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CN116546991A - mRNA治疗剂对CD4+-T细胞的体内靶向 - Google Patents

mRNA治疗剂对CD4+-T细胞的体内靶向 Download PDF

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CN116546991A
CN116546991A CN202180081589.0A CN202180081589A CN116546991A CN 116546991 A CN116546991 A CN 116546991A CN 202180081589 A CN202180081589 A CN 202180081589A CN 116546991 A CN116546991 A CN 116546991A
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CN
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lipid
cell
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cells
antibody
Prior art date
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Application number
CN202180081589.0A
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哈明德·帕尔兹
德鲁·韦斯曼
伊斯特万·通巴兹
诺贝特·帕尔迪
弗拉基米尔·穆济坎托夫
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University of Pennsylvania Penn
Original Assignee
University of Pennsylvania Penn
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Publication date
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Abstract

本发明涉及包含缀合至靶向结构域的递送载体的组合物，其中递送载体包含至少一种试剂，并且其中靶向结构域特异性结合至CD4+T细胞抗原。本发明还涉及使用所述组合物治疗或预防包括癌症、传染性疾病和免疫学病症的疾病和病症的方法。

Description

mRNA治疗剂对CD4+-T细胞的体内靶向
相关申请的引用
本申请主张2020年10月13日提交的美国临时申请号63/091,010的优先权，该申请以其全部内容作为参考并入本文。
有关联邦政府资助的研究或开发的声明
本发明是在National Institutes of Health提供的经费AI045008的政府支持下进行的。政府对本发明具有一定的权利。
背景技术
通过激活、抑制或修饰调节免疫细胞以改变它们的性质已成为一类被称为免疫治疗的流行且高需求的疗法。目前的免疫治疗剂很大程度上依赖于生物蛋白基试剂，它们是昂贵且难以生产的(Pranchevicius等人,2013,Bioengineered,4:305-312；Liu等人,2018,Precision Clinical Medicine,1:65-74)，或者需要免疫细胞的离体修饰(Schultz等人,2018,Immunotherapy in Translational Cancer Research；Maugeri等人,2019,NatureCommunications,10:4333)。一些实例包括：用于调节免疫细胞功能的抗体或细胞因子、用于重定向免疫功能的单克隆抗体、用于防止病毒感染的T细胞基因编辑和嵌合抗原受体(CAR)T细胞疗法(Schlake等人,2019,Cellular and Molecular Life Sciences,76:301-328；Wraith,2017,Frontiers in immunology 8,1668-1668；Whilding等人,2015,MolOncol,9:1994-2018)。
癌症免疫治疗的最相关应用之一是CAR T细胞疗法。目前，离体产生CAR T细胞，该过程是昂贵的，因为它需要在GMP细胞处理机构中扩增细胞培养物。另外，它不是患有高度恶性癌症、具有极低T细胞计数或者需要大规模使用的背景的患者的治疗选择(Schmidts等人,2018,Frontiers in immunology,9:2593-2593；Zhao等人,2019,Front.Immunol,10:2250；Junghans,2017,Cancer Gene Therapy,24:89-99)。仍非常需要开发体内靶向T细胞的mRNA递送系统以用于稳健且快速产生CAR T细胞。当期望如此时，mRNA基CAR T细胞治疗剂还可以通过降低由于它们的瞬时性质所造成的CAR T细胞诱导的毒性风险以及避免基因组整合风险来提供更安全的平台(Foster等人,2019,Molecular Therapy,27:747-756；Foster等人,2019,Hum Gene Ther,30:168-178；Kowalski等人,2019,Molecular Therapy,27:710-728；Pardi等人,2018,Nat Rev Drug Discov,17:261-279)。此外，mRNA基治疗剂可以提供用于以下的基因编辑工具：治疗病毒感染和癌症，或者修正遗传缺陷，如C-C趋化因子受体5(CCR5)基因的敲除以用于预防T细胞的HIV感染(Didigu等人,2014,Blood,123:61-69；Liu等人,2017,Cell Biosci,7:47)或者程序细胞死亡-1(PD-1)基因的敲除以用于工程化优良的肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)(Bailet等人,2019,Nature Biotechnology,37:1425-1434)。mRNA基免疫治疗剂开发中的重要障碍之一在于有效的体内递送。
因此，本领域需要有效、安全且免疫细胞特异的mRNA递送系统以用于引入和大规模使用当前稳健的mRNA基免疫治疗剂以及新生类型的稳健的mRNA基免疫治疗剂。本发明满足了这种未满足的需要。
附图说明
当结合附图阅读时，将会更好地理解本发明的实施方式的以下详细说明。应理解本发明不局限于附图中所示的实施方式的确切配置和工具。
图1A至图1C显示了靶向CD4的颗粒的体外结合和功能活性。图1A显示了在室温(RT)下培育1小时后，抗-人CD4/125I-标记的mRNA-LNP与人CD4+ T细胞的特异性体外结合。图1B显示了随着mRNA-LNP剂量升高，抗-CD4/mRNA-LNP和对照IgG/mRNA-LNP与人CD4+ T细胞的结合，以及它们相应的平均荧光强度(MFI)。图1C显示了在用抗-人CD4/mRNA-LNP或者对照IgG/mRNA-LNP处理的人CD4+ T细胞中所测量的Luc活性。
图2A和图2B显示了证实Cre mRNA-介导的体外基因重组的实例实验的结果。图2A显示了在CD3+CD8-细胞中，作为ZsGreen1+细胞％提供的Cre mRNA-诱导的基因重组和随后的报告基因表达。从Ai6小鼠收获脾细胞并以1、3、6或9μg每200万个细胞的剂量与CremRNA-LNP一起培育。将通过抗-CD4/mRNA-LNP施用的ZsGreen1+细胞％与对照IgG/mRNALNP和非缀合的mRNA-LNP施用相比较(****P<0.0001，使用Bonferroni修正的双向方差分析)。图2B显示了用于在CD3+CD8-细胞中识别ZsGreen1阳性细胞的设门(gating)策略。
图3显示了证明mRNA-LNP处理的CD3/CD4细胞群的流式细胞术分析的实例实验结果。从Ai6小鼠收获脾细胞并以3μg每200万个细胞每孔的剂量在6孔板中与Cre mRNA-LNP培育过夜。一旦施用抗-CD4/mRNA-LNP，观察到了CD4染色的瞬时消失，而非靶向的LNP处理的细胞未受影响。
图4A至图4D显示了证实将mRNA-LNP体内靶向CD4+ T细胞的实例实验的结果。图4A显示了在0.5小时，在小鼠中125I-标记的抗-CD4/和对照IgG/多聚(C)mRNA-LNP的生物分布。将组织吸收表示为平均值±SEM(****P<0.0001)。图4B显示了定位比，其计算为给定器官的％ID/g与注射后30分钟时，用125I-标记的抗CD4/或对照IgG/mRNA-LNP处理的小鼠血液中的％ID/g之比。显示了平均值±SEM。在mRNA-LNP静脉内注射后，将体内mRNA-LNP结合作为所选器官中放射性标记的抗-CD4/mRNA-LNP的百分比的定量测量(图4C)和脾脏中的定位比(图4D)。组的规模为3只动物。通过具有Bonferroni修正的双向方差分析进行统计分析(****P<0.0001)。
图5A和图5B显示了证实将多聚(C)RNA-LNP体内靶向CD4的实例实验的结果。图5A显示了作为免疫特异性指数的在脾脏和肝脏中的抗-CD4/mRNA-LNP-结合的体内动力学。将免疫特异性指数计算为用抗-CD4/处理的小鼠的所选器官的％ID/g vs.对照IgG/mRNA-LNP的比，其对血液水平归一化。图5B显示了在mRNA-LNP静脉内注射后，作为放射性标记的mRNALNP在所选器官中的百分比的定量测量的对照IgG/mRNA-LNP结合的体内动力学。组的规模为3只动物。
图6A至图6D显示了证实靶向的mRNA-LNP体内表达的生物分布的实例实验结果。对小鼠IV注射8μg mRNA-LNP。通过测量裂解组织中的Luc活性(图6A)和通过发光成像(图6B和图6C)，评价了在施用抗-CD4/和对照IgG/Luc mRNA-LNP后5小时的Luc mRNA表达的器官分布。图6A显示了作为光单位(LU)/mg蛋白的Luc的定量表达。在施用D-萤光素(luciferin)后5分钟，分析了解剖小鼠器官(图6B)和器官除去后的全胴体(显示发光淋巴结)(图6C)的代表性样品组。图6D显示了在得自注射了mRNA-LNP的小鼠脾脏的CD3+细胞制剂中，Luc作为LU/mg蛋白值的定量表达。对于图6A和图6D，误差线表示SEM。组的规模为3只动物。通过具有Bonferroni修正的双向方差分析进行统计分析，(*P<0.05，**P<0.01和***P<0.001)。
图7A至图7E显示了证实体内施用靶向CD4的Cre mRNA-LNP后Cre-介导的基因重组的实例实验结果。图7A显示了描绘抗-CD4/mRNA-LNP对于CD4+ T细胞中的选择性基因重组的靶向递送以及Ai6报告分子等位基因的原理的示意图：loxP-侧接的STOP卡盒的Cre介导的切除使得ZsGreen1(荧光蛋白)能够稳健表达。Ai6小鼠经由IV施用接受3、10和30μg剂量的Cre mRNA-LNP。在处理后24小时收获脾脏和淋巴结，并且使用流式细胞术在脾脏(图7B)和淋巴结(图7C)单细胞混悬液中确定CD3+CD8-细胞群中ZsGreen1+细胞的％。在IV注射10μg mRNA-LNP后，监测了脾脏(图7D)和淋巴结(图7E)中表达ZsGreen1的CD4+ T细胞的数目随时间的变化。在总计3个独立实验中，组的规模为8或9(图7B和图7C)或者6(图7D和图7E)只动物。每个符号代表一只动物并且水平线显示具有SEM的平均值。通过具有Bonferroni修正的双向方差分析进行统计分析。比较了注射不同剂量的抗-CD4/mRNA-LNP[*P<0.05，****P<0.0001]和非缀合的mRNA-LNP[####P<0.0001]后的ZsGreen1+细胞％。
图8A和图8B显示了证实体内施用Cre mRNA-LNP后非T细胞中Cre-介导的基因重组的实例实验结果。Ai6小鼠经由IV施用接受3、10和30μg剂量的Cre mRNA-LNP。在处理后24小时，使用流式细胞术确定了脾脏单细胞混悬液中的脾的树突状细胞(MHCII+CD11c+)(图8A)和巨噬细胞(MHCII+F4/80+)(图8B)中的ZsGreen1+细胞％。在总计3个独立实验中，组的规模为8-9只动物。每个符号代表一只动物并且水平线显示具有SEM的平均值。
图9A至图9C显示了证实不同T细胞亚型对Cre mRNA-LNP的体内吸收的实例实验结果。在用10μg Cre mRNA-LNP处理后24小时收获脾脏，并使用流式细胞术确定CD4+ T细胞亚群中(图9A)和vs.CD25标志物(图9B)的ZsGreen1+细胞的％。原初CD4+ T细胞被认为是CD44-CD62L-，中央记忆T细胞被认为是CD44+CD62L+，而效应记忆T细胞被认为是CD44+CD62L-。组的规模是3-11只动物。每个符号代表一只动物并且水平线显示具有SEM的平均值。通过具有Bonferroni修正的双向方差分析进行统计分析以比较T细胞亚型。图9C显示了用于标识不同CD4+ T细胞亚型中ZsGreen1阳性细胞的设门策略。
图10A和图10B显示了证实使用多次施用的mRNA-LNP靶向效率的实例实验结果。经由IV施用，作为每天注射，注射3天或5天，Ai6小鼠接受了10μg(0.4mg/kg)的抗-CD4/、对照IgG/或者非缀合的Cre mRNA-LNP。在3次或5次顺序注射后收获脾脏和淋巴结，并且使用流式细胞术在脾脏(图10A)和淋巴结(图10B)的单细胞混悬液中确定CD3+CD8-细胞群中的ZsGreen1+细胞的％。组的规模是9只动物。每个符号代表一只动物并且水平线显示平均值。误差线表示SEM。通过具有Bonferroni修正的双向方差分析进行统计分析。比较了不同注射次数的抗-CD4/mRNA-LNP[**P<0.01，****P<0.0001]后的ZsGreen1+细胞％。
具体实施方式
本发明涉及包含缀合至CD4+ T细胞靶向结构域的递送载体(媒介物，介质，vehicle)的组合物，其中所述递送载体包含至少一种试剂。在一个实施方式中，所述靶向结构域特异性结合至CD4。
在某些实施方式中，所述递送载体是包含缀合至所述靶向结构域的PEG-脂质的脂质纳米颗粒。在一些实施方式中，所述至少一种试剂是核酸。在一些实施方式中，所述至少一种试剂是mRNA分子。在一个实施方式中，所述mRNA分子是核苷修饰的mRNA。本发明还涉及使用本文所述的组合物治疗疾病或病症的方法。
定义
除非另外定义，否则本文所使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属领域的技术人员通常理解的含义相同的含义。
如本文所使用的，以下术语中的每一个具有在该部分中与之有关的含义。
冠词“一”和“一种”在本文中用于表示一个或大于一个(即至少一个)所述冠词的语法对象。举例来说，“一种要素”表示一个要素或大于一个要素。
当表示可测值，如量、时距等时，如本文所使用的“约”意味着涵盖了所指定值的±20％、±10％、±5％、±1％或±0.1％的变化，照此这些变化对于实施所公开的方法是适合的。
如本文所使用的术语“抗体”是指特异性结合抗原或表位的免疫球蛋白分子。抗体可以是来源于天然来源或来源于重组来源的完整免疫球蛋白，并且可以是完整免疫球蛋白的免疫活性部分。抗体通常是免疫球蛋白分子的四聚体。本发明中的抗体可以以多种形式存在，例如其包括多克隆抗体、单克隆抗体、Fv、Fab和F(ab)2以及单链抗体和人源化抗体(Harlow等人,1999,In:Using Antibodies:A Laboratory Manual,Cold Spring HarborLaboratory Press,NY；Harlow等人,1989,In:Antibodies:A Laboratory Manual,ColdSpring Harbor,New York；Houston等人,1988,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85:5879-5883；Bird等人,1988,Science 242:423-426)。
术语“抗体片段”是指全抗体的一部分并且是指全抗体的抗原决定可变区。抗体片段的实例包括但不限于Fab、Fab'、F(ab')2和Fv片段、线性抗体、scFv抗体和由抗体片段形成的多重特异性抗体。
如本文所使用的“抗体重链”是指以其天然存在的构象存在于所有抗体分子中的两种类型的多肽链中较大的多肽链。
如本文所使用的“抗体轻链”是指以其天然存在的构象存在于所有抗体分子中的两种类型的多肽链中较小的多肽链。κ和l轻链表示两种主要的抗体轻链同种型。
如本文所使用的术语“合成抗体”表示使用DNA重组技术所产生的抗体，例如通过噬菌体所表达的抗体。还应将该术语视为表示已通过编码所述抗体的DNA分子的合成产生并且所述DNA分子表达指明所述抗体的抗体蛋白质或氨基酸序列的抗体，其中已使用在本领域中可用的并且熟知的合成DNA或氨基酸序列技术获得了所述DNA或氨基酸序列。该术语还应被理解为表示通过编码所述抗体的RNA分子的合成产生的抗体。所述RNA分子表达抗体蛋白质，或者表示所述抗体的氨基酸序列，其中已通过在本领域中可用且熟知的转录DNA(合成或克隆)或其它技术获得RNA。
“疾病”是动物的健康状态，其中所述动物不可以维持体内平衡，并且其中如果所述疾病未得到改善，则所述动物的健康持续变差。相反，动物中的“病症”是其中所述动物能够维持体内平衡，但是其中所述动物的健康状态不如不存在所述病症的情况下的状态良好的健康状态。如果保持不治疗，则病症不必需导致所述动物的健康状态进一步降低。
如本文所使用的“有效量”是指提供治疗或预防益处的量。
“编码”是指多核苷酸中的特定核苷酸序列(如基因、cDNA或mRNA)用作生物过程中用于具有限定的核苷酸序列(即，rRNA、tRNA和mRNA)或者具有从中所获得的限定的氨基酸序列和生物学性质的其它聚合物和大分子的合成的模板的固有性质。因此，如果对应于所述基因的mRNA的转录和翻译在细胞或其它生物系统中产生了蛋白，则所述基因编码所述蛋白。其核苷酸序列与mRNA序列相同并且通常在序列表中提供的编码链以及用作基因或cDNA转录的模板的非编码链两者可以称为编码该基因或cDNA的蛋白或其它产物。
“表达载体(expression vector)”是指包含重组多核苷酸的载体，所述重组多核苷酸包含可操作性地连接至要表达的核苷酸序列的表达控制序列。表达载体包含对于表达来说足够的顺式作用元件；其它用于表达的元件可以通过宿主细胞或体外表达系统提供。表达载体包括本领域中已知的所有那些载体，如粘粒、质粒(例如，裸质粒或包含在脂质体中的质粒)、RNA和病毒(例如，慢病毒、反转录病毒、腺病毒和腺病毒相关病毒)，所述载体引入了重组多核苷酸。
“同源的”是指两个多肽之间或者两个核酸分子之间的序列相似性或序列同一性。当两条所比较的序列的两者中的位置被相同碱基或氨基酸单体亚基占据，例如，如果两个DNA分子中的每一个中的位置被腺嘌呤占据，则所述分子在该位置是同源的。两条序列之间的同源性百分比是两条序列共有的匹配或同源位置数目除以所比较的位置数目再×100。例如，如果两条序列的10个位置中有6个匹配或同源，则所述两条序列是60％同源的。举例来说，DNA序列ATTGCC和TATGGC共有50％的同源性。一般地，当两条序列比对时进行比较以提供最大同源性。
“分离的”表示相对于天然状态改变或从天然状态中除去。例如，天然存在于活体动物中的核酸或肽不是“分离的”，但是与其天然状态中共存的材料部分或完全分离的相同的核酸或肽是“分离的”。分离的核酸或蛋白可以处于基本纯的形式，或者可以存在于非天然环境中，例如宿主细胞中。
在本发明的背景中，使用了常见核酸(通过N-糖苷键结合至核糖或脱氧核糖的核碱基)的下列缩写。“A”是指腺苷，“C”是指胞苷，“G”是指鸟苷，“T”是指胸腺嘧啶核苷并且“U”是指尿苷。
除非另作说明，否则“编码氨基酸序列的核苷酸序列”包括作为彼此的简并形式并且编码相同氨基酸序列的所有核苷酸序列。短语编码蛋白或RNA的核苷酸序列还可以包括内含子，从而在一些形式中，编码所述蛋白的核苷酸序列可以含有内含子。
如本文所使用的，术语“调节”表示与不存在治疗或化合物的受试者中的应答水平相比和/或与相同但未治疗的受试者中的应答水平相比，介导受试者中的应答水平的可检测的升高或降低。该术语涵盖了干扰和/或影响受试者、优选地人中的天然信号或应答，借此介导有益治疗应答。
除非另作说明，否则“编码氨基酸序列的核苷酸序列”包括作为彼此的简并形式并且编码相同氨基酸序列的所有核苷酸序列。编码蛋白和RNA的核苷酸序列可以包括内含子。另外，所述核苷酸序列可以含有能够通过细胞中的翻译器进行翻译的修饰的核苷。例如，在一些方面，所述核苷酸序列包含mRNA，其中一些或全部尿苷已被假尿苷、1-甲基假尿苷或者另一种修饰的核苷替代。
术语“可操作性地连接的”是指调控序列和异源核酸序列之间的功能性连接，其致使后者表达。例如，当第一核酸序列与第二核酸序列处于功能关系时，第一核酸序列与第二核酸序列可操作性地连接。例如，如果启动子影响编码序列的转录或表达，则所述启动子可操作性地连接至编码序列。一般地，在相同阅读框中，可操作性地连接的DNA或RNA序列是邻接的，并且必要时，连接两个蛋白编码区。
术语“患者”、“受试者”、“个体”等在本文中是可互换使用的并且表示无论体外还是原位，对本文所述的方法起反应的任何动物或其细胞。在某些非限制性实施方式中，所述患者、受试者或个体是人。
如本文所使用的术语“多核苷酸”的定义为核苷酸链。此外，核酸是核苷酸的聚合物。因此，如本文所使用的核酸和多核苷酸是可互换的。本领域技术人员具有以下常识：核酸是多核苷酸，其可以水解为单体“核苷酸”。所述单体核苷酸可以水解为核苷。如本文所使用的多核苷酸包括但不限于通过本领域中可用的任何方式获得的所有核酸序列，所述方式无限制地包括重组方式(即，使用常规克隆技术和PCRTM等从重组文库或细胞基因组中对核酸序列的克隆)，和通过合成方式。
在某些情况下，本发明所述的多核苷酸或核酸是“核苷修饰的核酸”，其是指包含至少一个修饰的核苷的核酸。“修饰的核苷”是指具有修饰的核苷。例如，已在RNA中识别了超过100种不同的核苷修饰(Rozenski等人,1999,The RNA Modification Database:1999update.Nucl Acids Res 27:196-197)。
在一些实施方式中，“假尿苷”是指，在另一个实施方式中，m1acp3Y(1-甲基-3-(3-氨基-3-羧丙基)假尿苷)。在另一个实施方式中，该术语是指m1Y(1-甲基假尿苷)。在另一个实施方式中，该术语是指Ym(2'-O-甲基假尿苷)。在另一个实施方式中，该术语是指m5D(5-甲基二氢尿苷)。在另一个实施方式中，该术语是指m3Y(3-甲基假尿苷)。在另一个实施方式中，该术语是指未进一步修饰的假尿苷部分。在另一个实施方式中，该术语是指任何以上假尿苷的单磷酸酯、二磷酸酯或三磷酸酯。在另一个实施方式中，该术语是指本领域中已知的任何其它假尿苷。每种可能性代表了本发明的单独的实施方式。
如本文所使用的，术语“肽”、“多肽”和“蛋白质”是可互换使用的并且表示由通过肽键共价连接的氨基酸残基组成的化合物。蛋白或肽必须含有至少两个氨基酸，并且不限制可以组成蛋白或肽序列的最大氨基酸数目。多肽包括包含通过肽键彼此连接在一起的两个或更多个氨基酸的任何的肽或蛋白。如本文所使用的，该术语是指短链和长链两者，所述短链在本领域中通常也被称为肽、寡肽和寡聚物，并且长链在本领域中通常被称为蛋白，其存在多种类型。例如，“多肽”包括生物学活性片段、基本同源的多肽、寡肽、同型二聚体、杂二聚物、多肽的变体、修饰的多肽、衍生物、类拟物、融合蛋白等。多肽包括天然肽、重组肽、合成肽或它们的组合。
将如本文所使用的术语“启动子”定义为被细胞的合成器或引入的合成器识别的DNA序列，它是起始多核苷酸序列的特异性转录所需的。例如，通过噬菌体RNA聚合酶识别启动子并且将其用于通过体外转录产生mRNA。
对于亲和配体、具体地抗体来说，如本文所使用的术语“特异性结合”表示识别特异性抗原，但是基本不识别或结合样品中的其它分子的抗体。例如，特异性结合至来自一个物种的抗原的抗体还可以结合至来自一个或多个其它物种的抗原。但是，这种物种间的反应性本身不改变抗体作为特异性的分类。在另一个实例中，特异性结合至抗原的抗体还可以结合至所述抗原不同的等位基因形式。然而，这种交叉反应性本身不改变抗体作为特异性的分类。在一些情况下，术语“特异性结合”或“特异结合”可以参照抗体、蛋白或肽与第二化学物质的相互作用，用于表示所述相互作用取决于所述化学物质上特定结构(例如，抗原决定簇或表位)的存在；例如，抗体识别并结合至特异性蛋白结构，而不是一般性的蛋白。如果抗体对表位“A”特异，则在含有标记的“A”和所述抗体的反应中，含有表位A的分子(或者游离的未标记的A)的存在将降低标记的A结合至所述抗体的量。
如本文所使用的术语“治疗性的”表示治疗和/或预防。通过抑制、减少、缓解或消除疾病或病症的至少一种病征或症状获得治疗效果。
术语“治疗有效量”是指将引起研究人员、兽医、医生或其它临床医师所探寻的组织、系统或受试者的生物或医学应答的受试化合物的量。术语“治疗有效量”包括当施用时，足以预防正在治疗的疾病或病症的一种或多种病征和/或症状的发展或者在某种程度上减轻所述一种或多种病征和/或症状的化合物的量。治疗有效量将基于化合物、疾病及其严重程度、要治疗的受试者的年龄、体重等而改变。
作为本文中所使用的术语，“治疗”疾病表示降低受试者所经历的疾病或病症的至少一种病征或症状的频率或严重程度。
如本文所使用的术语“转染”或“转化”或“转导”是指将外源核酸转移或引入宿主细胞的过程。“转染”或“转化”或“转导”的细胞是已用外源核酸转染、转化或转导的细胞。细胞包括原代受试者细胞及其子代。
如本文所使用的短语“受转录控制”或者“可操作性连接的”表示启动子相对于多核苷酸处于正确位置和取向以控制通过RNA聚合酶的转录起始和多核苷酸的表达。
“载体(vector)”是包含分离的核酸并且可以用于向细胞内部递送分离的核酸的物质组合物。多种载体在本领域中是已知的，其包括但不限于线性多核苷酸、与离子或两亲性化合物缔合的多核苷酸、质粒和病毒。因此，术语“载体”包括自主复制质粒或病毒。该术语还应被视为包括有利于核酸向细胞递送的非质粒和非病毒化合物，例如聚赖氨酸化合物、脂质体等。病毒载体的实例包括但不限于腺病毒载体、腺病毒相关病毒载体、反转录病毒载体等。
“烷基”是指仅由碳和氢原子组成的直链或支链烃链基团，它是饱和或不饱和的(即，含有一个或多个双键和/或三键)，具有1至24个碳原子(C1-C24烷基)、1至12个碳原子(C1-C12烷基)、1至8个碳原子(C1-C8烷基)或者1至6个碳原子(C1-C6烷基)并且通过单键连接至所述分子的其余部分，例如，甲基、乙基、正丙基、1-甲基乙基(异丙基)、正丁基、正戊基、1,1二甲基乙基(叔丁基)、3甲基己基、2甲基己基、乙烯基、丙1烯基、丁-1-烯基、戊-1-烯基、戊-1,4-二烯基、乙炔基、丙炔基、丁炔基、戊炔基、己炔基等。除非另外具体指明，否则烷基是任选地取代的。
“亚烷基”或“亚烷基链”是指将所述分子的其余部分连接至基团的直链或支链二价烃链，其仅由碳和氢组成，它是饱和或不饱和的(即，含有一个或多个双键(亚烯基)和/或三键(亚炔基))并且例如具有1至24个碳原子(C1-C24亚烷基)、1至15个碳原子(C1-C15亚烷基)、1至12个碳原子(C1-C12亚烷基)、1至8个碳原子(C1-C8亚烷基)、1至6个碳原子(C1-C6亚烷基)、2至4个碳原子(C2-C4亚烷基)、1至2个碳原子(C1-C2亚烷基)，例如，亚甲基、亚乙基、亚丙基、正亚丁基、亚乙烯基、亚丙烯基、正亚丁烯基、亚丙炔基、正亚丁炔基等。亚烷基链通过单键或双键连接至所述分子的其余部分并且通过单键或双键连接至基团。亚烷基链与所述分子的其余部分以及与基团的附接点可以通过链内的一个碳或任意两个碳。除非在说明书中另有具体说明，否则亚烷基链可以是任选地取代的。
“环烷基”或“碳环”是指仅由碳和氢原子组成的稳定非芳香族单环或多环烃基，其可以包括稠合或桥连的环系统，所述系统具有3至15个碳原子，优选地具有3至10个碳原子，并且它是饱和或不饱和的并且通过单键连接至所述分子的其余部分。例如，单环基团包括环丙基、环丁基、环戊基、环己基、环庚基和环辛基。例如，多环基团包括金刚烷基、降冰片基、十氢萘基、7,7二甲基双环[2.2.1]庚基等。除非另外具体指明，否则环烷基基团是任选地取代的。
“亚环烷基”是二价环烷基基团。除非在说明书中另有具体说明，否则亚环烷基基团可以是任选地取代的。
“杂环基”或“杂环”是指由2至12个碳原子和1至6个选自由氮、氧和硫组成的组的杂原子所组成的稳定3元至18元非芳香族环基团。除非在说明书中另有具体说明，否则杂环基基团可以是单环、双环、三环或四环系统，其可以包括稠合或桥连的环系统；并且杂环基基团中的氮、碳或硫原子可以任选地被氧化；所述氮原子可以任选地季铵化；并且所述杂环基基团可以是部分或完全饱和的。这些杂环基基团的实例包括但不限于二氧戊环基、噻吩基[1,3]二噻烷基、十氢异喹啉基、咪唑啉基、咪唑烷基、异噻唑烷基、异噁唑烷基、吗啉基、八氢吲哚基、八氢异吲哚基、2-氧哌嗪基、2-氧哌啶基、2-氧吡咯烷基、噁唑烷基、哌啶基、哌嗪基、4-哌啶酮基、吡咯烷基、吡唑烷基、奎宁环基、噻唑烷基、四氢呋喃基、三噻烷基、四氢吡喃基、硫代吗啉基、硫吗啉基、1-氧-硫代吗啉基和1,1-二氧代-硫代吗啉基。除非另外具体指明，否则杂环基基团可以是任选地取代的。
本文所使用的术语“取代的”表示任何上述基团(例如，烷基、环烷基或杂环基)，其中至少一个氢原子被与非氢原子的键替换，如但不限于：卤素原子，如F、Cl、Br和I；桥氧基(＝O)；羟基(-OH)；烷氧基(ORa，其中Ra是C1-C12烷基或环烷基)；羧基(OC(＝O)Ra或者-C(＝O)ORa，其中Ra为H、C1-C12烷基或环烷基)；胺基(NRaRb，其中Ra和Rb各自独立地为H、C1-C12烷基或环烷基)；C1-C12烷基；和环烷基基团。在一些实施方式中，所述取代基是C1-C12烷基。在其它实施方式中，所述取代基是环烷基。在其它实施方式中，所述取代基是卤代基团，如氟代。在其它实施方式中，所述取代基是桥氧基。在其它实施方式中，所述取代基是羟基。在其它实施方式中，所述取代基是烷氧基。在其它实施方式中，所述取代基是羧基。在其它实施方式中，所述取代基是胺基。
“任选的”或“任选地”(例如，任选地取代的)表示随后所述的事件或状况可以或可以不发生，并且描述包括其中所述事件或状况发生的情况和其中它不发生的情况。例如，“任选地取代的烷基”表示所述烷基可以或可以不被取代，并且该描述包括取代的烷基和未取代的烷基两者。
范围：在整个发明公开中，本发明的多个方面可以以范围格式存在。应理解以范围格式的描述仅是为了方便和简洁，并且不应将其视为对本发明范围的刻板限制。因此，对范围的描述应认为具有具体公开的所有可能的子范围以及所述范围内的各个数值。例如，对范围，如1至6的描述应认为具有具体公开的子范围，如1至3，1至4，1至5，2至4，2至6，3至6等，以及该范围内的各个数值，例如，1、2、2.7、3、4、5、5.3和6。这是适用的，而无需考虑范围的宽度。
描述
本发明部分涉及用于递送载体的靶向递送的组合物和方法。在一个方面，本发明涉及包含缀合至靶向结构域的递送载体的组合物。在一个实施方式中，所述递送载体包含至少一种试剂。在一个实施方式中，所述递送载体包含RNA分子，其包括但不限于mRNA、核苷修饰的RNA、siRNA、miRNA、shRNA或者反义RNA。在一个实施方式中，所述递送载体包含治疗剂。在一个实施方式中，所述治疗剂是核苷修饰的RNA。
在多个实施方式中，所述靶向结构域结合至T细胞抗原的细胞表面分子。在一个实施方式中，所述T细胞抗原为CD4+ T细胞的表面抗原。在一个实施方式中，所述T细胞表面抗原为CD4。
在一个实施方式中，所述组合物包含缀合至靶向结构域的递送载体，所述靶向结构域结合CD4+ T细胞的CD4或表面抗原，借此将所述组合物引导至CD4+ T细胞。
在一个实施方式中，所述递送载体包含或包封用于调节CD4+ T细胞的试剂。在一些实施方式中，所述试剂是核酸分子。在一些实施方式中，所述核酸分子是核苷修饰的mRNA。
在一个实施方式中，所述递送载体包含或包封用于调节CD4+ T细胞的治疗剂。在一些实施方式中，所述治疗剂是核苷修饰的mRNA。在一些实施方式中，所述治疗剂是mRNA基免疫治疗剂。
本发明还部分涉及治疗对其有需要的受试者中的疾病或病症的方法，所述方法包括施用包括递送载体的组合物，所述递送载体包含缀合至结合CD4+ T细胞的CD4或表面抗原的靶向结构域的试剂。
可以使用本发明所述的靶向CD4 T细胞的治疗性组合物治疗的示例性疾病和病症包括但不限于癌症、传染性疾病和免疫学病症。
作为非限制性实例，在一个实施方式中，本发明所述的靶向CD4+ T细胞的递送载体包含或包封核苷修饰的1086C Env mRNA，其编码进化枝C传输/首建人类免疫缺陷性病毒(HIV)-1包膜(Env)1086C，用于治疗或预防HIV感染或与之有关的疾病或病症。
递送载体货物
在多个实施方式中，所述递送载体包含一个或多个基因修饰免疫细胞的核酸分子(例如，mRNA、表达载体或基因组编辑载体)货物(载物，cargo)。在靶标免疫细胞(例如，通过胞吞)进行细胞吸收所述递送载体后，所述货物核酸从内涵体(endosome)中释放。一旦释放，所述货物核酸便修饰受试者的靶标免疫细胞以表达一个或多个表面部分(例如，细胞受体)。
在一个实施方式中，所述递送载体包含至少一种试剂。在一些实施方式中，所述试剂是治疗剂、成像剂、诊断剂、造影剂、标记剂、检测剂或消毒剂。所述试剂还可以包括通常不认为是活性成分的具有生物学活性的物质，如香料、甜味剂、调味剂和风味增强剂、pH调节剂、泡腾剂、润肤剂、膨胀剂(bulking agent)、可溶性有机盐、渗透剂、抗氧化剂、着色剂或染色剂等。
在一个实施方式中，所述递送载体包含至少一种治疗剂。本发明不局限于任何具体治疗剂，而是涵盖可以包括在所述递送载体内的任何适合的治疗剂。示例性治疗剂包括但不限于抗病毒剂、抗菌剂、抗氧化剂、血栓溶解剂、化疗剂、抗炎剂、免疫原性剂、抗菌剂、麻醉剂、止痛剂、药物试剂、小分子、肽、核酸等。在一个实施方式中，所述试剂是如在本文其它地方所描述的mRNA分子(例如，核苷修饰的mRNA分子)。
核酸试剂
在一个方面，本发明公开提供了包含用于抑制、灭活和/或破坏激活的成纤维细胞的核酸货物(例如，DNA或RNA)的递送载体，所述核酸货物包括但不限于mRNA、表达载体、基因组编辑载体、siRNA、shRNA、miRNA。在多个实施方式中，所述核酸货物可以是核苷修饰的核酸分子(例如，核苷修饰的mRNA分子)。在多个实施方式中，所述试剂是分离的核酸。在一些实施方式中，所述分离的核酸分子是cDNA、mRNA、siRNA、shRNA或者miRNA分子。在一些实施方式中，所述分离的核酸分子是核苷修饰的RNA分子。在一些实施方式中，所述核苷修饰的RNA分子是siRNA、miRNA、shRNA或反义分子。
在多个实施方式中，该递送载体包含一个或多个基因修饰免疫细胞的核酸分子(例如，mRNA、表达载体或基因组编辑载体、DNA或RNA)货物。在靶标免疫细胞(例如，通过胞吞)进行细胞吸收所述递送载体后，所述货物核酸从内涵体中释放。一旦释放，所述货物核酸便修饰受试者的靶标免疫细胞。
在一个实施方式中，所述核酸包括启动子/调控序列，从而所述核酸能够指导所述核酸的表达。因此，本发明涵盖了用于将外源核酸引入细胞，并伴随着所述外源核酸在所述细胞中的表达的表达载体和方法，例如在Sambrook等人(2012,Molecular Cloning:ALaboratory Manual,Cold Spring Harbor Laboratory,New York)中和在Ausubel等人(1997,Current Protocols in Molecular Biology,John Wiley&Sons,New York)中以及如在本文其它地方所描述的。
