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CN116514892A - 甾类化合物、其制备方法和应用 - Google Patents

甾类化合物、其制备方法和应用 Download PDF

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CN116514892A CN202310078780.0A CN202310078780A CN116514892A CN 116514892 A CN116514892 A CN 116514892A CN 202310078780 A CN202310078780 A CN 202310078780A CN 116514892 A CN116514892 A CN 116514892A
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Abstract

本发明公开了一种甾类化合物、其制备方法和应用。该甾类化合物可具有如式VI等所示的结构。本发明的化合物具有SREBP通路抑制活性，可用于预防和/或治疗肥胖、高脂血症、脂肪肝、糖尿病、动脉粥样硬化症、心脑血管疾病、肝癌、皮肤损伤等疾病。

Description

甾类化合物、其制备方法和应用
技术领域
本发明涉及一种甾类化合物、其制备方法和应用。
背景技术
随着生活方式的转变，包括高热量食物和高糖饮料摄入、缺乏运动和体力活动等，在全球范围内，以高脂血症、肥胖、2型糖尿病以及脂肪肝为代表的代谢性疾病已经成为日益严重的健康问题。其中脂肪肝已成为欧美和我国富裕地区慢性肝病的重要病因，普通成人单纯性肝脏脂质堆积患病率10％～30％，其中10％～20％为脂肪性肝炎，后者10年内肝硬化、肝癌发病率达25％。然而截止目前，脂肪肝病理生理机制尚未完全阐明，临床上仍缺乏有效而特异的治疗药物。已知血液和肝脏中胆固醇、甘油三酯等脂质累积是引起高脂血症的主要原因，而高脂血症又是引起动脉粥样硬化、脑中风和脂肪性肝疾病的重要致病因素。因此，以降低脂质为导向，研发靶向脂质代谢调控通路的新型药物，正日渐成为新型代谢性疾病药物研发的重要方向。
已知哺乳动物细胞的脂质合成途径是调控脂质代谢平衡的重要因素。调控胆固醇和脂肪酸合成的关键因子是一类转录因子蛋白甾醇反应元件结合蛋白SREBP(Sterol-Regulatory Element Binding Protein)。这一类蛋白质的前体首先在内质网(ER)上合成，前体通过SREBP切割激活蛋白(SCAP，SREBP cleavage-activating protein)转运到高尔基体，然后经过两种蛋白酶(Site-1protease(S1P)和Site-2protease(S2P))酶切，释放其N端的活性结构域，进入细胞核发挥转录因子作用，与靶基因启动子区的SREBP反应元件(SRE)结合，启动下游基因的表达。SREBP蛋白的剪切成熟严格受细胞内甾醇(如胆固醇、25-羟胆固醇)水平的调控。当细胞在内质网中积累到充足的胆固醇时，胆固醇和SCAP结合，并改变SCAP的构象，引起SCAP-SREBP复合物结合蛋白Insig(Insulin-induced gene)，从而阻断SREBP向高尔基体的转运和随后SREBP的激活。反之，核内活性形式的SREBP增多，促进细胞脂质合成。除了胆固醇，25-羟胆固醇(25-hydroxylcholesterol，25-HC)是另一个强效的SREBP通路的内源性抑制剂。和胆固醇结合SCAP不同的是，25-HC直接结合Insig，并诱导SCAP和Insig结合。
前期研究发现抑制SREBP通路是预防和/或治疗肥胖、高脂血症、脂肪肝、动脉粥样硬化、糖尿病等代谢性疾病和心脑血管疾病、皮肤损伤、肝癌等疾病的有效策略和方法。
针对高脂血症，其发病机制主要是饮食或基因突变等因素引起的脂质合成增加或者脂质转运异常导致血液胆固醇和脂肪酸等脂质的过量累积。目前临床以他汀类药物和贝特类药物为主要调脂药物，其中他汀类药物的作用机理即是通过抑制细胞胆固醇合成途径同时促进血液胆固醇逆向运输实现的。表明靶向细胞脂质合成途径关键因子是有效降低脂质水平的重要手段。
目前为止，针对脂肪性肝病还没有被批准的治疗药物，因此确定治疗靶点和开发新的有效疗法是非常重要的。已知脂肪性肝病的发病机制涉及多种危险因素，如甘油三酯以脂滴形式积累可能引发的脂肪变性，细胞中异常增加的胆固醇和脂肪酸，能引起内质网压力和线粒体功能紊乱，从而导致细胞死亡、炎症和纤维化。其中，游离胆固醇积累被报道为单纯脂肪变性向侵袭性脂肪性肝炎转变的关键驱动因素。其次，建立脂肪肝小鼠模型，简单的无胆固醇高脂饮食即使在长时间喂养后也只能诱导脂肪变性，而在饮食中添加1-2％的胆固醇是实现炎症和纤维化的必要条件因此，降低胆固醇可能成为脂肪性肝病的一种新的治疗策略。已有研究显示：在脂肪肝患者和脂肪肝小鼠模型中发现SREBP异常激活；小鼠肝脏特异性Scap的缺失或敲除，可以消除所有SREBPs的激活，从而阻止脂肪肝和高脂血症的发生。此外，最近的研究表明内质网应激诱导的SREBP异常激活促进了脂肪生成和脂肪肝。因此，这些证据表明，通过抑制SREBP通路降低肝脏的甘油三酯和胆固醇水平是一种预防和/或治疗包括脂肪肝在内的代谢紊乱的有效策略。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是提供对SREBP通路具有抑制活性的新化合物。
本发明提供了一种式VI所示化合物或其药学上可接受的盐：
其中，R3a和R3b的定义如下任一组中所述：
(i)R3a为H，R3b为-NHS(O)2CH3、-NHS(O)2CH2CH3、-NHS(O)2CH2CH2CH3、-NHS(O)2CF3、-NH-C(O)-CH2OH、-CH2OH、-CH2-C(O)-CH2OH、-OR3c或-CH(OH)-CH2CH2OH；R3c为-S(O)2OH、-C(O)-CH2COOH、-C(O)-CH2OH、-C(O)-COOH或-CH2CH2OH；和
(ii)R3a为CH3，R3b为-OH；
R22为
式VI中，*标记的碳原子为手性碳原子时，其为R构型、S构型或者两者的混合。
在本发明某些优选实施方案中，所述的式VI或XI所示的化合物或其药学上可接受的盐中的某些基团如下定义，未提及的基团同本发明任一方案所述(简称“在一些实施方案中”或“在一些优选的实施方案中”)。
在一些实施方案中，如前所述的式VI所示化合物中，R3a和R3b的定义如下任一组中所述：
(i)R3a为H，R3b为-NHS(O)2CH3、-NH-C(O)-CH2OH、-CH2OH、-CH2-C(O)-CH2OH、-OR3c或-CH(OH)-CH2CH2OH；R3c为-S(O)2OH、-C(O)-CH2COOH、-C(O)-CH2OH、-C(O)-COOH或-CH2CH2OH；和
(ii)R3a为CH3，R3b为-OH；
R22为
式VI中，*标记的碳原子为手性碳原子时，其为R构型、S构型或者两者的混合。
在一些实施方案中，如前所述的式VI所示化合物中，R3a和R3b的定义如下任一组中所述：
(i)R3a为H，R3b为-NHS(O)2CH3、-OR3c或-CH(OH)-CH2CH2OH；R3c为-S(O)2OH、-C(O)-CH2COOH、-C(O)-CH2OH、-C(O)-COOH或-CH2CH2OH；
(ii)R3a为CH3，R3b为-OH；和
R22为
式VI中，*标记的碳原子为手性碳原子时，其为R构型、S构型或者两者的混合。
在一些实施方案中，如前所述的式VI所示化合物中，R3a为H，R3b为-NHS(O)2CH3、-NH-C(O)-CH2OH或-OR3c；或者，R3a为CH3，R3b为-OH。
在一些实施方案中，如前所述的式VI所示化合物中，R3c为-C(O)-CH2COOH、-C(O)-CH2OH或-C(O)-COOH。
在一些实施方案中，如前所述的式VI所示化合物中，R3b为-OR3c；R3c为-C(O)-CH2COOH、-C(O)-CH2OH或-C(O)-COOH。
在一些实施方案中，如前所述的式VI所示化合物中，R3a为H，R3b为-OR3c，R3c为-S(O)2OH。
在一些实施方案中，如前所述的式VI所示化合物中，R3a为H，R3b为-OR3c，R3c为-C(O)-CH2COOH。
在一些实施方案中，如前所述的式VI所示化合物中，R3a为H，R3b为-OR3c，R3c为-C(O)-CH2OH。
在一些实施方案中，如前所述的式VI所示化合物中，R3a为H，R3b为-OR3c，R3c为-C(O)-COOH。
在一些实施方案中，如前所述的式VI所示化合物中，R3a为H，R3b为-OR3c，R3c为-CH2CH2OH。
在一些实施方案中，如前所述的式VI所示化合物中，R3a为CH3，R3b为-OH。
在一些实施方案中，如前所述的式VI所示化合物中，R3a为H，R3b为-NHS(O)2CH3。
在一些实施方案中，如前所述的式VI所示化合物中，R3a为H，R3b为-NH-C(O)-CH2OH。
在一些实施方案中，如前所述的式VI所示化合物中，R3a为H，R3b为-CH2OH。
在一些实施方案中，如前所述的式VI所示化合物中，R3a为H，R3b-CH2-C(O)-CH2OH。
在一些实施方案中，如前所述的式VI所示化合物中，R3a为H，R3b为-CH(OH)-CH2CH2OH。
在一些实施方案中，如前任一方案所述的式VI所示化合物中，式VI中，*标记的碳原子为手性碳原子时，其为R构型。
在一些实施方案中，如前任一方案所述的式VI所示化合物中，式VI中，*标记的碳原子为手性碳原子时，其为S构型。
在一些实施方案中，如前任一方案所述的式VI所示化合物中，式VI中，*标记的碳原子为S构型和R构型的混合，例如S构型∶R构型＝1∶1。
在一些实施方案中，所述式VI所示化合物为如下任一化合物：
本发明还提供了一种式XI所示化合物或其药学上可接受的盐：
其中，R3d为H或R3c；R3c的定义如式VI的任一方案中所述；
R7a为H、F、CH3或CF3；
R7b为F或OH；
或者，R7a和R7b以及它们连接的碳原子一起形成R22为
式XI中，*标记的碳原子为R构型、S构型或者两者的混合；#标记的碳原子为手性碳原子时，其为R构型、S构型或者两者的混合。
在一些实施方案中，如前所述的式XI所示化合物中，R3d为H。
在一些实施方案中，如前所述的式XI所示化合物中，R3d为R3c；R3c的定义如式VI的任一方案中所述。
在一些实施方案中，如前任一方案所述的式XI所示化合物中，R22为
在一些实施方案中，如前任一方案所述的式XI所示化合物中，R22为
在一些实施方案中，如前任一方案所述的式XI所示化合物中，R7a为CH3，R7b为OH；或者，R7a和R7b以及它们连接的碳原子一起形成
在一些实施方案中，如前任一方案所述的式XI所示化合物中，R7a为H，R7b为F。
在一些实施方案中，如前任一方案所述的式XI所示化合物中，R7a为CF3，R7b为OH。
在一些实施方案中，如前任一方案所述的式XI所示化合物中，R7a为F，R7b为F。
在一些实施方案中，如前任一方案所述的式XI所示化合物中，R7a为CH3，R7b为OH。
在一些实施方案中，如前任一方案所述的式XI所示化合物中，R7a和R7b以及它们连接的碳原子一起形成
在一些实施方案中，如前任一方案所述的式XI所示化合物中，*标记的碳原子为R构型。
在一些实施方案中，如前任一方案所述的式XI所示化合物中，*标记的碳原子为S构型。
在一些实施方案中，如前任一方案所述的式XI所示化合物中，*标记的碳原子为S构型和R构型的混合，例如S构型∶R构型＝1∶1。
在一些实施方案中，如前任一方案所述的式XI所示化合物中，#标记的碳原子为R构型。
在一些实施方案中，如前任一方案所述的式XI所示化合物中，#标记的碳原子为S构型。
在一些实施方案中，如前任一方案所述的式XI所示化合物中，#标记的碳原子为S构型和R构型的混合，例如S构型∶R构型＝1∶1。
在一些实施方案中，所述式XI所示化合物为如下任一化合物：
本发明的化合物可以通过已知原料(例如羊毛甾醇)经本领域各种常规反应方法(例如羟基保护、双键臭氧氧化、wittig反应、水解反应、酰胺缩合反应、格式试剂加成反应、还原反应、亲核取代反应、环氧化反应)制备获得。示例性的制备方法如本申请的制备实施例中所描述。
例如，化合物37及其类似物的制备方法可以羊毛甾醇为起始原料，经过羟基保护，双键臭氧氧化，wittig反应，水解，缩合得到化合物37及其类似物；反应路线如下所示：
例如，化合物101及其类似物的制备方法可以羊毛甾醇为起始原料，经过羟基保护，双键臭氧氧化，wittig反应，水解，格式试剂加成反应得到化合物101及其类似物；反应路线如下所示：
例如，化合物80及其类似物的制备方法可以羊毛甾醇为原料，通过羟基保护，双键臭氧化，还原，两步取代，加成反应得到化合物80及其类似物；反应路线如下所示：
例如，化合物125及其类似物的制备方法可以羊毛甾醇为原料，通过羟基保护，双键臭氧氧化，wittig反应，水解，环氧化，水解最终得到化合物125及其类似物；反应路线如下所示：
例如，化合物193及其类似物的制备方法可以以羊毛甾醇为起始原料，经过羟基保护，双键臭氧氧化，双键移位，双键臭氧氧化，还原胺化，缩合，水解，得到化合物193。所述制备方法的反应路线如下图所示：
例如，化合物199及其类似物的制备方法，以(22E，24S)-豆甾-6(5)，22(23)-二烯-3β-醇为起始原料，经过羟基保护，双键臭氧氧化，Wittig反应，水解，Wittig反应，双键还原，有机锂试剂加成，环氧化得到产物199。所述制备方法的反应路线如下图所示：
本发明还提供了一种药物组合物，其包含如上所述的化合物或其药学上可接受的盐，以及至少一种药用辅料。
本发明还提供了一种如上所述的化合物或其药学上可接受的盐或如上所述的药物组合物在制备用于预防和/或治疗疾病的药物中的应用，其中所述疾病为肥胖、高脂血症、脂肪肝、糖尿病、动脉粥样硬化症、心脑血管疾病、肝癌或皮肤损伤。
本发明还提供了一种如上所述的化合物或其药学上可接受的盐或如上所述的药物组合物在制备用于抑制SREBP通路的药物中的应用。
本发明还提供了一种抑制SREBP通路的方法，其包括给予受试者有效量的如上所述的化合物或其药学上可接受的盐。
本发明还提供了一种预防和/或治疗疾病的方法，其包括给予受试者有效量的如上所述的化合物或其药学上可接受的盐，其中所述疾病为肥胖、高脂血症、脂肪肝、糖尿病、动脉粥样硬化症、心脑血管疾病、肝癌或皮肤损伤。
定义和说明
除非另有说明，本文所用的下列术语和短语旨在具有下列含义。一个特定的术语或短语在没有特别定义的情况下不应该被认为是不确定的或不清楚的，而应该按照普通的含义去理解。当本文中出现商品名时，意在指代其对应的商品或其活性成分。
在本文中，术语“取代”或“取代基”是基团中的氢原子被指定的基团所代替。当没有指明取代位置时，取代可以在任何位置，但是只有形成一个稳定的或者是化学意义上可行的化学物才是被允许的。举例说明如下：结构表示苯环上的氢原子被q个R8所取代，当存在多个R8时，每个R8相同或不同。
当任何变量(例如R)在化合物的组成或结构中出现一次以上时，其在每一种情况下的定义都是独立的。因此，例如，如果一个基团被0-2个R所取代，则所述基团可以任选地至多被两个R所取代，并且每种情况下的R都有独立的选项。此外，取代基和/或其变体的组合只有在这样的组合会产生稳定的化合物的情况下才是被允许的。
本文所列举的连接基团没有指明其连接方向时，其连接方向可以是任意的，既包括从左到右连接，也包括从右到左连接。举例说明如下，-A-L-B中连接基团L为-C-D-，在没有指明L的连接方向时，-A-L-B包括-A-C-D-B和-A-D-C-B。
当其中一个变量选自单键时，表示其连接的两个基团直接相连，比如A-L-Z中L代表单键时表示该结构实际上是A-Z。
在本文中，术语“烷基”是指饱和的直链或支链的一价烃基。C1-C6烷基表示具有1-6个碳原子的烷基。在一些实施方案中，C1-C6烷基可以为C1-C4烷基。C1-C4烷基包括甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、异丁基、仲丁基、叔丁基。
在本文中，术语“烯基”是指含有至少一个碳碳双键的直链或支链的一价烃基。当烯基中包含饱和碳原子和不饱和碳原子时，其既可以通过饱和碳原子与其他结构相连接，也可以通过不饱和碳原子与其他结构相连。C2-C4烯基表示具有2、3或4个碳原子的烯基。烯基的具体实例包括但不限于乙烯基、烯丙基。
在本文中，术语“亚烷基”是指饱和的直链或支链的二价烃基。C1-C4亚烷基是指具有1-4个碳原子的亚烷基，其具体为亚甲基、亚乙基(例如-CH2CH2-、-CH(CH3)-)、亚丙基(例如-CH2CH2CH2-、-C(CH3)2-、-CH2CH(CH3)-)、亚丁基(例如-CH2CH2CH2CH2-、-CH(CH3)CH(CH3)-、-CH2CH(CH3)CH2-)。
在本文中，术语“氟代烷基”是指烷基中的一个或多个氢原子被氟所取代形成的基团，其中烷基的定义如前所述。氟代烷基的实例包括但不限于一氟甲基、二氟甲基、三氟甲基、五氟乙基。
在本文中，术语“烷氧基”是指-O-烷基，其中烷基的定义如前所述。C1-C4烷氧基是指-O-(C1-C4烷基)，其中C1-C4烷基的定义如前所述，也即C1-C4烷氧基具体可以为甲氧基、乙氧基、正丙氧基、异丙氧基、正丁氧基、异丁氧基、仲丁氧基或叔丁氧基。
在本文中，术语“环烷基”是指饱和的单环或多环(例如稠环、螺环或桥环)的环状烃基。环烷基的实例包括但不限于环丙基、环丁基、环戊基、环己基、C3-10环烷基具体可以为C3、C4、C5、C6、C7、C8、C9、C10环烷基。C3-6环烷基具体可以为C3、C4、C5、C6环烷基。在一些实施方案中，环烷基为单环的。在一些实施方案中，环烷基为多环的(例如稠环、螺环或桥环)。
在本文中，术语“杂环烷基”是指由碳原子和至少一个杂原子形成的饱和的单环或多环(例如并环、螺环或桥环)环状基团，其中杂原子独立地选自N、O和S。杂环烷基可以通过环上的碳原子和杂原子与其他结构相连接。杂环烷基的实例包括但不限于四氢呋喃基、四氢噻吩基、四氢吡咯基、哌啶基、哌嗪基、吗啉基。3-10元杂环烷基具体可以为3、4、5、6、7、8、9或10元杂环烷基。3-6元杂环烷基具体可以为3、4、5或6元杂环烷基。在一些实施方案中，杂环烷基为单环的。在一些实施方案中，杂环烷基为多环的(例如稠环、螺环或桥环)。
在本文中，术语“C6-10芳基”是指苯基或萘基。
在本文中，术语“杂芳基”是指由碳原子和至少一个杂原子形成的芳香性的单环或稠环基团，其中杂原子独立地选自N、O和S。5-10元杂芳基具体可以为5、6、7、8、9或10元杂芳基，例如5-6元杂芳基或8-10元稠杂芳基。5-6元杂芳基是单环的，具体实例包括但不限于吡咯、呋喃、噻吩、噁唑、异噁唑、噻唑、异噻唑、吡唑、咪唑、吡啶、嘧啶、吡嗪。8-10元稠杂芳基的实例包括但不限于苯并吡咯、苯并呋喃、苯并噻吩、苯并噁唑、苯并异噁唑、苯并噻唑、苯并异噻唑、苯并吡唑、苯并咪唑、苯并吡啶、苯并嘧啶、苯并吡嗪、噻唑并噻唑、吡啶并吡啶、吡啶并吡嗪、吡啶并嘧啶。
在本文中，化学结构式中的表示连接位置。当包含于环状基团中并且没有指明所连接的环原子时，可以连接于任何环原子，但是只有形成一个稳定的或者是化学意义上可行的化学物才是被允许的。例如，包括等结构。
