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CN116478245A - 通过受体介导的化学疗法治疗癌症的肽化合物和肽缀合物 - Google Patents

通过受体介导的化学疗法治疗癌症的肽化合物和肽缀合物 Download PDF

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CN116478245A
CN116478245A CN202310436312.6A CN202310436312A CN116478245A CN 116478245 A CN116478245 A CN 116478245A CN 202310436312 A CN202310436312 A CN 202310436312A CN 116478245 A CN116478245 A CN 116478245A
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compound
peptide
cancer
peptide compound
conjugate
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博尔汉·阿纳比
米歇尔·德米勒
阿兰·拉洛克
吉恩-克里斯托夫·柯里
辛迪亚·沙菲
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Transfert Plus SC
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Abstract

本公开涉及用于治疗癌症并且增加肽化合物的细胞内化的所述肽化合物和缀合化合物、制备过程、方法及它们的用途。所述肽化合物选自：如SEQ ID NO：9所示的GVRAKAGVRNMFKSESY；如SEQ ID NO：10所示的GVRAKAGVRN(Nle)FKSESY；和如SEQ ID NO：11所示的YKSLRRKAPRWDAPLR DPALRQLL；并且其中将至少一个保护基团和/或至少一种标记试剂与所述肽化合物连接。

Description

通过受体介导的化学疗法治疗癌症的肽化合物和肽缀合物
相关申请
本申请要求于2015年11月24日提交的美国专利申请序列号第62/259178号的优先权权益，其通过引用整体并入本文。
公开领域
本公开涉及用于治疗癌症的肽化合物和缀合化合物、制备过程、方法及它们的用途。
公开背景
癌症
根据最近的世界卫生组织(World Health Organization)报告(2014年2月)，2012年有820万患者死于癌症。因此，癌症在发展中国家和发达国家都是日益严重的健康问题。还据估计，在未来20年内，每年的癌症病例数量将从2012年的1400万增加到2200万(WHO,2014)。目前，癌症的经典治疗是化学疗法、放射疗法和手术。
对化学疗法的抗性仍然是癌症治疗失败的主要原因。这种抗性表型由许多机制导致。多重抗药性(MDR)及其驱动机制的"传统"理解过度简化了扰乱的细胞癌症网络的复杂性，并侧重于几个通路/基因家族(Orit,2013)。从那个角度来看，抗药性与药物外排的诱导、DNA修复的激活、靶蛋白中的变异、减少的药物摄取、改变的新陈代谢、隔离、和凋亡通路中的变化密切相关(Fodalet,2011；Gillet,2010)。最近，肿瘤内异质性也已经被推断是关于在起源于相同肿瘤内部的癌细胞之间观察到差异的抗药性的主要促进因素。的确，已发现许多原发性人类肿瘤含有遗传上不同的细胞亚群，其被报道主要是随机过程和微环境信号的结果。除了肿瘤内的遗传差异或异质性之外，治疗性抗性还可能由几种其它非遗传过程(诸如与染色质修饰或DNA甲基化相关的表观遗传改变(Sanz-Moreno,2008))引起。对这些过程的一项研究是在具有单一基因克隆的系统中被进行的，并且推断在肿瘤细胞之中存在功能变异性(Kreso，2013；Marusyk，2013)。显然，遗传和非遗传假设以及异质性的整合应该被包括在新的实验模型和计算模型的设计中，以便更好地描述和最终解决MDR问题。
多重抗药性
原发性肿瘤治疗的临床进展缓慢。与这些肿瘤治疗相关的问题之一是它们对抗癌药物的相对弱的应答(Zhou,2008；Silvia,2015)。化学疗法和免疫疗法的有效性受到癌细胞固有的或获得的MDR表型的损害。MDR表型中涉及的主要机制之一参与P-糖蛋白(P-gp)的表达，所述P-糖蛋白是从MDR细胞中泵出各种抗癌药物的膜转运蛋白。P-gp也在大量正常分泌组织(诸如肾脏、肝脏和肠)中被表达。在人类中，已经报道P-gp由两个MDR基因(MDR1和MDR3)编码。人MDR1赋予抗性表型，而人MDR3不赋予。因此，P-gp可以被认为是“监控器(guardian)”，其通过将药物从癌细胞中排出来限制药物的进入，从而防止它们达到细胞毒性浓度。
肿瘤异质性
肿瘤内和肿瘤间异质性
癌症是狡猾的敌人，正如科学家找到解决这些问题的新方法一样，揭示了新的复杂性。最近的希望已经被投入到新一代“靶向治疗剂”上，这些治疗剂针对癌细胞中的特定分子缺陷，允诺了比不精确的化学治疗剂更有效且更低毒性的疗法(Fisher,2013)。然而，研究人员现在认识到，他们之前可能已经低估癌症最古老和最有名的复杂性之一：肿瘤异质性。这部分地解释了靶向治疗剂的成功和失望，并且应该激励对当前研究策略进行更广阔的重新审视。
肿瘤异质性是指在原发性肿瘤及其转移瘤内或在同一组织病理学亚型肿瘤之间(分别为肿瘤内和肿瘤间)存在具有不同基因型和表型的细胞亚群，所述基因型和表型可能隐藏不同的生物学行为(Corbin,2013)。随着深度测序技术的出现，肿瘤内-和肿瘤间-异质性的程度和流行性越来越受到重视。肿瘤内异质性的特征构成常规病理评估的一部分，但其确定尚不构成临床决策过程的一部分。核多形性是肿瘤内异质性的另一实例，例如其导致乳腺癌分级。对于治疗癌症的临床医生而言，具有同一肿瘤类型的患者之间和同一患者的不同肿瘤位点之间的肿瘤行为显著变化也是显而易见的；后者通常表现为对疗法的差异或混合应答。
作为肿瘤进展和异质性模型的克隆进化
Nowell(1976)首次提出了癌症发展的克隆进化模型，并详细阐述了达尔文的自然选择模型(Darwinian models of natural selection)-即，遗传不稳定的细胞累积遗传改变，并且选择性压力有助于具有生物适应性优势的变体亚群的生长和存活。空间和时间异质性可以允许肿瘤作为一个整体适应波动的肿瘤微环境。总之，争论的是异质性肿瘤应被视为复杂的生态系统或群落，在其中即使是较小的肿瘤亚群也可能影响整个肿瘤的生长并从而积极维持肿瘤的异质性(Heppner,1984；Marusyk,2010；Bonavia,2011)。在这个模型中，亚克隆占据肿瘤微环境内不同的小生境(niches)，并且肿瘤“群落”的存活优势超过了个体亚群的存活优势；出于这个目的，亚克隆之间的关系可以是竞争性的、共生性的或互惠性的。
肿瘤异质性的临床意义
癌症异质性的问题(包括肿瘤病灶内和肿瘤病灶之间的亚群之间的关系)可能对癌症药物疗法具有深远的意义。试图利用肿瘤对关键增殖或存活通路的依赖性的靶向疗法已经显著改善了一系列固体肿瘤类型中的患者结果，但是在大多数晚期疾病病例中，靶向治疗剂不能帮助所有经分子选择的患者也是显然的，并且甚至在观察到临床益处时，其持续时间通常有限(Gore,2011；Diaz,2012)。肿瘤异质性可以部分解释这些临床现象，并且这促使开发一个更有效的规避MDR表型的平台。
公开概述
因此，第一方面是与选自式(I)、式(II)、式(III)、式(IV)、式(V)、式(VI)、式(VII)、式(VIII)、式(IX)、式(X)、式(XI)和式(XII)的化合物的化合物具有至少80％序列同一性的肽化合物：
X1X2X3X4X5GVX6AKAGVX7NX8FKSESY (I)(SEQ ID NO:1)
(X9)nGVX10AKAGVX11NX12FKSESY (II)(SEQ ID NO:2)
YKX13LRRX14APRWDX15PLRDPALRX16X17L (III)(SEQ ID NO:3)
YKX18LRR(X19)nPLRDPALRX20X21L (IV)(SEQ ID NO:4)
IKLSGGVQAKAGVINMDKSESM (V)(SEQ ID NO:5)
IKLSGGVQAKAGVINMFKSESY (VI)(SEQ ID NO:6)
IKLSGGVQAKAGVINMFKSESYK (VII)(SEQ ID NO:7)
GVQAKAGVINMFKSESY (VIII)(SEQ ID NO:8)
GVRAKAGVRNMFKSESY (IX)(SEQ ID NO:9)
GVRAKAGVRN(Nle)FKSESY (X)(SEQ ID NO:10)
YKSLRRKAPRWDAPLRDPALRQLL (XI)(SEQ ID NO:11)
YKSLRRKAPRWDAYLRDPALRQLL (XII)(SEQ ID NO:12)
YKSLRRKAPRWDAYLRDPALRPLL (XIII)(SEQ ID NO:13)
其中
X1、X2、X3、X4、X5、X6、X7、X8、X9、X10、X11、X12、X13、X14、X15、X18和X19独立地选自任何氨基酸；
X16、X17、X20和X21独立地选自Q、P、Y、I和L；
n是0、1、2、3、4或5；
当存在超过一个的X9时，所述X9中的每一个独立地选自任何氨基酸；
当存在超过一个的X19时，所述X9中的每一个独立地选自任何氨基酸；
并且其中将至少一个保护基团和/或至少一种标记试剂在N-和/或C-末端处任选地与所述肽连接。
在另一方面，提供了肽化合物，其实际上是本公开中描述的任何肽化合物，从其已省略或除去约5或6个氨基酸。
在另一方面，提供了肽化合物，其实际上是包含如先前呈现的肽化合物中所限定的至少5个或至少6个连续的氨基酸的化合物。
在另一方面，提供了肽化合物，其包括选自式(I)、式(II)、式(III)、式(IV)、式(V)、式(VI)、式(VII)、式(VIII)、式(IX)、式(X)、式(XI)和式(XII)的化合物的化合物：
X1X2X3X4X5GVX6AKAGVX7NX8FKSESY (I)(SEQ ID NO:1)
(X9)nGVX10AKAGVX11NX12FKSESY (II)(SEQ ID NO:2)
YKX13LRRX14APRWDX15PLRDPALRX16X17L (III)(SEQ ID NO:3)
YKX18LRR(X19)nPLRDPALRX20X21L (IV)(SEQ ID NO:4)
IKLSGGVQAKAGVINMDKSESM (V)(SEQ ID NO:5)
IKLSGGVQAKAGVINMFKSESY (VI)(SEQ ID NO:6)
IKLSGGVQAKAGVINMFKSESYK (VII)(SEQ ID NO:7)
GVQAKAGVINMFKSESY (VIII)(SEQ ID NO:8)
GVRAKAGVRNMFKSESY (IX)(SEQ ID NO:9)
GVRAKAGVRN(Nle)FKSESY (X)(SEQ ID NO:10)
YKSLRRKAPRWDAPLRDPALRQLL (XI)(SEQ ID NO:11)
YKSLRRKAPRWDAYLRDPALRQLL (XII)(SEQ ID NO:12)
YKSLRRKAPRWDAYLRDPALRPLL (XIII)(SEQ ID NO:13)其中
X1、X2、X3、X4、X5、X6、X7、X8、X9、X10、X11、X12、X13、X14、X15、X18和X19独立地选自任何氨基酸；
X16、X17、X20和X21独立地选自Q、P、Y、I和L；
n是0、1、2、3、4或5；
当存在超过一个的X9时，所述X9中的每一个独立地选自任何氨基酸；
当存在超过一个的X19时，所述X9中的每一个独立地选自任何氨基酸；
并且其中将至少一个保护基团和/或至少一种标记试剂在N-和/或C-末端处任选地与所述肽连接。
在本文公开的另一方面是具有式A-(B)n的缀合化合物，
其中
n是1、2、3或4；
A是如本公开所限定的肽化合物，其中所述肽任选地被保护基团保护；和
B是至少一种治疗剂，其中B与A连接。
在本文公开的另一方面是具有式A-(B)n的缀合化合物，
其中
n是1、2、3或4；
A是如本公开所限定的肽化合物，其中所述肽任选地被保护基团保护；和
B是至少一种治疗剂，其中B与A连接，在所述肽化合物的游离胺处、在所述肽化合物的N-末端位置处、在所述肽化合物的游离–SH处或在所述肽化合物的游离羧基处连接。
本文公开的另一方面是具有式A-(B)n的缀合化合物
其中
n是1、2、3或4；
A是如本公开所限定的肽化合物，其中所述肽任选地被保护基团保护；和
B是至少一种治疗剂，其中B与A连接，在所述肽化合物的赖氨酸残基的游离胺处任选地经由接头连接，或在所述肽化合物的N-末端位置处任选地经由接头。
在另一方面，提供了用于制备本文公开的缀合化合物的方法，所述方法包括：
使接头与所述治疗剂一起反应以获得中间体；
任选地纯化所述中间体；
使所述中间体与所述肽化合物一起反应以获得所述缀合化合物，在其中所述治疗剂经由所述接头与所述肽化合物连接；和
任选地纯化所述缀合化合物；
其中所述治疗剂在赖氨酸残基的游离胺处或在N-末端处与所述肽化合物连接；并且其中所述肽化合物包含与其连接的1、2、3或4个治疗剂分子。
在另一方面，提供了治疗癌症的方法，其包括向有需要的对象施用本文公开的治疗有效量的至少一种化合物。
在另一方面，提供了治疗涉及分拣蛋白表达的癌症的方法，其包括使表达分拣蛋白的至少一种癌细胞与如至少一种本文所限定的化合物接触。
在另一方面，提供了治疗涉及分拣蛋白表达的疾病的方法，其包括向有需要的对象施用至少一种如本文所限定的治疗有效量的化合物。
在另一方面，提供了本文公开的化合物用于治疗癌症的用途。
另一方面是文库，其包含本文公开的化合物中的至少两种。
另一方面是脂质体、石墨烯或纳米颗粒，其包含至少一种如本公开所限定的化合物。
另一方面是脂质体、石墨烯或纳米颗粒，其被用至少一种如本公开所限定的化合物包被。
另一方面是脂质体、石墨烯或纳米颗粒，其负载有至少一种治疗剂或siRNA，并且脂质体被用至少一种如本公开所限定的化合物包被。
另一方面涉及药物递送系统，其包含如本公开所限定的此类脂质体、石墨烯或纳米颗粒。
另一方面是如本公开所限定的此类脂质体、石墨烯或纳米颗粒在药物递送系统中的用途。
另一方面涉及多聚体，其包含两个或更多个本文公开的化合物。
附图简述
根据如通过附图中的实例说明的具体实施方案的以下描述，本公开的另外特征和优势将变得更加显而易见，其中：
图1显示了使用表面等离子体共振的Katana肽与分拣蛋白之间的相互作用。将生物素化的Katana肽固定在链霉亲和素传感器芯片上。然后将可溶性分拣蛋白注射到固定化肽上。然后随着时间监测表面等离子体共振信号。
图2是细胞表面处的外排泵P-糖蛋白(P-gp或MDR1)的现有技术图示。与多重抗药性相关的外排泵P-gp或MDR1在许多癌细胞和各种组织的细胞表面处被高度表达。
图3显示了人癌细胞系中的分拣蛋白的免疫检测。通过凝胶电泳分离来自人癌细胞裂解物的等量蛋白质。电泳后，将蛋白质转移至PVDF膜上，并使用针对这种分拣蛋白受体的单克隆抗体对分拣蛋白进行免疫检测。可以通过与辣根过氧化物酶和化学发光试剂相连的针对小鼠IgG的第二抗体来显现分拣蛋白。
图4是(A)与Katana肽缀合的抗癌药物和(B)与Katana肽缀合的植物化学物质的示意图。。
图5显示了药物-Katana肽缀合物的结构。具有多西他赛(A)和阿霉素(B)的Katana肽缀合物以及具有姜黄素(C)的植物化学物质-Katana肽缀合物的实例。可以将不同数目(n＝1至4)的抗癌剂或植物化学物质分子结合在Katana肽的N-末端和赖氨酸上。
图6显示了在用MDR1转染的MDCK细胞中未缀合的药物和Katana-肽药物缀合物的摄取。6A.在存在或不存在P-gp(MDR1)抑制剂环孢菌素A(CsA)(10μM)的情况下，将MDCK-MDR1细胞与50nM的[3H]-多西他赛或[125I]-Katana肽-多西他赛缀合物(KBA105)在37℃下孵育1hr。6B.在存在或不存在CsA(10μM)的情况下，将MDCK-MDR1细胞与50nM的[14C]-阿霉素或[125I]-Katana肽-阿霉素缀合物(KBB106)在37℃下孵育1hr。在孵育后，洗涤细胞并定量细胞中累积的放射性。结果以摄取fmol/mg蛋白质表示。
图7显示了在SKOV3(图7A)和SK-MEL28(图7B)癌细胞中放射性标记的多西他赛和Katana缀合物(KBA105)的摄取。将细胞与放射性标记的化合物一起孵育长达2h。在孵育后，将细胞用PBS洗涤3次，然后定量累积的放射性。结果以作为时间函数的摄取(fmol/mg蛋白质)表示。
图8显示在分拣蛋白表达减少的细胞中Katana阿霉素缀合物(KBB106)的摄取减少，或通过分拣蛋白配体减少Katana阿霉素缀合物(KBB106)的摄取。A.用分拣蛋白siRNA(si分拣蛋白)转染卵巢癌细胞24hr，然后与KBB106一起孵育。通过荧光阿霉素的释放监测作为时间函数的KBB106的累积。B.在存在或不存在分拣蛋白配体(Katana肽、颗粒蛋白前体)的情况下，将卵巢癌细胞与KBB106一起孵育。通过荧光阿霉素的释放来估计KBB106的累积。
图9显示了缀合的多西他赛诱导卵巢癌细胞更好且持久的细胞死亡。9A.比较KBA105与多西他赛对卵巢(SKOV3)癌细胞细胞凋亡的影响。在孵育后，将细胞洗涤并针对膜联蛋白V染色。9B.缀合的多西他赛比未缀合的多西他赛诱导更强的细胞凋亡。这种水平的细胞凋亡类似于在P-gp(MDR1)抑制剂环孢菌素A(CsA)存在的情况下对多西他赛测量的水平。9C.与多西他赛细胞相比，KBA015的剂量依赖性增加的细胞凋亡潜能。将细胞与增加浓度的KBA105或多西他赛一起孵育5hr，然后测定细胞凋亡的水平。结果以作为药物浓度函数的细胞凋亡百分比表示。
图10显示了Katana药物缀合物对卵巢癌、皮肤癌和乳腺癌细胞细胞凋亡的影响。将癌细胞与2μM Katana药物缀合物或未缀合的多西他赛或卡巴他赛一起孵育5hr。在孵育后，将细胞洗涤并针对膜联蛋白V染色。结果以不同药物的细胞凋亡百分比表示。
