CN116323921A - 从人多能干细胞生成cd4+效应t细胞和调节性t细胞 - Google Patents
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Abstract
本文提供了用于生成CD4阳性效应T细胞和调节性T细胞的改进方法和组合物及其使用方法。
Description
相关申请的交叉引用
本申请要求于2020年10月28日提交的美国临时申请63/106,591的优先权,其公开内容通过引用以其整体并入本文。
发明背景
健康的免疫系统是处于平衡的系统。参与适应性免疫的细胞包括B淋巴细胞和T淋巴细胞。有两种通常类型的T淋巴细胞—效应T细胞(Teff)和调节性T细胞(Treg)。有两种通常类型的效应T细胞—T辅助(Th)细胞和细胞毒性T细胞(CTL)。表达CD4的效应T细胞通常充当Th细胞(CD4+效应T细胞),而表达CD8的效应T细胞通常充当CTL(CD8+效应T细胞)。Th细胞包括Th1、Th2和Th17细胞。除了Th细胞外,非常规T细胞(例如,NK T细胞、γ/δT细胞和粘膜相关不变T细胞)也可以表达CD4。众所周知另一种独特类型的T淋巴细胞Treg表达CD4。Treg细胞调节效应T(Teff)细胞并防止过度免疫应答和自身免疫(参见例如,Romano等人,FrontImm.(2019)10:43)。传统上定义的Treg是CD4+,但也有记载的CD8+Treg(Yu等人,OncologyLetters(2018)15:6)。
Teff细胞在抗原攻击后的细胞介导的免疫中起着核心作用,并且可以包括幼稚、记忆、干细胞记忆或终末分化效应T细胞。Teff细胞与幼稚T细胞的区别在于经历过抗原并执行效应功能(例如,分泌细胞因子或因子以促进“辅助者”和/或细胞免疫应答)。也可以有记忆T辅助细胞或干细胞记忆T辅助细胞,它们随后也可以重新分化为辅助T效应细胞以执行效应功能。
一些Treg在胸腺中生成;它们被称为天然Treg(nTreg)或胸腺Treg(tTreg)。其他Treg是在遇到抗原后在外周生成的或在细胞培养物中生成的,被称为诱导性Treg(iTreg)或适应性Treg。Treg主动控制其他免疫细胞的增殖和激活,包括诱导耐受,通过涉及特定细胞表面受体的细胞间接触,和抑制性细胞因子如IL-10、TGF-β和IL-35的分泌(Dominguez-Villar和Hafler.,Nat Immunol.(2018)19:665-73)。耐受性失败会导致自身免疫和慢性炎症。耐受性丧失可由Treg功能缺陷或Treg数量不足,或无应答或过度激活的Teff引起(Sadlon等人,Clin Transl Imm.(2018)7:e1011)。
近年来,人们对使用Treg治疗疾病很感兴趣。已经探索了若干方法,包括过继细胞疗法,以提高Treg的数量和功能,从而治疗自身免疫性疾病。Treg转移(递送激活和扩增的Treg群体)已在患有自身免疫性疾病(如I型糖尿病、皮肤红斑狼疮和克罗恩病)的患者和器官移植中进行了测试(Dominguez-Villar,同上;Safinia等人,Front Immunol.(2018)9:354)。
在过继细胞疗法中,CD4+Teff细胞也越来越受到关注。已知CD4+Teff通过优化在通过特定树突细胞和其他抗原呈递细胞(APC)的抗肿瘤或抗病原体(例如,抗病毒)启动过程中CTL的应答的幅度和质量来增强CD8+CTL的功能性(Borst等人,Nat Rev Immunol.(2018)18:635-47)。CD4+Teff也被证明在HIV疾病模型中具有治疗作用(Maldini等人,Mol Ther.(2020)28(7):1585-99)。T滤泡辅助细胞(Tfh)是CD4+Teff的另一个子集,其通过增强B细胞应答显示出治疗前景(Kamphorst等人,Immunotherapy(2013)5(9):975-98)。
目前,用于细胞疗法的CD4+Teff和Treg的唯一来源是成人或青少年原代血(例如,全血或单采血液分离产品)和组织(例如,胸腺)。从这些来源分离CD4+Teff和Treg具有侵入性和耗时性,并且只能产生少量细胞,尤其是Treg。此外,从这些来源获得的CD4+Teff和Treg本质上是多克隆的,可以在其潜在的免疫抑制应答中引入可变性。还有证据表明,简单增加Treg的数量可能不足以控制疾病(McGovern等人,Front Immunol.(2017)8:1517)。
因此,仍然需要有效地大量获得抗原特异性CD4+Teff和Treg细胞,尤其是基因工程改造的细胞。
发明内容
本公开提供了获得富含CD4+T细胞的细胞群的方法,包括提供CD4+CD8+未成熟T细胞的起始群,在包含佛波醇12-十四酸酯13-乙酸酯(PMA)和离子霉素(I)的培养基中培养细胞群,从而获得富含CD4单阳性T细胞的细胞群。在一些实施方案中,CD4单阳性T细胞是未成熟的CD4+T细胞,任选地其中T细胞表达ThPOK。在某些实施方案中,未成熟的CD4+T细胞是效应T(Teff)细胞,任选地其中Teff细胞是CD25低。
在一些实施方案中,培养基包含约0.00625μg/ml至约0.1μg/ml PMA和约0.125μg/ml至约2μg/ml离子霉素。在进一步的实施方案中,培养基包含0.00625μg/ml PMA和0.125μg/ml离子霉素。在一些实施方案中,培养基中PMA与离子霉素的重量比为约1:10至1:1000(例如,1:20、1:50、1:100、1:200、1:250或1:500)。在某些实施方案中,该比率为1:20。
在一些实施方案中,CD4+CD8+T细胞的起始群体在培养基中培养约一至五天。
在一些实施方案中,本公开提供了获得富含CD4+T细胞(例如,人细胞)的细胞群的方法,包括提供CD4+CD8+T细胞的起始群,在包含佛波醇12-十四酸酯13-乙酸酯(PMA)和离子霉素(I)的培养基中培养细胞群,从而获得富含CD4单阳性T细胞的细胞群,在包含IL-2、抗CD2抗体、抗CD3抗体和抗CD28抗体的第二培养基中培养CD4单阳性T细胞(例如,持续约5-10天),从而获得富含CD4+调节性T(Treg)细胞的细胞群。在进一步的实施方案中,第二培养基进一步包含TGF-β和全反式视黄酸(ATRA)。第二培养基也可以由添加了IL-2的T细胞特异性培养基组成;在进一步的实施方案中,第二培养基由添加了TGF-β、ATRA、IL-2、抗-CD2抗体、抗-CD3抗体和抗-CD28抗体中的一种或多种的T细胞特异性培养基组成。
在一些实施方案中,可通过例如荧光激活细胞分选(FACS)或磁激活细胞分选(MACS)从组织培养物中分离CD4单阳性Teff细胞或CD4单阳性和CD25阳性Treg细胞。在一些实施方案中,可通过FACS从组织培养物中分离CD4单阳性Teff细胞或CD4+CD25+CD127低Treg细胞。在一些实施方案中,可通过FACS从组织培养物中分离CD4+CD25高CD127低和CD4+CD25低CD127低Treg细胞。
在某些实施方案中,CD4+CD8+T细胞群衍生自人诱导多能干细胞(iPSC),例如,从T细胞重编程的iPSC。
在一些实施方案中,iPSC在基因组中包含异源序列,其中异源序列包含编码谱系定型因子(例如,FOXP3、Helios或ThPOK)的转基因,并且其中谱系定型因子(i)促进iPSC向CD4+Teff细胞分化或(ii)促进iPSC向CD4+Treg细胞分化或促进CD4+Treg细胞表型的维持。在进一步的实施方案中,异源序列被整合到T细胞特异性基因座(例如,T细胞受体α恒定基因座或TRAC基因座),使得转基因的表达处于基因座中转录调控元件的控制之下。在一些实施方案中,异源序列被整合到TRAC基因座的外显子1、2或3中。
在进一步的实施方案中,转基因包含额外多肽(例如,另一种谱系定型因子、治疗性蛋白质或抗原受体如嵌合抗原受体)的编码序列,其中谱系定型因子的编码序列和额外多肽的编码序列由自切割肽的框内编码序列或内部核糖体进入位点(IRES)分隔。
在一些实施方案中,异源序列被整合到T细胞特异性基因座的外显子中,并包含紧邻转基因上游的内部核糖体进入位点(IRES);或包含紧邻转基因上游并与转基因同框的自切割肽的第二编码序列。
在某些实施方案中,异源序列进一步包含紧邻IRES或自切割肽的第二编码序列上游的核苷酸序列,该核苷酸序列包含整合位点下游的T细胞特异性基因座的所有外显子序列,使得T细胞特异性基因座仍然能够表达完整的T细胞特异性基因产物。
在某些实施方案中,转基因包含FOXP3的编码序列、Helios的编码序列和/或ThPOK的编码序列,其中这些编码序列是框内的并且由自切割肽的框内编码序列分隔。
在一些实施方案中,起始细胞群包含选自II类主要组织相容性复合体反式激活因子(CIITA)基因、HLAI类或II类基因、与抗原加工相关的转运蛋白、次要组织相容性抗原基因和β2微球蛋白(B2M)基因的基因中的无效突变(null mutation)。
在一些实施方案中,起始细胞群包含任选地选自HSV-TK基因、胞嘧啶脱氨酶基因、硝基还原酶基因、细胞色素P450基因或caspase-9基因的自杀基因。
在一些方面,本公开还提供了通过本方法获得的富含CD4单阳性细胞的细胞群或富含CD4+Teff细胞的细胞群。在相关方面,本公开提供了在有此需要的患者中治疗癌症、感染性疾病、过敏症、哮喘或自身免疫或炎性疾病的方法,包括施用本文获得的富含CD4+Teff细胞的细胞群;本文获得的富含CD4+Teff细胞的细胞群用于制备治疗方法中的药物的用途;以及用于治疗方法的本文获得的富含CD4+Teff细胞的细胞群。
在一些方面,本公开提供了富含本文获得的CD4+Treg细胞的细胞群。在相关方面,本公开提供了治疗需要免疫抑制的患者的方法,包括施用通过本方法获得的富含CD4+Treg细胞的细胞群;通过本方法获得的富含CD4+Treg细胞的细胞群在制备用于治疗需要免疫抑制的患者的药物中的用途;和用于治疗需要免疫抑制的患者的通过本方法获得的富含CD4+Treg细胞的细胞群。在一些实施方案中,患者患有自身免疫性疾病;或已接受或将接受组织移植。
本发明的其他特征、目的和优点在以下详细描述中显而易见。然而,应当理解,详细描述虽然指示了本发明的实施方案和方面,但仅作为说明而不是限制的方式给出。本发明范围内的各种改变和修改将在详细描述中对本领域技术人员显而易见。
附图说明
图1是描述用于从iPSC生成造血干和祖细胞(HSPC)、淋巴祖细胞(lymphoidprogenitor cells)、双阳性(DP)T细胞、CD4单阳性(CD4sp)T细胞、CD4 Th细胞和Treg的过程的图。淋巴祖细胞:CD5+CD7+。双阳性:CD4+CD8+。单阳性:CD4+或CD8+。
图2是描述从在具有IL-2的T细胞特异性培养基(“T细胞培养基”)存在下培养的iPSC生成Treg的过程的图。
图3和4是评估PMA和离子霉素(PMAI)在第35天(图3)或第42天(图4)加入时促进DPT细胞分化为CD4sp细胞的能力的流式细胞术图组。以不同浓度添加PMAI,其中更低的浓度(0.125X、0.25X、0.50X、1X或2X)产生更多的CD4sp细胞。连续稀释的PMAI的组分如表A所示。
