CN116438300A

CN116438300A - 用于由丝状真菌生产的具有低粘度的工艺酶组合物的生产方法

Info

Publication number: CN116438300A
Application number: CN202180075446.9A
Authority: CN
Inventors: C·加茂夫; J·克拉伦
Original assignee: Clariant Products Germany Co
Current assignee: Clariant Products Germany Co
Priority date: 2020-11-12
Filing date: 2021-11-12
Publication date: 2023-07-14
Also published as: AU2021377469A1; US20230416713A1; EP4244334A1; CA3193996A1; EP4012018A1; WO2022101404A1

Abstract

本发明涉及用于由遗传修饰的丝状真菌细胞生产的具有低粘度的工艺酶组合物的生产方法，适用于生产工艺酶组合物的遗传修饰的丝状真菌，此类遗传修饰的丝状真菌用于生产具有低粘度的工艺酶组合物的用途以及通过此类方法生产的具有低粘度的工艺酶组合物。

Description

用于由丝状真菌生产的具有低粘度的工艺酶组合物的生产方法

技术领域

本发明涉及用于由遗传修饰的丝状真菌细胞生产的具有低粘度的工艺酶组合物的生产方法，适用于生产工艺酶组合物的遗传修饰的丝状真菌细胞，此类遗传修饰的丝状真菌细胞用于生产具有低粘度的工艺酶组合物的用途以及通过此类方法生产的具有低粘度的工艺酶组合物。

酶是许多商业产品和相应生产方法的重要组分。现代洗衣组合物含有各种不同的酶，例如纤维素酶，许多家畜饲料产品含有酶，并且酶也用于生产许多商业产品例如生产生物乙醇、塑料替代品/可生物降解的塑料或甚至食品。此类方法中用的酶通常称为“工业酶”或“工艺酶”。

为了获得所需最终产品的经济可行性，所用的工艺酶的高产率和低生产成本是必要的。当所需的商业最终产品是必须与源自廉价矿物油衍生的化学合成方法的低价格替代品竞争的散装产品时，这尤其适用。

众所周知，丝状真菌是各种技术上可行的酶的有效生产者。此外，丝状真菌能够在各种底物上生长。

然而，丝状真菌用于生产工艺酶的实施仍然不是非常普遍，因为此类真菌的发酵培养基的高粘度通常提供了耗时和成本消耗的措施，导致工艺酶组合物的生产成本过高。为了获得高产率的酶，期望真菌的强生长，然而，强生长导致发酵培养基中真菌生物量的高含量。已知由特别是菌丝组成的真菌在本领域中已知为使任何发酵底物成为高粘度组合物。当用呈现海绵状、粘滑外观的丝状真菌时，该效果显著更明显。

高粘度引起许多问题，因为真菌在生长过程中需要通过通气持续供氧。此外，需要发酵罐冷却，特别是在工业规模生产中。两者仅可以通过不断的搅拌来保证-在一方面，在培养基内均匀地分布气泡，并且在另一方面，促进与冷却装置的恒定热交换。发酵培养基的粘度越高，在反应器内实现有效搅拌需要消耗的能量越多。此外，必须将更多的空气压入反应器中，其导致压缩机和无菌过滤器单元内更高的能量消耗。因此，CAPEX和OPEX随着发酵培养基粘度的增加而增加。替代的措施-减少细胞量生产-对于商业生产也不具有吸引力，因为其总是伴随着工艺酶生产的较低产率。

发明内容

因此，本发明的发明人自己设定了任务，即开发用于由丝状真菌生产的具有低粘度的工艺酶组合物的生产方法，同时保持酶的高产率。

任务通过用于生产工艺酶组合物的方法得以解决，其包括以下步骤：

(a)提供葡萄糖含量为5至550g/L的发酵培养基；

(b)添加至少一种丝状真菌细胞，其中SEQ ID NO:1被破坏；

(c)在20至35℃的温度下，将发酵培养基和至少一种丝状真菌细胞混合1分钟至10天的时间段；

(d)获得工艺酶组合物。

本发明方法的特别优点是用含有大量葡萄糖的任何种类的培养基实现了目标酶的高产率。丝状真菌分泌的大部分蛋白质是降解天然存在的聚合物，例如纤维素和半纤维素的酶，并且葡萄糖的可利用性通常会阻止丝状真菌产生此类酶，因为其不是葡萄糖代谢所需要的。此外，不需要添加昂贵的诱导物质，例如葡葡寡糖或槐糖。因此，可以用容易且便宜获得的各种不同的发酵底物。

在本发明中，术语“工艺酶组合物”应理解为由部分或完全发酵的培养基组成或含有部分或完全发酵的培养基，甚至可以含有原始培养基的组分，但也可以含有在发酵过程中产生的任何化合物例如酶。“工艺酶组合物”还可以含有发酵微生物即丝状真菌的部分或全部微生物生物量。

在本发明中，工艺酶组合物优选含有至少一种属于水解酶类的酶和/或至少一种属于氧化还原酶类的酶。在本发明特别优选的实施方案中，工艺酶组合物含有至少一种属于水解酶类的酶和/或至少一种属于氧化还原酶类的酶，其由至少一种丝状真菌细胞产生。在另一个特别优选的实施方案中，工艺酶组合物含有至少一种属于纤维素酶类的酶和/或至少一种属于半纤维素酶类的酶，其由至少一种丝状真菌细胞产生。

在本发明中，术语“属于水解酶类的酶”应理解为包含能够水解化学键的任何酶。属于水解酶类的酶在酶的EC编号分类中被分类为EC 3。根据本发明，术语“水解酶”包含纤维素酶、半纤维素酶、并且还可以包括果胶酶、氧化酶、几丁质酶、壳聚糖酶、转谷氨酰胺酶、戊聚糖酶、巢蛋白酶(niringinases)、柠檬苦素酶、内酯酶、核酸酶、脲酶、脂氧合酶、酯酶、α-葡聚糖酶、磷酸酶、异构酶、蛋白酶和辅助蛋白。

在本发明中，“属于水解酶类的酶”可以是丝状真菌的天然酶或源自不同微生物种类，特别是源自不同丝状真菌种类的异源酶，但也可以源自非丝状真菌或细菌。

本发明中用的术语“纤维素酶”是指能够将纤维素聚合物水解成较短的低聚物和/或葡萄糖的任何酶。工艺酶组合物中优选的纤维素酶包括纤维二糖水解酶(CBH)(EC3.2.1.-)、内切-1,4-β-葡聚糖酶(EG)(EC 3.2.1.4).)、β-葡糖苷酶(EC 3.2.1.4)、纤维二糖水解酶(EC 3.2.1.21)、糖苷水解酶61(GH61和CBM33)。

本发明中用的术语“半纤维素酶”是指能够降解或支持半纤维素降解的任何酶。工艺酶组合物中优选的半纤维素酶包括β-葡聚糖酶(EC 3.2.1.-)、内切木聚糖酶(EC3.2.1.8)、β-木糖苷酶(EC 3.2.1.37)、乙酰木聚糖酯酶(EC 3.1.1.72)、乙酰半乳聚糖酯酶(EC 3.1.1.6)、乙酰甘露聚糖酯酶、阿魏酸酯酶(EC 3.1.1.73)、葡糖醛酸酯酶(EC3.1.1.-)、α-L-阿拉伯呋喃糖苷酶(EC 3.2.1.55)、α-阿拉伯吡喃糖苷酶(3.2.1.-)、α-半乳糖苷酶(EC 3.2.1.22)、β-半乳糖苷酶(EC 3.2.1.23)、α-葡糖醛酸酶(EC 3.2.1.139)、β-甘露聚糖酶(EC 3.2.1.78)、β-甘露糖苷酶(EC 3.2.1.25)、甘露聚糖1,4-甘露二糖苷酶(EC3.2.1.100)、阿拉伯半乳聚糖内切-β-1,4-半乳聚糖酶(EC 3.2.1.89)、内切-β-1,3-半乳聚糖酶(EC 3.2.1.90)、半乳聚糖内切-β-1,3-半乳聚糖酶(EC 3.2.1.181、葡糖醛酸阿拉伯木聚糖内切-1,4-β-木聚糖酶(EC 3.2.1.136)、α-L-岩藻糖苷酶(EC 3.2.1.51)、针叶树β-葡糖苷酶(EC 3.2.1.126)、木葡聚糖水解酶(EC 3.2.1.150、151、155)、木聚糖α-1,2-葡糖醛酸糖苷酶(EC 3.2.1.131)、内切-木糖半乳聚糖醛酸水解酶(EC 3.2.1.-；GH28)、α-淀粉酶(EC 3.2.1.1)、葡聚糖1,4-α-葡糖苷酶(EC 3.2.1.3)、半乳聚糖1,3-半乳糖苷酶(GH43)、-1,4,-内切半乳聚糖酶(EC 3.5.1.89；GH53)、α-鼠李糖苷酶(EC 3.2.1.40)和β-鼠李糖苷酶(EC 3.2.1.43)。

本发明中用的术语“果胶酶”是指能够降解或支持果胶降解的任何酶。在工艺酶组合物中优选的果胶酶包括多聚半乳糖醛酸酶(EC 3.2.1.15,67,82；GH28果胶甲基酯酶(EC3.1.1.11)、果胶乙酰基酯酶(EC 3.1.1.-)、鼠李糖半乳糖醛酸酶(EC 3.2.1.-；GH28)、鼠李糖半乳糖醛酸乙酰酯酶(EC 3.1.1.86)、鼠李糖半乳糖醛酸半乳糖醛酸水解酶(EC3.2.1.-)、木糖聚半乳糖醛酸水解酶(EC 3.2.1.-)、果胶甲酯酶(EC 3.1.1.11)、β-阿拉伯呋喃糖苷酶(EC 3.2.1.55)、β-1,4-半乳聚糖酶(EC 3.2.1.89)、β-1,3-半乳聚糖酶(EC3.2.1.90)、β-半乳糖苷酶(EC 3.2.1.23)、α-半乳糖苷酶(EC 3.1.1.22)、阿魏酸乙酰酯酶(EC3.1.1.-)、α-岩藻糖苷酶(EC3.2.1.51)、(β-岩藻糖苷酶)(EC3.2.1.38)、β-芹菜苷酶(EC3.2.1.-)、α-鼠李糖苷酶(EC3.2.1.40)、β-鼠李糖苷酶(EC3.2.1.43)、α-阿拉伯吡喃糖苷酶(EC3.2.1.-)、β-葡萄糖醛酸酶(EC3.2.1.31)、α-葡萄糖醛酸酶(EC3.2.1.139)、β-木糖苷酶(EC3.2.1.37)和α-木糖苷酶(EC3.2.1.x)。

本发明中用的术语“辅助蛋白”是指能够支持纤维素分解酶活性的任何酶。该术语是本领域技术人员众所周知的。在工艺酶组合物中优选的辅助蛋白包括扩张蛋白、膨胀素、松弛素和CIP蛋白(EC 3.1.1.-；CE15)。

本发明中用的术语“氧化还原酶”是指能够催化氧化和/或还原反应的任何酶。属于氧化还原酶类的酶在酶的EC编号分类中被分类为EC1。在工艺酶组合物中优选的氧化还原酶包括裂解多糖单加氧酶(LPMO)(AA9-11；分别为先前GH61和CBM33)(EC 1.14.99.53-56，1.14.99.B10)、木质素过氧化物酶(EC 1.11.1.14)、锰过氧化物酶(EC 1.11.1.13)、芳基醇氧化酶(EC 1.1.3.7)、乙二醛氧化酶(EC 1.1.3.)、碳水化合物氧化酶(EC 1.1.3.4,9,10)、纤维二糖脱氢酶(EC 1.1.99.18)、过氧化氢酶(过氧化氢氧化还原酶)(EC 1.11.1.6或EC 1.11.1.21)、染料脱色过氧化物酶(EC 1.11.1.19)、漆酶(EC 1.10.3.2)、过氧化物酶(EC 1.11.1.x)和多功能过氧化物酶(EC 1.11.1.16)。

本发明中用的术语“酯酶”是指能够裂解酯键的任何酶。在工艺酶组合物中优选的酯酶包括乙酰酯酶、葡糖醛酸酯酶、阿魏酰酯酶、脂肪酶、角质酶和磷脂酶。

本发明中用的术语“α-葡聚糖酶”是指能够降解α-连接的寡糖和多糖的任何酶。在工艺酶组合物中优选的α-葡聚糖酶包括α-淀粉酶、葡糖淀粉酶、支链淀粉酶、葡聚糖酶、海藻糖酶、乳糖酶、转化酶和麦芽糖酶。

本发明中用的术语“磷酸酶”是指能够裂解磷酸酯键的任何酶。在工艺酶组合物中优选的磷酸酶包括肌醇六磷酸酶。

本发明中用的术语“异构酶”是指能够将化合物转变为异构结构的任何酶。在工艺酶组合物中优选的异构酶包括木糖异构酶、葡萄糖异构酶和阿拉伯糖异构酶。

本发明中用的术语“蛋白酶”是指能够切割肽键的任何酶。在工艺酶组合物中优选的蛋白酶包括丝氨酸蛋白酶、苏氨酸蛋白酶、天冬氨酸蛋白酶、半胱氨酸蛋白酶、谷氨酸蛋白酶和金属蛋白酶。

本发明中提及的酶根据命名法进行分类，该命名法基于国际生物化学和分子生物学联合会的酶命名和分类(http://www.chem.qmul.ac.uk/iubmb/enzyme/)或基于碳水化合物-活性酶(http://www.cazy.org/)数据库。

根据本发明，术语“发酵培养基”应理解为是指本领域技术人员已知适用于本发明方法的任何发酵培养基。在本发明的方法中，发酵培养基含有5至550g/L葡萄糖，其中优选葡萄糖含量为5至450g/L、5至420g/L、8至400g/L和10至280g/L葡萄糖。进一步优选的葡萄糖范围为10至450g/L、40至400g/L和50至350g/L。葡萄糖还优选的范围为5至50g/L、6至40g/L或7至35g/L和50至450g/L、80至400g/L和100至380g/L。在发酵培养基中含有的葡萄糖可以源自本领域技术人员已知的适用于本发明方法的任何来源。在优选的实施方案中，葡萄糖源自玉米、甘蔗或甜菜，优选的来源是玉米糖浆、甘蔗或甜菜糖蜜及其混合物。

在本发明的优选的实施方案中，“发酵培养基”可以至少部分源自木质纤维素生物量的化学、机械和/或酶水解，并且优选包含木质纤维素生物量的预先机械和/或酸性预处理。源自木质纤维素生物量的化学、机械和/或酶水解的发酵培养基可以“原样”用，或者可以将另外的葡萄糖添加至发酵培养基中以获得所需的5至550g/L的发酵培养基的总葡萄糖含量。葡萄糖含量为5至450g/L、5至420g/L、8至400g/L和10至280g/L也适用于本发明的方法。葡萄糖进一步优选的范围为10至450g/L、40至400g/L和50至350g/L。葡萄糖还优选的范围为5至50g/L、6至40g/L或7至35g/L和50至450g/L、80至400g/L和100至380g/L。

木质纤维素生物量的水解已经通过机械和酶水解或通过单独的酶水解而不添加任何有机酸和/或无机酸来进行。木质纤维素生物量的水解是本领域技术人员已知的，示例性方法例如描述于Vishnu等人2012(Trends in bioconversion of lignocellulose:Biofuels,platform chemicals&biorefinery concept in bioconversion oflignocellulose:Biofuels,platformchemicals&biorefinery concept。Progress inEnergy and Combustion Science,2012年8月,第38卷(4),522-550)和Prasad等人2019(Bioethanol production from waste lignocelluloses:A review on microbialdegradation potential Chemosphere第231卷,2019年9月,第588-60页)。