在本文中，术语“药学上可接受的盐”表示由适宜的非毒性有机酸、无机酸、有机碱或无机碱与化合物形成的盐，其保留化合物的生物活性。所述的有机酸可为本领域常规的能成盐的各种有机酸，优选甲磺酸、对甲苯磺酸、马来酸、富马酸、柠檬酸、酒石酸、苹果酸、乳酸、甲酸、乙酸、丙酸、三氟乙酸、草酸、丁二酸、苯甲酸、羟乙基磺酸、萘磺酸和水杨酸中的一种或多种。所述的无机酸可为本领域常规的能成盐的各种无机酸，优选盐酸、硫酸和磷酸中的一种或多种。所述的有机碱可为本领域常规的能成盐的各种有机碱，优选吡啶类、咪唑类、吡嗪类、吲哚类、嘌啉类、叔胺类和苯胺类中的一种或多种。所述的叔胺类有机碱优选三乙胺和/或N，N-二异丙基乙胺。所述的苯胺类有机碱优选N，N-二甲基苯胺。所述的吡啶类有机碱优选吡啶、甲基吡啶、4-二甲氨基吡啶和2-甲基-5-乙基吡啶中的一种或多种。所述的无机碱可为本领域常规的能成盐的各种无机碱，优选碱金属氢化物、碱金属的氢氧化物、碱金属的烷氧化物、碳酸钾、碳酸钠、碳酸锂、碳酸铯、碳酸氢钾和碳酸氢钠中的一种或多种。所述的碱金属氢化物优选氢化钠和/或氢化钾。所述的碱金属的氢氧化物优选氢氧化钠、氢氧化钾和氢氧化锂中的一种或多种。所述的碱金属的烷氧化物优选甲醇钠、乙醇钠、叔丁醇钾和叔丁醇钠中的一种或多种。
化学结构中，用楔形实线键和楔形虚线键表示一个立体中心的绝对构型，用直形实线键和直形虚线键表示立体中心的相对构型。键并未指定构型，即如果化学结构中存在构型异构，键可以为或或者同时包含和两种构型(例如和的比例为1∶1)。碳碳双键并未指明其具体构型时，其可以为E或Z构型。立体异构体可以使用手性原料合成、手性拆分制备或者可以使用常规技术例如但不限于使用手性柱的高效液相(HPLC)拆分。
在本文中，术语“受试者”包括任何动物，优选哺乳动物，更优选人。
在本文中，术语“有效量”是指无毒的但能达到预期效果的药物或药剂的足够用量。有效量的确定因人而异，取决于受体的年龄和一般情况，也取决于具体的活性物质，个案中合适的有效量可以由本领域技术人员根据常规试验确定。
在不违背本领域常识的基础上，上述各优选条件，可任意组合，即得本发明各较佳实例。
本发明所用试剂和原料均市售可得。
本发明的积极进步效果在于：本发明提供了一类新化合物，其对SREBP通路具有抑制活性，可用于预防和/或治疗肥胖、高脂血症、脂肪肝、糖尿病、动脉粥样硬化症、心脑血管疾病、肝癌、皮肤损伤等疾病。
附图说明
图1为25-羟羊毛甾醇抑制AMLN饮食诱导的小鼠体重增加的结果。
图2为25-羟羊毛甾醇对小鼠进食量的影响。
图3为25-羟基羊毛甾醇降低小鼠血液总胆固醇的含量。
图4为25-羟基羊毛甾醇降低小鼠血液总甘油三酯的含量。
图5为25-羟基羊毛甾醇降低小鼠肝脏总胆固醇的含量。
图6为25-羟基羊毛甾醇降低小鼠肝脏总甘油三酯的含量。
图7为25-羟基羊毛甾醇降低小鼠血液谷草转氨酶(AST)水平。
图8为25-羟基羊毛甾醇降低小鼠血液谷丙转氨酶(ALT)水平。
图9为小鼠肝脏切片HE染色结果：C57BL/6J CD组。
图10为小鼠肝脏切片HE染色结果：Ldlr-/-CD组。
图11为小鼠肝脏切片HE染色结果：Ldlr-/-AMLN组。
图12为小鼠肝脏切片HE染色结果：Ldlr-/-AMLN+25-HL组。
图13为4组小鼠肝脏切片HE染色结果和NAFLD活动度积分定量统计结果。
图14为小鼠肝脏切片油红O染色结果：C57BL/6J CD组。
图15为小鼠肝脏切片油红O染色结果：Ldlr-/-CD组。
图16为小鼠肝脏切片油红O染色结果：Ldlr-/-AMLN组。
图17为小鼠肝脏切片油红O染色结果：Ldlr-/-AMLN+25-HL组。
图18为4组小鼠肝脏切片油红O染色定量结果。
图19为小鼠肝脏切片天狼星红染色结果：C57BL/6J CD组。
图20为小鼠肝脏切片天狼星红染色结果：Ldlr-/-CD组。
图21为小鼠肝脏切片天狼星红染色结果∶Ldlr-/-AMLN组。
图22为小鼠肝脏切片天狼星红染色结果：Ldlr-/-AMLN+25-HL组。
图23为4组小鼠肝脏切片天狼星红染色定量结果。
图24为小鼠肝脏切片F4/80免疫染色结果，以及偏振光成像指示胆固醇结晶的成像结果：C57BL/6J CD组。
图25为小鼠肝脏切片F4/80免疫染色结果，以及偏振光成像指示胆固醇结晶的成像结果：Ldlr-/-CD组。
图26为小鼠肝脏切片F4/80免疫染色结果，以及偏振光成像指示胆固醇结晶的成像结果：Ldlr-/-AMLN组。
图27为小鼠肝脏切片F4/80免疫染色结果，以及偏振光成像指示胆固醇结晶的成像结果：Ldlr-/-AMLN+25-HL组。
图28为4组小鼠肝脏切片F4/80免疫染色定量结果。
图29为4组小鼠肝脏切片偏振光成像指示胆固醇结晶的成像定量结果。
图30为小鼠主动脉树苏丹红IV染色结果：C57BL/6J CD组。
图31为小鼠主动脉树苏丹红IV染色结果：Ldlr-/-CD组。
图32为小鼠主动脉树苏丹红IV染色结果：Ldlr-/-AMLN组。
图33为小鼠主动脉树苏丹红IV染色结果：Ldlr-/-AMLN+25-HL组。
图34为4组小鼠主动脉树苏丹红IV染色定量结果。
图35为25-羟羊毛甾醇降低肝脏类器官中脂质生成相关基因(Hmgcs，Hmgcr和SCD1，FASN)的表达。
图36为25-羟羊毛甾醇降低肝脏类器官中和纤维化相关基因(Col1a1，aSMA)的表达。
图37为小鼠肝脏类器官的明场成像结果：溶媒对照组。
图38为小鼠肝脏类器官的明场成像结果：奥贝胆酸1μM组。
图39为小鼠肝脏类器官的明场成像结果：奥贝胆酸3μM组。
图40为小鼠肝脏类器官的明场成像结果：25-HL 1μM组。
图41为小鼠肝脏类器官的明场成像结果：25-HL 3μM组。
图42为小鼠肝脏类器官的尼罗红染色结果：溶媒对照组。
图43为小鼠肝脏类器官的尼罗红染色结果：奥贝胆酸1μM组。
图44为小鼠肝脏类器官的尼罗红染色结果：奥贝胆酸3μM组。
图45为小鼠肝脏类器官的尼罗红染色结果：25-HL 1μM组。
图46为小鼠肝脏类器官的尼罗红染色结果：25-HL 3μM组。
图47为5组小鼠肝脏类器官的尼罗红染色定量结果。
图48为小鼠肝脏类器官的纤维化标志蛋白αSMA免疫荧光染色结果：溶媒对照组。
图49为小鼠肝脏类器官的纤维化标志蛋白αSMA免疫荧光染色结果：奥贝胆酸1μM组。
图50为小鼠肝脏类器官的纤维化标志蛋白αSMA免疫荧光染色结果：奥贝胆酸3μM组。
图51为小鼠肝脏类器官的纤维化标志蛋白αSMA免疫荧光染色结果：25-HL 1μM组。
图52为小鼠肝脏类器官的纤维化标志蛋白αSMA免疫荧光染色结果：25-HL 3μM组。
图53为5组小鼠肝脏类器官的纤维化标志蛋白αSMA免疫荧光染色定量结果。
具体实施方式
下面通过实施例的方式进一步说明本发明，但并不因此将本发明限制在所述的实施例范围之中。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，按照常规方法和条件，或按照商品说明书选择。
以下实施例中，25-羟羊毛甾醇(25-HL)指的是实施例68化合物。
生物测试实施例动物：成年雄性C57BL/6J小鼠购于上海斯莱克公司，低密度脂蛋白受体基因敲除小鼠(Ldlr-/-小鼠，T001464)购自江苏集萃药康生物科技股份有限公司。小鼠均养于无致病源的条件下，保持12小时光照/黑暗的条件，自由摄取水和饲料。灌胃液溶媒为：0.5％Tween-80，0.5％甲基纤维素，0.9％氯化钠。AMLN饲料(AMLN，Dyets)含有40％(千卡百分比)脂肪(其中80％为反式脂肪)、22％(质量比)果糖和2％(质量比)胆固醇。
试剂：甲羟戊酸(41288)，多聚甲醛(P6148)，Tween-80(P8074)，甲基纤维素(V900506)，油红O(O0625)，细胞核染色试剂DAPI购自Sigma-Aldrich公司。洛伐他汀(纯度≥98.5％，HPLC)购于上海药谷公司。细胞培养用的dulbecco′s modified eagle medium(DMEM)培养基购自Thermo Scientific公司，胎牛血清(S1580)购于Biowest公司。去脂蛋白血清(LPDS)是本实验室通过超速离心而制备。奥贝胆酸(Obeticholic acid，OCA，CAS登录号459789-99-2，纯度98％(HPLC)。总胆固醇和总甘油三酯试剂盒购自上海科华生物工程股份有限公司。谷丙转氨酶(ALT)和谷草转氨酶(AST)试剂盒购自Lai Er Bio-tech公司。苏木精-伊红染色试剂盒(6765001、6766010)购自Thermo Scientific公司。天狼星红染色试剂盒(ab150681)购自Abcam公司。苏丹红IV(A610914)购自生工生物工程(上海)股份有限公司。尼罗红(HY-D0718)购自MCE公司。
抗体：用于免疫荧光染色分析的抗体如下：抗alpha smoothmuscleActin(αSMA，ab7817，1∶500)抗体购自Abcam；二抗荧光素(FITC)偶联的山羊抗小鼠IgG(H+L)(115-095-003)购自Jackson Immunoresearch公司。抗F4/80一抗*14-4801-85，Invitrogen，1∶100)、荧光二抗Alexa FluorPlus 488-偶联的山羊抗大鼠IgG(A-11006，1∶500)购自Invitrogen公司。
生物测试实施例1：细胞培养
人肝细胞癌细胞系Huh-7/SRE-Luc生长于含DMEM，10％胎牛血清，100units/ml青霉素、100μg/ml链霉素和200μg/ml G418的培养基中。
生物测试实施例2：SREBP荧光素酶报告基因系统
Huh-7/SRE-Luc细胞系为人肝细胞癌细胞系Huh-7中稳定表达LDLR promotor-luciferase和绿荧光蛋白(GFP)。其中，LDLRpromotor区域含甾醇调控元件(sterol-regulatory-element，SRE)，能够有效且灵敏地响应转录因子SREBP的调控，GFP信号作为内参，指征细胞数量的变化。因此，该细胞系可用于筛选调控SREBP信号通路的活性小分子。我们工作中，利用该细胞系筛选能够有效抑制SREBP信号通路的抑制剂。将细胞孵育于固醇缺乏的培养基中(5％去脂蛋白血清，2μM洛伐他汀，10μM甲羟戊酸)，同时添加相应浓度的化合物处理16小时。化合物处理结束后，细胞用裂解液(E397A，Promega)裂解，添加荧光素酶底物(E1500，Promega)后，SRE驱动的荧光素酶的活性通过BioTek SynergyHTX酶标仪(包含但不限于此一类的仪器)测量。绿色荧光蛋白(EGFP)的荧光强度也是通过上述的BioTek酶标仪(包含但不限于此一类的仪器)测量，并作为内参。SRE驱动的荧光素活性除以绿色荧光蛋白的荧光强度后得到的比值作为SREBP通路活性的指标。每一个受试化合物的测试数据经prism软件分析后得到该化合物的IC50参数。
生物测试实施例3：实时荧光定量PCR
肝脏或者肝脏类器官样品在TRI Reagent(T9424，Sigma)中匀浆，根据制造商提供的操作手册提取总RNA。等量的RNA模板以oligodT引物和MLV逆转录酶(Promega)用于合成cDNA，基因的定量数据通过Bio-Rad CFX96real-time PCR System采集，基因mRNA的相对量是通过相对CT方法来定量。所用引物序列如下表所示：
生物测试实施例4血清和肝脏代谢参数的测量
小鼠药物处理后，移去饲料饥饿4小时后处死小鼠，收集血液和肝脏。血液凝固后于4℃1500g离心10分钟，上清即为血清。肝脏中的脂质通过氯仿/甲醇的方法提取，先用匀浆仪Precelly24匀浆破碎，于4℃16000g离心10分钟，有机相转移到新管中，用氮气吹干，之后用乙醇溶解。血液和肝脏中的总胆固醇和甘油三酯水平分别通过胆固醇和甘油三酯试剂盒(上海科华生物工程有限公司)测量。血清中的ALT(LE-M0477，Lai Er Bio-tech)，AST(LE-M0568，Lai Er Bio-tech)，分别根据相应制造商的手册，采用希森美康医用电子(上海)有限公司的分析系统进行测量。
生物测试实施例5：肝脏的组织切片分析
苏木精-伊红染色：摘取后的肝脏用4％多聚甲醛4℃固定过液，石蜡包埋，用石蜡切片机(Leica RM2235)切片，切片厚度为7μm，脱蜡复水后用苏木精-伊红染色试剂盒(6765001，6766010，Thermo Scientific)染色，图像用Olympus VS120玻片显微镜拍摄，用ImageJ软件定量。油红O染色：肝脏用OCT包埋剂(Leica)包埋，用冰冻切片机(LeicaCM1950)切为7μm厚，并用Oil Red O(O0625，Sigma)染色，图像用OlympusVS120玻片显微镜拍摄，并用ImageJ软件定量。天狼星红(SiriusRed)胶原染色：肝脏的石蜡切片脱蜡复水后，按照厂家说明书用天狼星红染色试剂盒(ab150681，Abcam)进行染色。免疫荧光染色∶肝脏用OCT包埋剂(Leica)包埋，用冰冻切片机(LeicaCM1950)切为7μm厚，冰冻切片用抗F4/80大鼠单克隆抗体(14-4801-85，Invitrogen，1∶100)，AlexaFluor488偶联的山羊抗大鼠IgG二抗(A-11006，Invitrogen，1∶500)染色，DAPI(Sigma)30特异染色细胞核。染色封片后，用转盘共聚焦显微镜(Nikon CSU-W1 SoRa)拍照，并用ImageJ软件进行定量分析。胆固醇晶体的偏振光成像：冰冻切片F4/F80和DAPI染色后，用配置有偏振光滤光片的转盘共聚焦显微镜(Nikon CSU-W1 SoRa)进行拍照，并用ImageJ软件定量。
生物测试实施例6小鼠动脉树分离和动脉粥样硬化斑块苏丹红IV染色
小鼠给药实验结束后，主动脉被分离并固定在4％的PFA中，在体视显微镜下用眼科钳取出血管周围脂肪组织后，用苏丹IV染色，用70％乙醇清洗动脉粥样硬化斑块。染色后，用ZEISS Axio Zoom.V16立体显微镜对主动脉树进行成像。用ImageJ软件对动脉粥样硬化病变进行量化。
生物测试实施例7小鼠肝脏类器官的制备和培养
C57BL/6N小鼠在12周龄时投喂脂肪肝诱导饲料(TrophicDiet，TP2630052A，含有10.2％kcal蛋白质、37.3％kcal碳水化合物，52.6％kcal脂肪)和含果糖的饮用水(23.1g果糖和18.9g葡萄糖溶解在1L水中，然后过滤灭菌)共16周，生成脂肪肝模型。为了生成脂肪肝肝脏类器官，将脂肪肝小鼠的肝脏组织切碎，在37℃的消化缓冲液中消化30-60分钟。消化缓冲液包括DMEM/F-12(Cytiva，SH30023.01)和2.5mg/mL胶原酶D(罗氏，COLLD-RO)，0.1mg/mL DNaseI(Sigma-Aldrich，DN25)。分离的单个肝细胞，经70μm滤膜过滤，洗涤1次。离心收集细胞，将培养基与基底膜提取物(BME)(R&D Systems，3533-010-02)按1∶3的比例混合重悬。培养基包括AdDMEM/F12，10mM Hepes，1xGlutamax，1％pen/strep，1 x B27，1 x N2，NAC(1mM)，NIC(10mM)，Gastrin(10nM)，EGF(50ng/mL)，FGF10(100ng/mL)，A83-01(5μM)，Rki(10μM)，10％RSPO1条件培养基，30％Wnt3a条件培养基，5％Noggin条件培养基的培养条件中。给药前，类器官经胰酶(Gibco，Cat#25200072)消化后重悬。24小时后，以DMSO作为空白对照，给类器官换液含有不同浓度OCA或25-HL的培养基。将脂肪肝肝脏类脏器分为5组*1‰DMSO、1μM OCA、3μM OCA、1μM 25-HL和3μM 25-HL)，分别给予72小时药物治疗。
生物测试实施例8小鼠肝脏类器官的组织化学染色
免疫细胞化学：将类器官固定在免疫染色固定液(Beyotime Biotechnology，P0098)中，4℃过夜。然后在PBS中洗涤，然后用含0.5％TritonX-100的PBS在室温下处理20分钟。然后将类器官用含10％山羊血清的PBS封闭溶液在室温下处理1小时，并与一抗(Anti-alpha smooth muscle Actin，ab7817，Abcam，1∶500稀释)在4℃下孵育一夜。第二天，将类器官洗净，与第二抗体荧光素(FITC)偶联的山羊抗小鼠IgG(H+L)共孵育(JacksonImmunoresearch，115-095-003)。细胞核用荧光盾TM与DAPI(Sigma-Aldrich，F6057)复染。
为了观察脂滴，类器用4％多聚甲醛(PFA)固定1小时，室温下用250nmol/L尼罗红(MCE，HY-D0718)染色3分钟。成像前用PBS冲洗两次类器官。染色的类器官在Dragonfly高速共聚焦显微镜系统(Andor，Dragonfly200)下观察。
生物测试实施例9本发明化合物对SREBP通路抑制效果
通过生物测试实施例2的方法测试本发明化合物对SREBP通路的抑制效果，每个化合物浓度梯度设计为0.01、0.03、0.1、0.3、1.0、3.0、10μM，对照为溶媒DMSO。部分化合物的IC50值如表1中所示。
表1：部分实施例的化合物的活性数据
生物测试实施例1025-羟羊毛甾醇降低血脂水平、缓解脂肪肝和肝脏损伤
已知血液脂质水平升高和肝脏脂质蓄积是脂肪肝的高危因素，本发明进而分析了25-羟羊毛甾醇是否能减缓饮食诱导的小鼠脂肪肝的典型症状：脂质蓄积、肝损伤、炎症和纤维化。
购买8周龄的雄性C57BL/6J小鼠和雄性Ldlr-/-小鼠(T001464，江苏集萃药康生物科技股份有限公司)，分组并投喂不同的饲料以及给予不同药物处理，小鼠随机分成4组，每组8-9只小鼠：1组为C57BL/6J野生型小鼠投喂基础饲料(chow diet，CD)溶媒对照组。其它3组均为Ldlr-/-基因敲除小鼠，分别为基础饲料(CD)溶媒对照组，AMLN饲料(AMLNdiet，含20％脂肪，22％果糖，2％胆固醇)溶媒对照组，AMLN饲料25-羟羊毛甾醇给药组(25-羟羊毛甾醇的给药浓度为30mg/kg/day)。4组小鼠每天灌胃一次，期间统计不同处理组小鼠的进食和体重变化。8周后收集小鼠的血液和肝脏，分析血脂、肝脂和肝脏损伤的表型。
结果如图1-8所示，其中，图1为各组小鼠每周称重的统计结果，图2为各组小鼠进食量累积统计，图3为25-羟基羊毛甾醇降低小鼠血液总胆固醇的含量，图4为25-羟基羊毛甾醇降低小鼠血液总甘油三酯的含量，图5为25-羟基羊毛甾醇降低小鼠肝脏总胆固醇的含量，图6为25-羟基羊毛甾醇降低小鼠肝脏总甘油三酯的含量，图7为25-羟基羊毛甾醇降低小鼠血液谷草转氨酶(AST)水平，图8为25-羟基羊毛甾醇降低小鼠血液谷丙转氨酶(ALT)水平。
图1和图2中，P值采用统计学双因素two-way ANOVA(Dunnett′s multiplecomparisons test)方差分析计算；*表示P＜0.05；ns表示无统计学差异。图3-图8中，数据以平均值±标准偏差表示。P值采用单因素one-way ANOVA方差分析*表示P＜0.05，**表示P＜0.01，***表示P＜0.001。
