CN116370712B - 3d生物打印的人工仿生胰岛及其制备方法和用途 - Google Patents

Abstract

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种3D生物打印的人工仿生胰岛及其制备方法和用途。针对目前缺乏能治疗I型糖尿病、治疗效果持久、并且免疫原性低的人工仿生胰岛的问题，本发明提供了一种3D生物打印的人工仿生胰岛，由人胰腺β细胞经3D生物打印而制成，所述的人胰腺β细胞是由人尿液上皮样细胞来源的iPSCs诱导分化得到。本发明还在打印的人胰腺β细胞中加入了MVF，MVF能使人工仿生胰岛形成血管化网络结构，治疗效果更好。本发明还提供了人工仿生胰岛的制备方法，以及其在异种移植中的应用。本发明的3D打印方法操作简单，取材易得，制得的人工仿生胰岛移植安全性高，为糖尿病的治疗提供了一种新的思路和方法。

Description

3D生物打印的人工仿生胰岛及其制备方法和用途

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种3D生物打印的人工仿生胰岛及其制备方法和用途。

背景技术

I型糖尿病又称为胰岛素依赖型糖尿病，它是一种慢性的多因素自身免疫疾病，其发病机制是免疫系统攻击自身胰岛，造成分泌胰岛素的胰岛β细胞损伤或死亡，最终导致高血糖症。目前，全球范围内I型糖尿病还缺乏有效的治疗方法，而临床上对于1型糖尿病的治疗主要集中在以下三个方面：（1）外源胰岛素注射。（2）实体胰腺器官移植。（3）胰岛移植。

然而，胰岛移植中受体对移植细胞的免疫排斥大大限制了胰岛移植的治疗应用。因此，将胰岛细胞封装后进行体内移植是重要的发展方向。细胞封装技术为解决β细胞体内移植后面临的免疫排斥问题开辟了新的途径。而细胞封装中的安全性（防止任何潜在细胞逃逸）和功能性（保证物质运输）都至关重要，需要避免细胞聚集和细胞与宿主组织之间的直接相互作用，保护细胞免受机械应力的影响。在此背景下，宏封装方式具有高度的生物安全性，大量细胞被植入单一的设备，当植入装置后机体发生不良反应或移植细胞功能丧失及出现恶性转化时，宏封装装置易于监测和回收。但宏封装也存在一定的缺点：相对较大尺寸的封装装置面临着封装细胞与封装系统表面的扩散距离较大，氧气供应不足，导致移植细胞的长期存活能力下降，放大宿主免疫反应等问题。因此，为了能长期维持移植物的功能，有必要对宏封装装置的结构和制备方式进行探索。

我们已成功构建了DLP-3D生物打印组织工程胰岛的方法，采用特别筛选的生物打印墨水和DLP-3D打印技术制备了可回收的迷你胶囊装置，解决了免疫原性的问题，并能有效防止胰岛细胞渗漏。但该方法使用的是小鼠胰腺中的胰岛细胞，每只小鼠最多只能分离约200个左右的胰岛，取材时间长，步骤繁琐，在产业化应用时还存在困难。

因此，开发新的人工仿生胰岛的具有很重要的现实意义。

发明内容

本发明要解决的技术问题为：目前还未见有能治疗I型糖尿病、治疗效果持久、并且免疫原性低的人工仿生胰岛及制备方法，亟待开发。

本发明解决上述技术问题的技术方案为：提供一种3D生物打印的人工仿生胰岛，由人胰腺β细胞经3D生物打印而制成；所述的人胰腺β细胞是由人尿液上皮样细胞来源的iPSCs诱导分化得到的，人尿液上皮样细胞来源的iPSCs诱导分化方法包括以下步骤：

a、尿液上皮样细胞的获取、培养、扩增；

提取尿液，离心，初始培养基重悬，并于30-40℃下培养2-5天，之后加入RE/MC扩增培养基培养3-15天，直到出现贴壁的克隆样的尿液上皮样细胞团，待细胞汇合度达90%时，胰蛋白酶消化，胰酶抑制剂终止，继续扩增培养及传代，得到P1代和P2代的尿液上皮样细胞；

b、重编程获取iPSCs；

获取小鼠胚胎成纤维细胞MEF，并进行辐照；

培养HEK-293T细胞，待密度达80-90%时，将感染复合物滴加入其中进行感染，感染后继续培养4-6小时，更换成含5%-20%的胎牛血清的DMEM培养基，继续培养12-36小时24小时；

将步骤a得到的尿液上皮样细胞消化后，按照3000个-10000个细胞/cm2的密度均匀接种至0.1%-0.5%明胶包被的板中；收集含各病毒颗粒的HEK-293T细胞培养上清，过滤，各上清等比例混合后，加入聚凝胺，将病毒混合液加入到含尿液上皮样细胞的六孔板中；重复上述步骤进行二次感染，感染12-36小时后将尿液上皮样细胞的培养基更换为RE/MC扩增培养基；