在本发明中，术语“木质纤维素生物质”应理解为包括本领域技术人员已知的包含木质纤维素的所有种类的生物质。根据本发明，特别优选的木质纤维素生物量包括木材、谷物秸秆、例如但不限于小麦秸秆、稻草秸秆、大麦秸秆、黑麦秸秆和燕麦秸秆和/或其壳和/或麸皮、甘蔗渣、燕麦壳、柳枝稷、纤维素、原纸浆(从纸浆和纸生产中获得)及其混合物。另外的组分可以包含以下组分中的一种或多种：纯化的纤维素、纸浆、牛奶乳清或糖蜜。特别适合根据本发明方法进行水解的木质纤维素生物量选自谷物秸秆、谷物麸皮、谷物壳、木材、甘蔗渣及其混合物。

在优选的实施方案中，木质纤维素生物量含有至少25wt％，优选至少40wt％，更优选至少70wt％，甚至更优选至少80wt％和最优选至少90wt％的木质纤维素。应理解，木质纤维素生物量还可以包含其他化合物，例如蛋白质材料、淀粉、糖，例如可发酵糖和/或不可发酵糖。

源自木质纤维素生物量水解的发酵培养基具有0.90至2.00kg/L，优选0.95至1.90kg/L，更优选1.00至1.50kg/L，最优选1.05至1.35kg/L的高密度。

源自木质纤维素生物量水解的发酵培养基具有10至75wt％，优选10至70wt％，进一步优选20至65wt％、30至65wt％或40至60wt％的干物质含量，而10至20wt％和10至15wt％的干物质含量也是优选的。

在本发明的优选的实施方案中，发酵培养基还含有木糖，并且其中葡萄糖与木糖的比选自1至3.5，例如选自1至3、1至2.8、1至2.5或1至2.2的比。进一步优选的比是2.1、2.0、1.9和1.8。

在本发明的另一个优选的实施方案中，发酵培养基还含有乳糖，其中葡萄糖与乳糖的比选自1至10，例如选自1至9、1至8.5、1至8或1至7。进一步优选的比是3、4、5和6。

在本发明的优选的实施方案中，发酵培养基中没有添加葡葡寡糖，特别优选发酵培养基不含葡葡寡糖。

在本发明的优选的实施方案中，发酵培养基中没有添加槐糖，特别优选发酵培养基不含槐糖。

在本发明的另一个优选的实施方案中，发酵培养基含有少于100g/L的纤维素和/或半纤维素，优选少于80g/L，更优选少于70g/L，甚至更优选少于60g/L，特别优选少于50g/L，最优选少于40g/L的纤维素和/或半纤维素。在另一个优选的实施方案中，本发明的发酵培养基不含半纤维素。在本发明进一步优选的实施方案中，发酵培养基的纤维素含量选自0.01g/L至50g/L，优选0.1至40g/L，进一步优选1至30g/L，最优选1至20g/L。

在另一个优选的实施方案中，发酵培养基具有0.05至2.0g/L的氮含量。优选的氮含量选自0.1至1.5g/L、0.3至1.2g/L或0.5至1.0g/L。氮可以以本领域技术人员已知的适用于本发明目的的任何形式添加，并且可以以硫酸铵、氨、尿素、大豆提取物或其组合的形式添加。在本发明方法的步骤(a)和/或(b)之前或期间的任何时间，可以通过进料或添加总量向发酵培养基中来添加氮的量。因此，优选氮以25％(wt/wt)氨溶液或40％(wt/wt)尿素溶液的形式添加。

在本发明的另一个优选的实施方案中，发酵培养基含有0.5至80wt％糖蜜、玉米糖浆或其混合物，优选5至75wt％、15至70wt％、25至65wt％、35至60wt％、38至55wt％或40至52wt％。

在本发明方法的优选的实施方案中，发酵培养基的pH已被调节至选自pH 2.0至pH6.0的pH，其中特别优选pH 3.0至pH 5.5和pH 3.5至pH 5.5以及pH 3.5至5.0。pH的调节可以通过本领域技术人员已知的适用于本发明目的的任何手段和措施进行。在本发明的方法中，优选通过添加酸例如硫酸或乙酸、NaOH、H₃PO₄或氨来调节pH。

在本发明方法的优选的实施方案中，发酵培养基具有0.5至10.0g/L的磷酸氢钾含量、硫酸镁七水合物含量为0.05至1g/L、氯化钙二水合物含量为0.1至1g/L、硫酸铵含量为1.5至4.5g/L、硫酸铁(II)七水合物含量为0.005至0.1g/L、硫酸锰含量为0.00001至0.001g/L、硫酸锌七水合物含量为0.001至0.01g/L和/或硫酸铜五水合物含量为0.0001至0.001g/L。进一步优选的范围是磷酸氢钾含量为1至8.0g/L、硫酸镁七水合物含量为0.1至0.8g/L、氯化钙二水合物含量为0.3至0.8g/L、硫酸铵含量为1.7至4.0g/L、硫酸铁(II)七水合物含量为0.01至0.9g/L、硫酸锰含量为0.0001至0.0008g/L、硫酸锌七水合物含量为0.002至0.008g/L和/或硫酸铜五水合物含量为0.0002至0.008g/L。

根据本发明方法的步骤(a)“提供”发酵培养基可以通过本领域技术人员已知的适用于本发明方法的任何方法和任何手段进行。在一个优选的实施方案中，发酵培养基在分批或补料分批反应器中提供，该反应器优选配备搅拌装置和冷却装置。

根据本发明方法的步骤(b)，将其中SEQ ID NO:1被破坏的至少一种丝状真菌细胞添加至发酵培养基中。在本发明的另一个实施方案中，将其中SEQ ID NO:1和SEQ ID NO：5被破坏的至少一种丝状真菌细胞添加至发酵培养基中。至少一种丝状真菌细胞的添加可以通过本领域技术人员已知的适用于本发明方法的任何手段和措施进行。在一个优选的实施方案中，至少一种丝状真菌细胞的添加量为10²至10¹⁰细胞/克发酵培养基，优选10³至10⁸细胞/克发酵培养基，最优选10⁴至10⁷细胞/克发酵培养基。因此，至少一种丝状真菌细胞可以以干燥形式、分生孢子或含有剩余的预培养培养基的预培养基的形式添加。至少一种丝状真菌细胞还可以以完全培养的培养基(也称为主培养基)的形式添加。

在本发明中，术语“丝状真菌细胞”应理解为来自天然存在的和/或本领域技术人员已知的任何丝状真菌的任何细胞。该术语还包含天然来源或修饰的任何丝状真菌细胞。术语“修饰”是指遗传和非遗传修饰的真菌。即，已经通过遗传方法(例如转化)和非遗传方法(例如化学诱变或辐射)修饰的真菌，这两种方法都是本领域技术人员已知的。在一个优选的实施方案中，至少一种丝状真菌细胞选自枝顶孢属、曲霉属、毛壳属、裸胞壳属(Emericella)、镰刀菌属、腐质霉属、肉座菌属、耙菌属(Irpex)、巨座壳属(Magnaporte)、毁丝霉属、链孢菌属、青霉菌属、根霉属、篮状菌属、木霉属和栓菌属，其中特别优选木霉属和曲霉属，最优选里氏木霉(有性型：红褐肉座菌)。

在本发明的另一个优选的实施方案中，至少一种丝状真菌细胞是遗传修饰的丝状真菌细胞，其能够表达至少一种异源水解酶或氧化还原酶，例如但不限于属于纤维素酶类、属于β-葡糖苷酶类或属于木聚糖酶类或属于裂解多糖单加氧酶类的酶。在此类优选的实施方案中，至少一种异源水解酶或氧化还原酶优选源自另一种丝状真菌，例如但不限于枝顶孢属、曲霉属、毛壳属、裸胞壳属、镰刀菌属、腐质霉属、肉座菌属、耙菌属、巨座壳属、毁丝霉属、链孢菌属、青霉菌属、根霉菌属、篮状菌属、木霉属和栓菌属。在一个特别优选的实施方案中，至少一种丝状真菌细胞是里氏木霉细胞，并且至少一种异源水解酶或氧化还原酶源自且至少一种异源水解酶源自枝顶孢属、阿耶罗菌属、链格孢属、蜜环菌属、节皮菌属、曲霉素、生赤壳属、平脐蠕孢属、拟腊菌属、毛壳属、枝孢瓶霉属、红腐菌属(Clohesyomyces)、炭疽霉属，毛孢壳属、梨孢霉属、间座壳属、褥盘孢属、裸胞壳属、附球菌属、外瓶霉属、层孔菌属、着色霉属、镰刀菌属、赤霉菌属、蓝菌属(Grosmannia)、滑锈伞属、何德霉属、腐质霉属、肉座菌属、炭团菌属、耙菌属、棒束孢属、Kuraishia、白环蘑属、马杜拉分支菌属、梨孢菌属、盘单隔孢属、绿僵菌属、丛梗霉皮伞属、毁丝霉属、链孢菌属、脉孢菌属、树粉孢属、长喙壳菌属、拟青霉菌属、拟球腔菌属、青霉菌属、厚毛平革菌属、瓶霉属、侧耳属、普可尼亚属、假尾孢属、假裸囊菌属、核腔菌属、踝节菌属、啄枝孢霉属、根霉菌属、根球虫属、喙孢属、毛球腔菌属、亚球壳属、孢子丝菌属、葡萄穗霉属、匍柄霉属、篮状菌属、蚁巢伞属、腥黑粉菌属、虫壳属、栓菌属、木霉属、毛癣菌属、Uncinocarpus和/或黑腐皮壳属物种。

根据本发明，至少一种丝状真菌细胞是其中SEQ ID NO:1被破坏的丝状真菌细胞。因此，“破坏”可以通过本领域技术人员已知的适用于破坏目的的任何手段和措施进行。术语“破坏”包含导致基因不再被转录或导致由基因编码的蛋白质不再产生或仅以失活形式产生的所有技术。在优选的实施方案中，除了SEQ ID NO:1之外，SEQ ID NO：5也被破坏。

可在本发明中用的示例性方法是：

-从基因组中部分或完全去除基因、编码蛋白质的区域和/或启动子或基因表达所需的其它区域(＝“缺失”)

-改变编码区的DNA序列，使得产生缩短的蛋白质(＝产生终止密码子)或具有改变的氨基酸序列的蛋白质，其不再执行未改变的蛋白质的功能(＝“突变”)

-修饰启动子的DNA序列或基因表达所需的其它区域，使得基因不再被转录(＝没有RNA，因此没有蛋白质产生)

-表达具有与靶基因互补序列的RNA。其导致两种RNA的杂交(＝互补序列的配对)，并导致该双链RNA的降解。结果，不含靶基因的RNA可用于蛋白质合成(＝RNA干扰)。

在本发明中，SEQ ID NO:1和SEQ ID NO：5在序列方案中定义。

应理解，说明书中定义的任何实施方案和优选的实施方案适用于其中仅SEQ IDNO:1被破坏的丝状真菌细胞，但也适用于其中除SEQ ID NO:1外SEQ ID NO：5被破坏的丝状真菌细胞。

根据本发明的发明方法的步骤(c)的混合进行1分钟至10天，优选10小时至7天，进一步优选24小时至5天的时间段，优选在具有150至20000W/m³，更优选500至15000W/m³功率输入的不断搅拌下和在氧气控制条件下进行。平均溶解氧水平优选选自0.01％至80％，优选0.1％至50％，特别优选5％至30％，最优选12％至28％。在特别优选的实施方案中，溶解氧水平通过搅拌器或压缩空气流或内部反应器压力或这些措施中的两种或三种的组合来控制。此外，根据本发明方法的步骤(c)的混合在20至35℃的温度下，优选在21至34℃的温度下进行，其中选自22至33℃的温度也是优选的。

根据本发明的方法的步骤(c)的“混合”优选以分批模式(不连续)、补料分批模式或连续模式进行。最优选地，本发明方法以补料分批模式进行。

根据本发明方法的步骤(d)的“获得”优选通过在步骤(c)期间，在用于混合的时间段结束时，未经进一步处理而收获的工艺酶组合物来进行。

在本发明的另一个优选的实施方案中，本发明的方法进一步含有步骤(e)：针对根据步骤d)的工艺酶组合物进行的纯化方法。根据步骤(e)的纯化可以通过本领域技术人员已知的适用于本发明目的的任何措施进行。合适的纯化方法选自过滤(超滤、微滤、纳滤、深度过滤、无菌过滤、压滤机)、离心、倾析、浮选、色谱分离、吸附、电渗析、萃取、沉淀、结晶、喷雾干燥、造粒、包衣、挤出或其组合。优选基于过滤器的固-液分离。进一步特别优选用压滤机。过滤后的残留物应具有20％(wt/wt)，优选25％(wt/wt)，特别优选30％(wt/wt)，并且最优选40％(wt/wt)固体含量的最小固体含量。在根据本发明的方法涉及固液分离作为纯化的情况下，根据本发明方法的步骤(d)获得的工艺酶组合物被认为是液体馏分。

在本发明方法的优选的实施方案中，方法进一步包括以下步骤：

(ai)根据步骤(a)的发酵培养基的灭菌。

因此，可以通过本领域技术人员已知的适用于本发明目的的任何手段或措施进行灭菌。在优选的实施方案中，通过过滤，例如但不限于膜过滤方法或通过超高温加热进行灭菌。两种或多种灭菌方法的组合也是可能的，然而，特别优选仅应用超高温加热(也称为UHT)。UHT处理优选在100至155℃的温度下进行10至30秒的持续时间，更优选在120至140℃的温度下进行10至20秒的持续时间。

在另一方面，本发明涉及丝状真菌细胞，其中SEQ ID NO:1被破坏。术语“其中SEQID NO:1被破坏”涉及任何丝状真菌细胞，其中SEQ ID NO:1不再含有或不再起作用和/或其中丝状真菌细胞的基因组含有破坏的SEQ ID NO:1基因。SEQ ID NO:1的破坏可通过本领域技术人员已知的适用于本发明目的的任何手段和措施进行。在说明书中已经定义了可能的和优选的方法和措施。在优选的实施方案中，SEQ ID NO:1已经通过缺失、突变、启动子或任何其它调节序列的修饰、终止密码子的产生或RNA干扰而被破坏。术语“丝状真菌细胞”已在说明书中定义。所有给出的定义均适用。

在优选的实施方案中，除了SEQ ID NO:1的破坏之外，SEQ ID NO：5也被破坏。在说明书中已经定义了可能的和优选的方法和措施。

应理解，说明书中定义的任何实施方案和优选的实施方案适用于其中仅SEQ IDNO:1被破坏的丝状真菌细胞，但也适用于其中除了SEQ ID NO:1之外SEQ ID NO：5被破坏的丝状真菌细胞。

在优选的实施方案中，丝状真菌细胞是具有表达至少一种异源水解酶的能力的遗传修饰的丝状真菌细胞。此类遗传修饰的丝状真菌细胞已经在说明书中定义。在本发明特别优选的实施方案中，丝状真菌细胞是遗传修饰的丝状真菌细胞，其中丝状真菌细胞包含至少一种异源β-葡糖苷酶编码序列、至少一种异源纤维素酶编码序列、至少一种异源木聚糖酶编码序列、至少一种异源β-木糖苷酶编码序列、至少一种异源果胶酶编码序列、至少一种异源氧化酶编码序列、至少一种异源蛋白酶编码序列、至少一种异源异构酶编码序列和/或至少一种异源裂解多糖单加氧酶编码序列。

在另一方面，本发明涉及根据如上定义的方法生产的工艺酶组合物。

在另一方面，本发明涉及如上定义的丝状真菌细胞用于生产如上定义的工艺酶组合物的用途。

一般优选实施方案

在下文中，列出了本发明的一般优选实施方案，其不在任何方面限制本发明的范围和/或权利要求的范围。一般优选实施方案说明了通过丝状真菌里氏木霉生产工艺酶组合物的特别合适的实施方案。