结果显示，连续给药8周后，Ldlr-/-小鼠在投喂AMLN饲料同时给药25-羟羊毛甾醇组，其体重增加显著低于AMLN饲料溶媒对照组。说明25-羟羊毛甾醇对AMLN饮食诱导的体重增加有很好的抑制效果。脂肪性肝病的病理特征主要包括肝脏的脂肪变性、肝脏损伤、炎症浸润和纤维化。4组小鼠给药8周后，我们首先检测了小鼠血液总胆固醇，总甘油三酯等脂质水平的变化以及肝脏总胆固醇和总甘油三酯脂质水平的变化。如图3-4所示：与对照组相比，25-羟羊毛甾醇显著减低血清中总胆固醇和总甘油三酯水平。同时如图5-6所示25-羟羊毛甾醇显著减低小鼠肝脏总胆固醇和总甘油三酯水平。表明25-羟羊毛甾醇具有良好的降低血脂和肝脂的效果。从图7-8中可以看出，血清中的肝损伤标志分子谷草转氨酶AST和丙氨酸转氨酶ALT都被25-羟羊毛甾醇显著降低。表明25-羟羊毛甾醇具有良好的改善肝脏损伤的效果。
生物测试实施例11 25-羟羊毛甾醇减缓脂肪肝和动脉粥样硬化
进一步，我们对各组小鼠的肝脏组织切片进行多种染色或者免疫组化操作，分析其肝脏脂质蓄积和脂肪肝的表型变化。结果如图9-29所示，其中，图9-13为小鼠肝脏切片HE染色结果和NAFLD活动度积分定量结果：25-羟羊毛甾醇减少肝脏的脂肪变性并显著降低NAFLD活动度积分；图14-18为小鼠肝脏切片油红O染色和定量结果：25-羟羊毛甾醇减少肝脏中的脂滴；图19-23为小鼠肝脏切片天狼星红染色和定量结果：25-羟羊毛甾醇减少肝脏中的纤维化；图24-29为小鼠肝脏切片F4/80免疫染色和定量结果，以及偏振光成像指示胆固醇结晶的成像和定量结果：25-羟羊毛甾醇减少肝脏中Kupffer细胞的聚集和胆固醇结晶的形成。
图9-29定量分析采用Image J软件进行，数据以平均值±标准偏差表示。P值采用单因素one-wayANOVA方差分析*表示P＜0.05，**表示P＜0.01，***表示P＜0.001。
结果如图9-13苏木精-伊红染色所示：雄性Ldlr-/-小鼠在AMLN饲料喂养8周后肝脏中含有明显的大泡状脂滴、气泡状变性肝细胞。和对照组相比，25-羟羊毛甾醇显著减少所述表型。同时，图14-18肝脏组织切片的油红O染色结果显示：和对照组相比，25-羟羊毛甾醇显著减少肝脏中包括胆固醇和脂肪酸在内的中性脂类的脂滴堆积。这些结果和图1-8中25-羟羊毛甾醇降低肝脏脂质含量的结果相一致，表明25-羟羊毛甾醇有效改善AMLN饮食诱导的肝脏脂质堆积表型。此外，本发明进一步分析了肝脏中脂肪肝相关的炎症和纤维化表型的变化。图24-29免疫荧光染色结果显示溶媒对照Ldlr-/-AMLN饲料喂养小鼠中，F4/80特异性染色显示Kupffer细胞聚集在一起并在胆固醇结晶周围形成皇冠状结构(图24-27放大图)。25-羟羊毛甾醇显著减少Kupffer细胞形成的皇冠状结构，说明25-羟羊毛甾醇可显著减少肝脏的炎症浸润。肝脏切片中胆固醇晶体的偏振光成像结果显示在溶媒对照小鼠中，Kupffer细胞形成的皇冠状结构内部含有大量的胆固醇晶体。与单纯脂肪变性相比，这些胆固醇晶体和Kupffer细胞形成的皇冠状结构是脂肪肝的标志性特征，巨噬细胞被胆固醇晶体吸引并试图清除这些残留的脂滴，与动脉粥样硬化中描述的现象相似。更为重要的是，25-羟羊毛甾醇明显减少了皇冠状结构和胆固醇晶体的数量(图24-29)。同时，图19-23天狼星红染色结果显示25-羟羊毛甾醇显著减少小鼠肝脏组织切片胶原纤维形成的纤维化表型。以上结果提示25-羟羊毛甾醇缓解肝脏脂肪蓄积和脂肪肝的症状，可用于预防和/或治疗高血脂和脂肪肝等疾病。
AMLN喂养的Ldlr-/-小鼠也是动脉粥样硬化的常用模型，因此我们可以同时研究脂肪肝和动脉粥样硬化。8周龄雄性Ldlr-/-小鼠，投喂AMLN饲料，同时灌胃给药，每日1次，共8周。处死小鼠后，分离主动脉并用4％多聚甲醛固定。在体视显微镜下去除血管周围脂肪组织，经苏丹红IV染色，70％乙醇漂洗。用体视显微镜(德国蔡司，Axio ZoomV16)对主动脉树进行成像。并用ImageJ软件对动脉粥样硬化病变斑块进行定量分析。
结果如图30-34所示，图30-34为小鼠主动脉树苏丹红IV染色和定量结果：25-羟羊毛甾醇减少动脉粥样硬化斑块的形成。
结果显示，连续给药8周后，分离各组小鼠的主动脉树，进行主动脉苏丹红IV脂质特异性染色，如图30-34所示与对照组小鼠相比25-羟羊毛甾醇显著减少动脉粥样硬化斑块的形成和数量。25-羟羊毛甾醇对动脉粥样硬化的形成具有减缓作用。
图1-8至图9-34这些数据表明25-羟羊毛甾醇减少血液脂质水平升高，减少肝脏的脂肪蓄积、胆固醇结晶、肝细胞损伤、炎症浸润和纤维化，减少动脉粥样硬化斑块的形成和数量。说明25-羟羊毛甾醇针对高血脂、脂肪肝、动脉粥样硬化具有良好疗效。
生物测试实施例12利用体外肝脏类器官证明25-羟羊毛甾醇对脂肪肝的脂质生成和纤维化具有抑制效果
为了区分25-羟羊毛甾醇的抑制效果是直接基于对肝脏的影响还是全身系统性效应。我们利用3D肝脏类器官作为一种体外的脂肪肝的研究模型，分析25-羟羊毛甾醇对肝脏类器官脂质生成和纤维化标志分子表达的影响。我们给C57BL/6N小鼠在12周龄时投喂脂肪肝诱导饲料(TrophicDiet，TP2630052A，含有10.2％kcal蛋白质、37.3％kcal碳水化合物，52.6％kcal脂肪)和含果糖的饮用水(23.1g果糖和18.9g葡萄糖溶解在1L水中，然后过滤灭菌)共16周，生成脂肪肝模型。从该模型鼠肝脏器官分离并制备肝脏类器官进行体外培养。同时对类器官进行体外给药处理，奥贝胆酸(Obeticholic acid，OCA)是farnesoid Xreceptor(FXR)的激动剂，该药物在临床三期试验中表现了良好的抗脂肪肝的效果，本实施例采用此药物作为对照药物。类器官分组并给予相同浓度梯度的奥贝胆酸和25-羟羊毛甾醇处理3天，收集类器官RNA并采用荧光实时定量PCR分析脂质合成相关基因(Hmgcs，Hmgcr；SCD1，FASN)以及纤维化标志分子(αSMA，Col1a1)的表达差异。
结果如图35-53所示，其中，图35为25-羟羊毛甾醇降低肝脏类器官中脂质生成相关基因(Hmgcs，Hmgcr和SCD1，FASN)的表达，且效果优于相同浓度的对照药物奥贝胆酸；图36为25-羟羊毛甾醇降低肝脏类器官中和纤维化相关基因(Col1a1，αSMA)的表达，且效果优于相同浓度的对照药物奥贝胆酸；图37-53为肝脏类器官的明场成像结果，尼罗红染色和定量结果和纤维化标志蛋白αSMA免疫荧光染色和定量结果：25-羟羊毛甾醇降低肝脏类器官中脂质蓄积同时降低肝脏类器官中纤维化标志蛋白αSMA表达。
图35，图36数据以平均值±标准偏差表示。P值采用单因素one-wayANOVA方差分析ns表示无统计学差异，*表示P＜0.05，**表示P＜0.01，***表示P＜0.001。图47和图53的定量分析采用Image J软件进行。数据以平均值±标准偏差表示。P值采用单因素one-wayANOVA方差分析*表示P＜0.05，**表示P＜0.01，***表示P＜0.001。
结果显示，相较于奥贝胆酸未能抑制脂质合成基因表达，25-羟羊毛甾醇能显著抑制脂质合成相关基因(图35)和纤维化相关基因(图36)的表达水平。同时，尼罗红染色实验检测类器官中性脂质的蓄积情况，如图37-53结果显示25-羟羊毛甾醇和OCA使类器官的脂质积累减少，纤维化标志蛋白αSMA的染色数据显示纤维化蛋白αSMA表达显著减少。图35-53结果说明25-羟羊毛甾醇通过抑制脂肪生成和纤维化基因的表达，直接减少肝脏脂质积累和纤维化，而OCA可能通过促进脂质氧化，间接抑制肝脏脂质积累。这些数据证明了25-羟羊毛甾醇直接靶向对肝脏脂质合成途径和纤维化基因的调控。
关键中间体的制备
中间体II乙酸(1R，3aR，5aR，7S，9aS，11aR)-1-[(2R)-4-甲酰基丁-2-基]-3a，6，6，9a，11a-五甲基-2，3，3a，4，5，5a，6，7，8，9，9a，10，11，11a-十四氢-1H-环戊并[2，1-i]菲-7-基酯的制备
第一步(1R，3aR，5aR，7S，9aS，11aR)-3a，6，6，9a，11a-五甲基-1-[(2R)-6-甲基庚-5-烯-2-基]-2，3，3a，4，5，5a，6，7，8，9，9a，10，11，11a-十四氢-1H-环戊并[1，2-a]菲-7-醇(10.00g，23.4mmol，1.0eq)溶解于DCM(250mL)中，完全溶解后依次向反应体系中加入乙酸酐(6.7mL，71.0mmol，3.0eq)，DMAP(0.57g，4.7mmol，0.2eq)和TEA(16.3mL，117.2mmol，5.0eq)，加料完毕后在室温下搅拌2小时。TLC(PE∶EtOAc＝5∶1，磷钼酸烤板)监测反应完全后，用甲醇(10mL)萃灭，反应液用饱和碳酸氢钠(～100mL)和水(～100mL)各洗涤一次，无水硫酸钠干燥，浓缩，在浓缩快干时，加入甲醇(～100mL)，冰浴下搅拌30分钟，抽滤，滤饼用少量甲醇淋洗，滤饼干燥得到白色固体乙酸(1R，3aR，5aR，7S，9aS，11aR)-3a，6，6，9a，11a-五甲基-1-[(2R)-6-甲基庚-5-烯-2-基]-2，3，3a，4，5，5a，6，7，8，9，9a，10，11，11a-十四氢-1H-环戊并[2，1-i]菲-7-基酯(I)(9.00g，17.3mmol，纯度90.0％，收率82.54％)。1H NMR(400MHz，CDCl3)：δ4.50(dd，J＝11.5，4.5Hz，1H)，2.69(s，1H)，2.09-1.87(m，8H)，1.77-1.24(m，26H)，1.15(d，J＝11.4Hz，3H)，1.00(s，3H)，0.93-0.85(m，12H)，0.69(d，J＝2.7Hz，3H).13CNMR(400MHz，CDCl3)：δ203.21，171.00，134.37，134.32，99.99，80.90，77.34，77.02，76.71，50.50，50.30，49.82，44.54，41.14，37.81，36.90，36.08，36.03，35.27，30.95，30.78，28.24，28.15，27.91，26.38，24.23，24.17，21.33，20.98，19.19，18.46，18.40，18.11，16.53，15.78.
第二步乙酸(1R，3aR，5aR，7S，9aS，11aR)-3a，6，6，9a，11a-五甲基-1-[(2R)-6-甲基庚-5-烯-2-基]-2，3，3a，4，5，5a，6，7，8，9，9a，10，11，11a-十四氢-1H-环戊并[2，1-i]菲-7-基酯(I)(15.00g，32.0mmol，1.0eq)溶于DCM(二氯甲烷)(300mL)中，氮气置换，体系冰浴下降温到0℃，通入臭氧，鼓气10min。TLC(PE∶EtOAc＝5∶1，磷钼酸烤板)监测反应，点板产物点明显比原料点浓，停止通气，体系用氮气置换后直接浓缩至干，粗产物用快速色谱法分离纯化(PE∶EtOAc＝95∶5 to 90∶10，磷钼酸烤板)纯化，得到白色固体乙酸(1R，3aR，5aR，7S，9aS，11aR)-1-[(2R)-4-甲酰基丁-2-基]-3a，6，6，9a，11a-五甲基-2，3，3a，4，5，5a，6，7，8，9，9a，10，11，11a-十四氢-1H-环戊并[2，1-i]菲-7-基酯(II)(6.50g，13.2mmol，纯度95.5％，收率41.3％)。1H NMR(400MHz，CDCl3)：δ9.77(t，J＝1.9Hz，1H)，4.50(dd，J＝11.6，4.5Hz，1H)，2.51-2.30(m，2H)，2.09-1.88(m，8H)，1.86-1.24(m，17H)，1.23-1.12(m，2H)，0.99(d，J＝11.2Hz，3H)，0.93-0.84(m，12H)。
中间体VI(5R)-5-[(1R，3aR，5aR，7S，9aS，11aR)-7-羟基-3a，6，6，9a，11a-五甲基-2，3，3a，4，5，5a，6，7，8，9，9a，10，11，11a-十四氢-1H-环戊并[1，2-a]菲-1-基]己酸的制备
第一步乙酸(1R，3aR，5aR，7S，9aS，11aR)-1-[(2R)-4-甲酰基丁-2-基]-3a，6，6，9a，11a-五甲基-2，3，3a，4，5，5a，6，7，8，9，9a，10，11，11a-十四氢-1H-环戊并[2，1-i]菲-7-基酯(II)(1.50g，3.4mmol，1.0eq)溶解在二氯甲烷(50mL)中，0℃下依次加入三乙胺(1.41mL，10.2mmol，3.0eq)和叔丁基二甲硅基三氟甲磺酸酯(1.30g，5.1mmol，1.5eq)。反应液0℃搅拌2小时，TLC(PE∶DCM＝3∶1，磷钼酸烤板)显示原料点消失，反应液浓缩至干，加入正已烷(50mL)搅拌10分钟，过滤，滤液旋干，加入DCM(50mL)，反应液冷却到-78℃，通入臭氧，鼓泡10分钟，TLC(PE∶DCM＝3∶1)监测原料点消失，加入PPh3(0.89g，3.4mmol，1.0eq)搅拌30分钟，反应液直接浓缩，柱层析纯化(PE∶EtoAc＝90∶10)得到白色固体乙酸(1R，3aR，5aR，7S，9aS，11aR)-1-[(2R)-1-甲酰基丙-2-基]-3a，6，6，9a，11a-五甲基-2，3，3a，4，5，5a，6，7，8，9，9a，10，11，11a-十四氢-1H-环戊并[2，1-i]菲-7-基酯(III)(300mg，0.560mmol，16.52％)。1H NMR(400MHz，CDCl3)δ9.76(dd，J＝3.3，1.1Hz，1H)，4.50(dd，J＝11.6，4.5Hz，1H)，2.47(dd，J＝16.4，2.5Hz，1H)，2.17(m，1H)，2.04(m，7H)，1.92(m，1H)，1.43(m，18H)，0.99(dd，J＝9.3，2.8Hz，5H)，0.90(m，12H)，0.74(s，2H).
第二步乙酸(1R，3aR，5aR，7S，9aS，11aR)-1-[(2R)-1-甲酰基丙-2-基]-3a，6，6，9a，11a-五甲基-2，3，3a，4，5，5a，6，7，8，9，9a，10，11，11a-十四氢-1H-环戊并[1，2-i]菲-7-基酯(III)(300mg，0.700mmol，1.0eq)溶解在二氯甲烷(10mL)中，加入乙基(三苯基膦)乙酸酯(243.81mg，0.700mmol，1.0eq)，反应液室温搅拌2小时。TLC(PE∶DCM＝3∶1，磷钼酸烤板)监测反应完全，反应液直接浓缩，硅胶柱层析(PE∶EtOAc＝95∶5)得到白色固体(2E，5R)-5-[(1R，3aR，5aR，7S，9aS，11aR)-7-乙酰基氧基-3a，6，6，9a，11a-五甲基-2，3，3a，4，5，5a，6，7，8，9，9a，10，11，11a-十四氢-1H-环戊并[1，2-a]菲-1-基]己-2-烯酸乙酯(IV)(250mg，0.401mmol，57.30％)。1H NMR(400MHz，CDCl3)δ6.96(m，1H)，5.81(d，J＝15.5Hz，1H)，4.50(dd，J＝11.5，4.5Hz，1H)，4.19(q，J＝7.1Hz，2H)，1.99(m，8H)，1.63(m，12H)，1.31(m，6H)，1.17(m，3H)，1.00(s，3H)，0.92(t，J＝5.3Hz，4H)，0.87(m，10H)，0.69(m，3H).13C NMR(101MHz，CDCl3)δ171.01，148.45，134.35，122.47，80.90，77.33，77.21，77.01，76.69，60.12，50.50，50.24，49.86，44.60，39.33，37.81，36.91，36.38，35.26，30.80，28.22，27.91，26.92，26.38，24.25，24.17，21.33，20.96，19.19，18.96，18.11，16.53，15.78，14.29，-0.01.
第三步(2E，5R)-5-[(1R，3aR，5aR，7S，9aS，11aR)-7-羟基-3a，6，6，9a，11a-五甲基-2，3，3a，4，5，5a，6，7，8，9，9a，10，11，11a-十四氢-1H-环戊并[1，2-a]菲-1-基]己-2-烯酸乙基酯(IV)(250mg，0.55mmol，1.0eq)溶解在甲醇(10mL)中，加入钯(钯炭)(30mg，0.282mmol)，氢气氛围下，搅拌3小时，TLC(PE∶EtOAc＝5∶1，磷钼酸烤板)监测反应，反应完全后，硅藻土滤掉钯碳，滤液浓缩至干，硅胶柱层析纯化(PE∶EtOAc＝80∶20，磷钼酸烤板)得到白色固体(5R)-5-[(1R，3aR，5aR，7S，9aS，11aR)-7-羟基-3a，6，6，9a，11a-五甲基-2，3，3a，4，5，5a，6，7，8，9，9a，10，11，11a-十四氢-1H-环戊并[1，2-a]菲-1-基]己酸乙基酯(V)(200mg，0.392mmol，71.68％)。1H NMR(400MHz，CDCl3)δ4.50(dd，J＝11.5，4.5Hz，1H)，4.13(q，J＝7.1Hz，2H)，2.26(dd，J＝15.5，8.6Hz，2H)，2.04(m，8H)，1.68(m，7H)，1.50-1.37(m，9H)，1.26(t，J＝7.1Hz，3H)，1.15(m，3H)，1.00(s，3H)，0.90(m，12H)，0.68(s，3H).13C NMR(101 MHz，CDCl3)δ173.95，171.03，80.95，77.33，77.22，77.02，76.70，60.16，50.52，50.26，49.82，44.49，37.82，36.91，36.21，35.69，35.28，34.82，30.96，30.80，28.16，27.92，26.39，24.25，24.18，21.85，21.34，21.00，19.19，18.61，18.13，16.54，15.75，14.28，
第四步(5R)-5-[(1R，3aR，5aR，7S，9aS，11aR)-7-乙酰基氧基-3a，6，6，9a，11a-五甲基-2，3，3a，4，5，5a，6，7，8，9，9a，10，11，11a-十四氢-1H-环戊并[1，2-a]菲-1-基]己酸乙酯(V)(200mg，0.40mmol)溶解在乙醇(2mL)中，加入氢氧化钠溶液(2mL，4mol/L)，反应液加热到回流，搅拌过夜。TLC(PE∶EtOAc＝5∶1，磷钼酸烤板)监测反应。反应完全后，反应液降温到室温，用1N的盐酸调pH＝1，乙酸乙酯萃取3次，合并有机相，无水硫酸钠干燥，硅胶柱层析纯化(PE∶EtOAc＝90∶10 to 50∶50)得到白色固体(5R)-5-[(1R，3aR，5aR，7S，9aS，11aR)-7-羟基-3a，6，6，9a，11a-五甲基-2，3，3a，4，5，5a，6，7，8，9，9a，10，11，11a-十四氢-1H-环戊并[1，2-a]菲-1-基]己酸(VI)(150mg，0.331mmol，82.84％)。1H NMR(400MHz，CDCl3)δ3.24(dd，J＝11.6，4.5Hz，1H)，2.33(m，2H)，2.04(d，J＝8.2Hz，4H)，1.91(dd，J＝13.4，7.5Hz，1H)，1.70(m，6H)，1.50(m，7H)，1.19(m，7H)，0.99(d，J＝7.8Hz，5H)，0.91(t，J＝5.9Hz，3H)，0.87(s，3H)，0.81(s，3H)，0.69(s，3H).