将辐照后的MEF细胞培养，待感染病毒后的尿液上皮样细胞达到80-90%时，用胰蛋白酶消化，并用ESC/dFBS培养基终止消化、重悬，接种至含MEF的板中，在ESC/dFBS培养基中加入转化生长因子β的I型受体抑制剂、糖原合成酶激酶-3抑制剂、新型的Rho相关激酶抑制剂、环状抑制剂-α氢溴酸盐和丁酸钠，于第2天、第4天、第6天及第8天对重编程后的细胞进行换液；采用mTeSR培养基于第10天、第12天、第14天及第16天进行换液；从第18天开始每天用mTeSR培养基进行换液，培养5-7天，得到克隆的UiPSCs；

c、3D悬浮诱导分化iPSCs为类β细胞；

消化重悬iPSCs细胞，将iPSCs单细胞进行接种，加入Y27632，诱导培养24小时，记为第0天，第1天采用诱导分化培养基A培养；第2-3天，采用诱导分化培养基B培养；第4-6天，采用诱导分化培养基C培养；第7-9天，采用诱导分化培养基D培养；第10天，采用诱导分化培养基E培养；第11-14天，采用诱导分化培养基F培养；第15-22天，采用诱导分化培养基G培养，直至培养得到类β细胞；所述诱导分化培养基A组成包括：RPIM1640基础培养基，含0.2%胎牛血清、100U/mL青霉素-链霉素、1%谷氨酰胺、0.02%胰岛素-转铁蛋白-硒-氨基乙醇、100ng/mL激活素A以及50ng/mL Wnt3A；诱导分化培养基B组成包括：RPIM1640基础培养基，含0.2%胎牛血清、100U/mL青霉素-链霉素、1%谷氨酰胺、0.02%胰岛素-转铁蛋白-硒-氨基乙醇、100ng/mL激活素A；诱导分化培养基C组成包括：DMEM/F12基础培养基，含2%胎牛血清、100 U/mL青霉素-链霉素、0.1% ITS-X和50ng/mL角质细胞生长因子；诱导分化培养基D组成包括：DMEM基础培养基，含1% B27添加剂、1%谷氨酰胺、100U/mL青霉素-链霉素、0.25μM环巴胺、2μM视黄酸及50ng/mL指头蛋白；诱导分化培养基E组成包括：DMEM基础培养基，含1% B27添加剂、1%谷氨酰胺、100U/mL青霉素-链霉素、50ng/mL角质细胞生长因子、50ng/mL表皮细胞生长因子、50ng/mL指头蛋白和100nM视黄酸；诱导分化培养基F组成包括：DMEM基础培养基，含1% B27添加剂、1%谷氨酰胺、100U/mL青霉素-链霉素、1μM间变性淋巴瘤激酶2型抑制剂、50nM苯并内酰胺衍生的可渗透细胞的蛋白激酶C活化物、100nM视黄酸和100ng/mL指头蛋白；诱导分化培养基G组成包括：DMEM基础培养基，含1%非必需氨基酸、1% B27添加剂、1%谷氨酰胺、100U/mL青霉素-链霉素、10μM间变性淋巴瘤激酶2型抑制剂、500nM选择性骨形态发生蛋白I型受体抑制剂、1μMγ分泌酶抑制剂二苯并氮卓、1μM T3三碘甲状腺原氨酸、0.5mM维生素C、1mM乙酰半胱氨酸、10μM硫酸锌和10ug/mL硫酸类肝素。