图5是证实CD4分子在PMAI诱导的CD4sp T细胞中的再表达的图组。用增加浓度的链霉蛋白酶(未处理、0.02%、0.04%、0.08%、0.1%)处理细胞以去除CD4,并在4℃或37℃下孵育以分别阻止或允许CD4再表达。在链霉蛋白酶处理后1或2天后测量CD4 MFI(平均荧光强度)。条形图(左)显示在37℃培养两天后CD4 MFI相对于在4℃细胞的增加,并且流程图(右)显示与在4℃细胞相比,0.1%浓度的CD4再表达。
图6A和6B是显示用TGF-β1、ATRA、IL-2和CD3/CD28/CD2 T细胞激活剂处理的PMAI诱导的CD4sp T细胞中Treg标志物表达的流式细胞术直方图组。在第35天(图6A)或第42天(图6B)添加各种浓度的PMAI以诱导CD4sp T细胞。检测了FOXP3、Helios、CTLA-4、GARP和LAP的表达。
图7是显示激活的PMAI诱导的和TGF-β1处理的CD4sp T细胞(iPSC-Treg)中Treg标志物的表达的流式细胞术直方图组。检测了FOXP3、Helios、CTLA-4、GARP和LAP的表达。
图8是显示0.125X PMAI诱导的和TGF-β1处理的iPSC-Treg对应答T细胞增殖的抑制能力的流式细胞术直方图组。Tresp:应答T细胞。
图9是显示用TGF-β、ATRA、IL-2和CD3/CD28/CD2 T细胞激活剂处理的PMAI诱导的CD4sp T细胞中Treg标记物的表达的流式细胞术图和直方图组。CD4sp T细胞在100%StemSpanTMT细胞成熟培养基(成熟培养基)或额外补充IL-2的成熟培养基和T细胞特异性培养基的50%混合物中分化。在含有补充IL-2和CD3/CD28/CD2激活剂而不含TGFB和ATRA的成熟培养基和T细胞特异性培养基的50%混合物中分化的CD4sp T细胞用作对照。检测了CD4、CD8、CD25、CD127和FOXP3的表达。在CD4spCD127低CD25高和CD4spCD127低CD25低细胞中检测了FOXP3的表达。
图10是描述用于分选CD25高和CD25低iPSC-Treg的分选策略的流式细胞术图组。确定CD4、CD8、CD25和CD127的表达,以便定位分选门。
图11是显示Treg标志物在未激活和激活的CD25高和CD25低分选的iPSC-Treg中的表达的流式细胞术图组。检测了CD4、CD8、CD25、FOXP3、CD69和GARP的表达。
图12是显示了Treg标志物在未激活和激活的CD25高和CD25低分选的iPSC-Treg中的表达的流式细胞术图组。检测了FOXP3、Helios、CTLA-4和LAP的表达。
图13是显示分选的iPSC-Treg或iPSC-CD4sp T细胞对应答T增殖的抑制能力的图组。iPSC-Treg或iPSC-CD4sp T细胞与应答T细胞以最高达1:1(Treg:应答T)的渐增浓度共培养(n=3)。
图14描述了来自两个不同克隆的iPSC衍生的Treg中在FOXP3 Treg特异性去甲基化区域(TSDR)去甲基化的细胞的百分比。在用PMAI和TGF-β1处理后的iPSC-Treg(图A)、仅用0.125X PMAI处理后的CD4sp细胞以及原代Treg和应答T细胞(Tresp)对照(图B)中测定了甲基化。还通过流式细胞术在PMAI和TGF-β1处理的细胞中检测了FOXP3的表达(图C)。
图15描述了在去除死细胞之前(Ficoll前)和之后(Ficoll后)以及靶细胞(Treg)和非靶细胞(流经)中的Treg富集之后iPSC衍生的Treg中在FOXP3TSDR处去甲基化的细胞百分比(A组)。B组显示了证实去除死细胞和Treg富集后iPSC-Treg中FOXP3的表达的流式细胞术图。
图16描述了在分选的iPSC-Treg中在FOXP3 Treg特异性去甲基化区域(TSDR)去甲基化的细胞的百分比。在CD25高、CD25低iPSC-Treg和大量未分选群体中测定甲基化。原代Treg和Tresp用作对照。
图17A-C是描述各种类型的T细胞刺激生成Treg的能力的流式细胞术图组。检测了成熟CD4+T细胞(图17A)、Treg(图17B)和幼稚Treg(图17C)的标记物。
图18是描述各种浓度的PMAI从DP T细胞生成CD4sp T细胞,随后在TGF-β1和ATRA处理后生成iPSC-Treg的能力的流式细胞术图组。
图19是描述将编码一个或多个Treg定型(或诱导)因子(“TF”)的转基因整合到人TRAC基因的外显子2中的基因组编辑方法的示意图。由引入的mRNA产生的锌指核酸酶(ZFN)在外显子2中的特定位点(闪电击)产生双链断。由腺相关病毒(AAV)6载体引入的供体序列,从5’到3’包含:同源区1;自切割肽T2A的编码序列;第一TF、自切割肽P2A、第二TF2、自切割肽E2A和第三TF3的融合的编码序列;聚腺苷酸化(polyA)信号序列;和同源区2。同源区域与侧接ZFN切割位点的基因组区域同源。整合位点上游的TRAC外显子2部分、T2A编码序列和(一个或多个)TF编码序列彼此同框。在这种方法下,由于转基因整合,TRAC蛋白的表达被敲除。整合序列的表达由内源性TCRα链启动子调节。
图20是描述类似于图19中描述的基因组编辑方法的示意图,但在此处,异源序列包含涵盖整合位点下游的TRAC外显子序列的部分TRAC cDNA(即整合位点3’的外显子2序列和外显子3序列)。该部分TRAC cDNA紧接置于T2A编码序列的上游,并与T2A编码序列同框,使得工程化基因座在内源性TCRα链启动子下表达完整的TCRα链和(一个或多个)TF。
图21是描述整合编码一个或多个定型因子的转基因的又一基因组编辑方法的示意图。在这种方法中,转基因被整合到基因组安全港中。在该图中,转基因被插入到人AAVS1基因座的内含子1中,并可操作地连接到多西环素(Dox)诱导型启动子。SA:剪接受体。2A:自切割肽2A的编码序列。PuroR:嘌呤霉素抗性基因。TI:靶向整合。
图22是显示从使用图21中概述的示意图编辑的细胞生成的数据的图组。转基因编码绿色荧光蛋白(GFP)。Puro:嘌呤霉素。Dox:多西环素。Puro:嘌呤霉素。
图23是描述基因组编辑方法的示意图,其中将编码一个或多个定型因子的转基因整合到人AAVS1基因的内含子1中。整合到基因组中的异源序列包括CAR编码序列。一旦Treg分化完成,编码定型因子的转基因(位于两个LoxP位点之间)被切除,仅在整合位点留下CAR表达盒。
图24是描述将编码一个或多个定型因子的转基因整合到人TRAC基因的外显子2中的基因组编辑方法的示意图。在这种方法中,整合到基因组中的异源序列包括CAR编码序列。一旦Treg分化完成,编码定型因子的转基因(位于两个LoxP位点之间)被切除,仅在整合位点留下CAR表达盒。
图25是描述将具有单个重排的TCR的成熟Treg重编程为诱导型多能干细胞(iPSC)的过程的示意图。扩增后,iPSC重新分化回Treg表型。此处的TCR靶向不是同种异体抗原的抗原。
图26是描述iPSC分化为Treg的过程的示意图。HSC:造血干细胞。单阳性:CD4+或CD8+。双阳性:CD4+CD8+。
图27是细胞分选图组,证实将针对IL-7受体的α单元(IL-7Ra)的抗体引入组织培养基会倾斜iPSC衍生的祖细胞T细胞的分化,使从形成CD8单阳性细胞(左上象限)倾斜之形成CD4单阳性细胞(右下象限)。将抗体以三种浓度(低、中等和高)添加到组织培养基中。这种效果在两个独立的实验(Expt.#1和Expt.#2)中得到体现。
图28是描述用于将iPSC分化成Treg的多个过程的示意图。细胞在淋巴细胞分化包被材料(饲养层非依赖)上培养或与OP9基质细胞或OP9-DLL1基质细胞(表达Notch配体的OP9细胞,Delta样1)基质细胞(饲养层依赖)一起培养。然后如图26所示进一步培养细胞以促进分化为Treg。在替代途径中,三维胚胎中胚层类器官(EMO)是通过将iPSC与MSS-DLL1/4或EpCAM-CD56+基质细胞共培养形成的;在EMO的造血诱导后,人工胸腺类器官(ATO)形成,它们被诱导以生成成熟的Treg,其中TCR库更类似于胸腺选择的Treg。
发明详述
本公开提供了用于促进干细胞如诱导性多能干细胞(iPSC)和造血祖细胞分化为CD4+效应细胞和/或调节性T细胞的方法和组合物。
在一方面,本公开提供了用于通过激活蛋白激酶C(PKC)通路和/或其他T细胞信号传导通路(例如,TCR激活通路),通过例如增加细胞内钙流量达到模拟胸腺内天然CD4+Teff和/或Treg发育的程度,从干细胞和祖细胞(例如,iPSC、造血干细胞和祖细胞(HSPC)、淋巴样祖细胞或未成熟祖细胞T细胞)生成CD4+T细胞的组织培养方法和组合物。这些组织培养方法利用小分子和生物因子来促进预期的发育通路。本方法可以从iPSC生成CD4单阳性(CD4sp)T细胞,这些细胞可以进一步成熟为CD4sp效应T细胞和具有抑制功能的FOXP3+Treg样细胞。
在另一方面,本公开提供了用于进一步促进干细胞和祖细胞分化为CD4+Teff和Treg的基因工程方法和组合物。在这些方法中,亲代细胞经过基因工程改造以过表达(即以高于细胞正常水平的表达水平表达)CD4+辅助T细胞谱系定型因子(例如,Gata3和ThPOK)和/或Treg谱系定型因子(例如,FOXP3、Helios、Ikaros)。这些因素促进工程化干细胞和/或祖细胞分化为预期的细胞类型。
通过本方法获得的CD4+Teff和Treg细胞可以是自体的或同种异体的并且可以用于基于细胞的疗法。例如,Teff细胞可用于治疗需要增强免疫力的患者,如患有癌症或感染(例如,病毒感染)的患者。Treg细胞可用于治疗需要诱导免疫耐受或恢复免疫稳态的患者,如接受器官移植或同种异体细胞疗法的患者以及患有自身免疫性疾病的患者。
目前的Teff和Treg细胞将具有更高的治疗效果,因为它们可以是单克隆的,避免了过去T细胞疗法中多克隆性引起的变异性。此外,可以基于它们的抗原特异性来选择Teff和Treg细胞。例如,可以选择Teff和Treg细胞来表达T细胞受体(TCR)或编辑的嵌合抗原受体(CAR),这些受体对在期望T细胞的体内位点处的抗原具有特异性,使得TCR或CAR将T细胞引导至位点(例如,Treg细胞的炎症位点或Teff细胞的肿瘤位点),从而增强细胞的效力。
目前的Teff和Treg细胞可以衍生自具有自我更新属性和多能性(例如,iPSC)或专能性(例如,HSPC、淋巴祖细胞或未成熟祖细胞T细胞)的细胞群。因此,与原代T细胞相比,目前的CD4sp Teff和Treg相较于原代CD4sp Teff和Treg有可能产生相对低成本的过继细胞疗法,用于肿瘤学、感染性疾病、自身免疫和炎症性疾病以及其他治疗应用。
如本文所用,术语“CD4+效应T细胞”和“CD4+Teff”是指以CD4+CD25低表型为标志的T淋巴细胞亚群。它们是CD4+T细胞的子集,不包括已知表达高水平CD25的Treg。