一般优选实施方案1

用于生产工艺酶组合物的方法，其包括以下步骤：

步骤：

(a)提供葡萄糖含量为5至550g/L或5至450g/L的发酵培养基；

(b)添加至少一种里氏木霉细胞，其中SEQ ID NO:1被破坏；

(d)获得工艺酶组合物。

一般优选实施方案2

用于生产工艺酶组合物的方法，其包括以下步骤：

步骤：

(a)提供葡萄糖含量为5至550g/L或5至450g/L的发酵培养基，并且其中发酵培养基还含有木糖，并且其中葡萄糖与木糖的比选自1至3.5的范围；

(b)添加至少一种里氏木霉细胞，其中SEQ ID NO:1被破坏；

(d)获得工艺酶组合物。

一般优选实施方案3

用于生产工艺酶组合物的方法，其包括以下步骤：

(a)提供葡萄糖含量为5至550g/L或5至450g/L的发酵培养基，并且其中发酵培养基不含纤维素、半纤维素、葡葡寡糖和/或槐糖；

(b)添加至少一种里氏木霉细胞，其中SEQ ID NO:1被破坏；

(d)获得工艺酶组合物。

一般优选实施方案4

用于生产工艺酶组合物的方法，其包括以下步骤：

(a)提供葡萄糖含量为5至550g/L或5至450g/L和纤维素含量为0.01g/L至1g/L的发酵培养基；

(b)添加至少一种里氏木霉细胞，其中SEQ ID NO:1被破坏；

(d)获得工艺酶组合物。

一般优选实施方案5

用于生产工艺酶组合物的方法，其包括以下步骤：

步骤：

(a)提供葡萄糖含量为5至550g/L或5至450g/的发酵培养基；

(b)添加至少一种里氏木霉细胞，其中SEQ ID NO:1已经通过缺失、突变、启动子或任何其它调节序列的修饰、终止密码子的产生或RNA干扰而被破坏，并且其中丝状真菌细胞包含至少一种异源β-葡糖苷酶编码序列、至少一种异源纤维素酶编码序列、至少一种异源木聚糖酶编码序列、至少一种异源β-木糖苷酶编码序列、至少一种异源果胶酶编码序列、至少一种异源氧化酶编码序列、至少一种异源蛋白酶编码序列、至少一种异源异构酶编码序列和/或至少一种异源裂解多糖单加氧酶编码序列；

(d)获得工艺酶组合物。

一般优选实施方案6

用于生产工艺酶组合物的方法，其包括以下步骤：

(a)提供葡萄糖含量为5至550g/L或5至450g/L的发酵培养基，并且其中发酵培养基不含槐糖和/或葡葡寡糖；

(d)获得工艺酶组合物。

一般优选实施方案7

用于生产工艺酶组合物的方法，其包括以下步骤：

(a)提供葡萄糖含量为5g/L至550g/L或5g/L至450g/L的发酵培养基，其中发酵培养基可以至少部分地源自木质纤维素生物量的化学、机械和/或酶水解；

(b)添加至少一种里氏木霉细胞，其中SEQ ID NO:1被破坏；

(d)获得工艺酶组合物。

一般优选实施方案8

里氏木霉细胞，其中SEQ ID NO:1已经通过缺失、突变、启动子或任何其它调节序列的修饰、终止密码子的产生或RNA干扰而被破坏，并且其中丝状真菌细胞包含至少一种异源β-葡糖苷酶编码序列、至少一种异源纤维素酶编码序列、至少一种异源木聚糖酶编码序列、至少一种异源β-木糖苷酶编码序列、至少一种异源果胶酶编码序列、至少一种异源氧化酶编码序列、至少一种异源蛋白酶编码序列、至少一种异源异构酶编码序列和/或至少一种异源裂解多糖单加氧酶编码序列。

一般优选实施方案9

里氏木霉细胞，其中SEQ ID NO:1已经通过缺失、突变、启动子或任何其它调节序列的修饰、终止密码子的产生或RNA干扰而被破坏，并且其中丝状真菌细胞包含至少一种异源β-葡糖苷酶编码序列、至少一种异源纤维素酶编码序列、至少一种异源木聚糖酶编码序列、至少一种异源β-木糖苷酶编码序列、至少一种异源果胶酶编码序列、至少一种异源氧化酶编码序列、至少一种异源蛋白酶编码序列、至少一种异源异构酶编码序列和/或至少一种异源裂解多糖单加氧酶编码序列，并且其中至少一种异源酶序列源自枝顶孢属、曲霉属、毛壳属、裸胞壳属、镰刀菌属、腐质霉属、肉座菌属、耙菌属(Irpex)、巨座壳属、毁丝霉属、链孢菌属、青霉菌属、根霉属、篮状菌属、木霉属和栓菌属。

一般优选实施方案10

根据如一般优选的实施方案1至7中任一项所定义的方法生产的工艺酶组合物。

一般优选实施方案11

如一般优选的实施方案8或9中任一项所定义的丝状真菌细胞用于生产工艺酶组合物的用途。

一般优选实施方案12

用于生产工艺酶组合物的方法，其包括以下步骤：

(a)提供葡萄糖含量为5至550g/L或5至450g/L的发酵培养基；

(b)添加至少一种里氏木霉细胞，其中SEQ ID NO:1和SEQ ID NO：5被破坏；

(d)获得工艺酶组合物。

一般优选实施方案13

用于生产工艺酶组合物的方法，其包括以下步骤：

(d)获得工艺酶组合物。

一般优选实施方案14

用于生产工艺酶组合物的方法，其包括以下步骤：

(d)获得工艺酶组合物。

一般优选实施方案15

用于生产工艺酶组合物的方法，其包括以下步骤：

(d)获得工艺酶组合物。

一般优选实施方案16

用于生产工艺酶组合物的方法，其包括以下步骤：

(a)提供葡萄糖含量为5至550g/L或5至450g/L的发酵培养基；

(b)添加至少一种里氏木霉细胞，其中SEQ ID NO:1和SEQ ID NO：5已经通过缺失、突变、启动子或任何其它调节序列的修饰、终止密码子的产生或RNA干扰而被破坏，并且其中丝状真菌细胞包含至少一种异源β-葡糖苷酶编码序列、至少一种异源纤维素酶编码序列、至少一种异源木聚糖酶编码序列、至少一种异源β-木糖苷酶编码序列、至少一种异源果胶酶编码序列、至少一种异源氧化酶编码序列、至少一种异源蛋白酶编码序列、至少一种异源异构酶编码序列和/或至少一种异源裂解多糖单加氧酶编码序列；

(d)获得工艺酶组合物。

一般优选实施方案17

用于生产工艺酶组合物的方法，其包括以下步骤：

(d)获得工艺酶组合物。

一般优选实施方案18

用于生产工艺酶组合物的方法，其包括以下步骤：

(d)获得工艺酶组合物。

一般优选实施方案19

里氏木霉细胞，其中SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:5已经通过缺失、突变、启动子或任何其它调节序列的修饰、终止密码子的产生或RNA干扰而被破坏，并且其中丝状真菌细胞包含至少一种异源β-葡糖苷酶编码序列、至少一种异源纤维素酶编码序列、至少一种异源木聚糖酶编码序列、至少一种异源β-木糖苷酶编码序列、至少一种异源果胶酶编码序列、至少一种异源氧化酶编码序列、至少一种异源蛋白酶编码序列、至少一种异源异构酶编码序列和/或至少一种异源裂解多糖单加氧酶编码序列。

一般优选实施方案20

里氏木霉细胞，其中SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:5已经通过缺失、突变、启动子或任何其它调节序列的修饰、终止密码子的产生或RNA干扰而被破坏，并且其中丝状真菌细胞包含至少一种异源β-葡糖苷酶编码序列、至少一种异源纤维素酶编码序列、至少一种异源木聚糖酶编码序列、至少一种异源β-木糖苷酶编码序列、至少一种异源果胶酶编码序列、至少一种异源氧化酶编码序列、至少一种异源蛋白酶编码序列、至少一种异源异构酶编码序列和/或至少一种异源裂解多糖单加氧酶编码序列，并且其中至少一种异源酶序列源自枝顶孢属、曲霉属、毛壳属、裸胞壳属、镰刀菌属、腐质霉属、肉座菌属、耙菌属(Irpex)、巨座壳属、毁丝霉属、链孢菌属、青霉菌属、根霉属、篮状菌属、木霉属和栓菌属。

一般优选实施方案21

根据如一般优选的实施方案10至18中任一项所定义的方法生产的工艺酶组合物。

一般优选实施方案21

如一般优选的实施方案19或20中任一项所定义的丝状真菌细胞用于生产工艺酶组合物的用途。

附图和实施例

通过以下附图和实施例描述本发明。因此要强调的是，附图和实施例并不限制本发明和权利要求的范围，而仅仅构成本发明、本发明的目的和通过本发明的方法实现的益处的进一步说明。

附图列表

图1：pSEQ1M-HygR转化体MSEQ1-1至-3和对比菌株M18.2b的培养基上清液中的蛋白质浓度。数值是相对于宿主菌株M18.2b的上清液中的平均蛋白质浓度设定为1给出的。

图2：pSEQ1M-HygR转化体MSEQ1-1至-3和对比菌株M18.2b的培养基肉汤中的生物量浓度。数值是相对于宿主菌株M18.2b的培养基肉汤中的平均生物量浓度设定为1给出的。

图3：pSEQ1M-HygR转化体MSEQ1-1至-3和对比菌株M18.2b的培养基肉汤的粘度。数值是相对于宿主菌株M18.2b的培养基肉汤的粘度设定为1给出的。

图4：pSEQ1M-HygR转化体MSEQ1-1至-3和对比菌株M18.2b的培养基上清液的SDS-PAGE凝胶。

图5：基于MSEQ1-1的pSEQ5M-amdS转化体MSEQ1SEQ5-1和对比菌株MSEQ1-1和M18.2b的培养基上清液中的蛋白浓度。数值是相对于宿主菌株M18.2b的上清液中的平均蛋白质浓度设定为1给出的。

图6：基于MSEQ1-1的pSEQ5M-amdS转化体MSEQ1SEQ5-1和对比菌株MSEQ1-1和M18.2b的培养基肉汤中的生物量浓度。数值是相对于宿主菌株M18.2b的培养基肉汤中的平均生物量浓度设定为1给出的。

图7：基于MSEQ1-1的pSEQ5M-amdS转化体MSEQ1SEQ5-1和对比菌株MSEQ1-1和M18.2b的培养基肉汤的粘度。数值是相对于宿主菌株M18.2b的培养基肉汤的粘度设定为1给出的。图8：基于MSEQ1-1的pSEQ5M-amdS转化体MSEQ1SEQ5-1和对比菌株MSEQ1-1和M18.2b的培养基上清液的SDS-PAGE凝胶。

一般实施例

实施例描述了破坏里氏木霉SEQ1基因的方法，其通过缺失两个核苷酸导致移码和氨基酸编码密码子变为终止密码子。其还显示了SEQ1基因破坏对里氏木霉的蛋白质生产、生物量形成和培养基肉汤粘度的影响，以及SEQ1和SEQ5基因破坏对里氏木霉的蛋白质生产、生物量形成和培养基肉汤粘度的影响。

实施例1：SEQ1突变载体的构建

本领域技术人员已知的标准方法，例如由Sambrook和Russel(MolecularCloning-A laboratory manual；Cold Spring Harbor Laboratory Press，纽约)或由Jansohn等人(Gentechnische Methoden，Elsevier，München)所描述的用于DNA琼脂糖凝胶电泳、DNA纯化、大肠杆菌转化、质粒增殖和纯化、通过聚合酶链式反应(PCR)扩增DNA片段和从里氏木霉中分离基因组DNA的标准方法。连接非依赖克隆(LIC)基本上如由Aslanidis和de Jong(1990，Nucleic Acid Res.18(20)，6069)所描述的进行。

通过将潮霉素B抗性标记融合至SEQ1 3’侧翼区，并将融合产物克隆至含有SEQ1编码区的一部分的质粒中来构建SEQ1突变载体，其将包含核苷酸G4060和T4061(根据SEQ IDNO:1的位置)缺失的突变引入至SEQ1基因中。

潮霉素B抗性标记盒(SEQ ID NO：2)由Thermo Scientific合成。用来自ThermoScientific的phusion聚合酶，将引物hygrfw(5’-TGCAAGGCGATTAAGTTGGG-3’；SEQ ID NO:6)和hygrrv(5’-CGGCGAGGATCTTTCCTCGCTGCTTCTCTCAACAGACAAGAGCCCTATAACTTC-3’；SEQID NO:7)用于扩增约2.6kb长的盒(退火温度：63.2℃，延伸时间：1分钟，30个循环)。

分离来自里氏木霉M18.2b(DSM 19984)的基因组DNA，并与引物SEQ1fl3fw(5’-TTGTCAACGCCATCTTGAGC-3’；SEQ ID NO:8)和SEQ1fl3rv(5’-ACCAACCAGTCCATCCTCTG-3’；SEQ ID NO:9)一起用作模板，用来自Thermo Scientific的phusion聚合酶扩增SEQ1的约2.2kb 3’侧翼片段(退火温度：64.5℃，延伸时间：1分钟15秒，30个循环)。

纯化PCR扩增的潮霉素B抗性标记盒和SEQ1 3’侧翼区，并用来自ThermoScientific的phusion聚合酶和引物fus1(5’-AAACCAGACAGACAGTATACGACTCACTATAGGGCG-3’；SEQ ID NO:10)、fus2(5’-GTTAACAGACAAGAGCCCGAAGTTATTCGGGTAGTAGAGTTTGAAAGGGG-3’；SEQ ID NO:11)和fus3(5’-AGAGAGGAGAGACAGTGTTAACAGACAAGAGCCCGAAG-3’；SEQ IDNO:12)融合。用约100ng的两种模板、20μM的引物fus1和fus3和2μM的引物fus2。PCR由10个初始循环组成：在98℃下10秒，在65℃下30秒和在72℃下1分钟20秒，然后冷却至10℃。然后添加引物，然后在98℃下保持30秒，和30个循环为在98℃下10秒，在61.5℃下30秒和在72℃下初始2分钟5秒，每个循环72℃温育延长5秒。PCR通过在72℃下保持10秒并冷却至10℃结束。

纯化约4.1kb长的融合PCR产物，并克隆至含有LIC接受位点而不是多克隆位点的PshAI线性化pUC19-衍生质粒(SEQ ID NO：3)中。在dTTP存在下用T4 DNA聚合酶处理线性化载体。在dATP存在下用T4 DNA聚合酶处理融合PCR产物。如Aslanidis和de Jong Aslanidisand de Jong所述，将T4 DNA聚合酶处理的载体和融合PCR扩增子混合并退火。然后将LIC测定物在化学感受态大肠杆菌XL1-Blue细胞(Agilent)中转化，在含有100mg·l^-1氨苄青霉素(LB-Amp)的LB-Agar板上铺，并在37℃温育24小时。用牙签从琼脂板上挑取菌落，转移至液体LB-Amp培养基中，并在37℃下振荡(250RPM)温育24小时。分离质粒DNA，并通过用HpaI消化验证插入片段的整合。通过Sanger测序验证质粒克隆，将一个具有正确序列的质粒命名为pSEQ1-3fl-HygR。

用SrfI(新英格兰生物实验室)消化含有SEQ1基因的修饰部分的质粒pSEQ1flank5(在Thermo Scientific合成；SEQ ID NO:4)，其将包含核苷酸G4060和T4061(根据SEQ IDNO:1的位置)缺失的突变引入至SEQ1基因中。

通过用HpaI限制性消化从pSEQ1-3fl-HygR释放潮霉素抗性标记-SEQ1 3’侧翼区片段(约4.0kb)。在dTTP存在下用T4 DNA聚合酶处理SrfI线性化载体pSEQ1flank5。在dATP存在下用T4 DNA聚合酶处理来自pSEQ1-3fl-HygR的4.0kb HpaI片段。如Aslanidis和deJong所述，将T4 DNA聚合酶处理的载体和插入片段混合并退火。然后将测定物在化学感受态大肠杆菌XL1-Blue细胞(Agilent)中转化，在含有100mg·l^-1氨苄青霉素(LB-Amp)的LB-Agar板上铺，并在37℃下温育24小时。用牙签从琼脂板上挑取菌落，转移至液体LB-Amp培养基中，并在37℃下振荡(250RPM)温育24小时。分离质粒DNA，用XmnI消化验证插入片段的整合。通过Sanger测序验证质粒克隆，将一个具有正确序列的质粒命名为pSEQ1M-HygR。

