CN116568322A

CN116568322A - 针对covid-19的免疫原性或疫苗组合物的新用途

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Publication number: CN116568322A
Application number: CN202280007129.8A
Authority: CN
Inventors: N·施拉格; F·霍尔泽; J·布洛梅; D·德斯梅奇
Original assignee: Eye Vaccine Co
Current assignee: Eye Vaccine Co
Priority date: 2021-03-22
Filing date: 2022-03-22
Publication date: 2023-08-08

Abstract

本发明涉及针对SARS‑CoV‑2的免疫原性或疫苗组合物，用于治疗Covid‑19，其特征在于，所述组合物施用于眼粘膜和/或泌尿生殖粘膜上。

Description

针对COVID-19的免疫原性或疫苗组合物的新用途

背景技术

除了全身免疫系统，我们的机体还包含粘膜相关免疫系统(称为MALT，粘膜相关淋巴组织)。粘膜局部地包含其自身的免疫系统，例如在消化道中(GALT，肠相关淋巴组织)、在鼻中(NALT，鼻相关淋巴组织)或甚至在眼中(CALT，结膜相关淋巴组织)。

事实上，病原体进入体内的部位一般在眼、鼻、口或胃肠道的粘膜附近。因此，我们的机体直接在这些粘膜上包含大量的细胞和生化防御机制，这些机制在与病原体接触时激活。通常，粘膜的免疫系统包括上皮细胞、先天免疫细胞和树突细胞，它们是先天免疫和特异性(获得性)免疫之间的界面。因此，粘膜可含有先天免疫细胞、免疫活性细胞、记忆细胞和抗体产生细胞。

在经历了病原体的原发性感染后，机体产生针对该病原体的全身性(血清)免疫。此外，如果病原体与机体的粘膜接触，除了全身免疫之外，还产生粘膜免疫。

可以产生粘膜免疫的疫苗是已知的。这些疫苗基本上通过鼻或口服途径施用。它们呈现出在粘膜和全身水平诱导保护性免疫应答的独特优势。它们还靶向阻断作为大多数细菌和病毒病原体的通道的粘膜的穿过(blocking crossing)。例如，这是通过鼻喷雾剂施用的流感疫苗或甚至口服施用的脊髓灰质炎疫苗的情况。雪貂中通过眼部途径的流感病毒(甲流病毒)疫苗接种也在文章Eyedrop Vaccination Induced Systemicand Mucosal Immunity against Influenza Virus in Ferrets de Sangchul Yoon,Eun-Do Kim,Min-Suk Song,Soo Jung Han,Tae Kwann Park,Kyoung Sub Choi,Young-KiChoi,and Kyoung Yul Seo；PLoS One.2016；11(6):e0157634中进行了研究。Kyoung YulSeo、Soo Jung Han、Hye-Ran Cha、Sang-Uk Seo、Joo-Hye Song、So-Hyang Chung和Mi-NaKweon的团队还在小鼠中研究了眼部途径接种(Eye Mucosa:An Efficient VaccineDelivery Route for Inducing Protective Immunity；J.Immunol 2010；185:3610-3619)，虽然小鼠不是病毒的天然宿主。

在病原体定殖于粘膜并且具有高度传染性的情况下，病原体在定殖于粘膜之后迅速地繁殖，使得粘膜和更深层的感染进展得比生物体能够建立有效的免疫力而消除病原体更快。这是目前严重急性呼吸综合征冠状病毒2(SARS-CoV-2)感染的典型情况。事实上，COVID-19(或2019年冠状病毒病)主要表现为粘膜感染和炎症，并伴有继发性严重全身疾病，流感、疱疹或脊髓灰质炎也是如此。

当前的COVID-19大流行导致前所未有的研究，特别是为了开发疫苗，现在已经批准了几种COVID-19疫苗用于为全球群体接种疫苗。此类疫苗的实例有：(1)Pfizer/BioNTech mRNA疫苗，通常称为Bnt162b2或(2)Moderna mRNA疫苗，通常称为Moderna mRNA-1273、Spikevax或Moderna COVID-19疫苗；(3)阿斯利康的非复制型病毒载体疫苗，通常称为ChAdOx1-S或阿斯利康COVID-19疫苗；(4)Janssen/Johnson&Johnson的非复制型病毒载体疫苗，通常称为Ad26COV2.S、JMJ Vaccine或J&JCOVID-19；(5)Gamaleya的非复制型病毒载体疫苗，通常称为Sputnik V或Gam-COVID-Vac；(6)Sinovac R&D的含佐剂的抗COVID-19全灭活疫苗，通常称为CoronaVac；或者(7)Novavax的含佐剂(MatrixM)的重组纳米颗粒亚单位疫苗，通常称为Nuvaxovid或NVX-CoV2373。

目前所有可用的COVID-19疫苗均通过肌肉注射途径施用。因此，它们产生良好的全身免疫力，从而限制疾病的严重进展，但它们不用于在粘膜中形成免疫力。然而，粘膜中的这种免疫力对于预防新感染至关重要，否则SARS-CoV-2感染的风险将仍然很高。

此外，目前可用的疫苗数量仍然太少，这些疫苗可能产生的副作用(例如罕见的血栓形成)也是一些人担心的问题，这些人因此不愿接种疫苗。

因此，仍然需要改进全球人口对COVID-19的疫苗接种，以此作为摆脱这场大流行危机的一种方式。

发明内容

本发明通过一种新的COVID-19疫苗接种模式解决了这一需求，该模式可以提高免疫力(双重免疫——全身免疫和粘膜免疫——实际上产生针对病原体的更好的保护，从而有助于集体免疫的形成)，同时也降低了与疫苗接种相关的严重副作用的风险。因此，本发明用于形成IgM型免疫球蛋白，然后是IgG型免疫球蛋白，尤其是分泌型IgA型免疫球蛋白(粘膜上的sIgA)。本发明还旨在提供一种最有效的新的COVID-19疫苗接种模式。