如本文所用,术语“调节性T细胞”、“调节性T淋巴细胞”和“Treg”是指调节免疫系统、维持对自身抗原的耐受性并通常抑制或下调T效应细胞的诱导和增殖的T细胞亚群。Treg表型部分取决于主转录因子叉头框P3(FOXP3)的表达,其调节免疫抑制功能所必需的基因网络的表达(参见例如,Fontenot等人,Nature Immunology(2003)4(4):330-6)。Treg通常以CD4+CD25+CD127低FOXP3+的表型为标志。在一些实施方案中,Treg还是CD45RA+、CD62L高、Helios+和/或GITR+。在特定实施方案中,Treg标记为CD4+CD25+CD127低CD62L+或CD4+CD45RA+CD25高CD127低。
I.用于从多能和专能细胞中生成CD4+Teff和Treg细胞的组织培养方法
用于生成CD4+Teff和Treg细胞的起始细胞群是哺乳动物细胞,如人细胞、来自农场动物(例如,牛、猪或马)的细胞和来自宠物(例如,猫或狗)的细胞。细胞可以是多能干细胞(PSC)。多能干细胞(PSC)可以无限扩增并在人体内产生任何细胞类型。PSC是生产大量用于治疗应用的分化细胞的理想起始来源。PSC包括例如,胚胎干细胞(ESC)、通过体细胞核移植衍生的PSC和诱导PSC(iPSC)。参见例如,Iriguchi和Kaneko,Cancer Sci.(2019)110(1):16–22,用于将iPSC分化为T细胞。如本文所用,术语“胚胎干细胞”是指从早期胚胎获得的多能干细胞;在一些实施方案中,该术语是指从先前建立的胚胎干细胞系获得的ESC并且不包括通过人胚胎的最近破坏获得的干细胞。
在其他实施方案中,起始细胞群可以是专能细胞,如中胚层干细胞、间充质干细胞、造血干细胞(例如,从骨髓或脐带血中分离的那些)或造血祖细胞(例如,淋巴样祖细胞)。专能细胞能够发育成不止一种细胞类型,但在细胞类型潜能方面比多能细胞更受限制。专能细胞可以衍生自已建立的细胞系或分离自人骨髓或脐带。举例而言,造血干细胞(HSC)可以在粒细胞集落刺激因子(G-CSF)诱导的动员、普乐沙福(plerixafor)诱导的动员或其组合之后从患者或健康供体分离。为了从血液或骨髓中分离HSC,血液或骨髓中的细胞可以通过结合不需要的细胞的抗体进行淘选,如针对CD4和CD8(T细胞)、CD45(B细胞)、GR-1(粒细胞)和Iad(分化的抗原呈递细胞)的抗体(参见例如,Inaba等人(1992)J.Exp.Med.176:1693-1702)。然后可以通过CD34抗体对HSC进行阳性选择。
在一些实施方案中,起始细胞群是从人体细胞重编程的人iPSC,如成纤维细胞或成熟T细胞,如Treg(Takahashi等人(2007)Cell 131(5):861-72),如表达靶向非同种异体抗原的TCR的成熟Treg。参见图25和以下进一步讨论。
本公开提供了从PSC如诱导的PSC(iPSC)生成CD4+Teff和Treg细胞的方法。本公开还包括从专能细胞如中胚层祖细胞、造血干细胞或淋巴样祖细胞生成Treg细胞的方法。与多能细胞相比,专能细胞,包括专能干细胞和组织祖细胞,在分化成不同细胞类型的能力方面更加有限。
在本方法中,多能或专能细胞可以通过激活PKC通路和/或其他T细胞信号传导通路(例如,TCR激活通路)分化为CD4+T细胞(包括Teff和Treg)。此种激活模拟了胸腺内天然CD4+Teff和/或Treg的发育。这些通路的激活可以通过在充当通路激动剂的小分子和/或大分子存在下培养CD4+CD8+细胞来实现。此类激动剂的实例有佛波醇12-十四酸酯13-乙酸酯(PMA;用于PKC激活);离子载体离子霉素(用于提高细胞内钙水平和增加神经钙蛋白和NFAT去磷酸化);Src激酶抑制剂(用于阻断Lck活性;例如,JNJ 10198409、A 419259三盐酸盐、AZM 475271和阿特波龙(alsterpaullone),可从例如Tocris获得);以及促进TCR和共受体结合和激活的抗体或其他蛋白质(例如,CD3、CD28和CD2多聚体抗体或激动剂复合物,如ImmunoCultTM人CD3/CD28/CD2 T细胞激活剂,可从StemCell Technologies获得)。将细胞与MHC II类表达细胞(例如,B细胞、巨噬细胞和树突状细胞)共培养也可以模拟胸腺选择过程中的CD4+TCR参与。
在一些实施方案中,CD4+CD8+T细胞(双阳性T细胞)在PMA和离子霉素存在下培养以促进细胞分化为CD4单阳性T细胞。在特定实施方案中,PMA与离子霉素的重量比为约1:10至约1:1000(例如,1:20、1:50、1:100、1:250或1:500)。在一些实施方案中,双阳性细胞在PMA和离子霉素存在下培养约一至五天,例如约24小时。
举例而言,图1说明了从iPSC生成造血干细胞和祖细胞(HSPC)、淋巴样祖细胞、双阳性T细胞、CD4sp Teff和Treg的逐步过程。在该示例性过程中,iPSC可以首先在细胞因子和生长因子中生长成胚状体(EB)约5-12天(例如,约8天)以引导它们分化为中胚层谱系,然后分化为HSPC。例如,iPSC可以在约5-20(例如,10)ng/mL BMP4、约5-20(例如,10)ng/mLVEGF、约10-100(例如,50)ng/mL SCF、约5-20(例如,10)ng/mL bFGF和约5-20(例如,10)μMY-27632二盐酸盐存在下,在STEMdiffTMAPEL2TM培养基(StemCell Technologies)中培养约1-5天(例如,1天)以促进胚状体(EB)形成。然后可以在约10-50(例如,20)ng/mL VEGF、约50-200(例如,100)ng/mL SCF、约5-20(例如,10)ng/mL bFGF、约10-50(例如,20)ng/mLFlt-3、约10-50(例如,20)ng/mL TPO和约10-100(例如,40)ng/mL IL-3存在下在STEMdiffTMAPEL2TM中培养EB约1至10天(例如,7天),然后在约50-200(例如,100)ng/mLSCF、约10-50(例如,20)ng/mL Flt-3、约10-50(例如,20)ng/mL TPO和约10-100(例如,40)mg/mL IL-3存在下在StemProTM-34(Thermo Fisher)中培养约8至14天(例如,6天)以生成富含HSPC的细胞群。
来自EB的HSPC进一步分化为淋巴祖细胞,再持续14天左右。然后淋巴祖细胞分化为CD4+CD8+(双阳性)T细胞约7-14天(例如,在T细胞祖细胞成熟培养基中;可通过例如将StemSpanTMSFEM II与T细胞祖细胞成熟补充剂(StemCell Technologies)混合获得),此时将佛波醇12-十四酸酯13-乙酸酯和离子霉素(PMAI)添加到培养系统中约1至3天(例如,约1天或约24小时),以诱导对CD4谱系的定型。PMAI诱导的细胞可以在不存在PMAI的情况下进一步培养约5-15天(例如,7天)。然后通过添加约1-10ng/mL TGF-β1、约1-10nM全反式视黄酸(ATRA)、约10-1000U/mL IL-2和CD3/CD28/CD2人T细胞激活剂(ImmunoCultTM;或来自Thermo Fisher的Dynabeads),将所得CD4sp T细胞进一步分化为Treg约5-10天(例如,约7天)。在一些实施方案中,分化成CD4sp T细胞发生在包含T细胞特异性培养基的培养基中;这种培养基可以通过混合基础培养基如T细胞祖细胞成熟培养基和T细胞特异性培养基(例如,以1:1的体积比),并补充IL-2(例如,约10 -1000U/mL IL-2)制备(图2)。T细胞特异性培养基是促进T淋巴细胞生长和扩增的培养基,并且任选地不含血清。T细胞特异性培养基的实例包括但不限于OpTmizerTM(Thermo Fisher)、ImmunoCultTM-XF(StemCellTechnologies)和X-VIVOTM15(Lonza)。在这些方法中,从iPSC到Treg的分化过程可以完全独立于饲养层。在双阳性(CD4+CD8+)T细胞发育阶段向培养系统添加PMAI是将未成熟双阳性T细胞分化为CD4sp T细胞并最终分化为Teff和Treg的关键步骤。在T细胞特异性培养基中添加IL-2和分化可提高群体中总体Treg的数量。
在一些实施方案中,将PMA以0.0001至0.2(例如,0.0003125至0.1)ng/μl连同0.005至5(例如,0.00625至2)ng/μl离子霉素添加到双阳性T细胞的组织培养物中。在特定实施方案中,1X PMAI是指组织培养中0.05ng/μl PMA和1ng/μl离子霉素,并且双阳性细胞在0.00625X、0.125X、0.25X、0.50X、1X或2X PMAI存在下培养约24小时。双阳性细胞也可以在0.004X PMA和0.2X离子霉素中培养约24小时。可用于本培养方法的示例性PMAI浓度(例如,0.00625X至2X)如下表A所示:
表A
PMAI稀释 | PMA(ng/μl) | 离子霉素(ng/μl) |
混合原液@500X | 25 | 500 |
2X | 0.1 | 2 |
1X | 0.05 | 1 |
0.5X | 0.025 | 0.5 |
0.25X | 0.0125 | 0.25 |
0.125X | 0.00625 | 0.125 |
0.00625X | 0.0003125 | 0.00625 |
PMA(0.004X)+I(0.2X) | 0.0002 | 0.2 |
PMAI诱导的细胞可以在没有PMAI的情况下进一步培养约一周,以获得富含CD4spT细胞的细胞群。如本文所用,“富含”某种细胞类型的细胞群是指某种细胞类型占总细胞群的至少30%(例如,至少35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%或90%)。在一些实施方案中,PMAI诱导的细胞群含有至少60%-80%的CD4sp细胞。
CD4sp细胞可以进一步分化为CD4+Teff或Treg细胞。例如,如图1和2所示,富含CD4sp的T细胞群可以在存在TGF-β、ATRA、IL-2和针对CD2、CD3和CD28的抗体以及T细胞特异性培养基的情况下培养约一周以获得Treg细胞。另见Liu等人,Cell Mol Immunol.(2015)12(5):553-7;Chen和Konkel,Eur J Immunol.(2015)45(4):958-65。
替代性地,可以在IL-12存在下培养CD4sp细胞以获得富含Th1的T细胞群;在IL-4存在下获得富含Th2的T细胞群;或者在IL-6和TGF-β存在下获得富含Th17的T细胞群。
CD4+Teff和/或Treg可以使用FACS或MACS,使用特定于该细胞类型的细胞表面或细胞内标志物从培养的细胞群中纯化。对于总CD4sp细胞,可以使用以下标志物:CD3、CD4、CD8和TCRαβ。对于总Treg,可以使用以下标志物:CD4、CD8、CD25和CD127。对于幼稚Treg,可以使用以下标志物:CD4、CD8、CD25、CD127和CD45RA。纯化的细胞可以冷冻保存或扩增以供后续治疗使用。
