲液，转移至流式管(Falcon，NY，美国)中上机(美天旎，科隆，德国)测试。

图6为该FACS实验结果，该结果显示Jurkat细胞能与13B7抗体呈浓度依赖性的高亲和力的结合。

3.蛋白质免疫印迹法验证13B7抗体能特异性地结合ITPRIPL1表达量不同细胞的ITPRIPL1蛋白

将含有内源性表达ITPRIPL1情况各不相同的Jurkat、HCT116、MC38细胞计数，各取出1x10⁶个细胞，PBS清洗并离心后，用60微升RIPA裂解液(碧云天，上海，中国)与1：100蛋白酶抑制剂、磷酸酶抑制剂、PMSF三联(康臣，上海，中国)混合裂解液冰上裂解15分钟，取液氮三冻三融，经离心、上样缓冲液(碧云天，上海，中国)混合及100摄氏度金属浴变性后制得输入量蛋白样本。再按照说明书于胶板(伯乐，CA，美国)中配置12.5％PAGE凝胶(雅酶，上海，中国)，将配置好的胶置于电泳槽(伯乐，CA，美国)中，接好电源(伯乐，CA，美国)以80伏恒压的条件让条带跑完浓缩胶，以120伏恒压的条件跑完分离胶。待条带跑至分离胶底部时，运用湿法转膜，转膜槽(伯乐，CA，美国)350毫安恒流90分钟转膜。待转膜完成后，以ITPRIPL1蛋白及内参GAPDH蛋白的质量大小进行剪膜处理。用快速封闭液(雅酶，上海，中国)封闭十分钟，用13B7抗体以终浓度1微克每毫升稀释和GAPDH-HRP抗体(康臣，上海，中国)分别孵育ITPRIPL1与GAPDH相应条带，4℃过夜。次日经TBST清洗后，用5％溶于TBS的脱脂奶粉(生工，上海，中国)稀释的特异性抗鼠二抗(康臣，上海，中国)室温孵育一小时，经TBST清洗后，置于混合发光液(圣尔，上海，中国)中一分钟，于凝胶成像仪(伯乐，CA，美国)下曝光。

图7为该Western Blot实验结果。如图所示，根据GAPDH内参的提示，13B7抗体能特异性地与ITPRIPL1蛋白分子量所在位置显示出条带，并与各细胞内源性表达ITPRIPL1情况相符，说明13B7抗体能特异性地与ITPRIPL1蛋白进行结合。

实施例5各杂交瘤抗体对ITPRIPL1与CD3E/SEMA3G结合的阻断效果测定

为了验证各杂交瘤抗体对ITPRIPL1与CD3E或SEMA3G的结合是否存在阻断效果，采取酶联免疫吸附剂测定(ELISA)对各抗体的阻断效果进行验证。使用ELISA专用板(costar，ME，美国)。首先用1微克每毫升的ITPRIPL1-Fc标签重组蛋白(Abclonal，武汉，中国)或1微克每毫升的CD3E-Fc标签蛋白(Acro，北京，中国)溶于100微升ELISA包被液(Solarbio，北京，中国)包板，阴性对照采用不含蛋白的100微升包被液包板。四度包被过夜。PBST清洗后用100微升5％溶于PBS的BSA(VWR，PA，美国)进行封闭，温箱37度封闭90分钟。PBST清洗后，包被ITPRIPL1-Fc蛋白的孔加入终浓度为1微克每毫升的SEMA3G-His标签蛋白(cusabio，武汉，中国)，同时加入终浓度为1/2微克每毫升的杂交瘤抗体；包被CD3E-Fc蛋白的孔加入终浓度为1微克每毫升的ITPRIPL1-His标签蛋白(cusabio，武汉，中国)，同时加入终浓度为1/2微克每毫升的杂交瘤抗体；温箱37度结合60分钟。PBST清洗后，用PBS稀释的特异性抗His段抗体(Abcam，MA，美国)进行孵育结合，温箱37度结合30分钟。PBST清洗后，配置显色液(Invitrogen，CA，美国)，每孔100微升，置于温箱反应5-30分钟，再予以50微升终止液(生工，上海，中国)，置于酶标仪(赛默飞，MA，美国)下450nm显色读数。

图8为该ELISA实验结果。上图为ITPRIPL1-CD3E结合时各杂交瘤抗体的阻断情况，下图为ITPRIPL1-SEMA3G结合时各杂交瘤抗体的阻断情况。实验结果表明各杂交瘤抗体能不同程度地阻断ITPRIPL1与CD3E或SEMA3G的结合，显示了各抗体之间的异质性，其中以18B12以及13B7抗体的结合效果最好。

实施例6单克隆抗体能以更高的亲和力结合ITPRIPL1

1.免疫吸附剂测定(ELISA)验证各单克隆抗体对ITPRIPL1的结合力

在对各杂交瘤抗体进行单克隆纯化后，得到16株生长情况较好的单克隆抗体。为验证各单克隆抗体对ITPRIPL1的结合力，采取酶联免疫吸附剂测定(ELISA)验证各抗体与ITPRIPL1蛋白的直接结合。使用ELISA专用板(costar，ME，美国)。首先用100微升1微克每毫升的ITPRIPL1重组蛋白(cusabio，武汉，中国)ELISA包被液(Solarbio，北京，中国)包板，阴性对照采用不含蛋白的100微升包被液包板。四度包被过夜。PBST清洗后用100微升5％溶于PBS的BSA(VWR，PA，美国)进行封闭，温箱37度封闭90分钟。PBST清洗后，加入终浓度为1微克每毫升的不同的单克隆抗体，温箱37度结合60分钟。PBST清洗后，用PBS稀释的特异性抗鼠Fc段抗体(康臣，上海，中国)进行孵育结合，温箱37度结合30分钟。PBST清洗后，配置显色液(Invitrogen，CA，美国)，每孔100微升，置于温箱反应5-30分钟，再予以50微升终止液(生工，上海，中国)，置于酶标仪(赛默飞，MA，美国)下450nm显色读数。