本发明还旨在提供一种新的COVID-19疫苗接种模式，该模式实施起来更简单、更快捷，从而提高疫苗接种速度。

本发明用于通过靶向眼粘膜和/或泌尿生殖粘膜来形成针对SARS-CoV-2的粘膜免疫力。本发明还旨在形成一种称为杀菌(sterilizing)的免疫力。事实上，本发明的一个目的是靶向粘膜以主要形成IgA型免疫球蛋白(单体IgA，但也有粘膜上的二聚体IgA和分泌型IgA)，特别是为了阻断病毒在呼吸道粘膜中的复制(这可能通过IgA型而不是IgG型免疫球蛋白实现)。

因此，本发明涉及针对SARS-CoV-2的免疫原性或疫苗组合物，其用于预防和/或治疗Covid-19，其特征在于其施用于眼粘膜和/或泌尿生殖粘膜上。

施用这种组合物的目的在于建立针对SARS-CoV-2的粘膜免疫力和血清免疫力。这种双重免疫力有助于更好地保护生物体免受病毒侵害并限制感染风险，而不会出现严重的全身性副作用，而这些副作用(特别是罕见的血栓形成病例)目前可能是肌肉注射的一些疫苗造成的。事实上，在本发明的情况下，由于血清免疫是通过粘膜免疫间接获得的，因此预计不会发生血栓事件。

根据本发明，表述―免疫原性组合物”和/或―疫苗组合物”应理解为是指在施用于受试者后诱导针对SARS-CoV-2的免疫反应的组合物。疫苗组合物特别用于形成免疫力，更具体地说是针对SARS-CoV-2的保护性和适应性免疫反应。这种免疫反应可以是体液的和/或细胞的。这种免疫力也旨在正在形成免疫的。

根据本发明，术语―SARS-CoV-2”应理解为是指属于冠状病毒科、β冠状病毒属和Sarbecovirus亚属的病毒。它是一种具有螺旋衣壳的包膜病毒，其基因组由约30,000个核苷酸的单链RNA组成。SARS-CoV-2病毒粒子的结构特别包括一个由N蛋白形成的螺旋衣壳、一个由M蛋白形成的基质和一个脂质包膜，其中至少包含两种蛋白质类型：S(糖)蛋白(刺突)和小包膜蛋白(E)(以及潜在的血凝素酯酶(HE))。通过产生中和抗体，S蛋白和变体是免疫反应的主要目标。这种表面蛋白结合ACE2受体(在许多组织中表达)，从而使病毒能够穿透受污染生物体的细胞。S蛋白包含两个亚基，S1和S2。S1包括受体结合结构域(RBD)，其包含受体结合基序(RBM)。S2亚基包含融合肽，所述融合肽允许细胞宿主(受污染的生物体)的细胞膜与病毒包膜融合。

更具体地说，根据本发明，术语―SARS-CoV-2”应理解为表示其序列最初在GenBank中以登录号MN908947描述的病毒，以及该病毒的所有变体，特别是英国变体、南非变体、印度变体和巴西/日本变体。通常，这被理解为特别是指称为Alpha(B.1.1.7)、Beta(B.1.351)、Gamma(P.1)、Delta(B.1.617.2)和Omicron(B.1.1.529)的变体。这也被理解为是指变体B.1.640、B.1.427、B.1.429、B.1.616、B.1.525、P.3、B.1.617.2、B.1.620、B.1.617.3、B.1.214.2、A.23.1、A.27、A.28、C.16、B.1.351、B.1.526、B.1.526.1、B.1.526.2、P.2、B.1.1.519、AV.1、AT.1、C.36、B.1.621、C.37、AY.4.2、B.1.1.318、B.1.617.2、C.1.2或BA.2。有关SARS-CoV-2序列、突变和变体序列的信息可以在例如以下链接中找到：https://www.ncbi.nlm.nih.gov/sars-cov-2/；https://www.cdc.gov/coronavirus/2019-ncov/cases-updates/variant-survei llance/variant-info.html ；https://www.ecdc.europa.eu/en/covid-19/variants-concern ；https://www.gisaid.org/。

根据本发明，表述―预防Covid-19”应理解为预防(prophylaxis)。根据本发明的免疫原性或疫苗组合物的施用特别用于阻断或降低形成Covid-19的风险，和/或在适用时降低形成称之为重度(意指具有严重症状，例如呼吸困难和/或需要住院，通常在重症监护病房)的疾病形式的风险。根据本发明的免疫原性或疫苗组合物的施用还可以阻断或降低病毒传播的风险，通常是从一个人传播到另一个人。根据一个具体的实施方案，将根据本发明的用于预防Covid-19的免疫原性或疫苗组合物施用于未被SARS-CoV-2污染，优选未被感染的受试者。

根据本发明，表述―治疗Covid-19”应理解为治疗。根据本发明的免疫原性或疫苗组合物的施用实际上可以被认为是为了刺激机体的自然防御，即使人是已经最低限度地被病毒污染。根据一个具体实施方案，将根据本发明的用于治疗Covid-19的免疫原性或疫苗组合物施用于已被SARS-CoV-2污染和/或感染的受试者。

优选地，本发明涉及针对SARS-CoV-2的免疫原性或疫苗组合物，其用于预防Covid-19，其特征在于其施用于眼粘膜和/或泌尿生殖粘膜上。

根据本发明，表述―眼粘膜”应理解为是指结膜和角膜。结膜是覆盖上眼睑和下眼睑的内表面并且覆盖眼球的前表面的透明粘膜。因此，更确切地说，眼粘膜被理解为是指睑板结膜和球结膜、以及结膜穹窿。