其中，上述3D生物打印的人工仿生胰岛中，所述的人工仿生胰岛为圆柱形，直径13-20mm，高度3-5mm。优选为直径13.5mm，高度3mm。

其中，上述3D生物打印的人工仿生胰岛中，所述的人工仿生胰岛中人胰腺β细胞的数量为≥5×106个。

其中，上述3D生物打印的人工仿生胰岛中，所述的人胰腺β细胞是由人尿液上皮样细胞来源的iPSCs诱导分化得到的。

进一步的，上述3D生物打印的人工仿生胰岛中，还加入了小鼠脂肪垫来源的微血管片段。

进一步的，上述3D生物打印的人工仿生胰岛中，所述的小鼠脂肪垫来源的微血管片段中的细胞数量为≥0.6×106个。其中的细胞包括血管内皮细胞、周细胞和间质细胞等。

本发明还提供了一种上述3D生物打印的人工仿生胰岛的制备方法，包括以下步骤：

a、将GelMA溶于25-40℃的光引发剂溶液中，形成含有5-20%GelMA (w/v)和0.01-0.1%LAP的生物打印墨水；

b、再按照图案光的设定进行逐层打印凹槽结构，每层曝光时间为5-30秒；

c、在凹槽结构的中间添加混合了类β细胞的生物打印墨水，再次进行5-30秒的光固化；通过DLP-3D逐层打印，最终得到了类β细胞仿生胰岛。

其中，上述3D生物打印的人工仿生胰岛的制备方法中，步骤c所述的类β细胞为人尿液上皮样细胞来源的iPSCs诱导分化得到的人胰腺β细胞。

其中，上述3D生物打印的人工仿生胰岛的制备方法中，步骤c所述的类β细胞中再加入小鼠脂肪垫来源的微血管片段。

其中，上述3D生物打印的人工仿生胰岛的制备方法中，步骤c所述的类β细胞加入量为≥5×106个；小鼠脂肪垫来源的微血管片段细胞数量为≥0.6×106个。

本发明还提供了一种上述3D生物打印的人工仿生胰岛在制备预防或治疗糖尿病的药物或装置中的用途。

与现有技术相比，本发明的有益效果为：

本发明提供了一种3D生物打印的人工仿生胰岛，通过3D生物打印的方法，将人尿液上皮样细胞来源的iPSCs诱导分化得到的人胰腺β细胞制备成一圆柱形的迷你胶囊装置，用于胰岛的递送并对糖尿病小鼠进行体内移植。本发明的人工仿生胰岛具有与人工工程胰岛相近的效果，能有效改善STZ诱导的高血糖症状，并且免疫原性低，安全性好。本发明还同时在打印的人胰腺β细胞中加入了小鼠脂肪垫来源的微血管片段，能使制得的人工仿生胰岛形成血管化网络结构，治疗效果更好。本发明的3D打印方法操作简单，取材易得，制得的人工仿生胰岛移植安全性高，为糖尿病的治疗提供了一种新的思路和方法，具有重要科学意义和潜在的临床转化前景。

附图说明

图1所示为DLP-3D打印类β细胞球状体制备的仿生胰岛形态。

图2所示为仿生胰岛体内移植后小鼠随机非空腹血糖检测结果。

图3所示为MVF的形态（比例尺：100μm）。

图4所示为3D打印的联合微血管的仿生胰岛形态（比例尺：2mm）。

图5所示为仿生胰岛联合微血管移植体内后的随机非空腹血糖。

图6所示为接受含微血管仿生胰岛移植的小鼠血清中人源化C肽的检测。

图7所示为三种仿生胰岛移植体内4周后的随机非空腹血糖。

图8所示为仿生胰岛及联合微血管（MVF）的仿生胰岛皮下移植1个月后形成的血管网络（比例尺：1cm）。

图9所示为仿生胰岛及联合微血管（MVF）的仿生胰岛回收后免疫荧光鉴定INS及血管标记物CD31（比例尺：100μm）。

图10所示为胶原堆积及免疫细胞浸润的免疫荧光检测（比例尺：100μm）。

图11所示为流式细胞术检测的两种仿生胰岛中F4/80细胞、CD4+T细胞、CD8+T细胞进行统计分析结果。

图12所示为仿生胰岛植入体内后小鼠各器官的形态和H＆E染色图。

具体实施方式

本发明提供了一种3D生物打印的人工仿生胰岛，由人胰腺β细胞经3D生物打印而制成。本发明采用的是人胰腺β细胞进行打印，所述的人胰腺β细胞是由人尿液上皮样细胞来源的iPSCs诱导分化得到的，具体的诱导分化方法同申请号CN202310298528.0中的诱导方法一致。

具体的，人尿液上皮样细胞来源的iPSCs诱导分化方法包括以下步骤：

a、尿液上皮样细胞的获取、培养、扩增；

提取尿液，离心，初始培养基重悬，并于30-40℃下培养2-5天，之后加入RE/MC扩增培养基培养3-15天，直到出现贴壁的克隆样的尿液上皮样细胞团，待细胞汇合度达90%时，胰蛋白酶消化，胰酶抑制剂终止，继续扩增培养及传代，得到P1代和P2代的尿液上皮样细胞；

b、重编程获取iPSCs；

获取小鼠胚胎成纤维细胞MEF，并进行辐照；

培养HEK-293T细胞，待密度达80-90%时，将感染复合物滴加入其中进行感染，感染后继续培养4-6小时，更换成含5%-20%的胎牛血清的DMEM培养基，继续培养12-36小时24小时；

将步骤a得到的尿液上皮样细胞消化后，按照3000个-10000个细胞/cm2的密度均匀接种至0.1%-0.5%明胶包被的板中；收集含各病毒颗粒的HEK-293T细胞培养上清，过滤，各上清等比例混合后，加入聚凝胺，将病毒混合液加入到含尿液上皮样细胞的六孔板中；重复上述步骤进行二次感染，感染12-36小时后将尿液上皮样细胞的培养基更换为RE/MC扩增培养基；

将辐照后的MEF细胞培养，待感染病毒后的尿液上皮样细胞达到80-90%时，用胰蛋白酶消化，并用ESC/dFBS培养基终止消化、重悬，接种至含MEF的板中，在ESC/dFBS培养基中加入转化生长因子β的I型受体抑制剂、糖原合成酶激酶-3抑制剂、新型的Rho相关激酶抑制剂、环状抑制剂-α氢溴酸盐和丁酸钠，于第2天、第4天、第6天及第8天对重编程后的细胞进行换液；采用mTeSR培养基于第10天、第12天、第14天及第16天进行换液；从第18天开始每天用mTeSR培养基进行换液，培养5-7天，得到克隆的UiPSCs；