中间体VII(4R)-4-[(1R，3aR，5aR，7S，9aS，1iaR)-7-乙酰基氧基-3a，6，6，9a，11a-五甲基-2，3，3a，4，5，5a，6，7，8，9，9a，10，11，11a-十四氢-1H-环戊并[1，2-a]菲-1-基]戊酸的制备
将乙酸(1R，3aR，5aR，7S，9aS，11aR)-1-[(2R)-4-甲酰基丁-2-基]-3a，6，6，9a，11a-五甲基-2，3，3a，4，5，5a，6，7，8，9，9a，10，11，11a-十四氢-1H-环戊并[2，1-i]菲-7-基酯(II)(3.00g，6.78mmol，1.0eq.)溶于丙酮(50.0mL)中(溶不清，浑浊)，置换氮气三次后，降温至0℃，缓慢滴加琼斯试剂(7.8mL，2.0M，2.0eq.)反应5分钟后，TLC监测(PE∶EA＝5∶1，磷钼酸显色，Rf1＝0.72，Rf2＝0.34)。反应完，低温滴加15.0mL异丙醇淬灭，搅拌30分钟，浓缩后用50.0ml二氯甲烷溶解，分别用30.0mL 1.5N NaHSO3和30.0mL H2O洗一次干燥浓缩之后，得到粗品白色固体(4R)-4-[(1R，3aR，5aR，7S，9aS，11aR)-7-乙酰基氧基-3a，6，6，9a，11a-五甲基-2，3，3a，4，5，5a，6，7，8，9，9a，10，11，11a-十四氢-1H-环戊并[1，2-a]菲-1-基]戊酸(VII)(3.00g，4.56mmol，67.56％).1H NMR(400MHz，Chloroform-d)δ4.48(dd，J＝11.6，4.6Hz，1H)，2.40(ddd，J＝15.4，9.9，5.0Hz，2H)，2.25(ddd，J＝15.9，9.5，6.4Hz，1H)，2.08-1.92(m，7H)，1.84-1.56(m，8H)，1.45(td，J＝13.6，12.0，7.2Hz，3H)，1.31(dt，J＝11.8，4.3Hz，2H)，1.23-1.07(m，3H)，0.98(s，3H)，0.88(q，J＝4.7，3.8Hz，12H)，0.67(s，3H).13C NMR(100MHz，Chloroform-d)δ179.93，171.11，134.35，134.23，80.94，50.44，50.18，49.78，44.49，37.77，36.86，35.98，35.22，31.14，30.99，30.92，30.74，28.04，27.88，26.33，24.20，24.13，21.32，20.95，19.17，18.24，18.08，16.51，15.75.
中间体VIII(4R)-4-[(1R，3aR，5aR，7S，9aS，11aR)-7-羟基-3a，6，6，9a，11a-五甲基-2，3，3a，4，5，5a，6，7，8，9，9a，10，11，11a-十四氢-1H-环戊并[1，2-a]菲-1-基]戊酸的制备
称取(4R)-4-[(1R，3aR，5aR，7S，9aS，11aR)-7-乙酰基氧基-3a，6，6，9a，11a-五甲基-2，3，3a，4，5，5a，6，7，8，9，9a，10，11，11a-十四氢-1H-环戊并[1，2-a]菲-1-基]戊酸(500mg，1.09mmol，1.0eq.)，加入四氢呋喃(20.0mL)，甲醇(20.0mL)，1M氢氧化锂水溶液(20.0mL)，室温下搅拌过夜，点板监测，反应结束后，浓缩除去四氢呋喃和甲醇，随后浓缩液中加入水(30.0mL)，再以乙酸乙酯(30.0mL*3)萃取，有机相合并，干燥，浓缩得(4R)-4-[(1R，3aR，5aR，7S，9aS，11aR)-7-羟基-3a，6，6，9a，1 1a-五甲基-2，3，3a，4，5，5a，6，7，8，9，9a，10，11，11a-十四氢-1H-环戊并[1，2-a]菲-1-基]戊酸(VIII)(350mg，77.1％).1HNMR(400MHz，DMSO-d6)δ11.99(s，1H)，4.35(d，J＝5.1Hz，1H)，3.07-2.96(m，1H)，2.18(dddd，J＝22.7，15.9，9.3，6.2Hz，2H)，2.04-1.84(m，5H)，1.73-1.06(m，16H)，0.92(ddd，J＝30.4，18.0，4.7Hz，12H)，0.70(s，3H)，0.65(s，3H).
中间体IX(3R)-3-[(1R，3aR，5aR，7S，9aS，11aR)-7-乙酰氧基-3a，6，6，9a，11a-五甲基-2，3，3a，4，5，5a，6，7，8，9，9a，10，11，11a-十四氢-1H-环戊并[1，2-a]菲-1-基]丁酸的制备
化合物乙酸(1R，3aR，5aR，7S，9aS，11aR)-1-[(2R)-4-甲酰基丁-2-基]-3a，6，6，9a，11a-五甲基-2，3，3a，4，5，5a，6，7，8，9，9a，10，11，11a-十四氢-1H-环戊并[2，1-i]菲-7-基酯(III)(2.30g，5.2mmol，1.0eq)溶解于t-BuOH(叔丁醇)(60mL)中，冰浴下加入2-甲基-2-丁烯(2.19g，31.2mmol，6.0eq)以及磷酸二氢钠(2.1g，15.6mmol，3.0eq)和亚氯酸钠(1.41 g，15.6mmol，3.5eq)的水溶液(15mL)，反应液在室温下搅拌2hrs。TLC(PE∶EtOAc＝5∶1，磷钼酸显色剂)显示反应已经完成。反应液浓缩后，用EtOAc(50mL)萃取，用饱和碳酸氢钠(50mL×2)洗涤。有机层用无水硫酸钠干燥，粗品用PE∶EtOAc＝3∶1过柱，得到固体(3R)-3-[(1R，3aR，5aR，7S，9aS，11aR)-7-乙酰氧基-3a，6，6，9a，11a-五甲基-2，3，3a，4，5，5a，6，7，8，9，9a，10，11，11a-十四氢-1H-环戊并[1，2-a]菲-1-基]丁酸(IX)(1.6g，纯度90％，收率60.42％)。1H NMR(400MHz，CDCl3)δ4.50(dd，J＝11.6，4.5Hz，1H)，2.40(dd，J＝10.2，5.2Hz，1H)，2.29(dd，J＝9.5，6.5Hz，1H)，2.11-1.87(m，8H)，1.83(dd，J＝10.0，3.5Hz，1H)，1.77-1.54(m，7H)，1.53-1.44(m，2H)，1.43-1.22(m，4H)，1.22-1.10(m，2H)，1.00(s，3H)，0.97-0.81(m，12H)，0.69(s，3H).
制备实施例
实施例67
化合物67(1R，3aR，5aR，7S，9aS，11aR)-1-[(2R)-7-羟基庚-2-基]-3a，6，6，9a，11a-五甲基-2，3，3a，4，5，5a，6，7，8，9，9a，10，11，11a-十四氢-1H-环戊并[1，2-a]菲-7-醇的制备
第一步将乙酸(1R，3aR，5aR，7S，9aS，11aR)-1-[(2R)-4-甲酰基丁-2-基]-3a，6，6，9a，11a-五甲基-2，3，3a，4，5，5a，6，7，8，9，9a，10，11，11a-十四氢-1H-环戊并[2，1-i]菲-7-基酯(II)(500mg，1.1mmol)溶解在四氢呋喃(30mL)中，N2换气三次，降温至0℃，加入叔丁醇钾(253mg，2.3mmol)固体，并在0℃搅拌30min，将化合物(2-甲氧基-2-氧亚基乙基)膦酸二乙酯(500mg，1.1mmol)溶解在THF(5ml)中，滴加入上述反应体系中，自然升至室温，搅拌2h。TLC(PE∶EtOAc＝10∶1)无原料剩余，降温至零度加入1 M/HCl(2mL)，分液，用乙酸乙酯萃取两次，无水硫酸钠干燥，旋干，过柱子，得到，白色固体(2E，6R)-6-[(1R，3aR，5aR，7S，9aS，11aR)-7-乙酰基氧基-3a，6，6，9a，11a-五甲基-2，3，3a，4，5，5a，6，7，8，9，9a，10，11，11a-十四氢-1H-环戊并[1，2-a]菲-1-基]庚-2-烯酸甲基酯(67-1)(430mg，0.86mmol，76.65％)。1HNMR(399MHz，CDCl3)δ7.03-6.85(m，1H)，5.80(d，J＝15.6Hz，1H)，4.48(dd，J＝11.7，4.5Hz，1H)，3.77-3.62(m，3H)，2.25(s，1H)，2.12-1.92(m，8H)，1.89(d，J＝21.3Hz，1H)，1.57-1.39(m，4H)1.57-1.39(m，5H)，1.36-1.21(m，3H)，1.15(dd，J＝19.7，10.5Hz，3H)，0.98(s，3H)，0.87(dd，J＝14.6，4.9Hz，12H)，0.66(s，3H)
第二步将(2E，6R)-6-[(1R，3aR，5aR，7S，9aS，11aR)-7-乙酰基氧基-3a，6，6，9a，11a-五甲基-2，3，3a，4，5，5a，6，7，8，9，9a，10，11，11a-十四氢-1H-环戊并[1，2-a]菲-1-基]庚-2-烯酸甲基酯(67-1)(380mg，0.762mmol)溶解在乙酸乙酯(380mL)中，加入Pd/C(钯碳)(38mg，0.762mmol)，氢气换气三次，室温搅拌30min.TLC(PE∶EtOAc＝10∶1)无原料剩余，点板检测反应完全，硅藻土过滤，乙酸乙酯漂洗，旋干，后经柱层析(PE∶EtOAc＝100％-20％)，浓缩得到白色固体(6R)-6-[(1R，3aR，5aR，7S，9aS，11aR)-7-乙酰基氧基-3a，6，6，9a，11a-五甲基-2，3，3a，4，5，5a，6，7，8，9，9a，10，11，11a-十四氢-1H-环戊并[1，2-a]菲-1-基]庚酸甲基酯(67-2)(350mg，0.629mmol，82.56％).1H NMR(400MHz，CDCl3)δ4.49(dd，J＝11.5，4.6Hz，1H)，3.66(d，J＝1.1Hz，3H)，2.30(t，J＝8.0Hz，2H)，2.11-1.94(m，7H)，1.94-1.82(m，1H)，1.82-1.46(m，8H)，1.46-1.09(m，8H)，0.99(s，3H)，0.87(q，J＝2.7，2.2Hz，12H)，0.67(s，3H).13C NMR(101 MHz，CDCl3)δ134.42，134.20，51.46，50.38，49.77，44.43，37.78，36.86，36.25，35.77，35.24，34.18，30.92，30.78，28.18，27.90，26.35，25.90，25.39，24.23，24.15，21.35，20.97，19.17，18.62，18.10，16.52，15.73，1.02.
第三步将(6R)-6-[(1R，3aR，5aR，7S，9aS，11aR)-7-乙酰基氧基-3a，6，6，9a，11a-五甲基-2，3，3a，4，5，5a，6，7，8，9，9a，10，11，11a-十四氢-1H-环戊并[1，2-a]菲-1-基]庚酸甲基酯(67-2)(100mg，0.170mmol)溶解在四氢呋喃(5mL)中，N2换气，降温至零度，加入四氢铝锂(35mg，0.849mmol)，在零度反应2h。TLC(PE∶EtOAc＝10∶1)无原料剩余，加入甲醇，硅藻土过滤，旋干，后经柱层析(PE∶EtOAc＝100％-20％)得到白色固体(1R，3aR，5aR，7S，9aS，11aR)-1-[(2R)-7-羟基庚-2-基]-3a，6，6，9a，11a-五甲基-2，3，3a，4，5，5a，6，7，8，9，9a，10，11，11a-十四氢-1H-环戊并[1，2-a]菲-7-醇(67)(50mg，0.114mmol，67.02％).1H NMR(400MHz，CDCl3)δ3.64(t，J＝6.4Hz，2H)，3.22(d，J＝10.7Hz，1H)，2.02(s，4H)，1.96-1.83(m，1H)，1.76-1.63(m，5H)，1.56(s，1H)，1.46(dd，J＝19.2，10.2Hz，2H)，1.41-1.11(m，13H)，1.04(d，J＝12.7Hz，1H)，0.98(d，J＝7.8Hz，6H)，0.88(d，J＝8.3Hz，6H)，0.80(s，3H)，0.68(s，3H).13C NMR(101 MHz，CDCl3)δ134.36，78.98，77.31，77.00，76.68，63.10，50.41，50.37，49.78，44.43，38.87，36.99，36.35，36.15，35.56，32.87，30.95，30.82，28.21，27.94，27.82，26.48，26.19，26.12，24.25，20.98，19.13，18.69，18.23，15.73，15.41.
实施例68
化合物68(1R，3aR，5aR，7S，9aS，11aR)-1-[(2R)-6-羟基-6-甲基庚-2-基]-3a，6，6，9a，11a-五甲基-2，3，3a，4，5，5a，6，7，8，9，9a，10，11，11a-十四氢-1H-环戊并[1，2-a]菲-7-醇的制备
第一步将原料羊毛甾醇(3.00g，7.03mmol，1.0eq)溶于THF(四氢呋喃)(273mL)，加入水(68mL)，在室温加入NBS(0.73g，4.08mmol，0.58eq)，25℃搅拌2hrs。TLC(n-hexane∶EtOAc＝5∶1，磷钼酸)显示反应已经完成。加入二氯甲烷萃取三次，硫酸钠干燥，旋干，后经柱层析(PE∶EtOAc＝50∶1 to 5∶1)，浓缩得到(1R，3aR，5aR，7S，9aS，11aR)-1-[(2R)-5-溴-6-羟基-6-甲基庚-2-基]-3a，6，6，9a，11a-五甲基-2，3，3a，4，5，5a，6，7，8，9，9a，10，11，11a-十四氢-1H-环戊并[1，2-a]菲-7-醇(68-1)(1.3g，纯度90％，收率35.3％)。1H NMR(400MHz，CDC13)δ3.98(dd，J＝21.0，12.3Hz，1H)，3.27-3.19(m，1H)，2.14(d，J＝6.0Hz，1H)，2.00(d，J＝11.7Hz，5H)，1.84-1.61(m，6H)，1.58(s，9H)，1.33(t，J＝10.8Hz，9H)，1.27-1.12(m，3H)，1.04(d，J＝12.2Hz，1H)，0.99(d，J＝7.9Hz，7H)，0.94-0.84(m，7H)，0.80(s，3H)，0.69(d，J＝2.2Hz，3H).
第二步将(1R，3aR，5aR，7S，9aS，11aR)-1-[(2R)-5-溴-6-羟基-6-甲基庚-2-基]-3a，6，6，9a，11a-五甲基-2，3，3a，4，5，5a，6，7，8，9，9a，10，11，11a-十四氢-1H-环戊并[1，2-a]菲-7-醇(68-1)(900mg，1.72mmol，1.0eq)，溶于THF(四氢呋喃)(90mL)，加入LAH(433mg，12.40mmol，，7.2eq)。加完完毕后升温至70℃回流，搅拌2hrs，TLC(n-hexane∶EtOAc＝5∶1，磷钼酸)检测反应完成后，反应体系倒入冰水(10mL)淬灭，用DCM(二氯甲烷)(30mLx 3)萃取，用无水硫酸钠干燥，旋干得到(1R，3aR，5aR，7S，9aS，11aR)-1-[(2R)-6-羟基-6-甲基庚-2-基]-3a，6，6，9a，11a-五甲基-2，3，3a，4，5，5a，6，7，8，9，9a，10，11，11a-十四氢-1H-环戊并[1，2-a]菲-7-醇(68)(0.4g，纯度90％，收率48.7％).1H NMR(400MHz，CDCl3)δ3.23(d，J＝8.8Hz，1H)，2.02(s，4H)，1.92(d，J＝8.4Hz，1H)，1.69(d，J＝24.3Hz，7H)，1.58(d，J＝11.1Hz，2H)，1.52-1.33(m，8H)，1.30(s，2H)，1.18(d，J＝25.9Hz，8H)，1.01(dd，J＝22.8，9.8Hz，8H)，0.93-0.84(m，6H)，0.80(s，3H)，0.68(s，3H).13C NMR(101MHz，CDCl3)δ134.38，78.97，77.33，77.01，76.69，71.13，50.49，50.38，49.79，44.46，44.39，38.87，37.00，36.72，36.45，35.57，30.97，30.82，29.31，29.18，28.23，27.95，27.82，26.48，24.26，21.10，20.99，19.13，18.67，18.24，15.74，15.41
实施例71
化合物71(1R，3aR，5aR，9aS，11aR)-1-[(2R)-6-羟基-6-甲基庚-2-基]-3a，6，6，9a，11a-五甲基-2，3，3a，4，5，5a，6，7，8，9，9a，10，11，11a-十四氢-1H-环戊并[1，2-a]菲-7-酮的制备
将原料(1R，3aR，5aR，7S，9aS，11aR)-1-[(2R)-6-羟基-6-甲基庚-2-基]-3a，6，6，9a，11a-五甲基-2，3，3a，4，5，5a，6，7，8，9，9a，10，11，11a-十四氢-1H-环戊并[1，2-a]菲-7-醇(68)(1.0g，2.0mmol，1eq)溶于DCM(二氯甲烷)(20mL)中，氮气保护，室温下加入氯铬酸吡啶盐(0.87g，4.05mmol，2eq)，乙酸钠(0.33g，4.05mmol，2eq)。反应2小时。TLC(PE∶EtOAc＝5∶1，磷钼酸)监测反应。反应结束后垫硅藻土过滤，二氯甲烷淋洗两遍，滤液浓缩。柱层析纯化(PE∶EtOAc＝1∶10～1∶3)。得到白色固体(1R，3aR，5aR，9aS，11aR)-1-[(2R)-6-羟基-6-甲基庚-2-基]-3a，6，6，9a，11a-五甲基-2，3，3a，4，5，5a，6，7，8，9，9a，10，11，11a-十四氢-1H-环戊并[1，2-a]菲-7-酮(71)(0.65g，纯度90％，收率68.9％)。1H NMR(400MHz，CDCl3)δ2.57(dd，J＝11.2，7.1Hz，1H)，2.43-2.41(m，1H)，2.08-1.96(m，6H)，1.76-1.59(m，7H)，1.56-1.34(m，9H)，1.22-1.20(m，8H)，1.10(dd，J＝12.2，8.4Hz，9H)，0.92-0.88(m，6H)，0.72(s，2H).
实施例102
化合物102(1R，3aR，5aR，7S，9aS，11aR)-1-[(2R)-6-羟基辛-2-基]-3a，6，6，9a，11a-五甲基-2，3，3a，4，5，5a，6，7，8，9，9a，10，11，11a-十四氢-1H-环戊并[1，2-a]菲-7-醇的制备
第一步(1R，3aR，5aR，7S，9aS，11aR)-3a，6，6，9a，11a-五甲基-1-[(2R)-6-甲基庚-5-烯-2-基]-2，3，3a，4，5，5a，6，7，8，9，9a，10，11，11a-十四氢-1H-环戊并[1，2-a]菲-7-醇(10.00g，23.45mmol，1.0eq)溶解于DCM(250mL)中，完全溶解后依次向反应体系中加入乙酸酐(6.7mL，70.36mmol，3.0eq)，DMAP(0.57g，4.69mmol，0.2eq)和TEA(16mL，117.25mmol，5.0eq)，加料完毕后在室温下搅拌2小时。TLC (石油醚∶乙酸乙酯＝5∶1)监测反应完全后，用甲醇(10mL)萃灭，反应液用饱和碳酸氢钠(～100mL)和水(～100mL)各洗涤一次，无水硫酸钠干燥，浓缩，在浓缩快干时，加入甲醇(～100mL)，冰浴下搅拌30分钟，抽滤，滤饼用少量甲醇淋洗，滤饼干燥得到白色固体乙酸(1R，3aR，5aR，7S，9aS，11aR)-3a，6，6，9a，11a-五甲基-1-[(2R)-6-甲基庚-5-烯-2-基]-2，3，3a，4，5，5a，6，7，8，9，9a，10，11，11a-十四氢-1H-环戊并[2，1-i]菲-7-基酯(I)(9g，19.2mmol，纯度90.0％，收率73.7％)。
1H NMR(400MHz，CDCl3)：δ5.10(s，1H)，4.50(dd，J＝11.5，4.6Hz，1H)，2.08-1.97(m，8H)，1.95-1.82(m，2H)，1.76-1.58(m，10H)，1.58-1.43(m，4H)，1.42-1.22(m，6H)，1.20-1.14(m，3H)，1.00(s，3H)，0.95-0.83(m，15H).13CNMR(400MHz，CDCl3)：δ203.21，171.00，134.37，134.32，99.99，80.90，77.34，77.02，76.71，50.50，50.30，49.82，44.54，41.14，37.81，36.90，36.08，36.03，35.27，30.95，30.78，28.24，28.15，27.91，26.38，24.23，24.17，21.33，20.98，19.19，18.46，18.40，18.11，16.53，15.78.