根据本发明，表述―泌尿生殖器粘膜”应理解为是指泌尿和/或生殖系统(男性和女性系统)的粘膜。因此，更确切地说，泌尿生殖器粘膜被理解为意指泌尿生殖道。

眼粘膜和/或泌尿生殖器粘膜的靶向用于靶向粘膜，其(i)本身仅微弱地参与病原体的传播，但(ii)同时具有非常高的免疫活性，其用于非常快速地免疫机体，特别是在呼吸道感染之前。

本发明人的非限制性假设之一是，事实上，SARS-CoV-2对眼睛的感染导致免疫力的快速形成，使得机体赢得时间，从而当污染和/或感染在机体中进展到鼻子时，机体已经免疫。污染和/或感染从眼睛到鼻子的这种进展可以通过连接鼻子和眼睛的鼻泪管的存在来解释。在由APC病毒(Adeno-Pharyngo结膜炎，流行性角膜炎型腺病毒)引起的角膜炎病例中，已经描述了鼻泪管感染。这种疾病的典型进展始于通过飞沫感染结膜，并且表现为严重的结膜炎，随后是咽炎。这也可以解释为什么受试者，特别是医务人员，在发生对SARS-CoV-2呈阳性的结膜炎后，产生了针对SARS-CoV-2的全身免疫力。

优选地，将所述免疫原性或疫苗组合物施用于眼粘膜上。

根据另一个甚至更优选的实施方案，本发明因此涉及针对SARS-CoV-2的免疫原性或疫苗组合物，其用于预防Covid-19，其特征在于它施用于眼粘膜上。

根据本发明，所述免疫原性或疫苗组合物可以仅施用于一只眼中或两只眼中，优选施用于两只眼。与需要增加组织性和医疗工作的肌肉内施用疫苗不同(例如，准备注射器，在对疫苗接种的严重反应的情况下需要可用的复苏设备等)，在眼粘膜上的注射(通常通过滴眼液)实施起来更简单和快速。事实上，严重的风险(例如上述血栓形成的风险)降低了，严重的过敏风险也降低了，过敏风险主要表现为眼睛刺痛感、流泪或甚至红眼。通过滴眼液的疫苗接种可以进一步用于更快和更大规模的疫苗接种。

根据一个实施方案，所述免疫原性或疫苗组合物可以作为疫苗接种计划的第一剂或作为加强剂施用于一只或两只眼中。根据一个实施方案，在至少一次肌内施用免疫原性或疫苗组合物之前或之后，将所述免疫原性或疫苗组合物施用于眼粘膜和/或泌尿生殖粘膜上。优选地，在至少一次肌肉内施用免疫原性或疫苗组合物之前或之后，将所述免疫原性或疫苗组合物施用于眼粘膜上。优选地，在至少一次肌肉内施用疫苗组合物之前或之后，将所述疫苗组合物施用于眼粘膜上。通常，这意味着受试者第一次肌肉内接种疫苗，然后在粘膜，特别是眼粘膜上施用加强剂。这也可能意味着受试者第一次肌内接种疫苗，一种或多种加强免疫也是肌内接种的，然后一剂或多剂额外的加强免疫是通过粘膜，特别是眼部施用进行的。如果需要新的加强剂来靶向SARS-CoV-2病毒的特定变体，则在一次或多次肌内注射疫苗后，在眼粘膜和/或泌尿生殖粘膜上施用免疫原性或疫苗组合物可能具有吸引力。通常，在至少一次肌肉内施用免疫原性或疫苗组合物后，在眼粘膜和/或泌尿生殖道粘膜上施用根据本发明的免疫原性或疫苗组合物，目的是在第一次肌肉内施用后增强获得性免疫力。这也意味着可以在眼粘膜和/或泌尿生殖粘膜上进行免疫原性或疫苗组合物的第一次施用，并且可以在相同的粘膜上或通过肌肉内途径进行加强。

根据一个实施方案，所述免疫原性或疫苗组合物包含一种或多种用于引起针对SARS-CoV-2的免疫反应的物质。通常，根据本发明的所述免疫原性或疫苗组合物包含一种或多种SARS-CoV-2抗原。优选地，所述抗原对SARS-CoV-2具有特异性。

根据一个实施方案，免疫或疫苗组合物用于引起针对SARS-CoV-2的免疫反应，一旦它包含至少一种针对SARS-CoV-2的抗原，微生物(例如病毒或细菌)可以产生针对SARS-CoV-2的至少一种抗原，或者它包含表达SARS-CoV-2的至少一种抗原(通常是mRNA)所必需的遗传物质。在第一种情况下，抗原将在施用后立即与粘膜接触，而在第二种和第三种情况下，可以预期有一段潜伏期，即组合物施用后产生抗原的时间。优选地，所述微生物本身不致病，它可能引起的唯一免疫反应是与SARS-CoV-2抗原相关的免疫反应。