图11显示了Katana药物缀合物对癌细胞细胞凋亡的影响被未缀合的肽和分拣蛋白配体逆转。在存在或不存在游离肽、神经降压素(NT)和颗粒蛋白前体的情况下，将卵巢(SKOV3)癌细胞与2μM多西他赛Katana药物缀合物KBA-105(11A)和KBA-201(11B)一起孵育5hr。在孵育后，将细胞洗涤并针对膜联蛋白V染色。结果以SKOV3癌细胞的细胞凋亡百分比表示。
图12显示了与Katana肽缀合的多西他赛对卵巢癌细胞的增加的抗迁移作用。
图13是提供了在卵巢癌细胞中的Katana平台递送的验证以及缀合的多西他赛的受体介导的内化的证据的一系列图。神经降压素(13A)或Katana肽(游离肽)(13B)与多西他赛的共孵育没有改变多西他赛对细胞迁移的影响。相反，将游离肽或神经降压素添加至Katana多西他赛缀合物逆转了其对SKOV3迁移的影响。13C.结果显示，采用特异性分拣蛋白siRNA进行的分拣蛋白基因沉默逆转了多西他赛缀合物(KBA105)对卵巢癌细胞迁移的影响。
图14显示了Katana药物缀合物对卵巢癌、皮肤癌和乳腺癌细胞迁移的影响。将细胞与不同的Katana紫杉烷缀合物一起孵育2hr，然后进行细胞迁移。所有缀合物均强烈影响各种癌细胞的迁移。
图15显示了Katana药物缀合物对卵巢癌细胞迁移的影响。15A.将细胞与增加浓度的阿霉素或缀合的阿霉素(KBB106)一起孵育2hr并进行细胞迁移。15B.结果显示，神经降压素(NT)和Katana肽(KBP106)逆转了KBB106对卵巢癌细胞(ES-2)迁移的影响。15C.颗粒蛋白前体(PGR)，一种分拣蛋白配体，也逆转了阿霉素缀合物(KBB106)对卵巢癌细胞(ES-2)迁移的影响。
图16是卵巢癌和脑肿瘤中相对分拣蛋白表达的图示。16A.在人正常组织和卵巢癌活检组织中通过蛋白质印迹检测到分拣蛋白(来自Ghaemimanesh等人，2014)。结果显示，与正常组织相比，分拣蛋白在卵巢癌活检组织中被过表达。在来自具有不同脑(16B)和卵巢(16C)肿瘤分级的患者的cDNA样品(Origene；Rockville,MD,USA)中估计了分拣蛋白基因水平。
图17是来自人类蛋白质图谱(Human Protein Atlas)网站(http://www.proteinatlast.org)的人类癌症中分拣蛋白(SORT1)表达的现有技术图示。
图18显示了通过免疫组织化学(IHC)在卵巢组织中分拣蛋白的表达。18A.分拣蛋白在原发性卵巢肿瘤和卵巢转移瘤中被过度表达，并且在非恶性的健康卵巢组织中几乎检测不到。18B.也通过IHC在一系列的正常卵巢组织、良性肿瘤、交界性肿瘤、恶性肿瘤以及来自卵巢癌的转移瘤中检测到分拣蛋白。结果表明分拣蛋白表达作为它们恶性表型的函数增加并且在卵巢转移瘤中更高。
图19是多西他赛-Katana肽缀合物(KBA-105)的药代动力学图示。向小鼠以5mg/kg注射放射性标记的缀合物。在不同的时间点收集血浆，对放射性计数并将血浆水平作为时间函数作图。然后使用《PK解决方案》软件从曲线中提取药代动力学参数。
图20是显示作为时间函数的未缀合的和缀合的多西他赛的浓度的图。在等效剂量的多西他赛(多西他赛＝2.2mg/kg；KBA105＝5mg/kg)的情况下，用放射性标记的[3H]-多西他赛或放射性标记的[125I]-KBA105 iv注射小鼠。在不同的时间点收集血浆样品并定量放射性。结果以作为时间函数的血浆中KBA105或多西他赛的浓度表示。使用GraphPad Prism软件估计KBA105和多西他赛的时间段曲线下面积(AUC1-24)。计算KBA105与多西他赛的AUC1-24之间的比率为约35。
图21显示了[125I]-Katana肽-多西他赛的组织分布。用放射性标记的缀合物以5mg/kg经由iv弹丸注射(21A)或用2.2mg放射性标记的多西他赛(21B)注射CD-1小鼠。在指定的时间(1h、6h、24h)处死小鼠并用盐水灌注8min。然后收集组织并测量放射性。结果以ng/g组织表示。
图22显示了KBA105和多西他赛对卵巢皮下肿瘤的影响。用SKOV3癌细胞植入小鼠的侧腹中。使用Carestream的近红外成像系统通过发光度监测肿瘤生长。当肿瘤达到相似的发光度时，在等效剂量的多西他赛(10mg/kg/周)的情况下用多西他赛(22A)或KBA105(22B)处理小鼠。
图23显示了图22的发光度定量。结果以作为处理后天数的函数的发光强度表示。
图24是显示经治疗日监测的用多西他赛和KBA105处理的小鼠的体重的图。结果表明，在施用的剂量下，多西他赛对体重有强烈的影响。相反，在等效剂量的多西他赛的情况下，KBA105对小鼠的体重没有影响。这些结果表明，在等效剂量的多西他赛的情况下，KBA105被更好地耐受。
图25显示了阿霉素缀合物(KBB106)和未缀合的阿霉素对卵巢皮下肿瘤的影响。25A.用ES-2卵巢癌细胞植入小鼠的侧腹中。使用卡尺测量肿瘤生长。当肿瘤达到约150mm3的肿瘤体积时，在等效剂量的阿霉素(6mg/kg/周)的情况下，用阿霉素或KBB106处理小鼠。25B.结果显示与媒介物组相比，用阿霉素或KBB106处理的小鼠中在处理后第14天肿瘤体积增加。25C.由于KBB106功效和耐受性，用缀合物处理小鼠持续到处理后第66天。
图26显示了阿霉素缀合物(KBB106)对卵巢皮下肿瘤的影响。26A.用SKOV3卵巢癌细胞植入小鼠的侧腹中。当肿瘤达到约150mm3的体积时，如箭头所示用KBB106(18mg/kg/周)处理小鼠。结果显示与媒介物组相比，用KBB106处理的小鼠中的肿瘤体积进展(减去在D0时的初始肿瘤体积)。26B.在处理期间监测的小鼠体重。在用KBB106处理的小鼠中没有体重减轻表明治疗是良好耐受的。
图27显示了多西他赛缀合物(KBA106)和未缀合的多西他赛对乳房皮下肿瘤的影响。27A.用表达荧光素酶的MDA-MB231乳腺癌细胞植入小鼠的侧腹中。使用Carestream的体内成像系统显现按发光度计的肿瘤生长。用媒介物、多西他赛(15mg/kg/周)或KBA106(50mg/kg/周)处理小鼠。减去初始发光强度。27B.结果显示了在第74天通过与癌细胞相关的剩余发光度评价的残余肿瘤负荷。对于用媒介物处理的小鼠没有可用的值(N/A)，因为由于它们的肿瘤大小达到终点限制，然后处死所有小鼠。27C.肿瘤发光度结果以与初始肿瘤发光度相比处理后第74天的进展百分比表示。在多西他赛组中，肿瘤发光度增加了100％，而在KBA106处理组中，发光度降低了100％。在KBA106组中，在处理后第74天未检测到发光，表明在这些小鼠中没有残留肿瘤。
图28显示了姜黄素缀合物(KBC106)和未缀合的姜黄素对癌细胞增殖的影响。将乳腺癌细胞(MDA-MB231)与增加浓度的KBC106或姜黄素一起孵育。72hr后，进行胸苷掺入测定以评估两种分子的抗增殖性质。从抗增殖曲线提取IC50值。结果显示与未缀合的姜黄素相比，KBC106对这些乳腺癌细胞具有更强的抗增殖活性(约100倍)。
图29显示了在ES-2卵巢癌细胞中姜黄素缀合物(KBC106)的优先分拣蛋白依赖性摄取。A.将癌细胞与KBC106或姜黄素一起孵育。通过荧光实时成像评价对两种分子的摄取。对于KBC1006，检测到更高的荧光累积，表明对缀合物具有更好的细胞内化。B.在分拣蛋白配体神经降压素(NT)和颗粒体蛋白前体以及游离Katana肽存在的情况下，通过体外荧光成像监测KBC106的摄取。在卵巢癌细胞中的KBC106累积被分拣蛋白配体抑制。C.在存在或不存在分拣蛋白配体的情况下，KBC106累积的结果以KBC106荧光强度表示。数据证明分拣蛋白配体对KBC106摄取的药理学竞争。
图30是姜黄素缀合物(KBC106)诱导癌细胞细胞凋亡的证明。
图31是姜黄素缀合物(KBC106)抑制子宫内膜(MES)皮下肿瘤的肿瘤生长的证明。用子宫内膜(MES)癌细胞植入小鼠的侧腹中。使用卡尺测量肿瘤生长。当肿瘤达到约150mm3的体积时，用KBC106以60mg/kg/每周两次处理小鼠。
公开详述
如本文所用的术语“肽化合物”或“Katana肽”、“Katana生物制药肽”或“KBP”是指例如源自细菌蛋白质或源自靶向癌细胞(包括多重抗药性癌细胞)上表达的受体的受体的配体的肽。例如，肽化合物可以源自参与细胞渗透的细菌蛋白质或源自分拣蛋白配体(例如颗粒蛋白前体和神经降压素)。在某些实施方案中，肽化合物与至少一种治疗剂(诸如抗癌剂或植物化学物质)连接(例如经由共价键、原子或接头)至，从而形成可以被用于例如治疗癌症的缀合化合物。在某些其它实施方案中，肽化合物可以在脂质体的表面处被使用。例如，可以将肽化合物用于包被脂质体或纳米颗粒，其可以负载有至少一种治疗剂(诸如抗癌剂或植物化学物质，或基因或siRNA)。
术语“Katana生物制药肽家族1肽化合物”或“KBP家族1肽化合物”是指源自细菌细胞渗透蛋白的肽化合物。例如，KBP家族1肽化合物可以源自具有IKLSGGVQAKAGVINMDKSESM(SEQ ID NO:5)的氨基酸序列的蛋白质。KBP家族1肽化合物的非限制性实例如下所示：
如本文所用，肽化合物KBP-101由IKLSGGVQAKAGVINMDKSESM(SEQ ID NO:5)的氨基酸序列表示。
如本文所用，肽化合物KBP-102由琥珀酰基-IKLSGGVQAKAGVINMFKSESY的氨基酸序列表示，其包含SEQ ID NO:6的肽序列，其中琥珀酰基基团在N-末端处被连接其上。
如本文所用，肽化合物KBP-103由IKLSGGVQAKAGVINMFKSESYK(生物素)的氨基酸序列表示，其包含SEQ ID NO:7的肽序列，其中生物素分子在C-末端处与其连接。
如本文所用，肽化合物KBP-104由GVQAKAGVINMFKSESY(SEQ ID NO:8)的氨基酸序列表示。
如本文所用，肽化合物KBP-105由乙酰基-GVRAKAGVRNMFKSESY(SEQ ID NO:14)的氨基酸序列表示。
如本文所用，肽化合物KBP-106由乙酰基-GVRAKAGVRN(Nle)FKSESY(SEQ ID NO:15)的氨基酸序列表示。
术语“生物制药肽家族2肽化合物”或“KBP家族2肽化合物”是指源自分拣蛋白配体(颗粒蛋白前体和神经降压素)的肽。例如，肽可以源自人、大鼠或小鼠的颗粒蛋白前体。例如，KBP家族2肽化合物可以源自例如具有氨基酸序列KCLRREAPRWDAPLRDPALRQLL(SEQ IDNO:19)的人颗粒蛋白前体，源自例如具有氨基酸序列KCLRKKTPRWDILLRDPAPRPLL(SEQ IDNO:20)的大鼠颗粒蛋白前体，源自例如具有氨基酸序列KCLRKKIPRWDMFLRDPVPRPLL(SEQ IDNO:21)的小鼠颗粒蛋白前体，或源自例如具有氨基酸序列XLYENKPRRPYIL(SEQ ID NO:22)的神经降压素。KBP家族2肽化合物的非限制性实例如下所示：
如本文所用，肽化合物KBP-201由乙酰基-YKSLRRKAPRWDAPLRDPALRQLL(SEQ IDNO:16)的氨基酸序列表示。
如本文所用，肽化合物KBP-202由乙酰基-YKSLRRKAPRWDAYLRDPALRQLL(SEQ IDNO:17)的氨基酸序列表示。
如本文所用，肽化合物KBP-203由乙酰基-YKSLRRKAPRWDAYLRDPALRPLL(SEQ IDNO:18)的氨基酸序列表示。
如本文所用的术语“分拣蛋白”是指由SORT1基因编码的神经元1型膜糖蛋白，属于空泡蛋白分选10蛋白(Vps10)受体家族。分拣蛋白(也称为神经降压素受体3)在中枢神经系统和外周神经系统中被大量表达，并且也在其它类型的组织中被表达。例如，分拣蛋白的表达在许多癌症(包括例如卵巢癌、乳腺癌、结肠癌和前列腺癌)中被上调。分拣蛋白可以以两种形式(全长形式(110kDa)和截短形式(95kDa))存在，对应于之前在来自分拣蛋白过表达细胞的上清液培养物中已经检测到的其大细胞腔结构域(或胞外域)(Navarro等人,2002)。本文描述的肽化合物和缀合化合物可以对分离蛋白具有高结合亲和力，并因此可以特异性地靶向表达或过表达分拣蛋白的癌细胞。
如本文档中所用的术语“化合物”是指式(I)、(II)、(III)、(IV)、(V)、(VI)、(VII)、(VIII)、(IX)、(X)、(XI)、(XII)、(XIII)、(XIV)、(XV)、(XVI)、(XVII)、(XVIII)、(XIX)、(XX)、(XXI)、(XXII)、(XXIII)、(XXIV)(XXV)、(XXVI)、(XXVII)、(XXVIII)、(XXIX)、(XXX)、(XXXI)、(XXXII)、(XXXIII)、(XXXIV)、(XXXV)、(XXXVI)、(XXXVII)、(XXXVIII)、(XXXIX)、(XXXX)、(XXXXI)或(XXXXII)的化合物，或者是指这些化合物的药学上可接受的盐、溶剂合物、水合物和/或前药，这些后面化合物的同分异构体，或者这些后面化合物的外消旋混合物，和/或是指用如本公开中先前指示的此类化合物制备的组合物。表述“化合物”也指本文公开的各种化合物的混合物。
本公开的化合物包括前药。通常，此类前药将是这些化合物的功能性衍生物，它们可以在体内容易地转化为其理论上来源的化合物。本公开的化合物的前药可以是用可获得的羟基或氨基基团形成的常规酯。例如，可以在碱存在的情况下并且任选地在惰性溶剂(例如在吡啶中的氯化酰基)中使用活化的酸酰化本公开的化合物中的可获得的OH或氮。已经被用作前药的一些常用酯是苯基酯、脂肪族(C8-C24)酯、酰氧基甲基酯、氨基甲酸酯和氨基酸酯。在某些情况下，本公开的化合物的前药是其中化合物中的一个或更多个羟基基团被掩饰为可以在体内被转变成羟基基团的基团的那些。用于选择和制备适合的前药的常规程序被描述于例如“Design of Prodrugs”H.Bundgaard编辑,Elsevier,1985中。
本公开的化合物包括放射性标记的形式，例如，通过在结构内掺入2H、3H、14C、15N或放射性卤素(诸如125I)而标记的化合物。可以使用本领域已知的标准方法制备本公开的化合物的放射性标记的化合物。
如本文所用的表述“其衍生物”当提及化合物时，意指具有类似反应性并且可以被用作化合物的替代物以获得相同的所期望的结果的化合物的衍生物。
如本文所用的术语“癌症”意指原发性或继发性癌症，并且包括非转移性癌症和/或转移性癌症。提及癌症包括提及癌细胞。例如，癌症是卵巢癌、脑癌、乳腺癌、黑色素瘤、结肠直肠癌、成胶质细胞瘤、肝癌、肺癌、前列腺癌、宫颈癌、头部癌症、胃癌、肾癌、子宫内膜癌、睾丸癌、尿路上皮癌、急性成淋巴细胞性白血病、急性髓性白血病、霍奇金淋巴瘤、成神经细胞瘤、非霍奇金淋巴瘤、软组织癌、骨肉瘤、甲状腺癌、膀胱移行细胞癌、维尔姆氏肿瘤、神经胶质瘤、胰腺癌或脾癌。如本文所用的术语“癌症”还包含涉及分拣蛋白表达的任何癌症。
如本文所用的术语“治疗剂”意指与对照相比，能够通过抑制、遏制或减少对象中的癌症(例如，如由临床症状或癌细胞的量确定的)而产生治疗作用的药剂。治疗剂的实例包括例如抗癌剂和植物化学物质。
如本文所用的术语“抗癌剂”意指能够在癌细胞中引起毒性的药剂。例如，源自太平洋紫杉树短叶红豆杉(Taxus brevifolia)的树皮的紫杉烷类，其可以被用作抗癌剂。紫杉烷类包括例如紫杉醇、多西他赛和卡巴他赛。其它抗癌剂包括例如通过嵌入DNA来起作用的蒽环类化合物。例如，蒽环类包括阿霉素和道诺霉素。
如本文所用的术语“多西他赛”或“doce”意指具有以下结构的抗癌剂：
或其药学上可接受的盐、溶剂合物或前药以及它们的混合物。例如，可以经由被连接至在其侧链的位置2处的碳原子的氧原子将多西他赛与本公开的肽化合物缀合。可以直接地或经由接头将多西他赛与肽化合物连接。
如本文所用的术语“阿霉素”或“doxo”意指具有以下结构的抗癌剂：
或其药学上可接受的盐、溶剂合物或前药以及它们的混合物。例如，可以经由被连接至在位置14处的碳原子的氧原子将阿霉素与本公开的肽化合物缀合。可以直接地或经由接头将阿霉素与肽化合物连接。
如本文所用的术语“卡巴他赛”或“cab”意指具有以下结构的抗癌剂：
或其药学上可接受的盐、溶剂合物或前药以及它们的混合物。例如，可以经由被连接至在其侧链的位置2处的碳原子的氧原子将卡巴他赛与本公开的肽化合物缀合。可以直接地或经由接头将卡巴他赛与肽化合物连接。
如本文所用的术语“植物化学物质”意指在植物中天然存在并且可以被用于治疗癌症的化学化合物。植物化学物质的实例包括例如姜黄素、染料木黄酮、白藜芦醇、表没食子儿茶素-(3)-没食子酸酯(EGCG)、胡椒碱、莱菔硫烷、槲皮素、羽扇豆醇和β-胡萝卜素。姜黄素(二阿魏酰基甲烷)是一种存在于香料姜黄((姜黄)Curcuma longa)中的黄色色素，如由超过6,000次引用表明其已经与抗氧化、抗炎性、抗癌、抗病毒和抗细菌活性相关(Hosseini,2015)。可以使用的其它植物化学物质包括但不限于如下所示的那些：
如本文所用的术语“姜黄素”或“cur”意指具有以下结构的植物化学物质：
或其药学上可接受的盐、溶剂合物或前药以及它们的混合物。例如，可以经由其苯酚基团的氧原子将姜黄素与本公开的肽化合物缀合。可以直接地或经由接头将姜黄素与肽化合物连接。
如本文所用的术语“缀合化合物”或“肽-药物缀合物”是指包含任选地经由接头与至少一种治疗剂连接的本文公开的肽化合物的化合物。缀合化合物可以包含与本文公开的肽化合物连接的例如，1、2、3或4个治疗剂分子。这些1-4个治疗剂分子可以相同或不同，即多达四种不同的治疗剂以与肽连接。治疗剂经由至少一个共价键、至少一个原子或至少一个接头与肽连接。缀合化合物可以被用于治疗癌症。缀合化合物的实例包括但不限于以下所示的缀合化合物：
如本文所用的术语“缀合”是指例如上所限定的缀合物的制备。此类反应包括将肽化合物任选地经由接头与至少一种治疗剂连接在一起。
例如，以下是本文公开的一些缀合化合物的一般化学式。
多西他赛-Katana肽缀合物：
阿霉素-Katana肽缀合物：
姜黄素-Katana肽缀合物：
例如，以下是本文公开的一些缀合化合物的化学结构。
多西他赛-KBP-102药物(3:1)或KBA-102：
多西他赛-KBP105药物(2:1)或KBA-105：
姜黄素-KBP106(2:1)或KBC-106：
如本文所用的术语“接头”意指将本文公开的肽化合物与至少一种治疗剂连接的化学结构。可以将接头在肽化合物上的不同官能团处与肽化合物连接。例如，可以将接头在伯胺处(胺(–NH2)与肽化合物连接：该基团存在于每条多肽链的N-末端(被称为α-胺)和赖氨酸(Lys,K)残基的侧链中(被称为ε-胺)。例如，可以将接头在羧基(–COOH)处与肽化合物连接：该基团存在于每条多肽链的C-末端以及天冬氨酸(Asp,D)和谷氨酸(Glu,E)的侧链中。例如，可以将接头在巯基(–SH)处与肽化合物连接：该基团存在于半胱氨酸(Cys,C)的侧链中。通常，作为蛋白质的二级或三级结构的一部分，半胱氨酸经由二硫键(–S–S–)在它们的侧链之间被连接在一起。必须将这些基团还原成巯基，以使它们可用于由大多数类型的反应性基团进行的交联。例如，可以将接头在羰基(–CHO)处与肽化合物连接：可以通过用偏高碘酸钠氧化多糖翻译后修饰(糖基化)，在糖蛋白中产生酮或醛基团。例如，接头可以是可剪切接头。例如，接头可以是不剪切接头。