第二步 乙酸(1R，3aR，5aR，7S，9aS，11aR)-3a，6，6，9a，11a-五甲基-1-[(2R)-6-甲基庚-5-烯-2-基]-2，3，3a，4，5，5a，6，7，8，9，9a，10，11，11a-十四氢-1H-环戊并[2，1-i]菲-7-基酯(I)(15.00g，32.00mmol，1.0eq)溶于DCM(二氯甲烷)(300mL)中，氮气置换，体系冰浴下降温到0℃，通入臭氧，鼓气10min。TLC (石油醚∶乙酸乙酯＝5∶1)监测反应，点板产物点明显比原料点浓，停止通气，体系用氮气置换后直接浓缩至干，粗产物用快速色谱法分离纯化(石油醚∶乙酸乙酯＝95∶5 to 90∶10)纯化，得到白色固体乙酸(1R，3aR，5aR，7S，9aS，11aR)-1-[(2R)-4-甲酰基丁-2-基]-3a，6，6，9a，11a-五甲基-2，3，3a，4，5，5a，6，7，8，9，9a，10，11，11a-十四氢-1H-环戊并[2，1-i]菲-7-基酯(II)(6.50g，14.68mmol，纯度95.5％，收率43.8％)。1H NMR(400MHz，CDCl3)：δ9.77(t，J＝1.9Hz，1H)，4.50(dd，J＝11.6，4.5Hz，1H)，2.51-2.30(m，2H)，2.09-1.88(m，8H)，1.86-1.24(m，17H)，1.23-1.12(m，2H)，0.99(d，J＝11.2Hz，3H)，0.93-0.84(m，12H)。
第三步(甲氧基甲基)三苯基氯化磷(3.87g，11.32mmol，5.0eq)溶解在无水四氢呋喃(40mL)中，体系冰水浴降温到0℃，加入NaHMDS(11mL，1mol/L，5.0eq)，搅拌20分钟后，乙酸(1R，3aR，5aR，7S，9aS，11aR)-1-[(2R)-4-甲酰基丁-2-基]-3a，6，6，9a，11a-五甲基-2，3，3a，4，5，5a，6，7，8，9，9a，10，11，11a-十四氢-1H-环戊并[1，2-i]菲-7-基酯(II)(1.00g，2.26mmol，1.0eq)溶解在无水四氢呋喃(10mL)中，加入到反应液中，体系升至室温，搅拌2小时。TLC监测反应TLC(石油醚∶乙酸乙酯＝10∶1)监测反应。反应完全后，反应液加入水(20mL)，乙酸乙酯萃取，饱和盐水洗涤，无水硫酸钠干燥，硅胶柱层析(石油醚∶乙酸乙酯＝90∶10)得到白色固体乙酸(1R，3aR，5aR，7S，9aS，11aR)-1-[(2R，4E)-5-甲氧基戊-4-烯-2-基]-3a，6，6，9a，11a-五甲基-2，3，3a，4，5，5a，6，7，8，9，9a，10，11，11a-十四氢-1H-环戊并[1，2-i]菲-7-基酯(37-1)(850mg，1.81mmol，纯度80％，收率64.1％)。1H NMR(400MHz，CDCl3)δ6.28(d，J＝12.6Hz，1H)，5.85(d，J＝6.2Hz，1H)，4.71(d，J＝12.6Hz，1H)，4.50(dd，J＝11.5，4.5Hz，1H)，4.31(d，J＝6.5Hz，1H)，3.58(s，1H)，3.52-3.47(m，2H)，2.09-1.88(m，10H)，1.80-1.24(m，15H)，1.21-1.11(m，2H)，1.00(s，3H)，0.93-0.83(m，12H)，0.69(s，3H).
第四步 乙酸(1R，3aR，5aR，7S，9aS，11aR)-1-[(2R，4E)-5-甲氧基戊-4-烯-2-基]-3a，6，6，9a，11a-五甲基-2，3，3a，4，5，5a，6，7，8，9，9a，10，11，11a-十四氢-1H-环戊并[1，2-i]菲-7-基酯(37-1)(700mg，1.49mmol，1.0eq)溶解在稀盐酸中(5mol/L，20mL)和THF(20mL)的混合溶剂中，反应液加热到50℃，搅拌2小时，TLC(石油醚∶乙酸乙酯＝10∶1)监测反应。反应完全后，反应液用乙酸乙酯萃取，饱和盐水洗涤，无水硫酸干燥，硅胶柱层析纯化(石油醚∶乙酸乙酯＝95∶5 to 85∶15)得到白色固体乙酸(1R，3aR，5aR，7S，9aS，11aR)-1-[(2R)-5-甲酰基戊-2-基]-3a，6，6，9a，11a-五甲基-2，3，3a，4，5，5a，6，7，8，9，9a，10，11，11a-十四氢-1H-环戊并[1，2-i]菲-7-基酯(98-1)(500mg，1.09mmol，纯度80％，收率58.5％)。1H NMR(400MHz，CDCl3)δ9.77(t，J＝1.7Hz，1H)，4.50(dd，J＝11.6，4.5Hz，1H)，2.40(td，J＝7.9，1.7Hz，2H)，2.12-1.97(m，7H)，1.96-1.85(m，1H)，1.78-1.63(m，7H)，1.59-1.24(m，9H)，1.21-1.06(m，3H)，1.00(s，3H)，0.90(dd，J＝17.5，5.5Hz，12H)，0.69(s，3H).13C NMR(101MHz，CDCl3)δ202.99，171.02，134.43，134.30，129.64，115.29，80.93，77.33，77.02，76.70，50.51，50.24，49.82，44.50，44.35，37.81，36.90，36.31，35.74，35.27，30.96，30.79，28.19，27.92，26.38，24.24，24.18，21.33，20.99，19.19，18.96，18.57，18.12，16.53，15.75，-0.00.
第五步 乙酸(1R，3aR，5aR，7S，9aS，11aR)-1-[(2R)-5-甲酰基戊-2-基]-3a，6，6，9a，11a-五甲基-2，3，3a，4，5，5a，6，7，8，9，9a，10，11，11a-十四氢-1H-环戊并[1，2-i]菲-7-基酯(98-1)(80mg，0.18mmol，1.0eq)溶解在无水四氢呋喃(5mL)中，0°氮气保护下加入乙基氯化镁(0.9mL，1.80mmol，2.0mol/L，10eq)，TLC(石油醚∶乙酸乙酯＝5∶1)监测反应。反应完全后，氯化铵淬灭反应，乙酸乙酯萃取，无水硫酸钠干燥，硅胶柱层析纯化(石油醚∶乙酸乙酯＝90∶10)得到白色固体(1R，3aR，5aR，7S，9aS，11aR)-1-[(2R)-6-羟基辛-2-基]-3a，6，6，9a，11a-五甲基-2，3，3a，4，5，5a，6，7，8，9，9a，10，11，11a-十四氢-1H-环戊并[1，2-a]菲-7-醇(102)(45mg，0.10mmol，纯度95％，收率52.8％).1H NMR(400MHz，CDCl3)δ3.52-3.40(m，1H)，3.17(dd，J＝11.5，4.5Hz，1H)，2.00-1.91(m，4H)，1.88-1.81(m，1H)，1.68-1.58(m，5H)，1.54-1.42(m，6H)，1.35-1.22(m，7H)，1.20-1.05(m，4H)，0.98(dd，J＝12.6，2.1Hz，2H)，0.92(d，J＝7.8Hz，6H)，0.88(t，J＝7.5Hz，3H)，0.83(d，J＝6.4Hz，3H)，0.81(s，3H)，0.74(s，3H)，0.62(s，3H).13C NMR(101MHz，CDCl3)δ128.14，128.11，56.83，55.93，50.50，47.42，44.73，38.67，38.62，37.78，36.88，30.83，30.66，27.82，27.78，26.49，26.42，24.17，24.05，21.23，21.17，19.20，19.16，16.50，13.75，13.56.LC-MS：[M-17]+＝427.35
实施例129
化合物129(1R，3aR，5aR，7S，9aS，11aR)-1-[(2R)-4-(3，3-二甲基氧杂环丙-2-基)丁-2-基]-3a，6，6，9a，11a-五甲基-2，3，3a，4，5，5a，6，7，8，9，9a，10，11，11a-十四氢-1H-环戊并[1，2-a]菲-7-醇的制备
第一步 将白色固体乙酸(1R，3aR，5aR，7S，9aS，11aR)-3a，6，6，9a，11a-五甲基-1-[(2R)-6-甲基庚-5-烯-2-基]-2，3，3a，4，5，5a，6，7，8，9，9a，10，11，11a-十四氢-1H-环戊并[2，1-i]菲-7-基酯(I)(4.0g，4.2mmol，1.0eq)溶于DCM(二氯甲烷)(100mL)中，加入碳酸氢钠(0.39g，4.7mmol，1.1eq)，间氯过氧苯甲酸(0.88g，5.1mmol，1.2eq)。室温反应1小时TLC(PE∶EtOAc＝5∶1，磷钼酸)，检测反应完成。反应液用饱和碳酸氢钠溶液清洗两次(100mL x2)，硫酸钠干燥，浓缩。柱层析纯化(PE∶EtOAc＝1∶10～1∶3)得到白色固体乙酸(1R，3aR，5aR，7S，9aS，11aR)-1-[(2R)-4-(3，3-二甲基氧杂环丙-2-基)丁-2-基]-3a，6，6，9a，11a-五甲基-2，3，3a，4，5，5a，6，7，8，9，9a，10，11，11a-十四氢-1H-环戊并[2，1-i]菲-7-基酯(129-1)(1.6g，纯度85％，收率65.7％)。1H NMR(400MHz，CDCl3)：δ4.50(dd，J＝11.5，4.5Hz，1H)，2.69(t，J＝6.2Hz，1H)，2.05-2.00(m，8H)，1.67-1.31(m，17H)，1.35-1.08(m，8H)，1.01-0.96(m，3H)，0.96-0.85(m，11H)，0.72-0.57(m，3H).
第三步 将原料乙酸(1R，3aR，5aR，7S，9aS，11aR)-1-[(2R)-4-(3，3-二甲基氧杂环丙-2-基)丁-2-基]-3a，6，6，9a，11a-五甲基-2，3，3a，4，5，5a，6，7，8，9，9a，10，11，11a-十四氢-1H-环戊并[2，1-i]菲-7-基酯(129-1)(1.0g，2.1mmol，1eq)溶于THF(四氢呋喃)(40mL)中，氮气保护，冰浴下加入氢化铝里(0.16g，4.2mmol，2eq)。室温反应1.5小时。TLC(PE∶EtOAc＝5∶1，磷钼酸)。反应结束后加入十合水硫酸钠淬灭，过滤，滤液浓缩。柱层析纯化(DCM∶MeOH＝1∶10～1∶5)。得到白色固体(1R，3aR，5aR，7S，9aS，11aR)-1-[(2R)-4-(3，3-二甲基氧杂环丙-2-基)丁-2-基]-3a，6，6，9a，11a-五甲基-2，3，3a，4，5，5a，6，7，8，9，9a，10，11，11a-十四氢-1H-环戊并[1，2-a]菲-7-醇(129)(600mg，纯度90％，收率59.13％)。1H NMR(400MHz，CDCl3)δ3.24(dd，J＝11.5，4.5Hz，1H)，2.69(t，J＝6.2Hz，1H)，2.11-1.88(m，6H)，1.76-1.51(m，12H)，1.32-1.22(m，8H)，1.07-0.97(m，8H)，0.93-0.86(m，7H)，0.81(s，3H)，0.70(s，3H).13C NMR(101MHz，CDCl3)δ134.45，134.35，78.97，77.34，77.23，77.03，76.71，64.94，64.80，58.43，58.14，50.41，50.38，50.29，49.82，44.51，38.89，37.03，36.34，36.22，35.59，32.81，32.62，31.00，30.98，30.83，28.24，28.20，27.97，27.85，26.50，25.91，25.62，24.95，24.94，24.25，21.00，19.15，18.75，18.68，18.65，18.58，18.26，15.76，15.42
实施例147
化合物147(1R，3aR，5aR，7S，9aS，11aR)-1-[(2R)-6-羟基-6-甲基庚-2-基]-3a，6，6，9a，11a-五甲基-2，3，3a，5，5a，6，7，8，9，9a，11，11a-十二氢-1H-环戊并[1，2-a]菲-7-醇的制备
第一步(1R，3aR，5aR，7S，9aS，11aR)-3a，6，6，9a，11a-五甲基-1-[(2R)-6-甲基庚-5-烯-2-基]-2，3，3a，4，5，5a，6，7，8，9，9a，10，11，11a-十四氢-1H-环戊并[1，2-a]菲-7-醇(10.00g，23.45mmol，1.0eq)溶解于DCM(250mL)中，完全溶解后依次向反应体系中加入乙酸酐(6.7mL，70.36mmol，3.0eq)，DMAP(0.57g，4.69mmol，0.2eq)和TEA(16mL，117.25mmol，5.0eq)，加料完毕后在室温下搅拌2小时。TLC(石油醚∶EtOAc＝5∶1)监测反应完全后，用甲醇(10mL)萃灭，反应液用饱和碳酸氢钠(～100mL)和水(～100mL)各洗涤一次，无水硫酸钠干燥，浓缩，在浓缩快干时，加入甲醇(～100mL)，冰浴下搅拌30分钟，抽滤，滤饼用少量甲醇淋洗，滤饼干燥得到白色固体乙酸(1R，3aR，5aR，7S，9aS，11aR)-3a，6，6，9a，11a-五甲基-1-[(2R)-6-甲基庚-5-烯-2-基]-2，3，3a，4，5，5a，6，7，8，9，9a，10，11，11a-十四氢-1H-环戊并[2，1-i]菲-7-基酯(I)(9g，19.2mmol，纯度90.0％，收率73.7％)。1H NMR(400MHz，CDCl3)：δ5.10(s，1H)，4.50(dd，J＝11.5，4.6Hz，1H)，2.08-1.97(m，8H)，1.95-1.82(m，2H)，1.76-1.58(m，10H)，1.58-1.43(m，4H)，1.42-1.22(n，6H)，1.20-1.14(m，3H)，1.00(s，3H)，0.95-0.83(m，15H).13C NMR(400MHz，CDCl3)：δ203.21，171.00，134.37，134.32，99.99，80.90，77.34，77.02，76.71，50.50，50.30，49.82，44.54，41.14，37.81，36.90，36.08，36.03，35.27，30.95，30.78，28.24，28.15，27.91，26.38，24.23，24.17，21.33，20.98，19.19，18.46，18.40，18.11，16.53，15.78.
第二步 乙酸(1R，3aR，5aR，7S，9aS，11aR)-3a，6，6，9a，11a-五甲基-1-[(2R)-6-甲基庚-5-烯-2-基]-2，3，3a，4，5，5a，6，7，8，9，9a，10，11，11a-十四氢-1H-环戊并[2，1-i]菲-7-基酯(I)(15.00g，32.00mmol，1.0eq)溶于DCM(二氯甲烷)(300mL)中，氮气置换，体系冰浴下降温到0℃，通入臭氧，鼓气10min。TLC(石油醚∶EtOAc＝5∶1)监测反应。停止通气后，体系用氮气置换后直接浓缩至干，粗产物用快速色谱法分离纯化(石油醚∶乙酸乙酯＝95∶5 to90∶10，磷钼酸烤板)纯化，得到白色固体乙酸(1R，3aR，5aR，7S，9aS，11aR)-1-[(2R)-4-甲酰基丁-2-基]-3a，6，6，9a，11a-五甲基-2，3，3a，4，5，5a，6，7，8，9，9a，10，11，11a-十四氢-1H-环戊并[2，1-i]菲-7-基酯(II)(6.50g，14.68mmol，纯度95.5％，收率43.8％)。1H NMR(400MHz，CDCl3)：δ9.77(t，J＝1.9Hz，1H)，4.50(dd，J＝11.6，4.5Hz，1H)，2.51-2.30(m，2H)，2.09-1.88(m，8H)，1.86-1.24(m，17H)，1.23-1.12(m，2H)，0.99(d，J＝11.2Hz，3H)，0.93-0.84(m，12H)。
第三步(甲氧基甲基)三苯基氯化磷(3.87g，11.32mmol，5.0eq)溶解在无水四氢呋喃(40mL)中，体系冰水浴降温到0℃，加入NaHMDS(11mL，1mol/L，5.0eq)，搅拌20分钟后，乙酸(1R，3aR，5aR，7S，9aS，11aR)-1-[(2R)-4-甲酰基丁-2-基]-3a，6，6，9a，11a-五甲基-2，3，3a，4，5，5a，6，7，8，9，9a，10，11，11a-十四氢-1H-环戊并[1，2-i]菲-7-基酯(II)(1.00g，2.26mmol，1.0eq)溶解在无水四氢呋喃(10mL)中，加入到反应液中，体系升至室温，搅拌2小时。TLC(石油醚∶乙酸乙酯＝10∶1)监测反应。反应完全后，反应液加入水(20mL)，乙酸乙酯萃取，饱和盐水洗涤，无水硫酸钠干燥，硅胶柱层析(石油醚∶乙酸乙酯＝90∶10)得到白色固体乙酸(1R，3aR，5aR，7S，9aS，11aR)-1-[(2R，4E)-5-甲氧基戊-4-烯-2-基]-3a，6，6，9a，11a-五甲基-2，3，3a，4，5，5a，6，7，8，9，9a，10，11，11a-十四氢-1H-环戊并[1，2-i]菲-7-基酯(37-1)(850mg，1.81mmol，纯度80％，收率64.1％)。1H NMR(400MHz，CDCl3)δ6.28(d，J＝12.6Hz，1H)，5.85(d，J＝6.2Hz，1H)，4.71(d，J＝12.6Hz，1H)，4.50(dd，J＝11.5，4.5Hz，1H)，4.31(d，J＝6.5Hz，1H)，3.58(s，1H)，3.52-3.47(m，2H)，2.09-1.88(m，10H)，1.80-1.24(m，15H)，1.21-1.11(m，2H)，1.00(s，3H)，0.93-0.83(m，12H)，0.69(s，3H).
第四步 乙酸(1R，3aR，5aR，7S，9aS，11aR)-1-[(2R，4E)-5-甲氧基戊-4-烯-2-基]-3a，6，6，9a，11a-五甲基-2，3，3a，4，5，5a，6，7，8，9，9a，10，11，11a-十四氢-1H-环戊并[1，2-i]菲-7-基酯(37-1)(700mg，1.49mmol，1.0eq)溶解在稀盐酸中(5mol/L，20mL)和THF(20mL)的混合溶剂中，反应液加热到50℃，搅拌2小时，TLC(石油醚∶乙酸乙酯＝10∶1)监测反应完全。反应液用乙酸乙酯萃取，饱和盐水洗涤，无水硫酸干燥，硅胶柱层析纯化(石油醚∶乙酸乙酯＝95∶5 to 85∶15)得到白色固体乙酸(1R，3aR，5aR，7S，9aS，11aR)-1-[(2R)-5-甲酰基戊-2-基]-3a，6，6，9a，11a-五甲基-2，3，3a，4，5，5a，6，7，8，9，9a，10，11，11a-十四氢-1H-环戊并[1，2-i]菲-7-基酯(98-1)(500mg，1.09mmol，纯度80％，收率58.5％)。1H NMR(400MHz，CDCl3)δ9.77(t，J＝1.7Hz，1H)，4.50(dd，J＝11.6，4.5Hz，1H)，2.40(td，J＝7.9，1.7Hz，2H)，2.12-1.97(m，7H)，1.96-1.85(m，1H)，1.78-1.63(m，7H)，1.59-1.24(m，9H)，1.21-1.06(m，3H)，1.00(s，3H)，0.90(dd，J＝17.5，5.5Hz，12H)，0.69(s，3H).13C NMR(101MHz，CDCl3)δ202.99，171.02，134.43，134.30，129.64，115.29，80.93，77.33，77.02，76.70，50.51，50.24，49.82，44.50，44.35，37.81，36.90，36.31，35.74，35.27，30.96，30.79，28.19，27.92，26.38，24.24，24.18，21.33，20.99，19.19，18.96，18.57，18.12，16.53，15.75
第五步称取乙酸(3aR，7S，9aS，11aR)-1-[(2R)-5-甲酰基戊-2-基]-3a，6，6，9a，11a-五甲基-2，3，3a，4，5，5a，6，7，8，9，9a，10，11，11a-十四氢-1H-环戊并[1，2-i]菲-7-基酯(98-1)(830mg，1.82mmol，1.0eq.)，加入水(14.0mL)，叔丁醇(90mL)，室温下依次加入2-甲基-2-丁烯(2.5g，36.35mmol，20.0eq.)，磷酸二氢钠(2.4g，20.0mmol，10.0eq.)，亚氯酸钠(493mg，5.4mmol，3.0eq.)，室温下搅拌2个小时，TLC(石油醚∶乙酸乙酯＝3∶1)监测反应结束后，浓缩除去叔丁醇，随后浓缩液中加入水(10.0mL)，再以乙酸乙酯(10.0mL*3)萃取，有机相合并，干燥，浓缩得(5R)-5-[(3aR，7S，9aS，11aR)-7-乙酰基氧基-3a，6，6，9a，11a-五甲基-2，3，3a，4，5，5a，6，7，8，9，9a，10，11，11a-十四氢-1H-环戊并[1，2-a]菲-1-基]己酸(147-1)(1.05g，1.77mmol，97.78％)。1H NMR(399MHz，CDCl3)δ4.48(dd，J＝11.6，4.5Hz，1H)，2.42-2.22(m，2H)，2.03(s，4H)，1.98(s，2H)，1.94-1.85(m，1H)，1.76-1.63(m，8H)，1.51(dd，J＝20.7，7.5Hz，4H)，1.41(s，2H)，1.32-1.24(m，3H)，1.13(d，J＝14.2Hz，3H)，0.98(s，3H)，0.90(d，J＝6.3Hz，3H)，0.86(d，J＝4.8Hz，9H)，0.67(s，3H).