实施例2：将SEQ1突变载体转化至里氏木霉

根据制造商的说明书，用XmnI(新英格兰生物实验室)消化载体pSEQ1M-HygR，并通过琼脂糖凝胶电泳和来自Promega的Wizard PCR纯化试剂盒纯化突变盒(6.0kb)。基本上如

等人(1987)Gene61:155-164或Gruber等人(1990)Curr Genet 18:71-76所述，用消化的载体转化里氏木霉M18.2b(DSM 19984)。在含有100mg·l^-1潮霉素B和1M山梨醇的马铃薯葡萄糖琼脂板上选择转化体，并通过单一化进行纯化。纯化菌株的分生孢子储备液通过在30℃下在马铃薯葡萄糖琼脂板上其生长，直至板被孢子覆盖制备。分生孢子用无菌氯化钠(0.9g·l^-1)-Triton X-100(0.01g·l^-1)溶液收获，用无菌水调节至OD₆₀₀＝10，补充甘油至最终浓度为50g·l^-1，并储存在-80℃下。为了测定分生孢子滴度，将储备液的等分试样解冻，在马铃薯葡萄糖肉汤中适当稀释，并铺在含有1g·l^-1的TritonX-100的马铃薯葡萄糖琼脂上。将板在30℃下温育4天，然后对板上的菌落进行计数。

从转化体和宿主菌株的菌丝体中分离基因组DNA。根据制造商的说明书，分别用来自Thermo Fisher Scientific的phusion聚合酶，以来自转化体的基因组DNA作为模板和引物SEQ1MKOfw(5’-ATGTGCTAGGATTGTACGAG-3’；SEQ ID NO:13)和SEQ1MKO1rv(5’-ATAATAGCTCATGGTCTCAC-3’；SEQ ID NO:14)(退火温度：57.3℃，延伸时间：1分钟20秒，30个循环)或引物SEQ1MKOfw(5’-ATGTGCTAGGATTGTACGAG-3’；SEQ ID NO:13)和SEQ1MKO2rv(5’-TTGACAAAGGCCACAATATC-3’；SEQ ID NO:15)(退火温度：59.3℃，延伸时间：1分钟15秒，30个循环)通过PCR验证SEQ1突变盒在预期基因座的整合。具有引物SEQ1MKOfw和SEQ1MKO1rv的2.6kb条带表明突变盒整合在SEQ1基因座处，而具有引物SEQ1MKOfw和SEQ1MKO2rv的2.4kb条带表明SEQ1基因座仍然是天然的(即，该条带不是预期的来自在预期基因座处具有整合pSEQ1M-HygR片段的转化体的基因组DNA))。来自菌株M18.2b的基因组DNA也作为对比进行测试。为了验证预期的变异已经被插入到SEQ1 ORF中，用引物M1Seq-01(5’-ATCGCTACTTCTTTGTTCAG-3’；SEQ ID NO:16)和M1Seq-02(5’-CAGCTTGGAATACAGCACTG-3’；SEQ ID NO:17)对用引物SEQ1MKOfw和SEQ1MKO1rv获得的扩增子进行测序。

在SEQ1 ORF中含有来自pSEQ1M-HygR的突变的三个转化体命名为MSEQ1-1至-3。

实施例3：SEQ1突变菌株在摇瓶中的生长

菌株MSEQ1-1至-3和M18.2b在摇瓶中于水解产物培养基1中生长。水解产物培养基1含有(g·l^-1)：

用HCl或NaOH将培养基调节至pH 5.5，并高压灭菌(在121℃下20分钟)。

在无菌罩下，将15ml培养基分配到50ml锥形摇瓶中。将菌株MSEQ1-1至-3和M18.2b的分生孢子储备液解冻，在无菌罩下，将对应于2.5*10⁵个分生孢子的分生孢子悬浮液用移液管移至具有培养基的锥形瓶中，并用橡胶泡沫盖封闭烧瓶。每个菌株接种三个烧瓶。将烧瓶在30℃下振荡(250RPM)温育6天。6天后，将培养基倒入15ml管中。取出等分试样，离心(3220xg，4℃，15分钟)，并将上清液储存在4℃，同时将剩余的培养基肉汤用于测定生物量和粘度(参见下文)。

实施例4：培养基上清液和肉汤的表征：蛋白质浓度、SDS-PAGE、生物量、粘度

根据制造商的说明书，用快速启动Quick Start^TMBradford试剂(BioRad)和BSA标准溶液(BioRad)测量菌株MSEQ1-1至-3和M18.2b的离心培养基上清液中的蛋白质浓度。测量结果如图1所示。数值是相对于宿主菌株M18.2b的上清液中的平均蛋白质浓度设定为1给出的。从这些数据显而易见，菌株MSEQ1-1至-3比宿主菌株M18.2b产生显著更多的蛋白质。

对于生物量测定，将Whatman^TM过滤盘(P1)在60℃下干燥，直至其重量保持恒定24小时，冷却至室温并称重。用那些干燥的过滤盘过滤菌株MSEQ1-1至-3和M18.2b的培养基肉汤，并用至少十倍于培养基体积的去离子水洗涤菌丝体。然后在60℃下将具有菌丝体的过滤盘干燥，直至其重量保持恒定24小时。称重具有干燥菌丝体的过滤盘。然后通过从具有菌丝体的干燥过滤盘的质量中减去干燥过滤盘的质量，然后将该值除以已过滤的培养基肉汤的体积，计算培养基肉汤中的生物量浓度。测量结果如图2所示。数值是相对于宿主菌株M18.2b的培养基肉汤中的平均生物量浓度设定为1给出的。从这些数据显而易见，菌株MSEQ1-1至-3比宿主菌株M18.2b产生显著更少的生物量。

菌株MSEQ1-1至-3和M18.2b的培养基肉汤的粘度用具有Vane工具的MalvernKinexus Lab+KNX2110旋转流变仪(4Vnn:CUPnn)根据制造商的说明书，测量。在20℃的温度下和18.11RPM(“每分钟转数”)的转速下进行测量。粘度描绘在图3中，并且相对于菌株M18.2b的培养基肉汤的粘度设定为1呈现。从这些数据显而易见，用MSEQ1-1至-3产生的培养基肉汤的粘度显著低于宿主菌株M18.2b的粘度。

菌株MSEQ1-1至-3和M18.2b的离心培养基上清液的SDS-PAGE分析用本领域技术人员已知的方法(例如Jansohn等人(Gentechnische Methoden,Elsevier,München)描述的方法)和Criterion XT系统(BioRad)进行。在每个泳道中装载等体积的培养基上清液。Precision Plus Protein^TMAll Blue Standards(BioRad)用作蛋白质尺寸对比。凝胶图像如图4所示。本领域技术人员将认识到MSEQ1-1至-3的蛋白质模式与宿主菌株M18.2b的蛋白质模式是不可区分的。

实施例5：SEQ5突变载体的构建

本领域技术人员已知的标准方法，例如由Sambrook和Russel(MolecularCloning-A laboratory manual；Cold Spring Harbor Laboratory Press，纽约)或由Jansohn等人(Gentechnische Methoden，Elsevier，München)所描述的用于DNA琼脂糖凝胶电泳、DNA纯化、大肠杆菌转化、质粒增殖和纯化、通过聚合酶链式反应(PCR)扩增DNA片段和从里氏木霉和构巢绿霉中分离基因组DNA的标准方法。连接非依赖克隆(LIC)基本上如由Aslanidis和de Jong(1990，Nucleic Acid Res.18(20)，6069)所描述的进行。

构建SEQ5突变载体通过将构巢绿霉amdS基因融合至SEQ5 5’和3’侧翼区，并将融合产物克隆至pUC19衍生的质粒中。

根据制造商的说明书，用来自里氏木霉M18.2b(DSM 19984)的基因组DNA作为模板，引物SEQ5M5fw(5‘-GACTCTCTATCTGCATCAAC-3‘；SEQ ID NO:18)和SEQ5M5rv(5‘-TGACCTGGAAAGCTTTCAATGTAGAGGTAGACTAGTCAAAGAAGACATCACGAC-3‘；SEQ ID NO:19)和来自ThermoFisher Scientific的phusion聚合酶(退火温度：64.8℃，延伸时间：1分钟25秒，30个循环)通过PCR扩增SEQ5 5’侧翼区。用来自Promega的Wizard PCR纯化试剂盒纯化扩增子(2.7kb)。

根据制造商的说明书，用来自里氏木霉M18.2b(DSM 19984)的基因组DNA作为模板，引物SEQ5M3fw(5‘-CGCATGGTGGGCGTCGTGATGTCTTCTTTGACTAGTCTACCTCTACATTGAAAGC-3‘；SEQ ID NO:20)和SEQ5M3rv(5‘-GATTACCTGTCAAGTCTATG-3‘；SEQ ID NO:21)和来自Thermo Fisher Scientific的phusion聚合酶(退火温度：62.4℃，延伸时间：1分钟25秒，30个循环)通过PCR扩增SEQ5 3’侧翼区。用来自Promega的Wizard PCR纯化试剂盒纯化扩增子(2.7kb)。

用Phusion聚合酶(Thermo Fisher Scientific)和聚合酶提供的缓冲液和dNTP溶液通过PCR融合SEQ5 5’和3’侧翼区。将100ng纯化的SEQ5 5’PCR扩增子、100ng纯化的SEQ53’扩增子、10μl 5x Phusion HF缓冲液、1μl 10mM dNTP溶液、1U Phusion聚合酶和PCR级水混合至终体积为48μl。首先将混合物在98℃下温育30℃，然后进行10个循环为在98℃下10秒、在65℃下30秒和在72℃下2分钟40秒，然后冷却至10℃。然后添加1μl的20μM的引物SEQ5Mnestfw(5’-GACAGTCCTGCAGGAGTCACTGCCTTTGAAAG-3’；SEQ ID NO:22)溶液和1μl的20μM的引物SEQ5Mnestrv(5’-GACAGTCCTGCAGGTGTAAGGATAAAGGACGAC-3’；SEQ ID NO:23)的溶液，将混合物在98℃下温育30秒，然后进行30个循环为在98℃下10秒、在66.2℃下30秒和在72℃下1分钟20秒。在72℃下的温育时间每个循环延长5秒。最后，将混合物在72℃下温育10分钟，然后冷却至10℃。用来自Promega的Wizard PCR纯化试剂盒纯化扩增子(5.2kb)。

根据制造商的说明书，用SbfI(新英格兰生物实验室)消化纯化的SEQ5 5’和3’侧翼区融合产物，并用来自Promega的Wizard PCR纯化试剂盒纯化。

根据制造商的说明书，用SbfI(新英格兰生物实验室)消化，并用来自Promega的Wizard PCR纯化试剂盒纯化质粒pUC19(新英格兰生物实验室)。

根据制造商的说明书，用“Mighty Mix”DNA连接试剂盒(Takara)，用5：1的摩尔插入片段/载体比连接SbfI消化的SEQ5 5’和3’侧翼区融合产物和pUC19。将连接混合物在大肠杆菌Mach 1(Thermo Fisher Scientific)中转化，并铺在含有100mg·l^-1氨苄青霉素的LB琼脂板上。在37℃下温育20小时后，从板上挑取菌落，并用于接种3ml含有100mg·l^-1氨苄青霉素的LB液体培养基。在37℃下温育20小时后，分离质粒DNA，并用SbfI消化以鉴定含有插入片段的克隆。含有插入片段的质粒命名为pSEQ5-5’-3’。

根据制造商的说明书，用SpeI(新英格兰生物实验室)消化质粒pSEQ5-5’-3’，并用来自Promega的Wizard PCR纯化试剂盒纯化。将各1μl的10μM寡核苷酸LIC1fw(5’-CTAGGAGTTCTGCCTTGGGTTTAAACGAGAGAAAGACTC-3’；SEQ ID NO:24)and LIC1rv(5’-CTAGGAGTCTTTCTCTCGTTTAAACCCAAGGCAGAACTC-3’；SEQ ID NO:25)的溶液混合，放入PCR循环仪中，并在2小时过程中从70℃冷却至20℃。然后将寡核苷酸混合物与750ng纯化的、SpeI-消化的pSEQ5-5’-3’、1μl 10x T4连接酶缓冲液(Promega)、1μl 500g/lPEG3350、1μl T4 DNA连接酶(5U/μl；，T Thermo Fisher Scientific)和2μl PCR级水混合。将混合物在20℃温育1h，用来自Promega的Wizard PCR纯化试剂盒纯化，并将DNA在50μl的PCR级水中洗脱。向该溶液中补充6μl的Taq聚合酶缓冲液(Promega)，并添加PCR级水至终体积为60μl。然后将混合物在大肠杆菌Mach 1(Thermo Fisher Scientific)中转化，并铺在含有100mg·l^-1氨苄青霉素的LB琼脂板上。在37℃下培育20小时后，从板上挑取菌落，并用于接种3ml含有100mg·l^-1氨苄青霉素的LB液体培养基。在37℃下温育20小时后，分离质粒DNA，并根据制造商的说明书，用PmeI和SspI(新英格兰生物实验室)消化以鉴定含有插入物的克隆。含有插入片段的质粒命名为pSEQ5-5’-3’-LIC。

根据制造商的说明书，用PmeI(新英格兰生物实验室)消化质粒pSEQ5-5’-3’-LIC，并用Promega的Wizard PCR纯化试剂盒纯化。

根据制造商的说明书，用来自构巢大肠杆菌菌株CBS 124.59的基因组DNA作为模板，引物SEQ5MamdSfw(5’-GTTCTGCCTTGGGTTTAGGATGTACGACGTATATCC-3’；SEQ ID NO:27)和SEQ5MamdSrv(5’-GTCTTTCTCTCGTTTATGATGTCTATTGGAAGAAAACTTGG-3‘；SEQ ID NO:28)和来自Thermo Fisher Scientific的phusion聚合酶(退火温度：56.9℃，延伸时间：1分钟45秒，30个循环)通过PCR扩增包括启动子和终止子的构巢大肠杆菌amdS基因(SEQ ID NO:26)。用来自Promega的Wizard PCR纯化试剂盒纯化扩增子(3.4kb)。

用连接非依赖性克隆(LIC)将PCR扩增的amdS基因与PmeI-消化的pSEQ5-5’-3’-LIC融合。在dATP存在下用T4 DNA聚合酶处理线性化载体。在dTTP存在下用T4 DNA聚合酶处理PCR扩增的amdS。如Aslanidis and de Jong(1990,Nucleic Acid Res.18(20),6069)所述，将T4 DNA聚合酶处理的载体和amdS混合并退火。然后将测定物在化学感受态大肠杆菌Mach 1(Thermo Fisher Scientific)中转化，铺在含有100mg·l^-1氨苄青霉素的LB-Agar板上，并在37℃下温育24小时。用牙签从琼脂板上挑取菌落，转移至含有100mg·l^-1氨苄青霉素的液体LB培养基中，在37℃下振荡(250RPM)温育24小时。分离质粒DNA，用SbfI消化证实插入片段的整合。通过Sanger测序验证质粒克隆，将一个具有正确序列的质粒命名为pSEQ5M-amdS。

实施例6：SEQ5突变载体转化至里氏木霉

根据制造商的说明书，用SbfI(新英格兰生物实验室)消化载体pSEQ5M-amdS，并通过琼脂糖凝胶电泳和来自Promega的Wizard PCR纯化试剂盒纯化突变盒(8.6kb)。基本上如