c、3D悬浮诱导分化iPSCs为类β细胞；

消化重悬iPSCs细胞，将iPSCs单细胞进行接种，加入Y27632，诱导培养24小时，记为第0天，第1天采用诱导分化培养基A培养；第2-3天，采用诱导分化培养基B培养；第4-6天，采用诱导分化培养基C培养；第7-9天，采用诱导分化培养基D培养；第10天，采用诱导分化培养基E培养；第11-14天，采用诱导分化培养基F培养；第15-22天，采用诱导分化培养基G培养，直至培养得到类β细胞；所述诱导分化培养基A组成包括：RPIM1640基础培养基，含0.2%胎牛血清、100U/mL青霉素-链霉素、1%谷氨酰胺、0.02%胰岛素-转铁蛋白-硒-氨基乙醇、100ng/mL激活素A以及50ng/mL Wnt3A；诱导分化培养基B组成包括：RPIM1640基础培养基，含0.2%胎牛血清、100U/mL青霉素-链霉素、1%谷氨酰胺、0.02%胰岛素-转铁蛋白-硒-氨基乙醇、100ng/mL激活素A；诱导分化培养基C组成包括：DMEM/F12基础培养基，含2%胎牛血清、100 U/mL青霉素-链霉素、0.1% ITS-X和50ng/mL角质细胞生长因子；诱导分化培养基D组成包括：DMEM基础培养基，含1% B27添加剂、1%谷氨酰胺、100U/mL青霉素-链霉素、0.25μM环巴胺、2μM视黄酸及50ng/mL指头蛋白；诱导分化培养基E组成包括：DMEM基础培养基，含1% B27添加剂、1%谷氨酰胺、100U/mL青霉素-链霉素、50ng/mL角质细胞生长因子、50ng/mL表皮细胞生长因子、50ng/mL指头蛋白和100nM视黄酸；诱导分化培养基F组成包括：DMEM基础培养基，含1% B27添加剂、1%谷氨酰胺、100U/mL青霉素-链霉素、1μM间变性淋巴瘤激酶2型抑制剂、50nM苯并内酰胺衍生的可渗透细胞的蛋白激酶C活化物、100nM视黄酸和100ng/mL指头蛋白；诱导分化培养基G组成包括：DMEM基础培养基，含1%非必需氨基酸、1% B27添加剂、1%谷氨酰胺、100U/mL青霉素-链霉素、10μM间变性淋巴瘤激酶2型抑制剂、500nM选择性骨形态发生蛋白I型受体抑制剂、1μMγ分泌酶抑制剂二苯并氮卓、1μM T3三碘甲状腺原氨酸、0.5mM维生素C、1mM乙酰半胱氨酸、10μM硫酸锌和10ug/mL硫酸类肝素。

本发明首次发现该方法诱导分化的类β细胞具有与小鼠胰岛相似的结构（直径均为100-200μm的球状体），并且具有与胰岛素分泌相似的功能，还表现出了降低血糖的功能。因此，本发明尝试用该方法诱导得到的人胰腺β细胞进行生物打印，看是否能制备具有降血糖功能的人工仿生胰岛。

在DLP-3D打印人工仿生胰岛过程中，由于体外诱导分化的类β细胞成熟度和功能可能低于原代β细胞，因此我们对仿生胰岛的尺寸和包含的类β细胞球状体的数量都进行了大量的试验筛选，最终发现，当人工仿生胰岛中人胰腺β细胞的数量为≥5×106个，并且制备成直径13-20mm，高度3-5mm的圆柱体时，可以制备得到降血糖效果好的人工仿生胰岛。

本发明采用iPSC诱导分化的具有胰岛类似功能的类β细胞制备人工仿生胰岛，可以解决细胞治疗中的细胞来源问题，可以实现大规模的生产，为以后的临床应用奠定基础。此外，由于仿生胰岛是由iPSC分化而来，可以产生无限来源的具有胰岛类似功能的类β细胞，解决了临床上治疗的来源问题，而且未来我们也可以利用I型糖尿病病人自体的iPSC分化为类β细胞，从而实现个体化的精准治疗。

是否能在体内形成丰富的血管网络是移植后细胞进行高效的氧气运输和物质交换的前提，对移植后细胞的长期存活和维持持续疗效至关重要。进一步的，为了提高所移植细胞的长期存活和功能，我们又尝试将小鼠附睾脂肪垫来源的微血管片段MVF以及人脐静脉内皮细胞（HUVECs）与类β细胞联合，构建血管化的仿生胰岛。通过血糖及葡萄糖代谢能力检测发现含MVF的仿生胰岛具有更好的长期治疗效果，移植体内后能有效降低免疫排斥反应，维持移植细胞体内的长期存活，从而长期缓解小鼠的高血糖症状。而人脐静脉内皮细胞与类β细胞联合构建的仿生胰岛，并不能延长抑制小鼠血糖的作用。

通过对移植物进行胶原堆积（α-SMA、Fibronectin）及免疫细胞（CD45、F4/80、CD4、CD8）浸润的检测，发现仿生胰岛植入体内后产生的免疫排斥反应低，能保证移植细胞的长期存活。在移植3个月后，我们对接受仿生胰岛移植小鼠的心、肝、脾、肺、肾组织进行形态观察和切片染色，这些组织无明显病变，也进一步证明仿生胰岛移植到小鼠体内有免疫原性低，易于监测和回收，安全性高等特点，有良好的临床转化前景。