根据具体实施方案，用于引起针对SARS-CoV-2的免疫反应的物质/抗原选自：(i)灭活的SARS-CoV-2病毒，(ii)减毒的SARS-CoV-2病毒(iii)修饰的SARS-CoV-2病毒，优选是灭活或减毒的，其表达或能够表达一种或多种SARS-CoV-2抗原(例如SARS-CoV-2病毒蛋白)，(iv)遗传修饰的微生物(例如细菌或病毒，优选是灭活或减毒的)，其表达或能够表达一种或多种SARS-CoV-2抗原(例如SARS-CoV-2病毒蛋白)，(v)信使核糖核酸(mRNA)，其编码一种或多种SARS-CoV-2抗原(如SARS-CoV-2病毒蛋白)，(vi)脱氧核糖核酸(DNA)，其编码一种或多种SARS-CoV-2抗原(如SARS-CoV-2病毒蛋白)，(vii)SARS-CoV-2病毒蛋白或其一个或多个片段，或(viii)包含SARS-CoV-2病毒蛋白的融合蛋白或其一个或多个片段。……用于引起针对SARS-CoV-2的免疫反应的物质/抗原也可能是(ix)SARS-CoV-2病毒，表示未灭活或未减毒的活病毒，或甚至(x)重组细胞(例如树突细胞)，其表达或能够表达一种或多种SARS-CoV-2抗原，(xi)DNA质粒，其编码一种或多种SARS-CoV-2抗原(例如SARS-CoV-2病毒蛋白)，或(xii)假病毒颗粒，其包含一种或多种SARS-CoV-2抗原。根据具体实施方案，用于引起针对SARS-CoV-2的免疫反应的物质/抗原是表达或能够表达一种或多种SARS-CoV-2抗原(例如SARS-CoV-2病毒蛋白)或SARS-CoV-2病毒的遗传修饰的微生物，优选是表达或能够表达一种或多种SARS-CoV-2抗原(例如病毒载体)的遗传修饰的微生物(特别是腺病毒)。病毒蛋白片段优选包含免疫显性表位或其生物类似物。根据一个实施方案，病毒蛋白片段是免疫原性片段。所述病毒蛋白片段可以是重组的。

根据一个具体实施方案，用于引起针对SARS-CoV-2的免疫反应的物质/抗原选自：(i)灭活的SARS-CoV-2病毒，(ii)灭活的SARS-CoV-2病毒(iii)修饰的SARS-CoV-2病毒，优选灭活或减毒的，其表达或能够表达一种或多种抗原(例如SARS-CoV-2病毒的病毒蛋白)SARS-CoV-2病毒(iv)遗传修饰的微生物(例如细菌或病毒，优选灭活或减毒的)，其表达或能够表达一种或多种SARS-CoV-2抗原(如SARS-CoV-2病毒蛋白)，(v)信使核糖核酸(mRNA)，其编码一种或多种SARS-CoV-2抗原(例如SARS-CoV-2病毒蛋白)，(vi)脱氧核糖核酸(DNA)，其编码一种或多种SARS-CoV-2抗原(例如SARS-CoV-2病毒蛋白)，(vii)SARS-CoV-2病毒。

根据本发明的组合物可以包含一种或多种用于引起针对SARS-CoV-2的免疫反应的物质(抗原)。根据一个实施方案，各种物质(抗原)可以针对同一病毒的不同部分(例如病毒蛋白上的不同表位)、同一病毒的不同毒株、同一病毒的变体和甚至几种不同的病毒(联合疫苗)。根据本发明的免疫原性或疫苗组合物因此可以是单价或多价的。单价免疫原性或疫苗组合物针对单一病原体提供保护，而多价免疫原性或疫苗组合物针对多种病原体提供保护。

根据一个实施方案，表述―SARS-CoV-2病毒蛋白”更具体地理解为是指病毒的结构蛋白和辅助蛋白，优选结构蛋白。以这种方式，根据一个实施方案，所述病毒蛋白选自：S、HE、M、N或E蛋白或ORF蛋白，更具体地为，ORF1a、ORF1b、ORF3、ORF6、ORF7a、ORF7b、ORF8a、ORF8b。优选地，所述病毒蛋白选自S、HE、M、N或E蛋白，更具体地为S、HE、M或E，甚至更具体地为S蛋白。S蛋白的免疫原性片段更具体地是受体结合结构域(RBD)、S1亚基或S1亚基和S2亚基之间的切割区。根据本发明，病毒蛋白应理解为是指病毒的天然蛋白(例如在自然界中发现的病毒蛋白)、与天然蛋白或合成蛋白(修饰的、突变的或未修饰的)相比突变或变异的蛋白。

将根据本发明的免疫原性或疫苗组合物施用于受试者。根据一个实施方案，所述免疫原性或疫苗组合物用于预防和/或治疗人的Covid-19。根据一个实施方案，所述免疫原性或疫苗组合物用于预防和/或治疗儿童或成人的Covid-19，特别是成人的Covid-19。根据本发明，成人应理解为从16岁开始的人，优选地从18岁开始的人。进一步更优选地，成人的年龄大于或等于18岁且至多55岁。根据一个实施方案，可以将所述免疫原性或疫苗组合物施用于至少12岁的受试者。根据一个实施方案，可以将所述免疫原性或疫苗组合物施用于至少5岁的受试者。根据一个实施方案，所述免疫原性或疫苗组合物还用于预防和/或治疗婴儿和55岁以上的人的Covid-19。

根据另一个实施方案，可以想到根据本发明的所述免疫原性或疫苗组合物的兽医应用。在这种情况下，受试者是动物。

根据一个实施方案，所述免疫原性或疫苗组合物以免疫学上的有效量施用于受试者。这样的量可以由从业者确定。表述―免疫有效量”应理解为意指有效预防和/或治疗的足够量，特别是在需要这种预防或这种治疗的受试者中。作为一个实例，对于阿斯利康非复制病毒载体疫苗、Sputnik V疫苗、强生疫苗、Sinovac灭活COVID-19疫苗，甚至是Novavax的Nuvaxovid疫苗，间隔至少一周，优选2到12周的一到几次眼内滴剂或结膜下注射中的每一个中的疫苗组合物的剂量可以为0.005mL-0.05mL。

根据一个实施方案，将所述免疫原性组合物或疫苗组合物施用于尚未被引起感染的SARS-CoV-2病毒污染或甚至感染的受试者，或者施用于已经被引起感染的SARS-CoV-2病毒污染或甚至感染的受试者(该人可能已出现症状(轻度或重度)或无症状)。