另见图26和28用于从iPSC获得分化的T细胞的过程。
II.用于从多能和专能细胞生成CD4+Teff和Treg细胞的基因工程方法
为了进一步促进祖细胞或干细胞如iPSC分化为Teff和Treg,可以对细胞进行工程改造以表达一种或多种蛋白质,这些蛋白质促进祖细胞或干细胞的谱系定型成为CD4+辅助性T细胞并最终成为Treg细胞。这些定型因子可以在整个或部分Treg分化过程中组成型过表达,或者可以在Treg分化过程的特定时期诱导表达(例如,经由多西环素诱导的TetR介导的基因表达)。
在一些实施方案中,定型因子由随机整合到干细胞或祖细胞基因组中(例如,通过使用慢病毒载体、逆转录病毒载体或转座子)的转基因编码。
替代性地,定型因子由以位点特异性方式整合到干细胞或祖细胞的基因组中的转基因编码。例如,将转基因整合到基因组安全港位点,或整合到T细胞特异性基因的基因组位点,如T细胞受体α链恒定区(即,T细胞受体α恒定区或TRAC)基因。在前一种方法中,转基因可以任选地置于T细胞特异性启动子或诱导型启动子的转录控制之下。在后一种方法中,转基因可以在内源启动子和T细胞特定基因的其他转录调控元件(例如,TCRα链启动子)的控制下表达。将转基因置于T细胞特异性启动子控制之下的优点是转基因将仅在T细胞中表达,正如预期的那样,从而提高工程化细胞的临床安全性。
1.转基因编码CD4+Teff和Treg定型因子
为了进一步促进祖细胞或干细胞如iPSC分化为Teff和Treg,可以对细胞进行工程改造以表达一种或多种蛋白质,这些蛋白质促进祖细胞或干细胞的谱系定型成为CD4+辅助性T细胞并最终成为Treg细胞。在本方法中,引入干细胞或祖细胞基因组以促进它们分化为CD4+Teff的转基因是但不限于CD4、CTLA-4、Gata3和ThPOK。可以促进进一步分化为CD4+Treg的转基因可以是但不限于编码CD4、CD25、FOXP3、CD4RA、CD62L、Helios、GITR、Ikaros、CTLA4、Gata3、Tox、ETS1、LEF1、RORA、TNFR2和ThPOK中的一种或多种的转基因。编码这些蛋白质的cDNA序列可在GenBank和其他众所周知的基因数据库中获得。一种或多种这些蛋白质的表达将有助于干细胞或祖细胞定型至Treg在分化过程中的命运。在一些实施方案中,转基因编码Treg谱系定型因子FOXP3和/或CD4+辅助性T细胞谱系定型因子ThPOK(He等人,Nature(2005)433(7028):826-33)。在一些实施方案中,转基因编码在Treg亚群中表达的Helios(Thornton等人,Eur J Immunol.(2019)49(3):398-412)。
在一些实施方案中,干细胞或祖细胞可以被工程化以过表达增强造血干细胞(HSC)专能性的定型因子(参见Sugimura等人,Nature(2017)545(7655):432-38)。这些因子包括但不限于HOXA9、ERG、RORA、SOX4、LCOR、HOXA5、RUNX1和MYB。
在一些实施方案中,干细胞或祖细胞可以被工程化以经由工程化的位点特异性转录抑制构建体(例如ZFP-KRAB、CRISPRi等)、shRNA或siRNA下调EZHI,以增强HSC专能性(参见Vo等人,Nature(2018)553(7689):506-510)。
Treg的表型往往不稳定。在一些实施方案中,为了维持Treg表型和/或增加Treg谱系定型因子和转基因在工程化Treg细胞中的表达,可以在含有雷帕霉素和/或高浓度IL-2的组织培养基中培养细胞。(参见例如,MacDonald等人,Clin Exp Immunol.(2019)197:11-13)。可塑性是几乎所有类型免疫细胞的固有特性。在炎症和环境条件下,Treg细胞似乎可以转变(“漂移”)为Teff细胞(Sadlon等人,Clin Transl Imm.(2018)7(2):e1011)。具有抗原特异性部分如CAR或工程化TCR的工程化单克隆Treg,可以在自身免疫活性或器官移植部位增强免疫调节应答。
2.转基因编码定型因子的整合
为了对干细胞或祖细胞进行遗传工程改造,将携带感兴趣的转基因的异源核苷酸序列引入细胞中。这里的术语“异源”是指该序列被插入基因组中该序列不天然存在的位点。在一些实施方案中,异源序列被引入在Treg细胞中具有特异性活性的基因组位点。此类位点的实例是编码T细胞受体链(例如,TCRα链、β链、γ链或δ链)、CD3链(例如CD3ζ、ε、δ或γ链)、FOXP3、Helios、CTLA4、Ikaros、TNFR2或CD4的基因。
举例而言,异源序列被引入基因组中的一个或两个TRAC等位基因。TRAC基因座的基因组结构在图19和20中说明。TRAC基因位于TCRα链V和J基因的下游。TRAC含有被转录到TCRα链的恒定区的三个外显子。人TRAC基因的基因序列和外显子/内含子边界可见于Genbank ID 28755或6955中。用于整合的靶向位点可以是,例如在内含子中(例如,内含子1或2)、在TRAC基因最后一个外显子下游的区域中、在外显子中(例如,外显子1、2或3)、或在内含子与其相邻外显子之间的连接处。
图19和20说明通过基因编辑将异源序列靶向整合到人TRAC基因座的外显子2中的两种不同方法。在这两种方法中,转基因编码含有一个或多个Treg定型或诱导因子(例如,FOXP3),由自切割肽(例如,P2A、E2A、F2A、T2A)分隔的多肽。在一些实施方案中,FOXP3转基因被工程化以将已知被乙酰化的赖氨酸残基转化为精氨酸残基(例如,K31R、K263R、K268R),以增强Treg抑制活性(参见Kwon等人,J Immunol.(2012)188(6):2712-21)。
在图19所示的方法中,工程化细胞中TCRα链的表达被异源序列的插入破坏。在这种方法中,整合到基因组中的异源序列从5’到3’含有,(i)自切割肽T2A的编码序列(或内部核糖体进入位点(IRES)序列),(ii)定型因子的编码序列,以及(iii)聚腺苷酸化(polyA)位点。一旦整合,工程化的TRAC基因座将在内源启动子下表达定型因子,其中T2A肽允许从第一个定型因子(即,任何TCR可变结构域序列,以及由外显子1和外显子2 5’至整合位点的部分编码的任何恒定区序列)中删除任何TCRα链序列。由于TRAC基因被破坏,工程化细胞中无法产生功能性TCRα链。由于在转基因中包含P2A编码序列,工程化基因座可以将所有个体Treg诱导因子表达为单独的多肽。在这种方法下,干细胞或祖细胞可以进一步工程改造以表达期望的抗原识别受体(例如,靶向感兴趣抗原的TCR或CAR)。
在图20所示的方法中,异源序列从5’到3’可以含有,(i)TRAC外显子序列3’到整合位点(即整合位点下游剩余的外显子2序列,以及整个外显子3序列),(ii)T2A的编码序列(或IRES序列),(iii)一个或多个定型因子的编码序列,和(iv)polyA位点。在异源序列中包含TRAC外显子序列和T2A将允许产生完整的TCRα链。包含P2A将允许定型因子作为单独的多肽产生。TCRα链、外源引入的定型因子均在内源TCRα链启动子的控制下表达。这种方法特别适用于从已经重新排列其TCRα和β链基因座的成熟Treg重编程的工程化iPSC(参见图25和以下讨论)。从此类基因工程iPSC分化而来的Treg将保留祖先Treg细胞的抗原特异性。此外,保留TCRα链表达可以产生增强的T细胞和Treg分化,因为TCR信号传导完全参与胸腺中的T细胞和Treg发育。
在替代实施方案中,转基因可以整合到TRAC内含子而不是TRAC外显子中。例如,转基因被整合到外显子2或外显子3上游的内含子中。在此类实施方案中,携带转基因的异源序列从5’到3’可以含有剪接受体(SA)序列、编码一个或多个Treg定型因子的转基因和polyA位点。当期望重排的TCRα链基因的表达时,异源序列从5’到3’可以含有,(i)SA序列,(ii)异源序列整合位点下游的任何外显子,(iii)自切割肽或IRES序列的编码序列,(iv)编码一个或多个定型因子的转基因,和(v)polyA位点。一旦整合,SA将允许表达编码完整(即全长)TCRα链、自切割肽和定型因子的RNA转录物。该RNA转录物的翻译将产生两种(或多种)单独的多肽产物—完整的TCRα链和一种或多种定型因子。SA序列的实例是TRAC外显子的SA序列和本领域已知的其他SA序列。
在一些实施方案中,转基因被整合到工程化细胞的基因组安全港中。基因组安全港位点包括但不限于AAVS1基因座;ROSA26基因座;CLYBL基因座;针对白蛋白、CCR5和CXCR4的基因座;以及工程化细胞中内源基因被敲除的基因座(例如,T细胞受体α或β链基因座、HLA基因座、CIITA基因座或β2-微球蛋白基因座)。图21说明了此种方法。在这个实例中,异源序列被整合到人AAVS1基因座,例如内含子1。编码转基因的定型因子的表达由多西环素诱导型启动子控制。多西环素诱导型启动子可以包括Tet反应元件的5聚体重复序列。在组织培养中引入多西环素后,四环素控制的反式激活因子(rtTA)的组成型表达诱导形式与Tet响应元件结合并启动定型因子的转录。由引入的mRNA产生的锌指核酸酶(ZFN)在内含子1的特定位点产生双链断(lightning bolt)。由质粒DNA或线性化双链DNA引入的供体序列从5’到3’含有,同源区1、用于剪接AAVS1外显子1的剪接受体(SA)、自切割肽2A的编码序列、嘌呤霉素抗性基因的编码序列、polyA信号序列、5’基因组绝缘子序列、多西环素诱导的定型因子盒、从CAGG启动子驱动的rtTA编码序列,然后是polyA序列、3’基因组绝缘子序列和同源区2。基因组绝缘子序列确保其中的转基因在分化过程中不会表观遗传沉默。同源区域与ZFN切割位点侧翼的基因组区域同源。通过将嘌呤霉素引入培养物中,可以积极选择具有成功靶向整合(TI)的细胞。Treg诱导因子的可诱导表达是有用的,因为某些因子在中胚层、造血细胞或淋巴细胞发育过程中可能有毒,因此仅在T细胞发育过程中开启这些因子以向Treg谱系倾斜分化是有利的。
在一些实施方案中,异源序列含有抗原结合受体的表达盒,如嵌合抗原受体(CAR)。图23和24说明了此类实施方案的示例。在图23中,异源序列由质粒DNA或线性化双链DNA引入,并且从5’到3’含有,同源区1、由其自身启动子驱动并含有polyA位点的CAR表达盒(与供体呈反义方向)、5’LoxP位点、剪接AAVS1外显子1的剪接受体、自切割肽2A的编码序列、嘌呤霉素抗性基因的编码序列、自杀基因HSV-TK的编码序列、polyA位点、5’基因组绝缘子序列、多西环素诱导定型因子表达盒、由CAGG启动子驱动的rtTA编码序列、经由2A肽连接至rtTA序列的4-羟基他莫昔芬(4-OHT)诱导型Cre重组酶的编码序列,然后是polyA序列、3’基因组绝缘子序列、3’LoxP位点和同源区2。基因组绝缘子序列确保其中的转基因在分化过程中不会表观遗传沉默。同源区域与ZFN切割位点侧翼的基因组区域同源。通过将嘌呤霉素引入组织培养物,可以正选择具有成功靶向整合的细胞。组成型表达的4-OHT诱导型Cre允许在向培养物中添加4-OHT后切除LoxP位点之间的整个盒。没有经过重组酶介导的切除的细胞仍会表达HSV-TK,因此可以通过将更昔洛韦(GCV)添加到组织培养物中来进行负选择(消除)。GCV将导致任何表达HSV-TK的细胞死亡。该系统允许完全无痕地移除Treg诱导盒,同时保留整合的CAR盒以允许在工程化Treg中进行靶向免疫抑制。