下面将通过实施例对本发明的具体实施方式做进一步的解释说明，但不表示将本发明的保护范围限制在实施例所述范围内。

实施例中使用的各仪器和试剂均为普通市售产品。

实施例1诱导得到类β细胞

诱导方法参见申请号CN202310298528.0中的方法，成功得到人尿液来源的iPSCs诱导分化制备人胰腺β细胞。

实施例2制备DLP-3D打印的仿生胰岛

实施例1诱导得到的类β细胞的成熟度和功能均低于成熟的β细胞。要想成功的打印得到人工仿生胰岛，我们对类β细胞的需求量进行了实验摸索，最后发现，需要类β细胞量达到5×106个以上，约5000个类β细胞球状体（一个类β细胞球状体约含1000个左右的单细胞）时，才适合打印成人工仿生胰岛。最终，我们在计算机上设计出能装载类β细胞的图案形状，为直径13.5mm，高度3mm的圆柱体图案。

将GelMA溶于37℃的光引发剂（LAP）溶液中，形成含有10% GelMA (w/v)和0.05%LAP的生物打印墨水。再按照图案光的设定进行逐层打印凹槽结构，每层曝光时间为20秒；按照图案光的形状，在凹槽结构的中间添加混合了类β细胞的生物打印墨水，再次进行20秒的光固化；通过DLP-3D逐层打印，最终得到了类β细胞仿生胰岛。其中的类β细胞仿生胰岛为包含了5000个类β细胞球状体（如图1所示）。

实施例3仿生胰岛的皮下移植

具体的操作步骤如下：

（1）选择10周龄健康C57BL/6J的小鼠，采用STZ建模，将STZ建模后的高血糖小鼠在气麻机中进行麻醉；

STZ建模的方法如下：取STZ粉末，按1%的质量体积比溶于柠檬酸缓冲液中，避光置于冰上；对C57BL/6J的小鼠按照50mg/kg的剂量腹腔注射STZ溶液，对照组按照同等剂量注射等量柠檬酸缓冲液。每日重复上述操作，持续注射5天，直至建模成功。

（2）用剃毛器剔除小鼠背部毛发，并用75%酒精棉球进行擦拭消毒；

（3）在超净工作台中，用手术剪剪开小鼠背部皮肤，使用手术镊剥离皮肤和内部的筋膜组织；

（4）将3D打印的仿生胰岛递送至皮下，待其充分移植到皮下后进行缝合；

（5）使用碘伏擦拭缝合处，将小鼠放回饲养笼继续喂养。

在每周一和周四的下午监测小鼠的随机非空腹血糖。在不使用免疫抑制剂的情况下，发现16只小鼠中有13只在接受移植后的两周内血糖下降明显，其中有3只小鼠能实现长达60天的血糖改善。将移植物取出后，小鼠又马上恢复高血糖状态，说明了本发明制备的仿生胰岛移植小鼠后能改善小鼠的高血糖症状（如图2所示）。

实施例4打印含微血管和HUVECs的仿生胰岛

由于胰岛是高度血管化的微型器官，丰富的血管网络是保证胰岛氧气运输和物质交换的前提。因此，能否在移植后构建胰岛的血管化网络对于长期的治疗效果至关重要。为了延长人工仿生胰岛的血糖改善效果，我们尝试打印了含微血管的仿生胰岛。其中的微血管分别采用了小鼠脂肪垫来源的微血管片段（MVF）和人脐静脉内皮细胞（HUVECs）（来源于ATCC细胞库）。

其中，分离小鼠脂肪垫来源的微血管片段（MVF）的具体操作步骤如下：

1)在超净台里取出雄性C57BL/6小鼠的附睾脂肪垫（注意不要破坏肠道结构，避免污染）；

2)将取出的附睾脂肪垫放入预热的DMEM培养基中；

3)在超净台工作台中使用PBS清洗附睾脂肪垫3次；

4)将清洗完的脂肪垫转移到10mL离心管中；

5)将脂肪垫组织用手术剪刀剪碎，获得均匀的组织悬液；

6)用移液管加入两倍组织悬液体积的胶原酶I溶液；

7)将加入胶原酶I溶液后的组织悬液混匀，用移液管转移至50mL锥形瓶中；

8)用磁力搅拌器以350rpm的转速在37℃细胞培养箱中搅拌消化10分钟；

9)用移液枪吸取少部分消化后的细胞悬液在显微镜下观察，当单细胞旁含有游离的MVF时，即可终止消化；

10)用两倍胶原酶I溶液体积的PBS（含20%胎牛血清）终止消化；

11)用移液管将细胞悬液转移至新的离心管中；

12)将含有细胞悬液的离心管在37℃水浴锅中静置5分钟；

13)用1mL移液器小心吸出漂浮在细胞悬液表面的脂肪上清液；

14)用35目的滤网将细胞悬液过滤到新的50ml离心管中（去除剩余的脂肪凝块）；

15)将过滤后的细胞悬液在室温条件下以600g的转速离心5分钟，获得含有MVF颗粒的沉淀；

16)移除上清至管中仅剩1mL左右的液体，将沉淀进行重悬，并将悬液转移到灭菌后的1.5mL离心管中；

17)再次按照600g的转速离心5分钟；

18)移除全部上清液，用适量体积的PBS（含20%胎牛血清）重悬沉淀；

19)再次离心按照600g的转速离心5分钟；

20)移除上清后，用含10%胎牛血清及100U/mL青霉素-链霉素的DMEM培养基重悬沉淀；

21)将沉淀重悬后接种至孔板中，置于培养箱中继续培养，得到小鼠脂肪来源的微血管片段（MVF），收集到的产物具有尺寸不一的明显的微血管管状结构（如图3所示）。

将GelMA溶于37℃的光引发剂（LAP）溶液中，形成含有10% GelMA (w/v)和0.05%LAP的生物打印墨水。再按照图案光的设定进行逐层打印凹槽结构，每层曝光时间为20秒；按照图案光的形状，在凹槽结构的中间分别添加混合了类β细胞与微血管片段（MVF）和混合了类β细胞与人脐静脉内皮细胞（HUVECs）的生物打印墨水，再次进行20秒的光固化；通过DLP-3D逐层打印，最终分别得到了含MVF的仿生胰岛和含HUVECs的仿生胰岛。