等人(1987)Gene 61:155-164或Gruber等人(1990)Curr Genet 18:71-76所述，用消化的载体转化里氏木霉MSEQ1-1。在乙酰胺选择板上选择转化体(以g·l^-1计含有：乙酰胺0.6、CaCl₂*2H₂O 0.3、琼脂Noble 15、CsCl 2.5、FeSO₄*7H₂O 0.005、CuSO₄*5H₂O 0.0001、葡萄糖20、KH₂PO₄ 15、MgSO₄*7H₂O 0.3、MnSO₄*H₂O 0.0016、山梨醇182、ZnSO₄*7H₂O 0.0014；调节至pH 5.5)，并通过单一化纯化。纯化菌株的分生孢子储备液通过在30℃下在马铃薯葡萄糖琼脂板上其生长，直至板被孢子覆盖制备。分生孢子用无菌氯化钠(0.9g·l^-1)-TritonX-100(0.01g·l^-1)溶液收获，调节至OD600＝10，补充甘油50g·l^-1，并储存在-80℃下。为了测定分生孢子滴度，将储备液的等分试样解冻，在马铃薯葡萄糖肉汤中适当稀释，并铺在含有1g·l^-1的TritonX-100的马铃薯葡萄糖琼脂上。将板在30℃下温育4天，然后对板上的菌落进行计数。

从转化体和宿主菌株的菌丝体中分离基因组DNA。根据制造商的说明书，用来自Thermo Fisher Scientific的phusion聚合酶，来自转化体的基因组DNA作为模板和引物SEQ5MKO1fw(5’-ACTCTCTATCTGCATCAAC-3’；SEQ ID NO:29)和SEQ5MKO1rv(5’-GATCCCCGATTTCTTTGG-3’；SEQ ID NO:30)(退火温度：56.9℃，延伸时间：1分钟20秒，30个循环)和引物SEQ5MKO2fw(5’-TGATGTGCTTGATATTGGGC-3’；SEQ ID NO:31)和SEQ5MKO2rv(5’-CTCCATCGCTCAACTATGTG-3’；SEQ ID NO:32)(退火温度：57.5℃，延伸时间：1分钟15秒，30个循环)通过PCR验证SEQ5突变盒在预期基因座的整合。具有引物SEQ5MKO1fw和SEQ5MKO1rv的3.9kb条带表明突变盒整合在SEQ5基因座处，从而替代了SEQ5编码区，而SEQ5MKO2fw和SEQ5MKO2rv(1.2kb扩增子)扩增了被pSEQ5M-amdS替代的SEQ5基因的一部分，因此当SEQ5基因仍然存在时，仅给出一条条带。还测试了来自菌株MSEQ1-1的基因组DNA作为对比。

MSEQ1-1-衍生的菌株具有在SEQ5基因座处来自pSEQ5M-amdS的整合的突变盒，并由此替代的SEQ5基因命名为MSEQ1SEQ5-1。

实施例7：SEQ1SEQ5突变菌株在摇瓶中的生长

菌株MSEQ1SEQ5-1、MSEQ1-1和M18.2b在摇瓶中于水解产物培养基1中生长。水解产物培养基1含有(g·l^-1)：

用HCl或NaOH将培养基调节至pH5.5，并高压灭菌(在121℃下20分钟)。

在无菌罩下，将15ml培养基分配到50ml锥形摇瓶中。将菌株MSEQ1SEQ5-1、MSEQ1-1和M18.2b的分生孢子储备液解冻，在无菌罩下，将对应于2.5*10⁵个分生孢子的分生孢子悬浮液用移液管移至具有培养基的锥形瓶中，并用橡胶泡沫盖封闭烧瓶。每个菌株接种三个烧瓶。将烧瓶在30℃下振荡(250RPM)温育6天。6天后，将培养基倒入15ml管中。取出等分试样，离心(3220xg，4℃，15分钟)，并将上清液储存在4℃下，同时将剩余的培养基肉汤用于测定生物量和粘度(参见下文)。

实施例8：培养基上清液和肉汤的表征：蛋白质浓度、SDS–PAGE、生物量、粘度

根据供应商的说明书，使用Quick Start^TMBradford9(BioRad)试剂和BSA标准溶液(BioRad)测量菌株MSEQ1SEQ5-1、MSEQ1-1和M18.2b的培养基上清液中的蛋白质浓度。测量结果如图5所示。数值相对于菌株M18.2b的上清液中的平均蛋白质浓度设定为1给出的。从这些数据显而易见，菌株MSEQ1SEQ5-1比菌株MSEQ1-1和M18.2b产生显著更多的蛋白质。

对于生物量测定，将Whatman^TM过滤盘(P1)在60℃下干燥，直至其重量保持恒定24小时，冷却至室温并称重。用那些干燥的过滤盘过滤菌株MSEQ1SEQ5-1、MSEQ1-1和M18.2b的培养基肉汤，并用至少十倍于培养基体积的去离子水洗涤菌丝体。然后在60℃下将具有菌丝体的过滤盘干燥，直至其重量保持恒定24小时。称重具有干燥菌丝体的过滤盘。然后通过从具有菌丝体的干燥过滤盘的质量中减去干燥过滤盘的质量，然后将该值除以已过滤的培养基肉汤的体积，计算培养基肉汤中的生物量浓度。测量结果如图6所示。数值是相对于菌株M18.2b的培养基肉汤中的平均生物量浓度设定为1给出的。从这些数据显而易见，菌株MSEQ1SEQ5-1比菌株MSEQ1-1和M18.2b产生显著更少的生物量。

根据制造商的说明书，用具有Vane工具的Malvern Kinexus Lab+KNX2110旋转流变仪(4Vnn:CUPnn)测量菌株MSEQ1SEQ5-1和MSEQ1-1以及M18.2b的培养基肉汤的粘度。在20℃的温度下和在18.11RPM(“每分钟转数”)的转速下进行测量。粘度描绘在图7中，并且相对于菌株M18.2b的培养基肉汤的粘度设定为1呈现的。从这些数据显而易见，用MSEQ1-MSEQ5-1产生的培养基的粘度显著低于菌株MSEQ1-1和M18.2b的粘度。

菌株MSEQ1SEQ5-1、MSEQ1-1和M18.2b的离心培养基上清液的SDS-PAGE分析用本领域技术人员已知的方法(例如Jansohn等人(Gentechnische Methoden,Elsevier,München)描述的方法)和Criterion XT系统(BioRad)进行。在每个泳道中装载等体积的培养基上清液。Precision Plus Protein^TMAll Blue Standards(BioRad)用作蛋白质尺寸对比。凝胶图像如图8所示。本领域技术人员将认识到-除了MSEQ1SEQ5-1-和MSEQ1-1上清液中显著增加的蛋白质浓度-菌株MSEQ1SEQ5-1、MSEQ1-1和M18.2b的蛋白质模式是不可区分的。

发明内容

总之，这些数据表明SEQ1基因的破坏导致显著更有效的蛋白质生产，形成更多的蛋白质和更少的生物量。通过SDS-PAGE对分泌蛋白的分析显示，其组成没有显著变化，表明蛋白产量普遍增加。此外，生物量产量和培养基的粘度也显著降低。

序列表

SEQ ID NO:1

SEQ1天然基因

ATGGTTTCTGGCGACTACGCCTTCAACCCCGATCAACACGGCGCATATGCCGAACCGTACCAACAGCCGGACGACGGCCGGACTAGGACGCTGCTTGACAACCAAGCCTTCTTTTCTGACTTCGCGGGCCAGCAGCACTACGAACAGAACCAGATGGGCGACTATGGTGGCCCTAGATACTCCGGCGATGCCTTCTCTCCGACAGCAGCCATGGCTCCTCCGATGCTCACTGCCAACGACATGCCTCCACCCGAGATATTGGAGTACCAGGCTCCGCTCGAGCCAAGAGAGGTCCCCTTTGCCATTCAGGATCCCCACGACAACAACACGGCCATGTCTTCGTTCGACAACATGGCTGCGGTACTCCGTCACCGTGCCCGCACCACTGCCAAAAGACCTGCATATTGGGTCCTGGACAGCAAGGGCAAGGAGGTGGCATCCATTACATGGGACAAGCTGGCGTCAAGAGCGGAGAAAGTTGCACAAGTCATCCGAGACAAAAGTCCTCTTTACCGTGGCGATCGAGTTGCCTTGATCTATCGTGATAGCGAAATCATTGACTTCGCCATTGCCTTGCTGGGTTGCTTCATTGCTGGAGTTGTGGCTGTCCCGATCAATGACTTGCAAGACTACCAGCGCCTCAACTATATTCTCACCTCGACTCAGGCGCATCTGGCTCTTACTACCGAAAACAACCTCAAGACCTTCCAGAGAGACATTACTGCGCAGAAGCTCACGTGGCCTAAAGGGGTCGAGTGGTGGAAGACCAACGAGTTCGGCGGTTACCATCCGAAGAAGAAGGAAGACGCACCTCCGTTAACTGTTCCCGACCTGGCCTATATTGAGTTTTCGCGAGCACCAACCGGCGACTTGAGGGGCGTTGTTCTCAGCCACAGGACAATCATGCACCAGATGGCCTGCCTCAGTGCCATAATCTCTACCGTTCCCACCAACGGCCCCGGCGATACCTTCAACTCGACGTTGCGGGACAAGAACGGAAAGCTCATCGGCGGCGGAGCCAGCAGCGAGATATTGCTCTCCTATCTGGATCCCCGACAGGGCGTGGGCATGATTCTCGGCGTTTTGCTGACCGTTTACGGCGGCCACACTACCGTCTGGTTCGATCACAAAGCCGTCGAGTCGCCTGGCTTATACGCGCATCTGATTACCAAGTACAGAGCGACGATTATGATTGCGGATTACCCCGGGTTGAAGCGAGCTGCCTACAACTACCAGCAAGACCCCATGACGACACGAAACTTCAAAAAGGGGATGGAACCCAACTTCCAAGCGGTGAAGCTGTGCTTGATTGATACCCTGACCATTGATAGCGAGTTCCATGAAGTTCTGGCCGATAGATGGCTGCGGCCCCTGCGAAATCCGCGAGCGCGCGAGGTCGTGGCGCCGATGCTCTGCCTCCCCGAGCATGGCGGCATGATCATTAGCGTTCGAGACTGGCTCGGCGGTGAAGAACGACTGGGAGTTCCGCTGAAACTGGACGAGTCTGACAGGGAGTCGGATGACGAGAAAGAAGAGGAAGAGAAGCCGGCCCCGTCAAACGGATTTGGTAGCTTGCTTGGTGGTGGAGCAGCGACAACCAAGGAGCAGGACGAGAAGATTGAGTTGGGCGAGGTTATCCTTGACCGAGAGGCTCTCAAGACCAACGAGGTTGTCGTCTTGGCTCATGGCAACGAAGCTAGGAAGAAGACGTCGCTGGAGCCCACCATGGTCCGGGTCGGCGCCTTTGGATACCCTATCCCAGATGCCACGCTTGCTGTTGTGGACCCTGAGACTGGCCTCCTGGCAGCGCCGCACACGATTGGCGAGATCTGGGTTGACTCTCCGTCTCTCTCTGGAGGCTTCTGGGCGCAGCCAAAGAACACCGAGCTCATCTTCCACGCGCGTCCGTACAAGTTCGAGCCTGGCGAGCCGACGCCAACTGCCGTGGAGCCGGAATTCCTGCGAACCGGCCTGCTTGGCACAGTCATCGAGGGCAAGATCTATGTGCTAGGATTGTACGAGGATCGGATACGACAAAAGGTCGAATGGGTTGAGCACGGCCACGCGGGTATCGCCGAGTATCGCTACTTCTTTGTTCAGCACATTGTGGTGAGCATCGTCAAGAATGTCCCCAAGATCCACGACTGCTCTGCCTTTGACGTCTTTGTCAATGACGAGCACTTGCCTGTCGTGGTCCTCGAGTCTGCCGCAGCATCAACGGCGCCTCTCACTTCGGGCGGCCCCCCTGTCCAGCCTGACACGGTTCTGTTAGACTCGCTGGCGGAGAAATGCATGGAGGTGCTCATGCAGGAGCACCATCTTCGGGTTTACTGCGTTATGATCACAGCCCCGAACGCACTGCCGCGAGTGATCAAGAACGGAAGACGGGAAATAGGGAACATGCTCTGCCGGCGCGAGTTTGACCTTGGCAACCTCCCATGCGTGCATGTCAAATTTGGCGTCGAACATGCGGTTCTCAACCTCCCGATTGGCGTTGACCCCATTGGTGGTATCTGGTCACCAATCGCCTCGGACTCGAGAATCAATATCCTGGCTCCCGCCGATAAGCAGTATTCTGGAATCGACCGCAGAGAGGTTGTTATGGACGACCGGACGTCTACACCGCTCAACAATTTCAAGACCATCACCGATCTGATCCAGTGGCGTGTTGCTCGCCAGCCAGAGGAGCTCGCTTATTGTACCATTGACGGCAGGGGCAGAGAGGGCAAGGGGATTCCGTGGAAGAAGTTTGACTCCAAGGTGGCGGCTGTGGCCATGTATCTGAAGAACAAAGTCAAGGTGCGGCCGGGCGACCACCTGGTCCTCATGTACACCCACTCCGAGGAGTTTGTCTTTGCCGTCCACGCGGGAATCAACCTTGGCGCAGTCATTATTCCCATGGCGCCGCTTGACCAGAACCGGCTCAACGAAGATGTCCCTGCTTTCCTGCACCTGATCGCTGACTACAAGGTTAAGGCGGTCCTGGTCAACCAGGAAGTGGACCATTTGCTGAAGCTCAAGATCGTGTCGAGCCACATCAAACAGTCCGCACAGATCCTGAAGATCTCGATGCCGAATACCTACAACACTTCGAAGCCACCTAAGCAGAACAACGGTCTTCGCGAGCTTGGGCTGACGATAGATCCCGCCTGGATCAGGCCTGGATACCCCGTCCTCATCTGGACATACTGGACGCCGGACCAACGGAGAATCGCCGTCCAGCTGGGGCATGATACCATCCTGGGCATGTGCAAAGTGCAGAAGGAGACTTGTCAGATGACGAGCTTCCAGCCCGTTCTCGGTTGCGTAAGAAGCACAACGGGACTTGGTTTCGTGCACACGTGCCTGATGGGCATCTACGTTGGCACCGCCACCTACCTGCTGTCTCCTGTCGAGTTCGCCCAAAATCCCATCTCTCTCTTTGTTACGTTGTCGAGGTACAAGATCAAGGACACCTATGCAACGCCGCAGATGCTTGACCATGCCATGTCGTCGATGCAGGCCAAGGGCTTTACAATGCACGAACTGAAGAATATGATGATTACTGCAGAGGGCCGGCCGCGGGTAGATGTATTCCAGAAGGTACGGATGCATTTTGCGAGCGCCGGGCTGGATAGGACGGCCATCAACACGGTCTACTCGCATGTGCTCAACCCGATGATTGCTTCGAGGTCTTACATGTGCATCGAGCCTATTGAGCTCTGGCTCGACACCAAGGCTCTTCGACGCGGCCTCGTCGTCCCGGTCGATCACGATTCAAACCCGCAAGCTCTTCTCCTGCAGGATTCCGGCATGGTGCCGGTGTCTACCCAGATTGCCATTGTCAACCCCGAGAGCCGCGCGCATTGCTACGATGGAGAATATGGCGAGATCTGGGTCGACTCCGAGGCGTGCGTAAAGGCCTTTTACGGCTCCAAGGAAGCGTTTGACGTGGAGCGCTTCGACGGCCGGACGGTCGACGGCGACCCCAACGTGCGATACGTGCGAACTGGTGACTTGGGCTTTTTGTATAATGTCAACCGGCCTATCGGGCCCAACGGCGCCCTGGTGGAGATGCAAGTCTTGTTTGTGCTCGGTAGCATCGGCGAGACTTTTGAAATTAACGGTTTGAGTCACTTCCCCATGGATATTGAGCTGTCGGTGGAACGCTGCCACCGCAACATTGTACCCAACGGCTGGTAAGTACAGGGCCAACTCTTCTGTGAGATGCTACTTGACTAATAGTTGGTGATGTGCAGTGCTGTATTCCAAGCTGGTGGCTTGGTCGTGGTCCTGGTAGAGGTGAGCCGCAAGTCTTACCTCGCCTCCATGGTGCCAGTCATTGTCAACGCCATCTTGAGCGAGCATCAGATCGTTGCCGATATTGTGGCCTTTGTCAACAAGGGCGACTTCCCACGCTCTCGCCTGGGAGAGAAGCAGCGAGGAAAGATCCTCGCCGGATGGGTTACGCGCAAGATGCGCACCATGGCCCAGTTCGCCATCAGAGATCTCGACGCCAGCATGCTCGAGCCGGGTGAGGGTCCGGATGCCAATAGGACCTCTACGGGTAGCCTCCGTAGCCTGGGCGCCGCCGTCCCGCCAAACTTCAAGATGGTTGGACAGGCGCCGCAGATACTGGAACAGGAGGAATTTACGCAGCAGATGGATCACATGGCCCATTCGGAGCCGGTCAGGCATGCCATGGCCGCTCCAGAGGAGCAGCAGGCGCCGGCGGCCTATTACGCTGGCGGCCAGGAGGCTGCTTTCATGCAGGGCTATAATCAGCAGCCGCCACCACCACCACCAAGCAGCCAGGGAGGATACCAGTACGAGCAATTCGAGCCAGTGCAAGCACAGCAACAGTACCAGCCGCAGTCACAGCATCAGTTTGAACCATCTCAAGCCTTTGAGCCAGCGCAGCAATACGAGCCAGCGCAACAGCACGAGCAGGAGCCAAGGCCGATGGACTCTCGAGGACAAGATGCGCCGTCCATTGTTGAGCCAGAGACCTCAGCCTCCGTGCCTGATACGCCGCCGCCGAGAAACAGGTTGAGTCAAGGGCCGCCCCAGATCCGGCTCCCGGGCGTTGACGGACGGGAAGGGCTCGACTTCTGGGGAGGCAACGACGAGACGGACTGGACGGCCGATGCCATGATGCACATGAATCTCACTGGCCCACGGTAA