核苷修饰的RNA试剂
在一个实施方式中，本发明所述的组合物包含核苷修饰的核酸(例如，核苷修饰的mRNA分子)。在一个实施方式中，本发明所述的组合物包含编码蛋白、如治疗性蛋白的核苷修饰的RNA。
例如，在一个实施方式中，所述组合物包含核苷修饰的RNA。在一个实施方式中，所述组合物包含核苷修饰的mRNA。核苷修饰的mRNA相比于未修饰的mRNA具有特别的优势，例如，包括提高的稳定性、低或不存在的先天免疫原性和增强的翻译。在本发明中有用的核苷修饰的mRNA进一步描述于美国专利号8,278,036、8,691,966和8,835,108中，其每一篇都以其全部内容作为参考并入本文。
在某些实施方式中，核苷修饰的mRNA不激活任何病理生理途径，转化非常有效并且几乎在递送后立即转化，并且用作持续几天的体内连续蛋白质生产的模板(Kariko等人,2008,Mol Ther 16:1833-1840；Kariko等人,2012,Mol Ther 20:948-953)。发挥生理作用所需的mRNA的量较小而且这使其适用于人疗法。
在某些情况下，与使用蛋白、质粒DNA或病毒载体的方法相比，通过递送编码性mRNA来表达蛋白具有多种益处。在mRNA转染期间，所期望的蛋白的编码序列是递送至细胞的唯一物质，因此避免了与质粒主链、病毒基因和病毒蛋白质有关的所有副作用。更重要地，不同于DNA基和病毒基载体，mRNA不具有引入基因组的风险并且在mRNA递送后立即开始蛋白质生产。例如，已在体内注射编码mRNA 15至30分钟内测量到高水平的循环蛋白。在某些实施方式中，使用mRNA而不是蛋白也具有多种优势。蛋白在循环中的半衰期通常较短，因此蛋白处理将需要频繁的剂量施用，同时mRNA提供了几天的连续蛋白质生产的模板。蛋白纯化是成问题的并且它们可以含有引起副作用的聚集物及其它杂质(Kromminga andSchellekens,2005,Ann NY Acad Sci 1050:257-265)。
在某些实施方式中，所述核苷修饰的RNA包含天然存在的修饰的核苷假尿苷。在某些实施方式中，假尿苷的包含使得mRNA更稳定、非免疫原性且高度可翻译(Kariko等人,2008,Mol Ther 16:1833-1840；Anderson等人,2010,Nucleic Acids Res 38:5884-5892；Anderson等人,2011,Nucleic Acids Research 39:9329-9338；Kariko等人,2011,NucleicAcids Research39:e142；Kariko等人,2012,Mol Ther 20:948-953；Kariko等人,2005,Immunity 23:165-175)。
已证实修饰的核苷、包括假尿苷在RNA中的存在抑制它们先天免疫原性(Kariko等人,2005,Immunity 23:165-175)。此外，编码蛋白的、体外转录的含有假尿苷的RNA可以比不含或含有其它修饰的核苷的RNA更有效地翻译(Kariko等人,2008,Mol Ther 16:1833-1840)。随后，已表明假尿苷的存在改善了RNA的稳定性(Anderson等人,2011,NucleicAcids Research 39:9329-9338)并且降低了PKR的激活和翻译的抑制两者(Anderson等人,2010,Nucleic Acids Res 38:5884-5892)。
对于含有1-甲基假尿苷的RNA也观察到了如对于假尿苷所述的类似效果。
在一些实施方式中，所述核苷修饰的核酸分子是纯化的核苷修饰的核酸分子。例如，在一些实施方式中，纯化所述组合物以除去双链污染物。在一些情况下，将制备型HPLC纯化程序用于获得具有优良翻译潜力且无先天免疫原性的含有假尿苷的RNA(Kariko等人,2011,Nucleic Acids Research 39:e142)。将编码促红细胞生成素的HPLC-纯化的含假尿苷的RNA施用于小鼠和猕猴导致血清EPO水平显著升高(Kariko等人,2012,Mol Ther 20:948-953)，因此确认含假尿苷的mRNA适合于体内蛋白疗法。在一些实施方式中，使用非HPLC方法纯化所述核苷修饰的核酸分子。在一些情况下，使用色谱方法纯化所述核苷修饰的核酸分子，所述方法包括但不限于HPLC和快速蛋白液相色谱(FPLC)。示例性FPLC基纯化程序描述于Weissman等人,2013,Methods Mol Biol,969:43-54。在美国专利申请公开号US2016/0032316中也描述了示例性纯化程序，该专利申请公开以其全部内容作为参考并入本文。
本发明涵盖了包含假尿苷或修饰的核苷的RNA、寡核糖核苷酸和多核糖核苷酸分子。在某些实施方式中，所述组合物包含分离的核酸，其中所述核酸包含假尿苷或修饰的核苷。在某些实施方式中，所述组合物包含载体，所述载体包含分离的核酸，其中所述核酸包含假尿苷或修饰的核苷。
在一个实施方式中，本发明所述的核苷修饰的RNA是IVT RNA，如在本文其它地方所描述的。例如，在某些实施方式中，通过T7噬菌体RNA聚合酶合成所述核苷修饰的RNA。在另一个实施方式中，通过SP6噬菌体mRNA聚合酶合成所述核苷修饰的mRNA。在另一个实施方式中，通过T3噬菌体mRNA聚合酶合成所述核苷修饰的RNA。
在一个实施方式中，所述修饰的核苷是m1acp3Ψ(1-甲基-3-(3-氨基-3-羧丙基)假尿苷)。在另一个实施方式中，所述修饰的核苷是m1ψ(1-甲基假尿苷)。在另一个实施方式中，所述修饰的核苷是Ψm(2'-O-甲基假尿苷)。在另一个实施方式中，所述修饰的核苷是m5D(5-甲基二氢尿苷)。在另一个实施方式中，所述修饰的核苷是m3Ψ(3-甲基假尿苷)。在另一个实施方式中，所述修饰的核苷是未进一步修饰的假尿苷部分。在另一个实施方式中，所述修饰的核苷是任何以上假尿苷的单磷酸酯、二磷酸酯或三磷酸酯。在另一个实施方式中，所述修饰的核苷是本领域中已知的任何其它假尿苷样核苷。
在另一个实施方式中，在本发明所述的核苷修饰的RNA中修饰的核苷是尿苷(U)。在另一个实施方式中，所述修饰的核苷是胞苷(C)。在另一个实施方式中，所述修饰的核苷是腺苷(A)。在另一个实施方式中，所述修饰的核苷是鸟苷(G)。
在另一个实施方式中，本发明所述的修饰的核苷是m5C(5-甲基胞苷)。在另一个实施方式中，所述修饰的核苷是m5U(5-甲基尿苷)。在另一个实施方式中，所述修饰的核苷是m6A(N6-甲基腺苷)。在另一个实施方式中，所述修饰的核苷是s2U(2-硫代尿苷)。在另一个实施方式中，所述修饰的核苷是Ψ(假尿苷)。在另一个实施方式中，所述修饰的核苷是Um(2'-O-甲基尿苷)。
在其它实施方式中，所述修饰的核苷是m1A(1-甲基腺苷)；m2A(2-甲基腺苷)；Am(2’-O-甲基腺苷)；ms2m6A(2-甲基硫代-N6-甲基腺苷)；i6A(N6-异戊烯基腺苷)；ms2i6A(2-甲基硫代-N6异戊烯基腺苷)；io6A(N6-(顺羟基异戊烯基)腺苷)；ms2io6A(2-甲基硫代-N6-(顺羟基异戊烯基)腺苷)；g6A(N6-甘氨酰基氨基甲酰基腺苷)；t6A(N6-苏氨酰基氨基甲酰基腺苷)；ms2t6A(2-甲基硫代-N6-苏氨酰基氨基甲酰基腺苷)；m6t6A(N6-甲基-N6-苏氨酰基氨基甲酰基腺苷)；hn6A(N6-羟基正缬氨酰基氨基甲酰基腺苷)；ms2hn6A(2-甲基硫代-N6-羟基正缬氨酰基氨基甲酰基腺苷)；Ar(p)(2’-O-核糖基腺苷(磷酸酯))；I(肌苷)；m1I(1-甲基肌苷)；m1Im(1,2’-O-二甲基肌苷)；m3C(3-甲基胞苷)；Cm(2’-O-甲基胞苷)；s2C(2-硫代胞苷)；ac4C(N4-乙酰基胞苷)；f5C(5-甲酰基胞苷)；m5Cm(5,2’-O-二甲基胞苷)；ac4Cm(N4-乙酰基-2’-O-甲基胞苷)；k2C(赖胞苷)；m1G(1-甲基鸟苷)；m2G(N2-甲基鸟苷)；m7G(7-甲基鸟苷)；Gm(2’-O-甲基鸟苷)；m2 2G(N2,N2-二甲基鸟苷)；m2Gm(N2,2’-O-二甲基鸟苷)；m2 2Gm(N2,N2,2’-O-三甲基鸟苷)；Gr(p)(2’-O-核糖基鸟苷(磷酸酯))；yW(怀丁苷)；o2yW(过氧怀丁苷)；OHyW(羟基怀丁苷)；OHyW*(修饰不完全的羟基怀丁苷)；imG(怀俄苷)；mimG(甲基怀俄苷)；Q(辫苷)；oQ(环氧基辫苷)；galQ(半乳糖基-辫苷)；manQ(甘露糖基-辫苷)；preQ0(7-氰基-7-去氮鸟苷)；preQ1(7-氨基甲基-7-去氮鸟苷)；G+(古嘌苷)；D(二氢尿苷)；m5Um(5,2’-O-二甲基尿苷)；s4U(4-硫代尿苷)；m5s2U(5-甲基-2-硫代尿苷)；s2Um(2-硫代-2’-O-甲基尿苷)；acp3U(3-(3-氨基-3-羧基丙基)尿苷)；ho5U(5-羟基尿苷)；mo5U(5-甲氧基尿苷)；cmo5U(尿苷5-羟乙酸)；mcmo5U(尿苷5-氧乙酸甲酯)；chm5U(5-(羧基羟基甲基)尿苷)；mchm5U(5-(羧基羟基甲基)尿苷甲酯)；mcm5U(5-甲氧基羰基甲基尿苷)；mcm5Um(5-甲氧基羰基甲基-2’-O-甲基尿苷)；mcm5s2U(5-甲氧基羰基甲基-2-硫代尿苷)；nm5s2U(5-氨基甲基-2-硫代尿苷)；mnm5U(5-甲基氨基甲基尿苷)；mnm5s2U(5-甲基氨基甲基-2-硫代尿苷)；mnm5se2U(5-甲基氨基甲基-2-硒代尿苷)；ncm5U(5-氨基甲酰基甲基尿苷)；ncm5Um(5-氨基甲酰基甲基-2’-O-甲基尿苷)；cmnm5U(5-羧基甲基氨基甲基尿苷)；cmnm5Um(5-羧基甲基氨基甲基-2’-O-甲基尿苷)；cmnm5s2U(5-羧基甲基氨基甲基-2-硫代尿苷)；m6 2A(N6,N6-二甲基腺苷)；Im(2’-O-甲基肌苷)；m4C(N4-甲基胞苷)；m4Cm(N4,2’-O-二甲基胞苷)；hm5C(5-羟基甲基胞苷)；m3U(3-甲基尿苷)；cm5U(5-羧基甲基尿苷)；m6Am(N6,2’-O-二甲基腺苷)；m6 2Am(N6,N6,O-2’-三甲基腺苷)；m2,7G(N2,7-二甲基鸟苷)；m2,2,7G(N2,N2,7-三甲基鸟苷)；m3Um(3,2’-O-二甲基尿苷)；m5D(5-甲基二氢尿苷)；f5Cm(5-甲酰基-2’-O-甲基胞苷)；m1Gm(1,2’-O-二甲基鸟苷)；m1Am(1,2’-O-二甲基腺苷)；τm5U(5-牛磺酸甲基尿苷)；τm5s2U(5-牛磺酸甲基-2-硫代尿苷)；imG-14(4-去甲基怀俄苷)；imG2(异怀俄苷)；或者ac6A(N6-乙酰基腺苷)。
在另一个实施方式中，本发明所述的核苷修饰的RNA包含2种或更多种上述修饰的组合。在另一个实施方式中，所述核苷修饰的RNA包含3种或更多种上述修饰的组合。在另一个实施方式中，所述核苷修饰的RNA包含大于3种上述修饰的组合。
在另一个实施方式中，本发明所述的核苷修饰的RNA中0.1％至100％的残基是修饰的(例如，通过假尿苷或者修饰的核苷碱基的存在)。在另一个实施方式中，0.1％的残基是修饰的。在另一个实施方式中，修饰的残基的分数是0.2％。在另一个实施方式中，所述分数是0.3％。在另一个实施方式中，所述分数是0.4％。在另一个实施方式中，所述分数是0.5％。在另一个实施方式中，所述分数是0.6％。在另一个实施方式中，所述分数是0.8％。在另一个实施方式中，所述分数是1％。在另一个实施方式中，所述分数是1.5％。在另一个实施方式中，所述分数是2％。在另一个实施方式中，所述分数是2.5％。在另一个实施方式中，所述分数是3％。在另一个实施方式中，所述分数是4％。在另一个实施方式中，所述分数是5％。在另一个实施方式中，所述分数是6％。在另一个实施方式中，所述分数是8％。在另一个实施方式中，所述分数是10％。在另一个实施方式中，所述分数是12％。在另一个实施方式中，所述分数是14％。在另一个实施方式中，所述分数是16％。在另一个实施方式中，所述分数是18％。在另一个实施方式中，所述分数是20％。在另一个实施方式中，所述分数是25％。在另一个实施方式中，所述分数是30％。在另一个实施方式中，所述分数是35％。在另一个实施方式中，所述分数是40％。在另一个实施方式中，所述分数是45％。在另一个实施方式中，所述分数是50％。在另一个实施方式中，所述分数是60％。在另一个实施方式中，所述分数是70％。在另一个实施方式中，所述分数是80％。在另一个实施方式中，所述分数是90％。在另一个实施方式中，所述分数是100％。
在另一个实施方式中，所述分数小于5％。在另一个实施方式中，所述分数小于3％。在另一个实施方式中，所述分数小于1％。在另一个实施方式中，所述分数小于2％。在另一个实施方式中，所述分数小于4％。在另一个实施方式中，所述分数小于6％。在另一个实施方式中，所述分数小于8％。在另一个实施方式中，所述分数小于10％。在另一个实施方式中，所述分数小于12％。在另一个实施方式中，所述分数小于15％。在另一个实施方式中，所述分数小于20％。在另一个实施方式中，所述分数小于30％。在另一个实施方式中，所述分数小于40％。在另一个实施方式中，所述分数小于50％。在另一个实施方式中，所述分数小于60％。在另一个实施方式中，所述分数小于70％。
在另一个实施方式中，给定核苷(即，尿苷、胞苷、鸟苷或腺苷)的残基的0.1％是修饰的。在另一个实施方式中，修饰的给定核苷酸的分数是0.2％。在另一个实施方式中，所述分数是0.3％。在另一个实施方式中，所述分数是0.4％。在另一个实施方式中，所述分数是0.5％。在另一个实施方式中，所述分数是0.6％。在另一个实施方式中，所述分数是0.8％。在另一个实施方式中，所述分数是1％。在另一个实施方式中，所述分数是1.5％。在另一个实施方式中，所述分数是2％。在另一个实施方式中，所述分数是2.5％。在另一个实施方式中，所述分数是3％。在另一个实施方式中，所述分数是4％。在另一个实施方式中，所述分数是5％。在另一个实施方式中，所述分数是6％。在另一个实施方式中，所述分数是8％。在另一个实施方式中，所述分数是10％。在另一个实施方式中，所述分数是12％。在另一个实施方式中，所述分数是14％。在另一个实施方式中，所述分数是16％。在另一个实施方式中，所述分数是18％。在另一个实施方式中，所述分数是20％。在另一个实施方式中，所述分数是25％。在另一个实施方式中，所述分数是30％。在另一个实施方式中，所述分数是35％。在另一个实施方式中，所述分数是40％。在另一个实施方式中，所述分数是45％。在另一个实施方式中，所述分数是50％。在另一个实施方式中，所述分数是60％。在另一个实施方式中，所述分数是70％。在另一个实施方式中，所述分数是80％。在另一个实施方式中，所述分数是90％。在另一个实施方式中，所述分数是100％。
在另一个实施方式中，修饰的给定核苷酸的分数小于8％。在另一个实施方式中，所述分数小于10％。在另一个实施方式中，所述分数小于5％。在另一个实施方式中，所述分数小于3％。在另一个实施方式中，所述分数小于1％。在另一个实施方式中，所述分数小于2％。在另一个实施方式中，所述分数小于4％。在另一个实施方式中，所述分数小于6％。在另一个实施方式中，所述分数小于12％。在另一个实施方式中，所述分数小于15％。在另一个实施方式中，所述分数小于20％。在另一个实施方式中，所述分数小于30％。在另一个实施方式中，所述分数小于40％。在另一个实施方式中，所述分数小于50％。在另一个实施方式中，所述分数小于60％。在另一个实施方式中，所述分数小于70％。
在一些实施方式中，所述组合物包含单链核苷修饰的RNA的纯化制剂。例如，在一些实施方式中，单链核苷修饰的RNA的纯化制剂基本不含双链RNA(dsRNA)。在一些实施方式中，相对于所有其它核酸分子(DNA、dsRNA等)，所述纯化制剂是至少90％，或者至少91％，或者至少92％，或者至少93％，或者至少94％，或者至少95％，或者至少96％，或者至少97％，或者至少98％，或者至少99％，或者至少99.5％，或者至少99.9％的单链核苷修饰的RNA。
在另一个实施方式中，本发明所述的核苷修饰的RNA在细胞中的翻译比具有相同序列的未修饰的RNA分子更有效。在另一个实施方式中，所述核苷修饰的RNA显示出增强的被靶细胞翻译的能力。在另一个实施方式中，相对于其未修饰的对应物，翻译增强到2倍的倍数。在另一个实施方式中，翻译增强到3倍倍数。在另一个实施方式中，翻译增强到5倍倍数。在另一个实施方式中，翻译增强到7倍倍数。在另一个实施方式中，翻译增强到10倍倍数。在另一个实施方式中，翻译增强到15倍倍数。在另一个实施方式中，翻译增强到20倍倍数。在另一个实施方式中，翻译增强到50倍倍数。在另一个实施方式中，翻译增强到100倍倍数。在另一个实施方式中，翻译增强到200倍倍数。在另一个实施方式中，翻译增强到500倍倍数。在另一个实施方式中，翻译增强到1000倍倍数。在另一个实施方式中，翻译增强到2000倍倍数。在另一个实施方式中，所述倍数是10至1000倍。在另一个实施方式中，所述倍数是10至100倍。在另一个实施方式中，所述倍数是10至200倍。在另一个实施方式中，所述倍数是10至300倍。在另一个实施方式中，所述倍数是10至500倍。在另一个实施方式中，所述倍数是20至1000倍。在另一个实施方式中，所述倍数是30至1000倍。在另一个实施方式中，所述倍数是50至1000倍。在另一个实施方式中，所述倍数是100至1000倍。在另一个实施方式中，所述倍数是200至1000倍。在另一个实施方式中，翻译增强任何其它显著的量或量的范围。
在另一个实施方式中，本发明所述的核苷修饰的RNA显示出比具有相同序列的未修饰的体外合成的RNA分子显著较低的先天免疫原性。在另一个实施方式中，修饰的RNA分子显示出其未修饰的对应物的1/2倍的先天性免疫应答。在另一个实施方式中，先天免疫原性降低至1/3倍倍数。在另一个实施方式中，先天免疫原性降低至1/4倍倍数。在另一个实施方式中，先天免疫原性降低至1/5倍倍数。在另一个实施方式中，先天免疫原性降低至1/6倍倍数。在另一个实施方式中，先天免疫原性降低至1/7倍倍数。在另一个实施方式中，先天免疫原性降低至1/8倍倍数。在另一个实施方式中，先天免疫原性降低至1/9倍倍数。在另一个实施方式中，先天免疫原性降低至1/10倍倍数。在另一个实施方式中，先天免疫原性降低至1/15倍倍数。在另一个实施方式中，先天免疫原性降低至1/20倍倍数。在另一个实施方式中，先天免疫原性降低至1/50倍倍数。在另一个实施方式中，先天免疫原性降低至1/100倍倍数。在另一个实施方式中，先天免疫原性降低至1/200倍倍数。在另一个实施方式中，先天免疫原性降低至1/500倍倍数。在另一个实施方式中，先天免疫原性降低至1/1000倍倍数。在另一个实施方式中，先天免疫原性降低至1/2000倍倍数。在另一个实施方式中，先天免疫原性降低至另一倍数差。
在另一个实施方式中，“显示出显著较低的先天免疫原性”是指先天免疫原性的可检测降低。在另一个实施方式中，该术语是指先天免疫原性的成倍降低(例如，以上列举的降低倍数之一)。在另一个实施方式中，该术语是指这种降低使得可以施用有效量的所述核苷修饰的RNA但不会引发可检测的先天性免疫应答。在另一个实施方式中，该术语是指这种降低使得可以重复施用所述核苷修饰的RNA但不会引起足以可检测地降低所述修饰的RNA所编码的蛋白的生产的先天性免疫应答。在另一个实施方式中，所述降低使得可以反复施用所述核苷修饰的RNA，但不会引起足以消除所述修饰的RNA所编码的蛋白的可检测的生产的先天性免疫应答。
RNA干扰剂
在一个实施方式中，将siRNA用于降低靶标蛋白的水平。RNA干扰(RNAi)是其中双链RNA(dsRNA)向广泛的生物和细胞类型中的引入导致互补mRNA降解的现象。在细胞中，通过被称为Dicer的核糖核酸酶将长dsRNA切割成短的21-25个核苷酸的小干扰RNA或siRNA。随后，将siRNA与蛋白组分组装成RNA诱导的沉默复合体(RISC)，其在该过程中解旋。然后，将激活的RISC通过siRNA反义链和mRNA之间的碱基配对相互作用结合至互补转录本。将结合的mRNA切割，并且mRNA的序列特异性降解导致了基因沉默。例如，参见美国专利号6,506,559；Fire等人,1998,Nature 391(19):306-311；Timmons等人,1998,Nature395:854；Montgomery等人,1998,TIG 14(7):255-258；David R.Engelke主编,RNA Interference(RNAi)Nuts&Bolts of RNAi Technology,DNA Press,Eagleville,PA(2003)；和GregoryJ.Hannon主编,RNAi A Guide to Gene Silencing,Cold Spring Harbor LaboratoryPress,Cold Spring Harbor,NY(2003)。Soutschek等人(2004,Nature 432:173-178)描述了对辅助静脉内全身递送的siRNA的化学修饰。siRNA的优化包括对整体G/C含量、末端C/T含量、Tm和3'悬突的核苷酸含量的考虑。例如，参见Schwartz等人,2003,Cell,115:199-208和Khvorova等人,2003,Cell 115:209-216。因此，本发明还包括使用RNAi技术降低PTPN22水平的方法。
在一个方面，本发明包括包含siRNA或反义多核苷酸的载体。优选地，所述siRNA或反义多核苷酸能够抑制靶标多肽的表达。所期望的多核苷酸向载体的并入以及载体的选择在本领域中是熟知的，例如在Sambrook等人(2012)中和在Ausubel等人(1997)中以及在本文其它处所描述的。
在某些实施方式中，本文所述的表达载体编码短发夹RNA(shRNA)试剂。shRNA分子在本领域中是熟知的并且针对靶标的mRNA，借此降低所述靶标的表达。在某些实施方式中，通过细胞表达所编码的shRNA，然后加工成siRNA。例如，在某些情况下，细胞具有切割shRNA以形成siRNA的天然酶(例如，dicer)。
为了评价siRNA、shRNA或反义多核苷酸的表达，要引入到细胞中的表达载体还可以含有可选择标志物基因或报告基因或两者，以有利于从试图使用本发明所述的递送载体转染或感染的细胞群中鉴定(识别，identification)表达细胞。在其它实施方式中，所述可选择标志物可以在单独的DNA片上携带并且还可以包含在所述递送载体内。可选择标志物和报告基因两者均可以侧接适当的调控序列，以使得能够在宿主细胞中表达。有用的可选择标志物在本领域中是已知的，并且例如包括抗生素抗性基因，如新霉素抗性等。
因此，在一个方面，所述递送载体(媒介物，vehicle)可以含有载体(vector)，包含要递送的核苷酸序列或构建体。载体的选择将取决于其中它随后将引入的宿主细胞。在具体的实施方式中，本发明所述的载体为表达载体。适合的宿主细胞包括多种原核和真核宿主细胞。在具体的实施方式中，所述表达载体选自由病毒载体、细菌载体和哺乳动物细胞载体组成的组。原核生物载体基系统和/或真核生物载体基系统可以与本发明一起使用以产生多核苷酸或者它们的同源多肽。众多这类系统是可商购的和广泛可用的。
通过说明，其中引入核酸序列的载体可以是质粒，当引入细胞时，它整合或不整合到宿主细胞的基因组中。其中可以插入本发明所述的核苷酸序列或者本发明所述的基因构建体的载体的说明性的非限制性实例包括用于在真核生物细胞中表达的tet-on诱导型载体。
可以通过本领域技术人员已知的常规方法获得载体(Sambrook等人,2012)。在具体的实施方式中，所述载体是用于转化动物细胞的载体。
在一个实施方式中，所述重组表达载体还可以含有核酸分子，所述核酸分子编码肽或拟肽。
启动子可以是与基因或多核苷酸序列天然结合的启动子，如可以通过分离位于所述编码链段和/或外显子上游的5'非编码序列获得。这种启动子可以称为“内源的”。类似地，增强子可以是与多核苷酸序列天然结合的增强子，其位于该序列的下游或上游。作为另外一种选择，通过将编码多核苷酸链段置于重组或异源启动子的控制之下将获得某些优势，所述启动子是指在其天然环境中通常不与所述多核苷酸序列结合的启动子。重组或异源增强子还表示在其天然环境中通常不与所述多核苷酸序列结合的增强子。这些启动子或增强子可以包括其它基因的启动子或增强子，和分离自任何其它原核、病毒或真核细胞的启动子或增强子，和非“天然存在的”启动子或增强子，即，含有不同转录调控区的不同元件和/或改变表达的突变的启动子或增强子。除通过合成产生启动子和增强子的核酸序列之外，可以结合本文所公开的组合物，使用重组克隆和/或核酸扩增技术，包括PCRTM产生序列(美国专利4,683,202、美国专利5,928,906)。此外，设想到还可以使用在非核细胞器如线粒体、叶绿体等内指导序列的转录和/或表达的控制序列。
天然地，使用在选择用于表达的细胞类型、细胞器和生物体中有效指导DNA链段的表达的启动子和/或增强子将是重要的。分子生物学领域的技术人员通常已知如何使用启动子、增强子和细胞类型的组合来用于蛋白表达，例如，参见Sambrook等人(2012)。所使用的启动子可以是组成型的，组织特异的、诱导型的和/或在适当条件下有用的以指导所引入的DNA链段的高水平表达，如在重组蛋白和/或肽的大规模生产中是有利的。所述启动子可以是异源的或内源的。
重组表达载体还可以含有可选择标志物基因，其有利于宿主细胞的选择。适合的可选择标志物基因是编码蛋白(如赋予对某些药物的抗性的G418和潮霉素、β-半乳糖苷酶、氯霉素乙酰转移酶、荧光虫荧光素酶或免疫球蛋白或其部分，如免疫球蛋白的Fc部分，优选地IgG)的基因。可以在来自所关心的核酸的单独的载体上引入可选择标志物。
在siRNA多核苷酸产生后，技术人员将理解siRNA多核苷酸将具有可以修饰以改善作为治疗化合物的siRNA的某些特征。因此，还可以通过对其进行修饰以包括硫代磷酸酯或其它键、膦酸甲酯、砜、硫酸酯、羰游基、二硫代磷酸酯、氨基磷酸酯、磷酸酯等来设计siRNA多核苷酸以耐受降解(例如，参见Agrawal等人,1987,Tetrahedron Lett.28:3539-3542；Stec等人,1985Tetrahedron Lett.26:2191-2194；Moody等人,1989Nucleic AcidsRes.12:4769-4782；Eckstein,1989Trends Biol.Sci.14:97-100；Stein,In:Oligodeoxynucleotides.Antisense Inhibitors of Gene Expression,Cohen主编,Macmillan Press,London,第97-117页(1989))。
还可以修饰任何多核苷酸以提高其体内稳定性。可能的修饰包括但不限于在5'和/或3'端添加侧接序列；在主链中使用硫代磷酸酯或2'O-甲基，而不是磷酸二酯键；和/或包含非常规碱基，如肌苷、Q核苷(queuosine)和怀丁苷等以及腺嘌呤、胞嘧啶、鸟嘌呤、胸腺嘧啶和尿嘧啶的乙酰基-、甲基-、硫代-和其它修饰形式。
在本发明的一个实施方式中，将通过质粒载体表达的反义核酸序列用作抑制靶标蛋白表达的试剂。将反义表达载体用于转染哺乳动物细胞或哺乳动物本身，借此导致所述靶标蛋白的内源表达降低。
反义分子和它们用于抑制基因表达的使用在本领域中是熟知的(例如，参见Cohen,1989,In:Oligodeoxyribonucleotides,Antisense Inhibitors of GeneExpression,CRC Press)。如在本文其它处定义的术语，反义核酸是与特定mRNA分子的至少一部分互补的DNA或RNA分子(Weintraub,1990,Scientific American 262:40)。在细胞中，反义核酸杂交至相应mRNA，从而形成双链分子，借此抑制基因的翻译。
反义方法抑制基因翻译的使用在本领域中是已知的，并且例如描述于Marcus-Sakura(1988,Anal.Biochem.172:289)中。可以使用编码反义分子的DNA，通过基因表达向细胞提供这些反义分子，如Inoue,1993，美国专利号5,190,931所教导的。
作为另外一种选择，可以通过合成制备本发明的反义分子，然后向细胞提供。约10至约30，并且更优选地约15个核苷酸的反义寡聚物是优选的，因为它们易于合成和引入靶细胞。通过本发明所考虑的合成反义分子包括本领域中已知的寡核苷酸衍生物，与未修饰的寡核苷酸相比，其具有改善的生物活性(参见美国专利号5,023,243)。
在本发明的一个实施方式中，将核糖酶用作抑制靶标蛋白表达的试剂。可以通过将靶标序列引入基本的核糖酶结构中来设计用于抑制靶标分子表达的核糖酶，例如所述靶标序列与编码所述靶标分子的mRNA序列互补。可以使用可商购的试剂(AppliedBiosystems,Inc.,Foster City,CA)合成靶向所述靶标分子的核糖酶，或者可以从编码它们的DNA通过基因表达它们。
在一个实施方式中，所述试剂可以包含CRISPR-Cas系统的一种或多种组分，其中靶向编码靶标分子的基因的向导RNA(gRNA)和CRISPR-相关(Cas)肽形成复合物以诱导所述靶标基因内的突变。在一个实施方式中，所述试剂包括gRNA或者编码gRNA的核酸分子。在一个实施方式中，所述试剂包括Cas肽或者编码Cas肽的核酸分子。
微小RNA试剂
在一个实施方式中，所述试剂包含miRNA或miRNA的模拟物。在一个实施方式中，所述试剂包含编码miRNA或miRNA的模拟物的核酸分子。
MiRNA是能够通过抑制翻译或者通过靶向的mRNA的降解导致细胞中特定基因的转录后沉默的小非编码RNA分子。miRNA可以是完全互补的或者可以与靶标核酸具有非互补区，因此在非互补区导致产生“凸起(bulge)”。miRNA可以通过以下方式抑制基因表达：抑制翻译，如当miRNA不与靶标核酸完全互补时；或者通过导致靶标RNA降解，这被认为只有在miRNA以完全互补结合其靶标时发生。本发明公开还可以包括miRNA的双链前体。miRNA或pri-miRNA可以是18-100个核苷酸长，或者18-80个核苷酸长。成熟miRNA可以具有19-30个核苷酸，或者21-25个核苷酸，具体地21、22、23、24或25个核苷酸的长度。MiRNA前体通常具有约70-100个核苷酸的长度并且具有发夹构象。通过酶Dicer和Drosha从前体miRNA体内产生miRNA，所述酶将长前体miRNA特异性加工成功能性miRNA。可以通过细胞基系统体内合成或者通过化学合成体外合成本发明公开中所描述的发夹或成熟微小RNA或者pri-微小RNA试剂。
在多个实施方式中，所述试剂包含含有疾病相关miRNA的核苷酸序列的寡核苷酸。在某些实施方式中，所述寡核苷酸包含处于前体微小RNA、成熟或发夹形式的疾病相关miRNA的核苷酸序列。在其它实施方式中，设想了包含一种或多种疾病相关miRNA、任何前体miRNA、任何片段的序列或它们的任意组合的寡核苷酸的组合。
可以合成miRNA以包括赋予所期望的特征的修饰。例如，所述修饰可以改善稳定性、与靶标核酸的杂交热力学、对特定组织或细胞类型的靶向或者细胞渗透性，例如，通过依赖或不依赖胞吞的机制。
修饰还可以提高序列特异性，并因此减少脱靶。以下更详细地描述了合成和化学修饰方法。如果需要，可以修饰miRNA分子以对于降解稳定miRNA、提高半衰期或另外改善效力。例如，所期望的修饰描述于美国专利公开号20070213292、20060287260、20060035254、20060008822和2005028824，以上每篇专利公开以其全部内容作为参考并入本文。对于提高的核酸酶抗性和/或对靶标的结合亲和力，本发明公开中所表征的单链寡核苷酸试剂可以包括2'-O-甲基、2'-氟、2'-O-甲氧基乙基、2'-O-氨基丙基、2'-氨基和/或硫代磷酸酯键。锁核酸(LNA)、乙烯核酸(ENA)(例如，2'-4'-乙烯-桥核酸)的包含，和某些核苷酸修饰还可以提高与靶标的结合亲和力。吡喃糖在寡核苷酸主链中的包含还可以降低核酸内切切割。可以通过包含3'阳离子基团，或者通过用3-3'键在3'-末端逆转核苷来进一步修饰寡核苷酸。在另一种替代方案中，可以用氨烷基封闭3'-末端。其它3'缀合物可以抑制3'-5'核酸外切切割。尽管不受理论束缚，3'可以通过空间阻断核酸外切酶结合至寡核苷酸的3'端来抑制核酸外切切割。即使小的烷基链、芳基或杂环缀合物或修饰的糖(D-核糖、脱氧核糖、葡萄糖等)可以阻断3'-5'-核酸外切酶。
在一个实施方式中，miRNA包括含有寡脱氧核苷酸缺口的2'-修饰的寡核苷酸，其中将一些或全部核苷酸间键修饰成硫代磷酸酯以用于耐受核酸酶。膦酸甲酯修饰的存在提高寡核苷酸对于其靶标RNA的亲和力并因此降低IC5Q。这种修饰还提高所修饰的寡核苷酸的核酸酶耐受性。应理解本发明公开所述的方法和试剂可以结合可以发展以增强抑制性核酸分子的稳定性或效力的任何技术使用。
miRNA分子包括含有修饰的主链或非天然核苷间键的核苷酸寡聚物。具有修饰的主链的寡聚物包括在主链中保留磷原子的那些和在主链中不具有磷原子的那些。出于本发明公开的目的，还将在它们的核苷间主链中不具有磷原子的修饰的寡核苷酸认为是核苷酸寡聚物。例如，具有修饰的寡核苷酸主链的核苷酸寡聚物包括硫代磷酸酯、手性硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯、磷酸三酯、氨基烷基磷酸三酯、甲基及其它烷基磷酸酯，包括3'-亚烷基磷酸酯和手性磷酸酯、亚膦酸酯、氨基磷酸酯、硫羰磷酰胺酯、硫羰烷基磷酸酯、硫羰烷基磷酸三酯和硼烷磷酸酯。还包括多种盐、混合的盐和游离酸形式。
本文所描述的miRNA可以处于成熟或发夹形式，其可以作为裸寡核苷酸提供。在一些情况下，可以期望使用辅助miRNA或其它核苷酸寡聚物向细胞的递送的制剂(例如，参见美国专利号5,656,611、5,753,613、5,785,992、6,120,798、6,221,959、6,346,613和6,353,055，以上专利中的每一个作为参考并入本文)。
在一些实例中，miRNA组合物是至少部分结晶、均一结晶和/或无水的(例如，小于80、50、30、20或10％的水)。在另一个实例中，miRNA组合物处于水相，例如，处于包括水的溶液中。可以将所述水相或结晶组合物引入递送载体，例如，脂质体(特别是对于水相)或颗粒(例如，如可以适合于结晶组合物的微粒)。通常，以与预期施用方法相容的方式配制所述miRNA组合物。可以与另一种试剂(例如，另一种治疗剂)或稳定寡核苷酸试剂的试剂(例如，与寡核苷酸试剂复合的蛋白)组合配制miRNA组合物。其它试剂包括螯合剂，例如，EDTA(例如，以除去二价阳离子，如Mg)、盐和RNA酶抑制剂(例如，宽特异性RNA酶抑制剂)。在一个实施方式中，miRNA组合物包括另一种miRNA，例如，第二miRNA组合物(例如，不同于所述第一组合物的微小RNA)。其它制剂仍可以包括至少3、5、10、20、50或100或更多种不同的寡核苷酸物质。
在某些实施方式中，所述组合物包含模拟miRNA活性的寡核苷酸组合物。在某些实施方式中，所述组合物包含与miRNA的核碱基序列具有核碱基同一性的寡核苷酸，并因此设计以模拟miRNA的活性。在某些实施方式中，模拟miRNA活性的寡核苷酸组合物包含模拟成熟miRNA发夹或处理的miRNA双螺旋的双链RNA分子。