图9为该ELISA实验结果。实验结果表明各单克隆抗体之间对ITPRIPL1的结合力存在一定的差距，而整体对ITPRIPL1的结合力明显强于单克隆纯化之前的结合力，表明单克隆抗体能以更高的亲和力结合ITPRIPL1。

2.流式细胞术(FACS)验证各单克隆抗体与ITPRIPL1的结合

为进一步验证各单克隆抗体对ITPRIPL1的结合力，采取流式细胞术(FACS)证实各抗体与ITPRIPL1蛋白的直接结合。将内源性高表达ITPRIPL1的Jurkat细胞计数，调整细胞数为1x10⁶/毫升，各加入100微升至96孔板(赛默飞，MA，美国)中，向每孔中分别加入终浓度为1微克每毫升的单克隆抗体或对照血清，培养箱孵育30分钟。取出96孔板，将各孔细胞置于EP管(Axygen，CA,美国)中，400rcf离心5分钟后弃去上清。用500微升细胞染色缓冲液(Invitrogen，CA，美国)重悬洗涤细胞，重复离心与洗涤。用细胞染色缓冲液按1:500稀释抗鼠Fc段-Alexa Fluor 488抗体(Invitrogen，CA，美国)，各EP管加入200微升混合液重悬，室温孵育30分钟。400rcf离心5分钟后弃去上清，用1毫升细胞染色缓冲液重悬清洗细胞；重复离心与洗涤。各自加入300微升细胞染色缓冲液，转移至流式管(Falcon，NY，美国)中上机(美天旎，科隆，德国)测试。

结果如图10所示，各单克隆抗体与ITPRIPL1结合力的强弱各不相同，表现了抗体之间的异质性，而整体结合力强于单克隆纯化之前。上述结果证明各杂交瘤能与ITPRIPL1蛋白有结合力各不相同的结合，且单克隆纯化后对ITPRIPL1结合力更强。

实施例7：各单克隆抗体对ITPRIPL1与CD3E/SEMA3G结合的阻断效果测定

为了验证所得的单克隆抗体对ITPRIPL1与CD3E或SEMA3G的结合是否存在阻断效果，采取酶联免疫吸附剂测定(ELISA)对各抗体的阻断效果进行验证。使用ELISA专用板(costar，ME，美国)。首先用终浓度为1微克每毫升的ITPRIPL1-Fc标签重组蛋白(Abclonal，武汉，中国)或终浓度为1微克每毫升的CD3E-Fc标签蛋白(Acro，北京，中国)溶于100微升ELISA包被液(Solarbio，北京，中国)包板，阴性对照采用不含蛋白的100微升包被液包板。4℃包被过夜。PBST清洗后用100微升5％溶于PBS的BSA(VWR，PA，美国)进行封闭，温箱37度封闭90分钟。PBST清洗后，包被ITPRIPL1-Fc蛋白的孔加入终浓度为1微克每毫升的SEMA3G-His标签蛋白(cusabio，武汉，中国)，同时加入终浓度为1微克每毫升的单克隆抗体；包被CD3E-Fc蛋白的孔加入终浓度为1微克每毫升的ITPRIPL1-His标签蛋白(cusabio，武汉，中国)，同时加入终浓度为1/2微克每毫升的单克隆抗体；温箱37度结合60分钟。PBST清洗后，用PBS稀释的特异性抗His段抗体(Abcam，MA，美国)进行孵育结合，温箱37度结合30分钟。PBST清洗后，配置显色液(Invitrogen，CA，美国)，每孔100微升，置于温箱反应5-30分钟，再予以50微升终止液(生工，上海，中国)，置于酶标仪(赛默飞，MA，美国)下450nm显色读数。

图11为该ELISA实验结果。实验结果表明，各单克隆抗体对于ITPRIPL1于CD3E/SEMA3G的阻断效果仍各自存在一定差异，其中13B7A6H3/18B12D1A6/18B12D1F7的阻断效果较好，与单克隆纯化之前的结论相符。

实施例8杂交瘤抗体与单克隆抗体与多肽段结合测定

以ITPRIPL1胞外段蛋白序列为基础，设计1/3重合序列的多肽段，共计17段(金斯瑞，南京，中国)。其序列如SEQ ID NO.18-34所示。将所得的多肽段以400微克每毫升的终浓度溶于DMSO中，采取酶联免疫吸附剂测定(ELISA)验证各杂交瘤抗体并挑选4株单克隆抗体进行多肽段结合的验证。使用ELISA专用板(costar，ME，美国)。首先用终浓度为1微克每毫升的多肽段以100微升ELISA包被液(Solarbio，北京，中国)包板，阴性对照采用不含蛋白的100微升包被液包板。四度包被过夜。PBST清洗后用100微升5％溶于PBS的BSA(VWR，PA，美国)进行封闭，温箱37度封闭90分钟。PBST清洗后，加入终浓度为1微克每毫升的不同的杂交瘤抗体或单克隆抗体，温箱37度结合60分钟。PBST清洗后，用PBS稀释的特异性抗鼠Fc段抗体(康臣，上海，中国)进行孵育结合，温箱37度结合30分钟。PBST清洗后，配置显色液(Invitrogen，CA，美国)，每孔100微升，置于温箱反应5-30分钟，再予以50微升终止液(生工，上海，中国)，置于酶标仪(赛默飞，MA，美国)下450nm显色读数。

