CN116270760A - 代谢或隔绝游离的糖单体的组合物及其应用 - Google Patents

Abstract

本文公开了包含至少两种非病原微生物的组合物。所述非病原微生物可以是来自能够内化和/或代谢膳食多糖的第一物种和/或来自能够消耗和代谢游离的糖单体的第二物种。本文还公开了制备方法以及治疗和/或防止哺乳动物体内病原菌过度生长的应用。

Description

代谢或隔绝游离的糖单体的组合物及其应用

技术领域

本文所述实施方式主要涉及促进哺乳动物健康，更具体的，涉及调节人类个体的微生物组群(microbiome)。此外，本文所述实施方式涉及治疗和/或预防哺乳动物体内病原菌过度生长的方法。

技术背景

肠道微生物组群是指生活在胃肠道中的微生物群落，其主要存在于大肠或结肠。在健康的个体中，大多数经消化的膳食营养素在其到达结肠之前被身体吸收。然而，许多含有不消化的碳水化合物(即膳食纤维)的食物保持完整并且在其穿过肠道进入结肠时仍然不被吸收。结肠微生物组群在能够部分消耗此类纤维并利用该组分糖供能和代谢的细菌种类中十分丰富。在不同食物中测量膳食纤维的方法是本领域普通技术人员所熟知的。

哺乳动物中，摄乳(nursing)婴儿的肠微生物组群与成年人肠微生物组群截然不同，成年人肠微生物组群通常包含非常多样化的生物体但占总种群的比例较低。另一方面，摄乳婴儿的微生物组群是由几乎唯一的(高达80％)单一种类组成。

从摄乳婴儿中单一的、非多样化的微生物组群转变到成年人复杂的、多样化的微生物组群反映了哺乳动物从具有相当复杂纤维的单一营养源(例如，母乳寡糖)到不那么复杂、更加多样化的膳食纤维来源的转变。

生态失调(dysbiosis)，对微生物组群而言是指与天然健康微生物种群不一致在整个进化过程中，哺乳动物微生物组群的自然状态的示例是，经阴道分娩(即，从母体来源获得了特定微生物)、并母乳喂养的健康人类婴儿的胃肠道微生物组群。造成了人类婴儿的生态失调的原因有许多，包括通过剖腹产进行的手术分娩、替代食品或配方(而不是哺乳)的使用、抗生素滥用、新生儿设施/环境中的卫生状态，以及婴儿成长的家庭和医院的微生物环境。

生态失调同样可因类似的卫生学、抗生素滥用、以及人和动物食物和饲料的工业化的原因发生在各年龄的人类以及家养哺乳动物中，例如但不限于与农业相关的哺乳动物(如奶牛、猪、兔、山羊和绵羊)、哺乳动物伴侣动物(如猫、狗和马)、和竞赛哺乳动物(如纯种马、竞赛骆驼和工作犬)。

之前对于生态失调的哺乳动物的治疗方案包括给予根除所有或大部分微生物组群内细菌的抗生素。例如，在非常小的早产儿中偶发的坏死性肠炎(NEC)是一种严重的病症并且可以常常导致婴儿死亡，该病症通常需要进行大手术以切除具有某些终身后遗症的坏死肠道的部分，该病症普遍使用抗生素进行治疗。

成年或年轻的哺乳动物(例如猪崽、马驹和牛犊)中可存在其它生态失调的肠道微生物群落组分。在猪和马的集约农业生产之下，预防性地频繁使用抗生素，并且动物在这些情况下的微生物多样性降低，生态失调的肠道微生物群落接踵而来讽刺地，这常常会导致为了防止威胁生命的腹泻和可能的死亡，通过更强的抗生素治疗的病变(例如猪崽中的腹泻，或马驹中的例如艰难梭菌(Clostridium difficile)或产气荚膜梭菌(C.perfringens)等病原菌的爆发)。目前，在这些情况中，消灭这些病原菌的唯一选择是继续并且大量使用抗生素和支持或姑息治疗。因此，需要能够在各年龄哺乳动物(包括人类以及伴侣、竞赛或生产动物)中降低生态失调并且预防疾病的不需要另外给予抗生素的有效方法。