在一个实施方式中，所述寡核苷酸与内源miRNA或miRNA前体核碱基序列共有同一性。选择在本发明的组合物中包含的寡核苷酸可以是一些长度之一。这种寡核苷酸的长度可以为7至100个连接的核苷。例如，与miRNA共有核碱基同一性的寡核苷酸的长度可以为7至30个连接的核苷。与miRNA前体共有同一性的寡核苷酸的长度可以长达100个连接的核苷。在某些实施方式中，寡核苷酸包含7至30个连接的核苷。在某些实施方式中，寡核苷酸包含7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、28、29或者30个连接的核苷酸。在某些实施方式中，寡核苷酸包含19至23个连接的核苷。在某些实施方式中，寡核苷酸长度为40至50、60、70、80、90或100个连接的核苷。
在某些实施方式中，寡核苷酸具有与miRNA或其前体具有特定同一性的序列。本文所描述的成熟miRNA和它们相应的茎环序列的核碱基序列是miRBase(miRNA序列和注释的在线可搜索数据库)中存在的序列。miRBase序列数据库中的条目代表了miRNA转录本的预测发夹部分(茎环)，其具有有关成熟miRNA序列的位置和序列的信息。该数据库中的miRNA茎环序列不严格地为前体miRNA(pre-miRNA)，并且在一些情况下可以包括来自假定的一级转录本的前体miRNA和一些侧接序列。本文所描述的miRNA核碱基序列涵盖了miRNA的任何形式，包括miRBase序列数据库发布版10.0中所述的序列以及miRBase序列数据库的任何早期发布版中所述的序列。序列数据库发布版可以导致某些miRNA重命名。序列数据库发布版可以导致成熟miRNA序列变化。本发明所述的组合物涵盖了包含与本文所描述的miRNA的任何核碱基序列形式具有特定同一性的寡核苷酸的寡聚化合物。
在某些实施方式中，寡核苷酸具有在7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30个核碱基的区域内与miRNA具有至少60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、97％、98％或99％的同一性的核碱基序列。因此，在某些实施方式中，寡核苷酸的核碱基序列可以相对于miRNA具有一个或多个不相同的核碱基。
在某些实施方式中，所述组合物包含编码miRNA、前体、模拟物或其片段的核酸分子。例如，所述组合物可以包含病毒载体、质粒、粘粒或者适合于在所期望的哺乳动物细胞或组织中表达miRNA、前体、模拟物或其片段的其它表达载体。
体外转录的RNA试剂
在一个实施方式中，本发明所述的试剂包含体外转录的(IVT)RNA。在一个实施方式中，本发明所述的试剂包含编码治疗性蛋白的体外转录的(IVT)RNA。在一个实施方式中，本发明所述的试剂包含编码多种治疗性蛋白的IVT RNA。
在一个实施方式中，可以将IVT RNA作为瞬时转染形式引入细胞。使用合成产生的质粒DNA模板，通过体外转录产生RNA。可以使用适当引物和RNA聚合酶，通过PCR将来自任何来源的所关心的DNA直接转化为用于体外mRNA合成的模板。例如，DNA的来源可以是基因组DNA、质粒DNA、噬菌体DNA、cDNA、合成DNA序列或者任何其它适合的DNA来源。在一个实施方式中，体外转录所期望的模板是治疗性蛋白，如在本文其它地方所描述的。
在一个实施方式中，用于PCR的DNA含有开放阅读框。所述DNA可以来自来源于生物基因组的天然存在的DNA序列。在一个实施方式中，DNA是所关心的全长基因或基因的一部分。所述基因可以包括5'和/或3'非翻译区(UTR)的一些或全部。所述基因可以包括外显子和内含子。在一个实施方式中，用于PCR的DNA是人基因。在另一个实施方式中，用于PCR的DNA是包括5'和3'UTR的人基因。在另一个实施方式中，用于PCR的DNA是来自致病或共生生物(包括细菌、病毒、寄生虫和真菌)的基因。在另一个实施方式中，用于PCR的DNA来自致病或共生生物，包括细菌、病毒、寄生虫和真菌，所述DNA包括5'和3'UTR。作为另外一种选择，所述DNA可以是并非在天然存在的生物中正常表达的人工DNA序列。示例性人工DNA序列是含有连接在一起以形成编码融合蛋白的开放阅读框的基因的部分的序列。连接在一起的DNA的部分可以来自单一生物或来自多于一种生物。
可以用作PCR的DNA来源的基因包括编码诱导或增强生物中适应性免疫应答的多肽的基因。优选的基因是对于短期处理有用的基因，或者在对剂量或要表达的基因存在安全性顾虑的情况下有用的基因。
在多个实施方式中，将质粒用于产生RNA体外转录的模板，其将用于转染。
还可以使用具有促进稳定性和/或翻译效率的能力的化学结构。所述RNA优选地具有5'和3'UTR。在一个实施方式中，5'UTR的长度为0至3000个核苷酸。可以通过不同方法改变要添加至编码区的5'和3'UTR序列长度，所述方法包括但不限于设计用于与UTR的不同区域退火的PCR引物。使用该方法，本领域的技术人员可以在转录的RNA转染后，改变实现最优翻译效率所需的5'和3'UTR长度。
所述5'和3'UTR可以是所关心的基因的天然存在的、内源的5'和3'UTR。作为另外一种选择，可以通过将UTR序列引入正向和反向引物或通过对模板的任何其它修饰，添加对所关心的基因非内源的UTR序列。对所关心的基因非内源的UTR序列的使用对于改变RNA的稳定性和/或翻译效率可以是有用的。例如，已知3'UTR序列中富含AU的元件可以降低RNA的稳定性。因此，基于在本领域中熟知的UTR的性质，可以选择或设计3'UTR以提高转录的RNA的稳定性。
在一个实施方式中，5'UTR可以含有内源基因的Kozak序列。作为另外一种选择，当如以上所描述的，通过PCR添加对所关心的基因非内源的5'UTR时，可以通过添加5'UTR序列重新设计共有Kozak序列。Kozak序列可以提高一些RNA转录本的翻译效率，但是似乎不是所有RNA能够有效翻译所需的。多种RNA对Kozak序列的要求在本领域中是已知的。在其它实施方式中，5'UTR可以来源于其RNA基因组在细胞中稳定的RNA病毒。在其它实施方式中，多种核苷酸类似物可以用于3'或5'UTR中以阻碍RNA的核酸外切酶降解。
为了使得能够从DNA模板合成RNA而无需基因克隆，应将转录启动子连接至要转录的序列上游的DNA模板。当将起到RNA聚合酶启动子作用的序列加入至正向引物5'末端时，RNA聚合酶启动子被引入要转录的开放阅读框上游的PCR产物中。在一个优选的实施方式中，所述启动子是T7 RNA聚合酶启动子，如在本文其它地方所描述的。其它有用的启动子包括但不限于T3和SP6 RNA聚合酶启动子。T7、T3和SP6启动子的共有核苷酸序列在本领域中是已知的。
在优选的实施方式中，所述RNA在5'端和3'多聚(A)尾具有帽，其决定了核糖体结合、翻译起始以及RNA在细胞中的稳定性。在环状DNA模板上，例如质粒DNA，RNA聚合酶产生长多联体产物，其不适合于在真核细胞中表达。在3'UTR末端线性化的质粒DNA的转录导致产生正常尺寸的RNA，当在转录后多聚腺苷酸化时，它在真核转染中有效。
在线性DNA模板上，噬菌体T7 RNA聚合酶可以将转录本的3'端延伸至模板最后一个碱基之外(Schenborn and Mierendorf,Nuc Acids Res.,13:6223-36(1985)；Nachevaand Berzal-Herranz,Eur.J.Biochem.,270:1485-65(2003))。
多聚A/T段向DNA模板整合的常规方法是分子克隆。然而，整合到质粒DNA中的多聚A/T序列可以引起质粒不稳定性，这可以通过对于质粒增殖的重组非感受态细菌细胞的使用进行改善。
可以在体外转录后，通过使用多聚(A)聚合酶，如大肠杆菌(E.coli)多聚A聚合酶(E-PAP)或酵母多聚A聚合酶进一步延伸RNA的多聚(A)尾。在一个实施方式中，将多聚(A)尾的长度从100个核苷酸提高至300至400个核苷酸导致RNA翻译效率提高至约2倍。另外，不同化学基团与3'端的连接可以提高RNA稳定性。这种连接可以含有修饰/人工核苷酸、适体及其它化合物。例如，可以使用多聚(A)聚合酶将ATP类似物引入多聚(A)尾。ATP类似物可以进一步提高RNA的稳定性。
5'帽还对RNA分子提供稳定性。在优选的实施方式中，通过所述方法产生RNA以包括5'帽1结构。可以使用牛痘封端酶和2'-O-甲基转移酶(CellScript,Madison,WI)产生这种帽1结构。作为另外一种选择，使用本领域中已知的和本文所描述的技术提供5'帽(Cougot等人,Trends in Biochem.Sci.,29:436-444(2001)；Stepinski,等人,RNA,7:1468-95(2001)；Elango,等人,Biochim.Biophys.Res.Commun.,330:958-966(2005))。
多肽试剂
在其它相关方面，所述试剂包括调节靶标的分离的肽。例如，在一个实施方式中，本发明所述的肽直接通过结合至靶标抑制或激活靶标，借此调节所述靶标的正常功能活性。在一个实施方式中，本发明所述的肽通过与内源蛋白竞争调节靶标。在一个实施方式中，本发明所述的肽通过作为反式显性失活突变体起作用来调节靶标的活性。
所述多肽试剂的变体可以是(i)其中一个或多个氨基酸残基被保守或非保守氨基酸残基(优选地保守氨基酸残基)替换的一种变体，并且这种替换的氨基酸残基可以是或可以不是由遗传密码所编码的一种变体，(ii)其中存在一个或多个修饰的氨基酸残基，例如，通过取代基团的连接修饰的残基的一种变体，(iii)其中所述多肽是本发明所述的多肽的可变剪接变体的一种变体，(iv)所述多肽的片段和/或(V)其中所述多肽与另一种多肽，如前导序列或分泌序列或用于纯化(例如，His-标签)或用于检测(例如，Sv5表位标签)的序列融合的一种变体。所述片段包括通过原始序列的蛋白水解切割(包括多位点蛋白水解)所产生的多肽。变体可以翻译后修饰或者化学修饰。根据本文的教导内容，这些变体被认为在本领域技术人员的范围内。
抗体试剂
本发明还考虑了递送载体，其包含对靶标特异的抗体或抗体片段。也就是说，所述抗体可以抑制靶标以提供有益作用。
所述抗体可以是完整单克隆或多克隆抗体，和免疫活性片段(例如，Fab或(Fab)2片段)、抗体重链、抗体轻链、人源化抗体、基因工程单链FV分子(Ladner等人，美国专利号4,946,778)或嵌合抗体，例如，含有鼠科抗体的结合特异性，但是其中剩余部分是人源的抗体。可以使用本领域技术人员已知的方法制备抗体，包括单克隆和多克隆抗体、片段和嵌合体。
可以使用完整多肽或含有所关心的免疫性抗原的片段制备抗体。用于使动物免疫的多肽或寡肽可以得自RNA的翻译或化学合成，并且如果需要，可以缀合至载体蛋白。可以化学偶联至肽的适合的载体包括牛血清白蛋白和甲状球蛋白、钥孔血蓝素。然后，偶联的多肽可以用于使动物(例如，小鼠、大鼠或兔)免疫。
CAR试剂
在一个实施方式中，所述试剂包含编码嵌合抗原受体(CAR)的重组核酸序列。在一个实施方式中，所述试剂包含编码CAR的mRNA分子。在一个实施方式中，所述试剂包含编码CAR的核苷修饰的mRNA分子。
如本文所使用的，术语“嵌合抗原受体”或“CAR”是指工程化以在免疫效应细胞上表达且特异性结合抗原的人工T细胞受体。CAR可以用作使用继承性细胞转移的疗法。从患者除去T细胞并修饰，从而它们表达对抗原的特定形式特异的受体。在一些实施方式中，所述CAR对所选靶标具有特异性。CAR还可以包含胞内激活结构域、跨膜结构域和包含特异性结合至所选靶标的抗原结合区的胞外结构域。在一些方面，CAR包含胞外结构域，所述胞外结构域包含融合至CD3～ζ跨膜结构域和胞内结构域的抗B细胞结合结构域。
在一个实施方式中，本发明涉及包含试剂的递送载体，其中所述试剂包含编码嵌合抗原受体(CAR)的重组核酸序列(例如，mRNA)。在一个实施方式中，所述试剂包含编码嵌合抗原受体(CAR)的mRNA分子(例如，修饰的核苷mRNA分子)。在一个实施方式中，试剂包含编码CAR的mRNA分子。在一个实施方式中，试剂包含编码CAR的核苷修饰的mRNA分子。
在多个实施方式中，本文所考虑的CAR包含胞外结构域、跨膜结构域和胞内结构域。所述胞外结构域包含靶标特异性结合元件，其另外被称为抗原结合结构域。在一些实施方式中，所述胞外结构域还包含铰链域。在某些实施方式中，所述胞内结构域或另外所述胞质结构域包含共刺激信号区和ζ链部分。所述共刺激信号区是指包含共刺激分子的胞内结构域的CAR部分。共刺激分子是除淋巴细胞对抗原有效应答所需的抗原受体或它们的配体以外的细胞表面分子。
在CAR的胞外结构域和跨膜结构域之间或者在CAR的胞质结构域和跨膜结构域之间，存在引入的间隔臂结构域。如本文所使用的，术语“间隔臂结构域”通常表示起作用以将跨膜结构域连接至多肽链中的胞外结构域或胞质结构域的任何寡肽或多肽。间隔臂结构域可以包含至多5个氨基酸，或10个氨基酸，或20个氨基酸，或30个氨基酸，或40个氨基酸，或50个氨基酸，或60个氨基酸，或70个氨基酸，或80个氨基酸，或90个氨基酸，或100个氨基酸，或110个氨基酸，或120个氨基酸，或130个氨基酸，或140个氨基酸，或150个氨基酸，或160个氨基酸，或170个氨基酸，或180个氨基酸，或190个氨基酸，或200个氨基酸，或210个氨基酸，或220个氨基酸，或230个氨基酸，或240个氨基酸，或250个氨基酸，或260个氨基酸，或270个氨基酸，或280个氨基酸，或290个氨基酸，或300个氨基酸。
所述胞外结构域、跨膜结构域和胞内结构域可以来源于这些结构域的任何所期望的来源。
CAR抗原结合结构域
所述抗原结合结构域可以得自任何广泛多种与配体结合和/或信号转导有关的胞外结构域或分泌的蛋白。在一个实施方式中，抗原结合结构域可以由反过来可以借助于CHI和铰链区的存在共价结合Ig轻链的Ig重链组成，或者可以借助于铰链、CH2和CH3结构域的存在与其它Ig重链/轻链复合物变得共价结合。在后一种情况下，变得连接至嵌合构建体的重链/轻链复合物可以构成其特异性不同于所述嵌合构建体的抗体特异性的抗体。根据抗体功能、所期望的结构和信号转导，可以使用整条链或者可以使用截短的链，其中可以除去CHI、CH2或CH3结构域的全部或一部分或者可以除去铰链区的全部或一部分。
在多个实施方式中，所述CAR抗原结合结构域可以是人源化的或者包含完全人序列。
CAR跨膜结构域
相对于跨膜结构域，可以将本发明公开的CAR设计成包含融合至CAR的胞外结构域的跨膜结构域。在一个实施方式中，使用与所述CAR中的结构域之一天然结合的跨膜结构域。在一些情况下，可以选择并通过氨基酸替换修饰所述跨膜结构域以避免这些结构域与相同或不同的表面膜蛋白的跨膜结构域结合以最大程度降低与所述受体复合物的其它成员的相互作用。
所述跨膜结构域可以来源于天然来源或合成来源。当所述来源是天然来源时，所述结构域可以来源于任何膜结合蛋白或跨膜蛋白。在本发明中具有具体用途的跨膜区可以来源于T细胞受体的α、β或ζ链、CD28、CD3ε、CD45、CD4、CD5、CD8、CD9、CD16、CD22、CD33、CD37、CD64、CD80、CD86、CD134、CD137或CD 154(即至少包含它们的跨膜区)。作为另外一种选择，所述跨膜结构域可以是合成的，在这种情况下，它将主要包含疏水性残基，如亮氨酸和缬氨酸。在一个实施方式中，苯丙氨酸、色氨酸和缬氨酸的三联体可以存在于合成跨膜结构域的每个末端。任选地，例如但不限于长度为2至10个氨基酸的短寡肽或多肽接头可以在CAR的跨膜结构域和胞质信号转导结构域之间形成连接。在另一个实施方式中，所述接头包含甘氨酸-丝氨酸双联体。
CAR胞内结构域
在多个实施方式中，CAR的胞质结构域或另外胞内结构域可以负责其中表达CAR的免疫细胞的正常效应因子功能中的至少一种的激活。术语“效应因子功能”是指细胞的特化功能。例如，T细胞的效应因子功能可以是溶胞活性或辅助活性，包括细胞因子的分泌。术语“胞内信号转导域”是指转导效应因子功能信号并且指导细胞实施特化功能的蛋白部分。尽管通常可以使用整个胞内结构域，但是在多数情况下，不必需使用整条链。在使用胞内结构域的截短部分的程度上，可以使用该截短部分来代替完整链，只要它转导效应因子功能信号。因此，术语胞内结构域表示包括足以转导效应因子功能信号的胞内结构域的任何截短部分。
用于在本发明公开的CAR中使用的胞内结构域的优选实例包括在抗原受体接合后一致作用以起始信号转导的T细胞受体(TCR)和共受体的胞质序列，以及这些序列的任何衍生物或变体和具有相同功能能力的任何合成序列。
已知单独提供TCR产生的信号不足以完全激活T细胞并且还需要第二或共刺激信号。因此，据称可以通过两种类型的胞内信号序列介导T细胞激活：通过TCR引起抗原依赖性初始激活的那些(初始胞质信号序列)，和以独立于抗原的方式起作用以提供第二或共刺激信号的那些(第二胞质信号序列)。
初始胞内信号序列以刺激性方式或者以抑制性方式调节TCR复合物的初始激活。以刺激性方式起作用的初始胞内信号序列可以含有被称为免疫受体酪氨酸基激活基序或ITAM的信号转导基序。
含有在本发明中特别有用的初始胞内信号序列的ITAM的实例包括来源于TCRζ、FcRγ、FcRβ、CD3γ、CD3δ、CD3ε、CD5、CD22、CD79a、CD79b和CD66d的那些。在一个实施方式中，本发明的CAR中的胞内信号分子包含来源于CD3ζ的胞内信号序列。
在另一个实施方式中，可以设计CAR的胞内结构域以包含CD3-ζ信号转导结构域本身或者与在本发明的CAR的背景中有用的任何其它所期望的胞质结构域组合。例如，CAR的胞内结构域可以包含CD3ζ链部分和共刺激信号区。所述共刺激信号区是指包含共刺激分子的胞内结构域的CAR部分。共刺激分子是除抗原受体或它们的配体以外的细胞表面分子，它是淋巴细胞对抗原的有效应答所需的。这些分子的实例包括CD2、CD27、CD28、4-1BB(CD137)、Ox40、CD30、CD40、PD-1、ICOS、淋巴细胞功能相关抗原-1(LFA-1)、CD2、CD7、LIGHT、NKG2C、B7-H3和与CD83特异性结合的配体等。
本发明的CAR的胞内结构域内的胞内信号序列可以以随机或所指明的顺序彼此连接。任选地，短寡或多肽接头(例如，2至10个氨基酸长的接头)可以形成键。在一些实施方式中，甘氨酸-丝氨酸二联体提供了适合的接头。
在一个实施方式中，设计所述胞内结构域以包含CD3-ζ的信号转导结构域和CD28的信号转导结构域。在另一个实施方式中，设计所述胞内结构域以包含CD3-ζ的信号转导结构域和4-IBB的信号转导结构域。
所述抗原结合结构域可以是结合至抗原的任何结构域，所述抗原包括但不限于单克隆抗体、多克隆抗体、合成抗体、scFv、人抗体、人源化抗体及其片段。在一个非限制性实施方式中，所述抗原结合区特异性结合至所选靶标，例如，激活的成纤维细胞表面受体(如CD90、FAP、FSP-1、CD140a、CD140b、CD49b、CD87、CD95、α平滑肌肌动蛋白(αSMA)或者血小板源生长因子β(PDGFRβ))。
在多个实施方式中，所述CAR可以是“第一代”、“第二代”、“第三代”、“第四代”或“第五代”CAR(例如，参见Sadelain等人,Cancer Discov.3(4):388-398(2013)；Jensen等人,Immunol.Rev.257:127-133(2014)；Sharpe等人,Dis.Model Mech.8(4):337-350(2015)；Brentjens等人,Clin.Cancer Res.13:5426-5435(2007)；Gade等人,CancerRes.65:9080-9088(2005)；Maher等人,Nat.Biotechnol.20:70-75(2002)；Kershaw等人,J.Immunol.173:2143-2150(2004)；Sadelain等人,Curr.Opin.Immunol.(2009)；Hollyman等人,J.Immunother.32:169-180(2009)，每篇文献以其全部作为参考并入)。
用于在本发明中使用的“第一代”CAR包含融合至跨膜结构域的抗原结合结构域，例如，单链可变片段(scFv)，其融合至T细胞受体链的细胞质/胞内结构域。“第一代”CAR通常具有来自CD3ζ链的胞内结构域，它是来自内源T细胞受体(TCR)的初始信号发射器。“第一代”CAR可以提供从头抗原识别并独立于HLA介导的抗原递呈，通过单一融合分子中的它们的CD3ζ链信号转导结构域引起CD4+和CD8+ T细胞的激活。
用于在本发明中使用的“第二代”CAR包含抗原结合结构域，例如，单链可变片段(scFv)，其融合至能够激活T细胞的胞内信号转导域和设计以放大T细胞效力和持久性的共刺激结构域(Sadelain等人,Cancer Discov.3:388-398(2013))。因此，CAR设计可以将抗原识别与信号转导组合，这两种功能是两种不同复合物(TCR异源二聚体和CD3复合物)生理学所具有的。“第二代”CAR在CAR的胞质尾中包括来自多种共刺激分子，例如，CD28、4-1BB、ICOS、OX40等的胞内结构域，从而为所述细胞提供额外的信号。
“第二代”CAR例如通过CD28或4-1BB结构域提供共刺激，并且例如通过CD3ζ信号转导结构域提供激活。临床前研究已表明“第二代”CAR可以改善T细胞的抗肿瘤活性。例如，在靶向慢性淋巴细胞性白血病(CLL)和急性淋巴母细胞性白血病(ALL)患者中的CD19分子的临床试验中，证实了“第二代”CAR修饰的T细胞的稳健效力(Davila等人,Oncoimmunol.1(9):1577-1583(2012))。
“第三代”CAR例如通过包含CD28或4-1BB结构域提供多个共刺激，并且例如通过包含CD3ζ信号转导结构域提供激活。
除组成型或诱导型趋化因子组分之外，“第四代”CAR例如通过CD28或4-1BB结构域提供了共刺激，并且例如通过CD3ζ信号转导结构域提供了激活。
“第五代”CAR例如通过CD28或4-1BB结构域提供共刺激，并且例如通过CD3ζ信号转导结构域、组成型或诱导型趋化因子组分和细胞因子受体的胞内结构域，例如，IL-2Rβ提供激活。
在多个实施方式中，CAR可以包括于多价CAR系统中，例如，DualCAR或“TandemCAR”系统。多价CAR系统包括包含多个CAR的系统或细胞和包含靶向多于一种抗原的二价/双重特异性CAR的系统或细胞。
在本文所公开的实施方式中，CAR通常包含抗原结合结构域、跨膜结构域和胞内结构域，如以上所描述的。在具体的非限制性实施方式中，所述抗原结合结构域是scFv。
在一个实施方式中，所述抗原结合结构域是靶向结构域，其中所述靶向结构域将表达CAR的T细胞引导至所关心的特定细胞或组织。例如，在一个实施方式中，所述靶向结构域包含抗体、抗体片段或者特异性结合至抗原(例如，salef抗原或外源抗原)的肽，借此将表达CAR的T细胞重定向至表达所述抗原的细胞或组织。
可以产生对任何所期望的所关心的抗原具有反应性的本发明的CAR分子的抗原结合结构域，所述抗原包括但不限于肿瘤抗原、外源抗原(例如，细菌抗原或病毒抗原)或自体抗原。
肿瘤抗原是通过引起免疫应答的肿瘤细胞所产生的蛋白。本发明所述的含有VM结构域的融合分子的抗原结合结构域的选择将取决于要治疗的具体癌症类型。肿瘤抗原在本领域中是熟知的并且例如包括神经胶质瘤相关抗原、癌胚抗原(CEA)、β-人绒毛膜促性腺激素、甲胎蛋白(AFP)、凝集素反应性AFP、甲状球蛋白、RAGE-1、MN-CA IX、人端粒酶反转录酶、RU1、RU2(AS)、小肠羧基酯酶、mut hsp70-2、M-CSF、前列腺酶、前列腺特异性抗原(PSA)、PAP、NY-ESO-1、LAGE-1a、p53、前列腺特异性蛋白、PSMA、Her2/neu、存活素和端粒酶、前列腺癌瘤肿瘤抗原-1(PCTA-1)、MAGE、ELF2M、嗜中性白细胞弹性酶、ephrinB2、CD22、胰岛素生长因子(IGF)-I、IGF-II、IGF-I受体和间皮素。另一种示例性肿瘤抗原是硫酸软骨素蛋白聚糖4(CSPG4)(也称为黑素瘤相关硫酸软骨素蛋白聚糖(MCSP)、高分子量黑素瘤相关抗原(HMW-MAA)或者神经元-神经胶质抗原2(NG2))。
在一个实施方式中，所述肿瘤抗原包含与恶性肿瘤有关的一种或多种抗原性癌症表位。恶性肿瘤表达可以用作用于免疫攻击的靶标抗原的一些蛋白。这些分子包括但不限于黑素瘤中的组织特异性抗原，如MART-1、酪氨酸酶和GP 100以及前列腺癌中的前列腺酸性磷酸酶(PAP)和前列腺特异性抗原(PSA)。其它靶标分子属于转化相关分子组，如致癌基因HER-2/Neu/ErbB-2。另一组靶标抗原是肿瘤-胚胎抗原(onco-fetal antigens)，例如癌胚抗原(CEA)。在B细胞淋巴瘤中，肿瘤特异性独特型免疫球蛋白构成个体肿瘤独特的真正地肿瘤特异性的免疫球蛋白抗原。B细胞分化抗原，如CD19、CD20和CD37是B细胞淋巴瘤中靶标抗原的其它候选。这些抗原中的一些(CEA、HER-2、CD19、CD20、独特型)已用作单克隆抗体被动免疫疗法的靶标，但成效有限。
本发明中所提及的肿瘤抗原类型也可以是肿瘤特异性抗原(TSA)或者肿瘤相关抗原(TAA)。TSA对肿瘤细胞是独特的并且不发生在体内其它细胞上。TAA相关抗原不是肿瘤细胞独有的，并且相反在无法诱导对抗原免疫耐受状态的条件下也在正常细胞上表达。抗原在肿瘤上的表达可在使得免疫系统能够对抗原作出应答的条件下发生。TAA可以是当免疫系统不成熟并且不能应答时在胚胎发育期间在正常细胞上表达的抗原，或者其可以是在正常细胞上通常以极低水平存在但在肿瘤细胞上以高得多的水平表达的抗原。
TSA或TAA的非限制性实例包括下列：分化抗原，如MART-1/MelanA(MART-1)、gp100(Pmel 17)、酪氨酸酶、TRP-1、TRP-2以及肿瘤特异性多谱系抗原，如MAGE-1、MAGE-3、BAGE、GAGE-1、GAGE-2、p15；过表达的胚胎抗原，如CEA；过表达的致癌基因和突变的肿瘤抑制基因，如p53、Ras、HER-2/neu；由染色体易位造成的独特的肿瘤抗原；如BCR-ABL、E2A-PRL、H4-RET、IGH-IGK、MYL-RAR；以及病毒抗原，如Epstein Barr病毒抗原EBVA和人乳头瘤病毒(HPV)抗原E6和E7。其它大型基于蛋白质的抗原包括TSP-180、MAGE-4、MAGE-5、MAGE-6、RAGE、NY-ESO、p185erbB2、p180erbB-3、c-met、nm-23H1、PSA、TAG-72、CA 19-9、CA 72-4、CAM17.1、NuMa、K-ras、β-连环素、CDK4、Mum-1、p 15、p 16、43-9F、5T4、791Tgp72、α-胎儿球蛋白、β-HCG、BCA225、BTAA、CA 125、CA 15-3\CA 27.29\BCAA、CA 195、CA 242、CA-50、CAM43、CD68\P1、CO-029、FGF-5、G250、Ga733\EpCAM、HTgp-175、M344、MA-50、MG7-Ag、MOV18、NB/70K、NY-CO-1、RCAS1、SDCCAG16、TA-90\Mac-2结合蛋白\亲环蛋白C相关蛋白、TAAL6、TAG72、TLP和TPS。
外源抗原可以是病毒抗原、细菌抗原、真菌抗原、寄生虫抗原或其片段，或其变体。在本文其它处讨论了可以使用本发明所述的组合物和方法靶向的示例性病毒、细菌、真菌和寄生虫。
双重特异性T细胞衔接体(例如，BiTE)试剂
在另一个实施方式中，本发明公开所述的核酸货物分子(例如，mRNA、表达载体、CRISPR基因组编辑系统或者核苷修饰的mRNA分子)可以编码特异性结合至免疫细胞(例如，CD4+ T细胞)上的抗原和所关心的细胞，例如，病原体上的抗原两者的双重特异性T细胞衔接体。
双重特异性T细胞衔接体是通过将两种抗体的靶向区(即抗原结合域)连接成单一分子所产生的双重特异性分子。将所述分子的一个臂工程化以结合CD4+ T细胞表面上存在的蛋白，并且将另一个臂设计以结合主要在靶细胞上存在的特异性蛋白质。当两个靶标接合时，双重特异性T细胞衔接体(即BiTE分子)在CD4+ T细胞和靶细胞之间形成桥接。例如，在一个实施方式中，靶细胞是激活的成纤维细胞并且BiTE分子包含对于与成纤维细胞特异性标志物的结合特异的结合臂。成纤维细胞特异性标志物包括但不限于CD90、FAP、FSP-1、CD140a、CD140b、CD49b、CD87、CD95、α平滑肌肌动蛋白(αSMA)和血小板源生长因子β(PDGFRβ)。还可以参考Diego Ellerman,“Bispecific T-cell engagers:Towards understandingvariable influencing the in vitro potency and tumor selectivity and theirmodulation to enhance their efficacy and safety,”Methods,第154卷,2019年2月,第102-117页，该文献作为参考并入本文。
术语“双重特异性”是指双重特异性分子(例如，双重特异性T细胞衔接体)能够特异性结合至至少两种不同的抗原决定簇(例如，一种来自CD4+ T细胞并且另一种来自靶细胞，如病原体)。通常，双重特异性抗原结合分子包含两个抗原结合位点，它们中的每一个对于不同的抗原决定簇特异。在某些实施方式中，所述双重特异性抗原结合分子能够同时结合两种抗原决定簇，特别是在两种不同的细胞上表达的两种抗原决定簇。
本发明公开不局限于BiTE形式，但是考虑使用适合于T细胞重定向的任何适合的双重特异性形式，包括双链抗体(Holliger等人,Prot Eng 9,299-305(1996))及其衍生物，如串联双链抗体(Kipriyanov等人,J Mol Biol293,41-66(1999))、DART(双重亲和力重靶向)分子，其基于双链抗体形式，但是具有用于另外稳定的C末端二硫桥键(Moore等人,Blood 117,4542-51(2011))和三功能抗体(triomab)，它是完整杂交小鼠/大鼠IgG分子，并且目前正在临床试验中进行评价，代表了较大尺寸的形式(在Seimetz等人,Cancer TreatRev 36,458-467(2010)中综述)。以上参考文献中的每一篇作为参考并入本文。
用于制备双重特异性抗体的方法在本领域中是已知的。(例如，参见Millstein等人,Nature,305:537-539(1983)；Traunecker等人,EMBOJ.,10:3655-3659(1991)；Suresh等人,Methods in Enzymology,121:210(1986)；Kostelny等人,J.Immunol.148(5):1547-1553(1992)；Hollinger等人,PNAS USA,90:6444-6448(1993)；Gruber等人,J.Immunol.152:5368(1994)；美国专利号4,474,893；4,714,681；4,925,648；5,573,920；5,601,81；95,731,168；4,676,980；和4,676,980、WO 94/04690；WO 91/00360；WO 92/200373；WO 93/17715；WO 92/08802；和EP 03089)。这些与制备双重特异性抗体，包括BiTE有关的上述参考文献中的每一篇作为参考并入本文。
在实践本文所描述的方法中有用的示例性双重特异性抗体分子包含(i)两种抗体，第一抗体对靶细胞表面上表达的抗原具有结合特异性，并且第二抗体对于在免疫细胞(例如，CD4+ T细胞)表面上表达的抗原具有结合特异性，(ii)单一抗体，其具有对靶细胞表面上表达的抗原具有结合特异性的一条链或臂，和对免疫细胞(例如，CD4+ T细胞)具有结合特异性的第二链或臂，(iii)单链抗体，其对靶细胞表面上表达的抗原具有结合特异性并且还对免疫细胞(例如，CD4+ T细胞)具有结合特异性，例如，经由通过额外的肽接头串联连接的两个scFv；(iv)双可变结构域抗体(DVD-Ig)，其中每条轻链和重链含有通过短肽键串联的两个可变域；(v)化学连接的双重特异性(Fab')2片段；(vi)Tandab，它是两个单链双链抗体的融合蛋白，其导致产生对靶标抗原中的每一个具有两个结合位点的四价双重特异性抗体；(vii)柔性抗体(具有双链抗体的scFv的组合，其导致产生多价分子)；(viii)所谓的“对接锁定”分子(蛋白激酶A中的“二聚化和对接结构域”的调节，其可以应用于Fab以产生含有连接至不同Fab片段的两个相同的Fab片段的三价双重特异性结合蛋白；(ix)所谓的“蝎形(Scorpion)“分子，例如其含有融合至人Fc区的两个末端的两个scFv；(x)双链抗体；和(xi)所谓的“ImmTAC”分子(对癌症的免疫动员mTCR；例如，参见Liddy等人,Nat.Med.18:980-987(2012))。
成像剂
在一个实施方式中，所述递送载体包含成像剂。成像剂是允许所述递送载体在对细胞或组织暴露后显象的材料。显象包括对于肉眼的成像，以及需要用仪器检测或者检测通常对眼睛不可见的信息的成像，并且包括需要检测光子、声音或其它能量子的成像。实例包括：染色剂、活体染料、荧光标志物、放射性标记物、酶或者编码标志物或酶的质粒构建体。可以在递送载体中使用的用于成像和靶向的多种材料和方法提供于Handbook ofTargeted delivery of Imaging Agents,Torchilin主编,(1995)CRC Press,Boca Raton,Fla。
基于分子成像的显像通常包括在组织、细胞或分子水平检测生物过程或生物分子。分子成像可以用于评价用于基因疗法、细胞基疗法的具体靶标，并且作为诊断或研究工具用于使病理学状况显象。能够胞内递送的成像剂是特别有用的，因为这些试剂可以用于评价胞内活性或状况。成像剂必须有效地达到它们的靶标；因此，在一些实施方式中，细胞的有效吸收是所期望的。快速吸收还可以是所期望的以避免RES，参见以下中的综述：Allport and Weissleder,Experimental Hematology 1237-1246(2001)。
此外，成像剂优选地应提供高信噪比，从而可以以少量检测它们，无论是直接还是通过提高与特定靶标有关的信号的有效放大技术。放大策略综述于：Allport andWeissleder,Experimental Hematology 1237-1246(2001)并且例如包括抗生物素蛋白-生物素结合系统、转化配体捕捉、靶标结合后改变物理行为的探针和利用驰豫速度。成像技术的实例包括磁共振成象、放射性核素成像、计算机断层成像、超声波和光学成象。
如本文所述的递送载体可以有利地用于多种成像技术或策略，例如，通过将成像剂引入递送载体。多种成像技术和策略是已知的，例如，参见以下中的综述：Allport andWeissleder,Experimental Hematology 1237-1246(2001)；这些策略可以适合于与递送载体一起使用。适合的成像剂包括例如荧光分子、标记的抗体、标记的抗生物素蛋白:生物素结合剂、胶态金属(例如，金、银)、报告酶(例如，辣根过氧化物酶)、超顺磁转铁蛋白、第二报告分子系统(例如，酪氨酸酶)和顺磁螯合物。
在一些实施方式中，所述成像剂是磁共振成象造影剂。磁共振成象造影剂的实例包括但不限于1,4,7,10-四氮杂环十二烷-N,N',N”N”'-四乙酸(DOTA)、二乙烯三胺五乙酸(DTPA)、1,4,7,10-四氮杂环十二烷-N,N',N”,N”'-四乙基磷(DOTEP)、1,4,7,10-四氮杂环十二烷-N,N',N”-三乙酸(DOTA)及其衍生物(参见美国专利号5,188,816、5,219,553和5,358,704)。在一些实施方式中，所述成像剂是X射线造影剂。本领域中已知的X射线造影剂包括5-氨基-间苯二甲酸的一些卤化衍生物，特别是碘化衍生物。
小分子试剂
在多个实施方式中，所述试剂是小分子。当所述试剂是小分子时，可以使用技术人员已知的标准方法获得小分子。这些方法包括化学有机合成或生物方法。生物方法包括使用本领域中熟知的方法，从生物来源纯化、重组合成和体外翻译系统。在一个实施方式中，小分子试剂包含有机分子、无机分子、生物分子、合成分子等。