图12为该ELISA实验结果。与某一特定多肽段结合高于背景及其他多肽段三倍以上读数，即认为结合特定肽段。实验结果表明，具有较好阻断效果的13B7/18B12产生的单克隆抗体均结合P8，而无阻断效果或阻断效果较差的杂交瘤抗体及单克隆抗体无特定结合肽段，说明P8为优势结合位点。

实施例9：测定ITPRIPL1单克隆抗体对PBMC细胞杀伤肿瘤细胞的促进作用

流式细胞术证明具有阻断ITPRIPL1与CD3E/SEMA3G结合效果的单克隆抗体可以促进PBMC对肿瘤细胞的杀伤。

提前24小时用1ug/mL的Anti-CD3/CD28(Invitrogen，CA，美国)将复苏的PBMC细胞激活。将PBMC细胞与Raji细胞计数，分别调整细胞数为4x10⁶/毫升或1x10⁶/毫升，各加入100微升至96孔板(赛默飞，MA，美国)中，同时加入两个浓度的不同的单克隆抗体或对照血清，混合后置于培养箱中共孵育6小时。取出96孔板，将各孔细胞置于EP管(Axygen，CA,美国)中，400rcf离心5分钟后弃去上清。用500微升细胞染色缓冲液(Invitrogen，CA，美国)重悬洗涤细胞，重复离心与洗涤。400rcf离心5分钟后弃去上清，用1毫升binding buffer(碧云天，上海，中国)重悬清洗细胞；重复离心与洗涤。设置各实验和对照组，依据条件分别加入100微升binding buffer，5微升Annexin V-FITC(碧云天，上海，中国)与10微升PI(碧云天，上海，中国)，室温孵育15分钟，再各自加入400微升binding buffer，转移至流式管(Falcon，NY，美国)中上机(美天旎，科隆，德国)测试，结果如图13和14所示，该结果表明，与对照相比，抗体中具有阻断ITPRIPL1与CD3E/SEMA3G结合效果、能够结合P8(SEQ ID NO.25)的单克隆抗体13B7A6H3/18B12D1A6显著增加了PBMC对Raji细胞的杀伤。

经测序得知，单克隆抗体13B7A6H3的重链序列如SEQ ID NO.3所示，轻链序列如SEQ ID NO.4所示，重链可变区VH序列如SEQ ID NO.5所示，轻链可变区VL如SEQ ID NO.6所示，重链互补决定区HCDR1的序列如SEQ ID NO.7所示，重链互补决定区HCDR2的序列如SEQID NO.8所示，重链互补决定区HCDR3的序列如SEQ ID NO.9所示，轻链互补决定区LCDR1的序列如SEQ ID NO.10所示，轻链互补决定区LCDR2的序列为KV，轻链互补决定区LCDR3的序列如SEQ ID NO.11所示；单克隆抗体18B12D1A6的重链序列如SEQ ID NO.12所示，轻链序列如SEQ ID NO.13所示，重链可变区VH序列如SEQ ID NO.14所示，轻链可变区VL如SEQ IDNO.15所示，重链互补决定区HCDR1的序列如SEQ ID NO.7所示，重链互补决定区HCDR2的序列如SEQ ID NO.8所示，重链互补决定区HCDR3的序列如SEQ ID NO.9所示，轻链互补决定区LCDR1的序列如SEQ ID NO.16所示，轻链互补决定区LCDR2的序列为KV，轻链互补决定区LCDR3的序列如SEQ ID NO.17所示。

以上详细描述了本申请的较佳具体实施例。应当理解，本领域的普通技术无需创造性劳动就可以根据本申请的构思作出诸多修改和变化。因此，凡本技术领域中技术人员依本申请的构思在现有技术的基础上通过逻辑分析、推理或者有限的实验可以得到的技术方案，皆应在由权利要求书所确定的保护范围内。