发明内容

本发明部分涉及发明人发现哺乳动物乳汁，特别是乳汁的多糖成分，已经进化出供养两种消耗者：直接后代；和后代的某些肠道细菌。发明人发现在不存在与进化相关的细菌时(或存在生态失调的肠道时)，哺乳动物乳汁的不消化的多糖变得容易被其它细菌水解。这样释放了游离的糖单体(FSM)，其能够使那些本来不会出现的伺机性或高破坏性病原体生长。本文所述术语“膳食多糖”指那些不消化的多糖，有时候被称为“膳食纤维”，或不被哺乳动物消化道(例如小肠)内的内源性酶水解的碳水化合物聚合物。

本文一些实施方式涉及递送包括能够消耗膳食多糖的成分的组合物至生态失调哺乳动物肠道的方法和组合物。这样的组合物可以降低哺乳动物中FSM的浓度。FSM和膳食多糖的降低可以使对哺乳动物有害的病原菌过量的可能性减至最小。在一些实施方式中，组合物包括某些细菌(存活或死亡)或其它口服提供的结合和/或代谢FSM的成分，由此避免其被病原菌用作能源。

本发明的一些实施方式提供了诊断使哺乳动物新生儿中的病原菌生长的基质存在的方法。具体的，一些实施方式提供了确定出现FSM的诊断。

本发明的一些实施方式提供了一套a)作为益生菌主动去除包括完整膳食多糖和FSM的基质的微生物(如细菌或酵母)；b)能够失活或消除膳食多糖和/或糖的酶；和/或c)结合剂，与游离的糖单体物理结合并使其不可作为支持病原微生物生长的基质。

本发明的一些实施方式提供了组合物，将其给予以降低包括人类在内的哺乳动物中可能是使用抗生素治疗病原菌过度生长所导致的FSM浓度。

附图简要说明

图1：曲线图显示了在猪乳汁糖组分糖上的典型猪崽大肠杆菌分离株与其在偶联多糖上的对比。

图2：堆叠柱形图显示了拟杆菌(Bacteroidaceae)(以黄色标记)，和用蓝色标记的肠杆菌(Enterobacteriaceae)种群的相对丰度在幼猪粪便中强相关(r2＝0.661,p<0.001)。断奶动物中的群落加框表示。

图3A：图表显示了标记为唾液酸酶的宏基因组读数的分类标记。

图3B：图表显示了乳汁和断奶饮食之间唾液酸酶相对丰度的显著区别。

图4：图表显示了摄乳和断奶猪崽粪便中的游离唾液酸浓度。

图5：图表显示了猪的平均肠杆菌(Enterobacteriaceae)群落随时间的变化(左轴，柱，摄乳，蓝色；断奶，红色)和游离唾液酸的浓度，p<0.001(右轴，须，哺乳，蓝色；断奶，红色)在不同饮食中显著不同(p<0.001)。

图6:图表显示了14天龄摄乳猪肠道内拟杆菌(Bacteroidales)和肠杆菌(Enterobacteriaes)的生物地理学相对丰度。

图7：图表显示了通过饲喂乳杆菌(Lactobacillus)UCD14261治疗14天龄猪使得肠杆菌(Enterobacteriaceae)种群显著减少。

图8：图表给出了在饲喂乳杆菌(Lactobacillus)之前，“处于风险的(At risk)”或高肠杆菌(Enterobacteriaceae)的猪相较于“NR”或“没有风险的(No risk)”猪之间不同差异。

图9：图表显示了通过饲喂乳杆菌(Lactobacillus)可以将“处于风险的”(AR)或高肠杆菌(Enterobacteriaceae)的猪救治成类似于没有风险的或没有反应(Non Responder)的动物。字母表示显著组(a、b；p<0.05)。

图10：PMO消耗的模型。

优选实施方式详述

哺乳动物，特别是婴儿哺乳动物的生态失调可以通过对哺乳动物的身体症状(例如，腹泻、消化不适、发炎等)和/或对哺乳动物的粪便中FSM存在的检测进行观察。此外，基于哺乳动物周围环境的情况(例如，哺乳动物周边疾病的爆发、人工喂养(formulafeeding)、剖腹产等)，婴儿哺乳动物可能具有更高的患生态失调的可能性。