图24说明了来自工程化TRAC基因的CAR的表达。在这个实例中,由质粒DNA或线性化dsDNA引入的异源序列从5’到3’含有,同源区1、直接融合至CAR编码序列后跟polyA位点的2A编码序列、5’LoxP位点、5’基因组绝缘子序列、剪接AAVS1外显子1的剪接受体、2A编码序列、嘌呤霉素抗性基因的编码序列以及2A肽连接的自杀基因HSV-TK的编码序列(两者都由它们自身的启动子驱动并后跟polyA信号序列)、多西环素诱导型Treg诱导因子表达盒、由CAGG启动子驱动的rtTA编码序列、经由2A肽连接至rtTA序列的4-OHT诱导型Cre重组酶的编码序列,然后是polyA序列、3’基因组绝缘子序列、3’LoxP位点和同源区2。基因组绝缘子序列确保其中的转基因在分化过程中不会表观遗传沉默。同源区域与ZFN切割位点侧翼的基因组区域同源。通过将嘌呤霉素引入组织培养物(任选地等待一周或更长时间以使未整合的供体附加体稀释),可以正选择具有成功靶向整合的细胞。组成型表达的4-OHT诱导型Cre允许在向培养物中添加4-OHT后切除LoxP位点之间的整个盒。没有经过重组酶介导的切除的细胞仍会表达HSV-TK,因此可以通过将GCV添加到组织培养物中来消除。该系统允许完全无痕地移除Treg诱导盒,同时保留由整合的内源性TRAC启动子驱动的CAR盒,以允许在工程化Treg中进行靶向免疫抑制。
上述附图仅是对本发明的一些实施方案的说明。例如,可以使用其他自切割肽代替图中所示的T2A和P2A肽。自切割肽是病毒衍生的肽,其典型长度为18-22个氨基酸。自切割2A肽包括T2A、P2A、E2A和F2A。此外,2A肽的密码子多样化形式可用于将多个Treg诱导基因组合到一个大的整合转基因盒中。在一些实施方案中,IRES用于代替自切割肽编码序列。内含子和外显子都可以用于靶向。异源序列中可以包括额外的元件。例如,异源序列可以包括RNA稳定元件,如土拨鼠肝炎病毒转录后调节元件(WPRE)。
3.基因编辑方法
可以使用任何用于将异源序列靶向整合到特定基因组位点的基因编辑方法。为了提高转基因位点特异性整合的精确度,携带异源序列的构建体可以在其任一端或两端包含与靶向基因组位点同源的同源区域。在一些实施方案中,异源序列在5’和3’末端区域都携带与T细胞特异性基因座或基因组安全港基因座中的靶基因组位点同源的序列。异源序列上同源区的长度可以是例如50-1,000个碱基对。异源序列中的同源区可以但不必与靶向基因组序列相同。例如,异源序列中的同源区域可以与靶向基因组序列(例如,要由异源序列中的同源区域替换的序列)80%或更多百分比(例如,85%或更多、90%或更多、95%或更多、99%或更多)同源或相同。在进一步的实施方案中,该构建体在线性化时在一端包含同源区1,并在其另一端包含同源区2,其中同源区1和2分别与基因组中位于整合位点侧翼的基因组区1和基因组区2同源。
可以通过任何已知技术将携带异源序列的构建体引入靶细胞,如化学方法(例如,磷酸钙转染和脂质转染)、非化学方法(例如,电穿孔和细胞挤压)、基于粒子的方法(例如,磁转染)和病毒转导(例如,通过使用病毒载体,如牛痘载体、腺病毒载体、慢病毒载体、腺相关病毒(AAV)载体、逆转录病毒载体和杂交病毒载体)。在一些实施方案中,构建体是AAV病毒载体并且通过重组AAV病毒体引入靶人细胞,该重组AAV病毒体的基因组包含构建体,包括在两端具有AAV反向末端重复(ITR)序列以允许生产系统(如昆虫细胞/杆状病毒生产系统或哺乳动物细胞生产系统)中的AAV病毒体的产生的构建体。AAV可以是任何血清型,例如AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV8.2、AAV9或AAVrh10,可以是假型如AAV2/8、AAV2/5或AAV2/6。
可以通过任何位点特异性基因敲入技术将异源序列整合到TRAC基因组基因座。此类技术包括但不限于同源重组、基于锌指核酸酶或切口酶(本文统称为“ZFN”)、转录激活因子样效应核酸酶或切口酶(本文统称为“TALEN”)、成簇的规则间隔短回文重复序列系统(CRISPR,如那些使用Cas9或cpf1的系统)、大范围核酸酶、整合酶、重组酶和转座的基因编辑技术。如以下实施例中所示,对于位点特异性基因编辑,编辑核酸酶通常会在靶向基因组序列中生成DNA断裂(例如,单链或双链DNA断裂),从而使与靶向基因组序列具有同源性的供体多核苷酸(例如,本文所述的构建体)用作DNA断裂修复的模板,导致将供体多核苷酸引入基因组位点。
基因编辑技术在本领域中是众所周知的。对于CRISPR基因编辑技术,参见例如,美国专利8,697,359、8,771,945、8,795,965、8,865,406、8,871,445、8,889,356、8,895,308、8,906,616、8,932,814、8,945,839、8,993,233、8,999,641、9,790,490、10,000,772、10,113,167和10,113,167。对于ZFN技术及其在编辑T细胞和干细胞中的应用,参见例如,美国专利8,735,153、8,771,985、8,772,008、8,772,453、8,921,112、8,936,936、8,945,868、8,956,828、9,234,187、9,234,188、9,238,803、9,394,545、9,428,756、9,567,609、9,597,357、9,616,090、9,717,759、9,757,420、9,765,360、9,834,787、9,957,526、10,072,062、10,081,661、10,117,899、10,155,011和10,260,062。上述专利的公开内容通过整体引用并入本文。
在基因编辑技术中,可以通过改变复合物的DNA结合特异性来定制基因编辑复合物以靶向特定的基因组位点。例如,在CRISPR技术中,可以设计引导RNA序列来结合特定的基因组区域;在ZFN技术中,可以将ZFN的锌指蛋白结构域设计成具有对特定基因组区域特异的锌指,使得ZFN的核酸酶或切口酶结构域可以位点特异性地切割基因组DNA。根据期望的基因组靶标位点,可以相应地设计基因编辑复合体。
基因编辑复合物的组分可以通过众所周知的方法如电穿孔、脂质体转染、显微注射、基因枪、病毒体、脂质体、脂质纳米颗粒、免疫脂质体、聚阳离子或脂质体:核酸缀合物、裸露的DNA或mRNA、以及人工病毒体,与转基因构建体同时或依次递送到靶细胞中。使用例如Sonitron 2000系统(Rich-Mar)的声孔作用也可用于递送核酸。在特定实施方案中,基因编辑复合物的一种或多种组分,包括核酸酶或切口酶,作为mRNA递送到待编辑的细胞中。
4.Treg的抗原特异性
在一些实施方案中,干细胞或祖细胞可以被进一步工程改造(例如,使用本文所述的基因编辑方法)以包括编码抗原识别受体如TCR或CAR的转基因。替代性地,干细胞或祖细胞是从已经重排了它们的TCRα/β(或δ/γ)基因座的成熟的Treg重编程的细胞,并且从此类干细胞或祖细胞重新分化的Treg将保留它们祖先Treg的抗原特异性。在任何情况下,Treg都可以根据它们对特定治疗目标感兴趣的抗原的特异性来选择。
在一些实施方案中,感兴趣的抗原是多态性同种异体MHC分子,例如由实体器官移植中的细胞或基于细胞的疗法(例如,骨髓移植、癌症CAR T疗法或基于细胞的再生疗法)中的细胞表达的分子。如此靶向的MHC分子包括但不限于HLA-A、HLA-B或HLA-C;HLA-DP、HLA-DM、HLA-DOA、HLA-DOB、HLA-DQ或HLA-DR。例如,感兴趣的抗原是I类分子HLA-A2。HLA-A2是移植中常见的组织相容性错配抗原。HLA-A错配与移植后的不良结果有关。表达对MHC I类分子特异的CAR的工程化Treg是有利的,因为MHC I类分子在所有组织上广泛表达,因此无论移植的组织类型如何,Treg都可以用于器官移植。针对HLA-A2的Treg提供了额外的优势,即HLA-A2由相当大比例的人群表达,因此在许多供体器官上表达。已有证据表明,HLA-A2 CAR在Treg细胞中的表达可以增强Treg细胞预防移植排斥的效力(参见例如,Boardman,同上;MacDonald等人,J Clin Invest.(2016)126(4):1413-24;以及Dawson,同上)。
在一些实施方案中,感兴趣的抗原是自身抗原,即在机体特定组织中的自身免疫性炎症部位普遍或独特表达的内源性抗原。对此种抗原具有特异性的Treg可以归巢于发炎组织并通过引起局部免疫抑制发挥组织特异性活性。自身抗原的实例是水通道蛋白水通道(例如,水通道蛋白-4水通道)、癌旁抗原Ma2、双载蛋白、电压门控钾通道、N-甲基-d-天冬氨酸受体(NMDAR)、a-氨基-3-羟基-5-甲基-4-异恶唑丙酸受体(AMPAR)、甲状腺过氧化物酶、甲状腺球蛋白、抗-N-甲基-D-天冬氨酸受体(NR1亚基)、Rh血型抗原、桥粒芯糖蛋白1或3(Dsg1/3)、BP180、BP230、乙酰胆碱烟碱突触后受体、促甲状腺激素受体、血小板整合素、糖蛋白IIb/IIIa、钙蛋白酶抑制素、瓜氨酸化蛋白、α-β-晶状体蛋白、胃壁细胞内在因子、磷脂酶A2受体1(PLA2R1)和含有7A结构域的血小板反应蛋白1型(THSD7A)。自身抗原的其他实例是多发性硬化相关抗原(例如,髓鞘碱性蛋白(MBP)、髓鞘相关糖蛋白(MAG)、髓鞘少突胶质细胞糖蛋白(MOG)、蛋白脂质蛋白(PLP)、少突胶质细胞髓鞘寡聚蛋白(OMGP)、髓鞘相关少突胶质细胞碱性蛋白(MOBP)、少突胶质细胞特异性蛋白(OSP/密蛋白11)、少突胶质细胞特异性蛋白(OSP)、髓鞘相关神经突生长抑制剂NOGO A、糖蛋白Po、外周髓鞘蛋白22(PMP22)、2’3’-环核苷酸3’-磷酸二酯酶(CNPase)及其片段;关节相关抗原(例如,瓜氨酸取代的环状和线性聚丝蛋白肽、II型胶原蛋白肽、人软骨糖蛋白39肽、角蛋白、波形蛋白、纤维蛋白原和I、III、IV和V型胶原蛋白肽);和眼相关抗原(例如,视网膜抑制蛋白、S-抑制蛋白、光感受器间类视黄醇结合蛋白、β-晶状体蛋白BI、视网膜蛋白、脉络膜蛋白及其片段)。在一些实施方案中,Treg细胞靶向的自身抗原是IL23-R(用于治疗例如克罗恩氏病、炎性肠病或类风湿性关节炎)、MOG(用于治疗多发性硬化)或MBP(用于治疗多发性硬化)。在一些实施方案中,Treg可以靶向其他感兴趣的抗原(例如,B细胞标志物CD19和CD20)。
在一些实施方案中,识别外来肽(例如,CMV、EBV和HSV)而不是同种异体抗原的Treg可用于同种异体过继细胞转移环境,而没有通过识别同种异体抗原而不断被激活的风险,而不需要用于敲除TCR表达。
5.额外的基因组编辑