序列表

<110> 复旦大学

<120> 分离的抗原ITPRIPL1结合蛋白及其用途

<130> CN017-21008PICN

<160> 34

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 538

<212> PRT

<213> Artificial Sequence（人工序列）

<220>

<223> ITPRIPL1

<400> 1

His Pro Leu Met Val Ser Asp Arg Met Asp Leu Asp Thr Leu Ala Arg

1 5 10 15

Ser Arg Gln Leu Glu Lys Arg Met Ser Glu Glu Met Arg Leu Leu Glu

20 25 30

Met Glu Phe Glu Glu Arg Lys Arg Ala Ala Glu Gln Arg Gln Lys Ala

35 40 45

Glu Asn Phe Trp Thr Gly Asp Thr Ser Ser Asp Gln Leu Val Leu Gly

50 55 60

Lys Lys Asp Met Gly Trp Pro Phe Gln Ala Asp Gly Gln Glu Gly Pro

65 70 75 80

Leu Gly Trp Met Leu Gly Asn Leu Trp Asn Thr Gly Leu Phe Cys Leu

85 90 95

Phe Leu Val Phe Glu Leu Leu Arg Gln Asn Met Gln His Glu Pro Ala

100 105 110

Phe Asp Ser Ser Ser Glu Glu Glu Glu Glu Glu Val Arg Val Val Pro

115 120 125

Val Thr Ser Tyr Asn Trp Leu Thr Asp Phe Pro Ser Gln Glu Ala Leu

130 135 140

Asp Ser Phe Tyr Lys His Tyr Val Gln Asn Ala Ile Arg Asp Leu Pro

145 150 155 160

Cys Thr Cys Glu Phe Val Glu Ser Phe Val Asp Asp Leu Ile Glu Ala

165 170 175

Cys Arg Val Leu Ser Arg Gln Glu Ala His Pro Gln Leu Glu Asp Cys

180 185 190

Leu Gly Ile Gly Ala Ala Phe Glu Lys Trp Gly Thr Leu His Glu Thr

195 200 205

Gln Lys Phe Asp Ile Leu Val Pro Ile Val Pro Pro Gln Gly Thr Met

210 215 220

Phe Val Leu Glu Met Arg Asp Pro Ala Leu Gly Arg Arg Cys Gly Cys

225 230 235 240

Val Leu Val Glu Ser Glu Cys Val Cys Lys Arg Glu Lys Leu Leu Gly

245 250 255

Asp Val Leu Cys Leu Val His His His Arg Asp Pro Ser Ala Val Leu

260 265 270

Gly Lys Cys Ser Ser Ser Ile Lys Ala Ala Leu Cys Thr Gly Phe His

275 280 285

Leu Asp Val Cys Lys Thr Val Gln Trp Phe Arg Asn Met Met Gly Asn

290 295 300

Ala Trp Ala Leu Val Ala His Lys Tyr Asp Phe Lys Leu Ser Leu Pro

305 310 315 320

Pro Ser Thr Thr Ser Cys Lys Leu Arg Leu Asp Tyr Arg Ser Gly Arg

325 330 335

Phe Leu Ser Ile His Leu Val Leu Gly Val Gln Arg Glu Asp Thr Leu

340 345 350

Val Tyr Leu Val Ser Gln Ala Pro Asp Gln Glu Gln Leu Thr Ser Val

355 360 365

Asp Trp Pro Glu Ser Phe Val Ala Cys Glu His Leu Phe Leu Lys Leu

370 375 380

Val Gly Arg Phe Ala Pro Glu Asn Thr Cys His Leu Lys Cys Leu Gln

385 390 395 400

Ile Ile Leu Ser Leu Arg Gln His Gln Ser Leu Pro His Gly Ala Ser

405 410 415

Arg Pro Ile Leu Thr Ser Tyr His Phe Lys Thr Ala Leu Met His Leu

420 425 430

Leu Leu Arg Leu Pro Leu Thr Asp Trp Ala His Asn Met Leu Ser Gln

435 440 445

Arg Leu Gln Asp Ile Leu Trp Phe Leu Gly Arg Gly Leu Gln Gln Arg

450 455 460

Ser Leu His His Phe Leu Ile Gly Asn Asn Phe Leu Pro Leu Thr Ile

465 470 475 480

Pro Ile Pro Lys Thr Phe Arg Asn Ala Glu Pro Val Asn Leu Phe Gln

485 490 495

His Leu Val Leu Asn Pro Lys Ala His Ser Gln Ala Val Glu Glu Phe

500 505 510

Gln Asn Leu Leu Thr Gln Val Lys Thr Leu Pro His Ala Pro Leu Ala

515 520 525

Ala Ala Pro Asp Tyr Lys Asp Asp Asp Lys

530 535

<210> 2

<211> 310

<212> PRT

<213> Artificial Sequence（人工序列）

<220>

<223> ITPRIPL1-Fc重组蛋白

<400> 2

His Pro Leu Met Val Ser Asp Arg Met Asp Leu Asp Thr Leu Ala Arg

1 5 10 15

Ser Arg Gln Leu Glu Lys Arg Met Ser Glu Glu Met Arg Leu Leu Glu

20 25 30

Met Glu Phe Glu Glu Arg Lys Arg Ala Ala Glu Gln Arg Gln Lys Ala

35 40 45

Glu Asn Phe Trp Thr Gly Asp Thr Ser Ser Asp Gln Leu Val Leu Gly

50 55 60

Lys Lys Asp Met Gly Trp Pro Phe Gln Ala Asp Gly Gln Glu Gly Pro

65 70 75 80

Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu

85 90 95

Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp

100 105 110

Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp

115 120 125

Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly

130 135 140

Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn

145 150 155 160

Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp

165 170 175

Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro

180 185 190

Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu

195 200 205

Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn

210 215 220

Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile

225 230 235 240

Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr

245 250 255

Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys

260 265 270

Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys

275 280 285

Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu

290 295 300

Ser Leu Ser Pro Gly Lys

305 310

<210> 3

<211> 461

<212> PRT

<213> Artificial Sequence（人工序列）

<220>

<223> 13B7A6H3抗体重链HC

<400> 3

Met Glu Trp Arg Ile Phe Leu Phe Ile Leu Ser Gly Thr Ala Gly Val

1 5 10 15

His Ser Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Glu Leu Val Lys Pro

20 25 30

Gly Ala Ser Val Arg Met Ser Cys Lys Thr Ser Gly Tyr Thr Phe Thr

35 40 45

Asp Tyr Val Ile Ser Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu

50 55 60

Trp Ile Gly Glu Ile Phe Pro Arg Thr Gly Ser Thr Tyr Tyr Asn Glu

65 70 75 80

Asn Phe Lys Ala Thr Ala Thr Leu Thr Ala Asp Lys Ser Ser Asn Thr

85 90 95

Ala Tyr Met Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Ala Tyr

100 105 110

Phe Cys Ala Phe Ile Thr Ser Val Asp Trp Ala Met Glu Tyr Trp Gly

115 120 125

Gln Gly Thr Ser Val Thr Val Ser Ser Ala Lys Thr Thr Pro Pro Ser

130 135 140

Val Tyr Pro Leu Ala Pro Gly Ser Ala Ala Gln Thr Asn Ser Met Val

145 150 155 160

Thr Leu Gly Cys Leu Val Lys Gly Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val

165 170 175

Thr Trp Asn Ser Gly Ser Leu Ser Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala

180 185 190

Val Leu Gln Ser Asp Leu Tyr Thr Leu Ser Ser Ser Val Thr Val Pro

195 200 205

Ser Ser Thr Trp Pro Ser Glu Thr Val Thr Cys Asn Val Ala His Pro

210 215 220

Ala Ser Ser Thr Lys Val Asp Lys Lys Ile Val Pro Arg Asp Cys Gly

225 230 235 240

Cys Lys Pro Cys Ile Cys Thr Val Pro Glu Val Ser Ser Val Phe Ile

245 250 255

Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Val Leu Thr Ile Thr Leu Thr Pro Lys

260 265 270

Val Thr Cys Val Val Val Asp Ile Ser Lys Asp Asp Pro Glu Val Gln

275 280 285

Phe Ser Trp Phe Val Asp Asp Val Glu Val His Thr Ala Gln Thr Gln

290 295 300

Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Phe Arg Ser Val Ser Glu Leu

305 310 315 320

Pro Ile Met His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Phe Lys Cys Arg

325 330 335

Val Asn Ser Ala Ala Phe Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys

340 345 350

Thr Lys Gly Arg Pro Lys Ala Pro Gln Val Tyr Thr Ile Pro Pro Pro

355 360 365

Lys Glu Gln Met Ala Lys Asp Lys Val Ser Leu Thr Cys Met Ile Thr

370 375 380

Asp Phe Phe Pro Glu Asp Ile Thr Val Glu Trp Gln Trp Asn Gly Gln

385 390 395 400

Pro Ala Glu Asn Tyr Lys Asn Thr Gln Pro Ile Met Asp Thr Asp Gly

405 410 415

Ser Tyr Phe Val Tyr Ser Lys Leu Asn Val Gln Lys Ser Asn Trp Glu

420 425 430

Ala Gly Asn Thr Phe Thr Cys Ser Val Leu His Glu Gly Leu His Asn

435 440 445

His His Thr Glu Lys Ser Leu Ser His Ser Pro Gly Lys

450 455 460

<210> 4

<211> 238

<212> PRT

<213> Artificial Sequence（人工序列）

<220>

<223> 13B7A6H3抗体轻链LC

<400> 4

Met Lys Leu Pro Val Arg Leu Leu Val Leu Met Phe Trp Ile Pro Gly

1 5 10 15

Ser Ser Ser Asp Val Val Met Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu Pro Val

20 25 30

Ser Leu Gly Asp Gln Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Glu Ser Leu

35 40 45

Val Asn Ser Lys Gly Asn Thr His Leu His Trp Tyr Leu Gln Lys Pro

50 55 60

Gly Gln Ser Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser

65 70 75 80

Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr

85 90 95

Leu Lys Ile Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Leu Gly Val Tyr Phe Cys

100 105 110

Ser Gln Ser Thr His Ala Pro Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu

115 120 125

Glu Ile Lys Arg Ala Asp Ala Ala Pro Thr Val Ser Ile Phe Pro Pro

130 135 140

Ser Ser Glu Gln Leu Thr Ser Gly Gly Ala Ser Val Val Cys Phe Leu

145 150 155 160

Asn Asn Phe Tyr Pro Lys Asp Ile Asn Val Lys Trp Lys Ile Asp Gly

165 170 175

Ser Glu Arg Gln Asn Gly Val Leu Asn Ser Trp Thr Asp Gln Asp Ser

180 185 190

Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Met Ser Ser Thr Leu Thr Leu Thr Lys Asp

195 200 205

Glu Tyr Glu Arg His Asn Ser Tyr Thr Cys Glu Ala Thr His Lys Thr

210 215 220

Ser Thr Ser Pro Ile Val Lys Ser Phe Asn Arg Asn Glu Cys

225 230 235

<210> 5

<211> 119

<212> PRT

<213> Artificial Sequence（人工序列）

<220>

<223> 13B7A6H3重链可变区VH

<400> 5

Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala

1 5 10 15

Ser Val Arg Met Ser Cys Lys Thr Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Tyr

20 25 30

Val Ile Ser Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile

35 40 45

Gly Glu Ile Phe Pro Arg Thr Gly Ser Thr Tyr Tyr Asn Glu Asn Phe

50 55 60

Lys Ala Thr Ala Thr Leu Thr Ala Asp Lys Ser Ser Asn Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Met Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Ala Tyr Phe Cys

85 90 95

Ala Phe Ile Thr Ser Val Asp Trp Ala Met Glu Tyr Trp Gly Gln Gly

100 105 110

Thr Ser Val Thr Val Ser Ser

115

<210> 6

<211> 113

<212> PRT

<213> Artificial Sequence（人工序列）

<220>

<223> 13B7A6H3轻链可变区VL

<400> 6

Asp Val Val Met Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu Pro Val Ser Leu Gly

1 5 10 15

Asp Gln Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Glu Ser Leu Val Asn Ser

20 25 30

Lys Gly Asn Thr His Leu His Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser

35 40 45

Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro

50 55 60

Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile

65 70 75 80

Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Leu Gly Val Tyr Phe Cys Ser Gln Ser