SEQ ID NO:2

潮霉素B抗性标记

TGCAAGGCGATTAAGTTGGGTAACGCCAGGGTTTTCCCAGTCACGACGTTGTAAAACGACGGCCAGTGAGCGCGACGTAATACGACTCACTATAGGGCGAATTGGCGGAAGGCCGTCAAGGCCTAGGCGCGCCATGAGCTCGTTAACAAGACACAGCCCTATAACTTCGTATAATGTATGCTATACGAAGTTATATAACGGTGAGACTAGCGGCCGGTCCCCTTATCCCAGCTGTTCCACGTTGGCCTGCCCCTCAGTTAGCGCTCAACTCAATGCCCCTCACTGGCGAGGCGAGGGCAAGGATGGAGGGGCAGCATCGCCTGAGTTGGAGCAAAGCGGCCCGGCCGCCATGGGAGCAGCGAACCAACGGAGGGATGCCGTGCTTTGTCGTGGCTGCTGTGGCCAATCCGGGCCCTTGGTTGGCTCACAGAGCGTTGCTGTGAGACCATGAGCTATTATTGCTAGGTACAGTATAGAGAGAGGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGGGGAAAAAAGGTGAGGTTGAAGTGAGAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAATCCAACCACTGACGGCTGCCGGCTCTGCCACCCCCCTCCCTCCACCCCAGACCACCTGCACACTCAGCGCGCAGCATCACCTAATCTTGGCTCGCCTTCCCGCAGCTCAGGTTGTTTTTTTTTTCTCTCTCCCTCGTCGAAGCCGCCCTTGTTCCCTTATTTATTTCCCTCTCCATCCTTGTCTGCCTTTGGTCCATCTGCCCCTTTGTCTGCATCTCTTTTGCACGCATCGCCTTATCGTCGTCTCTTTTTTCACTCACGGGAGCTTGACGAAGACCTGACTCGTGAGCCTCACCTGCTGATTTCTCTCCCCCCCTCCCGACCGGCTTGACTTTTGTTTCTCCTCCAGTACCTTATCGCGAAGCCGGAAGAACCTCTTAACCTCTAGATGAAAAAGCCTGAACTCACCGCCACGTCTGTCGAGAAGTTCCTGATCGAAAAGTTCGACAGCGTCTCCGACCTGATGCAGCTCTCGGAGGGCGAAGAATCTCGTGCTTTCAGCTTCGATGTAGGAGGGCGTGGATATGTCCTGCGGGTAAATAGCTGCGCCGATGGTTTCTACAAAGATCGTTATGTTTATCGGCACTTTGCATCGGCCGCGCTCCCGATTCCGGAAGTGCTTGACATTGGGGAATTCAGCGAGAGCCTGACCTATTGCATCTCCCGCCGTGCACAGGGTGTCACGTTGCAAGACCTGCCTGAAACCGAACTGCCCGCTGTTCTGCAGCCGGTCGCGGAGGCCATGGATGCGATCGCTGCGGCCGATCTCAGCCAGACGAGCGGGTTCGGCCCATTCGGACCGCAAGGAATCGGTCAATACACTACATGGCGTGATTTCATATGCGCGATTGCTGATCCCCATGTGTATCACTGGCAAACTGTGATGGACGACACCGTCAGTGCGTCCGTCGCGCAGGCTCTCGATGAGCTGATGCTTTGGGCCGAGGACTGCCCCGAAGTCCGGCACCTCGTGCACGCGGATTTCGGCTCCAACAATGTCCTGACGGACAATGGCCGCATAACAGCGGTCATTGACTGGAGCGAGGCGATGTTCGGGGATTCCCAATACGAGGTCGCCAACATCTTCTTCTGGAGGCCGTGGTTGGCTTGTATGGAGCAGCAGACGCGCTACTTCGAGCGGAGGCACCCGGAGCTTGCAGGATCGCCGCGGCTCCGGGCGTATATGCTCCGCATTGGTCTTGACCAACTCTATCAGAGCTTGGTTGACGGCAATTTCGATGATGCAGCTTGGGCGCAGGGTCGATGCGACGCAATCGTCCGATCCGGAGCCGGGACTGTCGGGCGTACACAAATCGCCCGCAGAAGCGCGGCCGTCTGGACCGATGGCTGTGTAGAAGTACTCGCCGATAGTGGAAACCGACGCCCCAGCACTCGTCCGAGGGCAAAGGAATAGATGCATGGCTTTCGTGACCGGGCTTCAAACAATGATGTGCGATGGTGTGGTTCCCGGTTGGCGGAGTCTTTGTCTACTTTGGTTGTCTGTCGCAGGTCGGTAGACCGCAAATGAGCAACTGATGGATTGTTGCCAGCGATACTATAATTCACATGGATGGTCTTTGTCGATCAGTAGCTAGTGAGAGAGAGAGAACATCTATCCACAATGTCGAGTGTCTATTAGACATACTCCGAGAATAAAGTCAACTGTGTCTGTGATCTAAAGATCGATTCGGCAGTCGAGTAGCGTATAACAACTCCGAGTACCAGCGAAAGCACGTCGTGACAGGAGCAGGGCTTTGCCAACTGCGCAACCTTGCTTGAATGAGGATACACGGGGTGCAACATGGCTGTACTGATCCATCGCAACCAAAATTTCTGTTTATAGATCAAGCTGGTAGATTCCAATTACTCCACCTCTTGCGCTTCTCCATGACATGTAAGTGCACGTGGAAACCATACCCAATATAACTTCGTATAATGTATGCTATACGAAGTTATAGGGCTCTTGTCTGTT

SEQ ID NO:3

LIC接受载体

TTTATCAGGGTTATTGTCTCATGAGCGGATACATATTTGAATGTATTTAGAAAAATAAACAAATAGGGGTTCCGCGCACATTTCCCCGAAAAGTGCCACCTGACTAAACCAGACAGACAGCTGTCTCTCCTCTCTAACATGTGAGCAAAAGGCCAGCAAAAGGCCAGGAACCGTAAAAAGGCCGCGTTGCTGGCGTTTTTCCATAGGCTCCGCCCCCCTGACGAGCATCACAAAAATCGACGCTCAAGTCAGAGGTGGCGAAACCCGACAGGACTATAAAGATACCAGGCGTTTCCCCCTGGAAGCTCCCTCGTGCGCTCTCCTGTTCCGACCCTGCCGCTTACCGGATACCTGTCCGCCTTTCTCCCTTCGGGAAGCGTGGCGCTTTCTCATAGCTCACGCTGTAGGTATCTCAGTTCGGTGTAGGTCGTTCGCTCCAAGCTGGGCTGTGTGCACGAACCCCCCGTTCAGCCCGACCGCTGCGCCTTATCCGGTAACTATCGTCTTGAGTCCAACCCGGTAAGACACGACTTATCGCCACTGGCAGCAGCCACTGGTAACAGGATTAGCAGAGCGAGGTATGTAGGCGGTGCTACAGAGTTCTTGAAGTGGTGGCCTAACTACGGCTACACTAGAAGGACAGTATTTGGTATCTGCGCTCTGCTGAAGCCAGTTACCTTCGGAAAAAGAGTTGGTAGCTCTTGATCCGGCAAACAAACCACCGCTGGTAGCGGTGGTTTTTTTGTTTGCAAGCAGCAGATTACGCGCAGAAAAAAAGGATCTCAAGAAGATCCTTTGATCTTTTCTACGGGGTCTGACGCTCAGTGGAACGAAAACTCACGTTAAGGGATTTTGGTCATGAGATTATCAAAAAGGATCTTCACCTAGATCCTTTTAAATTAAAAATGAAGTTTTAAATCAATCTAAAGTATATATGAGTAAACTTGGTCTGACAGTTACCAATGCTTAATCAGTGAGGCACCTATCTCAGCGATCTGTCTATTTCGTTCATCCATAGTTGCCTGACTCCCCGTCGTGTAGATAACTACGATACGGGAGGGCTTACCATCTGGCCCCAGTGCTGCAATGATACCGCGAGACCCACGCTCACCGGCTCCAGATTTATCAGCAATAAACCAGCCAGCCGGAAGGGCCGAGCGCAGAAGTGGTCCTGCAACTTTATCCGCCTCCATCCAGTCTATTAATTGTTGCCGGGAAGCTAGAGTAAGTAGTTCGCCAGTTAATAGTTTGCGCAACGTTGTTGCCATTGCTACAGGCATCGTGGTGTCACGCTCGTCGTTTGGTATGGCTTCATTCAGCTCCGGTTCCCAACGATCAAGGCGAGTTACATGATCCCCCATGTTGTGCAAAAAAGCGGTTAGCTCCTTCGGTCCTCCGATCGTTGTCAGAAGTAAGTTGGCCGCAGTGTTATCACTCATGGTTATGGCAGCACTGCATAATTCTCTTACTGTCATGCCATCCGTAAGATGCTTTTCTGTGACTGGTGAGTACTCAACCAAGTCATTCTGAGAATAGTGTATGCGGCGACCGAGTTGCTCTTGCCCGGCGTCAATACGGGATAATACCGCGCCACATAGCAGAACTTTAAAAGTGCTCATCATTGGAAAACGTTCTTCGGGGCGAAAACTCTCAAGGATCTTACCGCTGTTGAGATCCAGTTCGATGTAACCCACTCGTGCACCCAACTGATCTTCAGCATCTTTTACTTTCACCAGCGTTTCTGGGTGAGCAAAAACAGGAAGGCAAAATGCCGCAAAAAAGGGAATAAGGGCGACACGGAAATGTTGAATACTCATACTCTTCCTTTTTCAATATTATTGAAGCA