本工程化细胞可以在上述基因组编辑之前或之后进一步进行基因工程改造,以使细胞更有效、更适用于更大的患者群体和/或更安全。基因工程改造可以通过例如随机插入感兴趣的异源序列(例如,通过使用慢病毒载体、逆转录病毒载体或转座子)或靶向基因组整合(例如,通过使用由ZFN、TALEN、CRISPR、位点特异性工程重组酶或大范围核酸酶介导的基因组编辑)。
例如,可以将细胞工程化以通过将CAR或TCR转基因位点特异性整合到细胞基因组中来表达一种或多种外源CAR或TCR。如上所述,外源性CAR或TCR可以靶向感兴趣的抗原。
还可以编辑细胞以编码一种或多种治疗剂以促进Treg的免疫抑制活性。治疗剂的实例包括细胞因子(例如,IL-10)、趋化因子(例如,CCR7)、生长因子(例如,用于治疗多发性硬化的髓鞘再生因子)和信号传导因子(例如,双调蛋白)。
在另外的实施方案中,细胞被进一步工程化以表达减少细胞疗法的严重副作用和/或毒性(如细胞因子释放综合征(CRS)和/或神经毒性)的因子(例如,抗IL-6scFv或可分泌的IL-12)(参见例如,Chmielewski等人,Immunol Rev.(2014)257(1):83-90)。
在一些实施方案中,EZH1信号传导在工程化细胞中被破坏以增强它们的淋巴定型(参见例如,Vo等人,Nature(2018)553(7689):506-10)。
在一些实施方案中,编辑的细胞可以是患者的同种异体细胞。在此情况下,可以进一步工程改造细胞以减少宿主对这些细胞的排斥(移植物排斥)和/或这些细胞对宿主的潜在攻击(移植物抗宿主病)。进一步工程化的同种异体细胞特别有用,因为它们可以用于多个患者而没有相容性问题。因此,同种异体细胞可以称为“通用”并且可以“非定制”使用。“通用”细胞的使用大大提高了效率并降低了采用细胞疗法的成本。
为了生成“通用”同种异体细胞,可以对细胞进行工程改造,例如,使其具有以下一种或多种的无效基因型:(i)T细胞受体(TCRα链或β链);(ii)多态性主要组织相容性复合体(MHC)I类或II类分子(例如HLA-A、HLA-B或HLA-C;HLA-DP、HLA-DM、HLA-DOA、HLA-DOB、HLA-DQ、或HLA-DR;或β2-微球蛋白(B2M));(iii)与抗原加工相关的转运蛋白(例如,TAP-1或TAP-2);(iv)II类MHC反式激活因子(CIITA);(v)次要组织相容性抗原(MiHA;例如,HA-1/A2、HA-2、HA-3、HA-8、HB-1H或HB-1Y);(vi)免疫检查点抑制剂如PD-1、CTLA-4;(vii)VIM;和(vi)其任何组合。
同种异体工程化细胞也可以表达不变的HLA或CD47,以增加工程化细胞(尤其是HLAI类敲除或敲低的细胞)对宿主的自然杀伤细胞和其他参与抗移植物排斥反应的免疫细胞的抵抗力。例如,携带定型因子转基因的异源序列可以另外包含不变HLA(例如,HLA-G、HLA-E和HLA-F)或CD47的编码序列。不变的HLA或CD47编码序列可以通过自切割肽的编码序列或IRES序列连接到异源序列中的原代转基因。
6.工程化细胞中的安全开关
在细胞疗法中,对于移植的细胞可以期望在其基因组中含有“安全开关”,使得当患者不再期望它们的存在时,可以停止细胞的增殖(参见例如,Hartmann等人,EMBO MolMed.(2017)9:1183-97)。例如,安全开关可以是自杀基因,其在向患者施用药物化合物时将被激活或失活,从而使细胞进入凋亡。自杀基因可以编码在人体中不存在的酶(例如,细菌酶或病毒酶),该酶在人细胞中将无害物质转化为有毒代谢物。
在一些实施方案中,自杀基因可以是来自单纯疱疹病毒(HSV)的胸苷激酶(TK)基因。TK可以将更昔洛韦、缬更昔洛韦、泛昔洛韦或其他类似的抗病毒药物代谢成干扰DNA复制并导致细胞凋亡的有毒化合物。因此,宿主细胞中的HSV-TK基因可以通过向患者施用此类抗病毒药物之一来发动以杀伤细胞。
在其他实施方案中,自杀基因编码例如另一种胸苷激酶、胞嘧啶脱氨酶(或尿嘧啶磷酸核糖基转移酶;其将抗真菌药物5-氟胞嘧啶转化为5-氟尿嘧啶)、硝基还原酶(其将CB1954(对于[5-(氮丙啶-1-基)-2,4-二硝基苯甲酰胺])转化为有毒化合物)、4-羟胺和细胞色素P450(其将异环磷酰胺转化为丙烯醛(氮芥))(Rouanet等人,Int J Mol Sci.(2017)18(6):E1231)、或诱导型caspase-9(Jones等人,Front Pharmacol.(2014)5:254)。在另外的实施方案中,自杀基因可以编码细胞内抗体、端粒酶、另一种半胱天冬酶或DNA酶。参见例如,Zarogoulidis等人,J Genet Syndr Gene Ther.(2013)doi:10.4172/2157-7412.1000139。
安全开关也可以是“开启”或“加速器”开关、编码小干扰RNA、shRNA的基因或干扰对细胞存活至关重要的细胞蛋白表达的反义基因。
安全开关可以利用任何合适的哺乳动物序列和其他必需的转录调节序列。可以使用本文所述的基因编辑技术或本领域已知的其他技术通过随机整合或位点特异性整合将安全开关引入细胞。可以期望将安全开关整合到基因组安全港中,以维持工程化细胞的遗传稳定性和临床安全性。本公开中使用的安全港的实例是AAVS1基因座;ROSA26基因座;CLYBL基因座;针对白蛋白、CCR5和CXCR4的基因座;以及工程化细胞中内源基因被敲除的基因座(例如,T细胞受体α或β链基因座、HLA基因座、CIITA基因座或β2-微球蛋白基因座)。
III.Teff和Treg细胞的用途
本公开的Teff和Treg细胞可用于细胞疗法以治疗需要诱导免疫耐受或恢复免疫稳态的患者(例如,人患者)。术语“治疗”和“处理”是指减轻或消除所治疗病况的一种或多种症状、预防症状的发生或复发、组织损伤的逆转或补救和/或疾病进展的减缓。
本文中的患者可以是患有或有风险患有非期望的炎性病症如自身免疫性疾病的患者。自身免疫性疾病的实例有艾迪森氏病、艾滋病、强直性脊柱炎、抗肾小球基底膜病、自身免疫性肝炎、皮炎、古德帕斯综合征、肉芽肿性多血管炎、格雷夫斯病、格林-巴利综合征、桥本氏甲状腺炎、溶血性贫血、过敏性紫癜(HSP)、幼年型关节炎、幼年型肌炎、川崎病、炎症性肠病(如克罗恩病和溃疡性结肠炎)、多肌炎、肺泡蛋白沉积症、多发性硬化、重症肌无力、视神经脊髓炎、PANDAS、银屑病、银屑病关节炎、类风湿性关节炎、干燥综合征、系统性硬皮病、系统性硬化症、系统性红斑狼疮、血小板减少性紫癜(TTP)、I型糖尿病、葡萄膜炎、血管炎、白癜风和原田病。
在一些实施方案中,Treg表达抗原结合受体(例如,TCR或CAR),抗原结合受体靶向与自身免疫性疾病相关的自身抗原,如髓鞘少突胶质细胞糖蛋白(多发性硬化)、髓鞘蛋白零(自身免疫性周围神经病)、HIV env或gag蛋白(AIDS)、髓鞘碱性蛋白(多发性硬化)、CD37(系统性红斑狼疮)、CD20(B细胞介导的自身免疫性疾病)和IL-23R(炎症性肠病,如克罗恩病或溃疡性结肠炎)。
本文中的患者可以是需要同种异体移植,如同种异体组织或实体器官移植或同种异体细胞疗法的患者。可以将本公开的Treg,例如那些表达靶向一种或多种同种异体MHC I类或II类分子的CAR的Treg引入患者,其中Treg将归巢于移植物并抑制由宿主免疫系统引起的同种异体移植物排斥反应和/或移植物抗宿主排斥。需要组织或器官移植或同种异体细胞疗法的患者包括需要例如肾移植、心脏移植、肝移植、胰腺移植、肠移植、静脉移植、骨髓移植和植皮的患者;需要再生细胞疗法的患者;需要基因疗法(基于AAV的基因疗法)的患者;以及那些需要癌症CAR T疗法的患者。
如果期望,在引入细胞移植物之前用温和的淋巴细胞清除程序或用剧烈的清髓性预处理方案治疗接受本文工程化Treg的患者(包括接受将在体内分化成Treg的工程化多能或专能细胞的患者)。
在一些实施方案中,本发明的Teff被工程化以表达抗原受体,如修饰或未修饰的TCR,或嵌合抗原受体。抗原受体靶向感兴趣的抗原。Teff可以增加炎症应答并促进其他免疫细胞(例如,NK细胞或CTL)杀伤有害细胞的活性。有害细胞可以是例如:肿瘤学环境中的肿瘤细胞;在传染病环境中被病毒或其他病原体感染的细胞;在自身免疫或炎症环境中产生自身抗体的B细胞或自身反应性细胞;和过敏环境中的致病性过敏原反应细胞。在一些实施方案中,Teff细胞可用于患有缺陷CD4+区室(例如,AIDS)的患者的细胞替代疗法。
本公开的工程化细胞可以在含有细胞和药学上可接受的载剂的药物组合物中提供。例如,该药物组合物包括无菌水、生理盐水或中性缓冲盐水(例如,磷酸盐缓冲盐水)、盐、抗生素、等渗剂和其他赋形剂(例如,葡萄糖、甘露糖、蔗糖、葡聚糖、甘露醇;蛋白质(例如,人血清白蛋白);氨基酸(例如,甘氨酸和精氨酸);抗氧化剂(例如,谷胱甘肽);螯合剂(例如,EDTA);和防腐剂)。药物组合物可以另外包含支持Treg表型和生长的因子(例如,IL-2和雷帕霉素或其衍生物)、抗炎细胞因子(例如,IL-10、TGF-β和IL-35)、和其他用于细胞疗法的细胞(例如,用于癌症疗法的CAR T效应细胞或用于再生疗法的细胞)。为了储存和运输,可以任选地冷冻保存细胞。使用前,可以将细胞解冻并稀释在药学上可接受的载剂中。
本公开的药物组合物以治疗有效量通过全身施用(例如,通过静脉内注射或输注)或局部注射或输注至感兴趣组织(例如,通过肝动脉输注,和注射到大脑、心脏或肌肉)施用至患者。术语“治疗有效量”是指药物组合物的量或细胞数,当施用于患者时足以实现治疗。
在一些实施方案中,药物组合物的单个剂量单位包含超过104个细胞(例如,约105至约106个细胞、约106至约1010个、约106至107个、约106至108个、约107至108个、约107至109个、或约108至109个细胞)。在某些实施方案中,组合物的单一剂量单位包含约106、约107、约108、约109或约1010或更多个细胞。可以每两天一次、每三天一次、每四天一次、每周一次、每两周一次、每三周一次、每月一次或以建立患者体内足够数量的工程化Treg细胞群所需的另一频率向患者施用药物组合物。
还提供了包含本文所述的任何锌指核酸酶或其他核酸酶和多核苷酸的药物组合物。
除非本文另有定义,否则与本公开结合使用的科学和技术术语应具有本领域普通技术人员通常理解的含义。下文描述了示例性方法和材料,尽管与本文描述的那些相似或等效的方法和材料也可以用于本公开的实践或测试。在冲突的情况下,以本说明书包括定义为准。一般而言,本文所述的免疫学、医学、药物和药物化学以及细胞生物学所使用的命名法和技术是本领域公知和常用的那些。酶促反应和纯化技术如本领域中常见的或如本文所述,根据制造商的说明书进行。此外,除非上下文另有要求,否则单数术语应包括复数,复数术语应包括单数。在整个说明书和实施方案中,词语“具有”和“包含”或诸如“有”、“拥有”、“包括”或“含有”的变体将被理解为意味着包括所述整数或整数组,但不排除任何其他整数或整数组。本文提及的所有出版物和其他参考文献通过整体引用并入。尽管本文引用了许多文献,但该引用并不应该被视为承认这些文献中的任何一个构成本领域普通常识的一部分。如本文所用,用于一个或多个感兴趣值的术语“约”或“大约”是指与所述参考值相似的值。在某些实施方案中,该术语是指在所述参考值的任一方向上(大于或小于)落入10%、9%、8%、7%、6%、5%、4%、3%、2%、1%或更小范围内的值,除非另有说明或从上下文中明显看出。