第六步 称取(5R)-5-[(3aR，7S，9aS，11aR)-7-乙酰基氧基-3a，6，6，9a，11a-五甲基-2，3，3a，4，5，5a，6，7，8，9，9a，10，11，11a-十四氢-1H-环戊并[1，2-a]菲-1-基]己酸(147-1)(1.0g，2.12mmol，1.0eq.)，溶于甲醇(100mL)中，室温下加入浓硫酸(3d)，随后升温至80℃下搅拌2.5个小时，TLC(石油醚∶乙酸乙酯＝10∶1)监测反应结束后，浓缩除去甲醇，随后经柱层析(石油醚∶乙酸乙酯＝50∶1～10∶1)得(5R)-5-[(3aR，7S，9aS，11aR)-7-羟基-3a，6，6，9a，11a-五甲基-2，3，3a，4，5，5a，6，7，8，9，9a，10，11，11a-十四氢-1H-环戊并[1，2-a]菲-1-基]己酸甲酯(147-2)(0.24g，0.54mmol)。1H NMR(399MHz，CDCl3)δ3.65(s，3H)，3.21(dd，J＝11.6，4.4Hz，1H)，2.25(dt，J＝16.7，8.5Hz，2H)，2.00(s，4H)，1.88(dd，J＝22.1，8.8Hz，1H)，1.77-1.61(m，7H)，1.54(s，2H)，1.41(d，J＝16.3Hz，3H)，1.32-1.11(m，5H)，1.03(d，J＝10.6Hz，2H)，0.97(d，J＝7.9Hz，6H)，0.89(d，J＝6.1Hz，3H)，0.85(s，3H)，0.79(s，3H)，0.67(s，3H).13C NMR(101MHz，CDCl3)δ174.34，134.32，78.95，77.30，77.19，76.98，76.67，51.43，50.37，50.18，49.78，44.45，38.86，36.99，36.16，35.67，35.55，34.53，30.93，30.80，28.12，27.94，27.82，26.47，24.23，21.76，20.97，19.12，18.57，18.23，15.71，15.39.
第七步称取(5R)-5-[(3aR，7S，9aS，11aR)-7-羟基-3a，6，6，9a，11a-五甲基-2，3，3a，4，5，5a，6，7，8，9，9a，10，11，11a-十四氢-1H-环戊并[1，2-a]菲-1-基]己酸甲酯(147-2)(100mg，0.23mmol，1.0eq.)，溶于二氯甲烷(10mL)中，随后在冰浴下加入间氯过氧苯甲酸(77.61mg，0.45mmol，2.0eq.)，加完后恢复至室温继续搅拌，TLC(石油醚∶乙酸乙酯＝10∶1，)监测反应结束后，加入饱和碳酸氢钠水溶液(5.0mL)，以二氯甲烷(5.0mL*3)萃取，有机相干燥浓缩得(5R)-5-[(2S，5S，7S，11R，14R，15R)-5-羟基-2，6，6，11，15-五甲基-18-氧杂五环[8.7.1.01，10.011，15.02，7]十八烷-14-基]己酸甲酯(147-3)(140mg，0.21mmol，94.6％)。1H NMR(399MHz，CDCl3)δ3.65(s，3H)，3.32-3.09(m，1H)，2.25(dd，J＝15.0，7.7Hz，2H)，1.97-1.80(m，5H)，1.73-1.58(m，7H)，1.49(dd，J＝25.3，12.7Hz，6H)，1.36-1.24(m，6H)，1.10(s，3H)，0.92(s，3H)，0.87(d，J＝6.9Hz，6H)，0.75(d，J＝6.8Hz，6H).
第八步称取(5R)-5-[(2S，5S，7S，11R，14R，15R)-5-羟基-2，6，6，11，15-五甲基-18-氧杂五环[8.7.1.01，10.011，15.02，7]十八烷-14-基]己酸甲酯(147-3)(140mg，0.30mmol，1.0eq.)，溶于丙酮(10mL)中，室温下加入浓硫酸(3滴)，随后在室温下搅拌5个小时，TLC(石油醚∶乙酸乙酯＝10∶1)监测反应结束后，浓缩除去丙酮，加入饱和碳酸氢钠水溶液(10.0mL)，再以乙酸乙酯(8.0mL*3)萃取，有机相分离，干燥，浓缩得(5R)-5-[(3aR，7S，9aS，11aR)-7-羟基-3a，6，6，9a，11a-五甲基-2，3，3a，5，5a，6，7，8，9，9a，11，11a-十二氢-1H-环戊并[1，2-a]菲-1-基]己酸甲酯(147-4)(120mg，0.22mmol，71.36％)。1H NMR(399MHz，CDCl3)δ5.44(s，1H)，5.29(d，J＝6.0Hz，1H)，3.65(s，3H)，3.23(dd，J＝11.3，4.5Hz，1H)，2.26(dd，J＝16.1，8.6Hz，2H)，2.15(s，1H)，2.05(dd，J＝17.4，6.0Hz，3H)，2.00-1.89(m，3H)，1.70(dd，J＝10.7，5.9Hz，3H)，1.61-1.51(m，3H)，1.39(dd，J＝16.0，7.2Hz，3H)，1.31-1.17(m，2H)，1.11-1.04(m，2H)，0.98(t，J＝8.2Hz，6H)，0.92-0.80(m，9H)，0.54(s，3H).
第九步称取(5R)-5-[(3aR，7S，9aS，11aR)-7-羟基-3a，6，6，9a，11a-五甲基-2，3，3a，5，5a，6，7，8，9，9a，11，11a-十二氢-1H-环戊并[1，2-a]菲-1-基]己酸甲酯(147-4)(120mg，0.27mmol，1.0eq.)，溶于四氢呋喃(5.0mL)中，降温至-10℃～0℃，随后滴加甲基锂的乙醚溶液(59.6mg，2.7mmol，10.0eq.)监测反应，后恢复至室温并在室温下搅拌2个小时，，加入饱和氯化铵水溶液(10.0mL)，再以乙酸乙酯(7.0mL*3)萃取，有机相分离，干燥，浓缩，制备板纯化得(3aR，7S，9aS，11aR)-1-[(2R)-6-羟基-6-甲基庚-2-基]-3a，6，6，9a，11a-五甲基-2，3，3a，5，5a，6，7，8，9，9a，11，11a-十二氢-1H-环戊并[1，2-a]菲-7-醇(147)(25mg，0.056mmol，20.53％)1H NMR(399MHz，CDCl3)δ5.45(s，1H)，5.28(s，1H)，3.23(dd，J＝11.0，4.1Hz，1H)，2.19(d，J＝18.5Hz，1H)，2.07(t，J＝11.9Hz，3H)，1.98(d，J＝13.1Hz，2H)，1.67(d，J＝11.8Hz，2H)，1.52-1.48(m，2H)，1.47-1.34(m，6H)，1.25(s，2H)，1.24(s，3H)，1.20(s，6H)，1.07(dd，J＝10.8，5.0Hz，2H)，0.98(d，J＝9.6Hz，6H)，0.91-0.84(m，9H)，0.55(s，3H).13C NMR(100MHz，CDCl3)δ145.85，142.65，120.14，116.27，78.93，77.30，77.18，76.98，76.66，71.10，51.00，50.28，49.08，44.36，43.72，38.67，37.79，37.33，36.63，36.21，35.68，31.47，30.91，29.67，29.31，29.17，28.11，27.90，27.77，25.55，22.97，22.71，21.08，18.45，15.76，15.62，0.99.LC-MS：[M-17]+＝425.35
实施例114
化合物114(1R，3aR，5aR，7S，9aS，11aR)-7-羟基-1-[(2R)-6-羟基-6-甲基庚-2-基]-3a，6，6，9a，11a-五甲基-2，3，3a，4，5，5a，6，7，8，9，9a，10，11，11a-十四氢-1H-环戊并[1，2-a]菲-4-酮的制备
将化合物(1R，3aR，5aR，7S，9aS，11aR)-1-[(2R)-6-羟基-6-甲基庚-2-基]-3a，6，6，9a，11a-五甲基-2，3，3a，5，5a，6，7，8，9，9a，11，11a-十二氢-1H-环戊并[1，2-a]菲-7-醇(147)(240mg，0.54mmol，1.0eq.)溶于冰醋酸(5.0mL)中，氮气保护下，冰浴降温至0℃，随后滴加双氧水(浓度31％，0.7mL，7.07mmol，13.0eq.)，滴加完后继续在冰浴下搅拌10分钟，随后渐渐升至室温搅拌，TLC监测(PE∶EtOAc＝2∶1，254nm显色，Rf1＝0.5，Rf2＝0.2)，反应结束后，反应液澄清，浓缩，制备TLC纯化得白色固体(1R，3aR，5aR，7S，9aS，11aR)-7-羟基-1-[(2R)-6-羟基-6-甲基庚-2-基]-3a，6，6，9a，11a-五甲基-2，3，3a，4，5，5a，6，7，8，9，9a，10，11，11a-十四氢-1H-环戊并[1，2-a]菲-4-酮(114)(160mg，0.31mmol，56.62％)。1H NMR(399MHz，CDCl3)δ3.30-3.17(m，1H)，2.40(d，J＝13.1Hz，1H)，2.28(dd，J＝11.6，7.7Hz，1H)，2.09-1.92(m，2H)，1.82(d，J＝12.4Hz，1H)，1.74(dd，J＝13.8，6.1Hz，2H)，1.66-1.58(m，4H)，1.46-1.30(m，8H)，1.23(s，3H)，1.19(s，6H)，1.14(s，3H)，1.07-1.02(m，1H)，0.97(s，3H)，0.87(d，J＝13.4Hz，9H)，0.62(d，J＝7.9Hz，3H).13CNMR(100MHz，CDCl3)δ199.11，164.88，138.92，77.90，77.30，76.98，76.67，71.09，49.77，49.03，47.72，44.87，44.33，39.73，38.88，36.61，36.34，34.75，31.96，30.07，29.67，29.31，29.17，28.77，28.06，27.38，24.97，23.64，21.03，18.73，18.32，15.74，15.26.LC-MS：[M+1]+＝459.55
实施例139
化合物139
[(1R，3aR，5aR，7S，9aS，11aR)-1-[(2R)-6-羟基-6-甲基庚-2-基]-3a，6，6，9a，11a-五甲基-2，3，3a，4，5，5a，6，7，8，9，9a，10，11，11a-十四氢-1H-环戊并[1，2-a]菲-7-基]氧磺酸的制备
将(1R，3aR，5aR，7S，9aS，11aR)-1-[(2R)-6-羟基-6-甲基庚-2-基]-3a，6，6，9a，11a-五甲基-2，3，3a，4，5，5a，6，7，8，9，9a，10，11，l1a-十四氢-1H-环戊并[1，2-a]菲-7-醇(68)(100mg，0.22mmol，1eq)溶于Pyridine(吡啶)(6mL)中，氮气保护，室温下加入三甲基铵三氧化硫共聚物(93.88mg，0.67mmol，3eq)。反应1小时。TLC(DCM∶MeOH＝10∶1，磷钼酸)。反应液导入0℃石油醚中析出白色固体，过滤。柱层析纯化(DCM∶MeOH＝1∶10)。得到白色固体[(1R，3aR，5aR，7S，9aS，11aR)-1-[(2R)-6-羟基-6-甲基庚-2-基]-3a，6，6，9a，11a-五甲基-2，3，3a，4，5，5a，6，7，8，9，9a，10，11，11a-十四氢-1H-环戊并[1，2-a]菲-7-基]氧磺酸(139)(19.9mg，纯度93.2％，收率21.1％)。
1H NMR(400MHz，DMSO)δ3.61(dd，J＝11.8，4.2Hz，1H)，2.06-1.85(m，6H)，1.82-1.50(m，6H)，1.48-1.38(m，3H)，1.31(dd，J＝23.8，13.4Hz，5H)，1.22-1.11(m，3H)，1.05(s，6H)，1.03-0.96(m，2H)，0.93(d，J＝9.1Hz，6H)，0.88(d，J＝6.3Hz，3H)，0.84(d，J＝7.1Hz，3H)，0.78-0.60(m，5H).13C NMR(101MHz，DMSO)δ134.06，83.02，69.25，51.23，50.57，49.85，44.61，44.50，40.60，40.39，40.18，39.97，39.76，39.55，39.34，38.49，36.94，36.90，36.42，35.63，29.87，29.67，28.46，28.25，24.92，24.52，21.04，20.97，19.42，19.03，18.33，16.91，16.06.
实施例140
化合物140 3-{[(1R，3aR，5aR，7S，9aS，11aR)-1-[(2R)-6-羟基-6-甲基庚-2-基]-3a，6，6，9a，11a-五甲基-2，3，3a，4，5，5a，6，7，8，9，9a，10，11，11a-十四氢-1H-环戊并[1，2-a]菲-7-基]氧基}-3-氧亚基丙酸的制备
第一步 将(1R，3aR，5aR，7S，9aS，11aR)-1-[(2R)-6-羟基-6-甲基庚-2-基]-3a，6，6，9a，11a-五甲基-2，3，3a，4，5，5a，6，7，8，9，9a，10，11，11a-十四氢-1H-环戊并[1，2-a]菲-7-醇(68)(200mg，0.450mmol，1.0eq)溶解在THF(四氢呋喃)(5mL)中并将反应体系置换成氮气氛围，滴加3-氯-3-氧亚基丙酸甲酯(61.44mg，0.450mmol，3eq)，反应混合液在室温搅拌1hr。TLC(PE∶EtOAc＝5∶1，磷钼酸烤板)显示反应已经完成，停止反应。将水(20mL)加入到反应体系中，用EA(乙酸乙酯)(3×25mL)萃取，合并有机相用饱和食盐水(20mL)洗涤，然后用无水硫酸钠干燥，过滤，浓缩得到粗产物。粗产物用快速色谱法分离纯化(PE∶EtOAc＝92∶8to 90∶10)得到白色固体3.甲氧基.3-氧亚基丙酸(1R，3aR，5aR，7S，9aS，11aR)-1-[(2R)-6-羟基-6-甲基庚-2-基]-3a，6，6，9a，11a-五甲基-2，3，3a，4，5，5a，6，7，8，9，9a，10，11，11a-十四氢-1H-环戊并[1，2-i]菲-7-基酯(140-1)(160mg，纯度90％，收率62.04％)。1H NMR(400MHz，CDCl3)δ4.50(dd，J＝11.7，4.4Hz，1H)，3.68(s，3H)，3.32(s，2H)，1.96(dd，J＝13.3，7.7Hz，5H)，1.83(d，J＝7.5Hz，1H)，1.65(m，6H)，1.40(d，J＝15.8Hz，8H)，1.36-1.17(m，8H)，1.15(s，5H)，0.95(d，J＝11.8Hz，4H)，0.86-0.78(m，13H)，0.62(s，3H).
第二步将原料3-甲氧基-3-氧亚基丙酸(1R，3aR，5aR，7S，9aS，11aR)-1-[(2R)-6-羟基-6-甲基庚-2-基]-3a，6，6，9a，11a-五甲基-2，3，3a，4，5，5a，6，7，8，9，9a，10，11，11a-十四氢-1H-环戊并[1，2-i]菲-7-基酯(140-1)(100mg，0.18mmol，1 eq)溶于EtOH(乙醇)(20mL)和水(5mL)中，滴加2N氢氧化钠水溶液(1mL)。将反应体系置换成氮气氛围，室温反应搅拌2hr。TLC(DCM∶MeOH＝10∶1，磷钼酸烤板)监测反应完全，停止反应。反应液使用1 NHCl酸化至PH＝3～4后，浓缩掉乙醇后用EA(乙酸乙酯)(20mL×3)萃取，合并的有机相用饱和食盐水(50mL)洗涤，然后用无水硫酸钠干燥，过滤，浓缩得到粗产物。粗产物用快速色谱法分离纯化(DCM∶MeOH＝96∶4)得到白色固体3-{[(1R，3aR，5aR，7S，9aS，11aR)-1-[(2R)-6-羟基-6-甲基庚-2-基]-3a，6，6，9a，11a-五甲基-2，3，3a，4，5，5a，6，7，8，9，9a，10，11，11a-十四氢-1H-环戊并[1，2-a]菲-7-基]氧基}-3-氧亚基丙酸(140)(39.29mg，纯度80.60％，收率41.06％)。1H NMR(400MHz，CDCl3)δ4.63(dd，J＝11.3，4.8Hz，1H)，3.44(s，2H)，2.07-1.98(m，4H)，1.95-1.88(m，1H)，1.80-1.62(m，6H)，1.60-1.50(m，1H)，1.50-1.34(m，7H)，1.33-1.26(m，2H)，1.25(s，2H)，1.22(s，6H)，1.16(d，J＝11.9Hz，2H)，1.01(s，3H)，0.91(t，J＝3.0Hz，6H)，0.88(d，J＝4.4Hz，6H)，0.69(s，3H).13C NMR(101MHz，CDCl3)δ168.62，168.07，134.64，134.05，83.44，71.34，50.50，50.49，49.81，44.48，44.36，40.16，37.93，36.87，36.71，36.48，35.18，30.94，30.81，29.30，29.18，28.24，27.90，26.34，24.29，24.04，21.12，21.03，19.18，18.69，18.08，16.46，15.77.
实施例141
化合物141羟基乙酸(1R，3aR，5aR，7S，9aS，11aR)-1-[(2R)-6-羟基-6-甲基庚-2-基]-3a，6，6，9a，11a-五甲基-2，3，3a，4，5，5a，6，7，8，9，9a，10，11，11a-十四氢-1H-环戊并[1，2-i]菲-7-基酯的制备
第一步将(1R，3aR，5aR，7S，9aS，11aR)-1-[(2R)-6-羟基-6-甲基庚-2-基]-3a，6，6，9a，11a-五甲基-2，3，3a，4，5，5a，6，7，8，9，9a，10，11，11a-十四氢-1H-环戊并[1，2-a]菲-7-醇(68)(200mg，0.45mmol，1.0eq)溶解在THF(四氢呋喃)(5mL)中并将反应体系置换成氮气氛围，滴加(苄基氧基)乙酰氯(124mg，0.67mmol，1.5eq)，室温搅拌18hr。TLC(PE∶EtOAc＝5∶1，磷钼酸烤板)显示反应已经完成，停止反应。将水(20mL)加入到反应体系中，用EA(乙酸乙酯)(3×25mL)萃取，合并的有机相用饱和食盐水(20mL)洗涤，然后用无水硫酸钠干燥，过滤，浓缩得到粗产物。粗产物用快速色谱法分离纯化(PE∶EtOAc＝92∶8 to 90∶10)得到白色固体(苄基氧基)乙酸(1R，3aR，5aR，7S，9aS，11aR)-1-[(2R)-6-羟基-6-甲基庚-2-基]-3a，6，6，9a，11a-五甲基-2，3，3a，4，5，5a，6，7，8，9，9a，10，11，11a-十四氢-1H-环戊并[1，2-i]菲-7-基酯(141-1)(180mg，纯度95％，收率64.13％)。1H NMR(400MHz，CDCl3)δ7.40-7.28(m，5H)，4.67-4.60(m，3H)，4.10(s，1H)，2.08-1.98(m，4H)，1.92(dd，J＝13.4，7.7Hz，1H)，1.79-1.62(m，6H)，1.61-1.55(m，1H)，1.52-1.44(m，6H)，1.41-1.29(m，5H)，1.26(s，1H)，1.22(s，6H)，1.16(d，J＝12.4Hz，2H)，1.00(s，3H)，0.89(dd，J＝8.9，6.3Hz，12H)，0.69(s，3H).