SEQ ID NO:4

pSEQ1flank5

CTAAATTGTAAGCGTTAATATTTTGTTAAAATTCGCGTTAAATTTTTGTTAAATCAGCTCATTTTTTAACCAATAGGCCGAAATCGGCAAAATCCCTTATAAATCAAAAGAATAGACCGAGATAGGGTTGAGTGGCCGCTACAGGGCGCTCCCATTCGCCATTCAGGCTGCGCAACTGTTGGGAAGGGCGTTTCGGTGCGGGCCTCTTCGCTATTACGCCAGCTGGCGAAAGGGGGATGTGCTGCAAGGCGATTAAGTTGGGTAACGCCAGGGTTTTCCCAGTCACGACGTTGTAAAACGACGGCCAGTGAGCGCGACGTAATACGACTCACTATAGGGCGAATTGGCGGAAGGCCGTCAAGGCCGCATGACTGAATAACTTCGGGCGGCCCCCCTGTCCAGCCTGACACGGTTCTGTTAGACTCGCTGGCGGAGAAATGCATGGAGGTGCTCATGCAGGAGCACCATCTTCGGGTTTACTGCGTTATGATCACAGCCCCGAACGCACTGCCGCGAGTGATCAAGAACGGAAGACGGGAAATAGGGAACATGCTCTGCCGGCGCGAGTTTGACCTTGGCAACCTCCCATGCGTGCATGTCAAATTTGGCGTCGAACATGCGGTTCTCAACCTCCCGATTGGCGTTGACCCCATTGGTGGTATCTGGTCACCAATCGCCTCGGACTCGAGAATCAATATCCTGGCTCCCGCCGATAAGCAGTATTCTGGAATCGACCGCAGAGAGGTTGTTATGGACGACCGGACGTCTACACCGCTCAACAATTTCAAGACCATCACCGATCTGATCCAGTGGCGTGTTGCTCGCCAGCCAGAGGAGCTCGCTTATTGTACCATTGACGGCAGGGGCAGAGAGGGCAAGGGGATTCCGTGGAAGAAGTTTGACTCCAAGGTGGCGGCTGTGGCCATGTATCTGAAGAACAAAGTCAAGGTGCGGCCGGGCGACCACCTGGTCCTCATGTACACCCACTCCGAGGAGTTTGTCTTTGCCGTCCACGCGGGAATCAACCTTGGCGCAGTCATTATTCCCATGGCGCCGCTTGACCAGAACCGGCTCAACGAAGATGTCCCTGCTTTCCTGCACCTGATCGCTGACTACAAGGTTAAGGCGGTCCTGGTCAACCAGGAAGTGGACCATTTGCTGAAGCTCAAGATCGTGTCGAGCCACATCAAACAGTCCGCACAGATCCTGAAGATCTCGATGCCGAATACCTACAACACTTCGAAGCCACCTAAGCAGAACAACGGTCTTCGCGAGCTTGGGCTGACGATAGATCCCGCCTGGATCAGGCCTGGATACCCCGTCCTCATCTGGACATACTGGACGCCGGACCAACGGAGAATCGCCGTCCAGCTGGGGCATGATACCATCCTGGGCATGTGCAAAGTGCAGAAGGAGACTTGTCAGATGACGAGCTTCCAGCCCGTTCTCGGTTGCGTAAGAAGCACAACGGGACTTGGTTTCGTGCACACGTGCCTGATGGGCATCTACGTTGGCACCGCCACCTACCTGCTGTCTCCTGTCGAGTTCGCCCAAAATCCCATCTCTCTCTTTGTTACGTTGTCGAGGTACAAGATCAAGGACACCTATGCAACGCCGCAGATGCTTGACCATGCCATGTCGTCGATGCAGGCCAAGGGCTTTACAATGCACGAACTGAAGAATATGATGATTACTGCAGAGGGCCGGCCGCGGGTAGATGTATTCCAGAAGGTACGGATGCATTTTGCGAGCGCCGGGCTGGATAGGACGGCCATCAACACGGTCTACTCGCATGTGCTCAACCCGATGATTGCTTCGAGGTCTTACATGTGCATCGAGCCTATTGAGCTCTGGCTCGACACCAAGGCTCTTCGACGCGGCCTCGTCGTCCCGGTCGATCACGATTCAAACCCGCAAGCTCTTCTCCTGCAGGATTCCGGCATGGTGCCGGTGTCTACCCAGATTGCCATTGTCAACCCCGAGAGCCGCGCGCATTGCTACGATGGAGAATATGGCGAGATCTGGGTCGACTCCGAGGCGTGCGTAAAGGCCTTTTACGGCTCCAAGGAAGCGTTTGACGTGGAGCGCTTCGACGGCCGGACGGTCGACGGCGACCCCAACGTGCGATACGTGCGAACTGGTGACTTGGGCTTTTTGTATAATGTCAACCGGCCTATCGGGCCCAACGGCGCCCTGGTGGAGATGCAACTTGTTTGTGCTCGGTAGCATCGGCGAGACTTTTGAAATTAACGGTTTGAGTCACTTCCCCATGGATATTGAGCTGTCGGTGGAACGCTGCCACCGCAACATTGTACCCAACGGCTGGTAAGTACAGGGCCAACTCTTCTGTGAGATGCTACTTGACTAATAGTTGGTGATGTGCAGTGCTGTATTCCAAGCTGGTGGCTTGGTCGTGGTCCTGGTAGAGGTGATAACAAGACACAGCCCGGGCTCTTGTCTGTTACTGGGCCTCATGGGCCTTCCGCTCACTGCCCGCTTTCCAGTCGGGAAACCTGTCGTGCCAGCTGCATTAACATGGTCATAGCTGTTTCCTTGCGTATTGGGCGCTCTCCGCTTCCTCGCTCACTGACTCGCTGCGCTCGGTCGTTCGGGTAAAGCCTGGGGTGCCTAATGAGCAAAAGGCCAGCAAAAGGCCAGGAACCGTAAAAAGGCCGCGTTGCTGGCGTTTTTCCATAGGCTCCGCCCCCCTGACGAGCATCACAAAAATCGACGCTCAAGTCAGAGGTGGCGAAACCCGACAGGACTATAAAGATACCAGGCGTTTCCCCCTGGAAGCTCCCTCGTGCGCTCTCCTGTTCCGACCCTGCCGCTTACCGGATACCTGTCCGCCTTTCTCCCTTCGGGAAGCGTGGCGCTTTCTCATAGCTCACGCTGTAGGTATCTCAGTTCGGTGTAGGTCGTTCGCTCCAAGCTGGGCTGTGTGCACGAACCCCCCGTTCAGCCCGACCGCTGCGCCTTATCCGGTAACTATCGTCTTGAGTCCAACCCGGTAAGACACGACTTATCGCCACTGGCAGCAGCCACTGGTAACAGGATTAGCAGAGCGAGGTATGTAGGCGGTGCTACAGAGTTCTTGAAGTGGTGGCCTAACTACGGCTACACTAGAAGAACAGTATTTGGTATCTGCGCTCTGCTGAAGCCAGTTACCTTCGGAAAAAGAGTTGGTAGCTCTTGATCCGGCAAACAAACCACCGCTGGTAGCGGTGGTTTTTTTGTTTGCAAGCAGCAGATTACGCGCAGAAAAAAAGGATCTCAAGAAGATCCTTTGATCTTTTCTACGGGGTCTGACGCTCAGTGGAACGAAAACTCACGTTAAGGGATTTTGGTCATGAGATTATCAAAAAGGATCTTCACCTAGATCCTTTTAAATTAAAAATGAAGTTTTAAATCAATCTAAAGTATATATGAGTAAACTTGGTCTGACAGTTACCAATGCTTAATCAGTGAGGCACCTATCTCAGCGATCTGTCTATTTCGTTCATCCATAGTTGCCTGACTCCCCGTCGTGTAGATAACTACGATACGGGAGGGCTTACCATCTGGCCCCAGTGCTGCAATGATACCGCGAGAACCACGCTCACCGGCTCCAGATTTATCAGCAATAAACCAGCCAGCCGGAAGGGCCGAGCGCAGAAGTGGTCCTGCAACTTTATCCGCCTCCATCCAGTCTATTAATTGTTGCCGGGAAGCTAGAGTAAGTAGTTCGCCAGTTAATAGTTTGCGCAACGTTGTTGCCATTGCTACAGGCATCGTGGTGTCACGCTCGTCGTTTGGTATGGCTTCATTCAGCTCCGGTTCCCAACGATCAAGGCGAGTTACATGATCCCCCATGTTGTGCAAAAAAGCGGTTAGCTCCTTCGGTCCTCCGATCGTTGTCAGAAGTAAGTTGGCCGCAGTGTTATCACTCATGGTTATGGCAGCACTGCATAATTCTCTTACTGTCATGCCATCCGTAAGATGCTTTTCTGTGACTGGTGAGTACTCAACCAAGTCATTCTGAGAATAGTGTATGCGGCGACCGAGTTGCTCTTGCCCGGCGTCAATACGGGATAATACCGCGCCACATAGCAGAACTTTAAAAGTGCTCATCATTGGAAAACGTTCTTCGGGGCGAAAACTCTCAAGGATCTTACCGCTGTTGAGATCCAGTTCGATGTAACCCACTCGTGCACCCAACTGATCTTCAGCATCTTTTACTTTCACCAGCGTTTCTGGGTGAGCAAAAACAGGAAGGCAAAATGCCGCAAAAAAGGGAATAAGGGCGACACGGAAATGTTGAATACTCATACTCTTCCTTTTTCAATATTATTGAAGCATTTATCAGGGTTATTGTCTCATGAGCGGATACATATTTGAATGTATTTAGAAAAATAAACAAATAGGGGTTCCGCGCACATTTCCCCGAAAAGTGCCAC

SEQ ID NO:5

SEQ5天然基因

ATGAGGGCCTATCAGATCGAGATGCTCGACAAGAGCCTCAAGCAAAATGTCATTGTTGCTGTATGTTGAAGTTTCTCTCCAATCCCCCGTCTCCCCCTTTGCTGTCGTTGTCTTCGACGTTGAAAGACATGTCCATTGACCAAGGGGCGTTGTTATAAATCTAGATGGACACGGGAAGTGGCAAGACTCAAGTGTAAGTTGTGCATCTTCATCATCGGCAGCCCACGTAACCTGTGCCAGCCCTTAGCACCCTTCTTCGCAAAAGACTGACTTGGCGCTTGCATCAGAGCTGTGCTTCGTATCAAGAAGGAGCTGGAAATCTGCGATGCATCAAAGGTGAGTCTGCCGTCTGGATACAGTTGCACAACGACCTGGACAGCTGCACTGACGCAGCACGCATCAGATCATCTGGTTCATCGCGCCAACAGTTTCGCTGTGTCATCAGCAACACGATGTGCTCAAGTTGCAGATACCTGCCGTGCCCATGATGACACTGGCCGGGAACTCCAATATCGATGCTTGGGGGCCGGATATCTGGGCCATTCTTCTCGACACGGTTCGAATTGTCATATCCACACCCCAGGTTCTGCTCGATGCCCTTGACCATGCTTACCTGAACTTGGGTCTTCTGGCGCTGCTTGTATTTGATGAAGGTATGGGACGACCTGCCTTCACTCTGTAAAGGCAAAGGGGCCGCCAGAAGTTGCAAATCGCTGACGTGTCTTGTGCAAAAGTCCACAACTGCATTGGCAGAAGTCCAGGCGGCAAAATCATGCTCCACCACTACCATCCGCGCAAGCTGGCTGGTGAAAGCGTGCCTGCTGTTCTGGGTCTGACGGCAACTCCGAGCATTCAGTCTGAGCTTGCCGATATTGATGCCTTGGAATGGCTGATGGATGCAAGATGCGTCTCGCCCACTCTCCATCGCGACGAACTGCTCAAATGCGTCAAGAGGCCCAATATCAAGCACATCATCTATAAAGCCGGCAAAGAAGACATCACGACGCCCACCATGCGCGACTTGGATCGGGTCTACCGGGCGCTGGACATTCTCGAAGACCCCTACATACTCATGCTGCGCAACAACCCTACGGACCGAAACAACCGCCTGCTGCTAACAGCCATTGAAAAGTACGATACCTACACACAGAACCAGATGAAGTCGTTCTGCGCCCGATCAAGAGAGATATGCAAGCAACTCGGTCCCTGGGCTGCTGACCTCTTCATCTGGAAGGCCATCTCAGCTCACTTGGACAAGGTGGACAGGCAGACGGATGGAGTTGACGAGTATGGCAACAAGTGGTCGTCGGGGTCGACAAGCTTCCTGGAAAAGAAGCACCTGGCCGACATCTATCGTCGAGTCAAGGTCCAACGTCCTTCCGATGTGCCACAGGTCTTTGAAGACATTTCCGACAAGGTCGGTAAGCTAATCTTTGAGCTTCTGTCGGTAGAGGAGCCCACGGTGGGCATCATCTTCGTCGAGGAACGAGTCATGGTTGCTATGCTGGCCGAGGTTCTCTCTGTCAACCACACAATCACGTCCCGGTACCGGATCGGGACCATGGTTGGCACCTCAAATTACGCTGGGCGGCGGAAGGCCGTTTATGACTTCGACCAGAAAACGGACTACAAGGACCTGCAGAGCTTCCGCTCCGGCAAGATTAACCTGCTGATTGCGACGTCAGTGCTGGAGGAGGGCATCGACGTGCCTGCCTGCAACCTAGTCATATGCTTTGACACTCCGACGACCCCAAAGTCCTTTATCCAGCGGCGCGGACGGGCTCGCTCCAAGGACTCGAATCTCCTTCTTTTCTTTGACGATGCCAACCCTGCGATCTTGAAGTGGCAGGCGAAAGAGGAGGAGATGAACAGGATCTTCGAAGACGAAGAGAGGGCGATTCGCGAACTCGGCAAACTGGAAGATTCGGAGAGTCCGAGCACCATCTCCTTCACCGTCCCGTCTACCGGCGCAAGGCTAGATTTTGACAATGCGAAGCAGCACCTCGAGCACTTCTGCAGAGTCTTGTGCCCGTCGGACTTTGTGGACAGCCGCCCGGACTACATCATCCGCAGGGAGCAGGACTCTCCTTTGTTGACTGCCATTGTACTGCTCCCTCCGTTTCTGCCGGTGAATCTGAGGCAGCACACCAGTGCTTCTCCTTGGCGCTCCGAGAAGAACGCCACCAAGGATGCTGCGTATCAGGCGTATATAGCCCTGTATGACGCGAAGCTCGTCAACGAGAACCTGCTGCCCTTCAAGTCCAGCGACATGCTCGGAATCGATAAGCGAGTATCCGAGGTGCCGGTCGAGCCGTTGATGAAGCCATGGCATCGTGTCGCTCCTGCGTGGCGGGAAGCTGGCGACAAGTGGCTTTACTCCTTGAGCTGCGTGGAGGAGGACGGCCGAGTAAGTGCAGAGTACGAGGTTCTGCTGCCAGTCTGGCTGAACCAGCCTCAGCCCCTGAAAATGTTCCTCGACCGCAATCACCAGGTGGAGTTGCAGCTGAAGGCCGGGATACCCGTGCCGCACGAGCAAGTTGCGTCCCTGCCAGATCATACATCGACTTTGCTGGCGCTGCATTTCGGTCATCGATGGCCTCTCGAGCAGAAAGAGCACGTCATTCGGGTCTGGGCCAAGGATCAACCCCTATCGCTGAACCAAATTGGCGAGCTCACATACGATCCACAGAATGAGAGCGTCAGCCGGGGAGAGTTTCTCATCCGGGACAACACCAGAGCCCCCTACCTGTACAAGGATACCATTGCGTTCAAGCCCGAACCGAGCCAGGTCCAGAATACCTTTTACGAGTACGACAAGGCGCCCGAAGACGTGCCGTATCTCGTGCTCACCAAATGGACGCGGCGGACCGACTTTCTGCATCGCCTCCAAGGGAATCCCGCCAAGAATGAGGTTAGTAGCAAGCCATACGCACGCGTATATCCGCTGTCGTGGGCGACAGTCGATACCATCCCCGCCAGGCACGCCCAGTTTGGCATGCTGATCCCGACCATGATCCACGAGCTCGGCGTCATGCTCATGGCCAAGGAGCTGGCCTACTCCGTTCTCGACGAGGTTGGCATTTCGGATCTGCAGCTGGTCAAGGAGGCCATCAGCGCGCGGAGTGCCTCGGAGCCGGTGAATTACGAGAGGCTGGAGTTTTTGGGCGACTCGATTCTCAAGTTTTGTGCCTGTATGCGCGCCGCTGCTGAAAGTAAGTTGCTCAAGCGTTTTACTCATATATGACTCCTGTGTGCACCTGTCCTCTGACATGGAACTGTTTTGCTGACCACATTTGATACTGCCTAGAACCCGACTATCCCGAGGGCTATCTCTCGTATTGGAGAGACCGACTCGTCTCCAACTCGAGGCTGTACAAAGCCGCTCTCGAGTTTGGGCTGCCGAGGTTCATCTTGACGAAACCTTTTACCGGTCAAAAGTGGCGCCCACTCTACCTGGACGAGGTCCTCCAGCAAGGGGACGTCGCTACGCCGGAGAAGAGAAAATTATCGACCAAGACGCTCGCAGACGTGGTCGAGGCGCTGATCGGGGCCTCATACGTCGATGGAGGCCTTTCAAAGGCAGTGACTTGCATCTCAAAATTCGTCCCCGAAGGCTCGTGGACCAGTGTTGATGCAGATAGAGAGTCTCTCTTTGCGAGAGTGCCAGACGGCGAGCCTCTCCCGCCGCCATTGGAGCCGCTGGAGAAGTTGATCGGCTACACGTTCCAGAAAAAGGCGCTCTTGATGGAGGCTCTGACGCATGCCTCGTATGCTGCAGACTTCGGAACGCGATCTCTCGAGAGGCTCGAATTCATAGGAGACGCTGTCCTGGACAACATTATCGTTACGAAGCTCTTTAGGCTGAAGCCAGCGCTGCCCCATTTCAGGATGCATACGCTGAAGACGGGCCTGGTGAATGGGGACTTTCTTGCTTTCATGACAATGGAGCACGGAGTGCAACTGGCGGCGGACCCTGTGGTGACAGAAGAAGCTACGGTGGAGGTCCCGGAAACGATTTCCTACCTGTGGTCGTTTTTGAGGCAGGCCTCTTTTCCCATTGCCATCGAGCTGAAGGAGACGAACAAGCGGCACGCTGCCCTGAGAGAGCAGATTCACGAAGCAATGGACAATGACGATCATTACCCCTGGGCGCTGCTGGCCGCCCTGAGCCCGAAGAAGTTCTACTCTGACCTCTTCGAGGCGGTTCTCGGCGCTGTGTGGATCGACTCCGGGTCGCTGGCGGCGTGCGAGGGCATGGTTGCGCAGTTTGGGATCTTAAAGTACATGGATCGGCTGCTGCGTGACGAAGTCCACGTGCAGCATCCTAAGGAGGAGCTGGGCATGTGGGCAAACACAGAGACTGTGACGTACGAGCTCGAGATGAAGGGGAGCGAGGAGAGCGCGGGGGAGAGGGAGTATTTCTGCAAGGTGTTTGTTGGAAAGAGGGAGGTTGTGGAGGTTCGTGGGGGGGTCAATAAGGAGGAGGTGAAGACGAAGGGTGCGACGGAGGCGTTGCGGATTTTGAGGGAGGAGAAAAGGCGCGGTGCTGAGGATGTGGTGATGGTGGGATAA