85 90 95

Thr His Ala Pro Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys

100 105 110

Arg

<210> 7

<211> 8

<212> PRT

<213> Artificial Sequence（人工序列）

<220>

<223> 13B7A6H3/18B12D1A6抗体HCDR1

<400> 7

Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Tyr Val

1 5

<210> 8

<211> 8

<212> PRT

<213> Artificial Sequence（人工序列）

<220>

<223> 13B7A6H3/18B12D1A6抗体HCDR2

<400> 8

Ile Phe Pro Arg Thr Gly Ser Thr

1 5

<210> 9

<211> 12

<212> PRT

<213> Artificial Sequence（人工序列）

<220>

<223> 13B7A6H3/18B12D1A6抗体HCDR3

<400> 9

Ala Phe Ile Thr Ser Val Asp Trp Ala Met Glu Tyr

1 5 10

<210> 10

<211> 11

<212> PRT

<213> Artificial Sequence（人工序列）

<220>

<223> 13B7A6H3抗体LCDR1

<400> 10

Glu Ser Leu Val Asn Ser Lys Gly Asn Thr His

1 5 10

<210> 11

<211> 9

<212> PRT

<213> Artificial Sequence（人工序列）

<220>

<223> 13B7A6H3抗体LCDR3

<400> 11

Ser Gln Ser Thr His Ala Pro Tyr Thr

1 5

<210> 12

<211> 461

<212> PRT

<213> Artificial Sequence（人工序列）

<220>

<223> 18B12D1A6抗体重链HC

<400> 12

Met Glu Trp Arg Ile Phe Leu Phe Ile Leu Ser Gly Thr Ala Gly Val

1 5 10 15

His Ser Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Glu Leu Val Lys Pro

20 25 30

Gly Ala Ser Val Lys Met Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr

35 40 45

Asp Tyr Val Ile Ser Trp Val Lys Gln Arg Thr Gly Gln Gly Leu Glu

50 55 60

Trp Ile Gly Glu Ile Phe Pro Arg Thr Gly Ser Thr Tyr Phe Asn Glu

65 70 75 80

Asn Phe Lys Ala Lys Ala Thr Leu Thr Ala Asp Lys Ser Ser Asn Thr

85 90 95

Ala Tyr Met Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Ala Tyr

100 105 110

Phe Cys Ala Phe Ile Thr Ser Val Asp Trp Ala Met Glu Tyr Trp Gly

115 120 125

Gln Gly Thr Ser Val Thr Val Ser Ser Ala Lys Thr Thr Pro Pro Ser

130 135 140

Val Tyr Pro Leu Ala Pro Gly Ser Ala Ala Gln Thr Asn Ser Met Val

145 150 155 160

Thr Leu Gly Cys Leu Val Lys Gly Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val

165 170 175

Thr Trp Asn Ser Gly Ser Leu Ser Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala

180 185 190

Val Leu Gln Ser Asp Leu Tyr Thr Leu Ser Ser Ser Val Thr Val Pro

195 200 205

Ser Ser Thr Trp Pro Ser Glu Thr Val Thr Cys Asn Val Ala His Pro

210 215 220

Ala Ser Ser Thr Lys Val Asp Lys Lys Ile Val Pro Arg Asp Cys Gly

225 230 235 240

Cys Lys Pro Cys Ile Cys Thr Val Pro Glu Val Ser Ser Val Phe Ile

245 250 255

Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Val Leu Thr Ile Thr Leu Thr Pro Lys

260 265 270

Val Thr Cys Val Val Val Asp Ile Ser Lys Asp Asp Pro Glu Val Gln

275 280 285

Phe Ser Trp Phe Val Asp Asp Val Glu Val His Thr Ala Gln Thr Gln

290 295 300

Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Phe Arg Ser Val Ser Glu Leu

305 310 315 320

Pro Ile Met His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Phe Lys Cys Arg

325 330 335

Val Asn Ser Ala Ala Phe Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys

340 345 350

Thr Lys Gly Arg Pro Lys Ala Pro Gln Val Tyr Thr Ile Pro Pro Pro

355 360 365

Lys Glu Gln Met Ala Lys Asp Lys Val Ser Leu Thr Cys Met Ile Thr

370 375 380

Asp Phe Phe Pro Glu Asp Ile Thr Val Glu Trp Gln Trp Asn Gly Gln

385 390 395 400

Pro Ala Glu Asn Tyr Lys Asn Thr Gln Pro Ile Met Asp Thr Asp Gly

405 410 415

Ser Tyr Phe Val Tyr Ser Lys Leu Asn Val Gln Lys Ser Asn Trp Glu

420 425 430

Ala Gly Asn Thr Phe Thr Cys Ser Val Leu His Glu Gly Leu His Asn

435 440 445

His His Thr Glu Lys Ser Leu Ser His Ser Pro Gly Lys

450 455 460

<210> 13

<211> 238

<212> PRT

<213> Artificial Sequence（人工序列）

<220>

<223> 18B12D1A6抗体轻链LC

<400> 13

Met Lys Leu Pro Val Arg Leu Leu Val Leu Met Phe Trp Ile Pro Ala

1 5 10 15

Ser Ser Ser Asp Val Val Met Thr Gln Ile Pro Leu Ser Leu Pro Val

20 25 30

Ser Leu Gly Asp Gln Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu

35 40 45

Ala Asn Ser Lys Gly Asn Thr His Leu His Trp Tyr Leu Gln Lys Pro

50 55 60

Gly Gln Ser Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser

65 70 75 80

Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr

85 90 95

Leu Lys Ile Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Leu Gly Leu Tyr Phe Cys

100 105 110

Ser Gln Ser Thr His Val Pro Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu

115 120 125

Glu Ile Lys Arg Ala Asp Ala Ala Pro Thr Val Ser Ile Phe Pro Pro

130 135 140

Ser Ser Glu Gln Leu Thr Ser Gly Gly Ala Ser Val Val Cys Phe Leu

145 150 155 160

Asn Asn Phe Tyr Pro Lys Asp Ile Asn Val Lys Trp Lys Ile Asp Gly

165 170 175

Ser Glu Arg Gln Asn Gly Val Leu Asn Ser Trp Thr Asp Gln Asp Ser

180 185 190

Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Met Ser Ser Thr Leu Thr Leu Thr Lys Asp

195 200 205

Glu Tyr Glu Arg His Asn Ser Tyr Thr Cys Glu Ala Thr His Lys Thr

210 215 220

Ser Thr Ser Pro Ile Val Lys Ser Phe Asn Arg Asn Glu Cys

225 230 235

<210> 14

<211> 119

<212> PRT

<213> Artificial Sequence（人工序列）

<220>

<223> 18B12D1A6重链可变区VH

<400> 14

Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala

1 5 10 15

Ser Val Lys Met Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Tyr

20 25 30

Val Ile Ser Trp Val Lys Gln Arg Thr Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile

35 40 45

Gly Glu Ile Phe Pro Arg Thr Gly Ser Thr Tyr Phe Asn Glu Asn Phe

50 55 60

Lys Ala Lys Ala Thr Leu Thr Ala Asp Lys Ser Ser Asn Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Met Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Ala Tyr Phe Cys

85 90 95

Ala Phe Ile Thr Ser Val Asp Trp Ala Met Glu Tyr Trp Gly Gln Gly

100 105 110

Thr Ser Val Thr Val Ser Ser

115

<210> 15

<211> 114

<212> PRT

<213> Artificial Sequence（人工序列）

<220>

<223> 18B12D1A6轻链可变区VL

<400> 15

Asp Val Val Met Thr Gln Ile Pro Leu Ser Leu Pro Val Ser Leu Gly

1 5 10 15

Asp Gln Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu Ala Asn Ser

20 25 30

Lys Gly Asn Thr His Leu His Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser

35 40 45

Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro

50 55 60

Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile

65 70 75 80

Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Leu Gly Leu Tyr Phe Cys Ser Gln Ser

85 90 95

Thr His Val Pro Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys

100 105 110

Arg Ala

<210> 16

<211> 11

<212> PRT

<213> Artificial Sequence（人工序列）

<220>

<223> 18B12D1A6抗体LCDR1

<400> 16

Gln Ser Leu Ala Asn Ser Lys Gly Asn Thr His

1 5 10

<210> 17

<211> 9

<212> PRT

<213> Artificial Sequence（人工序列）

<220>

<223> 18B12D1A6抗体LCDR3

<400> 17

Ser Gln Ser Thr His Val Pro Tyr Thr

1 5

<210> 18

<211> 15

<212> PRT

<213> Artificial Sequence（人工序列）

<220>

<223> 肽段P1

<400> 18

His Pro Leu Met Val Ser Asp Arg Met Asp Leu Asp Thr Leu Ala

1 5 10 15

<210> 19

<211> 15

<212> PRT

<213> Artificial Sequence（人工序列）

<220>

<223> 肽段P2

<400> 19

Val Ser Asp Arg Met Asp Leu Asp Thr Leu Ala Arg Ser Arg Gln

1 5 10 15

<210> 20

<211> 15

<212> PRT

<213> Artificial Sequence（人工序列）

<220>

<223> 肽段P3

<400> 20

Met Asp Leu Asp Thr Leu Ala Arg Ser Arg Gln Leu Glu Lys Arg

1 5 10 15

<210> 21

<211> 15

<212> PRT

<213> Artificial Sequence（人工序列）

<220>

<223> 肽段P4

<400> 21

Thr Leu Ala Arg Ser Arg Gln Leu Glu Lys Arg Met Ser Glu Glu

1 5 10 15

<210> 22

<211> 15

<212> PRT

<213> Artificial Sequence（人工序列）

<220>

<223> 肽段P5

<400> 22

Ser Arg Gln Leu Glu Lys Arg Met Ser Glu Glu Met Arg Leu Leu

1 5 10 15

<210> 23

<211> 15

<212> PRT

<213> Artificial Sequence（人工序列）

<220>

<223> 肽段P6

<400> 23

Glu Lys Arg Met Ser Glu Glu Met Arg Leu Leu Glu Met Glu Phe

1 5 10 15

<210> 24

<211> 15

<212> PRT

<213> Artificial Sequence（人工序列）

<220>

<223> 肽段P7

<400> 24

Ser Glu Glu Met Arg Leu Leu Glu Met Glu Phe Glu Glu Arg Lys

1 5 10 15

<210> 25

<211> 15

<212> PRT

<213> Artificial Sequence（人工序列）

<220>

<223> 肽段P8

<400> 25

Arg Leu Leu Glu Met Glu Phe Glu Glu Arg Lys Arg Ala Ala Glu

1 5 10 15

<210> 26

<211> 15

<212> PRT

<213> Artificial Sequence（人工序列）

<220>

<223> 肽段P9

<400> 26

Met Glu Phe Glu Glu Arg Lys Arg Ala Ala Glu Gln Arg Gln Lys

1 5 10 15

<210> 27

<211> 15

<212> PRT

<213> Artificial Sequence（人工序列）

<220>

<223> 肽段P10

<400> 27

Glu Arg Lys Arg Ala Ala Glu Gln Arg Gln Lys Ala Glu Asn Phe

1 5 10 15

<210> 28

<211> 15

<212> PRT