在治疗多种疾病和病况中潜在有用的分子多样性化合物的组合文库以及制备所述文库的方法在本领域中是熟知的。所述方法可以使用多种技术人员熟知的技术，其包括固相合成、溶液法、单个化合物的平行合成、化学混合物的合成、刚性核心结构、柔性线性序列、反卷积策略(deconvolution strategies)、标签技术和产生用于先导化合物发现的无偏分子图谱vs.用于先导化合物开发的偏差结构。在本发明的一些实施方式中，使用组合技术合成和/或标识所述试剂。
在小型文库合成的一般方法中，将激活的核心分子与一些构建块缩合，从而导致产生了共价连接的核心-构建块集合体的组合文库。所述核芯的形状和刚性决定了所述构建块在形状空间中的取向。可以通过改变核芯、键或构建块使文库偏倚以靶向特征化生物结构(“针对性文库(focused libraries)”)或者可以使用柔性核芯以较低的结构偏倚合成文库。在本发明的一些实施方式中，经由小文库合成来合成所述试剂。
即使未显示盐，本文所述的小分子和小分子化合物可以作为盐存在，并且应理解本发明涵盖了本文所示的试剂的所有盐和溶剂化物以及所述试剂的非盐和非溶剂化物形式，如技术人员所熟知的。在一些实施方式中，本发明所述的试剂的盐是药物可用的盐。
当对于任何本文所述的试剂可以存在互变异构形式时，每种互变异构形式旨在包含在本发明中，尽管可能仅明确显示了一种或一些互变异构形式。例如，当显示2-羟基吡啶基部分时，还预期显示了相应的2-吡啶酮互变异构体。
本发明还包括任何或全部立体化学形式，包括所述试剂的任何对映体或非对映体形式。在本文中对结构或名称的列举旨在涵盖所示试剂的全部可能的立体异构体。本发明还涵盖了所述试剂的所有形式，如所述试剂的结晶或非结晶形式。还预期了包含本发明的试剂的组合物，如包含其特定立体化学形式的基本纯的试剂的组合物，或者以任何比例包含本发明的试剂，包括两种或更多种立体化学形式的混合物，如外消旋或非外消旋混合物的组合物。
本发明还包括本文所描述的任何试剂的任何或所有活性类似物或衍生物，如前体药物。在一个实施方式中，所述试剂是前体药物。在一个实施方式中，本文所述的小分子是用于衍生化的候选分子。照此，在某些情况下，本文包括了具有调节的效力、选择性和溶解度的本文所述的小分子的类似物并且提供了用于药物发现和药物开发的有用的先导化合物。因此，在某些情况下，在优化期间，考虑药物递送、代谢、新颖性和安全性等问题，设计了新的类似物。
在一些情况下，如组合和药物化学领域中所熟知的，本文所描述的小分子试剂是已知试剂的衍生物或类似物。可以通过在不同位置上添加和/或取代官能团来制备类似物或衍生物。照此，可以使用熟知的化学合成程序将本文所述的小分子转化为衍生物/类似物。例如，可以选择性修饰所有氢原子或取代基以产生新的类似物。另外，可以将连接原子或基团修饰成具有碳主链或杂原子的更长或更短的接头。另外，可以改变所述环基团以在所述环中具有不同个数的原子和/或以包含杂原子。此外，芳香族可以转化为环，并且反之亦然。例如，所述环可以为5-7个原子，并且可以是碳环的或杂环的。
如本文所使用的，术语“拟物(analog)”、“类似物(analogue)”或“衍生物”意在表示通过一种或多种化学反应从母体化合物或分子所制备的化合物或分子。照此，类似物可以是具有与本文所述的小分子试剂类似的结构的结构或者可以基于本文所述的小分子试剂的骨架，但是相对于某些组件或结构组成而与之不同，其在代谢上可以具有类似或相反的作用。根据本发明的任何小分子抑制剂的类似物或衍生物可以用于治疗疾病或病症。
在一个实施方式中，可以通过将氢基彼此独立地修饰为其它取代基来使本文所述的小分子试剂独立地衍生化，或由此制备类似物。也就是说，可以相对于相同分子上的其它原子来独立地修饰每个分子上的每个原子。可以使用用于产生衍生物/类似物的任何常规修饰。例如，所述原子和取代基可以独立地由氢、烷基、脂族、直链脂族、具有链杂原子的脂族、支链脂族、取代的脂族、环脂族、具有一个或多个杂原子的杂环脂族、芳族、杂芳族、多芳族、聚氨基酸、肽、多肽、其组合、卤素、卤代取代的脂族等组成。另外，可以使化合物上的任何环基团衍生化以提高和/或降低环尺寸以及将主链原子改变为碳原子或杂原子。
递送载体
在一些实施方式中，本发明涉及包含用于递送一种或多种试剂的递送载体的组合物。在一些实施方式中，所述试剂包含本发明的mRNA分子(例如，核苷修饰的mRNA分子)。
在一些实施方式中，所述递送载体是胶体分散体系统，如大分子复合物、纳米胶囊、微球体、珠和脂质基系统，包括水包油乳液、胶束、混合胶束和脂质体。用作体外和体内递送载体的示例性胶体系统是脂质体(例如，人工膜囊)。
脂质制剂的使用旨在用于将至少一种试剂(体外、离体或体内)引入宿主细胞。在另一个方面，所述至少一种试剂可以与脂质结合。可以将与脂质结合的至少一种试剂包封在脂质体的水性内部、分散在脂质体的脂质双分子层内、通过与脂质体和寡核苷酸两者结合的连接分子连接至脂质体、包埋在脂质体中、与脂质体复合、分散在含有脂质的溶液中、与脂质混合、与脂质合并、作为混悬液包含在脂质中、包含或与胶束复合或另外与脂质结合。脂质、脂质/核酸或脂质/表达载体相关组合物不局限于溶液中的任何特定结构。例如，它们可以以双分子层结构、作为胶束或通过“塌缩”结构存在。它们还可以简单地散布在溶液中，可能地形成尺寸或形状不均一的聚集体。脂质是可以天然存在的脂肪物质或者合成脂质。例如，脂质包括天然存在于细胞质中的脂肪滴以及含有长链脂肪族烃和它们的衍生物的化合物种类，如脂肪酸、醇、胺、氨基醇和醛。
脂质及其衍生物
在多个实施方式中，所述递送载体可以包含脂质或其衍生物。
脂质是可以天然存在的脂肪物质或者合成脂质。例如，脂质包括天然存在于细胞质中的脂肪滴以及含有长链脂肪族烃和它们的衍生物的化合物种类，如脂肪酸、醇、胺、氨基醇、醛和聚合物(例如，PEG化脂质)。
适合使用的脂质可以得自商品化来源。例如，二豆蔻基磷脂酰胆碱(“DMPC”)可以得自Sigma,St.Louis,MO；联十六烷基磷酸酯(“DCP”)可以得自K&K Laboratories(Plainview,NY)；胆固醇(“Chol”)可以得自Calbiochem-Behring；二豆蔻基磷脂酰甘油(“DMPG”)及其它脂质可以得自Avanti Polar Lipids,Inc.(Birmingham,AL)。脂质在氯仿或氯仿/甲醇中的储液可以储存在约-20℃。由于比甲醇更易于蒸发，因此将氯仿用作唯一的溶剂。
在一些实施方式中，阳离子脂质是优选的。在某些实施方式中，阳离子脂质包含在选择性pH，如生理学pH携带净正电荷的任何一些脂质物质。这类脂质包括但不限于N,N-二油烯基-N,N-二甲基氯化铵(DODAC)；N-(2,3-二油烯基氧基)丙基)-N,N,N-三甲基氯化氨(DOTMA)；N,N-二硬脂酰-N,N-二甲基溴化铵(DDAB)；N-(2,3-二油酰基氧基)丙基)-N,N,N-三甲基氯化氨(DOTAP)；3-(N-(N',N'-二甲基氨基乙烷)-氨基甲酰基)胆固醇(DC-Chol)、N-(1-(2,3-二油酰基氧基)丙基)-N-2-(精胺甲酰胺)乙基)-N,N-二甲基三氟乙酸铵(DOSPA)、双十八烷基氨基甘氨酰羧基精胺(DOGS)、1,2-二油酰基-3-二甲基铵丙烷(DODAP)、N,N-二甲基-2,3-二油酰基氧基丙胺(DODMA)和N-(1,2-二肉豆蔻基氧代丙-3-基)-N,N-二甲基-N-羟乙基溴化铵(DMRIE)。另外，可以在本发明中使用的一些阳离子脂质的商品化制剂是可获得的。例如，这些包括(可商购的阳离子脂质体，其包含DOTMA和1,2-二油酰基-sn-3-磷酸乙醇胺(DOPE)，来自GIBCO/BRL，Grand Island,N.Y.)；(可商购的阳离子脂质体，其包含N-(1-(2,3-二油烯基氧基)丙基)-N-(2-(精胺甲酰胺)乙基)-N,N-二甲基三氟乙酸铵(DOSPA)和(DOPE)，来自GIBCO/BRL)；和(可商购的阳离子脂质，其包含处于乙醇中的双十八烷基氨基甘氨酰羧基精胺(DOGS)，来自Promega Corp.,Madison,Wis.)。以下脂质是阳离子的并且在低于生理学pH下具有正电荷：DODAP、DODMA、DMDMA、1,2-二亚油基氧基-N,N-二甲基氨基丙烷(DLinDMA)、1,2-二亚麻酰基氧基-N,N-二甲基氨基丙烷(DLenDMA)。
在一个实施方式中，所述阳离子脂质是氨基脂质。在本发明中有用的适合的氨基脂质包括WO 2012/016184中所述的那些，该专利以其全部内容作为参考并入本文。代表性的氨基脂质包括但不限于1,2-二亚油基氧基-3-(二甲基氨基)乙酰氧基丙烷(DLin-DAC)、1,2-二亚油基氧基-3-吗啉代丙烷(DLin-MA)、1,2-二亚油酰基-3-二甲基氨基丙烷(DLinDAP)、1,2-二亚油基硫代-3-二甲基氨基丙烷(DLin-S-DMA)、1-亚油酰基-2-亚油基氧基-3-二甲基氨基丙烷(DLin-2-DMAP)、1,2-二亚油基氧基-3-三甲基氨基丙烷氯化物盐(DLin-TMA.Cl)、1,2-二亚油酰基-3-三甲基氨基丙烷氯化物盐(DLin-TAP.Cl)、1,2-二亚油基氧基-3-(N-甲基哌嗪并)丙烷(DLin-MPZ)、3-(N,N-二亚油基氨基)-1,2-丙二醇(DLinAP)、3-(N,N-二油烯基氨基)-1,2-丙二醇(DOAP)、1,2-二亚油基氧代-3-(2-N,N-二甲基氨基)乙氧基丙烷(DLin-EG-DMA)和2,2-二亚油基-4-二甲基氨基甲基-[1,3]-二氧戊环(DLin-K-DMA)。
适合的氨基脂质包括具有化学式的那些：
其中R1和R2是相同或不同的并且独立地为任选地取代的C10-C24烷基、任选地取代的C10-C24烯基、任选地取代的C10-C24炔基或者任选地取代的C10-C24酰基；
R3和R4是相同或不同的并且独立地为任选地取代的C1-C6烷基、任选地取代的C2-C6烯基或任选地取代的C2-C6炔基，或者R3和R4可以连接以形成具有4至6个碳原子和选自氮和氧的1或2个杂原子的任选地取代的杂环；
R5是不存在或存在的，并且当存在时，是氢或C1-C6烷基；
m、n和p是相同或不同的，并且独立地为0或1，但条件是m、n和p不同时为0；
q是0、1、2、3或4；和
Y和Z是相同或不同的并且独立地为O、S或NH。
在一个实施方式中，R1和R2分别为亚油基(亚油醇基，linoleyl)，并且氨基脂质是二亚油基氨基脂质。在一个实施方式中，氨基脂质是二亚油基氨基脂质。
代表性的有用的二亚油基氨基脂质具有以下化学式：
其中n是0、1、2、3或4。
在一个实施方式中，阳离子脂质是DLin-K-DMA。在一个实施方式中，阳离子脂质是DLin-KC2-DMA(以上的DLin-K-DMA，其中n是2)。
在一个实施方式中，LNP的阳离子脂质组分具有式(I)的结构：
或其药物可用的盐、互变异构体、前体药物或立体异构体，其中：
L1和L2各自独立地为-O(C＝O)-、-(C＝O)O-或碳-碳双键；
R1a和R1b在每次出现时独立地为(a)H或C1-C12烷基，或者(b)R1a为H或C1-C12烷基，并且R1b与它所结合的碳原子一起和相邻的R1b以及与它所结合的碳原子结合在一起以形成碳-碳双键；
R2a和R2b在每次出现时独立地为(a)H或C1-C12烷基，或(b)R2a为H或C1-C12烷基，并且R2b与它所结合的碳原子一起和相邻的R2b以及与它所结合的碳原子结合在一起以形成碳-碳双键；
R3a和R3b在每次出现时独立地为(a)H或C1-C12烷基，或(b)R3a为H或C1-C12烷基，并且R3b与它所结合的碳原子一起和相邻的R3b以及与它所结合的碳原子结合在一起以形成碳-碳双键；
R4a和R4b在每次出现时独立地为(a)H或C1-C12烷基，或(b)R4a为H或C1-C12烷基，并且R4b与它所结合的碳原子一起和相邻的R4b以及与它所结合的碳原子结合在一起以形成碳-碳双键；
R5和R6各自独立地为甲基或环烷基；
R7在每次出现时独立地为H或C1-C12烷基；
R8和R9各自独立地为C1-C12烷基；或者R8和R9与它们所连接的氮原子一起形成包含一个氮原子的5、6或7元杂环；
a和d各自独立地为0至24的整数；
b和c各自独立地为1至24的整数；和
e是1或2。
在式(I)的某些实施方式中，R1a、R2a、R3a或R4a中的至少一个是C1-C12烷基或者L1或L2中的至少一个是-O(C＝O)-或-(C＝O)O-。在其它实施方式中，当a为6时，R1a和R1b不是异丙基，或者当a为8时，R1a和R1b不是正丁基。
在式(I)的其它实施方式中，R1a、R2a、R3a或R4a中的至少一个是C1-C12烷基或者L1或L2中的至少一个是-O(C＝O)-或-(C＝O)O-；且
当a为6时，R1a和R1b不是异丙基，或者当a为8时，R1a和R1b不是正丁基。
在式(I)的其它实施方式中，R8和R9各自独立地为未取代的C1-C12烷基；或者R8和R9与它们所连接的氮原子一起形成包含一个氮原子的5、6或7元杂环；
在式(I)的某些实施方式中，L1或L2中的任一个可以是-O(C＝O)-或碳-碳双键。L1和L2分别可以是-O(C＝O)-或者分别可以是碳-碳双键。
在式(I)的一些实施方式中，L1或L2之一是-O(C＝O)-。在其它实施方式中，L1和L2两者为-O(C＝O)-。
在式(I)的一些实施方式中，L1或L2之一是-(C＝O)O-。在其它实施方式中，L1和L2两者为-(C＝O)O-。
在式(I)的一些其它实施方式中，L1或L2之一是碳-碳双键。在其它实施方式中，L1和L2两者为碳-碳双键。
在式(I)的其它实施方式中，L1或L2之一是-O(C＝O)-并且L1或L2中的另一个是-(C＝O)O-。在更多实施方式中，L1或L2之一是-O(C＝O)-并且L1或L2中的另一个是碳-碳双键。在更多实施方式中，L1或L2之一是-(C＝O)O-并且L1或L2中的另一个是碳-碳双键。
应理解如在整个说明书中所使用的，“碳-碳”双键是指以下结构之一：
其中Ra和Rb在每次出现时独立地为H或取代基。例如，在一些实施方式中，Ra和Rb在每次出现时独立地为H、C1-C12烷基或环烷基，例如，H或C1-C12烷基。
在其它实施方式中，式(I)的脂质化合物具有以下结构(Ia)：
在其它实施方式中，式(I)的脂质化合物具有以下结构(Ib)：
在其它实施方式中，式(I)的脂质化合物具有以下结构(Ic)：
在式(I)的脂质化合物的某些实施方式中，a、b、c和d各自独立地为2至12的整数或者4至12的整数。在其它实施方式中，a、b、c和d各自独立地为8至12或5至9的整数。在一些特定的实施方式中，a是0。在一些实施方式中，a是1。在其它实施方式中，a是2。在更多实施方式中，a是3。在其它实施方式中，a是4。在一些实施方式中，a是5。在其它实施方式中，a是6。在更多实施方式中，a是7。在其它实施方式中，a是8。在一些实施方式中，a是9。在其它实施方式中，a是10。在更多实施方式中，a是11。在其它实施方式中，a是12。在一些实施方式中，a是13。在其它实施方式中，a是14。在更多实施方式中，a是15。在其它实施方式中，a是16。
在式(I)的一些其它实施方式中，b是1。在其它实施方式中，b是2。在更多实施方式中，b是3。在其它实施方式中，b是4。在一些实施方式中，b是5。在其它实施方式中，b是6。在更多实施方式中，b是7。在其它实施方式中，b是8。在一些实施方式中，b是9。在其它实施方式中，b是10。在更多实施方式中，b是11。在其它实施方式中，b是12。在一些实施方式中，b是13。在其它实施方式中，b是14。在更多实施方式中，b是15。在其它实施方式中，b是16。
在式(I)的一些其它实施方式中，c为1。在其它实施方式中，c是2。在更多实施方式中，c是3。在其它实施方式中，c是4。在一些实施方式中，c是5。在其它实施方式中，c是6。在更多实施方式中，c是7。在其它实施方式中，c是8。在一些实施方式中，c是9。在其它实施方式中，c是10。在更多实施方式中，c是11。在其它实施方式中，c是12。在一些实施方式中，c是13。在其它实施方式中，c是14。在更多实施方式中，c是15。在其它实施方式中，c是16。
在式(I)的一些特定的其它实施方式中，d是0。在一些实施方式中，d是1。在其它实施方式中，d是2。在更多实施方式中，d是3。在其它实施方式中，d是4。在一些实施方式中，d是5。在其它实施方式中，d是6。在更多实施方式中，d是7。在其它实施方式中，d是8。在一些实施方式中，d是9。在其它实施方式中，d是10。在更多实施方式中，d是11。在其它实施方式中，d是12。在一些实施方式中，d是13。在其它实施方式中，d是14。在更多实施方式中，d是15。在其它实施方式中，d是16。
在式(I)的一些其它多个实施方式中，a和d相同。在一些其它实施方式中，b和c相同。在一些其它具体实施方式中，a和d相同且b和c相同。
式(I)中a和b之和以及c和d之和是可以改变以获得具有所期望的性质的式(I)的脂质的因素。在一个实施方式中，选择a和b，从而它们的和为14至24范围内的整数。在其它实施方式中，选择c和d，从而它们的和为14至24范围内的整数。在其它实施方式中，a和b之和与c和d之和相同。例如，在一些实施方式中，a和b之和以及c和d之和均为相同整数，其可以在14至24的范围内。在更多实施方式中，选择a、b、c和d，从而a和b之和以及c和d之和为12或更大。
在式(I)的一些实施方式中，e是1。在其它实施方式中，e是2。
未具体限制在式(I)的R1a、R2a、R3a和R4a处的取代基。在某些实施方式中，R1a、R2a、R3a和R4a在每次出现时为H。在某些其它实施方式中，R1a、R2a、R3a和R4a中的至少一个是C1-C12烷基。在某些其它实施方式中，R1a、R2a、R3a和R4a中的至少一个是C1-C8烷基。在某些其它实施方式中，R1a、R2a、R3a和R4a中的至少一个是C1-C6烷基。在以上实施方式中的一些中，所述C1-C8烷基是甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、异丁基、叔丁基、正己基或正辛基。
在式(I)的某些实施方式中，R1a、R1b、R4a和R4b在每次出现时是C1-C12烷基。
在式(I)的其它实施方式中，R1b、R2b、R3b和R4b中的至少一个是H，或者R1b、R2b、R3b和R4b在每次出现时为H。
在式(I)的某些实施方式中，R1b与它所结合的碳原子一起与相邻R1b和它所结合的碳原子结合在一起以形成碳-碳双键。在上述其它实施方式中，R4b与它所结合的碳原子一起与相邻R4b和它所结合的碳原子结合在一起以形成碳-碳双键。
在上述实施方式中未具体限制在式(I)的R5和R6处的取代基。在某些实施方式中，R5或R6之一或两者是甲基。在某些其它实施方式中，R5或R6之一或两者是环烷基，例如环己基。在这些实施方式中，所述环烷基可以被取代或未被取代。在某些其它实施方式中，所述环烷基被C1-C12烷基，例如叔丁基取代。
在式(I)的上述实施方式中未具体限制R7处的取代基。在某些实施方式中，至少一个R7为H。在一些其它实施方式中，R7在每次出现时为H。在某些其它实施方式中，R7是C1-C12烷基。
在式(I)的上述实施方式的某些其它实施方式中，R8或R9之一是甲基。在其它实施方式中，R8和R9两者是甲基。
在式(I)的一些不同实施方式中，R8和R9与它们所连接的氮原子一起形成5、6或7元杂环。在上述的一些实施方式中，R8和R9与它们所连接的氮原子一起形成5元杂环，例如吡咯烷基环。
在多个不同的实施方式中，式(I)的示例性脂质可以包括
在一些实施方式中，LNP包含式(I)的脂质、至少一个试剂和选自中性脂质、类固醇和PEG化脂质的一种或多种赋形剂。在一些实施方式中，式(I)的脂质是化合物I-5。在一些实施方式中，式(I)的脂质是化合物I-6。
在一些其它实施方式中，LNP的阳离子脂质组分具有式(II)的结构：
或其药物可用的盐、互变异构体、前体药物或立体异构体，其中：
L1和L2各自独立地为-O(C＝O)-、-(C＝O)O-、-C(＝O)-、-O-、
-S(O)x-、-S-S-、-C(＝O)S-、-SC(＝O)-、-NRaC(＝O)-、-C(＝O)NRa-、-NRaC(＝O)NRa、
-OC(＝O)NRa-、-NRaC(＝O)O-，或直接的键；
G1是C1-C2亚烷基、-(C＝O)-、-O(C＝O)-、-SC(＝O)-、-NRaC(＝O)-或直接的键；
G2是-C(＝O)-、-(C＝O)O-、-C(＝O)S-、-C(＝O)NRa或直接的键；
G3是C1-C6亚烷基；
Ra是H或C1-C12烷基；
R1a和R1b在每次出现时独立地为：(a)H或C1-C12烷基；或者(b)R1a为H或C1-C12烷基，并且R1b与它所结合的碳原子一起和相邻R1b以及与它所结合的碳原子结合在一起以形成碳-碳双键；
R2a和R2b在每次出现时独立地为：(a)H或C1-C12烷基；或者(b)R2a为H或C1-C12烷基，并且R2b与它所结合的碳原子一起和相邻R2b以及与它所结合的碳原子结合在一起以形成碳-碳双键；
R3a和R3b在每次出现时独立地为：(a)H或C1-C12烷基；或者(b)R3a为H或C1-C12烷基，并且R3b与它所结合的碳原子一起和相邻R3b以及与它所结合的碳原子结合在一起以形成碳-碳双键；
R4a和R4b在每次出现时独立地为：(a)H或C1-C12烷基；或者(b)R4a为H或C1-C12烷基，并且R4b与它所结合的碳原子一起和相邻R4b以及与它所结合的碳原子结合在一起以形成碳-碳双键；
R5和R6各自独立地为H或甲基；
R7是C4-C20烷基；
R8和R9各自独立地为C1-C12烷基；或者R8和R9与它们所连接的氮原子一起形成5、6或7元杂环；
a、b、c和d各自独立地为1至24的整数；和
x为0、1或2。
在式(II)的一些实施方式中，L1和L2各自独立地为
-O(C＝O)-、-(C＝O)O-或直接的键。在其它实施方式中，G1和G2各自独立地为-(C＝O)-或直接的键。在一些不同的实施方式中，L1和L2各自独立地为-O(C＝O)-、-(C＝O)O-或直接的键；并且G1和G2各自独立地为-(C＝O)-或直接的键。
在式(II)的一些不同的实施方式中，L1和L2各自独立地为-C(＝O)-、-O-、-S(O)x-、-S-S-、-C(＝O)S-、-SC(＝O)-、-NRa-、-NRaC(＝O)-、
-C(＝O)NRa-、-NRaC(＝O)NRa、-OC(＝O)NRa-、-NRaC(＝O)O-、-NRaS(O)xNRa-、
-NRaS(O)x-或-S(O)xNRa-。
在式(II)的上述实施方式的其它实施方式中，所述脂质化合物具有(IIA)或(IIB)所示的下列结构之一：
在式(II)的一些实施方式中，所述脂质化合物具有结构(IIA)。在其它实施方式中，所述脂质化合物具有结构(IIB)。
在式(II)的任何上述实施方式中，L1或L2之一是-O(C＝O)-。例如，在一些实施方式中，L1和L2中的每一个为-O(C＝O)-。
在式(II)的一些不同的实施方式中，L1或L2之一是-(C＝O)O-。例如，在一些实施方式中，L1和L2中的每一个为-(C＝O)O-。
在式(II)的不同实施方式中，L1或L2之一是直接的键。如本文所使用的，“直接的键”表示基团(例如，L1或L2)不存在。例如，在一些实施方式中，L1和L2中的每一个是直接的键。
在式(II)的其它不同实施方式中，对于R1a和R1b的至少一次出现，R1a为H或C1-C12烷基，并且R1b与它所结合的碳原子一起和相邻的R1b以及与它所结合的碳原子结合在一起以形成碳-碳双键。
在式(II)的其它不同实施方式中，对于R4a和R4b的至少一次出现，R4a为H或C1-C12烷基，并且R4b与它所结合的碳原子一起和相邻的R4b以及与它所结合的碳原子结合在一起以形成碳-碳双键。
在式(II)的其它实施方式中，对于R2a和R2b的至少一次出现，R2a为H或C1-C12烷基，并且R2b与它所结合的碳原子一起和相邻的R2b以及与它所结合的碳原子结合在一起以形成碳-碳双键。
在式(II)的其它不同实施方式中，对于R3a和R3b的至少一次出现，R3a为H或C1-C12烷基，并且R3b与它所结合的碳原子一起和相邻的R3b以及与它所结合的碳原子结合在一起以形成碳-碳双键。
在式(II)的多种其它实施方式中，所述脂质化合物具有(IIC)或(IID)所示的下列结构之一：
其中e、f、g和h各自独立地为1至12的整数。
在式(II)的一些实施方式中，所述脂质化合物具有结构(IIC)。在其它实施方式中，所述脂质化合物具有结构(IID)。
在结构(IIC)或(IID)的多个实施方式中，e、f、g和h各自独立地为4至10的整数。
在式(II)的某些实施方式中，a、b、c和d各自独立地为2至12的整数或者4至12的整数。在其它实施方式中，a、b、c和d各自独立地为8至12或5至9的整数。在一些特定实施方式中，a是0。在一些实施方式中，a是1。在其它实施方式中，a是2。在更多实施方式中，a是3。在其它实施方式中，a是4。在一些实施方式中，a是5。在其它实施方式中，a是6。在更多实施方式中，a是7。在其它实施方式中，a是8。在一些实施方式中，a是9。在其它实施方式中，a是10。在更多实施方式中，a是11。在其它实施方式中，a是12。在一些实施方式中，a是13。在其它实施方式中，a是14。在更多实施方式中，a是15。在其它实施方式中，a是16。
在式(II)的一些实施方式中，b是1。在其它实施方式中，b是2。在更多实施方式中，b是3。在其它实施方式中，b是4。在一些实施方式中，b是5。在其它实施方式中，b是6。在更多实施方式中，b是7。在其它实施方式中，b是8。在一些实施方式中，b是9。在其它实施方式中，b是10。在更多实施方式中，b是11。在其它实施方式中，b是12。在一些实施方式中，b是13。在其它实施方式中，b是14。在更多实施方式中，b是15。在其它实施方式中，b是16。
在式(II)的一些实施方式中，c是1。在其它实施方式中，c是2。在更多实施方式中，c是3。在其它实施方式中，c是4。在一些实施方式中，c是5。在其它实施方式中，c是6。在更多实施方式中，c是7。在其它实施方式中，c是8。在一些实施方式中，c是9。在其它实施方式中，c是10。在更多实施方式中，c是11。在其它实施方式中，c是12。在一些实施方式中，c是13。在其它实施方式中，c是14。在更多实施方式中，c是15。在其它实施方式中，c是16。
在式(II)的一些某些实施方式中，d是0。在一些实施方式中，d是1。在其它实施方式中，d是2。在更多实施方式中，d是3。在其它实施方式中，d是4。在一些实施方式中，d是5。在其它实施方式中，d是6。在更多实施方式中，d是7。在其它实施方式中，d是8。在一些实施方式中，d是9。在其它实施方式中，d是10。在更多实施方式中，d是11。在其它实施方式中，d是12。在一些实施方式中，d是13。在其它实施方式中，d是14。在更多实施方式中，d是15。在其它实施方式中，d是16。
在式(II)的一些实施方式中，e是1。在其它实施方式中，e是2。在更多实施方式中，e是3。在其它实施方式中，e是4。在一些实施方式中，e是5。在其它实施方式中，e是6。在更多实施方式中，e是7。在其它实施方式中，e是8。在一些实施方式中，e是9。在其它实施方式中，e是10。在更多实施方式中，e是11。在其它实施方式中，e是12。
在式(II)的一些实施方式中，f是1。在其它实施方式中，f是2。在更多实施方式中，f是3。在其它实施方式中，f是4。在一些实施方式中，f是5。在其它实施方式中，f是6。在更多实施方式中，f是7。在其它实施方式中，f是8。在一些实施方式中，f是9。在其它实施方式中，f是10。在更多实施方式中，f是11。在其它实施方式中，f是12。
在式(II)的一些实施方式中，g是1。在其它实施方式中，g是2。在更多实施方式中，g是3。在其它实施方式中，g是4。在一些实施方式中，g是5。在其它实施方式中，g是6。在更多实施方式中，g是7。在其它实施方式中，g是8。在一些实施方式中，g是9。在其它实施方式中，g是10。在更多实施方式中，g是11。在其它实施方式中，g是12。
在式(II)的一些实施方式中，h是1。在其它实施方式中，e是2。在更多实施方式中，h是3。在其它实施方式中，h是4。在一些实施方式中，e是5。在其它实施方式中，h是6。在更多实施方式中，h是7。在其它实施方式中，h是8。在一些实施方式中，h是9。在其它实施方式中，h是10。在更多实施方式中，h是11。在其它实施方式中，h是12。
在式(II)的一些其它多个实施方式中，a和d相同。在一些其它实施方式中，b和c相同。在一些其它具体实施方式中，a和d相同且b和c相同。
式(II)中a和b之和以及c和d之和是可以改变以获得具有所期望的性质的脂质的因素。在一个实施方式中，选择a和b，从而它们的和为14至24范围内的整数。在其它实施方式中，选择c和d，从而它们的和为14至24范围内的整数。在其它实施方式中，a和b之和与c和d之和相同。例如，在一些实施方式中，a和b之和以及c和d之和均为相同整数，其可以在14至24的范围内。在更多实施方式中，选择a、b、c和d，从而a和b之和以及c和d之和为12或更大。
未具体限制式(II)的R1a、R2a、R3a和R4a处的取代基。在一些实施方式中，R1a、R2a、R3a和R4a中的至少一个为H。在某些实施方式中，R1a、R2a、R3a和R4a在每次出现时为H。在某些其它实施方式中，R1a、R2a、R3a和R4a中的至少一个是C1-C12烷基。在某些其它实施方式中，R1a、R2a、R3a和R4a中的至少一个是C1-C8烷基。在某些其它实施方式中，R1a、R2a、R3a和R4a中的至少一个是C1-C6烷基。在以上实施方式中的一些中，所述C1-C8烷基是甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、异丁基、叔丁基、正己基或正辛基。
在式(II)的某些实施方式中，R1a、R1b、R4a和R4b在每次出现时是C1-C12烷基。
在式(II)的其它实施方式中，R1b、R2b、R3b和R4b中的至少一个是H，或者R1b、R2b、R3b和R4b在每次出现时为H。
在式(II)的某些实施方式中，R1b与它所结合的碳原子一起与相邻R1b和它所结合的碳原子结合在一起以形成碳-碳双键。在上述其它实施方式中，R4b与它所结合的碳原子一起与相邻R4b和它所结合的碳原子结合在一起以形成碳-碳双键。
在上述实施方式中未具体限制在式(II)的R5和R6处的取代基。在某些实施方式中，R5或R6之一是甲基。在其它实施方式中，R5或R6中的每一个是甲基。
在上述实施方式中未具体限制在式(II)的R7处的取代基。在某些实施方式中，R7是C6-C16烷基。在一些其它实施方式中，R7是C6-C9烷基。在这些实施方式的一些中，R7被下列取代基取代：-(C＝O)ORb、-O(C＝O)Rb、-C(＝O)Rb、-ORb、-S(O)xRb、-S-SRb、-C(＝O)SRb、
-SC(＝O)Rb、-NRaRb、-NRaC(＝O)Rb、-C(＝O)NRaRb、-NRaC(＝O)NRaRb、
-OC(＝O)NRaRb、-NRaC(＝O)ORb、-NRaS(O)xNRaRb、-NRaS(O)xRb或-S(O)xNRaRb，其中：Ra是H或C1-C12烷基；Rb是C1-C15烷基；并且x为0、1或2。例如，在一些实施方式中，R7被-(C＝O)ORb或-O(C＝O)Rb取代。
在式(II)的上述实施方式的多种实施方式中，Rb是支链C1-C15烷基。例如，在一些实施方式中，Rb具有以下结构之一：
在式(II)的上述实施方式的某些其它实施方式中，R8或R9之一是甲基。在其它实施方式中，R8和R9两者是甲基。
在式(II)的一些不同实施方式中，R8和R9与它们所连接的氮原子一起形成5、6或7元杂环。在上述的一些实施方式中，R8和R9与它们所连接的氮原子一起形成5元杂环，例如吡咯烷基环。在上述的一些不同的实施方式中，R8和R9与它们所连接的氮原子一起形成6元杂环，例如哌嗪基环。
在式(II)的上述脂质的其它实施方式中，G3是C2-C4亚烷基，例如C3亚烷基。
在多个不同的实施方式中，所述脂质化合物具有以下结构之一：
在一些实施方式中，LNP包含式(II)的脂质、至少一个试剂和选自中性脂质、类固醇和PEG化脂质的一种或多种赋形剂。在一些实施方式中，式(II)的脂质是化合物II-9。在一些实施方式中，式(II)的脂质是化合物II-10。在一些实施方式中，式(II)的脂质是化合物II-11。在一些实施方式中，式(II)的脂质是化合物II-12。在一些实施方式中，式(II)的脂质是化合物II-32。
在一些其它实施方式中，LNP的阳离子脂质组分具有式(III)的结构：
或其药物可用的盐、互变异构体、前体药物或立体异构体，其中：
L1或L2之一是-O(C＝O)-、-(C＝O)O-、-C(＝O)-、-O-、-S(O)x-、-S-S-、
-C(＝O)S-、SC(＝O)-、-NRaC(＝O)-、-C(＝O)NRa-、NRaC(＝O)NRa-、-OC(＝O)NRa-或
-NRaC(＝O)O-，并且L1或L2中的另一个是-O(C＝O)-、-(C＝O)O-、-C(＝O)-、-O-、-S(O)x-、
-S-S-、-C(＝O)S-、SC(＝O)-、-NRaC(＝O)-、-C(＝O)NRa-、NRaC(＝O)NRa-、-OC(＝O)NRa-或-NRaC(＝O)O-或直接的键；
G1和G2各自独立地为未取代的C1-C12亚烷基或者C1-C12亚烯基；
G3是C1-C24亚烷基、C1-C24亚烯基、C3-C8亚环烷基、C3-C8亚环烯基；
Ra是H或C1-C12烷基；
R1和R2各自独立地为C6-C24烷基或C6-C24烯基；
R3是H、OR5、CN、-C(＝O)OR4、-OC(＝O)R4或-NR5C(＝O)R4；
R4是C1-C12烷基；
R5为H或C1-C6烷基；且
x为0、1或2。
在式(III)的以上实施方式中的一些实施方式中，所述脂质具有以下结构(IIIA)或(IIIB)之一：
其中：
A是3至8元环烷基或亚环烷基环；
R6在每次出现时独立地为H、OH或C1-C24烷基；
n为1至15范围内的整数。
在式(III)的以上实施方式中的一些实施方式中，所述脂质具有结构(IIIA)，并且在其它实施方式中，所述脂质具有结构(IIIB)。
在式(III)的其它实施方式中，所述脂质具有以下结构(IIIC)或(IIID)之一：
其中y和z各自独立地为1至12范围内的整数。
在式(III)的任何上述实施方式中，L1或L2之一是-O(C＝O)-。例如，在一些实施方式中，L1和L2中的每一个是-O(C＝O)-。在任何上述的一些不同的实施方式中，L1和L2各自独立地为-(C＝O)O-或-O(C＝O)-。例如，在一些实施方式中，L1和L2中的每一个为-(C＝O)O-。
在式(III)的一些不同的实施方式中，所述脂质具有以下结构(IIIE)或(IIIF)之一：
在式(III)的以上实施方式中的一些实施方式中，所述脂质具有以下结构(IIIG)、(IIIH)、(IIII)或者(IIIJ)之一：
在式(III)的以上实施方式中的一些实施方式中，n是2至12，例如，2至8或2至4范围内的整数。例如，在一些实施方式中，n是3、4、5或6。在一些实施方式中，n是3。在一些实施方式中，n是4。在一些实施方式中，n是5。在一些实施方式中，n是6。
在式(III)的上述实施方式中的一些其它实施方式中，y和z各自独立地为2至10范围内的整数。例如，在一些实施方式中，y和z各自独立地为4至9或4至6范围内的整数。
在式(III)的以上实施方式中的一些实施方式中，R6是H。在上述实施方式中的其它实施方式中，R6是C1-C24烷基。在其它实施方式中，R6是OH。
在式(III)的一些实施方式中，G3是未取代的。在其它实施方式中，G3是取代的。在多种不同实施方式中，G3是直链C1-C24亚烷基或者直链C1-C24亚烯基。
在式(III)的一些其它以上实施方式中，R1或R2或两者为C6-C24烯基。例如，在一些实施方式中，R1和R2各自独立地具有以下结构：