为使本发明得到更好的理解,阐述了以下实施例。这些实施例仅用于说明的目的,不应解释为以任何方式限制本发明的范围。
实施例
实施例1:TiPSC系的无饲养层衍生
该实施例描述了iPSC细胞系通过使用重编程因子从T细胞(TiPSC系)衍生的过程。在此过程中,iPSC衍生自冷冻保存的CD4+和CD8+T细胞的混合群体,这些细胞是先前从健康人类供体的白细胞分离群(AllCells,美国)中分离出来的。将细胞解冻并在补充有100U/mLIL-2的RPMI+10%人AB血清(huABS)中培养。用CD3/CD28免疫磁珠以1:1(细胞:珠)的比例激活细胞。激活的细胞以106个细胞/mL的密度铺板,并在37℃、5% CO2条件下培养过夜。
过夜培养后,对细胞进行染色并分选总CD4+T细胞、总CD8+T细胞和幼稚Treg(CD4+CD25高CD127低CD45RA+)。分选后,CD4+和CD8+T细胞在RPMI+10%huABS+100U/mL IL-2中恢复,并且幼稚Treg在RPMI+10%huABS+1000U/mL IL-2中恢复过夜。
第二天,按照制造商的说明,使用Cytotune-iPS 2.0仙台重编程试剂盒(ThermoFisher,美国)对分选的T细胞进行重编程。来自每个分选群体的大约0.5x106个细胞通过携带重编程因子(Oct3/4、Sox2、Klf4和c-Myc)的仙台病毒(SeV)旋转感染转导,并在不去除病毒的情况下铺板到它们各自的培养基中。
感染一天后,收获细胞并铺板到ReproTeSR(StemCell Technologies,加拿大)中的基质胶上。每1-2天将ReproTeSR添加到孔中,直到第7天移除培养基。第7天后,每天进行培养基的更换。重编程后大约2-3周,根据形态学手动挑选iPSC集落。人工传代集落直至形态稳定,然后在mTeSR培养基(StemCell Technologies)中再扩增数周。
实施例2:iPSC向造血干细胞和祖细胞的分化
该实施例描述了iPSC在组织培养中分化为造血干细胞和祖细胞(HSPC)的过程。该过程在图1中说明。
在此过程中,起始iPSC在存在10ng/mL BMP4、10ng/mL VEGF、50ng/mL SCF、10ng/mL bFGF和10μM ROCK抑制剂(Y-27632二盐酸盐)的情况下在第0天铺板在APEL2培养基(StemCell Technologies)中。将细胞短暂离心以增强EB形成。
在EB形成后的第1天或第2天,通过用含有20ng/mL VEGF、10ng/mL bFGF、100ng/mLSCF、20ng/mL Flt-3、20ng/mL TPO和40ng/mL IL-3的APEL2培养基替换所有孔中的培养基来进行完全的培养基更换。每2至3天更换一次培养基,直至第8天。
在第8天,通过用补充有非必需氨基酸、GlutaMAXTM和0.1mMβ-巯基乙醇并含有100ng/mL SCF、20ng/mL Flt-3、20ng/mL TPO和40ng/mL IL-3的完全StemPro-34培养基(Thermo Fisher,美国)替换培养基来进行完全的培养基更换。每2至3天更换一次培养基,持续6至7天。
在完全分化的第14天或第15天,收集HSPC并通过细胞过滤器过滤,以将EB与压出的HSPC分离。
实施例3:iPSC-HSPC向CD4sp T细胞和Treg的分化
该实施例描述了iPSC衍生的HSPC(iPSC-HSPC)分化为CD4sp T细胞和Treg的过程。该过程在图1和图2中说明。
在此过程中,将iPSC-HSPC以1x104–5x104细胞/mL(第14天)的密度铺板在StemSpanTM淋巴祖细胞扩增培养基(StemCell Technologies)中的预包被有淋巴分化包被材料的组织培养处理的板上。按照制造商的说明,在第17或18天、第21天和第24或25天喂养细胞,直到第28天以生成淋巴祖细胞(T细胞前体)。
在第28天,收获淋巴祖细胞并以0.2x106个细胞/mL的密度铺板到在StemSpanTMT细胞祖细胞成熟培养基中的包被有淋巴分化包被材料的新鲜板上。每3或4天喂养细胞,直至第35天或第42天。
为生成CD4sp T细胞,在第35天或第42天,用0.00625ng/μL至0.1ng/μL佛波醇12-十四酸酯13-乙酸酯(PMA)和0.125ng/μL至2ng/μL离子霉素(I)(0.125X–2X PMAI)处理细胞以生成CD4sp T细胞。处理后24小时,通过使用StemSpanTMT细胞祖细胞成熟培养基进行完全培养基更换,从培养物中去除PMAI。经处理的细胞每3-4天喂养一次,再持续7天。PMAI处理的iPSC衍生的CD4sp T细胞也接受链霉蛋白酶处理以确定对CD4谱系的定型。细胞在培养基中以渐增百分比至最高0.1%的链霉蛋白酶进行处理,并在4℃下孵育以防止CD4再表达,或在37℃下孵育以允许再表达。CD4和CD8表达的平均荧光强度(MFI)在处理后一天和两天通过流式细胞术检测。数据显示,CD4sp T细胞能够在链霉蛋白酶处理后再表达CD4和CD8,证明这些细胞在链霉蛋白酶处理之前已定型为谱系(图5)。
为生成iPSC衍生的Treg,根据制造商的说明,CD4sp T细胞在第43天或第50天用含有人重组TGF-β1、全反式维甲酸(ATRA)和IL-2的ImmunocultTM人Treg分化补充剂(StemCellTechnologies)处理(每49mL培养基添加1mL补充剂)。在TGF-β1和ATRA处理当天,细胞也被人CD3/CD28/CD2 T细胞激活剂(StemCell Technologies)(12.5μL/mL)激活。接下来的7天,细胞每3-4天喂养一次。
衍生自iPSC的Treg也通过用ImmunoCultTM人Treg分化补充剂(StemCellTechnologies)(每49mL培养基1mL补充剂)处理CD4sp T细胞生成,用人CD3/CD28/CD2 T细胞激活剂(StemCell Technologies)(12.5μL/mL)激活,并在StemSpanTMT细胞祖细胞成熟培养基和T细胞特异性培养基(OpTmizerTM、ImmunoCultTM或X-VIVOTM15)的50%混合物中补充IL-2。接下来的7天,细胞每3-4天喂养一次。
TGF-β1和ATRA第一次处理后七天,用补充有10U/mL-1000U/mL IL-2的12.5μL/mL–50μL/mL的CD3/CD28/CD2 T细胞激活剂刺激细胞,并用于下游功能或表征测定。
流式细胞术分析证明了PMAI在发育过程中的两个时间点将双阳性T细胞分化为CD4sp细胞的能力:在第35天(图3)或第42天(图4)添加PMAI。PMAI以不同浓度添加,与更高浓度的PMAI相比,更低浓度(0.125X至0.25X)产生更高百分比的CD4sp细胞。PMAI处理的CD4+CD8-细胞(所有图中的Q7)表达ThPOK但不表达FOXP3(所有图中的Q9)。细胞还表达CD3和TCRαβ。未用PMAI处理的双阳性细胞基本上保持双阳性,并且CD4+CD8-细胞不表达ThPOK。
进一步分析了CD4sp T细胞的身份和功能。流式细胞术分析显示在用TGF-β1、ATRA、IL-2和CD3/CD28/CD2 T细胞激活剂处理的PMAI诱导的CD4sp T细胞(在第35天或第42天添加PMAI)中激活的Treg标志物的表达。在分化第35天添加到双阳性细胞的较低浓度PMAI(0.125X和0.25X)下可以观察到FOXP3(图6A),但在分化第42天添加的所有浓度的PMAI下FOXP3均高度表达(图6B)。这些细胞还表达Helios和CTLA-4,但不表达LAP或GARP。尽管经过TGF-β1和ATRA处理,但未用PMAI处理的细胞几乎不表达FOXP3、CTLA-4、GARP和LAP。这些细胞上也表达Helios。
PMAI诱导和TGF-β1处理的iPSC-Treg的进一步表征也显示CD4sp群体中CD25的表达和CD127的极少表达或无表达。在CD25+群体中,大多数细胞(75%)是FOXP3+。CD25+群体内的进一步子门控显示,高表达CD25(CD25高)的细胞超过90% FOXP3+,而表达低/中等水平CD25(CD25低)的细胞含有FOXP3+和FOXP3-细胞的混合物(图9)。
流式细胞术分析进一步显示了Treg标志物在激活的PMAI诱导的和TGF-β1处理的CD4sp T细胞(iPSC-Treg)中的表达。数据显示FOXP3和CTLA-4在这些细胞上高表达,而Helios和LAP分别以中等和低水平表达(图7)。仅在0.125X、0.25X和0.5X PMAI浓度下观察到中等但不同的GARP+细胞群。未经PMAI处理的细胞不会高度表达这些标志物。
流式细胞术分析还显示0.125X PMAI和TGF-β1处理的iPSC-Treg对应答T细胞增殖的抑制能力。随着应答T细胞数量的增加,iPSC-Treg可以将它们的增殖抑制在15%-21%之间(图8)。未用PMAI处理但用TGF-β1和ATRA处理的细胞不会抑制T应答细胞增殖,并且似乎会刺激靶细胞增殖。
PMAI和TGF-β1处理的iPSC-Treg含有不纯的细胞群。因此,对细胞进行分选以去除不需要的细胞群(CD8单阳性、CD4和CD8双阳性以及CD4和CD8双阴性细胞)以获得主要为CD4单阳性、CD25阳性、CD127阴性/低和FOXP3阳性的细胞群。CD25高分选细胞含有超过90%的FOXP3+细胞,并且CD25低分选细胞含有FOXP3阳性和阴性细胞的混合物。这些数据表明,对CD25的荧光强度进行门控可以产生期望的FOXP3+细胞群(图9和10)。
这些分选的细胞被激活以表达通过流式细胞术确定的激活的Treg的标志物。与未激活的细胞相比,CD25高刺激的细胞在激活后显示出升高的CTLA-4水平以及适度增加的Helios和LAP。FOXP3表达水平在激活前后保持相似。CD25高刺激的细胞还表现出CD69和GARP表达的增加以及Treg标志物(CD4+CD25+FOXP3+)的保留。CD25低刺激的细胞也表现出增加的CTLA-4表达以及激活后Helios和LAP表达的适度增加;然而,即便激活,FOXP3水平仍远低于CD25高细胞(<18%)。CD25低刺激的细胞在激活后也表达CD69和GARP(图11和12)。
分选的细胞还显示出抑制T细胞增殖的能力。在应答T细胞与iPSC-Treg的比例相等的情况下,CD25高和CD25低iPSC-Treg在激活后可分别抑制应答T细胞增殖66%-49%和54%-38%。然而,PMAI诱导的CD4sp细胞未显示对应答T细胞增殖的抑制作用(图13)。