下表总结了用于标准化学缀合的一些主要接头的反应性类别和化学基团：
例如，可以使用同双功能交联剂和异双功能交联剂。例如，二琥珀酰亚胺基辛二酸酯(DSS)是同双功能交联剂，其在短间隔臂的任一端处具有相同胺反应性NHS-酯基团。例如，磺基琥珀酰亚胺基4-(N-马来酰亚胺基胺基甲基)环己烷-1-羧酸酯(磺基-SMCC)是异双功能交联剂，其在一端处具有胺反应性磺基-NHS-酯基团且在环己烷间隔臂的相对端处具有巯基反应性马来酰亚胺基团的。这允许依序的两步缀合程序。可商购获得的同双功能交联剂是：BSOCOES(双(2-[琥珀酰亚胺基氧基羰基氧基]乙基)砜；DPDPB(1,4-二-(3’-[2吡啶基二硫代]-丙酰氨基)丁烷；DSS(二琥珀酰亚胺基辛二酸酯)；DST(二琥珀酰亚胺基酒石酸酯)；磺基DST(磺基二琥珀酰亚胺基酒石酸酯)；DSP(二硫代双(琥珀酰亚胺基丙酸酯)；DTSSP(3,3’-二硫代双(磺基琥珀酰亚胺基丙酸酯)；EGS(乙二醇双(琥珀酰亚胺基琥珀酸酯))；和BASED(双(β-[4-叠氮基水杨酰氨基]-乙基)二硫化物可碘化的)。
可以将多肽通过多种接头(例如巯基基团、氨基基团(胺)或任何适当的反应性基团)缀合。接头可以是共价键。接头基团可以包含柔性臂，例如2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14或15个碳原子。
示例性接头包括但不限于吡啶二硫化物、硫代磺酸酯、乙烯基磺酸酯、异氰酸酯、亚氨酸酯、二嗪、肼、硫醇、羧酸、多肽接头(multi-peptide linkers)和乙炔。可替代地，可以使用的其它接头包括BS3[双(磺基琥珀酰亚胺基)辛二酸酯](其是靶向可接近的伯胺的同双功能N-羟基琥珀酰亚胺酯)、NHS/EDC(N-羟基琥珀酰亚胺和1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺(NHS/EDC允许伯胺基团与羧基基团的缀合)、磺基-EMCS([N-ε-马来酰亚胺基胺基己酸]酰肼(磺基-EMCS是针对巯基和氨基基团具有反应性的异双功能反应性基团)、酰肼(大多数蛋白质含有暴露的碳水合物并且酰肼是用于将羧基基团连接至伯胺的有用试剂)。
为了形成共价键，可以使用多种活性羧基基团(例如酯类)作为化学反应性基团，其中羟基部分在修饰肽所需的水平下是生理学上可接受的。具体的试剂包括例如N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)、N-羟基-磺基琥珀酰亚胺(磺基-NHS)、马来酰亚胺-苯甲酰基-琥珀酰亚胺(MBS)、γ-马来酰亚胺基胺基-丁酰基氧基琥珀酰亚胺酯(GMBS)、马来酰亚胺基丙酸(MPA)、马来酰亚胺基己酸(MHA)和马来酰亚胺基十一烷酸(MUA)。
伯胺是NHS酯类的主要目标；NHS酯类与伯胺反应以形成共价酰胺键。存在于蛋白质N-末端的可接近的α-胺基团和赖氨酸的ε-胺与NHS酯类反应。因此，本文公开的缀合的化合物可以包括具有与肽的N-末端氨基或赖氨酸的ε-胺缀合的NHS酯的接头。当NHS酯与伯胺反应释放N-羟基琥珀酰亚胺时形成酰胺键。含有反应性基团的琥珀酰亚胺可以被更简单地称为琥珀酰亚胺基基团。在一些实施方案中，蛋白质上的官能团将为硫醇基基团，并且化学反应性基团将为含马来酰亚胺基的基团(诸如γ-马来酰亚胺-丁酰胺(GMBA或MPA))。此类含马来酰亚胺的基团在本文中可以被称为马来酰基(maleido)基团。
胺-至-胺接头包括NHS酯类、亚氨酸酯类等，其实例如下所列。
接头也可以是巯基-至-巯基接头，诸如下面列出的马来酰亚胺类和吡啶基二硫醇类。
接头可以是胺-至-巯基接头，其包括NHS酯/马来酰亚胺化合物。以下提供这些化合物的实例。
接头可以与氨基基团和非选择性实体反应。此类接头包括NHS酯/芳基叠氮化物和NHS酯/双吖丙啶接头，以下列出它们的实例。
示例性胺-至-羧基接头包括碳二亚胺化合物(例如，DCC(N,N-二环己基碳二亚胺)和EDC(1-乙基-3-[3-二甲基氨基丙基]碳二亚胺))。示例性巯基-至-非选择性接头包括吡啶基二硫醇/芳基叠氮化物化合物(例如，APDP((N-[4-(p-叠氮基水杨酰氨基)丁基]-3’-(2’-吡啶基二硫代)丙酰胺))。示例性巯基-至-碳水化合物接头包括马来酰亚胺/酰肼化合物(例如，BMPH(N-[β-马来酰亚胺基丙酸]酰肼)、EMCH([N-ε-马来酰亚胺基己酸]酰肼)、MPBH 4-(4-N-马来酰亚胺基苯基)丁酸酰肼)和KMUH(N-[κ-马来酰亚胺基十一烷酸]酰肼))和吡啶基二硫醇/酰肼化合物(例如，PDPH(3-(2-吡啶基二硫代)丙酰基酰肼))。示例性碳水化合物-至-非选择性接头包括酰肼/芳基叠氮化物化合物(例如，ABH(p-叠氮基苯甲酰基酰肼))。示例性羟基-至-巯基接头包括异氰酸酯/马来酰亚胺化合物(例如，(N-[p-马来酰亚胺基苯基]异氰酸酯))。示例性胺-至-DNA接头包括NHS酯/补骨脂素化合物(例如，SPB(琥珀酰亚胺基-[4-(补骨脂素-8-基氧基)]-丁酸酯))。
为了在缀合肽中产生不同复杂性的分支点，接头可以是能够连接3-7个实体。
TMEA和TSAT通过它们的马来酰亚胺基团与巯基基团反应。THPP的羟基基团和羧基基团可以与伯胺或仲胺反应。其它有用的接头符合式Y＝C＝N–Q–A–C(O)–Z，其中Q是同芳香族或杂芳香族环体系；A是单键或未取代的或取代的二价C1-30桥接基团，Y是O或S；且Z是Cl、Br、I、N3、N-琥珀酰亚胺基氧基、咪唑基、1-苯并三唑基氧基、OAr其中Ar是缺电子激活芳基基团，或OC(O)R其中R是–A–Q–N＝C＝Y或C4-20叔烷基(参见美国专利第4,680,338号)。
其它有用的接头具有式其中R1是H、C1-6烷基、C2-6烯基、C6-12芳基或芳烷基或与二价有机–O–、–S–或偶联的这些基团，其中R’是连接部分的C1-6烷基；R2是H、C1-12烷基、C6-12芳基或C6-12芳烷基，R3是或能够使相邻氮的孤对电子离域的另一种化学结构，并且R4是能够将R3连接至肽载体或试剂的侧链(pendant)反应性基团(参见例如美国专利第5,306,809号)。
接头可以包括至少一个氨基酸残基并且可以是至少或约2、3、4、5、6、7、10、15、20、25、30、40或50个氨基酸残基的肽。当接头为单个氨基酸残基时，它可以是任何天然或非天然存在的氨基酸(例如，Gly或Cys)。当接头是短肽时，它可以是富含甘氨酸的肽(其倾向于是柔性的)，诸如具有序列[Gly-Gly-Gly-Gly-Ser]n的肽，其中n是1至6的整数(包括端值)(参见美国专利第7,271,149号)，或富含丝氨酸的肽接头(参见美国专利第5,525,491号)。富含丝氨酸的肽接头包括式[X-X-X-X-Gly]y的那些肽接头，其中至多两个X是Thr，其余X是Ser，并且y是1至5的整数(包括端值)(例如，Ser-Ser-Ser-Ser-Gly，其中y大于1)。其它接头包括刚性接头(例如PAPAP和(PT)nP，其中n为2、3、4、5、6或7)和α-螺旋接头(例如，A(EAAAK)nA，其中n是1、2、3、4或5)。
接头可以是脂肪族接头(例如，具有与多肽的酰胺键和与治疗剂的酯键)。当使用脂肪族接头时，它可以在长度(例如C1-C20)及它包括的化学部分(例如氨基基团或氨基甲酸酯)方面变化。
适合的氨基酸接头的实例为琥珀酸、Lys、Glu和Asp，或二肽(诸如Gly-Lys)。当接头为琥珀酸时，其一个羧基基团可以与氨基酸残基的氨基基团形成酰胺键，并且其另一个羧基基团可以例如与肽或取代基的氨基基团形成酰胺键。当接头为Lys、Glu或Asp时，其羧基基团可以与氨基酸残基的氨基基团形成酰胺键，并且其氨基可以例如与取代基的羧基基团形成酰胺键。当将Lys用作接头时，可以在Lys的ε-氨基基团和取代基之间插入另外的接头。另外的接头可以是琥珀酸，其可以与Lys的ε-氨基基团以及与取代基中存在的氨基基团形成酰胺键。在一实施方案中，另一个接头是Glu或Asp(例如，其与Lys的ε-氨基基团形成酰胺键，并且与取代基中存在的羧基基团形成另一个酰胺键)，即取代基为Nε-酰化的赖氨酸残基。
接头也可以是分枝多肽。示例性分枝肽接头描述于美国专利第6,759,509号。
接头可以提供可剪切的键(例如，硫酯键)或不可剪切的键(例如，马来酰亚胺键)。例如，细胞毒性蛋白可以与接头结合，所述接头与存在于多肽内的赖氨酸残基处和多肽的氨基-末端处的经修饰的游离胺反应。因此，本发明的缀合化合物中有用的接头可以包含与治疗剂部分缀合的多肽或经修饰的多肽上的伯胺反应的基团。更具体地，接头可以选自：单氟代环辛炔(MFCO)、双环[6.1.0]壬炔(BCN)、N-琥珀酰亚胺基-S-乙酰基硫代乙酸酯(SATA)、N-琥珀酰亚胺基-S-乙酰基硫代丙酸酯(SATP)、马来酰亚胺基和二苯并环辛炔酯(DBCO酯)。在给定接头内有用的环辛炔类包括OCT、ALO、MOFO、DIFO、DIBO、BARAC、DIBAC和DIMAC。
接头可以包含柔性臂，诸如例如短臂(<2个碳的链)、中等大小臂(2-5个碳的链)或长臂(3-6个碳的链)。
也可以将点击化学用于肽上的缀合(DBCO、TCO、四嗪、叠氮化物和炔烃接头)。这些接头家族可以对胺、羧基和巯基基团有反应性。另外，这些接头也可以被生物素化的、聚乙二醇化的、用荧光成像染料修饰的，或者亚磷酰胺化的以用于掺入寡核苷酸序列上。
如本文所用的术语“中间体”是指已经与接头反应从而形成治疗剂的中间体或活化形式的治疗剂。中间体可以与本文公开的肽化合物反应，从而形成可以被用于治疗癌症的本文公开的缀合化合物。
术语“氨基酸”是指本领域技术人员已知的常见的天然(基因编码的)或合成的氨基酸及其常见的衍生物。当应用于氨基酸时，“标准的”或“蛋白原性”是指它们的天然构型中的基因编码的20种氨基酸。类似地，当应用于氨基酸时，“非标准的”、“非天然的”或“不寻常的”是指广泛选择的非天然、稀有或合成的氨基酸，诸如由Hunt,S.在Chemistry andBiochemistry of the Amino Acids,Barrett,G.C.编辑,Chapman and Hall:New York,1985中描述的那些。非标准氨基酸的一些实例包括非α氨基酸、D-氨基酸。
用于氨基酸的缩写和肽名称遵循J.Biol.Chem.1972,247,977-983中的IUPAC-IUB生物化学命名委员会(IUPAC-IUB Commission of Biochemical Nomenclature)的规则。本文档已被更新：Biochem.J.,1984,219,345-373；Eur.J.Biochem.,1984,138,9-37；1985,152,1；Int.J.Pept.Prot.Res.,1984,24,第84页后；J.Biol.Chem.,1985,260,14-42；PureAppl.Chem.1984,56,595-624；Amino Acids and Peptides,1985,16,387-410；和Biochemical Nomenclature and Related Documents,第2版,Portland Press,1992,第39-67页。对规则的扩展被发表于JCBN/NC-IUB Newsletter 1985,1986,1989；参见Biochemical Nomenclature and Related Documents,第2版,Portland Press,1992,第68-69页。
术语“拮抗剂”是指减少蛋白质、受体、酶、相互作用等的内源性配体的至少一些作用的化合物。
术语“抑制剂”是指降低蛋白质、受体、酶、相互作用等的正常活性的化合物。
术语“反向激动剂”是指将组成型-活性受体的活性降低至它的基础水平以下的化合物。
术语“文库”是指可以被用于例如药物发现目的的化合物的集合。例如，文库化合物可以是本文公开的肽化合物和/或缀合化合物。
如本文所用的术语“混合物”意指包含两种或更多种化合物的组合物。在实施方案中，混合物是两种或更多种不同化合物的混合物。在另外的实施方案中，当化合物被称为“混合物”时，这意味着它可以包含任何比例的两种或更多种“形式”的化合物，诸如化合物的盐、溶剂合物、前药或者(在适用的情况下)立体异构体。本领域技术人员将理解，混合物中的化合物也可以作为形式的混合物存在。例如，化合物可以作为盐的水合物或作为化合物的前药的盐的水合物存在。本文公开的所有形式的化合物都在本申请的范围内。
术语“调节剂”是指对生物或化学过程或机制产生影响的化合物。例如，调节剂可以增加、促进、上调、活化、抑制、减少、阻断、防止、延迟、脱敏、去活化、下调等生物或化学过程或机制。因此，调节剂可以是“激动剂”或“拮抗剂”。受调节剂影响的示例性生物过程或机制包括但不限于酶结合、受体结合和激素释放或分泌。受调节剂影响的示例性化学过程或机制包括但不限于催化作用和水解作用。
术语“肽”是指包含使用酰胺键共价键合在一起的至少两个氨基酸的化学化合物。
如本文所用的术语“前药”是指已知化合物或组合物的活性形式的衍生物，当被施用给对象时，所述衍生物被逐渐转化为活性形式以产生更好的治疗应答和/或降低的毒性水平。通常，前药将是本文公开的化合物的功能性衍生物，其可容易地在体内转化成其理论上来源的化合物。前药包括但不限于酰基酯类、碳酸酯类、磷酸酯类和聚氨酯类。这些基团是示例性的而不是详尽的，并且本领域的技术人员可以制备前药的其它已知种类。可以例如用可用的羟基、硫醇、氨基或羧基基团形成前药。例如，可以在碱存在的情况下并且任选地在惰性溶剂(例如在吡啶中的酰基氯)中使用活化的酸对本公开的化合物中可用的OH和/或NH2进行酰化。已经被用作前药的一些常见酯类是苯基酯类、脂肪族(C1-C24)酯类、酰氧基甲基酯类、氨基甲酸酯类和氨基酸酯类。在某些情况下，本公开的化合物的前药是其中化合物中的羟基和/或氨基基团被掩饰为可以在体内被转化为羟基和/或氨基基团的基团的那些。用于选择和制备适合的前药的常规程序例如被描述于“Design of Prodrugs”H.Bundgaard编辑,Elsevier,1985。
术语“保护基团”是指可以被用于防止分子上的潜在反应性官能团(诸如胺、羟基或羧基)在分子中的其它地方发生化学变化时经历化学反应的的任何化学化合物。许多此类保护基团是本领域技术人员已知的，并且实例可以见于Protective Groups in OrganicSynthesis,T.W.Greene和P.G.Wuts,编辑,John Wiley&Sons,New York,第4版,2006,第1082页,ISBN 9780471697541。氨基保护基团的实例包括但不限于苯二甲酰亚氨基、三氯乙酰基、苄基氧基羰基、叔丁氧基羰基和金刚烷基-氧基羰基。在一些实施方案中，氨基保护基团是氨基甲酸酯氨基保护基团，当与氨基基团结合时形成氨基甲酸酯时，其被限定为氨基保护基团。在其它实施方案中，氨基氨基甲酸酯保护基团为烯丙基氧基羰基(Alloc)、苄基氧基羰基(Cbz)、9芴基甲氧基羰基(Fmoc)、叔丁氧基羰基(Boc)和α,α二甲基-3,5二甲氧基苄基氧基羰基(Ddz)。关于最近对较新的氮保护基团的讨论，参见：Tetrahedron 2000,56,2339-2358。羟基保护基团的实例包括但不限于乙酰基、叔丁基二甲基甲硅烷基(TBDMS)、三苯甲基(Trt)、叔丁基和四氢吡喃基(THP)。羧基保护基团的实例包括但不限于甲基酯、叔丁基酯、苄基酯、三甲基甲硅烷基乙基酯和2,2,2-三氯乙基酯。
如本文所用的术语"序列同一性"是指两条多肽序列或两条核酸序列之间的序列同一性的百分比。为了确定两条氨基酸序列或两条核酸序列的百分比同一性，将序列比对以用于最佳比较目的(例如，可以将空位引入第一条氨基酸或核酸序列的序列中用于与第二条氨基酸或核酸序列进行最佳比对)。然后比较在相应的氨基酸位置或核苷酸位置处的氨基酸残基或核苷酸。当第一条序列中的位置被与第二条序列中的相应位置相同的氨基酸残基或核苷酸占据时，则分子在那个位置处是同一的。两条序列之间的百分比同一性是由序列共享的同一位置的数量的函数(即，％同一性＝同一重叠位置的数量/位置.次数的总数量.100％)。在一实施方案中，两条序列的长度相同。也可以使用数学算法来完成两条序列之间的百分比同一性的确定。用于比较两条序列的数学算法的优选的非限制性实例是被修改为在Karlin和Altschul,1993,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.90:5873-5877中的Karlin和Altschul,1990,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.87:2264-2268的算法。此类算法被并入Altschul等人，1990,J.Mol.Biol.215:403的NBLAST和XBLAST程序中。可以用NBLAST核苷酸程序参数设置(例如对于评分＝100，字长＝12)进行BLAST核苷酸搜索，以获得与本申请的核酸分子同源的核苷酸序列。可以用XBLAST程序设置(例如评分-50，字长＝3)进行BLAST蛋白质搜索，以获得与本公开的蛋白质分子同源的氨基酸序列。为了获得用于比较目的的加空位的比对，可以如Altschul等人，1997,Nucleic Acids Res.25:3389-3402中描述，使用加空位的BLAST。可替代地，可以使用PSI-BLAST来进行检测分子(同上(Id.))之间的远距离关系的迭代搜索。当使用BLAST、加空位的BLAST和PSI-Blast程序时，可以使用各自程序(例如XBLAST和NBLAST的)的默认参数(参见例如NCBI网站)。用于比较序列的数学算法的另一优选的非限制性实例是Myers和Miller,1988,CABIOS 4:11-17的算法。此类算法被并入作为GCG序列比对软件包一部分的ALIGN程序(版本2.0)中。当使用ALIGN程序比较氨基酸序列时，可以使用PAM120权重残基表，空位长度罚分为12和空位罚分为4。可以使用与上述那些技术类似的技术在允许或不允许空位的情况下来确定两条序列之间的百分比同一性。在计算百分比同一性时，通常只计算精确匹配。