根据一个实施方案，所述免疫原性或疫苗组合物在眼粘膜和/或泌尿生殖器粘膜上施用一次或几次，优选一次、两次或三次。根据一个具体的实施方案，所述免疫原性或疫苗组合物在眼粘膜和/或泌尿生殖器粘膜上施用至少两次(换句话说，施用两个剂量的免疫原性或疫苗组合物)。根据一个具体的实施方案，当免疫原性或疫苗组合物施用几次时，其靶向相同的粘膜：例如在眼粘膜上施用两次或三次，或在泌尿生殖器粘膜上施用两次或三次。优选地，第一次和第二次施用至少间隔一周，更具体地包括4至12周的时间。―1至12周”是指(7至84天的天数)1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11或12周，或7至84天。

根据一个实施方案，所述免疫原性或疫苗组合物作为滴剂、冻干物或其他干燥形式施用。根据一个实施方案，所述免疫原性或疫苗组合物还可以作为干燥、粉末、凝胶、纳米颗粒或发油组合物(pomade composition)形式施用。通常，当以滴剂形式施用时，意味着所述免疫原性或疫苗组合物是液体制剂，并且当以冻干物或干燥组合物形式施用时，所述免疫原性或疫苗组合物是粉末形式。所述粉末可以直接施加到粘膜上，或者施加在滤纸、聚合物、凝胶、纳米颗粒或发油或任何其它适当的将与眼粘膜和/或泌尿生殖器粘膜接触的物质支持物上。因此，免疫原性或疫苗组合物将从滤纸、聚合物、凝胶或任何其它合适的物质或支持物转移至眼粘膜和/或泌尿生殖器粘膜。可以在冷冻根据本发明的免疫原性或疫苗组合物，然后用任何合适的技术进行干燥(除了冷冻干燥，其用于获得冻干物)之后获得所述干燥的组合物。

根据一个实施方案，所述免疫原性或疫苗组合物通过使用施用器施用，例如这使得滴注滴剂(滴眼辅助类型)或粉末或冻干物更容易。施用器也可以是安瓿、注射器、滤纸(具有例如流体或冻干物)、滴管瓶、单剂量施用装置、阴道螺旋型或海绵型施用装置，或甚至织物、包括改性外表面(即所述表面包括用于引起针对SARS-CoV-2的免疫反应的一种或多种物质，例如蛋白质、病毒载体等)的卫生棉塞，或包括改性外表面的避孕套等。

根据一个实施方案，免疫原性或疫苗组合物包含一种或多种用于引起针对SARS-CoV-2的免疫反应的物质(抗原)或由其组成。根据一个实施方案，可以认为根据本发明的免疫原性组合物包含在疫苗组合物(疫苗)中。也可以使用术语―疫苗”或―针对Covid-19的疫苗”来代替―疫苗组合物”。例如，根据本发明的免疫原性或疫苗组合物包含(1)Pfizer/BioNTech mRNA疫苗，通常称为Bnt162b2或(2)Moderna mRNA疫苗，通常称为Moderna mRNA-1273或Moderna COVID-19疫苗；(3)阿斯利康的非复制型病毒载体疫苗，通常称为ChAdOx1-S或阿斯利康COVID-19疫苗，或其等效的(4)Janssen的非复制型病毒载体疫苗，一般称为Ad26COV2.S、JMJ疫苗或J&J COVID-19；(5)Gamaleya的非复制型病毒载体疫苗，通常称为Sputnik V或Gam-COVID-Vac，甚至其轻型版本称为Sputnik light；(6)Sinovac R&D的含佐剂的抗COVID-19全灭活疫苗，通常称为CoronaVac；(7)Novavax的含佐剂(Matrix M)的重组纳米颗粒亚单位疫苗，通常称为Nuvaxovid、Corovax或NVX-CoV2373；(8)Medicago的带有SARS-CoV-2刺突蛋白的病毒样颗粒疫苗，通常称为(9)Baylor College of Medicine/BioELimited的蛋白亚单位疫苗，通常称为或BioE COVID-19；(10)CadilaHealthcare的基于DNA质粒的疫苗，通常称为ZyCoV-D；或甚至(11)Bharat Biotech的灭活病毒疫苗，通常称为

根据优选实施方案，疫苗组合物包含佐剂和/或赋形剂。

根据一个实施方案，所述免疫原性或疫苗组合物包含药学上可接受的媒介物。

佐剂和/或赋形剂和/或药学上可接受的媒介物是常规使用的那些。例如，药学上可接受的媒介物可以是用于在通过眼部途径施用或在泌尿生殖器粘膜上施用之前稀释组合物的溶剂或溶液。

根据一个实施方案，根据本发明的免疫原性或疫苗组合物还可以包含一种或多种附加物质。优选地，所述附加物质选自：

-防腐剂，

-标记物，例如着色剂，

-表面活性剂，和

-添加剂。

根据一个实施方案，根据本发明的免疫原性或疫苗组合物的特征在于其在施用第一标记物(例如着色剂)之后和施用第二标记物(例如着色剂)之前施用。因此，根据本发明的免疫原性或疫苗组合物在两个标记物之间施用。这两种标记物，优选是不同的，的施用用于验证根据本发明的免疫原性或疫苗组合物被正确施用至粘膜，特别是眼粘膜。

例如，防腐剂可以是抗微生物防腐剂，其目的是阻止免疫原性或疫苗组合物的微生物污染。根据本发明，防腐剂是与粘膜相容的防腐剂。

根据本发明，―标记物”应理解为意指可以在免疫原性或疫苗组合物中施用的任何可测量或指示物质。因此，它涉及药学上可接受的标记物。标记物还用于验证施用量和/或施用部位，这样做是为了确保免疫原性或疫苗组合物的安全和有效应用。