对来自PMAI诱导和刺激的TGF-β1和ATRA处理的iPSC-Treg的基因组DNA进行了FOXP3 Treg特异性去甲基化区域(TSDR)去甲基化分析。这些细胞在较低浓度的PMAI下表现出去甲基化的增加。未被PMAI诱导但仅用TGF-β1和ATRA刺激和处理的细胞在FOXP3 TSDR处几乎没有显示去甲基化(图14,A组)。来自原代Treg的基因组DNA显示超过80%的去甲基化,而原代Tresp和0.125X PMAI诱导的T细胞在TSDR处没有高度甲基化(图14,B组)。通过流式细胞术对FOXP3表达的分析表明,较高水平的FOXP3与较高百分比的FOXP3 TSDR去甲基化相关。此外,用较低水平的PMAI处理的细胞在刺激和TGF-β1和ATRA处理后生成更多的FOXP3+细胞(图14,C组)。
FOXP3 TSDR去甲基化在去除死细胞后增加(Ficoll前体积与Ficoll后体积),并在通过靶向CD25+CD4+CD127低细胞的免疫磁性分离富集Treg后进一步增强。流经或非靶标群体还含有TSDR去甲基化细胞,这些细胞可能无法有效分离或可以表明CD8 Treg的存在。原代Treg是高度TSDR去甲基化的,而Tresp细胞是高度甲基化的(图15,A组)。通过流式细胞术对FOXP3表达的分析表明,较高水平的FOXP3与较高百分比的FOXP3 TSDR去甲基化相关(图15,B组)。
将iPSC-Treg分选为CD25高和CD25低群体进一步揭示了两个群体之间的差异。与CD25低分选的iPSC-Treg(约14%)相比,CD25高分选的iPSC-Treg在FOXP3 TSDR处高度去甲基化(>90%)。原代Treg也高度去甲基化,而原代T应答细胞在FOXP3 TSDR处高度甲基化(图16)。
评估了常用的T细胞刺激试剂从iPSC衍生的DP T细胞生成CD4sp T细胞的能力。结合CD3和CD28或者CD3、CD28和CD2(StemCell Technologies)的可溶性四聚体抗体复合物与CD3/CD28免疫磁珠(Thermo Fisher)(与抗CD3和抗CD28抗体偶联的磁珠)一起进行了测试。未经PMAI处理或经0.125X PMAI处理的细胞用作对照。在用各种试剂刺激后八天,只有0.125X PMAI处理的细胞能够生成不同的但也是ThPOK+的CD4sp细胞群(图17A)。然后用TGF-β1和ATRA处理受刺激的细胞。仅用PMAI刺激的细胞生成也表达ThPOK和FOXP3的CD4sp细胞(图17B)。此外,仅用PMAI刺激的细胞生成了CD25高CD127低CD45RA+FOXP3+的幼稚Treg(图17C)。
还评估了0.004X PMA和0.2X离子霉素的组合促进CD4sp T细胞生成的能力(图18)。这种浓度的PMAI生成了大约33%的CD4sp T细胞,而0.125XPMAI生成了大约74%的CD4sp T细胞。0.125X PMAI诱导的CD4sp T细胞几乎都是ThPOK+,相比之下0.004X PMA和0.2X离子霉素诱导的CD4sp T细胞只有大约77%阳性。将TGF-β1和ATRA添加到0.004X PMA和0.2X离子霉素诱导的细胞中,可将细胞转化为CD8+和DP T细胞。向0.125X诱导的PMAI添加TGF-β1和ATRA保留了80% ThPOK+FOXP3+的CD4sp T细胞群。
实施例4:将转基因整合到iPSC的AAVS1基因座
该实施例描述了其中绿色荧光蛋白表达盒被整合到AAVS1基因座中的实验,如图21所示。第-7天,经由电穿孔将AAVS1 ZFN mRNA和供体质粒递送到iPSC中。一周后(第0天),将嘌呤霉素(0.3μg/mL)添加到组织培养物中,以开始对已进行靶向整合的细胞进行阳性选择。在第15天添加多西环素,并以3种不同剂量(0.3、1和3μg/mL)维持在培养物中,以诱导dox诱导型GFP表达盒的表达。对照细胞在培养物中不添加多西环素。细胞在多西环素存在下维持13天。在此期间,3μg/mL剂量的多西环素产生最高水平的诱导型GFP转基因表达(94%;图22)。当培养物中存在多西环素时,这种高水平的表达得以维持。从第15天至第28天,细胞在嘌呤霉素和多西环素中维持,并进一步进行阳性选择(通过靶向整合,等位基因从约50%增加到约70%)。
实施例5:iPSC向CD4+Treg谱系的倾斜分化
为了使iPSC倾斜分化为CD4+T细胞并最终成为Treg细胞,使用靶向IL-7受体α亚基(IL-7Ra)的抗体阻断干细胞通过IL-7受体的信号传导。在T细胞发育的后期阶段,将抗IL-7Ra抗体以渐增浓度添加到细胞培养基中。两次重复实验(Expt.1和Expt.2)均表明添加抗IL-7Ra抗体可增加CD4+单阳性细胞(右下象限)的百分比,与未处理细胞的2.81%或4.78%相比,达到6.9%(Expt.1)或7.7%(Expt#2),同时降低了CD8+单阳性细胞(左上象限)的百分比(图27)。
Claims (40)
1.获得富含CD4单阳性T细胞的细胞群的方法,所述方法包括:
提供CD4+CD8+T细胞的起始群体,
在包含佛波醇12-十四酸酯13-乙酸酯(PMA)和离子霉素的培养基中培养所述细胞的起始群体,从而获得富含CD4单阳性T细胞的细胞群。
2.权利要求1的方法,其中所述培养基含有0.00625μg/ml至0.1μg/ml PMA和0.125μg/ml至2μg/ml离子霉素。
3.权利要求1或2的方法,其中PMA与离子霉素的重量比为1:10至1:1000,任选地为1:20。
4.权利要求3的方法,其中所述培养基包含0.00625μg/ml PMA和0.125μg/ml离子霉素。
5.权利要求1-4中任一项的方法,其中所述细胞在所述培养基中培养约一至五天。
6.权利要求1-5中任一项的方法,其中所述CD4单阳性T细胞是未成熟的CD4+T细胞,任选地其中所述T细胞表达ThPOK。
7.权利要求6的方法,其中所述未成熟CD4+T细胞是效应T(Teff)细胞,任选地其中所述Teff细胞是CD25低。
8.权利要求1-6中任一项的方法,其进一步包括
在包含TGF-β和全反式视黄酸(ATRA)的第二培养基中培养所述CD4单阳性T细胞,从而获得富含CD4+调节性T(Treg)细胞的细胞群。
9.权利要求8的方法,其中所述第二培养基还包含IL-2、抗CD2抗体、抗CD3抗体和抗CD28抗体。
10.权利要求8的方法,其中所述第二培养基包含T细胞特异性培养基,以及TGF-β、ATRA、IL-2、抗CD2抗体、抗CD3抗体和抗CD28抗体中的一种或多种。
11.权利要求8-10中任一项的方法,其中所述CD4单阳性T细胞在所述第二培养基中培养约5-10天。
12.权利要求1-11中任一项的方法,其进一步包括通过荧光激活细胞分选(FACS)或磁激活细胞分选(MACS)从组织培养物中分离所述CD4单阳性Teff或Treg细胞。
13.权利要求1-11中任一项的方法,其进一步包括通过荧光激活细胞分选(FACS)从组织培养物中分离所述CD4单阳性Teff或CD4+CD25+CD127低Treg细胞。
14.权利要求1-11中任一项的方法,其进一步包括通过FACS从组织培养物中分离CD4+CD25高CD127低和CD4+CD25低CD127低Treg细胞。
15.权利要求1-14中任一项的方法,其中所述CD4+CD8+T细胞的起始群体衍生自人诱导多能干细胞(iPSC)。
16.权利要求15的方法,其中所述iPSC从T细胞重编程。
17.权利要求15或16的方法,其中所述iPSC在基因组中包含异源序列,
其中所述异源序列包含编码谱系定型因子的转基因,并且
其中所述谱系定型因子
(i)促进所述iPSC分化为CD4+Teff细胞或
(ii)促进所述iPSC分化为CD4+Treg细胞和/或促进所述CD4+Treg细胞表型的维持。
18.权利要求17的方法,其中所述异源序列被整合到T细胞特异性基因座中,使得所述转基因的表达处于所述基因座中转录调控元件的控制之下。
19.权利要求17或18的方法,其中所述转基因包含额外多肽的编码序列,其中所述谱系定型因子的编码序列和所述额外多肽的编码序列由自切割肽的框内编码序列或内部核糖体进入位点(IRES)分隔。
20.权利要求19的方法,其中所述额外多肽是另一种谱系定型因子、治疗性蛋白质或嵌合抗原受体。
21.权利要求17-20中任一项的方法,其中所述异源序列被整合到所述T细胞特异性基因座的外显子中,并且包含:
紧邻所述转基因上游的内部核糖体进入位点(IRES);或者
紧邻所述转基因上游并与所述转基因同框的自切割肽的第二编码序列。
22.权利要求21的方法,其中所述异源序列进一步包含紧邻所述IRES或所述自切割肽的第二编码序列上游的核苷酸序列,所述核苷酸序列包含所述整合位点下游的T细胞特异性基因座的所有外显子序列,使得所述T细胞特异性基因座仍然能够表达完整的T细胞特异性基因产物。
23.权利要求18-22中任一项的方法,其中所述T细胞特异性基因座是T细胞受体α恒定(TRAC)基因座。
24.权利要求23的方法,其中所述异源序列被整合到所述TRAC基因座的外显子1、2或3中。
25.权利要求17-24中任一项的方法,其中所述转基因编码FOXP3、
Helios或ThPOK。
26.权利要求25的方法,其中所述转基因包含FOXP3的编码序列和ThPOK的编码序列,其中这两个编码序列是框内的并且由自切割肽的框内编码序列分隔。
27.前述权利要求中任一项的方法,其中所述细胞的起始群体是人细胞。
28.权利要求27的方法,其中所述细胞的起始群体包含选自以下的基因中的无效突变:
II类主要组织相容性复合体反式激活因子(CIITA)基因,
HLAI类或II类基因,
与抗原加工相关的转运蛋白,
次要组织相容性抗原基因,和
β2微球蛋白(B2M)基因。
29.前述权利要求中任一项的方法,其中所述细胞的起始群体包含自杀基因,所述自杀基因任选地选自HSV-TK基因、胞嘧啶脱氨酶基因、硝基还原酶基因、细胞色素P450基因或caspase-9基因。
30.通过权利要求1-29中任一项的方法获得的富含CD4单阳性细胞的细胞群。
31.通过权利要求1-7和12-29中任一项的方法获得的富含CD4+Teff细胞的细胞群。
32.在有此需要的患者中治疗癌症、感染性疾病、过敏症、哮喘或自身免疫性疾病或炎性疾病的方法,所述方法包括向所述患者施用权利要求31的细胞群。
33.权利要求31的细胞群在制备用于治疗有此需要的患者的癌症、感染性疾病、过敏症、哮喘或自身免疫性疾病或炎性疾病的药物中的用途。
34.用于在有此需要的患者中治疗癌症、感染性疾病、过敏症、哮喘或自身免疫性疾病或炎性疾病中使用的权利要求31的细胞群,其。
35.通过权利要求1-6和8-29中任一项的方法获得的富含CD4+Treg细胞的细胞群。
36.治疗需要免疫抑制的患者的方法,所述方法包括向所述患者施用权利要求35的细胞群。
37.权利要求35的细胞群在制备用于治疗需要免疫抑制的患者的药物中的用途。
38.用于治疗需要免疫抑制的患者中使用的权利要求35的细胞群。
39.权利要求36-38中任一项的方法、用途或用于使用的细胞群,其中所述患者患有自身免疫性疾病、或者已经接受或将接受组织移植。
40.药物组合物,其包含权利要求30、31或35的细胞群和药学上可接受的载剂。
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