其中：
R7a和R7b在每次出现时独立地为H或C1-C12烷基；且
a是2至12的整数，
其中分别选择R7a、R7b和a，从而R1和R2各自独立地包含6至20个碳原子。例如，在一些实施方式中，a是5至9或8至12范围内的整数。
在式(III)的以上实施方式中的一些实施方式中，R7a的至少一次出现为H。例如，在一些实施方式中，R7a在每次出现时为H。在上述实施方式的其它不同的实施方式中，R7b的至少一次出现是C1-C8烷基。例如，在一些实施方式中，所述C1-C8烷基是甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、异丁基、叔丁基、正己基或正辛基。
在式(III)的不同的实施方式中，R1或R2或两者具有以下结构之一：
在式(III)的以上实施方式中的一些实施方式中，R3是OH、CN、-C(＝O)OR4、-OC(＝O)R4或-NHC(＝O)R4。在一些实施方式中，R4是甲基或乙基。
在多个不同的实施方式中，式(III)的阳离子脂质具有以下结构之一：
在一些实施方式中，LNP包含式(III)的脂质、至少一个试剂和选自中性脂质、类固醇和PEG化脂质的一种或多种赋形剂。在一些实施方式中，式(III)的脂质是化合物III-3。在一些实施方式中，式(III)的脂质是化合物III-7。
在某些实施方式中，所述阳离子脂质以约30至约95摩尔百分比的量存在于LNP中。在一个实施方式中，所述阳离子脂质以约30至约70摩尔百分比的量存在于LNP中。在一个实施方式中，所述阳离子脂质以约40至约60摩尔百分比的量存在于LNP中。在一个实施方式中，所述阳离子脂质以约50摩尔百分比的量存在于LNP中。在一个实施方式中，LNP仅包含阳离子脂质。
在某些实施方式中，所述LNP包含一种或多种其它脂质，其在它们形成期间稳定颗粒形成。
适合的稳定脂质包括中性脂质和阴离子脂质。
术语“中性脂质”是指在生理学pH，以不带电或中性两性离子形式存在的一些脂质物质中的任一种。代表性的中性脂质包括二酰基磷脂酰胆碱、二酰基磷脂酰乙醇胺、神经酰胺、鞘磷脂、二氢鞘磷脂、脑磷脂和脑苷脂。
例如，示例性中性脂质包括二硬脂酰磷脂酰胆喊(DSPC)、二油酰磷脂酰胆碱(DOPC)、二棕榈酰基磷脂酰胆碱(DPPC)、二油酰磷脂酰甘油(DOPG)、二棕榈酰磷脂酰甘油(DPPG)、二油酰基-磷脂酰乙醇胺(DOPE)、棕榈酰油酰磷脂酰胆碱(POPC)、棕榈酰油酰-磷脂酰乙醇胺(POPE)和二油酰基-磷脂酰乙醇胺4-(N-马来酰亚胺甲基)-环己烷-1-羧酸酯(DOPE-mal)、二棕榈酰基磷脂酰乙醇胺(DPPE)、二肉豆蔻酰磷酸乙醇胺(DMPE)、二硬脂酰-磷脂酰乙醇胺(DSPE)、16-O-单甲基PE、16-O-二甲基PE、18-1-反式PE、1-硬脂酰-2-油酰基-磷脂酰乙醇胺(SOPE)和1,2-二反油酰基-sn-甘油基-3-磷酸乙醇胺(反式DOPE(transDOPE))。在一个实施方式中，所述中性脂质是1,2-二硬脂酰-sn-甘油基-3-磷酸胆碱(DSPC)。
在一些实施方式中，所述LNP包含选自DSPC、DPPC、DMPC、DOPC、POPC、DOPE和SM的中性脂质。在多个实施方式中，阳离子脂质(例如，式(I)的脂质)与中性脂质的摩尔比在约2:1至约8:1的范围内。
在多个实施方式中，所述LNP还包含类固醇或类固醇类似物。“类固醇”是包含以下碳骨架的化合物：
在某些实施方式中，所述类固醇或类固醇类似物是胆固醇。在这些实施方式的一些中，阳离子脂质(例如，式(I)的脂质)与胆固醇的摩尔比在约2:1至1:1的范围内。
术语“阴离子脂质”是指在生理学pH带负电荷的任何脂质。这些脂质包括磷脂酰甘油、心磷脂、二酰基磷脂酰丝氨酸、二酰基磷脂酸、N-十二酰磷脂酰乙醇胺、N-琥珀酰磷脂酰乙醇胺、N-戊二酰磷脂酰乙醇胺、赖氨酰磷脂酰甘油、棕榈酰油酰基磷脂酰甘油(POPG)和结合至中性脂质的其它阴离子修饰基团。
在某些实施方式中，LNP包含糖脂(例如，单唾液酸神经节苷脂GM1)。在某些实施方式中，LNP包含甾醇，如胆固醇。
在一些实施方式中，LNP包含聚合物缀合的脂质。术语“聚合物缀合的脂质”是指包含脂质部分和聚合物部分两者的分子。聚合物缀合的脂质的实例是PEG化脂质。术语“PEG化脂质”是指包含脂质部分和聚乙二醇部分两者的分子。PEG化脂质在本领域中是已知的并且包括1-(单甲氧基-聚乙二醇)-2,3-二肉豆蔻酰甘油(PEG-s-DMG)等。
在某些实施方式中，所述LNP包含其它稳定-脂质，它是聚乙二醇-脂质(PEG化脂质)。适合的聚乙二醇-脂质包括PEG修饰的磷脂酰乙醇胺、PEG修饰的磷脂酸、PEG修饰的神经酰胺(例如，PEG-CerC14或PEG-CerC20)、PEG修饰的二烷基胺、PEG修饰的甘油二酯、PEG修饰的二烷基甘油。代表性的聚乙二醇-脂质包括PEG-c-DOMG、PEG-c-DMA和PEG-s-DMG。在一个实施方式中，聚乙二醇-脂质是N-[(甲氧基聚(乙二醇)2000)氨基甲酰]-1,2-二肉豆蔻基氧基丙基-3-胺(PEG-c-DMA)。在一个实施方式中，所述聚乙二醇-脂质是PEG-c-DOMG。在其它实施方式中，LNP包含PEG化的甘油二酯(PEG-DAG)，如1-(单甲氧基-聚乙二醇)-2,3-二肉豆蔻酰甘油(PEG-DMG)、PEG化的磷脂酰乙醇胺(PEG-PE)、PEG琥珀酸甘油二酯(PEG-S-DAG)，如4-O-(2',3'-二(十四酰氧基)丙基-1-O-(ω-甲氧基(聚乙氧基)乙基)丁二酸酯(PEG-S-DMG)、PEG化的神经酰胺(PEG-cer)或者PEG二烷氧基丙基氨基甲酸酯，如ω-甲氧基(聚乙氧基)乙基-N-(2,3-二(十四酰氧基)丙基)氨基甲酸酯或者2,3-二(十四酰氧基)丙基-N-(ω-甲氧基(聚乙氧基)乙基)氨基甲酸酯。在多个实施方式中，所述阳离子脂质与所述PEG化脂质的摩尔比在约100:1至约25:1的范围内。
在一些实施方式中，所述LNP包含具有以下结构(IV)的PEG化脂质：
或其药物可用的盐、互变异构体或立体异构体，其中：
R10和R11各自独立地为直链或支链、饱和或不饱和的烷基链，其含有10至30个碳原子，其中所述烷基链任选地被一个或多个酯键中断；和
z具有30至60范围内的平均值。
在PEG化脂质(IV)的以上实施方式的一些实施方式中，当z为42时，R10和R11不均为正十八基。在一些其它实施方式中，R10和R11各自独立地为含有10至18个碳原子的直链或支链、饱和或不饱和的烷基链。在一些实施方式中，R10和R11各自独立地为含有12至16个碳原子的直链或支链、饱和或不饱和的烷基链。在一些实施方式中，R10和R11各自独立地为含有12个碳原子的直链或支链、饱和或不饱和的烷基链。在一些实施方式中，R10和R11各自独立地为含有14个碳原子的直链或支链、饱和或不饱和的烷基链。在其它实施方式中，R10和R11各自独立地为含有16个碳原子的直链或支链、饱和或不饱和的烷基链。在其它实施方式中，R10和R11各自独立地为含有18个碳原子的直链或支链、饱和或不饱和的烷基链。在其它实施方式中，R10是含有12个碳原子的直链或支链、饱和或不饱和的烷基链，并且R11是含有14个碳原子的直链或支链，饱和或不饱和的烷基链。
在多个实施方式中，z覆盖选择以使得(II)的PEG部分具有约400至约6000g/mol的平均分子量的范围。在一些实施方式中，平均值z为约45。
在其它实施方式中，所述PEG化脂质具有以下结构之一：
其中n是选择以使得PEG化脂质的平均分子量为约2500g/mol的整数。
在某些实施方式中，所述其它脂质以约1至约10摩尔百分比的量存在于LNP中。在一个实施方式中，其它脂质以约1至约5摩尔百分比的量存在于LNP中。在一个实施方式中，其它脂质以约1摩尔百分比或者约1.5摩尔百分比存在于LNP中。
在一些实施方式中，LNP包含式(I)的脂质、核苷修饰的RNA、中性脂质、类固醇和PEG化脂质。在一些实施方式中，式(I)的脂质是化合物I-6。在不同的实施方式中，所述中性脂质是DSPC。在其它实施方式中，所述类固醇是胆固醇。在其它不同的实施方式中，所述PEG化脂质是化合物IVa。
在某些实施方式中，所述LNP包含一个或多个靶向部分，其将LNP靶向至细胞或细胞群。例如，在一个实施方式中，靶向结构域是配体，其将LNP引导至存在于细胞表面上的受体。
在某些实施方式中，所述LNP包含一个或多个内化结构域。例如，在一个实施方式中，所述LNP包含一个或多个结合至细胞以诱导LNP的内化的结构域。例如，在一个实施方式中，一个或多个内化结构域结合至存在于细胞表面上的受体以诱导受体介导的LNP的吸收。在某些实施方式中，所述LNP能够体内结合生物分子，其中所述LNP结合的生物分子然后可以被细胞表面受体识别以诱导内化。例如，在一个实施方式中，LNP结合全身性ApoE，其导致LNP和结合的货物的吸收。
本领域描述了其它示例性LNP和它们的生产，例如，在美国专利申请公开号US20120276209、Semple等人,2010,Nat Biotechnol.,28(2):172-176；Akinc等人,2010,Mol Ther.,18(7):1357-1364；Basha等人,2011,Mol Ther,19(12):2186-2200；Leung等人,2012,J Phys Chem C Nanomater Interfaces,116(34):18440-18450；Lee等人,2012,IntJ Cancer.,131(5):E781-90；Belliveau等人,2012,Mol Ther nucleic Acids,1:e37；Jayaraman等人,2012,Angew Chem Int Ed Engl.,51(34):8529-8533；Mui等人,2013,MolTher Nucleic Acids.2,e139；Maier等人,2013,Mol Ther.,21(8):1570-1578；和Tam等人,2013,Nanomedicine,9(5):665-74中，以上每篇文献以其全部内容作为参考并入。
以下反应流程显示了制备式(I)、(II)或(III)的脂质的方法。
一般反应流程1
可以根据一般反应流程1(“方法A”)制备式(I)的脂质的实施方式(例如，化合物A-5)，其中R是饱和或不饱和的C1-C24烷基或者饱和或不饱和的环烷基，m为0或1并且n是1至24的整数。参考一般反应流程1，具有结构A-1的化合物可以购自商品化来源或者根据本领域技术人员所熟悉的方法制备。将A-1、A-2和DMAP的混合物用DCC处理以提供溴化物A-3。在任何必需的清理和/或纯化步骤之后，在足以产生A-5的温度和时间下加热溴化物A-3、碱(例如，N,N-二异丙基乙胺)和N,N-二甲基二胺A-4的混合物。
一般反应流程2
可以根据一般反应流程2(“方法B”)制备式(I)的化合物的其它实施方式(例如，化合物B-5)，其中R是饱和或不饱和的C1-C24烷基或者饱和或不饱和的环烷基，m为0或1并且n是1至24的整数。如一般反应流程2所示，具有结构B-1的化合物可以购自商品化来源或者根据本领域技术人员所熟悉的方法制备。用酸性氯化物B-2(1当量)和碱(例如，三乙胺)处理B-1(1当量)的溶液。用氧化剂(例如，氯铬酸吡啶)处理粗产物，并回收中间产物B-3。在任何必需的清理和/或纯化之后，用还原剂(例如，三乙酰氧基氢硼化钠)处理粗B-3、酸(例如，乙酸)和N,N-二甲基氨基胺B-4的溶液以获得B-5。
应注意尽管以上将起始材料A-1和B-1显示在仅包括饱和亚甲基碳，但是包括碳-碳双键的起始材料也可以用于包括碳-碳双键的化合物的制备。
一般反应流程3
可以根据一般反应流程3(“方法C”)制备式(I)的脂质的不同实施方式(例如，化合物C-7或C9)，其中R是饱和或不饱和的C1-C24烷基或者饱和或不饱和的环烷基，m为0或1并且n是1至24的整数。参考一般反应流程3，具有结构C-1的化合物可以购自商品化来源或者根据本领域技术人员所熟悉的方法制备。
一般反应流程4
可以根据一般反应流程4(“方法D”)制备式(II)的化合物的实施方式(例如，化合物D-5和D-7)，其中R1a、R1b、R2a、R2b、R3a、R3b、R4a、R4b、R5、R6、R8、R9、L1、L2、G1、G2、G3、a、b、c和d是如本文所定义的并且R7'表示R7或C3-C19烷基。参考一般反应流程1，具有结构D-1和D-2的化合物可以购自商品化来源或者根据本领域技术人员所熟悉的方法制备。在任何必需的清理后，用还原剂(例如，三乙酰氧基氢硼化钠)处理D-1和D-2的溶液以获得D-3。在任何必需的清理和/或纯化之后，用酰基氯D-4(或羧酸和DCC)处理D-3和碱(例如，三甲胺、DMAP)的溶液以获得D-5。可以在任何必需的清理和/或纯化之后，用LiAlH4 D-6还原D-5以提供D-7。
一般反应流程5
可以根据一般反应流程5(“方法E”)制备式(II)的脂质的实施方式(例如，脂质E-5)，其中R1a、R1b、R2a、R2b、R3a、R3b、R4a、R4b、R5、R6、R7、R8、R9、L1、L2、G3、a、b、c和d是如本文所定义的。参考一般反应流程2，具有结构E-1和E-2的化合物可以购自商品化来源或者根据本领域技术人员所熟悉的方法制备。在任何必需的清理后，加热E-1(过量)、E-2和碱(例如，碳酸钾)的混合物以获得E-3。在任何必需的清理和/或纯化之后，用酰基氯E-4(或羧酸和DCC)处理E-3和碱(例如，三甲胺、DMAP)的溶液以获得E-5。
一般反应流程6
一般反应流程6提供了制备式(III)的脂质的示例性方法(方法F)。一般反应流程6中的G1、G3、R1和R3是如本文对于式(III)所定义的，并且G1'是指G1短1个碳的同系物。具有结构F-1的化合物是购买的或者根据本领域中已知的方法制备的。F-1与二醇F-2在适当缩合条件(例如，DCC)下的反应获得酯/醇F-3，其然后可以氧化(例如，PCC)为醛F-4。F-4与胺F-5在还原胺化条件下的反应获得式(III)的脂质。
应注意用于制备式(III)的脂质的多种替代策略对于本领域那些技术人员是可用的。例如，可以使用适当起始材料，根据类似方法制备其中L1和L2是除酯以外的式(III)的其它脂质。此外，一般反应流程6显示了式(III)的脂质的制备，其中G1和G2是相同的；然而，这不是本发明所要求的方面并且对以上反应流程的改变对于获得其中G1和G2不同的化合物是可能的。
本领域技术人员将理解在本文所描述的方法中，中间体化合物的官能性基团可以需要适当保护基的保护。这些官能性基团包括羟基、氨基、巯基和羧酸。羟基的适当保护基包括三烷基甲硅烷基或二芳基烷基甲硅烷基(例如，叔丁基二甲基甲硅烷基、叔丁基二苯基甲硅烷基或三甲基甲硅烷基)、四氢吡喃基、苄基等。适合于氨基、脒基和胍基的保护基包括叔丁氧羰基、苄氧羰基等。适合于巯基的保护基包括-C(O)-R”(其中R”是烷基、芳基或芳基烷基)、p-甲氧基苄基、三苯甲基等。适合于羧酸的保护基包括烷基、芳基或芳基烷基酯。可以根据标准技术添加或除去保护基，这是本领域技术人员已知的并且是如本文所描述的。保护基的使用详细描述于Green,T.W.and P.G.M.Wutz,Protective Groups in OrganicSynthesis(1999),第3版,Wiley。如本领域中技术人员将理解的，所述保护基还可以是聚合物树脂，如Wang树脂、Rink树脂或2-氯代三苯甲基氯树脂。
递送载体实施方式
考虑了任何适合的递送载体形式。
在一些实施方式中，所述递送载体是胶体分散体系统，如大分子复合物、纳米胶囊、微球体、珠和脂质基系统，包括水包油乳液、胶束、混合胶束、脂质体和脂质纳米颗粒。用作体外和体内递送载体的示例性胶体体系包括脂质体(例如，人工膜囊)和脂质纳米颗粒。
如以上所描述的，将所述脂质制剂的用途考虑用于将至少一种试剂引入宿主细胞(体外、离体或体内)。在另一个方面，所述至少一种试剂可以与脂质结合。可以将与脂质结合的至少一种试剂包封在脂质体的水性内部、分散在脂质体的脂质双分子层内、通过与脂质体和寡核苷酸两者结合的连接分子连接至脂质体、包埋在脂质体中、与脂质体复合、分散在含有脂质的溶液中、与脂质混合、与脂质合并、作为混悬液包含在脂质中、与脂质复合、包含或与胶束复合或另外与脂质结合。脂质、脂质/核酸或脂质/表达载体相关组合物不局限于溶液中的任何特定结构。例如，它们可以以双分子层结构、作为胶束或通过“塌缩”结构存在。它们还可以简单地散布在溶液中，可能地形成尺寸或形状不均一的聚集体。
在一个实施方式中，所述至少一种试剂的递送包括任何适合的递送方法，包括本文其它处所述的示例性递送方法。在某些实施方式中，至少一种试剂向受试者的递送包括在接触步骤前所述至少一种试剂与转染试剂的混合。在另一个实施方式中，本发明所述的方法还包括与转染试剂一起施用至少一种试剂。在另一个实施方式中，所述转染试剂是阳离子脂质试剂。
在另一个实施方式中，所述转染试剂是脂质基转染试剂。在另一个实施方式中，所述转染试剂是蛋白基转染试剂。在另一个实施方式中，所述转染试剂是聚乙烯亚胺基转染试剂。在另一个实施方式中，所述转染试剂是磷酸钙。在另一个实施方式中，所述转染试剂是 或在另一个实施方式中，所述转染试剂是本领域中已知的任何其它转染试剂。
在一些实施方式中，所述至少一种试剂的递送包括脂质体。“脂质体”是涵盖多种通过封闭的脂质双分子层或聚集物的产生所形成的单层和多层脂质载体的一般术语。可以将脂质体表征为具有磷脂双分子层膜和内部水媒介的胞囊状结构。多层脂质体具有通过水媒介分隔的多个脂质层。当将磷脂在过量水溶液中混悬时，它们自发形成。脂质组分在封闭结构形成前经历自重排，并且在脂质双分子层之间包埋水和溶解的溶质(Ghosh等人,1991Glycobiology 5:505-10)。然而，还涵盖了在溶液中具有不同于正常胞囊状结构的结构的组合物。例如，所述脂质可以采取胶束结构或者仅作为脂质分子的非均一聚集物存在。
可以将与脂质结合的至少一种试剂包封在脂质体的水性内部、分散在脂质体的脂质双分子层内、通过与脂质体和寡核苷酸两者结合的连接分子连接至脂质体、包埋在脂质体中、与脂质体复合、分散在含有脂质的溶液中、与脂质混合、与脂质合并、作为混悬液包含在脂质中、包含或与胶束复合或另外与脂质结合。脂质、脂质/核酸或脂质/表达载体相关组合物不局限于溶液中的任何特定结构。例如，它们可以以双分子层结构、作为胶束或通过“塌缩”结构存在。它们还可以简单地散布在溶液中，可能地形成尺寸或形状不均一的聚集体。
在另一个实施方式中，所述转染试剂形成脂质体。在另一个实施方式中，脂质体提高胞内稳定性，提高吸收效率并改善生物活性。在另一个实施方式中，脂质体是由以与组成细胞膜的那些脂质类似的方式排列的脂质所组成的中空球形囊泡。在一些实施方式中，所述脂质体包含用于包埋水溶性化合物的内部水性空间。在另一个实施方式中，脂质体可以将所述至少一种试剂以活性形式递送至细胞。
在一个实施方式中，所述组合物包含脂质纳米颗粒(LNP)和至少一种试剂。
术语“脂质纳米颗粒”是指具有至少纳米级(例如，1-1000nm)一维尺度的颗粒，其包括一个或多个脂质。在一些实施方式中，LNP包含在反脂质胶束内组织并且在脂质单层包膜内包覆或插入相邻脂质双分子层之间(例如，脂质双分子层-试剂-脂质双分子层)的至少一种试剂。在一些实施方式中，LNP的形态不像常规脂质体，其特征在于围绕水性核心的脂质双分子层，因为它们具有电子密集核心，其中阳离子/可电离脂质组织成围绕包封试剂(例如，mRNA分子)的反胶束(Cullis and Hope,2017；Guevara等人,2019b)。在多个实施方式中，所述颗粒包括式(I)、(II)或者(III)的脂质。在一些实施方式中，在包含如本文所描述的至少一种试剂的制剂中包括脂质纳米颗粒。在一些实施方式中，这些脂质纳米颗粒包含阳离子脂质(例如，式(I)、(II)或(III)的脂质)和选自下列的一种或多种赋形剂：中性脂质、荷电脂质、类固醇和脂质锚定的聚乙二醇(例如，PEG化脂质，如具有结构(IV)的PEG化脂质，如化合物IVa)。在一些实施方式中，所述至少一种试剂包封在所述脂质纳米颗粒的脂质部分或者通过所述脂质纳米颗粒的一些或全部脂质部分包围的水性空间中，借此保护它避免被酶促降解或者避免通过宿主生物或细胞机制诱导的其它不期望的影响，例如，不利的免疫应答。
在多个实施方式中，所述脂质纳米颗粒的平均直径为约30nm至约150nm、约40nm至约150nm、约50nm至约150nm、约60nm至约130nm、约70nm至约110nm、约70nm至约100nm、约80nm至约100nm、约90nm至约100nm、约70至约90nm、约80nm至约90nm、约70nm至约80nm或者约30nm、35nm、40nm、45nm、50nm、55nm、60nm、65nm、70nm、75nm、80nm、85nm、90nm、95nm、100nm、105nm、110nm、115nm、120nm、125nm、130nm、135nm、140nm、145nm或150nm。在一个实施方式中，所述脂质纳米颗粒具有约83nm的平均直径。在一个实施方式中，所述脂质纳米颗粒具有约102nm的平均直径。在一个实施方式中，所述脂质纳米颗粒具有约103nm的平均直径。在一些实施方式中，所述脂质纳米颗粒是基本无毒的。在某些实施方式中，当存在于所述脂质纳米颗粒中时，所述至少一种试剂在水溶液中耐受胞内或细胞间酶的降解作用。
所述LNP可以包含能够形成至少一种试剂与之连接或者其中包封或复合了至少一种试剂的颗粒的任何脂质。术语“脂质”是指作为脂肪酸的衍生物(例如，酯)并且特征通常为不溶于水但可溶于多种有机溶剂的一组有机化合物。在本文其它处显示了示例性脂质。
在一个实施方式中，LNP包含一种或多种阳离子脂质和一种或多种稳定脂质。稳定脂质包括中性脂质、阴离子脂质和PEG化脂质。
在一个实施方式中，LNP包含阳离子脂质。如本文所使用的，术语“阳离子或可电离脂质”是指当pH降低至低于脂质的可电离基团的pKa时，处于阳离子或变为阳离子(质子化)，但在更高的pH值逐渐更中性的脂质。在低于pKa的pH值，脂质则能够与带负电荷的核酸结合。在某些实施方式中，所述阳离子脂质包括pH降低时带正电荷的两性离子脂质。
在多个实施方式中，所述LNP包含阳离子或可电离脂质、稳定脂质、甾醇和脂质锚定的聚乙二醇(即PEG化脂质)。
在一些实施方式中，所述LNP包含式(I)的离子脂质、至少一种试剂和选自中性脂质、类固醇和PEG化脂质的一种或多种赋形剂。在一些实施方式中，式(I)的脂质是化合物I-5。在一些实施方式中，式(I)的脂质是化合物I-6。
在一些实施方式中，所述LNP包含式(II)的离子脂质、至少一种试剂和选自中性脂质、类固醇和PEG化脂质的一种或多种赋形剂。在一些实施方式中，式(II)的脂质是化合物II-9。在一些实施方式中，式(II)的脂质是化合物II-10。在一些实施方式中，式(II)的脂质是化合物II-11。在一些实施方式中，式(II)的脂质是化合物II-12。在一些实施方式中，式(II)的脂质是化合物II-32。
在一些实施方式中，所述LNP包含式(III)的离子脂质、至少一种试剂和选自中性脂质、类固醇和PEG化脂质的一种或多种赋形剂。在一些实施方式中，式(III)的脂质是化合物III-3。在一些实施方式中，式(III)的脂质是化合物III-7。
在某些实施方式中，所述阳离子脂质以约30至约95摩尔百分比的量存在于LNP中。在一个实施方式中，所述阳离子脂质以约30至约70摩尔百分比的量存在于LNP中。在一个实施方式中，所述阳离子脂质以约40至约60摩尔百分比的量存在于LNP中。在一个实施方式中，所述阳离子脂质以约50摩尔百分比的量存在于LNP中。在一个实施方式中，LNP仅包含阳离子脂质。
在某些实施方式中，所述LNP包含一种或多种稳定脂质(例如，中性或阴离子脂质)，其帮助包封货物并在它们的形成期间稳定颗粒形成。例如，示例性中性脂质包括二硬脂酰磷脂酰胆喊(DSPC)、二油酰磷脂酰胆碱(DOPC)、二棕榈酰基磷脂酰胆碱(DPPC)、二油酰磷脂酰甘油(DOPG)、二棕榈酰磷脂酰甘油(DPPG)、二油酰基-磷脂酰乙醇胺(DOPE)、棕榈酰油酰磷脂酰胆碱(POPC)、棕榈酰油酰-磷脂酰乙醇胺(POPE)和二油酰基-磷脂酰乙醇胺4-(N-马来酰亚胺甲基)-环己烷-1-羧酸酯(DOPE-mal)、二棕榈酰基磷脂酰乙醇胺(DPPE)、二肉豆蔻酰磷酸乙醇胺(DMPE)、二硬脂酰-磷脂酰乙醇胺(DSPE)、16-O-单甲基PE、16-O-二甲基PE、18-1-反式PE、1-硬脂酰-2-油酰基-磷脂酰乙醇胺(SOPE)和1,2-二反油酸氧基-sn-甘油基-3-磷酸乙醇胺(反式DOPE(transDOPE))。在一个实施方式中，所述中性脂质是1,2-二硬脂酰-sn-甘油基-3-磷酸胆碱(DSPC)。在多个实施方式中，阳离子脂质(例如，式(I)的脂质)与中性脂质的摩尔比在约2:1至约8:1的范围内。
在多个实施方式中，所述LNP还包含类固醇或类固醇类似物。在某些实施方式中，所述类固醇或类固醇类似物是胆固醇。在这些实施方式的一些中，阳离子脂质(例如，式(I)的脂质)与胆固醇的摩尔比在约2:1至1:1的范围内。
在某些实施方式中，LNP包含糖脂(例如，单唾液酸神经节苷脂GM1)。
在某些实施方式中，所述LNP包含作为聚乙二醇-脂质(PEG化脂质)的其它脂质以减少免疫系统识别和改善生物分布。在一个实施方式中，所述聚乙二醇-脂质是PEG-c-DOMG。在其它实施方式中，所述LNP包含PEG化的甘油二酯(PEG-DAG)，如1-(单甲氧基-聚乙二醇)-2,3-二肉豆蔻酰甘油(PEG-DMG)、PEG化的磷脂酰乙醇胺(PEG-PE)、PEG琥珀酸甘油二酯(PEG-S-DAG)，如4-O-(2',3'-二(十四酰氧基)丙基-1-O-(ω-甲氧基(聚乙氧基)乙基)丁二酸酯(PEG-S-DMG)、PEG化的神经酰胺(PEG-cer)或者PEG二烷氧基丙基氨基甲酸酯，如ω-甲氧基(聚乙氧基)乙基-N-(2,3-二(十四酰氧基)丙基)氨基甲酸酯或者2,3-二(十四酰氧基)丙基-N-(ω-甲氧基(聚乙氧基)乙基)氨基甲酸酯。在多个实施方式中，所述阳离子脂质与所述PEG化脂质的摩尔比在约100:1至约25:1的范围内。
在某些实施方式中，所述PEG化脂质以约1至约10摩尔百分比的量存在于LNP中。在一个实施方式中，PEG化脂质以约1至约5摩尔百分比的量存在于LNP中。在一个实施方式中，PEG化脂质以约1摩尔百分比或者约1.5摩尔百分比存在于LNP中。
在一些实施方式中，LNP包含式(I)的脂质、核苷修饰的RNA、中性脂质、类固醇和PEG化脂质。在一些实施方式中，式(I)的脂质是化合物I-6。在不同的实施方式中，所述中性脂质是DSPC。在其它实施方式中，所述类固醇是胆固醇。在其它不同的实施方式中，所述PEG化脂质是化合物IVa。
在某些实施方式中，所述LNP包含一个或多个靶向部分，其将LNP靶向至细胞或细胞群。例如，在一个实施方式中，靶向结构域是配体，其将LNP引导至存在于细胞表面上的受体。示例性靶向结构域包括CD4。
在某些实施方式中，所述LNP包含一个或多个内化结构域。例如，在一个实施方式中，所述LNP包含一个或多个结合至细胞以诱导LNP的内化的结构域。例如，在一个实施方式中，一个或多个内化结构域结合至存在于细胞表面上的受体以诱导受体介导的LNP的吸收。在某些实施方式中，所述LNP能够体内结合生物分子，其中所述LNP结合的生物分子然后可以被细胞表面受体识别以诱导内化。例如，在一个实施方式中，LNP结合全身性ApoE，其导致LNP和结合的货物的吸收。
本领域描述了其它示例性LNP和它们的生产，例如，在美国专利申请公开号US20120276209；Semple等人,2010,Nat Biotechnol.,28(2):172-176；Akinc等人,2010,Mol Ther.,18(7):1357-1364；Basha等人,2011,Mol Ther,19(12):2186-2200；Leung等人,2012,J Phys Chem C Nanomater Interfaces,116(34):18440-18450；Lee等人,2012,IntJ Cancer.,131(5):E781-90；Belliveau等人,2012,Mol Ther nucleic Acids,1:e37；Jayaraman等人,2012,Angew Chem Int Ed Engl.,51(34):8529-8533；Mui等人,2013,MolTher Nucleic Acids.2,e139；Maier等人,2013,Mol Ther.,21(8):1570-1578；和Tam等人,2013,Nanomedicine,9(5):665-74，以上每篇文献以其全部内容作为参考并入。
靶向部分
如以上所教导的，本文所考虑的递送载体—其可以包括多种形式，如但不限于大分子复合物、纳米胶囊、微球体、珠和脂质基系统，包括水包油乳液、胶束、混合胶束、脂质体和脂质纳米颗粒(LNP)—可以包含一个或多个靶向部分(或者等价地，“靶向结构域”或者“靶向配体”)，其起作用以将所述递送载体(例如，LNP)靶向至细胞或细胞群。靶向部分可以包括能够与靶细胞或组织表面上的靶细胞配体特异性相互作用或结合的任何适合的结合剂。所述靶向部分可以是天然存在的或者工程化的。靶向部分可以包括但不限于蛋白、肽、抗体或抗体片段、免疫球蛋白或免疫球蛋白片段、小分子、适体、维生素、核酸分子等。意在将本文所考虑的靶向部分认为是无限制的，只要任何特定靶向部分可以(a)偶联至递送载体(共价或非共价)和(b)能够通过递送载体上的靶向部分和靶细胞或组织上的靶细胞配体之间的结合或另外相互作用，导致或帮助将所述递送载体定位或靶向靶细胞或组织。
所述靶细胞配体可以包括细胞表面上或者细胞外的细胞间隙中存在的内源配体，如碳水化合物、脂质、多糖、蛋白、糖蛋白、糖脂、肽、细胞膜组分(例如，胆固醇)等。在某些实施方式中，靶细胞上的内源配体对靶细胞特异，即仅在靶细胞上表达和/或包含，或者至少最低限度地存在于不是靶细胞的细胞中。例如，靶细胞上的内源配体可以是疾病相关蛋白，例如，癌细胞蛋白，它是通常不在健康细胞中表达的细胞表面蛋白。在其它实施方式中，所述靶细胞上的靶标配体可以是工程化或另外非天然存在的配体，例如，表达非天然存在的表面细胞蛋白的基因修饰的靶细胞。可以选择适合的靶向配体，从而使用所述靶细胞的独特性质，因此允许所述组合物区分靶细胞和非靶细胞。
这方面可以被称为递送载体向所关心的靶细胞(例如，淋巴细胞，如T细胞)的“选择性递送”。术语“选择性递送”表示通过所述递送载体的靶向部分和所关心的靶细胞(例如，特定T细胞亚群)上的靶细胞配体之间的结合相互作用，通过共价或非共价结合至靶细胞(例如，特定T细胞亚群)，定位递送载体，但是其中所述递送载体不结合，或者最低限度结合至不表达所述靶细胞配体的细胞(即，这些细胞可以被称为“非靶细胞”)。“最低限度结合”表示递送载体与非靶细胞的结合的范围在未检测到至相对于阴性对照(它可以是已知不结合至所述递送载体的细胞类型)的小于1％，或者小于2％，或者小于3％，或者小于4％，或者小于5％，或者小于6％，或者小于7％，或者小于8％，或者小于9％，或者小于10％的提高的结合。
因此，可以通过使用(共价或非共价)连接至递送载体的靶向部分将本发明公开的递送载体定位或靶向至特定类型的细胞(例如，特定类型的T细胞)。优选地，连接所述靶向部分，从而使所述靶向部分存在或另外暴露于所述递送载体的外表面，从而所述部分可以与靶细胞或组织(例如，特定CD4抗原)表面上的同源结合结构域或配体相互作用，借此促进或帮助所述递送载体与靶细胞或组织(如CD4+ T细胞)结合，其中它将然后内化(例如，通过主动内化，如胞吞)并且一旦处于细胞内部，则伴随通过递送载体携带的试剂(例如，mRNA)的释放。
将理解靶向部分可以在制备期间或之后连接至递送载体表面。在一些实施方式中，所述靶向部分在所述载体已制备后连接至所述递送载体表面。在其它实施方式中，在所述载体已制备前，将所述靶向部分连接至未组装的递送载体的组分(例如，脂质)。可以通过本领域中任何已知的方式实施这种连接方式，包括在本领域中熟知的和在本文中所讨论的任何适合的缀合化学。
在一些其它实施方式中，所述递送载体或者包含所述递送载体的组合物还可以包括增强所述递送载体向靶细胞的定位的一种或多种其它试剂。这些其它试剂可以包括帮助递送载体向靶细胞的定位的其它肽、适体、寡核苷酸、维生素或其它分子，但是它不必然直接偶联至所述递送载体。
在一个实施方式中，本发明公开所述的递送载体包含能够将所述递送载体靶向白细胞的一个或多个靶向部分，其通常包括脊髓和淋巴类的免疫系统细胞。例如，骨髓细胞可以包括嗜中性白细胞、嗜曙红细胞、肥大细胞、嗜碱细胞和单核细胞。单核细胞还被分为树突状细胞和巨噬细胞。淋巴样细胞(或淋巴细胞)包括T细胞(再分成辅助性T细胞、记忆T细胞和细胞毒性T细胞)、B细胞(再分成浆细胞和记忆B细胞)和天然杀伤细胞。
本领域的常规技术人员将能够通过在递送载体上安装(共价或非共价)偶联(至所述递送载体)的正确匹配的靶向部分，例如，抗体、肽、蛋白、寡核苷酸、小分子、维生素或适体，从而使所述递送载体由于所述靶向部分和细胞靶标配体之间的特异性，并且优选地，选择性相互作用定位至所述靶细胞，来识别可以用作定位本文所描述的递送载体的工具的这些类型的白细胞中的每一种的适合的细胞靶标配体。
在多个实施方式中，本发明公开考虑了靶向和/或定位至白细胞，并且具体地，至特定淋巴细胞，如CD4+ T细胞的递送载体。在具体的实施方式中，所述递送载体包含能够将所述递送载体靶向至T细胞，包括辅助性T细胞的一个或多个靶向部分。
本领域的技术人员将理解白细胞包含被称为CD抗原的细胞表面抗原，所述CD抗原的特征在于不同类型的白细胞并且帮助定义了多种白细胞亚群。
分化簇(CD)是设想以识别和分类存在于白细胞的细胞表面上的抗原的术语系统。起初，表面抗原根据结合至它们的单克隆抗体来命名。由于在不同实验室中对每种抗原通常存在多种单克隆抗体，因此需要采用一致的术语。当前的系统是在1982年通过第1届人白细胞分化抗原(HLDA)国家研讨会所采用的。人细胞分化分子组织继续举办HLDA会议以维持和发展已知的CD标志物列表。
在该命名系统下，对良好鉴定的抗原分配任意数(例如，CD1、CD2、CD3、CD4、CD5、CD8等)，而为仅被一种单克隆抗体辨别的分子提供临时命名“CDw”，例如，CDw50。还在所分配的数之后添加小写字母以表示共享共有链的较大的分子，例如，CD1a或CD1d。生理学上，CD分子不属于任何具体类别，它们的功能范围从细胞表面受体广泛分布至粘附分子。尽管起初仅用于人白细胞，但是CD分子命名规则目前已扩大覆盖了不同物种(例如，小鼠)以及其它细胞类型。到2016年4月，人CD抗原编号多至CD371。
分别用“+”或“-”来表示来自特定细胞群表面的特异性抗原的存在或不存在。不同的细胞表达水平还标记为hi或low，例如，中央记忆T细胞是CD62Lhi，而效应因子记忆T细胞是CD62Llow。监测不同CD抗原的表达谱已使得能够根据它们在不同免疫过程中的功能对细胞类型进行鉴定、分离和分型。
本发明公开所述的递送载体可以包括结合至CD4抗原或另外与CD4抗原结合的一个或多个靶向部分。在多个实施方式中，将所述递送载体靶向至靶细胞(例如，白细胞)的靶向部分是抗体或抗体结合片段。这些抗体或抗体结合片段可以包括但不限于抗-CD4抗体或抗原结合片段。
如本文所使用的，“抗体”是指能够非共价、可逆并且以特异性方式结合相应抗原(例如，CD4抗原)的免疫球蛋白家族的多肽。例如，天然存在的IgG抗体是包含通过二硫键相互连接的至少两条重链(H)和两条轻链(L)的四聚体。每条重链由重链可变区(本文中缩写为VH)和重链恒定区组成。所述重链恒定区由3个结构域CH1、CH2和CH3组成。每条轻链由轻链可变区(本文中缩写为VL)和轻链恒定区组成。所述轻链恒定区由一个结构域CL组成。VH和VL区可以进一步再分成高变区，称为“互补决定区”(CDR)，其散布了更保守的区域，称为“框架区”(FR)。每个VH和VL由3个CDR和4个FR组成，其从氨基末端到羧基末端按以下顺序布置：FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3和FR4。重链和轻链的可变区含有与抗原相互作用的结合结构域。抗体恒定区可以介导免疫球蛋白与宿主组织或因子的结合，其包括免疫系统的多种细胞(例如，效应细胞)和经典补体系统第一组分(C1q)。