根据具体实施方案，标记物用于量化和/或可视化所述免疫原性或疫苗组合物在眼粘膜和/或泌尿生殖粘膜上的应用。更具体地，量化被理解为是指测量所施用的免疫原性或疫苗组合物的量。根据一个实施方案，标记物是指示物质，例如着色剂。例如，可以使用荧光素或吲哚菁型着色剂。该标记物特别用于追踪免疫原性或疫苗组合物在眼和/或泌尿生殖粘膜上的应用。着色也可用于追踪免疫原性或疫苗组合物在眼和/或泌尿生殖道粘膜上的溶解。可视化眼和/或泌尿生殖粘膜上的标记物(例如着色)用于确认免疫原性或疫苗组合物被适当地施加到眼和/或泌尿生殖粘膜上，甚至是施用的免疫原性或疫苗组合物的量。

为了获得更高的抗原性并因此获得更大的免疫应答，可以向免疫原性或疫苗组合物中添加例如表面活性剂的物质，以延长在眼和/或泌尿生殖器粘膜上的暴露时间，并可能能够计算所述组合物在粘膜上的暴露时间。

可以添加其他物质，例如添加剂，以赋予免疫原性或疫苗组合物有利的性质，例如改善免疫原性或疫苗组合物在粘膜中的渗透性的物质，或用于延长粘膜和组合物之间的接触时间的物质(例如透明质酸、用于形成水凝胶的一种或多种聚合物(例如卡波姆)、纤维素衍生物等)。

本发明还涉及用于预防和/或治疗受试者的COVID-19的方法，其包括在眼粘膜和/或泌尿生殖器粘膜上施用针对SARS-CoV-2免疫原性或疫苗组合物。更具体地，本发明涉及用于诱导针对SARS-CoV-2的保护性免疫应答的方法，其包括在眼粘膜和/或泌尿生殖器粘膜上施用免疫原性或疫苗组合物。

本发明还涉及针对SARS-CoV-2的免疫原性或疫苗组合物在制备旨在预防和/或治疗Covid-19的药物中的用途，并且其中所述药物旨在施用于眼粘膜和/或泌尿生殖器粘膜。

附图说明

图1：显示了第1组仓鼠的结果。

图2：显示了第2组仓鼠的结果。

图3：显示了病毒暴露前(12小时)所有组的PENH全身体积描记数据。

图4：显示了暴露于SARS-CoV-2病毒3天后所有组的PENH全身体积描记数据。

图5：显示了暴露于SARS-CoV-2病毒5天后所有组的PENH全身体积描记数据。

图6：显示了暴露于SARS-CoV-2病毒7天后所有组的PENH全身体积描记数据。

图7：显示了暴露于SARS-CoV-2病毒12天后所有组的PENH全身体积描记数据。

图8：显示了暴露于SARS-CoV-2病毒14天后所有组的PENH全身体积描记数据。

图9：显示了在各组仓鼠的血清中，在50％的病例中始终抑制SARS-CoV-2感染的最大稀释度(NT50)。

图10：显示了实施例5中测试的四组仓鼠的平均体重。

具体实施方式

实施例1：液体组合物的实施例

下表1总结了可以使用的根据本发明的组合物。

表1：液体组合物

实施例2：冻干组合物的实施例

下表2总结了可以使用的根据本发明的组合物。

表2：冻干组合物

实施例3：通过眼部途径使仓鼠针对SARS-CoV-2免疫

仓鼠具有ACE2受体。因此，它们可能被SARS-CoV-2污染并患病。

1.两组仓鼠两次注射病毒后的比较

研究两组仓鼠。

在第1组中，用3×10⁶个SARS-CoV-2病毒(B.1.214株)通过经鼻注射污染n＝7只仓鼠，并在第2组中，用含有3×10⁶个SARS-CoV-2病毒(B.1.214株)的滴眼液污染n＝7只仓鼠。

在观察期间，第1组的仓鼠生病，可通过显著的体重减轻识别，而第2组的仓鼠没有生病。

实上，从图1中可以看出，第1组的仓鼠从第2天体重开始减轻，其中在第5天减轻最大，并在第12天恢复正常；这表明仓鼠在通过经鼻注射的SARS-CoV-2污染/感染后患病。相比之下，在图2中可以看出，第2组的仓鼠在通过眼部途径接种SARS-CoV-2后体重没有减轻。这表明这些动物保持了良好的健康状况。

14天后，两组再次暴露于含有3×10⁶个SARS-CoV-2病毒剂量的经鼻注射。

在两组中，仓鼠的体重持续增加(见图1和2)。更具体地，在第21天，第1组的动物在吸入第二剂SARS-CoV-2病毒剂量后没有再次患病。这意味着它们已经因为在实验的前10天发展的疾病而获得免疫。

此外，在第21天，第2组的仓鼠在吸入第二剂SARS-CoV-2病毒后没有患病。这意味着仓鼠因为第一次通过眼部途径应用SARS-CoV-2而获得免疫。

因此，第2组的仓鼠通过眼周(epi-ocular)应用获得免疫力，与第1组不同，其是在没有发展严重的全身疾病的情况下获得的。

2.对通过眼部途径注射病毒后的仓鼠的研究

此外，对通过眼部途径接受了含有3×10⁶个SARS-CoV-2病毒剂量的组合物的单次应用的n＝10只其它仓鼠的研究表明，它们产生了高产量的抗病毒中和抗体(血清中至少1:640)。这些结果意味着，通过眼周应用病毒，仓鼠没有发生疾病，并且获得了在血清中可检测到的针对SARS-CoV-2的免疫力。

3.体积描记分析

上述第1组和第2组的肺功能(见第1点)是使用EMKA Technologies的四台单相机全身体积描记器(型号PLT-UNR-RT-3)测量的。每个体积描记室都配备了相同的有线呼吸速度计和相同的压差传感器(EMKA Technologies，型号USB_DP_T)。每个室中的开口允许以恒定速率(500mL/分钟)连续抽取污浊的空气，并通过专用泵(型号VENT_4_PLT)用来自房间的新鲜空气连续替换。每只测试动物的测量活动持续约20分钟。然后使用以下程序记录通过平静和警觉的呼吸在体积描记室中形成的流速信号。在实验前后系统地校准流速。如果检测到偏差超过5％，则拒绝收集的数据并重新开始测量活动。