如本文所用的表述“基本上由……组成”意在指明存在所陈述的特征、要素、成分、组、整数和/或步骤以及不会实质上影响特征、要素、成分、组、整数和/或步骤的一个或多个基本和新颖特性的那些。
术语“固相化学”是指化学反应的进行，其中反应的一个成分被共价键合至聚合物材料(如下限定的固体支撑物)。用于在固相上进行化学过程的反应方法在肽和寡核苷酸化学的传统领域之外变得更加众所周知和被建立(Solid-Phase Synthesis:A PracticalGuide,F.Albericio,编辑,CRC Press,2000,第848页,ISBN:978-0824703592；OrganicSynthesis on Solid Phase,第2版,Florencio ZaragozaWiley-VCH,2002,第530页,ISBN:3-527-30603-X；Solid-Phase Organic Synthesis:Concepts,Strategies,and Applications,P.H.Toy,Y.Lam,编辑,Wiley,2012,第568页,ISBN:978-0470599143)。
术语“固体支撑物”、“固相”或“树脂”是指被用于进行固相化学过程的机械和化学稳定的聚合物基质。这由“树脂”、“P-”或以下符号表示：
适当的聚合物材料的实例包括但不限于聚苯乙烯、聚乙烯、聚乙二醇(PEG，包括但不限于(Matrix Innovation,Quebec,Quebec,Canada；J.Comb.Chem.2006,8,213-220))、被接枝或共价键合至聚苯乙烯的聚乙二醇(也被称为PEG-聚苯乙烯，TentaGelTM,Rapp,W.；Zhang,L.；Bayer,E.In Innovations and Perspectives in SolidPhase Synthesis.Peptides,Polypeptides and Oligonucleotides；Epton,R.,编辑；SPCCLtd.:Birmingham,UK；第205页)、聚丙烯酸酯(CLEARTM)、聚丙烯酰胺、聚氨酯、PEGA[聚乙二醇聚(N,N二甲基-丙烯酰胺)共聚体，Tetrahedron Lett.1992,33,3077-3080]、纤维素等。这些材料可以任选地含有另外的化学剂以形成交联键以机械地稳定结构，例如与二乙烯基苯(DVB，通常0.1-5％，优选0.5-2％)交联的聚苯乙烯。这种固体支撑物可以包括作为非限制性实例的氨基甲基聚苯乙烯、羟甲基聚苯乙烯、二苯甲基胺聚苯乙烯(BHA)、甲基二苯甲基胺(MBHA)聚苯乙烯和含有用于进一步衍生化作用或反应的游离化学官能团(最典型的NH2或-OH)的其它聚合物主链。术语还意味着包括具有高比例(“负载”)的这些官能团(诸如由聚乙烯亚胺类和交联分子制备的那些)的“超树脂(Ultraresins)”(J.Comb.Chem.2004,6,340-349)。在合成结束时，通常将树脂丢弃，虽然它们已被证明能够被重新利用(Tetrahedron Lett.1975,16,3055)。
通常，被用作树脂的材料是不溶性聚合物，但是某些聚合物取决于溶剂具有不同的溶解度并且也可以被用于固相化学。例如，聚乙二醇可以以这种方式被使用，因为它在许多可以进行化学反应的有机溶剂中是可溶解的，但是它在其它溶剂(诸如二乙醚)中是不溶解的。因此，可以在溶液中均一地进行反应，然后聚合物上的产物通过加入二乙醚而沉淀并作为固体被加工。这已经被称为“液相”化学。
表述“药学上可接受的”意指与对象(诸如动物或人类)的治疗相容。
表述“药学上可接受的盐”意指适用于对象(诸如动物或人类)的治疗或与对象(诸如动物或人类)的治疗相容的酸加成盐或碱加成盐。
如本文所用的表述“药学上可接受的酸加成盐”意指本公开的任何化合物或任何其中间体的任何非毒性有机盐或无机盐。形成适合的盐的说明性无机酸包括盐酸、氢溴酸、硫酸和磷酸，以及金属盐(诸如正磷酸一氢钠和硫酸氢钾)。形成适合的盐的说明性有机酸包括单羧酸、二羧酸和三羧酸(诸如甘醇酸、乳酸、丙酮酸、丙二酸、琥珀酸、戊二酸、富马酸、苹果酸、酒石酸、柠檬酸、抗坏血酸、马来酸、苯甲酸、苯基乙酸、肉桂酸和水杨酸)，以及磺酸类(诸如对甲苯磺酸和甲磺酸)。可以形成单酸盐或二酸盐，并且此类盐可以以水合的、溶剂化的或基本上无水的形式存在。通常，本公开的化合物的酸加成盐更易溶于水和各种亲水性有机溶剂中，并且与它们的游离碱形式相比，通常表现出更高的熔点。适当的盐的选择对本领域技术人员来说将是已知的。例如在分离本公开的化合物中可以使用其它非药学上可接受的盐(例如草酸盐)，用于实验室用途或用于随后转化为药学上可接受的酸加成盐。
如本文所用的术语“药学上可接受的碱加成盐”意指本公开的任何酸性化合物或任何其中间体的任何非毒性有机或无机碱加成盐。可以形成碱加成盐的本公开的酸性化合物包括，例如，其中CO2H是官能团。形成适合的盐的说明性无机碱包括氢氧化锂、氢氧化钠、氢氧化钾、氢氧化钙、氢氧化镁或氢氧化钡。形成适合的盐的说明性有机碱包括脂肪族的、脂环族的或芳香族的有机胺类诸如甲基胺、三甲基胺和皮考啉或氨。适当的盐的选择对本领域技术人员来说将是已知的。例如在分离本公开的化合物中可以使用其它非药学上可接受的碱加成盐，用于实验室用途或用于随后转化为药学上可接受的酸加成盐。
使用标准技术来实现所期望的化合物盐的形成。例如，用酸或碱在适合的溶剂中处理中性化合物，并通过过滤、萃取或任何其它适合的方法分离所形成的盐。
使用标准技术来实现所期望的化合物盐的形成。例如，用酸或碱在适合的溶剂中处理中性化合物，并通过过滤、萃取或任何其它适合的方法分离所形成的盐。
如本文所用的术语“溶剂合物”意指化合物或其药学上可接受的盐，其中将适合的溶剂的分子掺入晶格中。在施用的剂量下适合的溶剂是生理上可耐受的。适合的溶剂的实例是乙醇、水等。当水是溶剂时，该分子被称为“水合物”。溶剂合物的形成将取决于化合物和溶剂化物而变化。通常，通过将化合物溶解在适当的溶剂中并通过冷却或使用抗溶剂分离溶剂合物来形成溶剂合物。通常在环境条件下干燥或共沸溶剂合物。
如本文所用的术语“对象”包括动物界(包括哺乳动物，诸如小鼠、大鼠、狗和人)的所有成员。
术语“适合的”和“适当的”意指具体的基团或条件的选择将取决于要进行的特定合成操作和分子的特性，但是该选择将完全在本领域中受过培训的人的技能范围内。本文所描述的所有方法步骤都要在适合于提供所示产物的条件下进行。本领域技术人员将理解，可以改变所有反应条件(包括例如反应溶剂、反应时间、反应温度、反应压力、反应物比率以及反应是否应该在无水或惰性气氛下进行)以优化所期望产物的产量，并且这样做在他们的技能范围内。
本公开的化合物或组合物的“治疗有效量”、“有效量”或“足够量”的表述是当被施用给对象(包括哺乳动物,例如人类)时足以产生有益的或所期望的结果(包括临床结果)的量，并因此“治疗有效量”或“有效量”取决于其应用的情形。例如，在治疗癌症的情形下，它是与未施用化合物或组合物而获得的应答相比足以实现癌症的此类治疗的化合物或组合物的量。将对应于有效量的本公开的给定化合物或组合物的量将根据各种因素(诸如给定的药物或化合物、药物制剂、施用途径、疾病或病症的类型、被治疗的对象或宿主的身份等)而变化，但仍可由本领域技术人员常规确定。另外，如本文所用，本公开的化合物或组合物的“治疗有效量”或“有效量”是与对照相比，在对象中抑制、遏制或减少癌症的量(例如由临床症状或癌性细胞的量所确定)。
如本文所用并且如在本领域中所熟悉的，"治疗(treatment)"或"治疗(treating)"是用于获得有益的或所期望的结果(包括临床结果)的方法。有益的或所期望的临床结果可以包括但不限于：减少肿瘤进展、减小肿瘤大小、降低肿瘤生长速率、减少肿瘤侵袭和转移潜能、缓解或改善一种或更多种症状或病况、降低疾病程度、稳定(即不恶化)的疾病状态、预防疾病传播、延迟或减缓疾病进展、改善或减轻疾病状态，以及缓解(不论是部分还是全部)，无论是可检测的还是不可检测的。"治疗(treatment)"或"治疗(treating)"还可以意指与如果不接受治疗而预期的存活期相比延长存活期。
如本文所用的术语“耐受性”或“耐受的”意指用治疗剂治疗的对象可以忍受或接受的治疗剂的程度。例如，耐受性可以通过测量不同的参数被评估，诸如(i)体重减轻的维持或不存在，(ii)经受治疗的持续时间，以及(iii)副作用的减少或不存在。例如，公认的是，当使用此类治疗剂治疗期间没有观察到体重减轻时，对象可以耐受治疗剂。
如本文所用的术语“被施用(administered)”或“施用(administering)”意指在体外(例如细胞培养)或体内(例如在对象中)向细胞施用治疗有效量的本申请的化合物或组合物。
在理解本公开的范围时，如本文所用的术语“包含”及其派生词意指开放式术语，其指定所述特征、要素、成分、组、整数和/或步骤的存在，但不排除其它未陈述的特征、要素、成分、组、整数和/或步骤的存在。前述内容也适用于具有类似含义的词语，诸如术语“包括”、“具有”及它们的派生词。最后，如本文所用的诸如“基本上”、“约(about)”和“大约(approximately)”的程度术语意指经修饰后的术语的合理偏差量，使得最终结果不会被显著改变。如果这种偏差不会否定它所修饰的词汇的含义，则这些程度术语应该被解释为包括经修饰的术语的至少±5％的偏差。
如在本说明书和所附权利要求中所用的，除非上下文另有明确规定，否则单数形式“一个/种(a/an)”和“该(the)”包括复数指代。因此，例如，含有“化合物”的组合物包括两种或更多种化合物的混合物。还应该注意的是，除非上下文另有明确规定，否则术语“或”通常以包括“和/或”的含义被使用。
在包含“另外的”或“第二的”成分的组合物中，如本文所用的第二成分在化学上不同于与其它成分或第一成分。“第三”成分不同于其它、第一和第二成分，并且进一步列举的或“另外的”成分也是类似地不同。
在具体部分中描述的限定和实施方案旨在适用于本文描述的其它实施方案，如本领域技术人员将理解的那样，它们适合于这些实施方案。
本文中通过端点列举的数值范围包括被包含在该范围内的所有数字和分数(例如，1至5包括1、1.5、2、2.75、3、3.90、4和5)。还应理解，假定其所有的数字和分数都由术语"约"修饰的。
最近开发了一个平台，其允许将治疗剂转运至癌细胞中用于针对原发性和继发性肿瘤的新疗法。该方法利用来源于细菌蛋白质或来源于癌细胞中表达的受体的配体(例如分拣蛋白/多配体聚糖)的肽化合物。在本公开中，描述了抗癌剂和植物化学物质与这些肽化合物之一的缀合。例如，可以将抗癌剂(例如多西他赛、卡巴他赛和阿霉素)与肽化合物缀合。也可以将植物化学物质(例如姜黄素)与肽化合物缀合。此外，在与Katana肽缀合后，缀合的Katana肽的摄取不受P-gp抑制剂环孢菌素A的影响，证实Katana肽不是外排泵(诸如P-gp)的底物。这些结果进一步表明，这些肽药物缀合物可以被用于肿瘤学以外的其它应用。除了与未缀合的治疗剂相比诱导更大的肿瘤细胞凋亡之外，本文所述的缀合化合物还可以提供更佳的耐受性和降低的毒性。
本文公开了肽化合物以及包含与肽化合物连接的至少一种治疗剂的缀合化合物。此类化合物可以被用于治疗癌症，例如涉及分拣蛋白表达的癌症。
因此，第一方面是与选自式(I)、式(II)、式(III)、式(IV)、式(V)、式(VI)、式(VII)、式(VIII)、式(IX)、式(X)、式(XI)、式(XII)和式(XIII)的化合物的化合物具有至少80％序列同一性的肽化合物：
X1X2X3X4X5GVX6AKAGVX7NX8FKSESY (I)(SEQ ID NO:1)
(X9)nGVX10AKAGVX11NX12FKSESY (II)(SEQ ID NO:2)
YKX13LRRX14APRWDX15PLRDPALRX16X17L (III)(SEQ ID NO:3)
YKX18LRR(X19)nPLRDPALRX20X21L (IV)(SEQ ID NO:4)
IKLSGGVQAKAGVINMDKSESM (V)(SEQ ID NO:5)
IKLSGGVQAKAGVINMFKSESY (VI)(SEQ ID NO:6)
IKLSGGVQAKAGVINMFKSESYK (VII)(SEQ ID NO:7)
GVQAKAGVINMFKSESY (VIII)(SEQ ID NO:8)
GVRAKAGVRNMFKSESY (IX)(SEQ ID NO:9)
GVRAKAGVRN(Nle)FKSESY (X)(SEQ ID NO:10)
YKSLRRKAPRWDAPLRDPALRQLL (XI)(SEQ ID NO:11)
YKSLRRKAPRWDAYLRDPALRQLL (XII)(SEQ ID NO:12)
YKSLRRKAPRWDAYLRDPALRPLL (XIII)(SEQ ID NO:13)
其中
X1、X2、X3、X4、X5、X6、X7、X8、X9、X10、X11、X12、X13、X14、X15、X18和X19独立地选自任何氨基酸；
X16、X17、X20和X21独立地选自Q、P、Y、I和L；
n是0、1、2、3、4或5；
当存在超过一个的X9时，所述X9中的每一个独立地选自任何氨基酸；
当存在超过一个的X19时，所述X9中的每一个独立地选自任何氨基酸；
并且其中将至少一个保护基团和/或至少一种标记试剂在N-和/或C-末端处任选地与所述肽连接。
例如，肽化合物是包含以下氨基酸序列的肽化合物：
X1X2X3X4X5GVX6AKAGVX7NX8FKSESY (I)(SEQ ID NO:1)
(X9)nGVX10AKAGVX11NX12FKSESY (II)(SEQ ID NO:2)
YKX13LRRX14APRWDX15PLRDPALRX16X17L (III)(SEQ ID NO:3)
YKX18LRR(X19)nPLRDPALRX20X21L (IV)(SEQ ID NO:4)
IKLSGGVQAKAGVINMDKSESM (V)(SEQ ID NO:5)
IKLSGGVQAKAGVINMFKSESY (VI)(SEQ ID NO:6)
IKLSGGVQAKAGVINMFKSESYK (VII)(SEQ ID NO:7)
GVQAKAGVINMFKSESY (VIII)(SEQ ID NO:8)
GVRAKAGVRNMFKSESY (IX)(SEQ ID NO:9)
GVRAKAGVRN(Nle)FKSESY (X)(SEQ ID NO:10)
YKSLRRKAPRWDAPLRDPALRQLL (XI)(SEQ ID NO:11)
YKSLRRKAPRWDAYLRDPALRQLL (XII)(SEQ ID NO:12)或
YKSLRRKAPRWDAYLRDPALRPLL (XIII)(SEQ ID NO:13)。例如，肽化合物是基本上由以下氨基酸序列组成的肽化合物：
X1X2X3X4X5GVX6AKAGVX7NX8FKSESY (I)(SEQ ID NO:1)
(X9)nGVX10AKAGVX11NX12FKSESY (II)(SEQ ID NO:2)
YKX13LRRX14APRWDX15PLRDPALRX16X17L (III)(SEQ ID NO:3)
YKX18LRR(X19)nPLRDPALRX20X21L (IV)(SEQ ID NO:4)
IKLSGGVQAKAGVINMDKSESM (V)(SEQ ID NO:5)
IKLSGGVQAKAGVINMFKSESY (VI)(SEQ ID NO:6)
IKLSGGVQAKAGVINMFKSESYK (VII)(SEQ ID NO:7)
GVQAKAGVINMFKSESY (VIII)(SEQ ID NO:8)
GVRAKAGVRNMFKSESY (IX)(SEQ ID NO:9)
GVRAKAGVRN(Nle)FKSESY (X)(SEQ ID NO:10)
YKSLRRKAPRWDAPLRDPALRQLL (XI)(SEQ ID NO:11)
YKSLRRKAPRWDAYLRDPALRQLL (XII)(SEQ ID NO:12)或
YKSLRRKAPRWDAYLRDPALRPLL (XIII)(SEQ ID NO:13)。
例如，肽化合物是由以下氨基酸序列组成的肽化合物：
X1X2X3X4X5GVX6AKAGVX7NX8FKSESY (I)(SEQ ID NO:1)
(X9)nGVX10AKAGVX11NX12FKSESY (II)(SEQ ID NO:2)
YKX13LRRX14APRWDX15PLRDPALRX16X17L (III)(SEQ ID NO:3)
YKX18LRR(X19)nPLRDPALRX20X21L (IV)(SEQ ID NO:4)
IKLSGGVQAKAGVINMDKSESM (V)(SEQ ID NO:5)
IKLSGGVQAKAGVINMFKSESY (VI)(SEQ ID NO:6)
IKLSGGVQAKAGVINMFKSESYK (VII)(SEQ ID NO:7)
GVQAKAGVINMFKSESY (VIII)(SEQ ID NO:8)
GVRAKAGVRNMFKSESY (IX)(SEQ ID NO:9)
GVRAKAGVRN(Nle)FKSESY (X)(SEQ ID NO:10)
YKSLRRKAPRWDAPLRDPALRQLL (XI)(SEQ ID NO:11)
YKSLRRKAPRWDAYLRDPALRQLL (XII)(SEQ ID NO:12)或
YKSLRRKAPRWDAYLRDPALRPLL (XIII)(SEQ ID NO:13)。
根据另一方面，提供了肽化合物，其包含选自式(I)、式(II)、式(III)、式(IV)、式(V)、式(VI)、式(VII)、式(VIII)、式(IX)、式(X)、式(XI)、式(XII)和式(XIII)的化合物的化合物：
X1X2X3X4X5GVX6AKAGVX7NX8FKSESY (I)(SEQ ID NO:1)
(X9)nGVX10AKAGVX11NX12FKSESY (II)(SEQ ID NO:2)
YKX13LRRX14APRWDX15PLRDPALRX16X17L (III)(SEQ ID NO:3)
YKX18LRR(X19)nPLRDPALRX20X21L (IV)(SEQ ID NO:4)
IKLSGGVQAKAGVINMDKSESM (V)(SEQ ID NO:5)
IKLSGGVQAKAGVINMFKSESY (VI)(SEQ ID NO:6)
IKLSGGVQAKAGVINMFKSESYK (VII)(SEQ ID NO:7)