本发明公开所述的抗体包括但不限于单克隆抗体、人抗体、人源化抗体、骆驼科动物抗体、嵌合抗体和抗-独特型(抗-Id)抗体(包括，例如，抗本发明公开所述的抗体的抗-Id抗体)。所述抗体可以是任何同种型/类型(例如，IgG、IgE、IgM、IgD、IgA和IgY)或者亚类(例如，IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1和IgA2)。
如本文所使用的，“互补决定域”或“互补决定区”(“CDR”)可互换地表示VL和VH的高变区。CDR是对这种靶标蛋白具有特异性的抗体链的靶标蛋白-结合位点。在每个人VL或者VH中存在3个CDR(CDR1-3，从N末端按顺序编号)，其构成了约15-20％的可变域。可以通过它们的区域和顺序表示CDR。例如：“VHCDR1”或“HCDR1”两者表示重链可变区的第一CDR。CDR与靶标蛋白表位结构互补，并因此直接负责结合特异性。VL或VH的剩余延伸，即所谓的框架区，显示出较少的氨基酸序列变化(Kuby,Immunology,第4版,第4章.W.H.Freeman&Co.,NewYork,2000)。
可以使用本领域中多种熟知的定义确定CDR和框架区的位置，例如，Kabat、Chothia和AbM(例如，参见Johnson等人,Nucleic Acids Res.,29:205-206(2001)；Chothiaand Lesk,J.Mol.Biol.,196:901-917(1987)；Chothia等人,Nature,342:877-883(1989)；Chothia等人,J.Mol.Biol.,227:799-817(1992)；Al-Lazikani等人,J.Mol.Biol.,273:927-748(1997))。抗原结合位点的定义还如下所述：Ruiz等人,Nucleic Acids Res.,28:219-221(2000)；和Lefranc,M.P.,Nucleic Acids Res.,29:207-209(2001)；MacCallum等人,J.Mol.Biol.,262:732-745(1996)；和Martin等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,86:9268-9272(1989)；Martin等人,Methods Enzymol.,203:121-153(1991)；和Rees等人,InSternberg M.J.E.(主编),Protein Structure Prediction,Oxford University Press,Oxford,141-172(1996))。在组合的Kabat和Chothia编号方案中，在一些实施方式中，CDR对应于作为Kabat CDR、Chothia CDR或两者的一部分的氨基酸残基。例如，在一些实施方式中，CDR对应于VH，例如，哺乳动物VH，例如，人VH中的氨基酸残基26-35(HC CDR1)、50-65(HCCDR2)和95-102(HC CDR3)；和VL，例如，哺乳动物VL，例如，人VL中的氨基酸残基24-34(LCCDR1)、50-56(LC CDR2)和89-97(LC CDR3)。
轻链和重链两者被分成具有结构和功能同源性的区域。在功能上使用术语“恒定”和“可变”。就此而言，将理解轻链(VL)和重链(VH)部分两者的可变域决定了抗原识别和特异性。相反，轻链(CL)和重链(CH1、CH2或CH3)的恒定域赋予了重要的生物学性质，如分泌、经胎盘移动性、Fc受体结合、补体结合等。按照惯例，恒定区结构域的编号随它们距抗体的抗原结合位点或氨基末端的远离而增大。所述N末端是可变区并且恒定区位于C末端；CH3和CL结构域实际上分别包含重链和轻链的羧基末端结构域。
如本文所使用的，“抗原结合片段”是指保留了与白细胞的CD4抗原的表位特异性相互作用(例如，通过结合、空间位阻、稳定/去稳定、空间分布)的能力的抗体的一个或多个部分。结合片段的实例包括但不限于单链Fv(scFv)、二硫键连接的Fv(sdFv)、Fab片段、F(ab')片段，由VL、VH、CL和CH1结构域组成的一价片段；F(ab)2片段，包含在铰链区通过二硫桥连接的两个Fab片段的二价片段；由VH和CH1结构域组成的Fd片段；由抗体的单臂的VL和VH结构域组成的Fv片段；由VH结构域组成的dAb片段(Ward等人,Nature 341:544-546,1989)；和分离的互补决定区(CDR)，或者抗体的其它表位结合片段。
此外，尽管通过单独的基因编码Fv片段的两个结构域VL和VH，但是可以使用重组方法，通过能够将它们制备为其中VL和VH区配对以形成一价分子的单一蛋白链的合成接头将它们连接(称为单链Fv(“scFv”)；例如，参见Bird等人,Science 242:423-426,1988；和Huston等人,Proc.Natl.Acad.Sci.85:5879-5883,1988)。这些单链抗体还旨在涵盖在术语“抗原结合片段”内。使用本领域技术人员已知的常规技术获得这些抗原结合片段，并且以与完整抗体相同的方式筛选所述片段的用途。
还可以将抗原结合片段引入单域抗体、大型抗体、微抗体、纳米抗体、胞内抗体、双链抗体、三链抗体、四链抗体、v-NAR和双-scFv(例如，参见Hollinger and Hudson,NatureBiotechnology 23:1126-1136,2005)。可以基于多肽，如III型纤连蛋白(Fn3)将抗原结合片段移植至骨架(参见美国专利号6,703,199，其描述了纤连蛋白多肽单体)。因此，本文中的抗体和抗原结合片段(例如，抗-CD4抗原结合片段)可以是多种结构，包括但不限于双重特异性抗体、微抗体、结构域抗体、合成抗体、抗体模拟物、嵌合抗体、抗体融合(有时称为“抗体缀合物”)和分别每种的片段。特异性抗体片段(或抗原结合片段)包括但不限于(i)由VL、VH、CL和CH1域组成的Fab片段；(ii)由VH和CH1域组成的Fd片段；(iii)由单一抗体的VL和VH域组成的Fv片段；(iv)dAb片段，其由单一可变区组成；(v)分离的CDR区；(vi)F(ab')2片段，包含两个连接的Fab片段的二价片段；(vii)单链Fv分子(scFv)，其中通过肽接头连接VH域和VL域，其允许两个结构域结合以形成抗原结合位点；(viii)双重特异性单链Fv二聚体和(ix)“双链抗体”或“三链抗体”，通过基因融合构建的多价或多重特异性片段。可以修饰所述抗体片段。例如，可以通过掺入连接VH和VL域的二硫桥键来稳定分子。抗体形式和结构的实例描述于Carter,2006,Nature Reviews Immunology 6:343-357和其中引用参考文献，所有参考文献均明确作为参考并入。
可以将抗原结合片段引入包含一对串联的Fv部分(VH-CH1-VH-CH1)的单链分子，其与互补轻链多肽一起形成抗原结合区对(Zapata等人,Protein Eng.8:1057-1062,1995；和美国专利号5,641,870)。
如本文所使用的，“单克隆抗体”是指具有基本相同的氨基酸序列或者来源于相同基因来源的多肽，包括抗体和抗原结合片段。该术语还包括单一分子组成的抗体分子的制备。单克隆抗体组合物显示出对特定表位的单一结合特异性和亲和力。
如本文所使用的，“人抗体”包括具有可变区的抗体，其中框架和CDR区两者来源于人来源的序列。此外，如果抗体含有恒定区，则所述恒定区还来源于这些人序列，例如，人种系序列，或者人种系序列的突变形式，或者含有来源于人框架序列分析的共有框架序列的抗体，例如，如Knappik等人,J.Mol.Biol.296:57-86,2000中所述。
在一些实施方式中，所述抗体是嵌合抗体或其抗原结合片段。嵌合抗体是包含来自不同基因来源的氨基酸序列的抗体。在一些实施方式中，所述嵌合抗体包含来自小鼠的氨基酸序列和来自人的氨基酸序列。在一些实施方式中，嵌合抗体包含来源于小鼠的可变域和来源于人的恒定域。
在一些实施方式中，所述抗体是人源化抗体或其抗原结合片段。如本文所使用的，“人源化”抗体表示包含人框架区(FR)和来自非人(通常小鼠或大鼠)抗体的一个或多个互补决定区(CDR)的抗体。提供CDR的非人抗体被称为“供体”并且提供框架的人免疫球蛋白被称为“受体”。人源化主要依赖于供体CDR在受体(人)VL和VH框架上的移植(Winter美国专利号5,225,539，该专利作为参考完全并入)。该策略被称为“CDR移植(CDR grafting)”。所选受体框架残基向相应供体残基的“回复突变”通常需要恢复在初始移植构建体中失去的亲和力(美国专利号5,693,762，该专利作为参考完全并入)。人源化抗体最优地还将包含免疫球蛋白恒定区的，通常人免疫球蛋白的至少一部分，并因此通常将包含人Fc区。用于非人抗体的人源化和改造的多种技术和方法在本领域中是熟知的(参见Tsurushita&Vasquez,2004,Humanization of Monoclonal Antibodies,Molecular Biology of B Cells,533-545,Elsevier Science(USA)和其中引用的参考文献，所有参考文献作为参考完全并入)。降低非人抗体可变区的免疫原性的人源化或其它方法可以包括表面重塑法，例如Roguska等人,1994,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 91:969-973，以上参考文献作为参考完全并入。在一个实施方式中，基于选择的方法可以用于使抗体可变区人源化和/或亲和力成熟，即提高可变区对其靶标抗原的亲和力。其它人源化方法可以包括仅部分CDR的移植，其包括但不限于美国专利序列号09/810,502；Tan等人,2002,J.Immunol.169:1119-1125；De Pascalis等人,2002,J.Immunol.169:3076-3084，以上参考文献作为参考完全并入。基于结构的方法可以用于人源化和亲合力成熟，例如，如美国专利系列号10/153,159和相关专利申请中所述，所有参考文献作为参考完全并入。
在一些实施方式中，所述抗体是人工程化的抗体。人工程化的抗体是指来源于非人来源的抗体，如小鼠，其中已进行了一个或多个取代，从而当向受试者施用所述抗体时，改善抗体所期望的特征，如提高稳定性或降低免疫原性。在一些实施方式中，在低风险位置进行取代(例如，暴露于溶剂，但对抗原结合或抗体结构无帮助)。这些取代减轻了在其施用后受试者将对抗体产生免疫应答的风险，且不影响抗体结合至所期望的表位或抗原的能力(例如，参见Studnicka等人，Protein Eng.1994.7(6):805-814)。
在一些实施方式中，所述抗体是单链抗体或抗原结合片段。单链抗体或单链可变片段(scFv)是包含如通过合成接头连接在一起的VH域和VL域以形成单一蛋白或多肽的蛋白或多肽(例如，参见Bird等人,Science.242:423-426,1988；和Huston等人,Proc.Natl.Acad.Sci.85:5879-5883,1988)。
在一些实施方式中，所述抗体是抗体片段或抗原结合片段。抗体片段是来源于抗体的蛋白或多肽。抗原结合片段是来源于能够结合至与它所来源的抗体相同的表位或抗原的蛋白或多肽。
在一些实施方式中，所述抗体具有降低的糖基化、无糖基化或者是低岩藻糖化的。糖基化是指糖、单糖、二糖、寡糖、多糖或者聚糖部分与分子，如多肽或蛋白的共价连接。这些糖或聚糖部分通常以翻译后方式，在通过B细胞分泌之前连接至抗体。糖基化降低的抗体具有比通常连接至具有基本相同氨基酸序列的抗体的数目少的这些连接的糖或聚糖部分，如当通过B细胞体外或在小鼠或人中体内产生抗体时。不具有糖基化的抗体无连接的糖或聚糖部分。低岩藻糖化的抗体具有比通常连接至具有基本相同氨基酸序列的抗体的数目少的岩藻糖基残基，如当通过B细胞体外或在小鼠或人中体内产生抗体时。
在其它实施方式中，可以以降低免疫原性的方式修饰本文所讨论的抗体和抗原结合片段。减少免疫原性的修饰可以包括降低来源于亲代序列的所处理的多肽与MHC蛋白的结合的修饰。例如，将氨基酸修饰工程化，从而不存在或存在最少数目的预测以高亲合力结合至任何普遍的MHC等位基因的免疫表位。识别蛋白序列中MHC结合表位的一些方法在本领域中是已知的并且可以用于对本发明的抗体中的表位打分。例如，参见美国专利序列号09/903,378、美国专利序列号10/754,296、美国专利序列号11/249,692和其中引用的参考文献，所有参考文献明确作为参考并入。
CD4是I型跨膜蛋白，其中4个免疫球蛋白超家族结构域(从N末端至细胞膜侧，依次表示为Dl至D4)存在于细胞外侧，并且总计两条N-连接的糖链结合至结构域D3至D4。CD4通过Dl和D2结构域结合至II型主要组织相容性复合体(MHC)，然后激活T细胞。此外，还已知CD4通过D3和D4结构域聚合。CD4的Dl结构域已知用作人类免疫缺陷性病毒(HIV)的受体(Anderson等人,Clinical Immunology and Immunopathology,84(l):73-84),1997)。
CD4包含根据条目号P01730-1(UniParc)的以下氨基酸序列：
MNRGVPFRHLLLVLQLALLPAATQGKKVVLGKKGDTVELTCTASQKKSIQFHWKNSNQIKILGNQGSFLTKGPSKLNDRADSRRSLWDQGNFPLIIKNLKIEDSDTYICEVEDQKEEVQLLVFGLTANSDTHLLQGQSLTLTLESPPGSSPSVQCRSPRGKNIQGGKTLSVSQLELQDSGTWTCTVLQNQKKVEFKIDIVVLAFQKASSIVYKKEGEQVEFSFPLAFTVEKLTGSGELWWQAERASSSKSWITFDLKNKEVSVKRVTQDPKLQMGKKLPLHLTLPQALPQYAGSGNLTLALEAKTGKLHQEVNLVVMRATQLQKNLTCEVWGPTSPKLMLSLKLENKEAKVSKREKAVWVLNPEAGMWQCLLSDSGQVLLESNIKVLPTWSTPVQPMALIVLGGVAGLLLFIGLGIFFCVRCRHRRRQAERMSQIKRLLSEKKTCQCPHRFQKTCSPI(SEQ ID NO：1)。
本发明所述的抗-CD4抗体可以是结合至CD4的任何抗体，例如，可以包括任何已知或未被发现的抗-CD4抗体的可变区(例如，CDR)。本发明的抗体可以对于CD4显示出选择性。实例包括：全长相对于剪接变体、细胞-表面相对于可溶性形式、对于多种多态性变体的选择性，或者对于靶标的特定构象形式的选择性。本发明的抗体可以结合CD4上的任何表位或区域，并且可以对于所述抗原的片段、突变体形式、剪接形式或异常形式特异。CD4-阳性细胞的实例包括CD4-阳性T细胞，如Thl细胞、Th2细胞、Thl7细胞、调节性T细胞(Treg)和γδΤ细胞。此外，CD4-阳性细胞与疾病，包括癌症和炎性疾病(例如，自体免疫疾病或变应性疾病)有关。
多种抗-CD4抗体和抗原结合片段在本领域中是已知的和/或是可商用的，它们全部可以在本发明中获得使用。
表1提供了可以在本发明公开中使用的多种商品化来源的抗-CD4抗体的列表。
表1：可商用的示例性抗-CD4抗体
除商品化来源外，文献已报道了大量抗CD4单克隆抗体。多种抗-CD4mAb处于以治疗癌症、免疫疾病和感染为目的的临床进展中。例如，基于以下事实：CD4和HIV之间的结合对于HIV感染必不可少，在作为HIV治疗剂的开发中，识别CD4的Dl结构域的抗体可以抑制HIV感染。作为癌症或免疫疾病的治疗剂所开发的抗-CD4 mAb的实例包括扎木单抗(6G5)、ibalizumab、曲加利珠单抗和凯利昔单(CE9.1)。这些抗体是通过特异性攻击作为靶细胞的CD4表达细胞发挥它们的药物效力的抗体，并且据考虑药物效力的机制主要是由于ADCC活性(Kim等人,Blood,109(11):4655-4662,2007)。
另外，本发明公开考虑使用以下参考文献中所公开的任何抗-CD4抗体或其抗体片段：US7338658B2；US5741488A；US5871732A；US9758581B2；Delmonico等人,“Anti-CD4monoclonal antibody therapy,”Clin Transplant,1996,Oct 10(5):第397-403页；Konig等人,“Tregalizumab–A Monoclonal Antibody to Target Regulatory T Cells,”FrontImmunol.2016,Vol.7:11；和JF Bach,“Therapeutic monoclonal antibodies,”Ann PharmFr.,2006,64(5):308-11，以上每篇文献以其全部内容作为参考并入本文。
文献中已知的所有以上提及的可商用和抗-CD4抗体可以用于本发明公开。
在某些其它实施方式中，用于将所述递送载体靶向至靶细胞(例如，白细胞)的靶向部分是抗-CD8抗体或抗原结合片段。
CD8是起到用于与MHC I类分子(pMHCI)复合的肽抗原的TCR识别的共受体的作用的表面糖蛋白。它作为αα同源二聚体或者作为αβ异源二聚体表达(Zamoyska,Immunity,1:243-6,1994)，两条链表达单一胞外Ig超家族(IgSF)V结构域、膜近端铰链区、跨膜结构域和胞质尾。CD8使用其β链以及胞外IgSF V结构域内的互补决定区(CDR)与im以及MHC I型分子的a2和a3结构域相互作用。这种结合提高了T细胞受体对其I类靶标的粘附/亲和力。
另外，通过CD8a链结合的酪氨酸蛋白激酶p561ck4'5介导的内部信号转导级联导致T细胞激活。Lck是初始CD8+ T细胞的激活和扩增所需的；然而，其表达不是记忆CD8+ T细胞对第二抗原体内或体外刺激的应答所必不可少的(Bachman等人,J Exp Med,189:1521-30,1999)。如通过CD8a或CD8B基因靶向的小鼠所示，CD8在MHC I类-限制的T淋巴细胞的成熟与功能中起重要作用(Nakayama等人,Science,263:1131-3,1984)。已发现患有反复细菌感染的一位患者由于CD8a基因中的单一突变而显示出CD8缺陷。CD8的缺少似乎不是CD8+ T细胞谱系提交或外周溶胞功能所必不可少的(de la Calle-Martin等人,J Clin Invest,108:117-23,2001)。
人CD8分子是在细胞毒T细胞(CTL)上表达的糖蛋白和细胞表面标志物。这些是T-淋巴细胞亚型并且在脊椎动物的适应性免疫系统中起重要作用。它们负责除去病毒感染的细胞或者其它异常细胞，如一些肿瘤细胞。经由T细胞受体(TCR)特异性识别这些细胞，T细胞受体与经由靶细胞上的I类MHC(主要组织相容性复合体)所递呈的特定抗原相互作用。
通过P01732-1(UniParc)表示示例性CD8氨基酸序列，其被称为正规序列：
MALPVTALLLPLALLLHAARPSQFRVSPLDRTWNLGETVELKCQVLLSNPTSGCSWLFQPRGAAASPTFLLYLSQNKPKAAEGLDTQRFSGKRLGDTFVLTLSDFRRENEGYYFCSALSNSIMYFSHFVPVFLPAKPTTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACDIYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYCNHRNRRRVCKCPRPVVKSGDKPSLSARYV(SEQ ID NO：2)。
多种抗-CD8抗体和抗原结合片段在本领域中是已知的和/或是可商用的，它们全部可以在本发明中获得使用。
表2提供了可以在本发明公开中使用的多种商品化来源的抗-CD8抗体的列表。
表2：可商用的示例性抗-CD8抗体
存在多种本领域中已知的抗-CD8抗体，包括单克隆抗体，包括：2D2；4D12.1；7B12IG1 1；8E-1.7；8G5；14；21Thy；51.1；66.2；109-2D4；138-17；143-44；278F24；302F27；AICD8.1；抗-T8；B9.1.1；B9.2.4；B9.3.1；B9.4.1；B9.7.6；B9.8.6；B9.1 1；B9.1 1.10；BE48；BL15；BL-TS8；BMAC8；BU88；BW135/80；C1-11G3；CIO；C12/D3；CD8-4C9；CLB-T8/1；CTAG-CD8、3B5；F80-1D4D11；F101-87(S-T8a)；GIO-I；GlO-1.1；HI208；HI209；HI212；HIT8a；HIT8b；HIT8d；ICO-31；ICO-122；IP48；ITI-5C2；ITM8-1；JML-H7；JML-H8；L2；L533；Leu-2a；LT8；LY17.2E7；LY19.3B2；M236；M-T122；M-T415；M-T805；M-T806；M-T807；M-T808；M-T809；M-T1014；MCD8；MEM-31；MEM-146；NU-Ts/c；OKT8；OKT8f；P218；RPA-T8；SM4；T8；T8/2T8-19；T8/2T8-2A1；T8/2T8-1B5；T8/2T8-1C1；T8/7Pt3F9；T8/21thy2D3；T8/21thy；T8/TPE3FP；T8b；T41D8；T811；TU68；TU102；UCHT4；VIT8；VIT8b；WuT8-l；X107；YTC141.1；和/或YTC182.20。除商品化来源外，文献已报道了大量抗CD8单克隆抗体。例如，本文中考虑了以下出版物中所述的抗-CD8抗体或其片段：AU2014249243B2；10,746,726；9,790,279；9,758,581；9,587,022；8,877,913；8,685,651；8,673,304；8,586,715；8,440,806；8,399,621；7,541,443；7,482,000；7,452,981；7,452,534；7,338,658；6,136,310；6,056,956；5,871,732；和5,741,488，以上每篇文献以其全部内容作为参考并入本文。
文献中已知的所有以上提及的可商用和抗-CD8抗体可以用于本发明公开。
在某些其它实施方式中，用于将所述递送载体靶向至靶细胞(例如，白细胞)的靶向部分是抗-CD3抗体或抗原结合片段。
CD3抗原与T细胞上的T细胞受体复合物结合。对CD3和靶细胞抗原具有特异性的多重特异性抗原结合蛋白可以引发靶细胞上T细胞的细胞毒活性。即，通过抗原结合蛋白与CD3和与靶细胞，例如，肿瘤细胞的多重特异性结合，可以诱导靶细胞的细胞胞溶。具有CD3结合位点的抗原结合蛋白以及它们的产生在本领域中是已知的(并且例如描述于Kipriyanov等人,1999,Journal of Molecular Biology 293:41-56、Le Gall等人,2004,Protein Engineering,Design&Selection,17/4:357-366)。
CD3抗原是5条不变的多肽链的复合物：γ、δ、ε、ζ和η，它们的分子量分别为25-28、21、20、16和22kDa。CD3链以两种不变的二聚体组聚类，与由ζ同源二聚体组成的可变二聚体结合的γ/ε和δ/ε，或者ζ/η，或者ζ/γFcR异源二聚体(γFcR是Fc受体的γ链)，或者γFcR同源二聚体。CD3是包括T细胞受体(TCR)的较大的复合物的一部分。与TCR结合的CD3复合物在免疫应答期间参与结合至I和II类主要组织相容性复合体的肽的识别。当通过MHC复合物将外源抗原递呈至TCR时，可以诱导T细胞激活。通过成熟T淋巴细胞并通过胸腺细胞亚型表达CD3抗原。
多种抗-CD3抗体和抗原结合片段在本领域中是已知的和/或是可商用的，它们全部可以在本发明中获得使用。
表3提供了可以在本发明公开中使用的多种商品化来源的抗-CD8抗体的列表。
表3：可商用的示例性抗-CD3抗体
抗-CD3抗体，包括单克隆抗体在本领域中是已知的，包括：以下中所公开的那些：US2018/0057593、US11007267B2、US10865251B2、US10759858B2、US10906978B2、US20210253701A1、US20200123255A1、US20210095027A1、US20210147561A1、US10544220B2、US20190284278A1、US20190263904A1和US20200048348A1，以上每篇文献以其全部内容作为参考并入本文。
文献中已知的所有以上提及的可商用和抗-CD3抗体可以用于本发明公开。
另外，还可以通过任何适合的常规方法制备可以用作本文所使用的递送载体上的靶向部分的本发明公开所述的抗体。在一种方法中，在用所关心的抗原(例如，CD4)免疫后，选择具有产生抗体，具体地B淋巴细胞(B细胞)的潜力的体细胞用于MAb产生规程。这些细胞可以得自活组织检查的脾脏或淋巴结，或者得自循环血液。然后，将来自免疫动物的抗体产生B淋巴细胞与永生化骨髓瘤细胞的细胞融合，通常是与所免疫的动物相同物种或者人或人/小鼠嵌合细胞之一。适合于在杂交瘤-产生融合程序中使用的骨髓瘤细胞系优选地是非抗体-产生的，具有高融合效率，和然后使其不能在仅支持所期望的融合细胞(杂交瘤)生长的特定选择培养基中生长的酶缺陷。可以使用一些骨髓瘤细胞中的任一种，如本领域技术人员已知的(Goding,第65-66页,1986；Campbell,第75-83页,1984)。
用于产生抗体的方法
产生抗体-产生脾脏或淋巴结细胞和骨髓瘤细胞的杂交体的方法通常包括在存在一种或多种促进细胞膜融合的试剂(化学或电学)的情况下将体细胞与骨髓瘤细胞混合。Kohler and Milstein(1975；1976)已描述了使用仙台病毒的融合方法，并且Gefter等人(1977)描述了使用聚乙二醇(PEG)，如37％(v/v)PEG的那些方法。电学诱导的融合方法的使用也是适合的(Goding,第71-74页,1986)。
培养提供了从中选择特异性杂交瘤的杂交瘤群。通常，通过在微量滴定板中的单一克隆稀释，然而测试各个克隆上清液(在约2至3周后)所期望的反应性，通过培养细胞进行杂交瘤的选择。所述测定应是灵敏、简单且快速的，如放射免疫测定、酶免疫测定、细胞毒性测定、空斑测定、免疫斑点测定等。然后，对所选的杂交瘤进行连续修饰或通过流式细胞分选进行单细胞分选并克隆到各个抗体-产生细胞系中，所述克隆然后可以无限繁殖以提供mAb。
所述细胞系可以以两种基本方式用于MAb产生。可以将杂交瘤样品注射到动物(例如，小鼠)中(通常注射到腹膜腔中)。任选地，在注射前，用烃，具体地油剂，如异十八烷(四甲基十五烷)使动物初免。当以这种方式使用人杂交瘤时，最优地注射免疫受损的小鼠，如SCID小鼠，以防止肿瘤排斥。注射动物出现分泌通过融合细胞杂交体所产生的特异性单克隆抗体的肿瘤。然后，可以放出动物体液，如血清或腹水，以提供高浓度MAb。还可以离体培养单个细胞系，其中MAb被天然分泌到培养基中，从所述培养基可以容易地以高浓度获得它们。作为另外一种选择，可以体外使用人杂交瘤细胞系以在细胞上清液中产生免疫球蛋白。所述细胞系可以适合于在无血清培养基中生长以优化回收高纯度的人单克隆免疫球蛋白的能力。
如果需要，可以使用过滤、离心和多种色谱方法，如FPLC或亲合色谱法进一步纯化通过任一种方式所产生的MAb。本发明公开的单克隆抗体片段可以得自通过包括酶，如胃蛋白酶或木瓜蛋白酶的消化，和/或通过化学还原对二硫键的切割的方法的纯化的单克隆抗体。作为另外一种选择，可以使用自动肽合成仪合成通过本发明公开所涵盖的单克隆抗体片段。
还考虑分子克隆方法可以用于产生单克隆。对此，RNA可以分离自杂交瘤系，并且通过RT-PCR获得抗体基因并克隆至免疫球蛋白表达载体。作为另外一种选择，从分离自所述细胞系的RNA制备免疫球蛋白噬粒组合文库并通过使用病毒抗原淘选来选择表达适当抗体的噬粒。这种方法相对于常规杂交瘤技术的优势在于可以在单一轮次产生并筛选很多个抗体，并且通过H和L链组合产生新的特异性，其进一步提高了获得适当抗体的概率。
分别作为参考并入本文的教导在本发明公开中有用的抗体的产生的美国专利包括美国专利5,565,332，其描述了使用组合方法的嵌合抗体的产生；美国专利4,816,567，其描述了重组免疫球蛋白制备；和美国专利4,867,973，其描述了抗体-治疗剂缀合物。
组合
在一个实施方式中，本发明提供了T细胞靶向的递送载体的组合，其靶向两种或更多种T细胞抗原。在一个实施方式中，所述两种或更多种T细胞抗原选自CD1、CD2、CD3、CD4、CD5、CD7、CD8、CD16、CD25、CD26、CD27、CD28、CD30、CD38、CD39、CD40L、CD44、CD45、CD62L、CD69、CD73、CD80、CD83、CD86、CD95、CD103、CD119、CD126、CD150、CD153、CD154、CD161、CD183、CD223、CD254、CD275、CD45RA、CXCR3、CXCR5、FasL、IL18R1、CTLA-4、OX40、GITR、LAG3、ICOS、PD-1、leu-12、TCR、TLR1、TLR2、TLR3、TLR4、TLR6、NKG2D、CCR、CCR1、CCR2、CCR4、CCR6或CCR7。在一个实施方式中，所述组合包含一个或多个T细胞靶向的递送载体，其靶向CD4+ T细胞的表面抗原和CD8+ T细胞的表面抗原。在一个实施方式中，所述组合包含两种或更多种T细胞靶向的递送载体，其靶向CD4和CD8。
在一个实施方式中，T细胞靶向的递送载体的组合将相同试剂递送至表达不同表面抗原的T细胞。在一个实施方式中，T细胞靶向的递送载体的组合将第一试剂递送至表达第一表面抗原的T细胞的一个亚型，并且将第二不同的试剂递送至表达第二表面抗原的T细胞的第二亚型。因此，在多个实施方式中，可以使用本发明的组合将1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或大于10种不同的试剂递送至T细胞。
在一个实施方式中，本发明所述的组合物包含本文所描述的试剂的组合。在某些实施方式中，包括本文所述的试剂的组合的组合物具有累加效果，其中所述组合的整体效果与每种单独的试剂的效果之和近似相等。在其它实施方式中，包括本文所述的试剂的组合的组合物具有协同作用，其中所述组合的整体效果大于每种单独的试剂的效果之和。
包含试剂组合的组合物包含处于任何适合的比例的单个试剂。例如，在一个实施方式中，所述组合物包含1:1比例的两种单独的试剂。然而，所述组合不局限于任何特定的比例。而是，涵盖了证明有效的任何比例。
缀合
在本发明的多个实施方式中，将所述递送载体缀合至靶向结构域。示例性的缀合方法可以包括但不限于共价键、静电相互作用和疏水性(“范德华力”)相互作用。在一个实施方式中，缀合是可逆缀合，从而一旦暴露于特定条件或化学试剂，所述递送载体可以与所述靶向结构域分离。在另一个实施方式中，所述缀合是不可逆缀合，从而在正常条件下，所述递送载体不与所述靶向结构域分离。
在一些实施方式中，所述缀合包含激活的聚合物缀合的脂质和所述靶向结构域之间的共价键。术语“激活的聚合物缀合的脂质”是指包含脂质部分和已经由第一偶联基团对聚合物缀合的脂质的官能化激活的聚合物部分的分子。在一个实施方式中，所述激活的聚合物缀合的脂质包含能够与第二偶联基团反应的第一偶联基团。在一个实施方式中，所述激活的聚合物缀合的脂质是激活的PEG化脂质。在一个实施方式中，所述第一偶联基团结合至所述PEG化脂质的脂质部分。在另一个实施方式中，所述第一偶联基团结合至所述PEG化脂质的聚乙二醇部分。在一个实施方式中，所述第二官能团共价连接至所述靶向结构域。
所述第一偶联基团和第二偶联基团可以是本领域技术人员已知共同形成共价键，例如，在温和反应条件或生理条件下形成共价键的任何官能团。在一些实施方式中，所述第一偶联基团或第二偶联基团选自马来酰亚胺、N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)酯、碳二亚胺、酰肼、五氟苯基(PFP)酯、膦、羟甲基膦、补骨脂素、亚氨酸酯、二硫吡啶、异氰酸酯、乙烯砜、α-卤代乙酰基、芳基叠氮化物、酰基叠氮化物、烷基叠氮化物、双吖丙啶、苯甲酮、环氧化物、碳酸酯、酸酐、磺酰氯、环辛炔、醛和巯基。在一些实施方式中，所述第一偶联基团或第二偶联基团选自由以下组成的组：游离胺(-NH2)、游离巯基(-SH)、游离氢氧化物基团(-OH)、羧酸根、酰肼和烷氧基胺。在一些实施方式中，所述第一偶联基团是对巯基具有反应性的官能团，如马来酰亚胺、二硫吡啶或卤代乙酰基。在一个实施方式中，所述第一偶联基团是马来酰亚胺。
在一个实施方式中，所述第二偶联基团是巯基。可以使用本领域技术人员已知的任何方法将巯基布置在靶向结构域上。在一个实施方式中，所述巯基存在于游离半胱氨酸残基上。在一个实施方式中，经由靶向结构域上二硫键的还原，如通过与2-半胱胺的反应显示巯基。在一个实施方式中，经由化学反应，如游离胺和2-亚氨基四氢噻吩或者N-琥珀酰亚胺基S-乙酰基硫乙酸酯(SATA)之间的反应，布置所述巯基。
在一些实施方式中，用“点击”化学中所使用的基团官能化所述聚合物缀合的脂质和靶向结构域。生物正交“点击”化学包含了官能团与1,3-偶极体，如叠氮化物、氧化腈、硝酮、异氰化物之间的反应以及与烯烃或炔烃亲偶极体的连接。示例性亲偶极体包括本领域技术人员已知的任何应变环烯和环炔，包括但不限于环辛炔、二苯并环辛炔、一氟化环辛炔、二氟化环辛炔和二芳基氮杂环辛酮。
肽靶向部分
在一个实施方式中，本发明所述的靶向结构域包含肽。在某些实施方式中，所述肽靶向结构域特异性结合至所关心的靶标。
可以使用化学法制备本发明所述的肽。例如，肽可以通过固相技术合成(RobergeJ Y等人(1995)Science 269:202-204)，从树脂切割并通过制备型高效液相色谱纯化。例如，根据生产商所提供的说明，使用ABI 431A肽合成仪(Perkin Elmer)可以实现自动合成。
作为另外一种选择，可以通过重组方式或者通过从较长的多肽切割来制备肽。可以通过氨基酸分析或测序确认肽的组成。
根据本发明所述的肽的变体可以是(i)其中一个或多个氨基酸残基被保守或非保守氨基酸残基(优选地保守氨基酸残基)替换的一种变体，并且这种替换的氨基酸残基可以或可以不是由遗传密码所编码的一种变体，(ii)其中存在一个或多个修饰的氨基酸残基，例如，通过取代基团的连接修饰的残基的一种变体，(iii)其中所述肽是本发明所述的肽的可变剪接变体的一种变体，(iv)所述肽的片段和/或(v)其中所述肽与另一种肽，如前导序列或分泌序列或用于纯化(例如，His-标签)或用于检测(例如，Sv5表位标签)的序列融合的一种变体。所述片段包括通过原始序列的蛋白水解切割(包括多位点蛋白水解)所产生的肽。变体可以翻译后修饰或者化学修饰。根据本文的教导内容，这些变体被认为在本领域技术人员的范围内。
如本领域中已知的，通过将一条肽的氨基酸序列及其保守氨基酸替换与第二条肽的序列相比较，确定两条肽之间的“相似性”。将变体定义为包括不同于原始序列，优选地每个所关心的链段不同于原始序列的小于40％的残基，更优选地每个所关心的链段不同于原始序列的小于25％的残基，更优选地每个所关心的链段不同于小于10％的残基，最优选地每个所关心的链段不同于原始蛋白序列的仅几个残基，并且同时与原始序列足够同源以保持原始序列的功能性的肽序列。本发明包括与原始氨基酸序列至少60％、65％、70％、72％、74％、76％、78％、80％、90％或95％类似或相同的氨基酸序列。使用本领域技术人员普遍已知的计算机算法和方法确定两条肽之间的同一性程度。优选地，通过使用BLASTP算法确定两条氨基酸序列之间的同一性[BLAST Manual,Altschul,S.,等人,NCBI NLM NIHBethesda,Md.20894,Altschul,S.,等人,J.Mol.Biol.215:403-410(1990)]。