含MVF的仿生胰岛为包含了5000个类β细胞球状体和12000个MVF（约0.6×106个细胞）。含HUVECs的仿生胰岛为包含了5000个类β细胞球状体和1×106个HUVECs。

最后，得到的含微血管的仿生胰岛形态如图4所示。

实施例5含MVF的仿生胰岛对小鼠血糖的影响

按照实施例3中的方法将含MVF的仿生胰岛进行小鼠的皮下移植，并在每周一和周四下午进行随机非空腹血糖监测，可以看到大部分小鼠在接受移植后血糖明显下降，血糖改善的效果能维持1个月左右；此外，结果也发现接受移植的15只小鼠中有5只实现了高血糖的长期缓解（大于3个月）（如图5所示）。

C肽和胰岛素一样是由胰岛β细胞分泌的，而且与胰岛素有一个共同的前体胰岛素原。因此，检测C肽比检测胰岛素更能证实仿生胰岛的β细胞功能。为了进一步验证含MVF的仿生胰岛在改善高血糖症状中发挥的作用，在移植完成3个月后，我们对接受移植的小鼠进行了人源化C肽的检测。

禁食12小时后，分别在注射葡萄糖前后30分钟通过眼眶取血收集小鼠血清，ELISA方法检测小鼠血清中的人源化C肽。结果发现：小鼠在注射葡萄糖前，未分泌C肽，而注射了葡萄糖之后，C肽的表达较高，证明含MVF的仿生胰岛移植体内能对高血糖刺激做出反应，能有效改善高血糖症状（如图6所示）。

实施例6含HUVECs的仿生胰岛对糖尿病小鼠的葡萄糖代谢能力的影响

为了验证含HUVECs的仿生胰岛是否也能达到和含MVF的仿生胰岛类似的效果。按照实施例3的方法将含HUVECs的仿生胰岛移植小鼠，通过连续一个月的随机非空腹血糖检测，结果发现含HUVECs的仿生胰岛移植至体内之后仅在一周内发现有略微的血糖下降，随后又马上恢复了高血糖症状，不能稳定的发挥降血糖的功能（如图7所示）。图7的结果还同时显示了：含MVF的仿生胰岛的治疗效果，与正常组最为接近，证明含MVF的仿生胰岛治疗效果最好。

实施例7MVF有助于仿生胰岛在体内形成血管化网络结构

为了验证MVF是否已在体内形成血管化网络，我们在移植完成1个月后对移植物进行回收。结果发现，与实施例3移植的普通仿生胰岛组相比，含MVF的仿生胰岛仅在移植后1个月便在皮下形成了丰富的血管化网络（如图8所示）。我们将移植物剥离后进行免疫荧光染色，通过将β细胞的指标INS和血管化的指标CD31共染，能看到联合MVF的仿生胰岛内部也形成了相互连接的血管结构（如图9所示），以上结果证明了MVF能有助于仿生胰岛移植体内后的血管化网络生成，能够解决移植细胞在体内由于缺氧所导致的营养供应不足的问题，能保证细胞移植后的长期疗效。

实施例8仿生胰岛体内移植引起免疫排斥反应研究

采用免疫荧光对胶原堆积相关指标α-SMA、Fibronectin以及免疫细胞的CD45进行染色。具体的免疫荧光染色步骤如下：

1)将移植物从小鼠皮下剖离后用磷酸盐缓冲液洗涤3次后置于4%多聚甲醛中固定72小时，随后冲水过夜；

2)将回收的移植物置于10%、20%及30%的梯度蔗糖溶液中进行脱水；

3)在模具中倒入冰冻切片包埋剂，覆盖住模具底部即可，并将其置于液氮上方使其凝固；

4)将脱水后的样品置于凝固的包埋剂上方，再滴加包埋剂，置于液氮上方使其凝固；

5)将包埋凝固后的样品进行冰冻切片或置于-80℃冰箱中保存；

6)冰冻切片置于-20℃保存；

7)进行染色时，取出冰冻切片，室温放置10分钟；

8)将冰冻切片用冷丙酮固定15分钟；

9)用磷酸盐缓冲液漂洗3次，每次3分钟；

10)滴加封闭用血清37℃封闭1小时；

11)用磷酸盐缓冲液稀释一抗至合适浓度；（一抗为α-SMA，厂家Invitrogen，货号701457；Fibronectin,厂家Abcam,货号ab2413; CD45,厂家Abcam，货号ab23910）