GVQAKAGVINMFKSESY (VIII)(SEQ ID NO:8)
GVRAKAGVRNMFKSESY (IX)(SEQ ID NO:9)
GVRAKAGVRN(Nle)FKSESY (X)(SEQ ID NO:10)
YKSLRRKAPRWDAPLRDPALRQLL (XI)(SEQ ID NO:11)
YKSLRRKAPRWDAYLRDPALRQLL (XII)(SEQ ID NO:12)
YKSLRRKAPRWDAYLRDPALRPLL (XIII)(SEQ ID NO:13)
其中
X1、X2、X3、X4、X5、X6、X7、X8、X9、X10、X11、X12、X13、X14、X15、X18和X19独立地选自任何氨基酸；
X16、X17、X20和X21独立地选自Q、P、Y、I和L；
n是0、1、2、3、4或5；
当存在超过一个的X9时，所述X9中的每一个独立地选自任何氨基酸；
当存在超过一个的X19时，所述X9中的每一个独立地选自任何氨基酸
并且其中将至少一个保护基团和/或至少一种标记试剂在N-和/或C-末端处任选地与所述肽连接。
例如，肽化合物与选自式(I)、式(II)、式(III)、式(IV)、式(V)、式(VI)、式(VII)、式(VIII)、式(IX)、式(X)、式(XI)、式(XII)和式(XIII)的肽化合物的肽化合物具有至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％序列同一性。
例如，肽化合物与由式(I)或SEQ ID NO:1表示的肽化合物具有至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％序列同一性。
例如，肽化合物与由式(II)或SEQ ID NO:2表示的肽化合物具有至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％序列同一性。
例如，肽化合物与由式(III)或SEQ ID NO:3表示的肽化合物具有至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％序列同一性。
例如，肽化合物与由式(IV)或SEQ ID NO:4表示的肽化合物具有至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％序列同一性。
例如，肽化合物与由式(V)或SEQ ID NO:5表示的肽化合物具有至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％序列同一性。
例如，肽化合物与由式(VI)或SEQ ID NO:6表示的肽化合物具有至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％序列同一性。
例如，肽化合物与由式(VII)或SEQ ID NO:7表示的肽化合物具有至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％序列同一性。
例如，肽化合物与由式(VIII)或SEQ ID NO:8表示的肽化合物具有至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％序列同一性。
例如，肽化合物与由式(IX)或SEQ ID NO:9表示的肽化合物具有至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％序列同一性。
例如，肽化合物与由式(X)或SEQ ID NO:10表示的肽化合物具有至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％序列同一性。
例如，肽化合物与由式(XI)或SEQ ID NO:11表示的肽化合物具有至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％序列同一性。
例如，肽化合物与由式(XII)或SEQ ID NO:12表示的肽化合物具有至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％序列同一性。
例如，肽化合物与由式(XIII)或SEQ ID NO:13表示的肽化合物具有至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％序列同一性。
在一实施方案中，n是0。在一实施方案中，n是1。在一实施方案中，n是2。在一实施方案中，n是3。在一实施方案中，n是4。在一实施方案中，n是5。
在实施方案中，肽化合物由式(I)或式(II)表示。
在一实施方案中，肽化合物由式(I)或SEQ ID NO:1表示。
在一实施方案中，肽化合物由式(II)或SEQ ID NO:2表示。
在实施方案中，肽化合物由式(V)、式(VI)、式(VII)、式(VIII)、式(IX)或式(X)表示。
在一实施方案中，肽化合物由式(V)表示。
在一实施方案中，肽化合物由式(VI)表示。
在一实施方案中，肽化合物由式(VII)表示。
在一实施方案中，肽化合物由式(VIII)表示。
在一实施方案中，肽化合物由式(IX)表示。
在一实施方案中，肽化合物由式(X)表示。
在一实施方案中，肽化合物由式(III)或式(IV)表示。
在一实施方案中，肽化合物由式(III)表示。
在一实施方案中，肽化合物由式(IV)表示。
在一实施方案中，肽化合物由式(XI)、式(XII)或式(XIII)表示。
在一实施方案中，肽化合物由式(XI)表示。
在一实施方案中，肽化合物由式(XII)表示。
在一实施方案中，肽化合物由式(XIII)表示。
在一实施方案中，肽由SEQ ID NO:1的氨基酸序列表示。在一实施方案中，肽由SEQID NO:2的氨基酸序列表示。在一实施方案中，肽由SEQ ID NO:3的氨基酸序列表示。在一实施方案中，肽由SEQ ID NO:4的氨基酸序列表示。在一实施方案中，肽由SEQ ID NO:5的氨基酸序列表示。在一实施方案中，肽由SEQ ID NO:6的氨基酸序列表示。在一实施方案中，肽由SEQ ID NO:7的氨基酸序列表示。在一实施方案中，肽由SEQ ID NO:8的氨基酸序列表示。在一实施方案中，肽由SEQ ID NO:9的氨基酸序列表示。在一实施方案中，肽由SEQ ID NO:10的氨基酸序列表示。在一实施方案中，肽由SEQ ID NO:11的氨基酸序列表示。在一实施方案中，肽由SEQ ID NO:12的氨基酸序列表示。在一实施方案中，肽由SEQ ID NO:13的氨基酸序列表示。
在一实施方案中，将至少一个保护基团在N-和/或C-末端处与所述肽连接。
在一实施方案中，将琥珀酰基基团与肽化合物连接。例如，肽化合物具有琥珀酰基-IKLSGGVQAKAGVINMFKSESY的序列，其对应于SEQ ID NO:6并且具有琥珀酰基基团在N-末端处被连接其上。
在一实施方案中，将乙酰基基团与肽化合物连接。例如，肽化合物具有乙酰基-GVRAKAGVRNMFKSESY(SEQ ID NO:14)的序列。例如，肽化合物具有乙酰基-GVRAKAGVRN(Nle)FKSESY(SEQ ID NO:15)的序列。例如，肽化合物具有乙酰基-YKSLRRKAPRWDAPLRDPALRQLL(SEQ ID NO:16)的序列。例如，肽化合物具有乙酰基-YKSLRRKAPRWDAYLRDPALRQLL(SEQ IDNO:17)的序列。例如，肽化合物具有乙酰基-YKSLRRKAPRWDAYLRDPALRPLL(SEQ ID NO:18)的序列。
在一实施方案中，将至少一种标记试剂在N-和/或C-末端处与所述肽连接。
本领域技术人员将会理解可以使用常用的标记试剂。例如，标记试剂是维生素。例如，标记试剂是生物素。
在一实施方案中，肽化合物生物素化的。例如，肽化合物具有IKLSGGVQAKAGVINMFKSESYK(生物素)的序列，其对应于SEQ ID NO:7且具有生物素分子在C-末端处被连接其上。
在一实施方案中，X16独立地选自Q、P、Y、I和L。
例如，X16是Q。
例如，X16是P。
例如，X16是Y。
例如，X16是I。
在一实施方案中，X17独立地选自Q、P、Y、I和L。
例如，X17是Q。
例如，X17是P。
例如，X17是Y。
例如，X17是I。
在一实施方案中，X20独立地选自Q、P、Y、I和L。
例如，X20是Q。
例如，X20是P。
例如，X20是Y。
例如，X20是I。
在一实施方案中，X21独立地选自Q、P、Y、I和L。
例如，X21是Q。
例如，X21是P。
例如，X21是Y。
例如，X21是I。
在一实施方案中，肽化合物选自：
X1X2X3X4X5GVX6AKAGVX7NX8FKSESY (SEQ ID NO:1)；
(X9)nGVX10AKAGVX11NX12FKSESY (SEQ ID NO:2)；
YKX13LRRX14APRWDX15PLRDPALRX16X17L (SEQ ID NO:3)；
YKX18LRR(X19)nPLRDPALRX20X21L (SEQ ID NO:4)；
IKLSGGVQAKAGVINMDKSESM (SEQ ID NO:5)；
琥珀酰基-IKLSGGVQAKAGVINMFKSESY(其包含SEQ ID NO:6，其中琥珀酰基基团在N-末端处被连接其上)；
IKLSGGVQAKAGVINMFKSESYK(生物素)(其包含SEQ ID NO:7，其中生物素分子在C-末端处被连接其上)；
GVQAKAGVINMFKSESY (SEQ ID NO:8)；
乙酰基-GVRAKAGVRNMFKSESY (SEQ ID NO:14)；
乙酰基-GVRAKAGVRN(Nle)FKSESY (SEQ ID NO:15)；
乙酰基-YKSLRRKAPRWDAPLRDPALRQLL (SEQ ID NO:16)；
乙酰基-YKSLRRKAPRWDAYLRDPALRQLL (SEQ ID NO:17)；和
乙酰基-YKSLRRKAPRWDAYLRDPALRPLL (SEQ ID NO:18)。
在一实施方案中，为了获得或增加肽末端处的优先结合位点，可以通过加入一个或更多个氨基酸残基在C-和/或N-末端处修饰肽化合物。例如，氨基酸可以是半胱氨酸。例如，氨基酸可以是赖氨酸。
可以将本文所述的肽化合物与小分子、肽、抗癌肽、蛋白质、寡核苷酸、诊断剂、成像剂或放射性核素剂、大分子(诸如单克隆抗体)、治疗剂(诸如抗癌剂)和植物化学物质，或者与药物递送系统(包括负载有治疗剂、成像剂、基因、siRNA的纳米颗粒、脂质体、石墨烯颗粒)连接(connected)、连接(linked)、混合或缀合。可以将所得的缀合化合物用作单一疗法或组合疗法，例如用于治疗癌症。
因此，本文公开的第二方面是具有式A-(B)n的缀合化合物，
其中
n是1、2、3或4；
A是如权利要求1至14中任一项所限定的肽化合物，其中所述肽任选地被保护基团保护；和
B是至少一种治疗剂，其中B与A连接。
本文公开的第三方面是具有式A-(B)n的缀合化合物，
其中
n是1、2、3或4；
A是如本文所限定的肽化合物；和
B是至少一种治疗剂，其中B与A连接，在所述肽化合物的赖氨酸残基的游离胺处任选地经由接头连接，或在所述肽化合物的N-末端位置处任选地经由接头连接。
在实施方案中，B经由接头，任选的可剪切接头与A连接。
可以使用的抗癌剂包括例如烷化剂，例如氮芥类(美法仑、环磷酰胺、异环磷酰胺)、亚硝基脲类、烷基磺酸酯类、乙撑亚胺类、三氮烯、甲基肼类和铂配位络合物(诸如顺铂、卡铂、奥沙利铂)。
例如，可以将抗代谢物(诸如叶酸拮抗剂(诸如氨甲喋呤)、嘌呤拮抗剂和嘧啶拮抗剂(诸如5-氟尿嘧啶和卡拉巴豆碱(cytabarine)))用作抗癌剂。
例如，可以将天然产物用作抗癌剂。此类天然产物包括植物产物，例如长春花生物碱类(诸如长春新碱、长春花碱)、紫杉烷类(诸如紫杉醇、多西他赛和卡巴他赛)、毒素类、表鬼臼毒素类(诸如依托泊苷)和喜树碱类(诸如伊立替康)和微生物产物例如抗生素(诸如阿霉素和博来霉素)，以及酶类诸如L-天冬酰胺酶。
可以使用的其它抗癌剂包括例如美登素、奥瑞斯他汀、多拉司林(Dolastin)、卡里奇霉素(Chalicheamicin)、美坦新(Emtansine)、鹅膏蕈碱、吡咯并苯二氮卓类(Pyrrolobenzodiazepines)、微管溶素类、羟基脲、甲磺酸伊马替尼、利妥昔单抗、表柔比星、硼替佐米、唑来膦酸、吉非替尼、甲酰四氢叶酸、帕米膦酸盐和吉西他滨。
例如，可以将以下的激素和拮抗剂用作抗癌剂：诸如皮质类固醇类(强的松、地塞米松)、雌激素类(乙炔雌二醇)、抗雌激素类(他莫昔芬)、激孕甾酮衍生物(醋酸甲地孕酮)、雄激素(丙酸睾酮)、抗雄激素(氟他胺、比卡鲁胺)、芳香化酶抑制剂(来曲唑、阿那曲唑)、5-α还原酶抑制剂(非那雄胺)、GnRH类似物(亮丙瑞林、布舍瑞林)和生长激素、胰高血糖素和胰岛素抑制剂(奥曲肽)。
例如，可以将本文公开的化合物与用于靶向癌症疗法的抗癌剂连接，所述用于靶向癌症疗法的抗癌剂包括例如酪氨酸激酶抑制剂(TKI)(例如甲磺酸伊马替尼、吉非替尼、厄洛替尼、索拉非尼、舒尼替尼、达沙替尼、拉帕替尼、尼罗替尼和硼替佐米)、抗体、单克隆抗体(mAB)(例如利妥昔单抗、曲妥珠单抗、阿仑单抗、西妥昔单抗、贝伐珠单抗和易普利姆玛)、雷帕霉素(mTOR)抑制剂的机制性靶标和抗体-药物缀合物(例如曲妥珠单抗美坦新(T-MD1)。
例如，可以将本文公开的化合物与用于基于肽的癌症疗法的肽连接，所述用于基于肽的癌症疗法的肽为诸如例如布舍瑞林、戈那瑞林、戈舍瑞林、组氨瑞林、亮丙瑞林、那法瑞林、曲普瑞林、阿巴瑞克、西曲瑞克、地加瑞克和加尼瑞克。
在实施方案中，治疗剂是抗癌剂。
例如，抗癌剂是多西他赛、卡巴他赛、紫杉醇、阿霉素和道诺霉素。
在实施方案中，抗癌剂是多西他赛。
在实施方案中，缀合化合物选自式(XIV)、式(XV)、式(XVI)、式(XVII)和式(XVIII)的化合物：
IK(多西他赛)LSGGVQAK(多西他赛)AGVINMFK(多西他赛)SESY
(XIV)
其包含具有SEQ ID NO:6的肽化合物，其中每个赖氨酸残基具有与其连接的多西他赛分子；
GVQAK(多西他赛)AGVINMFK(多西他赛)SESY(XV)
其包含具有SEQ ID NO:8的肽化合物，其中每个赖氨酸残基具有与其连接的多西他赛分子；
GVRAK(多西他赛)AGVRNMFK(多西他赛)SESY(XVI)
其包含具有SEQ ID NO:9的肽化合物，其中每个赖氨酸残基具有与其连接的多西他赛分子；
GVRAK(多西他赛)AGVRN(Nle)FK(多西他赛)SESY(XVII)
其包含具有SEQ ID NO:10的肽化合物，其中每个赖氨酸残基具有与其连接的多西他赛分子；和
YK(多西他赛)SLRRK(多西他赛)APRWDAPLRDPALRQL(XVIII)
其包含具有SEQ ID NO:11的肽化合物，其中每个赖氨酸残基具有与其连接的多西他赛分子。
在实施方案中，缀合化合物由式(XIV)表示。
在实施方案中，缀合化合物由式(XV)表示。
在实施方案中，缀合化合物由式(XVI)表示。
在实施方案中，缀合化合物由式(XVII)表示。
在实施方案中，缀合化合物由式(XVIII)表示。
在另一实施方案中，缀合化合物选自：
琥珀酰基-IK(多西他赛)LSGGVQAK(多西他赛)AGVINMFK(多西他赛)SESY(XIX)
其包含具有SEQ ID NO:6的肽化合物，其中每个赖氨酸残基具有与其连接的多西他赛分子；并且其中琥珀酰基基团被连接在N-末端；
乙酰基-GVRAK(多西他赛)AGVRNMFK(多西他赛)SESY(XX)
其包含具有SEQ ID NO:14的肽化合物，其中每个赖氨酸残基具有与其连接的多西他赛分子；
乙酰基-GVRAK(多西他赛)AGVRN(Nle)FK(多西他赛)SESY(XXI)
其包含具有SEQ ID NO:15的肽化合物，其中每个赖氨酸残基具有与其连接的多西他赛分子；和
乙酰基-YK(多西他赛)SLRRK(多西他赛)APRWDAPLRDPALRQLL(XXII)
其包含具有SEQ ID NO:16的肽化合物，其中每个赖氨酸残基具有与其连接的多西他赛分子。
在实施方案中，缀合化合物由式(XIX)表示。
在实施方案中，缀合化合物由式(XX)表示。
在实施方案中，缀合化合物由式(XXI)表示。
在实施方案中，缀合化合物由式(XXII)表示。
在又一实施方案中，抗癌剂是阿霉素。
在实施方案中，缀合化合物选自式(XXIII)、式(XXIV)和式(XXV)的化合物：
GVQAK(阿霉素)AGVINMFK(阿霉素)SESY(XXIII)
其包含具有SEQ ID NO:8的肽化合物，其中每个赖氨酸残基具有与其连接的阿霉素分子；
GVRAK(阿霉素)AGVRN(Nle)FK(阿霉素)SESY(XXIV)
其包含具有SEQ ID NO:10的肽化合物，其中每个赖氨酸残基具有与其连接的阿霉素分子；和
YK(阿霉素)SLRRK(阿霉素)APRWDAPLRDPALRQLL(XXV)
其包含具有SEQ ID NO:11的肽化合物，其中每个赖氨酸残基具有与其连接的阿霉素分子。
在实施方案中，缀合化合物由式(XXIII)表示。
在实施方案中，缀合化合物由式(XXIV)表示。
在实施方案中，缀合化合物由式(XXV)表示。
例如，缀合化合物可以选自：
乙酰基-GVRAK(阿霉素)AGVRN(Nle)FK(阿霉素)SESY(XXVI)
其包含具有SEQ ID NO:15的肽化合物，其中每个赖氨酸残基具有与其连接的阿霉素分子；和
乙酰基-YK(阿霉素)SLRRK(阿霉素)APRWDAPLRDPALRQLL(XXVII)
其包含具有SEQ ID NO:16的肽化合物，其中每个赖氨酸残基具有与其连接的阿霉素分子。
在实施方案中，缀合化合物由式(XXVI)表示。
在实施方案中，缀合化合物由式(XXVII)表示。
在实施方案中，抗癌剂是卡巴他赛。
在实施方案中，缀合化合物选自式(XXVIII)、式(XXIX)和(XXX)的化合物：
GVRAK(卡巴他赛)AGVRNMFK(卡巴他赛)SESY(XXVIII)
其包含具有SEQ ID NO:9的肽化合物，其中每个赖氨酸残基具有与其连接的卡巴他赛分子；
GVRAK(卡巴他赛)AGVRN(Nle)FK(卡巴他赛)SESY(XXIX)
其包含具有SEQ ID NO:10的肽化合物，其中每个赖氨酸残基具有与其连接的卡巴他赛分子；
和YK(卡巴他赛)SLRRK(卡巴他赛)APRWDAPLRDPALRQL(XXX)