可以翻译后修饰本发明所述的肽。例如，属于本发明的范围的翻译后修饰包括信号肽切割、糖基化、乙酰化、异戊二烯化、蛋白水解、豆蔻酰化、蛋白折叠和蛋白水解加工等。一些修饰或加工事件需要引入另外的生物学机器。例如，通过向标准翻译反应添加犬科微粒体膜或非洲蟾蜍卵细胞提取物(美国专利号6,103,489)来检验加工事件，如信号肽切割和核心糖基化。
本发明所述的肽可以包括通过翻译后修饰或者通过在翻译期间引入非天然氨基酸所形成的非天然氨基酸。
核酸靶向部分
在一个实施方式中，本发明所述的靶向结构域包含分离的核酸，例如包括DNA寡核苷酸和RNA寡核苷酸。在某些实施方式中，所述核酸靶向结构域特异性结合至所关心的靶标。例如，在一个实施方式中，所述核酸包含特异性结合至所关心的靶标的核苷酸序列。
作为另外一种选择，核酸靶向结构域的核苷酸序列可以包含相对于原始核苷酸序列的序列变化，例如，一个或多个核苷酸的替换、插入和/或缺失，但条件是所得核酸起到原始核酸的作用并且特异性结合至所关心的靶标。
在本文描述中所使用的意义上，当其核苷酸序列相对于所述核苷酸序列具有至少60％，有利地至少70％，优选地至少85％并且更优选地至少95％的同一性程度时，核苷酸序列与本文描述的任何核苷酸序列“基本同源”。可能的修饰的其它实例包括一个或多个核苷酸在所述序列中的插入、一个或多个核苷酸在任何序列末端的添加或者一个或多个核苷酸在任何序列末端或内部的缺失。使用本领域技术人员普遍已知的计算机算法和方法确定两条多核苷酸之间的同一性程度。优选地，通过使用BLASTN算法确定两条氨基酸序列之间的同一性[BLAST Manual,Altschul,S.,等人,NCBI NLM NIH Bethesda,Md.20894,Altschul,S.,等人,J.Mol.Biol.215:403-410(1990)]。
抗体靶向部分
在一个实施方式中，本发明所述的靶向结构域包含抗体或抗体片段。在某些实施方式中，所述抗体靶向结构域特异性结合至所关心的靶标。这些抗体包括多克隆抗体、单克隆抗体、Fab和其单链Fv(scFv)片段、双重特异性抗体、杂合偶联抗体、人和人源化抗体。
所述抗体可以是完整单克隆或多克隆抗体，和免疫活性片段(例如，Fab或(Fab)2片段)、抗体重链、抗体轻链、人源化抗体、基因工程单链FV分子(Ladner等人，美国专利号4,946,778)或嵌合抗体，例如，含有鼠科抗体的结合特异性，但是其中剩余部分是人源的抗体。可以使用本领域技术人员已知的方法制备抗体，包括单克隆和多克隆抗体、片段和嵌合体。
可以以多种方式产生这些抗体，包括杂交瘤培养、在细菌或哺乳动物细胞培养物中的重组表达和在转基因动物中的重组表达。生产方法的选择取决于一些因素，包括所期望的抗体结构、抗体上碳水化合物部分的重要性、培养和纯化的容易程度以及成本。可以使用标准表达技术产生多种不同的抗体结构，包括全长抗体、抗体片段，如Fab和Fv片段以及包含来自不同物种的组分的嵌合抗体。可以在细菌表达系统中产生小尺寸的抗体片段，如Fab和Fv片段，其不具有效应因子功能和有限的药物动力学活性。单链Fv片段显示出低免疫原性。
在一个实施方式中，本发明所述的靶向结构域是特异性结合至CD4+ T细胞表面抗原的抗体。在一个实施方式中，本发明所述的靶向结构域是特异性结合至CD4的抗体。
T细胞
在多个实施方式中，所述递送载体的靶标可以是体内的任何类型的细胞(即，“靶标细胞”)。在优选的实施方式中，靶细胞是免疫细胞，如但不限于任何种类的骨髓细胞(例如，嗜中性白细胞、嗜曙红细胞、肥大细胞、嗜碱细胞和单核细胞)或者任何种类的淋巴细胞(例如，T细胞(例如，细胞毒性T细胞、辅助性T细胞或者记忆T细胞)、B细胞(例如，浆细胞和记忆B细胞)和天然杀伤细胞)。
在一些实施方式中，可以使用本发明所述的组合物将T细胞靶向免疫刺激性细胞，即介导免疫应答的细胞。在一些实施方式中，可以使用本发明所述的组合物靶向的T细胞可以包括但不限于T辅助细胞(CD4+)和CD4+细胞毒性T细胞(也称为细胞毒T淋巴细胞，CD4+CTL)。在某些实施方式中，所述靶细胞是T细胞。在一些实施方式中，可以使用本发明所述的组合物靶向的T细胞可以是CD4+或CD8+，并且可以包括但不限于T辅助细胞(CD4+)、细胞毒性T细胞(也称为细胞毒T淋巴细胞，CTL；CD8-T细胞)和记忆T细胞，包括中央记忆T细胞(TCM)、干细胞记忆T细胞(TSCM)、干细胞样记忆T细胞(或干细胞样记忆T细胞)和效应因子记忆T细胞，例如，TEM细胞和TEMRA(CD45RA+)细胞、效应T细胞、Th1细胞、Th2细胞、Th9细胞、Th17细胞、Th22细胞、Tfh(卵泡辅助)细胞、调节性T细胞、天然杀伤T细胞、粘膜相关不变T细胞(MAIT)和γδT细胞。主要的T细胞亚型包括TN(初始)、TSCM(干细胞记忆)、TCM(中央记忆)、TTM(瞬时记忆)、TEM(效应因子记忆)和TTE(末端效应因子)、TCR-转基因T细胞、通用细胞因子介导杀伤的重定向T细胞(TRUCK)、肿瘤浸润T细胞(TIL)、CAR-T细胞或者可以用于治疗疾病或病症的任何T细胞。在一些实施方式中，所述T细胞是CD4+ T细胞。
治疗方法
本发明提供了将用于疾病，或者疾病或病症的诊断、治疗或预防的至少一种试剂递送至CD4+ T细胞的方法。在一个实施方式中，所述CD4+ T细胞靶向的递送载体包含或包封了要向受试者施用的试剂。在一些实施方式中，所述试剂是核苷修饰的mRNA。本发明因此提供了将至少一种试剂递送至CD4+ T细胞的方法。
在一个实施方式中，CD4+ T细胞靶向的递送载体包含或包封了用于治疗疾病或病症的治疗剂。在一些实施方式中，所述治疗剂是核苷修饰的mRNA。本发明因此提供了将至少一种治疗剂递送至CD4+ T细胞的方法。在某些实施方式中，所述方法用于治疗或预防受试者中的疾病或病症。示例性的疾病或病症包括但不限于癌症、传染性疾病和免疫学病症。
以下是可以通过所公开的方法治疗或预防的癌症的非限制性实例：急性淋巴母细胞性白血病、急性髓细胞性白血病、肾上腺皮质癌、阑尾癌、基底细胞癌、胆管癌、膀胱癌、骨癌、脑和脊髓肿瘤、脑干神经胶质瘤、脑肿瘤、乳腺癌、支气管瘤、伯基特淋巴瘤、类癌瘤、中枢神经系统非典型畸胎瘤样/横纹肌样瘤、中枢神经系统胚胎性瘤、中枢神经系统淋巴瘤、小脑星形细胞瘤、脑星形细胞瘤/恶性神经胶质瘤、脑星形细胞瘤/恶性神经胶质瘤、宫颈癌、儿童视通路肿瘤、脊索瘤、慢性淋巴细胞性白血病、慢性粒性白血病、慢性脊髓增生病、结肠癌、结肠直肠癌、颅咽管瘤、皮肤癌、皮肤T-细胞淋巴瘤、子宫内膜癌、成室管膜细胞瘤、室管膜瘤、食道癌、尤文氏家族肿瘤、颅外癌、性腺外生殖细胞瘤、肝外胆管癌、肝外癌、眼癌，蕈样、胆囊癌、胃(胃部)癌、胃肠癌、胃肠道类癌瘤、胃肠道间质瘤(gist)、生殖细胞瘤、妊娠癌、妊娠滋养细胞肿瘤、成胶质细胞瘤、神经胶质瘤、毛细胞白血病、头颈癌、肝细胞(肝)癌、组织细胞增多病、霍奇金淋巴瘤、舌癌、下丘脑和视通路胶质瘤、下丘脑肿瘤、眼内(眼)癌、眼内黑素瘤、胰岛细胞瘤、卡波西肉瘤、肾(肾脏细胞)癌、郎格罕细胞癌、郎格罕细胞组织细胞增生症、喉癌、白血病、唇癌和口腔癌、肝癌、肺癌、淋巴瘤、巨球蛋白血症、骨恶性纤维组织细胞瘤和骨肉瘤、成神经管细胞瘤、髓上皮瘤、黑素瘤、merkel细胞癌、间皮瘤、原发灶隐匿的转移性颈鳞癌、口腔癌、多发性内分泌瘤综合征、多发性骨髓瘤、霉菌病、脊髓发育不良综合征、骨髓增生异常/骨髓增生性疾病、粒细胞性白血病、骨髓性白血病、骨髓瘤、脊髓增生病、鼻腔和鼻窦癌、鼻咽癌、成神经细胞瘤、非霍奇金氏淋巴瘤、非小细胞肺癌、口腔癌、口腔癌、口咽癌、骨肉瘤和恶性纤维组织细胞瘤、骨肉瘤和骨恶性纤维组织细胞瘤、卵巢、卵巢癌、卵巢上皮癌、卵巢生殖细胞瘤、卵巢低度恶性潜能肿瘤、胰腺癌、乳头状瘤病、副神经节瘤、甲状旁腺癌、阴茎癌、咽癌、嗜铬细胞瘤、中分化松果体实质细胞瘤、成松果体细胞瘤和幕上原始神经外胚层瘤、垂体瘤、浆细胞赘生物、浆细胞肿瘤/多发性骨髓瘤、胸膜肺胚细胞瘤、原发性中枢神经系统癌、原发性中枢神经系统淋巴瘤、前列腺癌、直肠癌、肾脏细胞(肾)癌、肾盂和输尿管癌、涉及染色体15上的nut基因的呼吸道癌、成视网膜细胞瘤、横纹肌肉瘤、唾液腺癌、肉瘤、塞扎里综合征、皮肤癌(黑素瘤)、皮肤癌(非黑素瘤)、皮肤癌、小细胞肺癌、小肠癌、软组织癌、软组织肉瘤、鳞状细胞癌、颈鳞癌、胃部(胃)癌症、幕上原始神经外胚层瘤、幕上原始神经外胚层瘤和成松果体细胞瘤、T细胞淋巴瘤、睾丸癌、咽喉癌、胸腺瘤和胸腺癌、甲状腺癌、移行细胞癌、肾盂和输尿管的移行细胞癌、滋养叶瘤、尿道癌、子宫癌、子宫肉瘤、阴道癌、视通路和下丘脑神经胶质瘤、外阴癌、瓦尔登斯物伦巨球蛋白血症和胚胎性癌肉瘤。
在一些实施方式中，本发明描绘了用于治疗或预防自体免疫疾病的方法，所述自体免疫疾病包括但不限于类风湿性关节炎/血清阴性关节病、骨关节炎、炎症性肠病、全身性红斑狼疮、虹膜炎/葡萄膜视神经炎、特发性肺纤维化、全身性血管炎/韦格纳氏肉芽肿病、结节病，包括但不限于、类风湿性关节炎/血清阴性关节病、骨关节炎、炎症性肠病、全身性红斑狼疮、虹膜炎/葡萄膜视神经炎、特发性肺纤维化、全身性血管炎/韦格纳氏肉芽肿病、结节病、心肌炎、心肌梗塞后综合症、开胸-心包切开后综合征、亚急性细菌性心内膜炎(SBE)、抗肾小球基底膜肾炎、间质性膀胱炎、狼疮肾炎、自体免疫性肝炎、原发性胆汁性胆管炎(PBC)、原发性硬化性胆管炎、抗合成酶综合征、斑形脱发、自体免疫性血管性水肿、自体免疫性黄体酮皮炎、自体免疫性荨麻疹、大疱性类天疱疮、瘢痕性类天疱疮、疱疹样皮炎、盘状红斑狼疮、后天性大疱性表皮松解、结节性红斑、妊娠性类天疱疮、化脓性汗腺炎、扁平苔癣、硬化性苔癣、线性IgA大疱病(LAD)、硬斑病、寻常天疱疮、急性苔癣痘疹样糠疹、穆-哈二氏病、银屑病、系统性硬皮病、白癜风、阿狄森氏病、1型自身免疫性多内分泌综合征(APS)、2型自身免疫性多内分泌综合征(APS)、3型自身免疫性多内分泌综合征(APS)、自体免疫性胰腺炎(AIP)、1型糖尿病、自体免疫甲状腺炎、奥德甲状腺炎、突眼性甲状腺肿、自体免疫性卵巢炎、子宫内膜异位、自体免疫性睾丸炎、干燥综合征、自体免疫性肠病、腹腔病、克罗恩氏病、显微镜下结肠炎、溃疡性结肠炎、抗磷脂综合征(APS、APLS)、再生障碍性贫血、自身免疫性溶血性贫血、自体免疫性淋巴组织增生性综合征、自体免疫性中性白细胞减少、自身免疫性血小板减少性紫癜、冷凝集素病、特发性混合型冷沉淀球蛋白血症、伊文思综合征、恶性贫血、单纯红细胞再生障碍性贫血、血小板减少、德尔肯氏病、成人斯蒂尔氏病、强直性脊柱炎、CREST综合征、药物引起的狼疮、起止点炎相关关节炎、嗜酸细胞性筋膜炎、费尔蒂综合征、IgG4-相关疾病、幼年型关节炎、莱姆病(慢性)、混合结缔组织病(MCTD)、汉-罗二氏综合征、帕-罗二氏综合征、帕松纳-特纳综合症、牛皮癣关节炎、反应性关节炎、复发性多软骨炎、腹膜后纤维化、风湿热、Schnitzler综合征、未分化结缔组织病(UCTD)、皮肤肌炎、纤维性肌痛、包含体肌炎、肌炎、重症肌无力、神经性肌强直、副肿瘤性小脑变性、多肌炎、急性播散性脑脊髓炎(ADEM)、急性运动轴索神经病、抗-N-甲基-D-天冬氨酸(抗-NMDA)受体脑炎、巴洛同心圆性硬化症、比克斯塔夫脑炎、慢性炎症性脱髓鞘性多发性神经病、吉兰-巴雷综合征、桥本氏脑病、特发性炎症性脱髓鞘疾病、Lambert-Eaton类重症肌无力综合征、多发性硬化(II型)、奥舒兰综合征、与链球菌相关的儿科自身免疫性神经精神病学病症(PANDAS)、进行性炎症性神经病、多动腿综合征、僵人综合征、sydenham舞蹈病、横贯性脊髓炎、自体免疫性视网膜病、自体免疫性葡萄膜炎、科干综合征、格雷夫斯眼病、中间葡萄膜炎、木质性结膜炎、角膜侵蚀性溃疡、视神经脊髓炎、视性眼阵挛肌阵挛综合征、视神经炎、巩膜炎、苏萨克氏综合征、交感性眼炎、托洛萨-亨特综合征、自身免疫性内耳病(AIED)、梅尼埃病、疾病、伴有多血管炎的嗜酸性肉芽肿病(EGPA)、巨细胞性动脉炎、肉芽肿病合并多血管炎(GPA)、IgA血管炎(IgAV)、川崎病、白细胞破裂性血管炎、狼疮血管炎、类风湿血管炎、显微性下多血管炎(MPA)、多发性结节性动脉炎(PAN)、风湿性多肌痛、荨麻疹脉管炎、血管炎和原发性免疫缺陷。
在一些实施方式中，所述治疗剂是用于治疗或预防感染或传染性疾病的试剂。在一个实施方式中，所述治疗剂是用于治疗或预防细菌感染或与之有关的疾病或病症的试剂。所述细菌可以来自以下门中的任一种：酸杆菌门(Acidobacteria)、放线菌门(Actinobacteria)、产水菌门(Aquificae)、拟杆菌门(Bacteroidetes)、嗜热丝菌门(Caldiserica)、衣原体门(Chlamydiae)、绿菌门(Chlorobi)、绿弯菌门(Chloroflexi)、产金菌门(Chrysiogenetes)、蓝藻门(Cyanobacteria)、脱铁杆菌门(Deferribacteres)、异常球菌-栖热菌门(Deinococcus-Thermus)、网团菌门(Dictyoglomi)、迷踪菌门(Elusimicrobia)、纤维杆菌门(Fibrobacteres)、厚壁菌门(Firmicutes)、梭杆菌门(Fusobacteria)、芽单胞菌门(Gemmatimonadetes)、黏胶球形菌门(Lentisphaerae)、硝化螺旋菌门(Nitrospira)、浮霉菌门(Planctomycetes)、变形菌门(Proteobacteria)、螺旋体门(Spirochaetes)、互养菌门(Synergistetes)、无壁菌门(Tenericutes)、热脱硫杆菌门(Thermodesulfobacteria)、热袍菌门(Thermotogae)和疣微菌门(Verrucomicrobia)。
所述细菌可以是革兰氏阳性细菌或者革兰氏阴性细菌。所述细菌可以是好氧细菌或者厌氧细菌。所述细菌可以是自养细菌或者异养细菌。所述细菌可以是嗜温菌、嗜中性菌、嗜极菌、嗜酸菌、嗜碱菌、嗜热菌、嗜冷菌、嗜盐菌或嗜高渗菌。
所述细菌可以是炭疽杆菌、抗生素抗性细菌、造成疾病的细菌、食物中毒细菌、感染性菌、沙门氏菌(Salmonella bacterium)、葡萄球菌属(Staphylococcus)细菌、链球菌(Streptococcus)细菌或者破伤风细菌。所述细菌可以是分枝杆菌属(mycobacteria)、破伤风梭菌(Clostridium tetani)、鼠疫耶尔森氏菌(Yersinia pestis)、炭疽芽孢杆菌(Bacillus anthracis)、甲氧西林抗性金黄色葡萄球菌(methicillin-resistantStaphylococcus aureus，MRSA)或者艰难梭菌(Clostridium difficile)。
在一个实施方式中，所述治疗剂是用于治疗或预防病毒感染，或者与之有关的疾病或病症的试剂。在一些实施方式中，所述病毒来自以下科中的一种：腺病毒科(Adenoviridae)、沙粒病毒科(Arenaviridae)、布尼亚病毒科(Bunyaviridae)、杯状病毒科(Caliciviridae)、冠状病毒科(Coronaviridae，包括SARS和SARS-CoV-2)、丝状病毒科(Filoviridae)、肝病毒科(Hepadnaviridae)、疹病毒科(Herpesviridae)、正粘病毒科(Orthomyxoviridae)、乳多空病毒科(Papovaviridae)、副粘病毒科(Paramyxoviridae)、细小病毒科(Parvoviridae)、小核粮核酸病毒(Picornaviridae)、痘病毒科(poxviridae)、呼肠孤病毒科(Reoviridae)、反转录病毒科(Retroviridae)、弹状病毒科(Rhabdoviridae)或者披衣病毒科(Togaviridae)。所述病毒抗原可以来自人类免疫缺陷性病毒(HIV)、基孔肯亚病毒(CHIKV)、登革热病毒、乳头状瘤病毒，例如，人乳头状瘤病毒(HPV)、脊髓灰质炎病毒、肝炎病毒，例如，甲型肝炎病毒(HAV)、乙型肝炎病毒(HBV)、丙型肝炎病毒(HCV)、丁型肝炎病毒(HDV)和戊型肝炎病毒(HEV)、天花病毒(重型天花和轻型天花)、牛痘病毒、流感病毒、鼻病毒、马脑炎病毒、风疹病毒、黄热病毒、诺沃克病毒、甲型肝炎病毒、人T细胞白血病病毒(HTLV-I)、毛细胞白血病病毒(HTLV-II)、加利福尼亚脑炎病毒、Hanta病毒(出血热)、狂犬病病毒、埃博拉热病毒、马伯格氏病毒、麻疹病毒、腮腺炎病毒、呼吸道合胞病毒(RSV)、单纯性疱疹1(口腔疱疹)、单纯性疱疹2(生殖器疱疹)、带状疱疹(水痘-带状疱疹，也叫做水痘)、巨细胞病毒(CMV)，例如，人CMV、埃-巴二氏病毒(EBV)、黄病毒、口蹄疫病毒、拉沙病毒、沙粒病毒或者造成癌症的病毒。
在一个实施方式中，所述治疗剂是用于治疗或预防寄生虫感染，或者与之有关的疾病或病症的试剂。在一些实施方式中，所述寄生虫是原生动物、蠕虫或外寄生虫。所述蠕虫(即，蠕虫)可以是扁虫(例如，蛭和绦虫)、棘头虫或蛔虫(例如，蛲虫)。所述外寄生虫可以是虱、蚤、蜱和螨。
所述寄生虫可以是导致以下疾病中任一种的任何寄生虫：棘阿米巴角膜炎、阿米巴病、蛔虫病、巴贝虫病、小袋虫病、浣熊蛔虫病、恰加斯式病、华支睾吸虫病、锥蝇属病、隐孢子虫病、裂头绦虫病、麦地那龙线虫病、包虫病、象皮病、蛲虫病、片吸虫病、姜片虫病、丝虫病、贾第鞭毛虫病、颚口线虫病、膜壳绦虫病、等孢子球虫病、片山热、利什曼病、莱姆病、疟疾、后殖吸虫病、蝇蛆病、盘尾丝虫病、虱病、疥疮、血吸虫病、昏睡病、粪类圆线虫病、绦虫病、弓蛔虫病、弓形体病、旋毛虫病和鞭虫病。
所述寄生虫可以是棘阿米巴(Acanthamoeba)、异尖线虫(Anisakis)、人蛔虫(Ascaris lumbricoides)、马蝇(Botfly)、结肠小袋虫(Balantidium coli)、臭虫(Bedbug)、多节绦虫(Cestoda)(绦虫(tapeworm))、恙螨(Chiggers)、嗜人锥蝇(Cochliomyia hominivorax)、痢疾内变形虫(Entamoeba histolytica)、肝片吸虫(Fasciola hepatica)、肠兰伯式鞭毛虫(Giardia lamblia)、钩虫(Hookworm)、利什曼虫属(Leishmania)、鼻腔舌形虫(Linguatula serrata)、肝吸虫(Liver fluke)、罗阿丝虫(Loaloa)、并殖吸虫-肺吸虫(Paragonimus-lung fluke)、蛲虫(Pinworm)、恶性疟原虫(Plasmodium falciparum)、血吸虫(Schistosoma)、粪类圆线虫(Strongyloidesstercoralis)、螨(Mite)、绦虫(Tapeworm)、刚地弓形虫(Toxoplasma gondii)、锥虫属(Trypanosoma)、鞭虫(Whipworm)或者班氏丝虫(Wuchereria bancrofti)。
在一个实施方式中，所述治疗剂是用于治疗或预防真菌感染，或者与之有关的疾病或病症的试剂。在一些实施方式中，所述真菌是曲霉属(Aspergillus)的种、皮炎芽生菌(Blastomyces dermatitidis)、假丝酵母(例如，白假丝酵母(Candida albicans))、球孢子菌属(Coccidioides)、新型隐球酵母(Cryptococcus neoformans)、格特隐球菌(Cryptococcus gattii)、皮癣霉菌(dermatophyte)、镰刀菌属(Fusarium)的种、荚膜组织胞浆菌(Histoplasma capsulatum)、毛霉亚门(Mucoromycotina)、耶氏肺孢子菌(Pneumocystis jirovecii)、申克孢子丝菌(Sporothrix schenckii)、凸脐蠕孢属(Exserohilum)或者芽枝霉(Cladosporium)
通过非限制性实例，在一个实施方式中，本发明提供了CD4+ T细胞-靶向的递送载体，其包含或包封了核苷修饰的1086C Env mRNA，其编码进化枝C传输/首建人类免疫缺陷性病毒(HIV)-1包膜(Env)1086C，用于治疗或预防HIV感染或与之有关的疾病或病症。
当通过本发明公开，包括本文详述的方法所提供的，本领域技术人员将理解本发明不局限于已建立的疾病或病症的治疗。具体地，所述疾病或病症不需要已表现出损害受试者的程度；实际上不需要在施用治疗之前在受试者中检测所述疾病或病症。也就是说，不必在本发明可以提供益处之前发生明显的疾病或病症的病征或症状。因此，本发明包括用于预防疾病或病症的方法，其中如先前在本文其它处所讨论的，可以在疾病或病症发病之前向受试者施用组合物，借此预防疾病或病症。
当通过本文中的公开内容所提供时，本领域技术人员将理解疾病或病症的预防涵盖了作为对疾病或病症的发生或发展的预防措施向受试者施用组合物。如在本文其它处更全面地讨论的，调节基因或基因产物的水平或活性的方法涵盖了广泛的技术，其不仅用于调节多肽基因产物的水平和活性，而且还用于调节核酸的表达，包括转录、翻译或两者。
本发明涵盖了递送载体的递送，所述递送载体包含缀合至靶向结构域的至少一种试剂。为了实践本发明所述的方法；本领域技术人员将理解基于本文所提供的发明公开，如何配制和向受试者施用适合的组合物。本发明不局限于任何具体的施用方法或治疗方案。
本领域技术人员将理解可以单独或以任意组合施用本发明所述的组合物。此外，可以在时间意义上单独或以任意组合施用本发明所述的组合物，其中它们可以同时，或者在彼此之前和/或之后施用。本领域的技术人员将理解基于本文所提供的发明公开，本发明所述的组合物可以用于预防或治疗疾病或病症，并且可以单独或与另一种组合物以任意组合使用所述组合物以实现治疗结果。在多个实施方式中，本文所述的本发明的任何组合物可以单独或者和与疾病或病症有关的其它分子的其它调节剂组合施用。
本发明所述的组合物(例如，递送载体)向人患者的施用可以通过任何途径，包括但不限于静脉内、节点内、皮内、透皮、皮下、肌内、吸入(例如，经由气溶胶)、口腔(例如，舌下)、局部(即皮肤和粘膜表面两者，包括气道表面)、鞘内、关节内、胸膜内、脑内、动脉内、腹膜内、口服、淋巴管内、鼻内、直肠或阴道施用、通过局部导管输注或通过直接病灶内注射。在一个实施方式中，通过限定时间内(例如，0.5至2小时)所提供的静脉内推注或静脉内输注来施用本发明所述的组合物(例如，递送载体)。可以通过蠕动方式或以储罐形式递送本发明所述的组合物，尽管如本领域熟知的，任何给定情况下最适合的途径将取决于如下因素：受试者的物种、年龄、性别和整体状况、要治疗的病况的性质和严重程度和/或要施用的特定组合物的性质(即剂量、制剂)。在具体的实施方式中，施用途径经由一段时间内的弹丸或连续输注，每周一次或两次。在其它具体的实施方式中，施用途径通过在一个或多个位点(例如，大腿、腰、臀、手臂)所提供的皮下注射，任选地每周一次或两次。在一个实施方式中，通过门诊施用本发明所述的组合物和/或方法。
在一个实施方式中，本发明包括方法，所述方法包括施用本文所述的组合物的组合。在某些实施方式中，所述方法具有累加效果，其中施用组合物的组合的整体效果与施用每种单独的抑制剂的效果之和近似相等。在其它实施方式中，所述方法具有协同效果，其中施用组合物的组合的整体效果大于施用每种单独的组合物的效果之和。
所述方法包括以任何适合的比例施用组合物的组合。例如，在一个实施方式中，所述方法包括以1:1的比例施用两个单独的组合物。然而，所述方法不局限于任何特定比例。而是，涵盖了证明有效的任何比例。
药物组合物
可以通过任何药学领域中已知的或此后发展的方法制备本文所述的药物组合物的制剂。一般地，这些制备方法包括使活性成分与载体或一种或多种其它辅助成分结合的步骤，然后，如有必要或者如果希望，将所述产物成形或包装成所期望的单剂量或多剂量单元。
尽管对本文所提供的药物组合物的描述主要涉及适合于向人伦理学施用的药物组合物，但是技术人员将理解这些组合物通常适合于向各种各样的动物施用。对适合于向人施用的药物组合物进行改变以使所述组合物适合于向多种动物施用是很好理解的，并且常规兽医药理学家可以仅通过常规实验(即使有的话)来设计和实施这些改变。考虑了施用本发明所述的药物组合物的受试者，其包括但不限于人及其它灵长类、哺乳动物，包括商业上相关的哺乳动物，如非人灵长类、牛、猪、马、绵羊、猫和狗。
可以以适合于眼、口服、直肠、阴道、肠胃外、局部、肺部、鼻内、口腔、静脉内、脑室内、皮内、肌内或者另一种施用途径的制剂制备、包装或出售在本发明所述的方法中有用的药物组合物。其它所考虑的制剂包括投射纳米颗粒(projected nanoparticle)、脂质体制剂、包含活性成分的重新包封的红细胞和基于免疫原性的制剂。
可以作为整体，作为单一单位剂量或者作为多个单一单位剂量制备、包装或出售本发明的药物组合物。如本文所使用的，“单位剂量”是包含预定量的活性成分的药物组合物的单个的量。所述活性成分的量通常等于将向受试者施用的活性成分的剂量或者其剂量的便捷的部分(convenient fraction)，例如其剂量的一半或三分之一。
在本发明的药物组合物中，所述活性成分、所述药物可用的载体和任何其它成分的相对量将基于所治疗的受试者的身份、体型和状况并且还基于施用所述组合物的途径而改变。举例来说，所述组合物可以包括0.1％至100％(w/w)的活性成分。
除所述活性成分之外，本发明的药物组合物还可以包括一种或多种其它药物活性剂。
可以使用常规技术制备本发明的药物组合物的控释或缓释制剂。
如本文所使用的，药物组合物的“肠胃外施用”包括任何施用途径，其特征在于物理打破受试者组织并通过所述组织中的破口施用所述药物组合物。因此，肠胃外施用包括但不限于通过组合物的注射，通过手术切口的组合物应用，通过穿透组织的非手术伤口的组合物应用等的药物组合物的施用。具体地，考虑了肠胃外施用，其包括但不限于眼内、玻璃体内、皮下、腹膜内、肌内、皮内、胸骨内注射、肿瘤内、静脉内、脑室内和肾透析输注技术。
适合于肠胃外施用的药物组合物制剂包括与药物可用的载体，如无菌水或无菌等渗盐水组合的活性成分。可以以适合于丸剂施用或者适合于连续施用的形式制备、包装或出售这些制剂。可以以单位剂量形式，如在安瓿瓶中或在含有防腐剂的多剂量容器中制备、包装或出售注射制剂。用于肠胃外施用的制剂包括但不限于处于油性或水性载体中的混悬液、溶液、乳液、糊剂和可植入缓释或生物可降解制剂。这些制剂还可以包括一种或多种其它成分，其包括但不限于混悬剂、稳定剂或分散剂。在用于肠胃外施用的制剂的一个实施方式中，以在肠胃外施用所复原的组合物之前，用适合的载体(例如，无菌无热原的水)复原的干燥(即，粉末或颗粒)形式提供所述活性成分。
以无菌可注射的水性或油性混悬液或溶液的形式制备、包装或出售所述药物组合物。可以根据已知技术配制这种混悬液或溶液，并且除所述活性成分之外，其可以包括本文所描述的其它成分，如分散剂、润湿剂或助悬剂。可以使用无毒的肠胃外可用的稀释剂或溶剂，例如水或1,3-丁二醇制备这些无菌注射制剂。其它可用的稀释剂和溶剂包括但不限于林格氏溶液、等渗氯化钠溶液和固定油剂，如合成的单甘油酯或二甘油酯。其它有用的可胃肠外施用的制剂包括包含处于微晶形式，处于脂质体制剂中或者作为可生物降解的聚合物系统的组分的活性成分的那些。用于缓释或植入的组合物可以包括药物可用的聚合物或疏水性材料，如乳液、离子交换树脂、微溶性聚合物或微溶性盐。
可以以适合于通过颊间隙肺部施用的制剂制备、包装或出售本发明的药物组合物。这种制剂可以包括干燥的颗粒，所述颗粒包括活性成分并且具有约0.5至约7纳米，并且优选地约1至约6纳米的范围内的直径。这些组合物方便地处于用于使用装置或者使用自抛射溶剂/粉末分配容器施用的干粉形式，所述装置包括干粉储罐，可以将抛射剂流引导至所述干粉储罐以分散所述粉末，并且所述自抛射溶剂/粉末分配容器如包括溶解或混悬在密封容器中的低沸点抛射剂中的活性成分的装置。优选地，这些粉末包括颗粒，其中按重量计至少98％的所述颗粒的直径大于0.5纳米并且按数量计至少95％的所述颗粒的直径小于7纳米。更优选地，按重量计至少95％的所述颗粒的直径大于1纳米并且按数量计至少90％的所述颗粒的直径小于6纳米。干粉组合物优选地包括固体细粉稀释剂，如糖，并且所述干粉组合物方便地以单位剂量形式提供。
低沸点抛射剂通常包括在大气压力下具有小于65°F的沸点的液体抛射剂。通常，所述抛射剂可以占所述组合物的50至99.9％(w/w)，并且所述活性成分可以占所述组合物的0.1至20％(w/w)。所述抛射剂还可以包括其它成分，如液体非离子或固体阴离子表面活性剂或者固体稀释剂(优选地，具有与包含所述活性成分的颗粒同数量级的颗粒尺寸)。
适合于肠胃外施用的药物组合物制剂包括与药物可用的载体，如无菌水或无菌等渗盐水组合的活性成分。可以以适合于丸剂施用或者适合于连续施用的形式制备、包装或出售这些制剂。可以以单位剂量形式，如在安瓿瓶中或在含有防腐剂的多剂量容器中制备、包装或出售注射制剂。用于肠胃外施用的制剂包括但不限于处于油性或水性载体中的混悬液、溶液、乳液、糊剂和可植入缓释或生物可降解制剂。这些制剂还可以包括一种或多种其它成分，其包括但不限于混悬剂、稳定剂或分散剂。在用于肠胃外施用的制剂的一个实施方式中，以在肠胃外施用所复原的组合物之前，用适合的载体(例如，无菌无热原的水)复原的干燥(即，粉末或颗粒)形式提供所述活性成分。
以无菌可注射的水性或油性混悬液或溶液的形式制备、包装或出售所述药物组合物。可以根据已知技术配制这种混悬液或溶液，并且除所述活性成分之外，其可以包括本文所描述的其它成分，如分散剂、润湿剂或助悬剂。可以使用无毒的肠胃外可用的稀释剂或溶剂，例如水或1,3-丁二醇制备这些无菌注射制剂。其它可用的稀释剂和溶剂包括但不限于林格氏溶液、等渗氯化钠溶液和固定油剂，如合成的单甘油酯或二甘油酯。其它有用的可胃肠外施用的制剂包括包含处于微晶形式，处于脂质体制剂中或者作为可生物降解的聚合物系统的组分的活性成分的那些。用于缓释或植入的组合物可以包括药物可用的聚合物或疏水性材料，如乳液、离子交换树脂、微溶性聚合物或微溶性盐。
如本文所使用的，“其它成分”包括但不限于以下中的一种或多种：赋形剂；表面活性剂；分散剂；惰性稀释剂；造粒剂和崩解剂；粘结剂；润滑剂；甜味剂；调味剂；着色剂；防腐剂；生理学可降解的组成，如明胶；水性载体和溶剂；油性载体和溶剂；助悬剂；分散剂或润湿剂；乳化剂，镇痛剂；缓冲剂；盐；增稠剂；填料；乳化剂；抗氧化剂；抗生素；抗真菌剂；稳定剂；和药物可用的聚合物或疏水性材料。可以包括在本发明的药物组合物中的其它“另外的成分”在本领域中是已知的并且例如描述于Remington's Pharmaceutical Sciences(1985,Genaro主编,Mack Publishing Co.,Easton,PA)，该文献作为参考并入本文。
实验实施例
通过参考以下实验实施例进一步详细描述了本发明。除非另作说明，否则仅出于说明的目的提供了这些实施例，并且它们不意欲限制。因此，本发明决不应视为受限于以下实施例，而是应视为涵盖由于本文所提供的教导内容而变得显而易见的任何和所有改变。
在不进行进一步描述的情况下，据信本领域的技术人员可以使用以上描述和以下说明性实施例制备和使用本发明和实践所主张的方法。因此，不应以任何方式将以下工作实施例视为对本发明公开的其余部分的限制。
实施例1：使用工程化CD4+ T细胞-归巢mRNA-LNP的高效CD4+ T细胞靶向和基因重 组
mRNA基治疗剂提供了解决当前蛋白基或病毒基免疫疗法的困难的多种优势，所述困难如生产困难、不稳定性、缺少对表达量和持续时间的控制、高毒性和在一些情况下，基因组整合或脱靶效应(off-site effects)(Goswami等人,2019,Front.Oncol,9:297；Das等人,2015,J.Cell.Physiol,230:259–271；Chames等人,2009,Br.J.Pharmacol,157:220–233)。有效的体内递送已成为开发mRNA基免疫治疗的关键障碍。到目前为止，用于临床应用的T细胞修饰需要提取自体同源T细胞、扩增和离体基因组编辑，这是昂贵且耗时的，并且使其无法广泛用于更常见的疾病，如HIV或镰刀形红细胞贫血症。已知T细胞是难以转染的(hard-to-transfect)细胞(Peer等人,2010,Journal of Controlled Release,148:63-68；Gust等人,2008,Cell Commun Signal,6:3；Goffinet等人,2006,The FASEB Journal,20:500-502)。在本文中，据证实用含有抗-CD4抗体缀合的Luc mRNA的LNP，但不用对照IgG缀合的LNP靶向人T细胞在人CD4+ T细胞中以剂量依赖性方式导致了强结合和荧光素酶表达(图1A至图1C)。类似地，当全身注射至C57BL/6小鼠时，抗小鼠CD4/mRNA-LNP特异性积累并且在T细胞富集组织，如脾脏和淋巴结中翻译mRNA(图3和图4A至图4C)。此外，在功能上评价了使用Cre/loxP报告分子系统，靶向T细胞的mRNA-LNP系统介导基因组编辑的潜力。在CD4+ T细胞中体内诱导了Cre介导的基因重组。有趣地，在高剂量(30μg/小鼠)下，在脾脏和淋巴组织两者中来自非靶向mRNA-LNP的信号不为零，如在未处理的小鼠中所观察到的(在CD3+CD8-细胞中，28％ ZsGreen1+细胞)。这种观察可能是由于一些T细胞对ApoE受体的表达(Sundqvist,2018,Front.Immunol,9:974；Panezai等人,2017,Immunology 152:308-327)，因为LNP结合ApoE并且通常靶向肝脏31。通过多次注射抗-CD4/mRNA-LNP进一步提高了基因编辑的细胞的百分比。其它处尚未报道这种高水平的体内靶向T细胞的基因重组。对于潜在基因编辑疗法的重要发现是在静息和激活的CD4+ T细胞中观察到了类似水平的基因重组。成功靶向的T细胞的存在随时间的评价显示在用抗-CD4/mRNA-LNP处理后1周期间，ZsGreen1信号在脾脏中的逐渐降低。考虑循环T细胞(它们是脾脏中T细胞的主要群)的寿命，预期了这种趋势(Langeveld等人,2006,Journal of Clinical Investigation,36:250-256；Bronte等人,2013,Immunity,39:806-818)。然而，淋巴结中ZsGreen1的表达在用抗-CD4/mRNA-LNP处理后的7天实验时间内保持最低限度改变。分析大鼠主要淋巴和非淋巴组织中51Cr-标记的胸导管淋巴细胞(TDL)的迁移的报告显示淋巴细胞在淋巴结中的停留时间比脾脏24中更长。同样，对小鼠报道了相当的停留时间(Mandl等人,2012,Proc NatlAcad Sci U S A,109:18036-18041)。最终，评价了多种T细胞亚型是否在被靶向方面不同。当用抗-CD4/Cre mRNA-LNP处理时，在原初、记忆和效应记忆亚型中，吸收和重组没有显著性差异。抗-CD4 mRNA-LNP系统允许在组织，如脾脏和淋巴结中的CD4+ T细胞靶向，这对于T细胞疗法是至关重要的。通过使靶向T细胞的治疗mRNA递送成为可能，当前的T细胞靶向平台对于多种体内T细胞操作基应用具有巨大潜力。体内递送至特定细胞类型(例如，T淋巴细胞等)是集中发展的领域，如多项近期研究所证实的(Veiga等人,2020,Adv Drug DelivRev,159:364–376；Mizrahy等人,2017,Mol Ther,25:1491-1500；Fenton等人,2017,AdvMater,29；Ramishetti等人,2016,J Drug Target,24:780-786；Veiga等人,2018,NatCommun,9:4493)。出于基因沉默的目的，已将用抗体修饰的LNP用于将siRNA递送至淋巴细胞(Ramishetti等人,2015,ACS Nano,9:6706-6716)。Ramishetti等人用抗-CD4单克隆抗体表面修饰了加载了siRNA的LNP以用于靶向CD4+ T淋巴细胞。它们在约30％分离自脾脏的CD4+ T细胞中观察到基因沉默，这仅是用CD4-靶向的Cre mRNA-LNP所观察到的靶向功能活性的一半(脾脏中CD4+ T细胞的约60％)。值得注意地，由于他们使用siRNA-LNP以及对他们实验的非二元读数，因此不能直接比较两种平台的靶向效率。已进行了用其它脂质基和聚合物基载体靶向淋巴细胞的其它尝试。McKinlay等人(McKinlay等人,2018,Proceedingsof the National Academy of Sciences 115,E5859-E5866)报道了使用混合的脂质基两亲性电荷改变可释放转运蛋白(CART)的mRNA递送的组合化学方法，其在小鼠中实现了约1.5％的T淋巴细胞转染效率。类似地，Fenton等人(Fenton等人,2017,AdvancedMaterials,29:1606944)描述了不使用活性靶向配体，设计将mRNA递送至B淋巴细胞的特异性LNP。他们显示与他们的LNP制剂文库的其它非选择性制剂相比，来自脾脏中靶向B细胞的Luc mRNA-LNP制剂的增强的发光信号。Veiga等人(Veiga等人,2018,Naturecommunications,9:4493-4493)使用他们的ASSET平台(该平台也使用单克隆抗体靶向)，将表面修饰的LNP中的mRNA递送至炎性Ly6C+白细胞。编码IL-10的mRNA的递送和表达在结肠炎模型中显示出显著的治疗效果。尽管一些T细胞也表达Ly6c，如单核细胞、巨噬细胞和嗜中性白细胞，但是不确定哪些白细胞群吸收和表达靶向Ly6c的LNP并达到什么程度。靶向mRNA-LNP平台是关于用于选择性和功能性CD4+靶向的LNP基mRNA递送系统的首个报道。整体上，本文所提供的靶向T细胞的mRNA-LNP平台为广泛的体内T细胞操作提供了巨大机会。该系统在难以接近的组织，如淋巴结中达到所有T细胞亚型的巨大潜力将使该靶向平台对于多种类型的T细胞体内操纵可用。应用潜力包括将mRNA治疗剂递送至T细胞以用于潜在HIV治愈。具体地，通过从感染细胞基因组切下HIV整合的原病毒，工程化基因组编辑酶的靶向递送具有治愈HIV的潜力(Karpinski等人,2016,Nat Biotechnol,34:401-409)。另外，淋巴细胞的靶向修饰对于开发用于广泛的癌症、传染性疾病和免疫学病症的快速作用和成本有效的免疫治疗具有多种应用。