12)用滤纸吸去切片上的血清封闭液；

13)在组织切片上滴加稀释后的一抗，置于湿盒内，4℃孵育过夜；

14)将组织切片用磷酸盐缓冲液漂洗3次，每次5分钟；

15)用滤纸尽可能小心吸去切片上的缓冲液液体，随后滴加经磷酸盐缓冲液稀释的荧光二抗；

16)室温避光孵育2小时；

17)磷酸盐缓冲液漂洗3次，每次5分钟；

18)吸去切片上的液体，并用细胞核染料染色15分钟；

19)磷酸盐缓冲液漂洗5分钟；

20)吸去切片上的磷酸盐缓冲液体后，滴加抗荧光淬灭剂后盖上盖玻片；

21)使用荧光显微镜观察染色结果。

结果如图10所示，结果显示：α-SMA和Fibronectin在仿生胰岛和含MVF的仿生胰岛的边缘都有表达，但表达量并不高，表明所引起的胶原沉积较少。此外，CD45阳性的细胞都聚集在上面两种仿生胰岛四周，表明两种仿生胰岛都能有效防止免疫细胞浸润，从而保证移植细胞长期存活。

为了更进一步明确这两种仿生胰岛在异种移植中的免疫保护作用，我们将移植物回收后进行消化解离，通过流式细胞术检测了F4/80、CD4阳性T细胞以及CD8阳性T细胞占免疫细胞的比例。

具体的操作步骤如下：

1)将仿生胰岛从小鼠皮下剖离后，使用磷酸盐缓冲液清洗3次，每次3分钟；

2)将仿生胰岛用剪刀剪碎成小的碎片后，加入GelMA（甲基丙烯酰化明胶）裂解液（购买自ELF公司，货号EFL-GM-LS-001）浸没仿生胰岛碎片，用移液枪反复吹打，使水凝胶充分破碎；

3)在37°C培养箱无菌裂解，每15分钟在显微镜下观察裂解情况;

4)充分裂解后按照1000转离心5分钟，弃上清，加入5ml含10%胎牛血清的DMEM培养基重复洗涤离心1次；

5)弃掉上清，用磷酸盐缓冲液重悬细胞沉淀，制备单细胞悬液，按照每管100μL的体系分装至流式管中；

6)向流式管中加入3μL流式抗体，每种抗体3μL（流式抗体分别为F4/80、CD4、CD8、CD45），混匀后在冰上避光孵育30分钟；

7)用磷酸盐缓冲液重悬细胞，在4℃条件下，按照500g的转速离心3分钟，弃去上清，重复此步骤3次；

8)轻轻倒掉上清，用100μL磷酸盐缓冲液重悬细胞沉淀，在流式细胞仪上进行操作分析。

统计结果如图11所示，结果发现两种仿生胰岛中F4/80占免疫细胞的比例最高（约30%以上），两组之间没有显著性差异；CD4和CD8阳性T细胞（免疫排斥反应中主要的T细胞）比例非常低，CD4阳性T细胞的比例低于10%，而CD8阳性T细胞的比例仅为3%左右。上述结果共同说明了尽管两种仿生胰岛外周有约50μm深度的免疫细胞浸润，但其浸润程度并不会对内部的移植细胞产生实质性影响，进一步证明了这两种仿生胰岛均具有免疫隔离屏障，体内移植引起的免疫排斥反应低。

实施例9仿生胰岛植入体内后的安全性评价

在移植完成3个月后，回收小鼠的心、肝、脾、肺以及肾进行组织形态学观察和组织切片染色，结果发现所有接受移植治疗的小鼠体内器官无明显病变（如图12所示），说明本发明制备的这两种仿生胰岛移植入体内后不但引起的免疫排斥反应低，而且易于监测和回收，安全性高。

Claims (9)

1.3D生物打印的人工仿生胰岛，其特征在于：由人胰腺β细胞经3D生物打印而制成；所述的人胰腺β细胞是由人尿液上皮样细胞来源的iPSCs诱导分化得到的，人尿液上皮样细胞来源的iPSCs诱导分化方法包括以下步骤：

a、尿液上皮样细胞的获取、培养、扩增；

提取尿液，离心，初始培养基重悬，并于30-40℃下培养2-5天，之后加入RE/MC扩增培养基培养3-15天，直到出现贴壁的克隆样的尿液上皮样细胞团，待细胞汇合度达90%时，胰蛋白酶消化，胰酶抑制剂终止，继续扩增培养及传代，得到P1代和P2代的尿液上皮样细胞；

b、重编程获取iPSCs；

获取小鼠胚胎成纤维细胞MEF，并进行辐照；

培养HEK-293T细胞，待密度达80-90%时，将感染复合物滴加入其中进行感染，感染后继续培养4-6小时，更换成含5%-20%的胎牛血清的DMEM培养基，继续培养12-36小时24小时；

将步骤a得到的尿液上皮样细胞消化后，按照3000个-10000个细胞/cm²的密度均匀接种至0.1%-0.5%明胶包被的板中；收集含各病毒颗粒的HEK-293T细胞培养上清，过滤，各上清等比例混合后，加入聚凝胺，将病毒混合液加入到含尿液上皮样细胞的六孔板中；重复上述步骤进行二次感染，感染12-36小时后将尿液上皮样细胞的培养基更换为RE/MC扩增培养基；