其包含具有SEQ ID NO:9的肽化合物，其中每个赖氨酸残基具有与其连接的卡巴他赛分子。在实施方案中，缀合化合物由式(XXVIII)表示。
在实施方案中，缀合化合物由式(XXIX)表示。
在实施方案中，缀合化合物由式(XXX)表示。
例如，缀合化合物可以选自式(XXXI)、式(XXXII)和(XXXIII)的化合物：
乙酰基-GVRAK(卡巴他赛)AGVRNMFK(卡巴他赛)SESY(XXXI)
其包含具有SEQ ID NO:14的肽化合物，其中每个赖氨酸残基具有与其连接的卡巴他赛分子；
乙酰基-GVRAK(卡巴他赛)AGVRN(Nle)FK(卡巴他赛)SESY(XXXII)
其包含具有SEQ ID NO:15的肽化合物，其中每个赖氨酸残基具有与其连接的卡巴他赛分子；和
乙酰基-YK(卡巴他赛)SLRRK(卡巴他赛)APRWDAPLRDPALRQLL(XXXIII)
其包含具有SEQ ID NO:16的肽化合物，其中每个赖氨酸残基具有与其连接的卡巴他赛分子。
在实施方案中，缀合化合物由式(XXXI)表示。
在实施方案中，缀合化合物由式(XXXII)表示。
在实施方案中，缀合化合物由式(XXXIII)表示。
可以使用的其它治疗剂包括植物化学物质。
在实施方案中，植物化学物质是姜黄素。
在实施方案中，缀合化合物由式(XXXIV)表示：
GVRAK(姜黄素)AGVRN(Nle)FK(姜黄素)SESY(XXXIV)
其包含具有SEQ ID NO:10的肽化合物，其中每个赖氨酸残基具有与其连接的姜黄素分子。
例如，缀合化合物可由式(XXXV)表示：
乙酰基-GVRAK(姜黄素)AGVRN(Nle)FK(姜黄素)SESY(XXXV)
其包含具有SEQ ID NO:15的肽化合物，其中每个赖氨酸残基具有与其连接的姜黄素分子。
在实施方案中，B(至少一种治疗剂)经由接头在所述肽化合物的所述赖氨酸残基的所述游离胺处与A(肽化合物)连接。
在实施方案中，B(至少一种治疗剂)经由接头在所述肽化合物的所述N-末端位置处与A(肽化合物)连接。
在实施方案中，接头选自琥珀酸和二甲基戊二酸接头。
例如，接头是可剪切接头。
例如，接头是不可剪切接头。
如实施例2所示，缀合化合物可以包含将至少一种治疗剂与肽化合物连接的可剪切接头。例如，至少一种治疗剂可以通过酯酶作用于酯键而从肽化合物中被释放。
例如，如实施例2和图4中所示，治疗剂可以通过形成诸如肽键的键在肽上的可用的游离胺上，在赖氨酸或氨基-末端处与肽化合物缀合。
在实施方案中，缀合化合物包含与肽化合物连接的1个治疗剂分子。
在实施方案中，缀合化合物包含与肽化合物连接的2个治疗剂分子。
在实施方案中，缀合化合物包含与肽化合物链接的3个治疗剂分子。
在实施方案中，缀合化合物包含与肽化合物连接的4个治疗剂分子。
在一实施方案中，使治疗剂与肽化合物缀合从而形成缀合化合物不会改变治疗剂的效力。
例如，如表4中所示，在卵巢癌细胞、乳腺癌细胞和皮肤癌细胞中，多西他赛-Katana肽缀合物的IC50值与未缀合的多西他赛的IC50值类似。
也可以将本文公开的缀合化合物用于将治疗剂转运至细胞中，因为它们不是外排泵(诸如从多重抗药性细胞中泵出其它治疗剂的P-糖蛋白膜转运体泵)的底物。
例如，如图6中所示，在MDCK-MDR细胞(即用人多重抗药性基因MDR1转染的肾上皮细胞)中的多西他赛-缀合物摄取比未缀合的多西他赛更快且在更高的浓度下累积。
在另一方面，提供了用于制备本文公开的缀合化合物的方法，所述方法包括：
使接头与所述治疗剂一起反应以获得中间体；
任选地纯化所述中间体；
使所述中间体与所述肽化合物一起反应以获得所述缀合化合物；和
任选地纯化所述缀合化合物；
其中治疗剂在赖氨酸残基或N-末端的游离胺处与肽化合物连接；并且其中肽化合物包含与其连接的1、2、3或4个治疗剂分子连接其上。
例如，肽化合物包含与其连接的1个治疗剂分子。例如，肽化合物包含与其连接的2个治疗剂分子。例如，肽化合物包含与其连接的3个治疗剂分子。例如，肽化合物包含与其连接的4个治疗剂分子。
例如，接头是琥珀酸。
例如，接头是二甲基戊二酸接头。
在实施方案中，肽化合物在与所述中间体反应之前在所述N-末端处被保护。
缀合化合物的合成的实例显示于实施例11和12中。
例如，在与接头结合之前，可以将诸如FMOC的保护基团作为保护基团加入到治疗剂上的游离胺。在它合成后，缀合化合物可以经历从保护基团脱保护。例如，可以使用哌啶将包含保护剂FMOC的缀合化合物脱保护。本领域技术人员将容易理解，其它已知的化学试剂可以被用于缀合化合物的脱保护。
例如，可以通过其乙酰化作用对治疗剂和/或肽化合物的N-末端加帽，从而在N-末端处提供不可逆的保护基团。
在实施方案中，中间体在与所述肽化合物反应之前被活化。
例如，中间体在与所述肽化合物反应之前被任选地选自以下的偶联剂活化：N,N,N′,N′-四甲基-O-(苯并三唑-1-基)脲四氟硼酸盐(TBTU)、(2-(1H-苯并三唑-1-基)-1,1,3,3-四甲基脲六氟磷酸盐)(HBTU)和(1-[双(二甲基氨基)亚甲基]-1H-1,2,3-三唑并[4,5-b]吡啶3-氧化物六氟磷酸盐)(HATU)。
例如，在与肽化合物缀合之前，可以用TBTU(肽偶联试剂)活化包含与接头连接的治疗剂的中间体。
在一实施方案中，缀合化合物在其合成后被纯化。
也可以将本文公开的化合物用于融合蛋白的情形中。例如，可以通过将本文公开的化合物(例如肽化合物)与一种或更多种蛋白质或其部分(诸如功能性结构域)融合来工程化融合蛋白。融合蛋白可以例如通过重组DNA技术被工程化，并且使用蛋白表达系统(诸如细菌或哺乳动物蛋白表达系统)被表达。在一些实施方案中，在蛋白质之间添加肽接头。在其它实施方案中，融合蛋白不包含连接蛋白质的接头。
通常使用的蛋白质表达系统包括源自细菌、酵母、杆状病毒/昆虫、植物和哺乳动物细胞以及最近的丝状真菌(诸如嗜热毁丝霉(Myceliophthora thermophile))的那些蛋白质表达系统。
此外，在一些实施方案中，可以将本文所述的化合物与一种或更多种其它化合物缔合、连接(linked)或连接(connected)以形成多聚体(诸如二聚体、三聚体或四聚体以及分枝肽)。可以例如经由共价键、原子或接头将此类化合物连接在一起。例如，多聚体包含多于一个肽化合物和/或多于一个缀合化合物。用于制备多聚体(例如二聚体的、三聚体的)形式的化合物的方法被描述于美国专利第9,161,988号中，其通过引用整体并入本文。
本公开的另一方面包括治疗疾病的方法，其包括向有需要的对象施用治疗有效量的至少一种本文公开的化合物。
例如，本文提供了治疗涉及分拣蛋白表达的癌症的方法，其包括使表达分拣蛋白的至少一种癌细胞与至少一种本文公开的化合物接触。
例如，本文提供了治疗涉及分拣蛋白表达的疾病的方法，其包括向有需要的对象施用治疗有效量的至少一种本文公开的化合物。
例如，本文提供了治疗涉及选自空泡蛋白分选10(Vps10)受体家族的至少一种受体的表达的癌症的方法，其包括使表达至少一种受体的至少一种癌细胞与至少一种本文公开的化合物接触。
例如，本文提供了治疗涉及选自空泡蛋白分选10(Vps10)受体家族的至少一种受体的表达的疾病的方法，其包括向有需要的对象施用治疗有效量的至少一种本文公开的化合物。
例如，至少一种受体选自分拣蛋白、SorL1、SorCS1、SorCS2和SorCS3。
例如，至少一种受体在神经元细胞和非神经元细胞中的蛋白质运输以及细胞内和细胞间信号传导中发挥多效性功能。
例如，在涉及治疗剂、改善的医学治疗方法中，其中该方法包括通过施用治疗剂与至少一种本文公开的化合物增加向有需要的对象施用的治疗剂的耐受性。
例如，在涉及治疗剂、改善的医学治疗的方法中，其中该方法包括通过施用与至少一种本文公开的化合物缀合的治疗剂增加向有需要的对象施用的治疗剂的耐受性。
例如，本文提供了增加治疗剂的耐受性的方法，其包括：
获得本文公开的缀合化合物，其中缀合化合物包含治疗剂，和
向有需要的对象施用治疗有效量的缀合化合物。
例如，本文提供了增加治疗剂的耐受性的方法，其包括：
使治疗剂与本文公开的肽化合物缀合以获得缀合化合物，和
向有需要的对象施用治疗有效量的缀合化合物。
例如，本文提供了增加治疗剂的抗增殖活性的方法，其包括：
获得本文公开的缀合化合物，其中缀合化合物包含治疗剂，和
向有需要的对象施用治疗有效量的缀合化合物。
例如，本文提供了增加治疗剂的抗增殖活性的方法，其包括：
使治疗剂与本文公开的肽化合物缀合以获得缀合化合物，和
向有需要的对象施用治疗有效量的缀合化合物。
例如，与未缀合的治疗剂相比，抗增殖活性被增加至少10倍、至少20倍、至少30倍、至少40倍、至少50倍、至少60倍、至少70倍、至少80倍、至少90倍或至少100倍。
例如，癌症是卵巢癌、脑癌、乳腺癌、黑色素瘤、结肠直肠癌、成胶质细胞瘤、肝癌、肺癌、前列腺癌、宫颈癌、头部癌症、胃癌、肾癌、子宫内膜癌、睾丸癌、尿路上皮癌、急性成淋巴细胞性白血病、急性髓性白血病、霍奇金淋巴瘤、成神经细胞瘤、非霍奇金淋巴瘤、软组织癌、骨肉瘤、甲状腺癌、膀胱移行细胞癌、维尔姆氏肿瘤、神经胶质瘤、胰腺癌或脾癌。
例如，癌症是涉及分拣蛋白表达的癌症。
例如，本文提供了增加治疗剂的细胞内化的方法，其包括：
获得本文公开的缀合化合物，其中缀合化合物包含治疗剂，和
向有需要的对象施用治疗有效量的缀合化合物。
例如，本文提供了增加治疗剂的细胞内化的方法，其包括：
使治疗剂与本文公开的肽化合物缀合以获得缀合化合物，和
向有需要的对象施用治疗有效量的缀合化合物。
例如，本文提供了增加治疗剂的细胞内化的方法，其包括：
使治疗剂与本文公开的肽化合物缀合以获得缀合化合物，和
使至少一种细胞与缀合化合物接触。
另一方面包括至少一种本文公开的化合物用于治疗疾病的用途。
另一方面包括用于治疗疾病的一种或更多种本文公开的化合物。
在一实施方案中，疾病是癌症。
另一方面提供了治疗癌症的方法，其包括向有需要的对象施用治疗有效量的至少一种本文公开的化合物。
另一方面包括至少一种本文公开的化合物用于治疗癌症的用途。
又一方面包括用于治疗癌症的一种或更多种本文公开的化合物。
在一实施方案中，化合物是本文公开的缀合化合物。
可以使用本文公开的化合物治疗的癌症包括但不限于血液癌和实体癌，包括例如卵巢肿瘤、子宫内膜肿瘤、皮肤肿瘤、脑肿瘤、脊柱肿瘤、乳腺肿瘤、结肠肿瘤、小肠肿瘤、肝肿瘤、肺肿瘤、前列腺肿瘤、头部肿瘤、颈部肿瘤、胃肿瘤、骨肿瘤、甲状腺肿瘤、膀胱肿瘤、肾肿瘤、胰腺肿瘤和脾肿瘤。
在一实施方案中，癌症是卵巢癌。
在一实施方案中，癌症是乳腺癌。
在一实施方案中，癌症是脑部癌症。
在一实施方案中，癌症是肺癌。
在一实施方案中，癌症是皮肤癌。
在实施方案中，癌症是血液癌症。
在实施方案中，血液癌症是白血病，诸如急性髓性白血病(AML)、急性淋巴细胞白血病(ALL)、慢性淋巴细胞白血病(CLL)和慢性髓细胞性白血病(CML)。在另一实施方案中，血液癌症是骨髓瘤。在实施方案中，血液癌症是淋巴瘤，诸如非霍奇金淋巴瘤和霍奇金淋巴瘤。
在实施方案中，癌症是脑癌。在实施方案中，脑癌是成胶质细胞瘤。
在实施方案中，癌症是肝癌。在实施方案中，肝癌是肝细胞腺癌。
在实施方案中，癌症是肺癌。在实施方案中，肺癌是非小细胞肺癌。
在实施方案中，癌症是肾癌。在实施方案中，肾癌是维尔姆氏肿瘤。
在实施方案中，癌症是膀胱癌。在实施方案中，膀胱癌是膀胱移行细胞癌。
在实施方案中，癌症选自乳腺癌、黑色素瘤、结肠直肠癌、成胶质细胞瘤和肝细胞腺癌。
在一实施方案中，缀合化合物诱导癌细胞细胞凋亡。
例如，Katana-药物缀合物在癌细胞(诸如例如卵巢癌细胞、黑色素瘤癌细胞和乳腺癌细胞)中诱导细胞凋亡。
如图10所示，多西他赛缀合物和卡巴他赛缀合物比未缀合的多西他赛和卡巴他赛在癌细胞中诱导细胞凋亡方面更有效。类似地，如图30所示，与未缀合的姜黄素相比，姜黄素缀合物在癌细胞中诱导更大的细胞凋亡。
在一实施方案中，Katana-药物缀合物比未缀合的治疗剂在诱导肿瘤遏制方面更有效。
在一实施方案中，可以将本文公开的化合物用于治疗癌症(例如多重抗药性癌症)。
如图6所示，与未缀合的多西他赛相比，缀合化合物在具有人多重抗药性基因MDR1的MDCK-转染的细胞中以更快的速率和更高的多西他赛缀合物浓度累积。
在一实施方案中，本文公开的化合物还降低了癌细胞的迁移能力。
例如，如图16所示，在与缀合化合物一起孵育的癌细胞中评价了细胞迁移。结果显示了Katana-药物缀合物强烈地降低了癌细胞迁移的能力。
在一实施方案中，可以将本文公开的化合物用于减少肿瘤生长。
如实施例4中所证明的，如通过在小鼠异种移植物肿瘤模型中定量肿瘤发光度所测量的，Katana药物缀合物比未缀合的化合物更有效地减少肿瘤生长。
可以将本文公开的化合物用于治疗其中分拣蛋白/多配体聚糖受体被表达和/或被涉及的疾病。
例如，可以将本文公开的化合物用于治疗炎性疾病(Mortensen,2014)、溶酶体病症(Coutinho,2012,Prabakaran,2012)和心血管疾病(Kjolby,2015)。
例如，提供了本文公开的缀合化合物用于增加至少一种治疗剂的细胞内化的用途。
例如，提供了至少一种本文公开的化合物用于治疗涉及分拣蛋白表达的疾病的用途。
例如，用途是用于治疗涉及选自空泡蛋白分选10(Vps10)受体家族的至少一种受体的表达的疾病。
例如，至少一种受体选自：分拣蛋白、SorL1、SorCS1、SorCS2和SorCS3。
例如，至少一种受体在神经元细胞和非神经元细胞中的蛋白质运输以及细胞内和细胞间信号传导中发挥多效性功能。
例如，提供了至少一种本文公开的化合物用于治疗癌症的用途。
例如，提供了本文公开的化合物在制造用于治疗癌症的药物中的用途。
例如，癌症是涉及分拣蛋白表达的癌症。
例如，癌症是卵巢癌、脑癌、乳腺癌、黑色素瘤、结肠直肠癌、成胶质细胞瘤、肝癌、肺癌、前列腺癌、宫颈癌、头部癌症、胃癌、肾癌、子宫内膜癌、睾丸癌、尿路上皮癌、急性成淋巴细胞性白血病、急性髓性白血病、霍奇金淋巴瘤、成神经细胞瘤、非霍奇金淋巴瘤、软组织癌、骨肉瘤、甲状腺癌、膀胱移行细胞癌、维尔姆氏肿瘤、神经胶质瘤、胰腺癌或脾癌。
例如，提供了本文公开的化合物用于选择性靶向表达分拣蛋白的细胞的用途。
众所周知，某些抗癌剂是有效的，然而与副作用有关。阿霉素例如以剂量依赖性方式与心脏毒性有关。在人类中，阿霉素的最大累积剂量为550mg/m2。超过该阈值的累积剂量与心脏毒性的增加速率相关。如本文所提及的，本文所述的化合物选择性地靶向表达分拣蛋白的细胞。因此，它们提供选择性递送抗癌剂至表达分拣蛋白的癌细胞，因此降低了由抗癌剂(诸如阿霉素)引起的一般细胞毒性。
例如，提供了本文公开的化合物在药物递送系统中的用途。
例如，提供了本文公开的化合物在融合蛋白的情形中的用途，任选地，其中融合蛋白通过使用表达系统，任选地源自以下的表达系统被工程化：细菌、酵母、杆状病毒/昆虫、植物细胞、哺乳动物细胞和丝状真菌，任选地为嗜热毁丝霉真菌(Myceliophthorathermophila fungi)。
例如，提供了本文公开的化合物在制造用于治疗涉及分拣蛋白表达的疾病的药物中的用途。
例如，提供了本文公开的化合物用于增加治疗剂的耐受性的用途。
例如，提供了本文公开的化合物用于增加治疗剂的耐受性的用途。
例如，提供了本文公开的化合物用于增加治疗剂的抗增殖活性的用途。
另一方面是文库，其包含本文公开的化合物中的至少两种。
又一方面是本文描述的文库用于鉴定调节生物靶标的化合物的用途。
正如前面所提到的，可以将本文公开的化合物用于药物递送系统的情形中。例如，可以将化合物连接(connected)、连接(linked)、混合、吸附至负载有治疗剂的纳米颗粒、脂质体、石墨烯颗粒的表面。例如，也可以经由接头、原子或键将化合物连接至表面。
本文公开的一方面是包含至少一种本文公开的化合物的脂质体、石墨烯或纳米颗粒。
另一方面是被用至少一种本文公开的化合物包被的脂质体、石墨烯或纳米颗粒。
另一方面是负载有至少一种治疗剂、基因或siRNA的脂质体、石墨烯或纳米颗粒；并且脂质体或纳米颗粒被用至少一种本文所限定的化合物包被。例如，可以将至少一种化合物连接至脂质体或纳米颗粒的表面。
在一实施方案中，至少一种化合物是本文公开的肽化合物。在一实施方案中，至少一种化合物是本文公开的缀合化合物。
本领域技术人员可以设想脂质体或纳米颗粒的不同实施方案。例如，脂质体或纳米颗粒可以包含在脂质体或纳米颗粒的表面上包被的本文公开的至少一种肽化合物和在脂质体或纳米颗粒内的治疗剂(例如抗癌剂)。例如，脂质体或纳米颗粒可以包含在脂质体或纳米颗粒的表面上包被的至少一种本文公开的缀合化合物和在脂质体或纳米颗粒内的治疗剂(例如抗癌剂)。
例如，本文提供了包含本文公开的两个或更多个化合物的多聚体。
例如，本文公开的两个或更多个化合物直接或间接地相互连接。
例如，两个或更多个化合物经由共价键直接连接。
例如，两个或更多个化合物经由接头间接连接。
例如，多聚体是二聚体、三聚体或四聚体。
现在将参考以下实施例描述本公开的另外实施方案。应理解，这些实施例是为了说明本公开的实施方案的目的，并且不限制本公开的范围。
实施例1
肽化合物的产生
主要目标之一是通过使用目标是在这些细胞上表达的受体的肽-药物缀合物来确定Katana受体介导的平台是否可以有效对抗癌细胞。Katana肽的第一家族源自细菌细胞渗透蛋白，而第二家族基于分拣蛋白配体(颗粒蛋白前体和神经降压素)(表1)。
表1.源自细菌蛋白质(家族1)和两种分拣蛋白配体颗粒蛋白前体和神经降压素(家族2)的分拣蛋白结合肽的Katana肽的氨基酸序列
首先使用表面等离子体共振(SPR)研究这些肽是否可以被分拣蛋白识别。对于这种方法，在肽合成期间将生物素添加在Katana生物制药肽的C-末端。然后使用来自制造商的推荐程序将生物素化的肽(KBP-103)固定在链霉亲和素传感器芯片上。然后将增加浓度的可溶形式的分拣蛋白注射到传感器芯片上。然后实时监测固定化的KBP-103与受体分拣蛋白之间的相互作用。图1中显示了代表性的相互作用曲线，并且从传感图曲线中确定亲和常数以及Ka和Kd并表示于表2中。使用BIA评价软件从各种注射中提取亲和常数(KD、Ka和Kd)。Katana肽对分拣蛋白的亲和力常数(KD)处于低nM范围内，表明肽对这种受体具有高亲和力。
表2：亲和常数KD、Ka和Kd
还研究了通过蛋白质印迹确定的各种癌细胞中分拣蛋白的表达。结果显示可以在大多数经测试的癌细胞中检测到分拣蛋白。在一些情况下，这种受体的表达水平非常高。在许多乳腺癌细胞、黑色素瘤、结肠直肠癌、成胶质细胞瘤和肝细胞腺癌中均发现高表达(图3)。这与文献一致，因为已经报道分拣蛋白在不同实体肿瘤(包括乳腺癌、结肠直肠癌、肺癌、前列腺癌和卵巢癌)中被表达(Roseli,2015；Ghaemimanesh,2014；Hammati,2009)。