现将描述用于实验的材料和方法。
小鼠
C57BL/6J小鼠。相等数目的雄性和雌性C57BL/6J小鼠购自Jacksonlaboratories。Ai6(RCL-ZsGreen)小鼠。C57BL/6J背景的Ai6(RCL-ZsGreen)小鼠购自Jackson Laboratory(库存编号：007906)并且内部纯合繁殖。Ai6是具有防止CAG启动子驱动的增强型绿色荧光蛋白变体(ZsGreen1)的转录的loxP-侧接STOP盒(终止盒)的Cre报告分子等位基因—全部插入Gt(ROSA)26Sor基因座。通过Cre介导的重组，Ai6小鼠表达稳健的ZsGreen1荧光。
mRNA产生和LNP制备
对Cre重组酶或荧火虫荧光素酶的编码序列密码子优化、合成并克隆至mRNA产生质粒(分别为pUC-ccTEV-Cre-A101和pUC-ccTEV-Luc2-A101)。使用T7 RNA聚合酶(Megascript,Ambion)在线性化质粒上产生mRNA。转录mRNA以包含101个核苷酸长的多聚(A)尾。使用m1ψ-5'-三磷酸酯(TriLink)而不是UTP产生含有修饰的核苷的mRNA。使用三核苷酸端帽1类似物，CleanCap(TriLink)通过共转录进行体外转录的mRNA的封端。如所述的，通过纤维素纯化来纯化mRNA(Baiersdorfer等人,2019,Mol Ther Nucleic Acids,15:26-35)。通过天然琼脂糖凝胶电泳分析所有mRNA并在-20℃冷冻储存。
使用自组装方法，将含有m1ψ的mRNA包封在LNP中，其中将mRNA水溶液在pH＝4.0与溶于乙醇的脂质溶液快速混合(Maier等人,2013,Mol Ther,21:1570-1578)。在本研究中使用的LNP与先前所述那些的组成类似(Maier等人,2013,Mol Ther,21:1570-1578；Jayaraman等人,2012,Angew Chem Int Ed Engl,51:8529-8533)，其含有可电离阳离子脂质(Acuitas)/磷脂酰胆碱/胆固醇/PEG-脂质(50:10:38.5:1.5，mol/mol)并以RNA比总脂质比约0.04(wt/wt)包封。如使用Zetasizer Nano ZS(Malvern Instruments Ltd.,Malvern,UK)仪，通过动态光散射所测量的，所述纳米颗粒的直径为约80nm。将mRNA-LNP制剂在-80℃，以约1μg/μL的mRNA浓度储存。
单克隆抗体缀合的脂质纳米颗粒
用对CD4特异的mAb缀合LNP。如前所述18，经由SATA-马来酰亚胺缀合化学，将纯化的NA/LE大鼠抗小鼠CD4(BD PharmingenTM)、纯化的大鼠抗人CD4抗体，克隆A161A1(BioLegend)和对照同种型-匹配的IgG偶联至LNP。简要地，通过插入后技术，用DSPE-PEG-马来酰亚胺修饰LNP。用SATA(N-琥珀酰亚胺基S-乙酰基硫乙酸酯)(Sigma-Aldrich)修饰抗体以引入巯基，从而允许缀合至马来酰亚胺。使用0.5M羟胺对SATA脱保护，随后通过G-25Sephadex Quick旋转蛋白柱(Roche Applied Science,Indianapolis,IN)除去未反应的组分。然后，使用硫醚缀合化学，将抗体上的反应性巯基缀合至马来酰亚胺部分。使用Sepharose CL-4B凝胶过滤柱(Sigma-Aldrich)进行纯化。通过实施改良的Quant-iTRiboGreen RNA测定(Invitrogen)计算mRNA含量。分别使用动态光散射(DLS)和多普勒激光测速(LDV)，在Malvern Zetasizer Nano ZS(Malvern Instruments,Worcestershire UK)上确定靶向的脂质纳米颗粒的尺寸和表面电荷。在PBS pH 7.4中，在25℃，在相关一次性毛细管池(capillary cells)中进行尺寸和ζ电位测量两者。以173°的散射角，将非侵入反向散射系统(NIBS)用于尺寸测量。将非缀合的和抗体修饰的mRNA-LNP的直径理解为颗粒制剂的归一化强度粒径分布以及Z均值。
体外细胞结合研究
如前所述，对于使用放射性测量的细胞结合研究，首先使用碘化珠(Pierce)用Na125I放射性标记LNP(Khoshnejad等人,2016,Bioconjug Chem,27:628-637)。然后，将人CD4+ T细胞与不断增加的量的抗-CD4/或对照IgG/mRNA-LNP在室温下培育1小时。然后，除去培养基并用PBS缓冲液清洗细胞三次以从细胞表面除去未结合的纳米颗粒。用1％Triton X100在1N NaOH中的溶液裂解细胞，并通过Wallac 1470Wizardγ计数器(Gaithersburg,MD)测量细胞相关放射性，并与总添加活性相比。
对于使用流式细胞术的细胞结合研究，将人CD4+ T细胞以150,000个细胞每孔在24孔板中接种。将携带多聚(C)RNA的LNP以不断增加的mRNA的量/孔加入至培养基，并将细胞在室温下培育1小时。然后，除去培养基并用PBS缓冲液清洗细胞三次以从细胞表面除去未结合的纳米颗粒。将加FITC标签的抗大鼠IgG(Abcam,Cambridge,UK)在BD LSR II流式细胞仪上用于监测抗体缀合的LNP的结合。
体外细胞转染研究
对于使用荧火虫荧光素酶mRNA的细胞转染研究，将人CD4+ T细胞在48孔板中铺板。18小时后，将携带报告分子荧光素酶mRNA的LNP以不断增加的浓度添加至细胞，并培育1.5小时。然后，用PBS清洗板三次并将完全培养基加入至细胞。在完全培养基中培养24小时后，用PBS清洗细胞，在荧光素酶细胞培养裂解剂(Promega,Madison,WI)中裂解并作为发光测量荧光素酶酶活力(荧光素酶测定系统，Promega)18。转染重复三次。对于使用Cre重组酶mRNA的细胞转染研究，从两只Ai6小鼠收获脾脏并产生混合的单细胞混悬液。然后，将200万个脾细胞在6孔板的每个孔中铺板。将细胞与1、3、6或9μg CD4-靶向的或非靶向的(非缀合的或对照IgG缀合的)Cre mRNA-LNP培育过夜。然后，收集细胞并用Live/Dead Aqua(ThermoFisher Sci,L34966)和抗CD3和CD8(和CD4，其在后续实验中省略)抗体染色，并使用流式细胞术确定表达ZsGreen1的CD3+CD8-细胞的百分比。
抗-CD4/mRNA-LNP在C57BL/6J小鼠中的生物分布；组织吸收
通过IV(眶后)注射至C57BL/6小鼠(The Jackson Laboratory,Bar Harbor,ME)施用125I-放射性标记的mRNA-LNP。在注射后0.5、1和24小时从下腔静脉收集血液。还在相同时间点收获特定器官(肝、脾、肺、肾和心脏)，用盐水漂洗，吸干并称重。在γ计数器(Wallac1470Wizardγ计数器，Gaithersburg,MD)中测量每个器官中以及100μL血液样品中的放射性的量。使用放射性值和样品重量计算作为每克组织注射剂量的百分比的组织吸收(％ID/g)和作为器官比血液之比的定位比(LR)。还将免疫特异性指数(ISI)计算为CD4-靶向的mRNA-LNP的LR与对照IgG-修饰的那些的LR之比。
C57BL/6J小鼠中抗-CD4/mRNA-LNP的生物分布；在组织和细胞水平的荧光素酶 mRNA翻译
对C57BL/6J小鼠IV(眶后)注射抗-CD4/mRNA-LNP或对照IgG/mRNA-LNP制剂。注射后5小时，将动物安乐死并收获所选器官(肝、脾、肺、肾和心脏)，用PBS漂洗并在-80℃储存直至分析。当融化时，将组织样品在适当体积的含有蛋白酶抑制剂混合物(1X)的细胞裂解缓冲液(1X)(Promega Corp,Madison,WI)中匀浆并在4℃轻轻混合1小时。然后，在干冰/37℃对匀浆进行冻融循环，并在4℃以16,000g离心10分钟。然后，使用Victor 31420Multilabel板计数器(Perkin Elmer,Wellesley,MA)，测量上清液中的荧光素酶活性。此外，评价CD3+细胞群中的mRNA表达。基于生产商的说明，使用MagniSortTM小鼠CD3+选择试剂盒(ThermoFisher Scientific,Waltham,MA)从注射小鼠的脾脏或淋巴结分离CD3+细胞。简要地，将生物素化的抗小鼠CD3抗体和抗生蛋白链菌素涂覆的磁珠用于CD3+细胞分离。将CD3+细胞结合至抗体，并然后结合至磁珠。当置于磁场时，通过倾析从CD3+细胞分离不希望的细胞。对富含CD3+的细胞群的细胞裂解液进行荧光素酶活性测量。
生物发光成像
对C57BL/6J小鼠IV(眶后)注射抗-CD4/mRNA-LNP或对照IgG/mRNA-LNP制剂。在注射后5小时，如上所述18，使用IVIS光谱成像系统(Caliper Life Sciences,Waltham,MA)进行生物发光成像。将D-萤光素以150mg/kg的剂量腹膜内施用于小鼠。5分钟后，将小鼠安乐死；收获所期望的组织，并立即置于成像平台。使用5秒或更长的暴露时间，在IVIS成像系统上测量组织发光以确保所得信号在手术检测范围内。还使用通过Caliper所提供的LivingImage软件，通过测量所关心的区域中的光子通量(光子/秒)定量生物发光值。
使用Cre/loxP报告分子系统的抗-CD4/mRNA-LNP的靶向效率的确定
为了分析向脾脏和淋巴结内的靶向细胞群的递送效率，以单细胞分辨率追踪mRNA翻译。将含有Cre重组酶mRNA的靶向和非靶向LNP IV(眶后)注射至具有防止绿色荧光蛋白变体(ZsGreen1)的转录的loxP-侧接STOP盒(终止盒)的Cre报告分子等位基因的Ai6小鼠。Cre重组酶切下loxP-侧接STOP盒，因此允许ZsGreen1转录。在注射后所期望的时间点，将动物安乐死并收获脾脏和淋巴结。使用流式细胞术评价器官单细胞混悬液中发出绿色荧光信号的CD3+CD8-细胞的数目。
单细胞混悬液制备和流式细胞术
从脾脏和淋巴结制备单细胞混悬液。简要地，使用玻璃显微镜用载玻片的磨砂端挤压组织，然后通过70-μm过滤器。在离心并除去上清液后，将细胞在RPMI+10％ FBS培养基中再混悬，并首先用Live/Dead Aqua细胞染色剂(Thermo Fisher Sci.,Cat#L34957)染色，然后用抗-小鼠抗体的混合物染色(图11)。在BD LSR II流式细胞仪(BD Biosciences)上鉴定染色的单细胞群。每个样品收集500,000个事件。对于Live/Dead Aqua使用ArCTM胺反应性珠(Thermo Fisher Sci.)，对于所有抗体使用Compbead抗大鼠和抗仓鼠Igκ/阴性对照补偿颗粒组(BD Biosciences)并且对于ZsGreen1使用GFP BrightComp eBeads(Thermo FisherSci.,Cat#A10514)进行多色流式细胞术补偿。用FlowJo软件(Ashland,OR)分析数据。现将描述在这些实验中所使用的材料和方法。
现将描述本实验的结果。
mRNA-LNP体外靶向CD4+ T细胞
考虑到T细胞不天然胞吞纳米颗粒，起初在mAb结合后，寻找胞吞的CD4+ T细胞表面抗原。选择CD4-靶向的受体介导的胞吞以实现靶向CD4+ T细胞的递送19。CD4受体靶向还显示一旦纳米颗粒结合，能够吸收和内化20,21。首先对得自健康供体的人CD4+ T细胞评价靶向的mRNA-LNP的结合能力。将抗-CD4 IgG抗体(抗-CD4/mRNA-LNP)或非特异性同种型对照IgG(对照IgG/mRNA-LNP)缀合至mRNA-LNP。如图1A所示，放射性标记的抗-CD4/mRNA-LNP选择性结合至人CD4+ T细胞，而对照IgG对应物不会。还使用流式细胞术确认了对CD4+ T细胞的选择性靶向(图1B-图1C)。将人CD4+ T细胞与抗-CD4/多聚(C)RNA-LNP或对照IgG/多聚(C)RNA-LNP培育，并将加FITC标签的抗大鼠IgG用于监测抗体缀合的LNP与细胞的结合。观察到抗-CD4/多聚(C)RNA-LNP的剂量反应性结合。为了确定靶向mRNA-LNP的内化和功能活性(mRNA翻译)，将具有荧火虫荧光素酶(Luc)编码mRNA的抗-CD4抗体或者对照IgG-缀合的LNP与人CD4+ T细胞培育。与对照IgG/mRNA-LNP相比，证实了mRNA在抗-CD4/mRNA-LNP中的有效翻译。CD4+ T细胞与更高剂量的Luc mRNA-LNP的培育获得了更高的Luc活性，从而证实了剂量反应相关性(图1C)。
为了在单细胞水平上直接评价靶向效率并且为了出于基因编辑目的测试靶向平台，从具有Ai6(具有loxP-侧接的STOP盒的Cre报告分子等位基因，其通过Cre介导的重组表达稳健的ZsGreen1荧光)的小鼠收获脾细胞，并用不同的量的靶向或非靶向(非缀合或对照IgG-缀合的)Cre mRNA-LNP处理。然后收集细胞，并用抗CD3和CD8抗体(图11中列出了抗体)染色并通过流式细胞术分析。图2B提供了在CD3+CD8-群中识别ZsGreen1阳性细胞的设门策略，其中图2A显示了相应的ZsGreen1阳性细胞。使用CD3+CD8-染色，而不是直接CD4染色以识别CD4+ T细胞，这是因为一旦施用抗-CD4抗体缀合的纳米颗粒，CD4瞬时消失(图3)。当使用非靶向LNP时，极低百分比的CD3+CD8-细胞显示出阳性ZsGreen1信号，而约80％的这种细胞群吸收并翻译抗-CD4抗体缀合的LNP中递送的Cre mRNA，即使在所施用的mRNA-LNP的最低量下。在从Ai9小鼠收获的脾细胞中进行相同实验，Ai9小鼠在Cre介导的重组后表达稳健的tdTomato荧光，并且获得了类似的结果。这表明靶向的抗-CD4/mRNA-LNP体外有效转染CD4+ T细胞的潜力。
抗-CD4/mRNA-LNP体内靶向CD4+ T细胞
然后在眶后静脉内(IV)施用后，分析小鼠中抗-CD4/mRNA-LNP的生物分布。在用抗小鼠CD4或对照IgG缀合后，用125I直接标记LNP，因此所测量的放射性仅显示了颗粒的分布，而无任何影响结果的脱离的靶向抗体。为了测量组织吸收，计算了多个组织中放射性的量(每克组织注射剂量的百分比-％ID/g)。如所期望的，在注射后0.5小时(h)，显著的量的对照IgG/mRNA-LNP颗粒仍在血液中循环(19.35±2.2％ID/g)，表明生物分布的显著变化，其中对照IgG LNP的肝脏靶向降低(图4A)。对于抗-CD4/mRNA-LNP，较少量的颗粒循环(10.84±0.42％ID/g)。大部分抗-CD4/mRNA-LNP吸收发生在脾脏中(131.59±9.71％ID/g)，表明与对照IgG/mRNA-LNP相比，脾脏吸收升高至3.5倍(37.6±8.67％ID/g)。还对CD4-靶向的和对照IgG/mRNA-LNP两者计算了定义为给定器官的％ID/g与血液中的％ID/g之比的定位比(LR)。作为网状内皮系统的一部分的脾脏有助于通过非靶向mRNA-LNP所观察到的非特异性脾脏吸收。抗-CD4/mRNA-LNP在脾脏中的定位比它们的对照IgG对应物的水平高6倍(图4B，图5A)。为了进一步研究和定量抗-CD4/mRNALNP的体内组织吸收的动力学，将靶向和非靶向125I-标记的多聚(C)RNA-LNP IV注射至小鼠。在注射后0.5、1和24小时，将动物组处死，并且收获所选组织(血液、脾、肝、肺和肾)。靶向的mRNA-LNP的最高循环量为最早测试时间点，血液中的10.84±0.42％ID/g(图4C)。在随后的时间点，血液中靶向颗粒的浓度快递降低至分别在1和24小时的6.86±1.34和0.51±0.07％ID/g。靶向颗粒的特异性脾脏吸收在注射后0.5h达到峰值(131.59±9.71％ID/g)(图4C)并且在最后测试时间点，24小时，定位比随时间升高至61.15(图4D)。
将靶向LNP中的mRNA体内有效递送至CD4+ T细胞
然后，在IV施用后，分析了Luc mRNA-LNP的mRNA翻译。首先，以8μg(0.32mg/kg)mRNA的剂量施用对照IgG/Luc mRNA-LNP和抗-CD4/Luc mRNA-LNP。注射后5小时，收获多个器官，并且测量来自组织裂解液的荧光素酶活性，或者通过完整器官的直接发光成像检测荧光素酶活性(图6A-图6C)。Luc表达模式显示出抗-CD4和对照IgG/Luc mRNA-LNP处理小鼠之间的显著差异，如使用CD4靶向的肝脏中发光信号显著减小。最重要地，在脾脏中，与对照IgG修饰的mRNA-LNP相比，抗-CD4/Luc-mRNA-LNP的Luc活性约7倍高(图6A和图6B)。在除去脾脏、肾、肺、心脏和肝脏—其显示出非缀合和抗体缀合的LNP两者的高吸收—后，在抗-CD4/Luc mRNA-LNP处理的小鼠中观察到淋巴结荧光素酶表达(图6C)。这显示了靶向的LNP穿过内皮膜并且在功能上接近组织，如淋巴结中的细胞的能力。为了证实mRNA被特异性递送至T细胞群，从如上处理的小鼠脾脏分离CD3+ T细胞(因为无法进行CD4选择)。在抗-CD4/Luc mRNA-LNP施用后，CD3+群的Luc活性为对照IgG/Luc mRNA-LNP处理的样品的33倍高。结论如下：由于Luc活性集中在T细胞(图6D)，在靶向的纳米颗粒的IV递送后，特异性且有效地靶向CD4+T细胞。
为了确认使用除ALC-0307LNP以外的LNP制剂的CD4-靶向的mRNALNP平台的靶向效率，将相同抗体缀合策略应用于含有可电离脂质0315(ALC-0315LNP)的Acuitas LNP制剂，它是最近美国食品和药物管理局(FDA)批准的Pfizer/BioNTech COVID疫苗中的LNP制剂(Thran等人,2017,EMBO Mol.Med.9,1434–1447；WO2017075531A1)。这种LNP制剂中的成分列表包括(4-羟丁基)氮烷二基)双(己烷-6,1-二基)双(2-己基癸酸酯)或者ALC-0315可电离脂质、2[(聚乙二醇-2000]-N,N-双十四烷基乙酰胺、1,2-二硬脂酰-sn-甘油基-3-磷酸胆碱和胆固醇。注射抗-CD4-靶向的Luc mRNA-ALC-0315LNP后5小时，当与对照IgG对应物相比时，观察到了与CD4-靶向的ALC-0307LNP非常类似的Luc表达模式(即脾脏中更高的发光信号和肝脏中较低的信号)。这些数据证明通过其它LNP制剂，如ALC-0315LNP的CD4靶向实现了类似的靶向效率。
CD4-靶向的Cre-mRNA-LNP影响CD4+ T细胞中的体内基因重组
靶向的mRNA疗法的一种用途是基因编辑和插入。为了在细胞水平评价对于体内基因修饰，使用CD4-靶向的LNP的mRNA的递送效率，将Cre mRNA-LNP施用于Ai6小鼠(图7A)。在这些小鼠中，编码荧光蛋白ZsGreen1的报告基因的Cre/loxP介导的表达使得能够使用流式细胞术容易地读出成功转染且LoxP重组的靶细胞(图7B和图7C)。测试了广泛的剂量(3、10、30和90μg)。IV注射小鼠，然后第二天收获脾脏和淋巴结，并从每个组织制备单细胞混悬液。使用抗CD3和CD8抗体，对于流式细胞术染色细胞以识别CD4+ T细胞(图11)。在未处理的动物中未观察到信号，表明报告分子构建体无泄漏。对照IgG/Cre mRNA-LNP的施用导致低转染效率，在所测试的两种组织，即脾脏(图7B)和淋巴结(图7C)中，在所使用的mRNA剂量范围内水平类似。如所期望的，当与对照IgG-和非缀合的mRNA-LNP对应物相比时，在所有测试的mRNA剂量，通过抗-CD4/Cre mRNALNP处理观察到了ZsGreen1-表达细胞数目的显著增加(图7B和图7C)。在用非缀合的mRNA-LNP处理的小鼠中，当剂量升高至30μg时，观察到mRNA递送和后续Cre/loxP重组中的显著增加(CD3+CD8-细胞群中多至约20％的ZsGreen1+细胞)。这仍远低于在所有测试剂量下，通过靶向的mRNA-LNP观察到的强响应，并且可能是由于通过一些T细胞对ApoE受体的表达(Sundqvist,2018,Front.Immunol,9:974；Panezai等人,2017,Immunology 152,308-327)。尽管施用90μg抗-CD4/Cre mRNA-LNP导致产生了甚至更高百分比的ZsGreen1+CD4+ T细胞，但是这种LNP的量被证明在所有组(非缀合和对照IgG-缀合的以及CD4-靶向的LNP处理)中是有毒性的，因此从其它实验中除去了该剂量。选择性CD4靶向相对于非靶向LNP对照不会提高纳米颗粒在巨噬细胞和树突状细胞中的吸收(图8)，这可能是由于纳米颗粒它们广泛的天然噬菌细胞吸收所造成的，而通过CD4+ T细胞，与非靶向对照mRNA-LNP相比，靶向的mRNA-LNP吸收显著升高。在本研究中，非T细胞脾细胞，如树突状细胞和巨噬细胞中的ZsGreen1表达细胞的数目在剂量范围内无差异(图8)。
使用CD4-靶向的ALC-0315LNP进行了类似的实验。当向Ai6小鼠i.v.注射携带CremRNA的这些靶向的LNP时，观察到了与CD4-靶向的ALC-0307LNP-Cre mRNA相当的靶向效率(与对照IgG对应物相比，用抗-CD4/ALC-0315LNP-Cre mRNA处理的小鼠中ZsGreen1表达细胞的数目增加)。
通过抗-CD4/mRNA-LNP的CD4+ T细胞靶向不是T细胞亚型特异的然后，研究了某些T细胞亚型是否有利于靶向LNP的吸收。在施用剂量10μg的Cre mRNA-LNP后1天，收获脾脏并用抗CD3、CD8、CD44和CD62L抗体对单细胞混悬液染色以识别原初、记忆和效应记忆T细胞亚群。对于所检验的任何特定CD4+ T细胞亚群：CD4+原初T细胞(CD44-CD62L-)、中央记忆T细胞(CD44+CD62L+)和效应记忆T细胞(CD44+CD62L-)将要吸收和表达的CD4-靶向的mRNA-LNP，未发现明显的偏向(图9A)。大部分T细胞体内不激活。在接受Cre mRNA-LNP的CD4+ T细胞上分析了T细胞激活标志物(CD25)的表达。值得注意地，CD4-靶向的mRNA-LNP在约57％的静息细胞(CD25-)中诱导Cre重组，相比之下在约40％的激活的(CD25+)CD4+ T细胞中诱导(图9B)，因此证实了在静息CD4+ T细胞中有效的靶向、转染和基因重组。
在脾脏中CD4-靶向的递送后，重组细胞随时间减少
在单次IV施用10μg Cre mRNALNP后，追踪ZsGreen1表达七天。在注射后1、4或7天收获脾脏和淋巴结，并且如上所述，对单细胞制剂染色以用于流式细胞术分析。施用10μg抗-CD4/Cre mRNA-LNP后4天，表达ZsGreen1的脾脏CD4+ T细胞的数目显著降低(从第1天的约50％降低至第4天的约32％)。然而，在所测试的最后时间点，它保持在约26％的类似水平(第7天)，仍显著大于通过IgG和非缀合的对应物所观察到的值(图7D)。血液和脾脏是瞬时-再循环T细胞位点，该数据反映了这种情况(Ganusov等人,2014,PLoS Comput Biol,10:e1003586；Mandl等人2012,Proc Natl Acad Sci U S A,109:18036-18041)。对于所有处理，在提取自淋巴结的T细胞中，ZsGreen1表达在7天内不显著改变(图7E)。这反映了T细胞在淋巴结中较长的停留时间(Ganusov等人,2014,PLoS Comput Biol,10:e1003586；Mandl等人2012,Proc Natl Acad Sci U S A,109:18036-18041)。
体内靶向的mRNA-LNP诱导的特异性基因重组显示处加合作用
通过连续施用mRNA-LNP，测试了靶向mRNA递送的潜在加合作用(图10A和图10B)。小鼠接受了10μg剂量的Cre mRNA-LNP的3或5次IV注射，每24小时注射1次。最后一次注射后第2天，收获脾脏和淋巴结。当与3次注射相比时，5次注射导致了显著更高的ZsGreen1+细胞数目。有趣地，对于对照IgG/和非缀合的mRNALNP两者观察到了ZsGreen1表达CD4+ T细胞数目的稳定增加。然而，在非缀合组中表达升高至28％，仍相对低于所测试的任何注射次数的抗-CD4/mRNA-LNP。整体上，靶向的mRNA-LNP的顺序施用导致在脾脏和淋巴结两者中随着注射次数的增加，Cre诱导的基因重组增加。
本文所引用的每篇专利、专利申请和专利公开的公开内容以其全部内容作为参考并入本文。尽管已参考具体实施方式公开了本发明，但是显然在不背离本发明的真正精神和范围的情况下，本领域其它技术人员可以设计本发明的其它实施方式和变化。所附权利要求旨在视为包括所有这些实施方式和等价变化。
序列表
<110> 宾夕法尼亚大学理事会（THE TRUSTEES OF THE UNIVERSITY OFPENNSYLVANIA）
哈明德·帕尔兹（Parhiz, Hamideh）
德鲁·韦斯曼（Weissman, Drew）
伊斯特万·通巴兹（Tombacz, Istvan）
诺贝特·帕尔迪（Pardi, Norbert）
弗拉基米尔·穆济坎托夫（Muzykantov, Vladimir）
<120> mRNA治疗剂对CD4+-T细胞的体内靶向
<130> 046483-6215-00WO
<150> US 63/091,010
<151> 2020-10-13
<160> 2
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 458
<212> PRT
<213> 智人
<400> 1
Met Asn Arg Gly Val Pro Phe Arg His Leu Leu Leu Val Leu Gln Leu
1 5 10 15
Ala Leu Leu Pro Ala Ala Thr Gln Gly Lys Lys Val Val Leu Gly Lys
20 25 30
Lys Gly Asp Thr Val Glu Leu Thr Cys Thr Ala Ser Gln Lys Lys Ser
35 40 45
Ile Gln Phe His Trp Lys Asn Ser Asn Gln Ile Lys Ile Leu Gly Asn
50 55 60
Gln Gly Ser Phe Leu Thr Lys Gly Pro Ser Lys Leu Asn Asp Arg Ala
65 70 75 80
Asp Ser Arg Arg Ser Leu Trp Asp Gln Gly Asn Phe Pro Leu Ile Ile
85 90 95
Lys Asn Leu Lys Ile Glu Asp Ser Asp Thr Tyr Ile Cys Glu Val Glu
100 105 110
Asp Gln Lys Glu Glu Val Gln Leu Leu Val Phe Gly Leu Thr Ala Asn
115 120 125
Ser Asp Thr His Leu Leu Gln Gly Gln Ser Leu Thr Leu Thr Leu Glu
130 135 140
Ser Pro Pro Gly Ser Ser Pro Ser Val Gln Cys Arg Ser Pro Arg Gly
145 150 155 160
Lys Asn Ile Gln Gly Gly Lys Thr Leu Ser Val Ser Gln Leu Glu Leu
165 170 175
Gln Asp Ser Gly Thr Trp Thr Cys Thr Val Leu Gln Asn Gln Lys Lys
180 185 190
Val Glu Phe Lys Ile Asp Ile Val Val Leu Ala Phe Gln Lys Ala Ser
195 200 205
Ser Ile Val Tyr Lys Lys Glu Gly Glu Gln Val Glu Phe Ser Phe Pro
210 215 220
Leu Ala Phe Thr Val Glu Lys Leu Thr Gly Ser Gly Glu Leu Trp Trp
225 230 235 240
Gln Ala Glu Arg Ala Ser Ser Ser Lys Ser Trp Ile Thr Phe Asp Leu
245 250 255
Lys Asn Lys Glu Val Ser Val Lys Arg Val Thr Gln Asp Pro Lys Leu
260 265 270
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290 295 300
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305 310 315 320
Gln Leu Gln Lys Asn Leu Thr Cys Glu Val Trp Gly Pro Thr Ser Pro
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<210> 2
<211> 235
<212> PRT
<213> 智人
<400> 2
Met Ala Leu Pro Val Thr Ala Leu Leu Leu Pro Leu Ala Leu Leu Leu
1 5 10 15
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20 25 30
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35 40 45
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50 55 60
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65 70 75 80
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85 90 95
Thr Phe Val Leu Thr Leu Ser Asp Phe Arg Arg Glu Asn Glu Gly Tyr
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130 135 140
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145 150 155 160
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165 170 175
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180 185 190
Cys Gly Val Leu Leu Leu Ser Leu Val Ile Thr Leu Tyr Cys Asn His
195 200 205
Arg Asn Arg Arg Arg Val Cys Lys Cys Pro Arg Pro Val Val Lys Ser
210 215 220
Gly Asp Lys Pro Ser Leu Ser Ala Arg Tyr Val
225 230 235

Claims (15)

1.一种组合物，包含缀合至靶向结构域的递送载体，其中所述递送载体包含至少一种试剂，并且其中所述靶向结构域特异性结合至CD4+T细胞的细胞表面抗原。
2.根据权利要求1所述的组合物，其中所述递送载体选自由脂质体、脂质纳米颗粒和胶束组成的组。
3.根据权利要求1所述的组合物，其中所述递送载体是脂质纳米颗粒。
4.根据权利要求3所述的组合物，其中所述脂质纳米颗粒包含缀合至所述靶向结构域的PEG-脂质。
5.根据权利要求3所述的组合物，其中所述至少一种试剂包封在所述脂质纳米颗粒中。
6.根据权利要求1所述的组合物，其中所述至少一种试剂选自由治疗剂、成像剂、诊断剂、造影剂、标记剂、检测剂和消毒剂组成的组。
7.根据权利要求1所述的组合物，其中所述至少一种试剂是治疗剂。
8.根据权利要求7所述的组合物，其中所述治疗剂包含核酸分子。
9.根据权利要求7所述的组合物，其中所述治疗剂包含核苷修饰的核酸分子。
10.根据权利要求8所述的组合物，其中所述核酸分子包含mRNA分子。
11.根据权利要求1所述的组合物，其中所述靶向结构域选自由核酸分子、肽、抗体和小分子组成的组。
12.根据权利要求1所述的组合物，其中所述靶向结构域是抗体。
13.根据权利要求1所述的组合物，其中所述靶向结构域是抗-CD4抗体。
14.一种治疗或预防对其有需要的受试者中的疾病或病症的方法，所述方法包括向所述受试者施用权利要求7所述的组合物。
15.根据权利要求14所述的方法，其中所述疾病或病症选自由癌症、传染性疾病和免疫学病症组成的组。
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