将辐照后的MEF细胞培养，待感染病毒后的尿液上皮样细胞达到80-90%时，用胰蛋白酶消化，并用ESC/dFBS培养基终止消化、重悬，接种至含MEF的板中，在ESC/dFBS培养基中加入转化生长因子β的I型受体抑制剂、糖原合成酶激酶-3抑制剂、新型的Rho相关激酶抑制剂、环状抑制剂-α氢溴酸盐和丁酸钠，于第2天、第4天、第6天及第8天对重编程后的细胞进行换液；采用mTeSR培养基于第10天、第12天、第14天及第16天进行换液；从第18天开始每天用mTeSR培养基进行换液，培养5-7天，得到克隆的UiPSCs；

c、3D悬浮诱导分化iPSCs为类β细胞；

消化重悬iPSCs细胞，将iPSCs单细胞进行接种，加入Y27632，诱导培养24小时，记为第0天，第1天采用诱导分化培养基A培养；第2-3天，采用诱导分化培养基B培养；第4-6天，采用诱导分化培养基C培养；第7-9天，采用诱导分化培养基D培养；第10天，采用诱导分化培养基E培养；第11-14天，采用诱导分化培养基F培养；第15-22天，采用诱导分化培养基G培养，直至培养得到类β细胞；所述诱导分化培养基A组成包括：RPIM1640基础培养基，含0.2%胎牛血清、100U/mL青霉素-链霉素、1%谷氨酰胺、0.02%胰岛素-转铁蛋白-硒-氨基乙醇、100ng/mL激活素A以及50ng/mL Wnt3A；诱导分化培养基B组成包括：RPIM1640基础培养基，含0.2%胎牛血清、100U/mL青霉素-链霉素、1%谷氨酰胺、0.02%胰岛素-转铁蛋白-硒-氨基乙醇、100ng/mL激活素A；诱导分化培养基C组成包括：DMEM/F12基础培养基，含2%胎牛血清、100U/mL青霉素-链霉素、0.1% ITS-X和50ng/mL角质细胞生长因子；诱导分化培养基D组成包括：DMEM基础培养基，含1% B27添加剂、1%谷氨酰胺、100U/mL青霉素-链霉素、0.25μM环巴胺、2μM视黄酸及50ng/mL指头蛋白；诱导分化培养基E组成包括：DMEM基础培养基，含1% B27添加剂、1%谷氨酰胺、100U/mL青霉素-链霉素、50ng/mL角质细胞生长因子、50ng/mL表皮细胞生长因子、50ng/mL指头蛋白和100nM视黄酸；诱导分化培养基F组成包括：DMEM基础培养基，含1% B27添加剂、1%谷氨酰胺、100U/mL青霉素-链霉素、1μM间变性淋巴瘤激酶2型抑制剂、50nM苯并内酰胺衍生的可渗透细胞的蛋白激酶C活化物、100nM视黄酸和100ng/mL指头蛋白；诱导分化培养基G组成包括：DMEM基础培养基，含1%非必需氨基酸、1% B27添加剂、1%谷氨酰胺、100U/mL青霉素-链霉素、10μM间变性淋巴瘤激酶2型抑制剂、500nM选择性骨形态发生蛋白I型受体抑制剂、1μMγ分泌酶抑制剂二苯并氮卓、1μM T3三碘甲状腺原氨酸、0.5mM维生素C、1mM乙酰半胱氨酸、10μM硫酸锌和10ug/mL硫酸类肝素。

2.根据权利要求1所述的3D生物打印的人工仿生胰岛，其特征在于：所述的人工仿生胰岛为圆柱形，直径13-20mm，高度3-5mm。

3.根据权利要求1所述的3D生物打印的人工仿生胰岛，其特征在于：所述的人工仿生胰岛中人胰腺β细胞的数量为≥5×10⁶个。

4.根据权利要求1所述的3D生物打印的人工仿生胰岛，其特征在于：还加入了小鼠脂肪垫来源的微血管片段。

5.根据权利要求4所述的3D生物打印的人工仿生胰岛，其特征在于：所述的小鼠脂肪垫来源的微血管片段中的细胞数量为≥0.6×10⁶个。

6.权利要求1-4任一项所述的3D生物打印的人工仿生胰岛的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

a、将GelMA溶于25-40℃的光引发剂溶液中，形成含有5-20%GelMA (w/v)和0.01-0.1%LAP的生物打印墨水；

b、再按照图案光的设定进行逐层打印凹槽结构，每层曝光时间为5-30秒；

c、在凹槽结构的中间添加混合了类β细胞的生物打印墨水，再次进行5-30秒的光固化；通过DLP-3D逐层打印，最终得到了类β细胞仿生胰岛。

7.根据权利要求6所述的3D生物打印的人工仿生胰岛的制备方法，其特征在于：步骤c所述的类β细胞中再加入小鼠脂肪垫来源的微血管片段。

8.根据权利要求7所述的3D生物打印的人工仿生胰岛的制备方法，其特征在于：所述的类β细胞加入量为≥5×10⁶个；小鼠脂肪垫来源的微血管片段细胞数量为≥0.6×10⁶个。

9.权利要求1-6任一项所述的3D生物打印的人工仿生胰岛在制备预防或治疗糖尿病的药物或装置中的用途。