实施例2
Katana-肽药物缀合物的产生
首先选择多西他赛和阿霉素用于抗癌剂的原理证明，而在植物化学物质中选择姜黄素。多西他赛是一种紫杉醇的半合成类似物，紫杉醇是来自稀有的太平洋紫杉树短叶红豆杉的树皮的提取物。该药物已被FDA(美国国家癌症研究所(National CancerInstitute))批准用于治疗局部晚期或转移性乳腺癌、头颈癌、胃癌、激素难治性前列腺癌和非小细胞肺癌。可以将多西他赛用作单一药剂使用或与其它化学疗法药物组合使用，这取决于特定的癌症类型和阶段。卡巴他赛(先前的XRP-6258，商品名JevtanaTM)是天然紫杉烷的半合成衍生物。它是由Sanofi-Aventis开发的微管抑制剂。它于2010年6月17日获得美国FDA批准用于治疗激素难治性前列腺癌。阿霉素是一种与天然产物道诺霉素密切相关的蒽环霉素抗肿瘤抗生素(注意：在这个情形下，这并不意味着它用于治疗细菌感染)，并且与所有蒽环霉素类一样，通过嵌入DNA起作用，最严重的副作用是危及生命的心脏损伤(美国国家癌症研究所)。其经批准被单独或与其它药物一起使用以治疗：急性成淋巴细胞性白血病(ALL)、急性髓性白血病(AML)、乳腺癌、胃(gastric/stomach)癌、霍奇金淋巴瘤、成神经细胞瘤、非霍奇金淋巴瘤、卵巢癌、小细胞肺癌、软组织和骨肉瘤、甲状腺癌、膀胱移行细胞癌和维尔姆氏肿瘤。姜黄素(二阿魏酰基甲烷)是一种存在于香料姜黄((姜黄)Curcumalonga)中的黄色色素，如由超过6,000次引用表明其已经与抗氧化、抗炎性、抗癌、抗病毒和抗细菌活性相关(Hosseini,2015)。
可以使用胺缀合策略将抗癌剂(例如多西他赛、卡巴他赛、阿霉素)或植物化学物质(例如姜黄素)缀合在肽上。简而言之可以通过与活化的多西他赛形成肽键(酰胺键)在肽上可用的游离胺(赖氨酸或氨基末端)上将多西他赛与Katana肽缀合。在KBP-101中，有4个游离胺可用于缀合，即N-末端和3个赖氨酸。因此，可以通过将1、2、3和4个多西他赛添加至肽来产生不同的缀合物。阿霉素和姜黄素可以使用类似的缀合策略(图4和5)。
例如，以下策略已被用于药物与Katana肽的缀合。N-末端被封闭并且所有3个其它缀合位点都被多西他赛饱和，从而形成每个肽分子的3个多西他赛分子的肽药物缀合物。通过HPLC分析整个缀合，并通过质谱(MALDI-TOF)确认缀合物。多西他赛可以通过酯酶剪切酯键被释放。
使用可剪切接头缀合抗癌剂(例如多西他赛、阿霉素)和植物化学物质(例如姜黄素)。然后可以通过酯酶对酯键的作用将天然药物从载体释放。在图5中呈现了2种Katana-抗癌剂缀合物(A和B)以及一种植物化学物质-Katana药物缀合物(C)的结构的实例。
已经产生多西他赛、阿霉素、姜黄素、卡巴他赛和Katana肽之间的不同缀合物。在下表3中总结了这些缀合物。
表3
实施例3
缀合化合物的体外作用
评价多西他赛-Katana肽缀合物对各种细胞系增殖的影响，并与未缀合的多西他赛比较(表4)。在测试的癌细胞中，对多西他赛-Katana肽缀合物所获得的IC50值与多西他赛的IC50值非常类似。总体而言，这些结果显示了多西他赛-Katana肽缀合物在体外阻断细胞增殖的效力类似于未缀合的多西他赛，表明抗癌剂的效力在它们缀合后保持不变。
表4.使用[3H[-胸苷掺入测定的Katana-药物缀合物对细胞增殖的影响.呈现了从抗增殖曲线获得的IC50(nM)。
IC50(nM)
lC50(nM)
为了确定抗癌药物-Katana-肽缀合物是否也可以是P-gp底物，使用具有人MDR1的MDCK转染细胞(MDCK-MDR1)。如图6中所示，在P-gp竞争性抑制剂环孢菌素A(CsA)存在下，P-gp底物[3H]-多西他赛的累积增加了2倍。然而，缺乏CsA对[125I]-多西他赛-Katana肽缀合物累积的影响表明，当它与KBP缀合后，药物部分不再被P-gp识别。后者的结果证实Katana缀合物有效地绕开了P-gp的外排作用。
另外，在图7中，在卵巢SKOV3癌细胞和SKMEL-28黑色素瘤癌细胞中比较了放射性标记的[125I]-Katana缀合物(KBA-105)的摄取与未缀合的放射性标记的[3H]-多西他赛的摄取。结果证明，在SKOV3细胞(图7A)以及SKMEL-28细胞(图7B)中的缀合物摄取比未缀合的多西他赛更快且在更高浓度下累积。
在表达分拣蛋白受体的细胞中Katana缀合物的摄取增加。如图8中所示，在其中分拣蛋白表达降低的细胞中，Katana阿霉素缀合物(KBB106)的摄取减少。例如，图8A显示了在用分拣蛋白siRNA转染的卵巢癌细胞中KBB106的摄取减少，并且图8B显示了由于分拣蛋白配体(即Katana肽和颗粒蛋白前体)的药理学抑制导致的卵巢癌细胞中KBB106的摄取减少。
还通过使用膜联蛋白V/PI染色的流式细胞术分析评价了多西他赛和KB-肽上的缀合的多西他赛对卵巢癌细胞死亡的影响(图9)。结果表明，与游离药物相比，缀合的多西他赛诱导了更高和持续的细胞死亡(图9A)。为了诱导类似的细胞死亡，需要添加P-gp抑制剂环孢菌素A(CsA)(图9B)。这些结果显示了，KBP-多西他赛缀合物更有效，部分原因是它绕开P-gp外排泵的能力。
也评估了在暴露于药物5小时后，增加浓度的多西他赛-Katana肽缀合物(KBA-105)或多西他赛浓度对卵巢SKOV3癌细胞的细胞凋亡的影响(图9)。结果显示，KBA-105缀合物在相对较短的孵育时间后诱导这些癌细胞的细胞凋亡。
将这种细胞凋亡测定用于在各种癌细胞上筛选缀合物(图10)。结果表明，5小时后，全部Katana-药物缀合物均诱导所测试的癌细胞模型的细胞凋亡。它们中的大多数也比未缀合的母体药物(多西他赛或卡巴他赛)更有效。
为了确定由Katana-药物缀合物诱导的细胞凋亡是否与受体介导的内吞作用相关，在不存在或存在过量游离肽和两种分拣蛋白配体神经降压素(NT)或颗粒蛋白前体的情况下进行测定(图11)。游离肽的添加逆转了由缀合物诱导的SKOV3(图11A)和SK-MEL28(图11B)的细胞凋亡，表明了由KBA-105诱导这些细胞是受体介导的。此外，两种分拣蛋白配体，神经降压素和颗粒蛋白前体也抑制了Katana-药物缀合物诱导的细胞凋亡，表明分拣蛋白参与这种受体介导的细胞凋亡诱导。
KBP产物对SKOV3卵巢癌细胞迁移的影响。将这些癌细胞与游离多西他赛或Katana-多西他赛缀合物一起孵育2小时，然后使用xCELLigence生物传感器系统实时测量细胞迁移作为时间的函数。这种测定反映了这些分子对SKOV3卵巢癌细胞功能的细胞效应。如图12中所示，当与游离多西他赛比较时，Katana-多西他赛缀合物对SKOV3细胞具有更强的影响，从而导致更强的对它们迁移的抑制。缀合的多西他赛对癌细胞迁移的更强抑制是这些癌细胞的侵袭或转移潜能受缀合物的影响要比未缀合的多西他赛更多的指示。
有趣地是，添加过量的游离Katana肽(图13A)或神经降压素(图13B)强烈逆转了Katana多西他赛缀合物的迁移作用。通过游离多西他赛的癌细胞迁移的减少不受Katana肽或神经降压素的影响。此外，发现使用特定分拣蛋白siRNA进行的分拣蛋白基因沉默逆转了Katana-多西他赛缀合物对癌细胞迁移的影响(图13C)。这些结果支持Katana-多西他赛缀合物具有不同于游离药物的独特作用机制的概念。分拣蛋白配体神经降压素显著逆转了缀合物的细胞效应的事实进一步支持了分拣蛋白家族的受体成员参与缀合物内化或作用机制。
评价在使用特异性siRNA或乱序siRNA序列的分拣蛋白基因沉默后多西他赛和KBP-多西他赛对细胞迁移的影响。在所用的实验条件下，分拣蛋白基因表达被降低了约80％。图14中的结果清楚地显示游离多西他赛对SKOV3细胞迁移的影响不受分拣蛋白表达降低的影响。相反，当分拣蛋白表达低时，缀合的多西他赛的影响被强烈降低。在卵巢癌细胞中，使用特异性的siRNA降低分拣蛋白表达逆转了缀合的多西他赛细胞毒性效应，但不是游离多西他赛的细胞毒性效应。
还将这种第二种细胞测定用于筛选不同的Katana-药物缀合物(图15)。如图15A中所示，将卵巢(SKOV3和ES-2)癌细胞与阿霉素或缀合的阿霉素(KBB106)(2μM)一起孵育2小时，洗涤，然后进行细胞迁移。结果显示了Katana-药物缀合物强烈影响这些癌细胞迁移的能力。例如，KBA-106几乎完全消除了这些细胞迁移的细胞能力，表明Katana-药物缀合物对癌症侵袭或转移分散发挥了强烈的作用。然而，如图15B和15C中所示，在存在分拣蛋白配体(神经降压素，Katana肽或颗粒蛋白前体)的情况下，当将癌细胞与缀合的阿霉素(KBB106)孵育时，阿霉素缀合物的迁移影响被逆转。
表面等离子体共振、细胞凋亡和迁移结果提供了Katana-肽和缀合物与分拣蛋白受体相互作用或需要分拣蛋白受体的证据。有趣地是，已经报道，与正常卵巢组织相比，分拣蛋白受体在卵巢癌中被过表达(图16A)(Hemmati 2009,Ghaemimanesh 2014)。也显示了分拣蛋白在各种人实体肿瘤(诸如结肠、前列腺、胰腺和肺)中被表达。此外，分拣蛋白表达与乳腺癌的侵袭性有关(Roseli,2015)。在这里，还观察到这种受体在I级至IV级的各种人脑肿瘤中(图16B)以及I级至IV级的各种人卵巢癌中(图16C)被表达。总之，由于分拣蛋白参与了Katana-肽的转运，这些结果表明多西他赛-Katana肽缀合物可以靶向表达分拣蛋白受体的肿瘤。
除了在卵巢肿瘤和脑肿瘤中关于分拣蛋白表达的这些结果之外，已经在“人类蛋白质图谱(Human protein atlas)”中报道了在各种人类癌症中的高水平的分拣蛋白。取自网站http://www.proteinatlas.org/的图17清楚地表明，已经在人类癌症(包括黑色素瘤、乳腺癌、子宫内膜癌和肺癌)的活组织检查中检测到高分拣蛋白表达。
实施例4
缀合化合物的体内作用
分拣蛋白在癌组织中被过度表达，但在健康组织中几乎检测不到。如图18A和18B所证明，组织中的分拣蛋白表达作为恶性组织表型的函数而增加。特别地，分拣蛋白表达在卵巢转移癌中更高。
a)多西他赛
为了评价药物缀合至Katana生物制药肽对药物药代动力学和组织分布的影响，给小鼠注射[125I]-多西他赛-Katana肽缀合物。在不同的时间收集血浆(图19)。定量与血浆相关的放射性并确定药代动力学参数。如图19所示，缀合的多西他赛的半衰期为6小时。这种血浆半衰期显著高于文献中报道的游离多西他赛的1hr半衰期(来自欧洲药品管理局(theEuropean Medicines Agency)的多西他赛Teva的评估报告)。在图20中，在iv弹丸注射后，将多西他赛-Katana肽缀合物的血浆浓度与未缀合的多西他赛的血浆浓度进行比较。结果表明，与未缀合的多西他赛的曲线下面积相比，多西他赛-Katana肽缀合物的曲线下面积要高得多。
对于组织分布，在等效剂量多西他赛的情况下，通过iv弹丸注射施用放射性标记的Katana-药物缀合物(KBA-105)和多西他赛(图21)。在指定的时间(1、6和24小时)，在2、6和24小时的iv弹丸注射后，用盐水以8ml/min的流速进行全身灌注8min。然后收集组织，并定量放射性并定量放射性标记的缀合物(KBA-105)的水平。结果显示了在肺、肝、脾和肾脏组织中缀合物的高累积。此外，在大多数组织中KBA-105的测量水平高于多西他赛的那些测量水平。为进一步表征两种放射性标记的化合物的水平差异，计算不同组织的AUC1-24值，并在表5中进行比较。KBA-105与多西他赛之间的AUC1-24比率表明Katana-药物缀合物可以以比未缀合的多西他赛更高的水平累积。
表5.来自图21组织分布结果的放射性标记的多西他赛和Katana-药物缀合物(KBA-105)的曲线下面积(AUC1-24)。
为了进一步评价Katana-药物缀合物的体内功效，将表达荧光素酶的SKOV3癌细胞植入小鼠侧腹中。在等效剂量(10mg/kg/周)多西他赛的情况下，用多西他赛或Katana-药物缀合物KBA-105处理具有类似肿瘤的小鼠。用多西他赛处理的小鼠接受3次处理，并且用KBA-105处理的小鼠接受5次处理。通过注射荧光素酶底物萤光素和使用来自Carestream的Xtreme成像系统在不同的天数进行肿瘤成像。
图22中的成像结果显示了，与用多西他赛处理的小鼠相比，用KBA-105处理的小鼠在不同天数的低得多的发光度。然后定量发光度并作为植入后天数的函数作图(图23)。这些早期定量的发光度结果显示KBA-105可能比未缀合的多西他赛更有效地减少这种卵巢动物肿瘤模型中的肿瘤生长。用多西他赛处理的小鼠的体重减轻接近20％(图22A)，而用KBA-105处理的小鼠的体重仍然不受20mg/kg/周处理的影响(图22B)。此外，用KBA-105处理5次后处理的小鼠的体重不受影响(图24)，而以等效剂量的多西他赛处理的小鼠仅在3次处理后就受到强烈影响。
b)阿霉素
还评价了缀合的和未缀合的阿霉素对卵巢皮下肿瘤的作用。用ES-2卵巢癌细胞植入小鼠。使用卡尺测量肿瘤生长。当肿瘤达到约150mm3的肿瘤体积时，在等效剂量(6mg/kg/周)阿霉素的情况下，用阿霉素或Katana-阿霉素缀合物KBB106处理小鼠。结果显示，在用KBB106处理的小鼠中，第一次处理后的肿瘤体积保持大致相同，然而在用阿霉素处理的小鼠中，第一次处理后肿瘤体积增加(图25A)。类似地，如图25B所证明，与媒介物组相比在KBB106处理的小鼠中肿瘤体积减少了97％，相较之下，与媒介物组相比阿霉素处理的小鼠中的肿瘤体积减少了43％。与对照组相比，SKOV3异种移植物肿瘤在KBB106处理的小鼠中的进展也被显著降低(图26A)。
不仅缀合的阿霉素更有效地遏制大小，缀合的阿霉素的耐受性也优于未缀合的阿霉素的耐受性。在图25C中，显示用KBB106的处理持续至处理后第66天。此外，用KBB106的处理对小鼠体重几乎没有影响(图26B)，因此表明用缀合的阿霉素处理耐受良好。
在多西他赛和多西他赛缀合物处理的小鼠中评估残余的肿瘤负荷(图27)。用表达荧光素酶的MDA-MB231乳腺癌细胞植入小鼠的侧腹中。使用来自Carestream的体内成像系统显现通过发光度计的肿瘤生长。用媒介物、多西他赛(15mg/kg/周)或KBA106(50mg/kg/周)处理小鼠。处理后74天后，在多西他赛缀合物处理的小鼠中未检测到发光(图27B和27C)，因此表明小鼠中没有残余肿瘤。
c)姜黄素
还针对癌细胞增殖测试了未缀合的和缀合的植物化学物质姜黄素(图28)。将乳腺癌细胞(MDA-MB231)用增加浓度的KBC106或姜黄素一起孵育。72hr后，进行胸苷掺入测定以评估两种分子的抗增殖性质。从抗增殖曲线提取IC50值。如图28中所示，与未缀合的姜黄素相比，KBC106对这些乳腺癌细胞具有更强的抗增殖活性(约100倍)。还使用不同类型的癌细胞(卵巢癌细胞、乳腺癌细胞、皮肤癌细胞和结肠直肠癌细胞)进行了增殖测定。从抗增殖曲线计算IC50值。在所有情况下，姜黄素缀合物(KBC106)比未缀合的姜黄素具有更强的抗增殖活性(9-100倍)，如下表6所示。
表6：缀合的和未缀合的姜黄素的抗增殖IC50值
如本文所证明，姜黄素缀合物(KBC106)的细胞摄取是分拣蛋白依赖性的。如图29A中所示，使用荧光实时成像评估了与缀合的或未缀合的姜黄素一起孵育的癌细胞的对两种分子的摄取。发现与未缀合的姜黄素相反，细胞增加了缀合的姜黄素的细胞内化。此外，显示出分拣蛋白配体(神经降压素，颗粒蛋白前体和游离Katana肽)抑制缀合的姜黄素的细胞更新(图29B和29C)。
在图30中，进一步评价了姜黄素缀合物(KBC106)是否诱导癌细胞细胞凋亡。将癌细胞与KBC106和姜黄素一起孵育。第一列，可以通过荧光显微镜检查术监测对两种分子的摄取。对于KBC1006，检测到更高的荧光累积，表明对缀合物具有更好的细胞内化。在这些癌细胞中，姜黄素累积几乎不可见。在第二列中，通过荧光和图像检测α-微管蛋白，表明KBC106强烈影响癌细胞微管，而单独的姜黄素对它们几乎无影响。在第三列中，将细胞核用荧光染料DAPI标记。与未缀合的姜黄素相反，KBC106清楚地诱导核片段化，显示了缀合物诱导癌细胞的细胞凋亡，而单独的姜黄素不诱导细胞凋亡。最后一列(合并)显示了KBC106荧光与α-微管蛋白检测共定位。
姜黄素缀合物(KBC106)也显示出对子宫内膜癌生长具有抑制效果(图31)。将子宫内膜(MES)癌细胞植入小鼠侧腹。使用卡尺测量肿瘤生长。当肿瘤达到约150mm3的体积时，用KBC106以60mg/kg/一周两次处理小鼠。处理后第28天的结果显示，与媒介物组相比，KBC1006抑制肿瘤生长约62％，如表7中所示。
表7：在第28天KBC106对子宫内膜肿瘤生长的抑制效果
总之，结果描述了包括抗癌药物(小分子，生物制剂诸如mAb)和植物化学物质的药物-Katana肽缀合物的新应用。这些抗癌药物缀合物在体外保持活性，如通过有效抑制细胞增殖和诱导细胞毒性所证明的。重要地是，用Katana肽缀合物获得的数据表明，抗癌药物与Katana肽的缀合允许它们从P-gp作用中逃脱。此外，这些结果表明抗癌药物或植物化学物质与Katana肽的缀合通过以下方式增加它们在体内的功效：1)靶向在癌细胞中被表达或被过表达的受体(诸如分拣蛋白)，因此将潜在地减少缀合的药物的副作用，2)绕开P-gp外排泵和/或3)通过修改治疗药物的药代动力学或生物利用度。事实上，例如抗癌药物多西他赛与Katana肽的缀合将游离药物的半衰期增加约1小时至约6小时。此外，通过特异性靶向受体，与如在用KBA-105和KBB106的体内研究中观察到的等效剂量的未缀合的药物相比，Katana-药物缀合物更好地被耐受。总之，本公开中描述的数据表明可以将与Katana肽缀合的抗癌药物和植物化学物质针对原发性肿瘤(诸如卵巢癌、乳腺癌、肺癌和皮肤癌)使用。特别地，可以将这些缀合物针对涉及分拣蛋白的表达或过表达的癌症使用。此外，由于P-gp外排泵可以限制在其它疾病中潜在有效药物的累积，因此与Katana肽的缀合可以潜在地被用于肿瘤之外的适应症。此外，可以将Katana肽与其它类型的分子(包括抗癌肽、较大的生物制剂(例如单克隆抗体)、siRNA以及诸如纳米颗粒和脂质体的药物递送系统)缀合。
实施例5
细胞增殖测定