SEQ ID NO:6

hygrfw

TGCAAGGCGATTAAGTTGGG

SEQ ID NO:7

hygrrv

CGGCGAGGATCTTTCCTCGCTGCTTCTCTCAACAGACAAGAGCCCTATAACTTC

SEQ ID NO:8

SEQ1fl3fw

TTGTCAACGCCATCTTGAGC

SEQ ID NO:9

SEQ1fl3rv

ACCAACCAGTCCATCCTCTG

SEQ ID NO:10

fus1

AAACCAGACAGACAGTATACGACTCACTATAGGGCG

SEQ ID NO:11

fus2

GTTAACAGACAAGAGCCCGAAGTTATTCGGGTAGTAGAGTTTGAAAGGGG

SEQ ID NO:12

fus3

AGAGAGGAGAGACAGTGTTAACAGACAAGAGCCCGAAG

SEQ ID NO:13

SEQ1MKOfw

ATGTGCTAGGATTGTACGAG

SEQ ID NO:14

SEQ1MKO1rv

ATAATAGCTCATGGTCTCAC

SEQ ID NO:15

SEQ1MKO2rv

TTGACAAAGGCCACAATATC

SEQ ID NO:16

M1Seq-01

ATCGCTACTTCTTTGTTCAG

SEQ ID NO:17

M1Seq-02

CAGCTTGGAATACAGCACTG

SEQ ID NO:18

SEQ5M5fw

GACTCTCTATCTGCATCAAC

SEQ ID NO:19

SEQ5M5rv

TGACCTGGAAAGCTTTCAATGTAGAGGTAGACTAGTCAAAGAAGACATCACGAC

SEQ ID NO:20

SEQ5M3fw

CGCATGGTGGGCGTCGTGATGTCTTCTTTGACTAGTCTACCTCTACATTGAAAG

SEQ ID NO:21

SEQ5M3rv

GATTACCTGTCAAGTCTATG

SEQ ID NO:22

SEQ5Mnestfw

GACAGTCCTGCAGGAGTCACTGCCTTTGAAAG

SEQ ID NO:23

SEQ5Mnestrv

GACAGTCCTGCAGGTGTAAGGATAAAGGACGAC

SEQ ID NO:24

LIC1fw

CTAGGAGTTCTGCCTTGGGTTTAAACGAGAGAAAGACTC

SEQ ID NO:25

LIC1rv

CTAGGAGTCTTTCTCTCGTTTAAACCCAAGGCAGAACTC

SEQ ID NO:26

amdS

GGATGTACGACGTATATCCATCTTTAACTAGTCATCATTGGATAGGCAGATTACTCAGCCTGAATGACATCAACATGTTACCCATGATACAATAGGTCACACAAACAAGCGCTAAGATGCACTTGGTATGACAAGCCCAGTAGTCCGTTTCAAAAGACCTAGATGATGAACTACAACATGAGGTGTTGCCTCCTGATCCAGTCCAACTGCAAACGCTGATGTATACTCAATCAAGCCTGATGTAAATGCTGCGACTGCATTCGCTGGATATGAAGATCAAAGAGAGCTCTGATGGGTCCAATATAGCCGGGTTTTGTTAGGACAGTCCACCACACCGATATTAGAATTGGTCAAGCACCTTATCATTTCATAGAGATTGCGGTTTCTAGATCTACGCCAGGACCGAGCAAGCCCAGATGAGAACCGACGCAGATTTCCTTGGCACCTGTTGCTTCAGCTGAATCCTGGCAATACGAGATACCTGCTTTGAATATTTTGAATAGCTCGCCCGCTGGAGAGCATCCTGAATGCAAGTAACAACCGTAGAGGCTGACACGGCAGGTGTTGCTAGGGAGCGTCGTGTTCTACAAGGCCAGACGTCTTCGCGGTTGATATATATGTATGTTTGACTGCAGGCTGCTCAGCGACGACAGTCAAGTTCGCCCTCGCTGCTTGTGCAATAATCGCAGTGGGGAAGCCACACCGTGACTCCCATCTTTCAGTAAAGCTCTGTTGGTGTTTATCAGCAATACACGTAATTTAAACTCGTTAGCATGGGGCTGATAGCTTAATTACCGTTTACCAGTGCCGCGGTTCTGCAGCTTTCCTTGGCCCGTAAAATTCGGCGAAGCCAGCCAATCACCAGCTAGGCACCAGCTAAACCCTATAATTAGTCTCTTATCAACACCATCCGCTCCCCCGGGATCAATGAGGAGAATGAGGGGGATGCGGGGCTAAAGAAGCCTACATAACCCTCATGCCAACTCCCAGTTTACACTCGTCGAGCCAACATCCTGACTATAAGCTAACACAGAATGCCTCAATCCTGGGAAGAACTGGCCGCTGATAAGCGCGCCCGCCTCGCAAAAACCATCCCTGATGAATGGAAAGTCCAGACGCTGCCTGCGGAAGACAGCGTTATTGATTTCCCAAAGAAATCGGGGATCCTTTCAGAGGCCGAACTGAAGATCACAGAGGCCTCCGCTGCAGATCTTGTGTCCAAGCTGGCGGCCGGAGAGTTGACCTCGGTGGAAGTTACGCTAGCATTCTGTAAACGGGCAGCAATCGCCCAGCAGTTAGTAGGGTCCCCTCTACCTCTCAGGGAGATGTAACAACGCCACCTTATGGGACTATCAAGCTGACGCTGGCTTCTGTGCAGACAAACTGCGCCCACGAGTTCTTCCCTGACGCCGCTCTCGCGCAGGCAAGGGAACTCGATGAATACTACGCAAAGCACAAGAGACCCGTTGGTCCACTCCATGGCCTCCCCATCTCTCTCAAAGACCAGCTTCGAGTCAAGGTACACCGTTGCCCCTAAGTCGTTAGATGTCCCTTTTTGTCAGCTAACATATGCCACCAGGGCTACGAAACATCAATGGGCTACATCTCATGGCTAAACAAGTACGACGAAGGGGACTCGGTTCTGACAACCATGCTCCGCAAAGCCGGTGCCGTCTTCTACGTCAAGACCTCTGTCCCGCAGACCCTGATGGTCTGCGAGACAGTCAACAACATCATCGGGCGCACCGTCAACCCACGCAACAAGAACTGGTCGTGCGGCGGCAGTTCTGGTGGTGAGGGTGCGATCGTTGGGATTCGTGGTGGCGTCATCGGTGTAGGAACGGATATCGGTGGCTCGATTCGAGTGCCGGCCGCGTTCAACTTCCTGTACGGTCTAAGGCCGAGTCATGGGCGGCTGCCGTATGCAAAGATGGCGAACAGCATGGAGGGTCAGGAGACGGTGCACAGCGTTGTCGGGCCGATTACGCACTCTGTTGAGGGTGAGTCCTTCGCCTCTTCCTTCTTTTCCTGCTCTATACCAGGCCTCCACTGTCCTCCTTTCTTGCTTTTTATACTATATACGAGACCGGCAGTCACTGATGAAGTATGTTAGACCTCCGCCTCTTCACCAAATCCGTCCTCGGTCAGGAGCCATGGAAATACGACTCCAAGGTCATCCCCATGCCCTGGCGCCAGTCCGAGTCGGACATTATTGCCTCCAAGATCAAGAACGGCGGGCTCAATATCGGCTACTACAACTTCGACGGCAATGTCCTTCCACACCCTCCTATCCTGCGCGGCGTGGAAACCACCGTCGCCGCACTCGCCAAAGCCGGTCACACCGTGACCCCGTGGACGCCATACAAGCACGATTTCGGCCACGATCTCATCTCCCATATCTACGCGGCTGACGGCAGCGCCGACGTAATGCGCGATATCAGTGCATCCGGCGAGCCGGCGATTCCAAATATCAAAGACCTACTGAACCCGAACATCAAAGCTGTTAACATGAACGAGCTCTGGGACACGCATCTCCAGAAGTGGAATTACCAGATGGAGTACCTTGAGAAATGGCGGGAGGCTGAAGAAAAGGCCGGGAAGGAACTGGACGCCATCATCGCGCCGATTACGCCTACCGCTGCGGTACGGCATGACCAGTTCCGGTACTATGGGTATGCCTCTGTGATCAACCTGCTGGATTTCACGAGCGTGGTTGTTCCGGTTACCTTTGCGGATAAGAACATCGATAAGAAGAATGAGAGTTTCAAGGCGGTTAGTGAGCTTGATGCCCTCGTGCAGGAAGAGTATGATCCGGAGGCGTACCATGGGGCACCGGTTGCAGTGCAGGTTATCGGACGGAGACTCAGTGAAGAGAGGACGTTGGCGATTGCAGAGGAAGTGGGGAAGTTGCTGGGAAATGTGGTGACTCCATAGCTAATAAGTGTCAGATAGCAATTTGCACAAGAAATCAATACCAGCAACTGTAAATAAGCGCTGAAGTGACCATGCCATGCTACGAAAGAGCAGAAAAAAACCTGCCGTAGAACCGAAGAGATATGACACGCTTCCATCTCTCAAAGGAAGAATCCCTTCAGGGTTGCGTTTCCAGTCTAGACACGTATAACGGCACAAGTGTCTCTCACCAAATGGGTTATATCTCAAATGTGATCTAAGGATGGAAAGCCCAGAATATTGGCTGGGTTGATGGCTGCTTCGAGTGCAGTCTCATGCTGCCACAGGTGACTCTGGATGGCCCCATACCACTCAACCCATGGTACCCGTGCCTCAGGGGTGAGCTGGTTGTTGCCTTGCGGTAGAGTAATAACGATAGCTCAGCCTTGCAGGTGATTTCCGCGTCTGTCTATTGTCCTTATTACTGTGTCGAGTCCCCAAGTTTTCTTCCAATAGACATCA

SEQ ID NO:27

SEQ5MamdSfw

GTTCTGCCTTGGGTTTAGGATGTACGACGTATATCC

SEQ ID NO:28

SEQ5MamdSrv

GTCTTTCTCTCGTTTATGATGTCTATTGGAAGAAAACTTGG

SEQ ID NO:29

SEQ5MKO1fw

ACTCTCTATCTGCATCAAC

SEQ ID NO:30

SEQ5MKO1rv

GATCCCCGATTTCTTTGG

SEQ ID NO:31

SEQ5MKO2fw

TGATGTGCTTGATATTGGGC

SEQ ID NO:32

SEQ5MKO2rv

CTCCATCGCTCAACTATGTG

权利要求书(按照条约第19条的修改)

1.一种用于生产工艺酶组合物的方法，其包括以下步骤：

(a)提供葡萄糖含量为5至550g/L的发酵培养基；

(b)添加至少一种丝状真菌细胞，其中SEQ ID NO:1被破坏；

(c)在20至35℃的温度下，将所述发酵培养基和所述至少一种丝状真菌细胞混合1分钟至10天的时间段；

(d)获得工艺酶组合物；

其中所述丝状真菌细胞选自里氏木霉。

2.根据权利要求1所述的方法，其中将根据步骤(a)的发酵培养基的pH调节至选自pH2.0至6.0的pH。

3.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述葡萄糖与木糖的比选自1.0至3.5。

4.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其进一步包括步骤

(ai)通过蒸发、膜过滤或薄层蒸发浓缩发酵培养基以将发酵培养基的重量降低2至6倍。

5.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其进一步包括步骤

(aii)对步骤(a)的发酵培养基或步骤(ai)的浓缩发酵培养基灭菌。

6.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中步骤(a)的发酵培养基具有小于0.5g/L的糠醛含量。

7.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中步骤(a)所述的发酵培养基具有小于0.5g/L的羟甲基糠醛(HMF)含量。

8.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其进一步包括以下步骤(e)对步骤(c)的发酵培养基进行固液分离，以获得固体组分和液体组分。

9.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中在所述方法的步骤(a)和/或(b)期间加入0.05至5wt％的氮气。

10.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中在所述方法的步骤(a)和/或(b)期间添加0.5-350mg/L的FeSO₄、MnSO₄、MgSO₄和/或ZnSO₄。

11.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述丝状真菌细胞包含至少一种异源β-葡萄糖苷酶。

12.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中SEQ ID NO：11被破坏。

13.一种丝状真菌细胞，其中SEQ ID NO:1被破坏，所述丝状真菌细胞选自里氏木霉。

14.根据权利要求13所述的丝状真菌细胞，其中SEQ ID NO：11被破坏。

15.根据权利要求13或14所述的丝状真菌细胞，其中SEQ ID NO:1和/或11通过缺失、突变、启动子或任何其它调节序列的修饰、终止密码子的产生或RNA干扰而被破坏。

16.根据权利要求13或15所述的丝状真菌细胞，其中所述至少一种丝状真菌细胞是遗传修饰的丝状真菌细胞，其具有表达至少一种异源水解酶、至少一种外源果胶酶、至少一个异源氧化酶和/或至少一种异源辅助蛋白的能力。

17.根据权利要求13或16所述的丝状真菌细胞，其中所述至少一种丝状真菌细胞是遗传修饰的丝状真菌细胞，其中所述丝状真菌细胞包含至少一种异源β-葡糖苷酶编码序列、至少一种异源纤维素酶编码序列、至少一种异源木聚糖酶编码序列、至少一种异源β-木糖苷酶编码序列、至少一种异源果胶酶编码序列、至少一种异源氧化还原酶编码序列、至少一种异源蛋白酶编码序列、至少一种异源异构酶编码序列和/或至少一种异源裂解多糖单加氧酶编码序列。

18.根据权利要求13至17中任一项所述的丝状真菌细胞用于生产全肉汤酶组合物的用途。

Claims

1.一种用于生产工艺酶组合物的方法，其包括以下步骤：

(a)提供葡萄糖含量为5至550g/L的发酵培养基；

(b)添加至少一种丝状真菌细胞，其中SEQ ID NO:1被破坏；

(d)获得工艺酶组合物。

3.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述发酵培养基还含有木糖，并且其中所述葡萄糖与木糖的比选自1至3.5。

4.根据权利要求1或2中任一项所述的方法，其中所述发酵培养基还含有乳糖，并且其中所述葡萄糖与乳糖的比选自1至10。

5.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述发酵培养基中未添加葡寡糖。

6.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述发酵培养基中未添加槐糖。

7.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其进一步包括步骤

(ai)对根据步骤(a)的发酵培养基进行灭菌。

8.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述发酵培养基具有0.5至10.0g/L的磷酸氢钾含量、0.05至1g/L的硫酸镁七水合物含量、0.1至1g/L的氯化钙二水合物含量、1.5至4.5g/L的硫酸铵含量、0.005至0.1g/L的硫酸铁(II)七水合物含量、0.00001至0.001g/L的硫酸锰含量、0.001至0.01g/L的硫酸锌七水合物含量和/或0.0001-0.001的硫酸铜五水合物含量。

9.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述发酵培养基具有0.05至2.0g/L的氮含量。

10.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述丝状真菌细胞选自枝顶孢属、曲霉属、毛壳属、裸胞壳属、镰刀菌属、腐质霉属、肉座菌属、耙菌属、巨座壳属、毁丝霉属、链孢菌属、青霉菌属、根霉属、篮状菌属、木霉属和栓菌属。

11.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述丝状真菌细胞选自里氏木霉。

12.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述丝状真菌细胞包含至少一种异源β-葡糖苷酶编码序列、至少一种异源纤维素酶编码序列、至少一种异源木聚糖酶编码序列、至少一种异源β-木糖苷酶编码序列、至少一种异源果胶酶编码序列、至少一种异源氧化还原酶编码序列、至少一种异源蛋白酶编码序列、至少一种异源异构酶编码序列和/或至少一种异源裂解多糖单加氧酶编码序列。

13.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其进一步包括以下步骤：

e)对根据步骤d)的工艺酶组合物进行纯化。

14.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中SEQ ID NO：5被破坏。

15.一种丝状真菌细胞，其中SEQ ID NO:1被破坏。

16.根据权利要求15所述的丝状真菌细胞，其中SEQ ID NO：5被破坏。

17.根据权利要求15或16所述的丝状真菌细胞，其中SEQ ID NO:1和/或5通过缺失、突变、启动子或任何其它调节序列的修饰、终止密码子的产生或RNA干扰而被破坏。

18.根据权利要求15-17中任一项所述的丝状真菌细胞，其中所述至少一种丝状真菌细胞是遗传修饰的丝状真菌细胞，其中所述丝状真菌细胞包含至少一种异源β-葡糖苷酶编码序列、至少一种异源纤维素酶编码序列、至少一种异源木聚糖酶编码序列、至少一种异源β-木糖苷酶编码序列、至少一种异源果胶酶编码序列、至少一种异源氧化还原酶编码序列、至少一种异源蛋白酶编码序列、至少一种异源异构酶编码序列和/或至少一种异源裂解多糖单加氧酶编码序列。

19.根据权利要求15-18中任一项所述的丝状真菌细胞，其中所述丝状真菌细胞选自里氏木霉。

20.根据权利要求1-14中任一项所述的方法生产的工艺酶组合物。

21.根据权利要求15-19中任一项所述的丝状真菌细胞用于生产工艺酶组合物的用途。