通过以2kHz对信号进行采样来获取原始数据曲线。首先通过检查流速峰值的恒定性手动评估呼吸模式的规律性。根据这一标准，除了少数咳嗽和梳理毛发的情况外，大多数仓鼠在室内度过的第5至20分钟呼吸正常。与实验小鼠不同，仓鼠是一种可以在几秒钟内从警觉状态进入深度睡眠状态并恢复的动物。这两种状态之间的呼吸模式非常不同，在观察状态下选择规律呼吸的发作至关重要。此外，这些动物的探索行为比小鼠或大鼠强烈得多，并伴有由强烈嗅探组成的特定呼吸模式。因此，选择单次有规律的呼吸发作是不够的。出于这个原因，要分析的发作的选择必须由经验丰富的员工系统地手动完成，然后使用IOX2软件(来自EMKA Technologies的IIOX_1PULMO_4a)处理生成流速曲线。然后分析胸腹流速曲线以测定吸气时间(TI)和呼气时间(TE)、最大吸气流速(PIF)、和最大呼气流速(PEF)和当前体积(TV)。后者在每个周期系统地测量两次，一次在呼吸周期的吸气部分(TI)期间，一次在呼气部分(TE)。计算了另外两个参数：呼气前64％的TV所需的时间，称为松弛时间(RT)，以及Hamelmann等提出的支气管收缩指数(Penh)，使用公式Penh＝[(TE/RT)-1]*(PEF/PIF)(Hamelmann E,Schwarze J,Takeda K,Oshiba A,Larsen GL,Irvin CG,GelfandEW.Noninvasive measurement of airway responsiveness in allergic mice usingbarometric plethysmography.Am J Respir Crit Care Med.1997Sep；156(3Pt1):766-75.doi:10.1164/ajrccm.156.3.9606031.PMID:9309991)。

最后，呼吸频率[RR＝60/(TI+TE)]、分钟通气量(MV＝RR*TV)、平均吸气流速(MIF＝TV/TI)、平均呼气流速(MEF＝TV/TE)和循环比[％TI＝TI/(TI+TE)]也由上述测量的参数和体重(BW)计算得出。根据得到的定量值，系统地测定中值并用于计算仓鼠和进行分析当天的代表性平均值。

结果：

Penh是无量纲的，可用于筛选实验动物肺部窘迫的复合值。

结果以四组的形式显示，如下表3所示。

表3：所分析仓鼠的描述

结果如图3至8所示。

在感染之前，所有动物都有相似的通气模式，无论组别如何(图3)。感染SARS-CoV-2病毒后，观察到两种不同的模式。

首先，G2、G3和G4组动物的模式与感染前观察到的非常相似，没有显著差异，这与G1组不同(图4至6)。

周一，12日(感染后)观察到G1组仓鼠恢复正常(图7和8)。

4.血清中和抗体的评价

将仓鼠的全血样品收集于冷冻管中，在环境温度下凝固1至2小时，并在4℃下储存24小时。然后将血液离心，并将血清置于冷冻管中并在56℃下去补体45分钟。然后将去补体血清储存在-20℃，直到它们用于测定中和抗体滴度。

在96孔培养板上以对数稀释连续滴定病毒原液以获得50％(TCID50)的组织培养感染剂量。每天用倒置光学显微镜观察板，持续五天，以评估细胞病变效应(ECP)的存在，并根据Reed&Muench方法计算最终滴度。

为每只仓鼠储存血清样品用于中和抗体滴度的定量。病毒中和试验是在含有汇合的Vero E6细胞(ATCC CRL-1586)的96孔板中使用SARS-CoV-2的BetaCov/Belgium/SartTilman/2020/1毒株进行的。

使用了每种热灭活血清的九种稀释度(56℃下40分钟)(1:10-1:1280–对应于测试的最终稀释度1:20-1:2580)。稀释是在96孔培养板上的DMEM/FBS中的三个样本中进行的。

将血清(50μL/孔)与相同体积(vol/vol)的含有100TCID50(组织培养感染剂量50)的SARS-CoV-2病毒的溶液混合。

然后将血清-病毒混合物在含5％ CO2的潮湿环境中于37℃孵育1小时。

孵育后，加入100μL Vero细胞悬浮液，以便在每个孔中放置20,000个细胞。然后将板再次孵育五天。对于每种血清，该过程重复两次。五天后，在光学显微镜下评估ECP。显示ECP的血清稀释度被视为非中和(阴性)，而未显示任何ECP的血清稀释度被视为阳性/中和。

将血清病毒中和滴度报告为中和ECP和50％孔(NT50)的最高血清稀释度。对于NT50>1:320的所有血清，通过使用更高的稀释度(高达1:20480)进行第二个过程。

将阳性对照(NT50＝1:160，来自比利时国家人类微生物学参考中心)和阴性对照(盐水溶液)插入每个板中。

结果如图9所示。

实施例4：在鼻腔感染期间SARS-CoV-2的传播的研究

本发明人分析了病毒在由经鼻注射被SARS-CoV-2污染的仓鼠中的传播，如实施例3中所述。

因此，本发明人观察到，在病毒进入鼻后的前48小时内，感染缓慢进展，其中鼻腔感染仅在粘膜中，形成气溶胶。这些气溶胶然后可以感染支气管和肺泡，特别是在吸气期间，并且在呼气期间污染其他人。