将癌细胞在96孔白板(Perkin Elmer)中培养。将它们在血清去除的培养基中同步化24小时。将细胞与未缀合的药物(多西他赛、卡巴他赛、阿霉素)或与药物-Katana肽缀合物一起孵育2天或3天后，将所有培养基吸出并且在37℃/95％O2/5％CO2下将细胞用含有2.5μCi/mL[甲基-3H]胸苷(Perkin Elmer)的培养基进行脉冲-标记4小时。在添加闪烁液(Microscint 0,Perkin Elmer)之前，将细胞洗涤、固定并干燥。24小时后，通过在平板读数仪(TopCount，Perkin Elmer)上计数来定量细胞相关的氚。针对每个药物浓度对掺入的[3H]胸苷绘图。
实施例6
通过xCELLigence生物传感器系统进行的细胞迁移测定
使用实时细胞分析仪(RTCA)双板(DP)仪器，xCELLigence系统(RocheDiagnostics,QC)进行实验。根据供应商的说明书使用该系统。然后，将细胞(25 000个细胞/孔)接种在CIM-Plates 16(Roche diagnostics)的无血清培养基中。这些板类似于常规跨孔(Transwells)(8-μm孔径)，在膜底部上有金电极阵列，其可以提供细胞迁移的实时测量。在细胞接种之前，将来自上室的孔的底面用25μL在PBS中的0.15％明胶包被并在37℃下孵育1h。将下室用无血清培养基填充。将每孔的上室用100μL的SKOV3-荧光素酶细胞(2.5×105个细胞/mL)填充，SKOV3-荧光素酶细胞用或不用缀合的多西他赛(2μM)或游离多西他赛(2μM)预处理2小时。粘附30min后，每5分钟监测细胞迁移共8h。通过RTCADP仪器测量阻抗值并将其表示为被称为细胞指数的任意单位，其反映了迁移活性细胞的量。在重复孔中进行每个实验。
实施例7
缀合物的碘化
使来自Sigma的碘珠用标准程序碘化肽。将Katana-肽在0.1M磷酸盐缓冲液，pH6.5(PB)中稀释。每种蛋白质使用两个碘珠。将这些珠子在Whatman过滤器上用3ml的PB洗涤两次并重悬于60μl的PB中。在室温下将来自Amersham-Pharmacia生物技术的125I(1mCi)添加至珠悬浮液5min。通过添加100μg(80-100μl)引发每种肽的碘化。在室温下孵育10min后，通过HPLC去除游离碘。
实施例8
MDCK-MDR1中的药物累积
在于24孔板中生长的过表达P-gpMDCK-MDR1细胞中测量了[3H]-多西他赛和[125I]-多西他赛-Katana肽缀合物的细胞摄取。将细胞用PBS洗涤三次，并在37℃下，在有或没有P-gp抑制剂环孢菌素A(10μM)的情况下，在没有血清的培养基中预孵育30min。然后添加放射性标记的分子(50nM)60min。将细胞用冰冷的PBS快速洗涤三次，然后在500μL的0.1MNaOH中裂解。通过β-闪烁计数(Packard型1900TR)对保留在细胞中的放射性标记分子的量进行计数。平行使用等份的细胞裂解物以确定细胞蛋白质浓度。
实施例9
异种移植物肿瘤模型
将表达荧光素酶的SKOV3癌细胞(2.5x106个细胞)植入小鼠的右侧腹中。通过注射荧光素酶底物萤光素，使用来自Carestream的近红外(NiR)成像系统来监测肿瘤生长。在等效剂量(10mg/kg/周)多西他赛的情况下，用多西他赛和Katana-药物缀合物(KBA-105)处理小鼠。由于体重减轻(约-20％)，3次注射后停止多西他赛处理。用KBA-105的处理更好地被耐受，因为即使在5次处理后，以等效剂量处理的小鼠的体重也不受影响。用仪器软件定量与SKOV3/Luc癌细胞的肿瘤生长相关的发光度作为治疗后天数的函数。
实施例10
药代动力学和组织分布
使用碘珠将多西他赛-Katana肽缀合物用[125I]放射性标记。放射性标记后，去除游离碘。向小鼠注射5mg/kg的多西他赛-[125I]-Katana肽缀合物。在指定的时间收集血浆。1、2和24小时后，将一些小鼠用盐水灌注，处死并收集组织。在放射性计数器中测量血浆和组织中的放射性，以及计算结果并且对于血浆以μl/ml表示或对于组织以ng/g表示。
实施例11
多西他赛-Katana肽(KBA-106)缀合物的合成
DoceSuOH
在搅拌下将DIEA(0.21ml,1.2mmol)逐滴加入到在DMSO(5ml)中的多西他赛(0.81g,1.0mmol)和琥珀酸酐(105mg,1.05mmol)的悬浮液。将混合物在室温下搅拌并通过UPLC-MS监测。2h后，反应完成。去除溶剂，并将所得残余物溶于DCM中并负载在Biotage硅胶柱上进行纯化。冻干后获得呈白色粉末的DoceSuOH，UPLC-MS纯度>95％。
KBP106-(SuDoce)2
为了预活化DoceSuOH，将DIEA(0.234mmol)逐滴加入到在DMSO(3-4ml)中的DoceSuOH(213mg,0.234mmol)和TBTU(75mg,0.234mmol)的溶液中。通过UPLC-MS监测预活化的完成，然后添加在DMSO(0.2ml)中的KBP106(120mg,0.062mmol)的溶液。将混合物在室温下搅拌。通过UPLC-MS监测反应直至完成。使用30RPC树脂柱和AKTA纯化器系统(10％至80％ACN)纯化反应混合物，冻干后得到呈白色粉末的KBP106-(SuDoce)2(145mg)，UPLC-MS纯度>95％。
实施例12
阿霉素-Katana肽(KBA-106)缀合物的合成
阿霉素Fmoc-DmgOH
为了在阿霉素上掺入接头Dmg，Doxo的糖中的游离伯胺需要首先由Fmoc基团保护。在Biotage系统上纯化这种DoxoFmoc中间体。然后在搅拌下将DIEA(0.21ml,1.2mmol)逐滴加入到在DMSO(x ml)中的DoxoFmoc(0.81g,1.0mmol)和二甲基戊二酸(Dmg)酸酐(105mg,1.05mmol)的悬浮液。将混合物在室温下搅拌并通过UPLC-MS监测反应。完成后，去除溶剂，并将所得残余物溶于DCM中并负载到Biotage硅胶柱上进行纯化。冻干后获得呈微红色粉末的DoxoFmoc-DmgOH，UPLC-MS-MS纯度>95％。
KBB106-(Dmg-FmocDoxo)2缀合物
为了预活化DmgOH-FmocDoxo，将DIEA(0.234mmol)逐滴加入到在DMSO(3-4ml)中的DmgOH-FmocDoxo(27.3mg,0.03mmol)和TBTU(9.6mg,0.03mmol)的溶液中。通过UPLC-MS监测预活化的完成，然后添加在DMSO(0.2ml)中的KBP106(16mg,0.008mmol)溶液。将混合物在室温下搅拌。通过UPLC-MS监测反应直至完成。使用30RPC树脂柱和AKTA纯化器系统(10％至80％ CAN；0.1甲酸)纯化反应混合物以得到KBP106-(DmgOH-FmocDoxo)2。
从KBP106-Dmg-FmocDoxo进行Fmoc脱保护
将Dmg-FmocDoxo(50mg)溶于1.5ml DMSO中并添加10μl哌啶。混合物瞬间变成紫色，并且通过UPLC-MS监测从Doxo部分去除Fmoc基团。在约10分钟内完成脱保护。为了去除游离Fmoc基团和哌啶，然后将混合物直接负载到30RPC树脂柱上以使用具有10-80％ ACN；0.1甲酸梯度的AKTA纯化器系统纯化。获得呈微红色粉末的KBP106-Dmg-Doxo，UPLC-MS纯度>95％。
实施例13
姜黄素-Katana肽(KBA-106)缀合物的合成
将Dmg(1.5当量)添加至在吡啶(4ml)中的姜黄素(0.5g)溶液。将混合物在65℃回流下搅拌并通过UPLC-MS监测反应。Dmg掺入后，去除溶剂，并将所得残余物溶于DCM中并负载在Biotage硅胶柱上进行纯化。冻干后获得呈黄色粉末的Cur-DmgOH，UPLC-MS纯度>95％。
添加NHS接头至DmgOH
在这个第二步中，将NHS接头添加至DmgOH-Cur。简而言之，将5倍过量的NHS(224mg；1.95mmol)和EDC(373mg；1.95mmol)添加至在DMSO中的DmgOH-Cur(200mg；0.39mmol)。在NHS掺入完成后，将混合物直接负载在30RPC树脂上以在AKTA纯化器系统(10-80％ ACN；0.1％FA梯度)上纯化
KBP106-(DmgCur)2
通过将KBP106(50mg；0.026mmol)溶液加入到溶于DMSO中的NHS-DmgCur(38mg；0.062mmol)，在DMSO 80％(pH 9.8)中进行缀合。将混合物在室温下搅拌并通过UPLC-MS监测缀合。使用30RPC树脂柱和AKTA纯化器系统(10％至80％ ACN；0.1甲酸)纯化反应混合物，以在冻干后得到呈黄色粉末的KBP106-(DmgCur)2，UPLC-MS纯度>95％。
实施例14
卡巴他赛-Katana肽(KBA-106)缀合物的合成
卡巴他赛-SuOH
在搅拌下将DIEA(0.21ml,1.2mmol)逐滴加入到在DMSO(x ml)中的卡巴他赛(0.81g,1.0mmol)和琥珀酸酐(105mg,1.05mmol)的悬浮液中。将混合物在室温下搅拌并通过UPLC-MS监测。2h后，反应完成。去除溶剂，并将所得残余物溶于DCM中并负载在Biotage硅胶柱上进行纯化。冻干后获得呈白色粉末的卡巴他赛-SuOH，UPLC-MS-MS纯度>95％。
KBP106-(Su卡巴他赛)2
为了预活化卡巴他赛SuOH，将DIEA(0.234mmol)逐滴加入到在DMSO(3-4ml)中的卡巴他赛SuOH(219mg,0.234mmol)和TBTU(75mg,0.234mmol)的溶液中。通过UPLC-MS监测预活化的完成，然后添加在DMSO(0.2ml)中的KBP106(120mg,0.062mmol)溶液。将混合物在室温下搅拌。通过UPLC-MS监测反应直至完成。使用30RPC树脂柱和AKTA纯化器系统(10％至80％ACN)纯化反应混合物，冻干后得到呈白色粉末的KBP106-(Su卡巴他赛)2(150mg)，UPLC-MS-MS纯度>95％。
实施例15
多西他赛-Katana肽(KBA-105)缀合物的合成
2步骤制备过程：
1.在多西他赛上添加接头
-添加琥珀酸(过夜)
-在Biotage上纯化(1小时)
-蒸发溶剂(30min)
2.缀合
-用TBTU活化多西他赛(5-10min)
-添加肽
-在DMF中反应(无需遵循pH)
-反应时间30min
-在30RPC上纯化，然后在-80℃下冻干
总产率约为75％
纯度>95％。
实施例16
阿霉素-Katana肽(KBB-106)缀合物的合成
4步骤制备过程：
1.在阿霉素游离胺上添加Fmoc
2.在阿霉素-Fmoc中间体上掺入接头
-二甲基戊二酸(DMG)接头
-在Akta上纯化阿霉素(Fmoc)-DMG，然后冻干
3.缀合
-用TBTU活化阿霉素-DMG(5-10min)
-添加肽
-在DMSO中反应(无需遵循pH)
-反应时间30min
-在AKTA(30RPC树脂)上纯化，然后在冻干
4.用哌啶对Fmoc基团脱保护(5-10min)，然后纯化
总产率约为42％
纯度>95％。
本公开说明书的第38页第6段至第61页第8段(对应于PCT国际公开文本的段落[00154]至[00371])的实施方案以这样的方式呈现在本公开中，以便证明当可适用时可以进行实施方案的每个组合。因此，这些实施方案在说明书中以等同于对依赖于前述权利要求中任一项的所有实施方案(覆盖先前呈现的实施方案)做出从属权利要求的方式呈现，由此证明它们可以以所有可能的方式被组合在一起。例如，当适用时，在说明书的第38页第6段至第61页第8段(对应于PCT国际公开文本的段落[00154]至[00371])的实施方案之间的所有可能的组合在此被本公开涵盖。
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Claims (38)

1.肽化合物，其由式(XI)组成：
YKSLRRKAPRWDAPLRDPALRQLL(XI)(SEQ ID NO:11)，
其中将至少一个保护基团和/或至少一种标记试剂在N-和/或C-末端处与所述肽化合物连接。
2.肽化合物，其由式(XI)组成：
YKSLRRKAPRWDAPLRDPALRQLL(XI)(SEQ ID NO:11)。
3.如权利要求1所述的肽化合物，其中所述至少一个保护基团与所述N-末端连接。
4.如权利要求1或3所述的肽化合物，其中所述肽化合物与所述至少一个保护基团连接，所述至少一个保护基团为乙酰基或琥珀酰基。
5.如权利要求1或3所述的肽化合物，其中所述肽化合物由式(XXXX)表示：
乙酰基-YKSLRRKAPRWDAPLRDPALRQLL(XXXX)(SEQ ID NO:16)。
6.式A-(B)n的缀合化合物，
其中
n是1、2、3或4；
A是权利要求1至5中任一项所述的肽化合物，其中所述肽化合物任选地被保护基团保护；和
B是至少一种抗癌剂，其中B与A连接，任选地在所述肽化合物的游离胺处、在所述肽化合物的N-末端位置处、在所述肽化合物的游离–SH处或在所述肽化合物的游离羧基处连接。
7.式A-(B)n的缀合化合物，
其中
n是1、2、3或4；
A是权利要求1至5中任一项所述的肽化合物，其中所述肽化合物任选地被保护基团保护；和
B是至少一种抗癌剂，其中B与A在所述肽化合物的赖氨酸的游离胺处任选地经由接头连接，或在所述肽化合物的N-末端位置处任选地经由接头连接。
8.式A-(B)n的缀合化合物，
其中
n是1、2、3或4；
A是权利要求1至5中任一项所述的肽化合物；和
B是至少一种抗癌剂，其中B与A连接。
9.如权利要求6或7所述的缀合化合物，其中B经由接头与A连接。
10.如权利要求6至8中任一项所述的缀合化合物，其中所述抗癌剂是多西他赛、卡巴他赛、紫杉醇、阿霉素或道诺霉素。
11.如权利要求10所述的缀合化合物，其中所述抗癌剂是多西他赛。
12.如权利要求11所述的缀合化合物，其中所述缀合化合物是式(XVIII)的化合物：
YK(多西他赛)SLRRK(多西他赛)APRWDAPLRDPALRQL(XVIII)，
其在SEQ ID NO:11的肽化合物的基础上，其中每个赖氨酸残基与多西他赛分子连接。
13.如权利要求11所述的缀合化合物，其中所述缀合化合物是式(XXII)的化合物：
乙酰基-YK(多西他赛)SLRRK(多西他赛)APRWDAPLRDPALRQL(XXII)，
其在SEQ ID NO:16的肽化合物的基础上，其中每个赖氨酸残基与多西他赛分子连接。
14.如权利要求10所述的缀合化合物，其中所述抗癌剂是阿霉素。
15.如权利要求14所述的缀合化合物，其中所述缀合化合物是式(XXV)的化合物：
YK(阿霉素)SLRRK(阿霉素)APRWDAPLRDPALRQLL(XXV)，
其在SEQ ID NO:11的肽化合物的基础上，其中每个赖氨酸残基与阿霉素分子连接。
16.如权利要求14所述的缀合化合物，其中所述缀合化合物是式(XXVII)的化合物：
乙酰基-YK(阿霉素)SLRRK(阿霉素)APRWDAPLRDPALRQLL(XXVII)，
其在SEQ ID NO:16的肽化合物的基础上，其中每个赖氨酸残基与阿霉素分子连接。
17.如权利要求10所述的缀合化合物，其中所述抗癌剂是卡巴他赛。
18.如权利要求17所述的缀合化合物，其中所述缀合化合物是式(XXX)的化合物：
YK(卡巴他赛)SLRRK(卡巴他赛)APRWDAPLRDPALRQLL(XXX)，
其在SEQ ID NO:11的肽化合物的基础上，其中每个赖氨酸残基与卡巴他赛分子连接。
19.如权利要求17所述的缀合化合物，其中所述缀合化合物是式(XXXIII)的化合物：
乙酰基-YK(卡巴他赛)SLRRK(卡巴他赛)APRWDAPLRDPALRQLL(XXXIII)，
其在SEQ ID NO:16的肽化合物的基础上，其中每个赖氨酸残基与卡巴他赛分子连接。
20.如权利要求6至8中任一项所述的缀合化合物，其中所述抗癌剂是姜黄素。
21.如权利要求6至8中任一项所述的缀合化合物，其中所述B经由接头在所述肽化合物的所述赖氨酸残基的所述游离胺处与A连接。
22.如权利要求6至8中任一项所述的缀合化合物，其中所述B经由接头在所述肽化合物的所述N-末端位置处与A连接。
23.如权利要求21所述的缀合化合物，其中所述接头选自琥珀酸和二甲基戊二酸。
24.如权利要求22所述的缀合化合物，其中所述接头选自琥珀酸和二甲基戊二酸。
25.用于制备权利要求6至24中任一项所述的缀合化合物的方法，所述方法包括：
使接头与权利要求6-24任一项中的至少一种抗癌剂一起反应以获得中间体；
任选地纯化所述中间体；
使所述中间体与权利要求1-5中任一项所述的肽化合物一起反应以获得所述缀合化合物，其中所述至少一种抗癌剂经由所述接头与所述肽化合物连接；和
任选地纯化所述缀合化合物；
其中所述至少一种抗癌剂在赖氨酸残基的游离胺处或在N-末端处与所述肽化合物连接；并且其中所述肽化合物与1、2、3或4个抗癌剂分子连接。
26.如权利要求25所述的方法，其中所述肽化合物在与所述中间体反应之前在所述N-末端处被保护。
27.如权利要求25或26所述的方法，其中所述中间体在与所述肽化合物反应之前用任选地选自以下的偶联剂活化：N,N,N′,N′-四甲基-O-(苯并三唑-1-基)脲四氟硼酸盐(TBTU)、(2-(1H-苯并三唑-1-基)-1,1,3,3-四甲基脲六氟磷酸盐)(HBTU)和(1-[双(二甲基氨基)亚甲基]-1H-1,2,3-三唑并
[4,5-b]吡啶3-氧化物六氟磷酸盐)(HATU)。
28.权利要求1至5中任一项所述的肽化合物或权利要求6-24中任一项所述的缀合化合物在制造用于治疗涉及分拣蛋白表达的癌症的药物中的用途，其中所述癌症为卵巢癌、乳腺癌、结肠直肠癌、胰腺癌、肺癌或皮肤癌。
29.如权利要求28所述的用途，其中所述癌症是卵巢癌。
30.如权利要求28所述的用途，其中所述癌症是乳腺癌。
31.如权利要求28所述的用途，其中所述癌症是结肠直肠癌。
32.如权利要求28所述的用途，其中所述癌症是胰腺癌。
33.如权利要求28所述的用途，其中所述癌症是肺癌。
34.如权利要求28所述的用途，其中所述癌症是皮肤癌。
35.权利要求1至5中任一项所述的肽化合物在制造用于选择性靶向表达分拣蛋白的细胞的药物中的用途。
36.脂质体、石墨烯或纳米颗粒，其包含至少一种权利要求1至5中任一项所述的肽化合物或至少一种权利要求6-24中任一项所述的缀合化合物。
37.脂质体、石墨烯或纳米颗粒，其用至少一种权利要求1至5中任一项所述的肽化合物或至少一种权利要求6-24中任一项所述的缀合化合物包被。
38.脂质体、石墨烯或纳米颗粒，其负载有治疗剂和siRNA中的至少一种；并且所述脂质体、石墨烯或纳米颗粒用至少一种权利要求1至5中任一项所述的肽化合物包被。
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