<213> Artificial Sequence（人工序列）

<220>

<223> 肽段P11

<400> 28

Ala Ala Glu Gln Arg Gln Lys Ala Glu Asn Phe Trp Thr Gly Asp

1 5 10 15

<210> 29

<211> 15

<212> PRT

<213> Artificial Sequence（人工序列）

<220>

<223> 肽段P12

<400> 29

Arg Gln Lys Ala Glu Asn Phe Trp Thr Gly Asp Thr Ser Ser Asp

1 5 10 15

<210> 30

<211> 15

<212> PRT

<213> Artificial Sequence（人工序列）

<220>

<223> 肽段P13

<400> 30

Glu Asn Phe Trp Thr Gly Asp Thr Ser Ser Asp Gln Leu Val Leu

1 5 10 15

<210> 31

<211> 15

<212> PRT

<213> Artificial Sequence（人工序列）

<220>

<223> 肽段P14

<400> 31

Thr Gly Asp Thr Ser Ser Asp Gln Leu Val Leu Gly Lys Lys Asp

1 5 10 15

<210> 32

<211> 15

<212> PRT

<213> Artificial Sequence（人工序列）

<220>

<223> 肽段P15

<400> 32

Ser Ser Asp Gln Leu Val Leu Gly Lys Lys Asp Met Gly Trp Pro

1 5 10 15

<210> 33

<211> 15

<212> PRT

<213> Artificial Sequence（人工序列）

<220>

<223> 肽段P16

<400> 33

Leu Val Leu Gly Lys Lys Asp Met Gly Trp Pro Phe Gln Ala Asp

1 5 10 15

<210> 34

<211> 15

<212> PRT

<213> Artificial Sequence（人工序列）

<220>

<223> 肽段P17

<400> 34

Lys Lys Asp Met Gly Trp Pro Phe Gln Ala Asp Gly Gln Glu Gly

1 5 10 15

Claims

1.一种ITPRIPL1的表位肽，所述表位肽的氨基酸序列如SEQ ID NO:25所示。

2.权利要求1所述的表位肽在筛选能够高效阻断ITPRIPL1与CD3E和/或SEMA3G的结合的结合蛋白中的用途，所述用途包含使候选结合蛋白与所述表位肽接触，能够与所述表位肽特异性结合的所述候选结合蛋白被确定为能够高效阻断ITPRIPL1与CD3E和/或SEMA3G的结合。

3.权利要求1所述的表位肽在筛选能够促进PBMC细胞杀伤肿瘤细胞的结合蛋白中的用途，所述用途包含使候选结合蛋白与所述表位肽接触，能够与所述表位肽特异性结合的所述候选结合蛋白被确定为能够促进PBMC细胞杀伤肿瘤细胞。

4.一种特异性结合ITPRIPL1的抗体或其抗原结合片段，其中HCDR1的氨基酸序列如SEQID NO:7所示，HCDR2的氨基酸序列如SEQ ID NO:8所示，HCDR3的氨基酸序列如SEQ ID NO:9所示，且其中LCDR1的氨基酸序列如SEQ ID NO:10所示，LCDR2的氨基酸序列为KV，LCDR3的氨基酸序列如SEQ ID NO:11所示。

5.根据权利要求4所述的抗体或其抗原结合片段，其包括氨基酸序列SEQ ID NO:5所示的重链可变区以及氨基酸序列SEQ ID NO:6所示的轻链可变区。

6.一种特异性结合ITPRIPL1的抗体或其抗原结合片段，其中HCDR1的氨基酸序列如SEQID NO:7所示，HCDR2的氨基酸序列如SEQ ID NO:8所示，且HCDR3的氨基酸序列如SEQ IDNO:9所示，且其中LCDR1的氨基酸序列如SEQ ID NO:16所示，LCDR2的氨基酸序列为KV，LCDR3的氨基酸序列如SEQ ID NO:17所示。

7.根据权利要求6所述的抗体或其抗原结合片段，其包括氨基酸序列SEQ ID NO: 14所示的重链可变区以及氨基酸序列SEQ ID NO: 15所示的轻链可变区。

8.根据权利要求4-7中任一项所述的抗体或其抗原结合片段，其包括抗体重链恒定区，且所述抗体重链恒定区源自人IgG重链恒定区。

9.根据权利要求4-7中任一项所述的抗体或其抗原结合片段，其包括抗体轻链恒定区，且所述抗体轻链恒定区包括人Igκ恒定区。

10.根据权利要求4-5中任一项所述的抗体或其抗原结合片段，其包含抗体重链HC，且所述HC包含SEQ ID NO:3所示的氨基酸序列。

11.权利要求6-7中任一项所述的抗体或其抗原结合片段，其包含抗体重链HC，且所述HC包含SEQ ID NO: 12所示的氨基酸序列。

12.根据权利要求4-5中任一项所述的抗体或其抗原结合片段，其包含抗体轻链LC，且所述LC包含SEQ ID NO:4所示的氨基酸序列。

13.根据权利要求6-7中任一项所述的抗体或其抗原结合片段，其包含抗体轻链LC，且所述LC包含SEQ ID NO: 13所示的氨基酸序列。

14.根据权利要求4-7中任一项所述的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗原结合片段选自以下组：Fab，Fab’， F(ab)₂、Fv片段、 F(ab’)₂，scFv和di-scFv。

15.根据权利要求4-7中任一项所述的抗体或其抗原结合片段，所述ITPRIPL1包含人ITPRIPL1。

16.嵌合抗原受体，其包含权利要求4-15中任一项所述的抗体或其抗原结合片段。

17.免疫偶联物，其包含权利要求4-15中任一项所述的抗体或其抗原结合片段。

18.分离的一种或多种核酸分子，其编码权利要求4-15中任一项所述的抗体或其抗原结合片段或权利要求16所述的嵌合抗原受体。

19.载体，其包含权利要求18所述的核酸分子。

20.细胞，其包含权利要求18所述的核酸分子或权利要求19所述的载体。

21.药物组合物，其包含权利要求4-15中任一项所述的抗体或其抗原结合片段、权利要求16所述的嵌合抗原受体、权利要求17所述的免疫偶联物，以及任选地药学上可接受的佐剂。

22.制备权利要求4-15中任一项所述的抗体或其抗原结合片段的方法，所述方法包括在使得权利要求4-15中任一项所述的抗体或其抗原结合片段表达的条件下，培养权利要求20所述的细胞。

23.权利要求4-15中任一项所述的抗体或其抗原结合片段、权利要求16所述的嵌合抗原受体、权利要求17所述的免疫偶联物、和/或权利要求21所述的药物组合物在制备药物中的用途，所述药物用于预防、缓解和/或治疗肿瘤。

24.根据权利要求23所述的用途，其中，所述肿瘤包括淋巴瘤。