第二步 将(苄基氧基)乙酸(1R，3aR，5aR，7S，9aS，11aR)-1-[(2R)-6-羟基-6-甲基庚-2-基]-3a，6，6，9a，11a-五甲基-2，3，3a，4，5，5a，6，7，8，9，9a，10，11，11a-十四氢-1H-环戊并[1，2-i]菲-7-基酯(141-1)(100mg，0.17mmol，1eq)溶于MeOH(甲醇)(10mL)中，然后加入钯碳(约55％水湿润)(10.79mg，0.10mmol，0.6eq)并将反应体系置换成氢气氛围，室温反应搅拌18hrs。TLC(PE∶EtOAc＝5∶1，磷钼酸烤板)监测反应完全，停止反应。反应液用硅藻土过滤收集滤液，滤液浓缩得到粗产物。粗产物用快速色谱法分离纯化(PE∶EtOAc＝85∶15 to80∶20)得到白色固体羟基乙酸(1R，3aR，5aR，7S，9aS，11aR)-1-[(2R)-6-羟基-6-甲基庚-2-基]-3a，6，6，9a，11a-五甲基-2，3，3a，4，5，5a，6，7，8，9，9a，10，11，11a-十四氢-1H-环戊并[1，2-i]菲-7-基酯(141)(49.86g，纯度97.54％，收率57.62％)。1H NMR(400MHz，CDCl3)δ4.65(dd，J＝11.4，4.7Hz，1H)，4.15(d，J＝1.3Hz，2H)，2.09-1.96(m，4H)，1.95-1.87(m，1H)，1.80-1.63(m，9H)，1.62-1.53(m，2H)，1.51-1.28(m，9H)，1.22(s，6H)，1.19-1.14(m，2H)，1.01(s，3H)，0.92-0.87(m，12H)，0.69(s，3H).13C NMR(101MHz，CDCl3)δ173.29，134.62，134.09，82.81，71.14，60.68，50.50，49.81，44.48，44.42，37.95，36.88，36.73，36.48，35.21，30.94，30.81，29.35，29.23，28.24，27.97，26.35，24.29，24.21，21.13，21.02，19.19，18.69，18.09，16.50，15.77，0.01.LC-MS：[M+H]+＝485.00
实施例142
化合物142 2-{[(1R，3aR，5aR，7S，9aS，11aR)-1-[(2R)-6-羟基-6-甲基庚-2-基]-3a，6，6，9a，11a-五甲基-2，3，3a，4，5，5a，6，7，8，9，9a，10，11，11a-十四氢-1H-环戊并[1，2-a]菲-7-基]氧基}-2-氧亚基乙酸的制备
参照实施例140，将第一步的3-氯-3-氧亚基丙酸甲酯换为2-氯-2-氧亚基乙酸甲酯，最终得到化合物2-{[(1R，3aR，5aR，7S，9aS，11aR)-1-[(2R)-6-羟基-6-甲基庚-2-基]-3a，6，6，9a，11a-五甲基-2，3，3a，4，5，5a，6，7，8，9，9a，10，11，11a-十四氢-1H-环戊并[1，2-a]菲-7-基]氧基}-2-氧亚基乙酸(142).1H NMR(400MHz，MeOD)δ4.63(s，1H)，2.20-1.93(m，5H)，1.91-1.73(m，5H)，1.72-1.86(m，15H)，1.26-1.20(m，6H)，1.14-1.08(m，3H)，1.08-0.88(m，12H)，0.85-0.72(m，3H).13CNMR(101MHz，MeOD)δ162.25，162.13，134.20，78.28，70.17，50.47，49.65，44.31，43.93，43.73，37.73，36.78，36.66，36.37，30.53，30.52，29.44，28.01，27.94，27.84，27.16，26.50，26.13，25.76，23.47，20.76，18.42，17.98，17.88，17.23，15.73，15.08.LC-MS：[M+H]+＝499.00
实施例143
化合物143(6R)-6-[(1R，3aR，5aR，7S，9aS，11aR)-7-[(2-羟基乙基)氧基]-3a，6，6，9a，11a-五甲基-2，3，3a，4，5，5a，6，7，8，9，9a，10，11，11a-十四氢-1H-环戊并[1，2-a]菲-1-基]-2-甲基庚-2-醇的制备
第一步将(1R，3aR，5aR，7S，9aS，11aR)-1-[(2R)-4-(3，3-二甲基氧杂环丙-2-基)丁-2-基]-3a，6，6，9a，11a-五甲基-2，3，3a，4，5，5a，6，7，8，9，9a，10，11，11a-十四氢-1H-环戊并[1，2-a]菲-7-醇(129)(360mg，0.81mmol，1.0eq)和醋酸铑(22.77mg，0.081mmol，0.1eq)置于封管中，加入DCM(二氯甲烷)(5mL)中，滴加重氮乙酸乙酯(463.89mg，4.066mmol，5.0eq)。反应混合物在氮气氛围，40℃搅拌18hr。TLC(PE∶EtOAc＝10∶1，磷钼酸烤板)显示反应已经完成，停止反应。将反应体系真空旋干得到。粗产物用快速色谱法分离纯化(PE∶EtOAc＝98∶2 to 97∶3)得到白色固体{[(1R，3aR，5aR，7S，9aS，11aR)-1-[(2R)-4-(3，3-二甲基氧杂环丙-2-基)丁-2-基]-3a，6，6，9a，11a-五甲基-2，3，3a，4，5，5a，6，7，8，9，9a，10，11，11a-十四氢-1H-环戊并[1，2-a]菲-7-基]氧基}乙酸乙酯(143-1)(230mg，纯度95％，收率48.15％)。1H NMR(400MHz，CDCl3)δ4.26(s，2H)，4.09(dd，J＝20.5，6.5Hz，2H)，2.92(dd，J＝11.7，3.9Hz，1H)，2.69(t，J＝6.1Hz，1H)，2.02(d，J＝3.5Hz，1H)，1.92(s，1H)，1.80-1.63(m，6H)，1.61-1.43(m，7H)，1.31(s，6H)，1.27(s，3H)，1.06(s，3H)，0.99(s，3H)，0.91(d，J＝6.0Hz，3H)，0.86(d，J＝4.2Hz，6H)，0.69(s，3H).
第二步 将{[(1R，3aR，5aR，7S，9aS，11aR)-1-[(2R)-4-(3，3-二甲基氧杂环丙-2-基)丁-2-基]-3a，6，6，9a，11a-五甲基-2，3，3a，4，5，5a，6，7，8，9，9a，10，11，11a-十四氢-1H-环戊并[1，2-a]菲-7-基]氧基}乙酸乙酯(143-1)(180mg，0.34mmol，1 eq)溶于THF(四氢呋喃)(10mL)中，将反应体系冷却至0℃，缓慢加入氢化铝锂(64.59mg，1.702mmol，5eq)，反应混合物在氮气氛围80℃反应18h。TLC(PE∶EtOAc＝5∶1，磷钼酸烤板)监测反应完全后，停止反应。反应体系冷却至室温后，过滤收集滤液，滤液浓缩得到粗产物。粗产物用快速色谱法分离纯化(PE∶EtOAc＝85∶15)(6R)-6-[(1R，3aR，5aR，7S，9aS，11aR)-7-[(2-羟基乙基)氧基]-3a，6，6，9a，11a-五甲基-2，3，3a，4，5，5a，6，7，8，9，9a，10，11，11a-十四氢-1H-环戊并[1，2-a]菲-1-基]-2-甲基庚-2-醇(143)(31.20mg，纯度98.69％，收率18.38％)。1H NMR(400MHz，CDCl3)δ3.76-3.68(m，3H)，3.46-3.39(m，1H)，2.85(dd，J＝11.7，4.0Hz，1H)，2.07-1.98(m，4H)，1.96-1.86(m，1H)，1.83-1.66(m，5H)，1.56-1.34(m，9H)，1.33-1.24(m，2H)，1.22(s，6H)，1.16(d，J＝9.4Hz，2H)，1.05(dd，J＝12.5，2.1Hz，2H)，0.99(d，J＝3.2Hz，6H)，0.93-0.86(m，6H)，0.82(s，3H)，0.69(s，3H).13C NMR(101MHz，CDCl3)δ134.46，134.40，87.28，71.13，70.49，62.30，50.82，50.52，49.81，44.50，44.42，38.98，36.99，36.74，36.47，35.44，31.01，30.83，29.35，29.21，28.25，28.17，26.46，24.27，23.48，21.12，21.04，19.17，18.69，18.15，16.30，15.75.LC-MS：[M+H]+＝417.00
实施例144
化合物144{[(1R，3aR，5aR，7S，9aS，11aR)-1-[(2R)-6-羟基-6-甲基庚-2-基]-3a，6，6，9a，11a-五甲基-2，3，3a，4，5，5a，6，7，8，9，9a，10，11，11a-十四氢-1H-环戊并[1，2-a]菲-7-基]氧基}乙酸的制备
参照实施例140，将第一步的{[(1R，3aR，5aR，7S，9aS，11aR)-1-[(2R)-4-(3，3-二甲基氧杂环丙-2-基)丁-2-基]-3a，6，6，9a，11a-五甲基-2，3，3a，4，5，5a，6，7，8，9，9a，10，11，11a-十四氢-1H-环戊并[1，2-a]菲-7-基]氧基}乙酸乙酯(143-1)换为(1R，3aR，5aR，7S，9aS，11aR)-1-[(2R)-6-羟基-6-甲基庚-2-基]-3a，6，6，9a，11a-五甲基-2，3，3a，4，5，5a，6，7，8，9，9a，10，11，11a-十四氢-1H-环戊并[1，2-a]菲-7-醇(68)，最终得到化合物{[(1R，3aR，5aR，7S，9aS，11aR)-1-[(2R)-6-羟基-6-甲基庚-2-基]-3a，6，6，9a，11a-五甲基-2，3，3a，4，5，5a，6，7，8，9，9a，10，11，11a-十四氢-1H-环戊并[1，2-a]菲-7-基]氧基}乙酸(144).1H NMR(400MHz，CDCl3)δ4.12(dd，J＝61.1，16.2Hz，2H)，3.03(dd，J＝11.8，3.4Hz，1H)，2.09-1.97(m，4H)，1.97-1.87(m，1H)，1.83-1.65(m，5H)，1.63-1.52(m，3H)，1.49-1.29(m，8H)，1.25(s，2H)，1.22(s，6H)，1.19-1.12(m，J＝11.4Hz，2H)，1.03(s，3H)，1.00(s，3H)，0.91(d，J＝6.1Hz，3H)，0.87(s，6H)，0.69(s，3H).13C NMR(101MHz，CDCl3)δ171.09，134.64，134.13，89.01，71.19，66.84，50.68，50.51，49.80，44.48，44.39，38.84，36.92，36.73，36.46，35.21，30.95，30.80，29.70，29.34，29.20，28.22，26.40，24.29，23.30，21.11，21.04，19.14，18.69，18.10，16.31，15.75.LC-MS：[M+H]+＝485.00
实施例145
化合物145(1R，5aR，9aS，11aR)-1-[(2R)-6-羟基-6-甲基庚-2-基]-6，6，7，9a，11a-五甲基-2，3，3a，4，5，5a，6，7，8，9，9a，10，11，11a-十四氢-1H-环戊并[1，2-a]菲-7-醇的制备
将(1R，3aR，5aR，9aS，11aR)-1-[(2R)-6-羟基-6-甲基庚-2-基]-3a，6，6，9a，11a-五甲基-2，3，3a，4，5，5a，6，7，8，9，9a，10，11，11a-十四氢-1H-环戊并[1，2-a]菲-7-酮(71)(120mg，0.280mmol，1.0eq)溶解在THF(四氢呋喃)(10mL)中，将反应体系冷却至0℃，缓慢加入甲基氯化镁(3MinTHF，0.933mL，2.800mmol，6eq)，反应混合物在氮气氛围室温反应18h。TLC(PE∶EtOAc＝5∶1，磷钼酸烤板)显示反应已经完成，停止反应。体系中加入水(40mL)稀释，用EtOAc(乙酸乙酯)(30mL×3)萃取，合并的有机相用饱和食盐水(50mL)洗涤，然后用无水硫酸钠干燥，过滤，浓缩得到粗产物。粗产物用快速色谱法分离纯化(PE∶EtOAc＝92∶8 to91∶1)得到白色固体(1R，5aR，9aS，11aR)-1-[(2R)-6-羟基-6-甲基庚-2-基]-6，6，7，9a，11a-五甲基-2，3，3a，4，5，5a，6，7，8，9，9a，10，11，1la-十四氢-1H-环戊并[1，2-a]菲-7-醇(145)(24.63mg，纯度92.03％，收率19.39％)。1H NMR(400MHz，CDCl3)δ2.08-1.98(m，4H)，1.93-1.88(m，1H)，1.67-1.57(m，4H)，1.49-1.42(m，10H)，1.40-1.31(m，5H)，1.22(s，3H)，1.00(s，1H)，0.92-0.86(m，4H)，0.69(s，3H).13C NMR(101MHz，CDCl3)δ134.26，75.20，71.13，50.49，49.78，48.53，44.51，44.43，36.75，36.75，30.98，30.84，29.35，29.22，29.22，28.57，28.25，26.60，25.37，24.35，23.32，21.13，21.12，19.40，18.96，18.82，18.69，18.69，15.75.LC-MS：[M+H]+＝441.00
实施例150
化合物150(1R，3aR，5aR，7S，9aS，11aR)-7-羟基-1-[(2R)-6-羟基辛-2-基]-3a，6，6，9a，11a-五甲基-2，3，3a，4，5，5a，6，7，8，9，9a，10，11，11a-十四氢-1H-环戊并[1，2-a]菲-4-酮的制备
第一步(1R，3aR，5aR，7S，9aS，11aR)-1-[(2R)-6-羟基辛-2-基]-3a，6，6，9a，11a-五甲基-2，3，3a，4，5，5a，6，7，8，9，9a，10，11，11a-十四氢-1H-环戊并[1，2-a]菲-7-醇(102)(2g，4.50mmol，1.0eq)溶解在二氯甲烷(100mL)中，依次加入乙酸酐(2.1mL，22.49mmol，5.0eq)，DMAP(0.11g，0.90mmol，0.2eq)和三乙胺(3.13mL，22.49mmol，5.0eq)。室温搅拌2小时，TLC(PE∶EtOAc＝10∶1，磷钼酸烤板)监测反应，反应结束后，反应液用甲醇淬灭，分别用饱和碳酸氢钠和饱和盐水洗涤，有机相无水硫酸钠干燥，硅胶柱层析纯化，无水硫酸钠干燥，硅胶柱层析纯化得到白色蜡状物乙酸-(7R)-7-[(1R，3aR，5aR，7S，9aS，11aR)-7-乙酰氧基-3a，6，6，9a，11a-五甲基-2，3，3a，4，5，5a，6，7，8，9，9a，10，11，11a-十四氢-1H-环戊并[1，2-a]菲-1-基]辛-3-基酯(150-1)(2.5g，4.02mmol，89.4％)。1H NMR(400MHz，CDCl3)δ4.82(d，J＝5.5Hz，1H)，4.50(dd，J＝11.5，4.5Hz，1H)，2.08-1.97(m，10H)，1.94-1.85(m，1H)，1.78-1.59(m，7H)，1.55-1.23(m，11H)，1.16(dd，J＝17.5，8.2Hz，3H)，1.01(d，J＝7.9Hz，4H)，0.88(t，J＝6.6Hz，15H)，0.68(s，3H).
第二步 乙酸-(7R)-7-[(1R，3aR，5aR，7S，9aS，11aR)-7-乙酰氧基-3a，6，6，9a，11a-五甲基-2，3，3a，4，5，5a，6，7，8，9，9a，10，11，11a-十四氢-1H-环戊并[1，2-a]菲-1-基]辛-3-基酯(150-1)(2.5g，4.73mmol，1.0eq)溶解在二氯甲烷(100mL)中，氮气保护冰水浴下，分批加入m-CPBA(0.82g，4.73mmol，1.0eq)，随后转至室温反应，TLC(PE∶EtOAc＝10∶1，磷钼酸烤板)监测反应，反应结束后，随后用饱和亚硫酸氢钠淬灭，饱和碳酸氢钠洗涤，饱和盐水洗涤，有机相用无水硫酸钠干燥，硅胶柱层析纯化(PE∶EtOAc＝95∶5 to 85∶15)得到白色蜡状物乙酸-2-[(2R，5R，6R，11S)-5-[(2R)-6-乙酰氧基辛-2-基]-2，6，10，10-四甲基-14-氧杂四环[7.4.1.01，9.02，6]十四烷-11-基]-2-甲基丙基酯(150-2)(2g，2.94mmol，62.1％)。1H NMR(400MHz，CDCl3)δ4.81(s，1H)，4.46(s，1H)，2.04(d，J＝6.9Hz，7H)，1.99-1.81(m，5H)，1.76-1.67(m，4H)，1.66-1.45(m，11H)，1.34(m，11H)，0.97(d，J＝9.5Hz，2H)，0.87(dd，J＝11.7，7.0Hz，13H)，0.82(s，3H)，0.76(s，3H).
第三步 乙酸-2-[(2R，5R，6R，11S)-5-[(2R)-6-乙酰氧基辛-2-基]-2，6，10，10-四甲基-14-氧杂四环[7.4.1.01，9.02，6]十四烷-11-基]-2-甲基丙基酯(150-2)(1.9g，3.49mmol，1.0eq)溶解在丙酮(100mL)中，加入浓硫酸10滴，TLC(PE∶EtOAc＝10∶1，磷钼酸烤板)监测反应，反应结束后，旋蒸掉丙酮，加入乙酸乙酯100mL，饱和碳酸氢啊洗涤，再用饱和盐水洗涤，无水硫酸钠干燥，硅胶柱层析纯化(PE∶EtOAc＝90∶10 to 80∶20)得到白色固体乙酸-(7R)-7-[(1R，3aR，5aR，7S，9aS，11aR)-7-乙酰氧基-3a，6，6，9a，11a-五甲基-2，3，3a，5，5a，6，7，8，9，9a，11，11a-十二氢-1H-环戊并[1，2-a]菲-1-基]辛-3-基酯(150-3)(1g，1.71mmol，49.0％)。1H NMR(400MHz，CDCl3)δ5.53(s，1H)，5.39(d，J＝6.0Hz，1H)，4.89(t，J＝6.1Hz，1H)，4.59(dd，J＝11.1，4.8Hz，1H)，2.20-2.10(m，9H)，2.10-2.03(m，2H)，1.81(ddd，J＝11.7，7.5，3.5Hz，2H)，1.75-1.53(m，9H)，1.49-1.32(m，8H)，1.29-1.22(m，2H)，1.08(s，3H)，1.03(s，3H)，0.98-0.93(m，15H)，0.63(s，3H).13C NMR(101MHz，CDCl3)δ170.99，170.96，145.60，142.78，119.87，116.58，80.83，77.33，77.01，76.70，75.58，75.51，50.99，50.32，49.25，43.72，37.82，37.61，37.23，36.20，36.17，36.04，36.00，35.40，34.03，31.88，31.59，31.48，28.09，27.91，27.07，26.91，26.88，25.52，24.26，22.82，22.78，22.66，22.19，22.14，21.33，21.28，18.42，18.40，16.93，15.65，14.12，9.62，9.59.
第四步 乙酸-(7R)-7-[(1R，3aR，5aR，7S，9aS，11aR)-7-乙酰氧基-3a，6，6，9a，11a-五甲基-2，3，3a，5，5a，6，7，8，9，9a，11，11a-十二氢-1H-环戊并[1，2-a]菲-1-基]辛-3-基酯(150-3)(0.9g，1.71mmol，1.0eq)溶解在冰醋酸(30mL)中，氮气保护冰水浴下，滴加30％双氧水(1.7mL，17.1mmol，10.0eq)，保温搅拌10分钟后，反应升至室温搅拌，TLC(PE∶EtOAc＝10∶1，磷钼酸烤板)监测反应，反应结束后，加入乙酸乙酯稀释，饱和盐水洗涤2次，有机相无水硫酸钠干燥，浓缩干得到粗品乙酸-(7R)-7-[(1R，3aS，5aR，7S，9aS，11aR)-7-乙酰氧基-3a，6，6，9a，11a-五甲基-4-氧亚基-2，3，3a，3b，4，5，5a，6，7，8，9，9a，11，11a-十四氢-1H-环戊并[1，2-a]菲-1-基]辛-3-基酯(150-4)(350mg，0.52mmol，30.2％)，粗品直接投入下一步。
第五步乙酸-(7R)-7-[(1R，3aS，5aR，7S，9aS，11aR)-7-乙酰氧基-3a，6，6，9a，11a-五甲基-4-氧亚基-2，3，3a，3b，4，5，5a，6，7，8，9，9a，11，11a-十四氢-1H-环戊并[1，2-a]菲-1-基]辛-3-基酯(150-4)(200mg，0.37mmol)溶在氯仿(3mL)和甲醇(1.5mL)的混合溶剂中，氮气保护，冰水浴下，滴加浓盐酸(36％-38％)(0.18mL)。保温搅拌10分钟后，转至室温反应。TLC(PE∶EtOAc＝10∶1，磷钼酸烤板)监测反应，反应结束后，反应加水稀释，乙酸乙酯萃取3次，有机相无水硫酸钠干燥，硅胶柱层析纯化(PE∶EtOAc＝80∶20)得到乙酸-(7R)-7-[(1R，3aR，5aR，7S，9aS，11aR)-7-乙酰氧基-3a，6，6，9a，11a-五甲基-4-氧亚基-2，3，3a，4，5，5a，6，7，8，9，9a，10，11，11a-十四氢-1H-环戊并[1，2-a]菲-1-基]辛-3-基酯(150-5)(100mg，0.12mmol，32.5％)。1H NMR(400MHz，CDCl3)δ4.85-4.76(m，1H)，4.51(dd，J＝11.6，4.3Hz，1H)，2.42(t，J＝8.6Hz，1H)，2.29(dt，J＝17.0，6.9Hz，1H)，2.06(d，J＝5.6Hz，6H)，2.00-1.90(m，1H)，1.84-1.69(m，5H)，1.60-1.46(m，5H)，1.41-1.20(m，8H)，1.19-1.13(m，3H)，1.02(m，2H)，0.96(d，J＝8.2Hz，3H)，0.86(m，14H)，0.63(d，J＝8.5Hz，2H).13C NMR(101MHz，CDCl3)δ198.73，171.01，170.83，79.62，77.34，77.02，76.70，75.53，49.86，49.03，47.79，44.90，39.62，37.76，36.45，36.27，34.50，34.05，31.99，30.09，27.38，27.10，26.91，25.02，23.85，23.70，22.12，21.29，21.24，18.72，18.44，16.37，15.79，9.62，9.59.