实施例5：通过不同的免疫原性或疫苗组合物进行接种

研究了四组新的仓鼠。

在第1组中，在D＝1时，将直接从小瓶中取出(无任何修饰)的20μL含Janssen/Johnson&Johnson非复制型病毒载体(通常称为Ad26COV2.S)的疫苗施用至n＝8只仓鼠的左眼。14天后(D＝14)，奖直接从小瓶中取出(无任何修饰)的20μL相同的疫苗再次施用至n＝8只仓鼠的左眼。

在第2组中，在D＝1时，将直接从小瓶中取出(无任何修饰)的50μL含Janssen/Johnson Johnson非复制型病毒载体(通常称为Ad26COV2.S)的疫苗肌内施用至n＝8只仓鼠的双侧臀部。14天后(D＝14)，将直接从小瓶中取出(无任何修饰)的50μL相同疫苗再次肌内施用至n＝8只仓鼠的双侧臀部。

在第3组中，在第D＝1天，在n＝8只仓鼠的左眼中施用20μLPBS(磷酸盐缓冲盐水)。14天(D＝14)后，再次在n＝8只仓鼠的左眼中施用20μL PBS(磷酸盐缓冲盐水)。

在第4组中，在实验的第14天(D＝14)，在n＝8只仓鼠的双眼中施用20μL含有3×10⁶个SARS-CoV-2病毒(SARS-CoV-2病毒的武汉样变体)(减毒病毒，而非灭活病毒)的溶液。

再过14天(自实验开始后D＝28)后，用200μL含6×10⁶TCID 50(组织培养感染剂量50)的SARS-CoV-2病毒(SARS-CoV-2病毒的武汉样变体)溶液对4组动物进行鼻内污染。

对四个组中的每一组的动物的体重减轻(即仓鼠患病的指标)进行分析。结果示于图10中。曲线显示了四组中仓鼠的平均重量。

结果显示，与第3组的仓鼠不同，第1、2和4组的仓鼠受到保护并且不患病。

实施例6：人眼部疫苗接种。

通过眼部途径进行的疫苗接种已在人中进行了测试。

在肌肉注射后六个月以上，之前肌肉接种COVID-19疫苗的两人(在左臂三角肌注射两次COVID-19疫苗)接受了施用于右眼眼粘膜上的20μL新剂量的COVID-19疫苗。

然后测定血清中的IgG和口腔和咽部粘膜中的IgA，通过在眼粘膜上施用新疫苗剂量的当天，然后在三周后收集血液并用10mL 0.9％氯化钠清洗口腔和咽部两分钟。

结果显示在下面的图4中。

表4：受试者的IgG、IgM和IgA水平

Claims

1.一种针对SARS-CoV-2的免疫原性或疫苗组合物，用于预防和/或治疗Covid-19，其特征在于，所述组合物施用于眼粘膜和/或泌尿生殖粘膜上。

2.根据权利要求1所述的免疫原性或疫苗组合物，其特征在于，所述组合物施用于眼粘膜上。

3.根据前述权利要求中任一项所述的免疫原性或疫苗组合物，其特征在于，所述组合物包含一种或多种用于引起针对SARS-CoV-2的免疫反应的物质。

4.根据权利要求3所述的免疫原性或疫苗组合物，其特征在于，用于引起针对SARS-CoV-2的免疫反应的物质选自SARS-CoV-2病毒、灭活的SARS-CoV-2病毒、减毒的SARS-CoV-2病毒、表达或能够表达一种或多种SARS-CoV-2抗原的修饰的SARS-CoV-2病毒、表达或能够表达一种或多种SARS-CoV-2抗原的遗传修饰的微生物、编码一种或多种SARS-CoV-2抗原(如SARS-CoV-2病毒蛋白)的信使核糖核酸(mRNA)、编码一种或多种SARS-CoV-2抗原(如SARS-CoV-2病毒蛋白)的脱氧核糖核酸(DNA)、SARS-CoV-2病毒蛋白或其一个或多个片段、包含SARS-CoV-2病毒蛋白的融合蛋白或其一个或多个片段、表达或能够表达一种或多种SARS-CoV-2抗原的重组细胞、编码一种或多种SARS-CoV-2抗原的DNA质粒或假病毒颗粒。

5.根据权利要求4所述的免疫原性或疫苗组合物，其中所述病毒蛋白选自：S、HE、M、N或E蛋白或ORF蛋白，优选选自S、M、N或E蛋白。

6.根据权利要求4至5任一项所述的免疫原性或疫苗组合物，其中所述病毒蛋白是S蛋白或其片段，例如受体结合结构域(RBD)、S1亚基或S1亚基与S2亚基之间的切割区。

7.根据前述权利要求中任一项的免疫原性或疫苗组合物，其特征在于，所述组合物以滴剂、冻干物、干燥组合物、粉末、凝胶、纳米颗粒或发油的形式施用。

8.根据前述权利要求中任一项的免疫原性或疫苗组合物，其特征在于，所述组合物通过使用施用器施用。

9.根据前述权利要求中任一项的免疫原性或疫苗组合物，用于预防和/或治疗动物或人的Covid-19，特别用于预防和/或治疗成人的Covid-19。

10.根据前述权利要求中任一项的免疫原性或疫苗组合物，其特征在于，所述组合物还包含一种或多种附加物质。

11.根据权利要求10所述的免疫原性或疫苗组合物，其特征在于，所述附加物质选自：

-防腐剂，

-标记物，特别是指示物质，例如着色剂，

-表面活性剂，和

-添加剂。

12.根据权利要求1至11中任一项所述的免疫原性或疫苗组合物，其特征在于，所述组合物在施用第一标记物之后和施用第二标记物之前施用。

13.根据前述权利要求中任一项所述的免疫原性或疫苗组合物，其特征在于，在至少一次肌肉内施用免疫原性或疫苗组合物之前或之后，进行眼粘膜和/或泌尿生殖粘膜上的施用。