第六步 乙酸-(7R)-7-[(1R，3aR，5aR，7S，9aS，11aR)-7-乙酰氧基-3a，6，6，9a，11a-五甲基-4-氧亚基-2，3，3a，4，5，5a，6，7，8，9，9a，10，11，11a-十四氢-1H-环戊并[1，2-a]菲-1-基]辛-3-基酯(150-5)(100mg，0.18mmol，1.0eq)溶解在无水四氢呋喃(1mL)溶液中，氮气保护，0度下滴加甲基氯化镁溶液(0.307mL)，随手转至室温反应，TLC(PE∶EtOAc＝10∶1，磷钼酸烤板)监测反应，反应结束后，饱和氯化铵溶液淬灭，乙酸乙酯萃取，无水硫酸钠干燥，硅胶柱层析纯化(PE∶EtOAc＝80∶20)得到白色固体(1R，3aR，5aR，7S，9aS，11aR)-7-羟基-1-[(2R)-6-羟基辛-2-基]-3a，6，6，9a，11a-五甲基-2，3，3a，4，5，5a，6，7，8，9，9a，10，11，11a-十四氢-1H-环戊并[1，2-a]菲-4-酮(150)(14mg，0.03mmol，16.6％)。1HNMR(400MHz，CDCl3)δ3.58-3.48(s，1H)，3.28(dd，J＝11.5，4.5Hz，1H)，2.50-2.34(m，2H)，2.34-2.20(m，2H)，2.10-1.90(m，2H)，1.85(d，J＝13.0Hz，1H)，1.80-1.69(m，4H)，1.63(dd，J＝12.3，5.4Hz，1H)，1.46-1.23(m，12H)，1.17(s，3H)，1.00(s，3H)，1.10-1.04(m，1H)，0.94(dd，J＝13.6，5.2Hz，9H)，0.88(s，3H)，0.65(s，3H).13C NMR(101MHz，CDCl3)δ199.03，164.75，139.01，77.95，77.32，77.01，76.69，73.43，73.35，49.85，49.01，47.77，44.92，39.77，38.92，37.50，37.37，36.65，36.39，36.28，36.17，34.83，32.00，30.28，30.14，28.77，27.44，25.00，23.66，22.44，22.30，18.77，18.34，15.79，15.27，9.84.LC-MS：[M+1]+＝459.3
实施例192
化合物192(1R，3aR，5aR，7S，9aS，11aR)-1-[(2R)-6-羟基辛-2-基]-3a，4，6，6，9a，11a-六甲基-2，3，3a，4，5，5a，6，7，8，9，9a，10，11，11a-十四氢-1H-环戊并[1，2-a]菲-4，7-二醇的制备的制备
乙酸-(7R)-7-[(1R，3aR，5aR，7S，9aS，11aR)-7-乙酰氧基-3a，6，6，9a，11a-五甲基-4-氧亚基-2，3，3a，4，5，5a，6，7，8，9，9a，10，11，11a-十四氢-1H-环戊并[1，2-a]菲-1-基]辛-3-基酯(150-5)(100mg，0.18mmol，1.0eq)溶解在无水四氢呋喃(1mL)溶液中，氮气保护，0℃下滴加甲基溴化镁溶液(0.5mL，3.0mol/L，10.0eq)，随后转至室温反应，TLC(石油醚∶乙酸乙酯＝1∶1，)监测反应。反应结束后，冰水浴下用饱和氯化钠溶液淬灭，乙酸乙酯萃取，无水硫酸钠干燥，硅胶柱层析纯化(石油醚∶乙酸乙酯＝90∶10)得到粗品，粗品再经过反相制备得到白色固体(1R，3aR，5aR，7S，9aS，11aR)-1-[(2R)-6-羟基辛-2-基]-3a，4，6，6，9a，11a-六甲基-2，3，3a，4，5，5a，6，7，8，9，9a，10，11，11a-十四氢-1H-环戊并[1，2-a]菲-4，7-二醇(192)(3.5mg，0.006mmol，纯度81％，收率7％)。1H NMR(400MHz，CDCl3)δ3.56-3.49(m，1H)，3.28-3.17(m，1H)，2.15-1.88(m，6H)，1.81-1.66(m，6H)，1.60-1.43(m，11H)，1.36-1.24(m，10H)，1.23-1.15(m，2H)，1.07(d，J＝4.4Hz，3H)，1.03-0.99(m，3H)，0.98-0.87(m，11H)，0.86-0.60(m，6H).13C NMR(101MHz，CDCl3)δ140.54，139.00，78.59，77.32，77.00，76.68，75.06，73.47，55.26，50.63，50.51，50.32，48.60，46.11，39.65，39.09，38.33，37.56，35.92，31.66，31.40，31.23，30.28，30.06，28.82，27.86，27.55，25.91，23.34，22.40，21.57，18.79，18.47，17.03，15.51，9.85LCMS(ESI)[M-OH]+＝457.4
实施例189
化合物189 2-羟基-N-[(1R，3aR，5aR，9aS，11aR)-1-[(2R)-6-羟基-6-甲基庚-2-基]-3a，6，6，9a，11a-五甲基-2，3，3a，4，5，5a，6，7，8，9，9a，10，11，11a-十四氢-1H-环戊并[1，2-a]菲-7-基]乙酰胺的制备
第一步将原料(1R，3aR，5aR，7S，9aS，11aR)-1-[(2R)-4-(3，3-二甲基氧杂环丙-2-基)丁-2-基]-3a，6，6，9a，11a-五甲基-2，3，3a，4，5，5a，6，7，8，9，9a，10，11，11a-十四氢-1H-环戊并[1，2-a]菲-7-醇(129)(3g，6.776mmol，1.0eq)，醋酸钠(1.84g，13.552mmol，2.0eq)溶解在DCM(二氯甲烷)(20mL)中，加入氯铬酸吡啶鎓(2.92g，13.552mmol，2.0eq)。反应混合物在氮气氛围室温搅拌18hr。TLC(石油醚∶乙酸乙酯＝5∶1监测。反应完成后，反应液用硅藻土过滤，滤液真空旋干得到粗产物。粗产物用快速色谱法分离纯化(石油醚∶乙酸乙酯＝90∶10)得到白色固体(1R，3aR，5aR，9aS，11aR)-1-[(2R)-4-(3，3-二甲基氧杂环丙-2-基)丁-2-基]-3a，6，6，9a，11a-五甲基-2，3，3a，4，5，5a，6，7，8，9，9a，10，11，11a-十四氢-1H-环戊并[1，2-a]菲-7-酮(189-1)(1.8g，纯度90％，收率54.2％)。1H NMR(400MHz，CDCl3)δ2.69(t，J＝6.1Hz，1H)，2.65-2.36(m，2H)，2.13-1.90(m，2H)，1.81-1.37(m，5H)，1.31(s，1H)，1.27(s，1H)，1.11(d，J＝9.3Hz，2H)，1.07(s，1H)，0.92(d，J＝6.1Hz，3H)，0.89(s，3H)，0.72(s，3H).
第二步 将原料(1R，3aR，5aR，9aS，11aR)-1-[(2R)-4-(3，3-二甲基氧杂环丙-2-基)丁-2-基]-3a，6，6，9a，11a-五甲基-2，3，3a，4，5，5a，6，7，8，9，9a，10，11，11a-十四氢-1H-环戊并[1，2-a]菲-7-酮(189-1)(1.8g，4.08mmol，1.0eq)和醋酸钠(1.67g，12.253mmol，3.0eq)溶解在EtOH(乙醇)(20mL)中，加入盐酸羟胺(0.85g，12.253mmol，3.0eq)，反应混合物在氮气氛围60℃搅拌3h。TLC(石油醚∶乙酸乙酯＝5∶1)监测。反应完成后，体系中加入水(40mL)稀释，用乙酸乙酯(30mL×3)萃取，合并的有机相用饱和食盐水(50mL)洗涤，然后用无水硫酸钠干燥，过滤，浓缩得到粗卢物。粗卢物用快速色谱法分离纯化(石油醚∶乙酸乙酯＝95∶5 to 92∶8)得到白色固体[(1R，3aR，5aR，7E，9aS，11aR)-1-[(2R)-4-(3，3-二甲基氧杂环丙-2-基)丁-2-基]-3a，6，6，9a，11a-五甲基-2，3，3a，4，5，5a，6，7，8，9，9a，10，11，11a-十四氢-1H-环戊并[1，2-a]菲-7-亚基]羟胺(189-2)(1.7g，纯度90％，收率82.2％)。1H NMR(400MHz，CDCl3)δ3.16-3.08(m，1H)，2.69(t，J＝6.1Hz，1H)，2.25(ddd，J＝15.5，12.8，5.8Hz，1H)，2.06(dt，J＝15.9，9.1Hz，4H)，1.96-1.85(m，2H)，1.74-1.33(m，14H)，1.31(s，4H)，1.27(s，3H)，1.20(s，4H)，1.11(s，3H)，1.10(s，3H)，0.92(d，J＝6.0Hz，3H)，0.87(s，3H)，0.71(s，3H).
第三步 将原料[(1R，3aR，5aR，7E，9aS，11aR)-1-[(2R)-4-(3，3-二甲基氧杂环丙-2-基)丁-2-基]-3a，6，6，9a，11a-五甲基-2，3，3a，4，5，5a，6，7，8，9，9a，10，11，11a-十四氢-1H-环戊并[1，2-a]菲-7-亚基]羟胺(189-2)(50mg，0.22mmol，1.0eq)溶解在THF(四氢呋喃)(5mL)中，将反应体系冷却至0℃，缓慢加入氢化铝锂(41.56mg，1.095mmol，5.0eq)，反应混合物在氮气氛围80℃反应18h。TLC(DCM∶MeOH＝10∶1)监测。反应完全后，反应体系冷却至室温后，过滤收集滤液，滤液浓缩得到粗产物。粗产物用快速色谱法分离纯化(DCM∶MeOH＝95∶5 to 94∶6)得到白色固体(6R)-6-[(1R，3aR，5aR，9aS，11aR)-7-氨基-3a，6，6，9a，11a-五甲基-2，3，3a，4，5，5a，6，7，8，9，9a，10，11，11a-十四氢-1H-环戊并[1，2-a]菲-1-基]-2-甲基庚-2-醇(189-3)(20mg，纯度90％，收率12.3％)。
1H NMR(400MHz，CDCl3)δ2.65(dd，J＝12.0，3.3Hz，1H)，2.09-1.88(m，11H)，1.82-1.57(m，8H)，1.52-1.35(m，9H)，1.22(s，6H)，1.06(s，3H)，0.98(s，3H)，0.92-0.87(m，9H)，0.68(s，3H).
第四步 将原料羟基乙酸(18.85mg，0.25mmol，1.1eq)溶解于DMF(N，N-二甲基甲酰胺)(10mL)中，加入HATU(102.82mg，0.27mmol，1.2eq)和N，N-二异丙基乙基胺(0.074mL，0.451mmol，2eq)后将反应体系置换成氮气氛围。反应混合物在室温搅拌30min后，加入(6R)-6-[(1R，3aR，5aR，9aS，11aR)-7-氨基-3a，6，6，9a，11a-五甲基-2，3，3a，4，5，5a，6，7，8，9，9a，10，11，11a-十四氢-1H-环戊并[1，2-a]菲-1-基]-2-甲基庚-2-醇(189-3)(100mg，0.225mmol，1eq)，继续保持室温搅拌3h。TLC(石油醚∶乙酸乙酯＝1∶2)监测。反应完全后，体系中加入水(40mL)稀释，用乙酸乙酯(40mL×3)萃取，合并的有机相用饱和食盐水(50mL)洗涤，然后用无水硫酸钠干燥，过滤，浓缩得到粗产物。粗产物用快速色谱法分离纯化(石油醚∶乙酸乙酯＝45∶55 to 34∶66)得到白色固体2-羟基-N-[(1R，3aR，5aR，9aS，11aR)-1-[(2R)-6-羟基-6-甲基庚-2-基]-3a，6，6，9a，11a-五甲基-2，3，3a，4，5，5a，6，7，8，9，9a，10，11，11a-十四氢-1H-环戊并[1，2-a]菲-7-基]乙酰胺(189)(19.64mg，纯度84.66％，收率16.44％)。19.64mg，0.037mmol，16.44％).1H NMR(400MHz，DMSO)δ7.03(d，J＝9.9Hz，1H)，5.49(t，J＝5.8Hz，1H)，4.03(s，1H)，3.87-3.75(m，2H)，3.55-3.44(m，1H)，2.05-1.83(m，6H)，1.74-1.52(m，7H)，1.48-1.28(m，8H)，1.24-1.13(m，4H)，1.05(s，6H)，0.94(d，J＝4.6Hz，3H)，0.90-0.86(m，7H)，0.79(s，3H)，0.77(s，6H)，0.67(s，3H).13C NMR(101MHz，DMSO)δ171.40，134.55，134.21，69.24，61.82，55.72，51.43，50.56，49.89，44.62，44.48，38.18，36.99，36.94，36.51，36.42，31.04，30.86，29.89，29.70，28.86，28.25，26.48，25.94，24.53，21.03，20.91，19.30，19.03，18.59，16.84，16.10.LCMS[M+H]+＝502.5
实施例190
化合物190 N-[(1R，3aR，5aR，9aS，11aR)-1-[(2R)-6-羟基-6-甲基庚-2-基]-3a，6，6，9a，11a-五甲基-2，3，3a，4，5，5a，6，7，8，9，9a，10，11，l1a-十四氢-1H-环戊并[1，2-a]菲-7-基]甲烷磺酰胺的制备
将原料(6R)-6-[(1R，3aR，5aR，9aS，11aR)-7-氨基-3a，6，6，9a，11a-五甲基-2，3，3a，4，5，5a，6，7，8，9，9a，10，11，11a-十四氢-1H-环戊并[1，2-a]菲-1-基]-2-甲基庚-2-醇(189-3)(50mg，0.11mmol，1.0eq)和三乙胺(0.047mL，0.34mmol，3.0eq)溶解在DCM(二氯甲烷)(10mL)中，将反应体系冷却至0℃后，加入甲基磺酰氯(15.53mg，0.14mmol，1.2eq)，反应混合物在氮气氛围室温搅拌2h。TLC(石油醚∶乙酸乙酯＝1∶2)监测。反应完成后，体系中加入水(40mL)稀释，用DCM(二氯甲烷)(20mL×3)萃取，合并的有机相用饱和食盐水(50mL)洗涤，然后用无水硫酸钠干燥，过滤，浓缩得到粗产物。粗产物用快速色谱法分离纯化(石油醚∶乙酸乙酯＝20∶80 to 10∶90)得到白色固体N-[(1R，3aR，5aR，7S，9aS，11aR)-1-[(2R)-6-羟基-6-甲基庚-2-基]-3a，6，6，9a，11a-五甲基-2，3，3a，4，5，5a，6，7，8，9，9a，10，11，11a-十四氢-1H-环戊并[1，2-a]菲-7-基]甲烷磺酰胺(190)(1.7g，纯度88.38％，收率24.08％)。1HNMR(400MHz，DMSO)δ7.41(d，J＝9.5Hz，1H)，4.03(s，1H)，3.46(d，J＝9.2Hz，1H)，2.10-1.85(m，6H)，1.82(s，3H)，1.77-1.52(m，6H)，1.50-1.40(m，3H)，1.39-1.28(m，6H)，1.21-1.11(m，4H)，1.05(s，6H)，0.94(s，3H)，0.89-0.85(m，6H)，0.77(s，3H)，0.75(s，3H)，0.67(s，3H).13C NMR(101MHz，DMSO)δ137.00，136.98，69.24，56.33，56.11，51.45，50.56，49.88，44.61，44.48，38.27，36.98，36.94，36.66，36.42，31.04，30.85，29.89，29.70，28.88，28.24，25.99，24.52，23.29，21.03，20.89，19.39，19.03，18.60，17.17，16.09LCMS：[M+H]+＝527.5。

Claims (14)

1.一种式VI所示化合物或其药学上可接受的盐：
其中，R3a和R3b的定义如下任一组中所述：
(i)R3a为H，R3b为-NHS(O)2CH3、-NHS(O)2CH2CH3、-NHS(O)2CH2CH2CH3、-NHS(O)2CF3、-NH-C(O)-CH2OH、-CH2OH、-CH2-C(O)-CH2OH、-OR3c或-CH(OH)-CH2CH2OH；R3c为-S(O)2OH、-C(O)-CH2COOH、-C(O)-CH2OH、-C(O)-COOH或-CH2CH2OH；和
(ii)R3a为CH3，R3b为-OH；
R22为
式VI中，*标记的碳原子为手性碳原子时，其为R构型、S构型或者两者的混合。
2.如权利要求1所述的式VI所示化合物或其药学上可接受的盐，其特征在于，R3a和R3b的定义如下任一组中所述：
(i)R3a为H，R3b为-NHS(O)2CH3、-NH-C(O)-CH2OH、-CH2OH、-CH2-C(O)-CH2OH、-OR3c或-CH(OH)-CH2CH2OH；R3c为-S(O)2OH、-C(O)-CH2COOH、-C(O)-CH2OH、-C(O)-COOH或-CH2CH2OH；和
(ii)R3a为CH3，R3b为-OH；
R22为
式VI中，*标记的碳原子为手性碳原子时，其为R构型、S构型或者两者的混合。
3.如权利要求1所述的式VI所示化合物或其药学上可接受的盐，其特征在于，R3a和R3b的定义如下任一组中所述：
(i)R3a为H，R3b为-NHS(O)2CH3、-OR3c或-CH(OH)-CH2CH2OH；R3c为-S(O)2OH、-C(O)-CH2COOH、-C(O)-CH2OH、-C(O)-COOH或-CH2CH2OH；
(ii)R3a为CH3，R3b为-OH；和
R22为
式VI中，*标记的碳原子为手性碳原子时，其为R构型、S构型或者两者的混合。
4.如权利要求1-3任一项所述的式VI所示化合物或其药学上可接受的盐，其特征在于，R3a为H，R3b为-NHS(O)2CH3、-NH-C(O)-CH2OH或-OR3c；或者，R3a为CH3，R3b为-OH。
5.如权利要求1-3任一项所述的式VI所示化合物或其药学上可接受的盐，其特征在于，其满足以下条件中的一种或多种：
(1)R3c为-C(O)-CH2COOH、-C(O)-CH2OH或-C(O)-COOH；和
(2)R3b为-OR3c。
6.如权利要求1-3任一项所述的式VI所示化合物或其药学上可接受的盐，其特征在于，R3a和R3b的定义如下任一组中所述：
a)R3a为H，R3b为-OR3c，R3c为-S(O)2OH；
b)R3a为H，R3b为-OR3c，R3c为-C(O)-CH2COOH；
c)R3a为H，R3b为-OR3c，R3c为-C(O)-CH2OH；
d)R3a为H，R3b为-OR3c，R3c为-C(O)-COOH；
e)R3a为H，R3b为-OR3c，R3c为-CH2CH2OH；
f)R3a为CH3，R3b为-OH；
g)R3a为H，R3b为-NHS(O)2CH3；
h)R3a为H，R3b为-NH-C(O)-CH2OH；
i)R3a为H，R3b为-CH2OH；
j)R3a为H，R3b-CH2-C(O)-CH2OH；和
k)R3a为H，R3b为-CH(OH)-CH2CH2OH。
7.如权利要求1-3任一项所述的式VI所示化合物或其药学上可接受的盐，其特征在于，所述式VI所示化合物为如下任一化合物：
8.一种式XI所示化合物或其药学上可接受的盐：
其中，R3d为H或R3c；R3c的定义如权利要求1-7任一项中所述；
R7a为H、F、CH3或CF3；
R7b为F或OH；
或者，R7a和R7b以及它们连接的碳原子一起形成
R22为
式XI中，*标记的碳原子为R构型、S构型或者两者的混合；#标记的碳原子为手性碳原子时，其为R构型、S构型或者两者的混合。
9.如权利要求8所述的式XI所示化合物或其药学上可接受的盐，其特征在于，其满足以下条件中的一种或多种：
(1)R3d为H；
(2)R22为或者，R22为和
(3)R7a为CH3，R7b为OH；或者，R7a和R7b以及它们连接的碳原子一起形成
10.如权利要求8所述的式XI所示化合物或其药学上可接受的盐，其特征在于，其满足以下条件中的一种或多种：R7a和R7b的定义如下任一组中所述：
a)R7a为H，R7b为F；
b)R7a为CF3，R7b为OH；
c)R7a为F，R7b为F；
d)R7a为CH3，R7b为OH；和
e)R7a和R7b以及它们连接的碳原子一起形成
11.如权利要求8所述的式XI所示化合物或其药学上可接受的盐，其特征在于，所述式XI所示化合物为如下任一化合物：
12.一种药物组合物，其包含：
(1)如权利要求1-7中任一项所述的式VI所示化合物或其药学上可接受的盐，和/或，如权利要求8-11中任一项所述的式XI所示化合物或其药学上可接受的盐；
以及(2)至少一种药用辅料。
13.一种如权利要求1-7中任一项所述的式VI所示化合物或其药学上可接受的盐、如权利要求8-11中任一项所述的式XI所示化合物或其药学上可接受的盐或如权利要求12所述的药物组合物在制备用于预防和/或治疗疾病的药物中的应用，其中所述疾病为肥胖、高脂血症、脂肪肝、糖尿病、动脉粥样硬化症、心脑血管疾病、肝癌或皮肤损伤。
14.一种如权利要求1-7中任一项所述的式VI所示化合物或其药学上可接受的盐、如权利要求8-11中任一项所述的式XI所示化合物或其药学上可接受的盐或如权利要求12所述的药物组合物在制备用于抑制SREBP通路的药物中的应用。
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