生活在包含复合多糖的介质中的大多数肠道微生物将水解酶分泌到其周围的环境中，分解那些可以被这些微生物消耗的可消化片段(FSM)，用于获得能量和/或这些微生物的其它需求。发明人发现，通过使许多这样的复合多糖(乳寡糖)首先内化并进行有限的事先水解或完全不进行事先水解，一些微生物可以在哺乳动物乳汁中发现的复合多糖上排他性生长。这些内化的多糖以这样的方式水解：产生的FSM在细胞质中释放，并且不用将其释放到外部环境中，可以经代谢获得能量和/或这些微生物的其它需求。这些后述微生物通常不分泌碳水化合物活性水解酶。分泌碳水化合物活性水解酶的微生物经常会在周围介质中留下大量残留片段或FSM，而进化出通过内化消耗来自哺乳动物乳汁的寡糖的微生物并不会在周围介质中留下残留的FSM。这样的情况出现在当这些相应的生物体在哺乳动物的肠道中生长时。

因此，使用本发明对某些症状进行治疗和/或预防的婴儿哺乳动物可以是：(a)具有表示生态失调的身体状况(例如，腹泻或消化不适)；(b)在其粪便中具有可测量的FSM水平；和/或(c)基于哺乳动物周围的环境的情况(例如，哺乳动物周边疾病的爆发、人工喂养、剖腹产等)具有更高的患生态失调的可能性。哺乳动物可以是人、牛、猪、兔、山羊、绵羊、猫、狗、马、或骆驼。

婴儿哺乳动物粪便中的FSM水平在组成肠道微生物组群的细菌不能完全消耗膳食多糖时升高。部分细胞外降解膳食多糖的结果是FSM和二糖在下肠道中升高。FSM可包括但不局限于：岩藻糖、唾液酸、N-乙酰葡萄糖胺、葡萄糖、葡萄糖酸盐、甘露糖、N-乙酰半乳糖胺、核糖、和/或半乳糖。

包括但不限于人、马、和猪、牛、兔、山羊、绵羊、狗、马、骆驼、或猫等哺乳动物中的某些病变与肠道中某些病原菌的过度生长有关，例如但不限于包括肠杆菌(Enterobacteriaceae)的变形菌门(Proteobacteria)和包括梭菌(Clostridium)的厚壁菌门(Firmicutes)。发明人观察到，这些问题性细菌的过度生长(泛溢)似乎与膳食多糖的部分消化所生成的大量FSM有关。发明人同样确定，病原体作为肠道内生态失调结果的根本原因与下肠道中存在过量FSM相关，FSM包括但不限于藻糖、唾液酸、N-乙酰葡萄糖胺、N-乙酰半乳糖胺、和葡萄糖酸盐。FSM的过量可以是由于驻肠道微生物组群对膳食多糖(例如在哺乳动物乳汁和其它食物来源中发现的)的不完全消化所引起的。因此，FSM和肠道病原体之间的关系是因果关系。

就人类而言，特别是在很容易获得现代医疗保健和治疗的西方国家，通过剖腹手术(剖腹产)出生的婴儿比例较高，人造乳汁(婴儿配方奶粉)在生命早期的使用比例较高，并且在早期阶段或在母亲使用抗生素进行治疗的比例较高。在所有的这些情况中，人类婴儿可以很快地发育出与一个“祖传的”或“理想的”阴道分娩、母乳喂养的婴儿截然不同的胃肠微生物群。正常成年人的微生物组群相较于母乳喂养的婴儿是高度复杂的。例如，阴道分娩、母乳喂养的婴儿的微生物组群在定植(colonization)的初始阶段之后，较为理想的是由单一种属的细菌(双歧杆菌(Bifidobacterium))主导并且通常是由单一种和亚种(长双歧杆菌婴儿亚种(Bifidobacterium longum subsp.Infantis(B.infantis)))主导。这个乳汁引导的、长双歧杆菌婴儿亚种(B.infantis)主导的微生物组群通常在婴儿停止食用母乳之后，极快的转变成复杂的类似成人的(adult-like)微生物组群。由婴儿饮食改变导致的微生物组群变化与人类婴儿、孩童或成年人、或任何其它哺乳动物在抗生素治疗后出现的微生物组群改变是完全不同的，后者的微生物组群被严重破坏或生态失调。

本文中的婴儿哺乳动物可以是已经用抗生素进行治疗，或是正在用抗生素进行治疗，或是由已经用抗生素进行治疗的动物或是正在用抗生素进行治疗的动物所生的。婴儿哺乳动物是可以已经用或正在用抗生素治疗的人、牛、猪、兔、山羊、绵羊、猫、狗、马、或骆驼。

在一些实施方式中，本发明提供了一种包含至少两种非病原微生物的组合物。本文所用术语“非病原微生物”指不能致病的微生物，其也可以被称为“共生微生物”，表示生活在一起而不会对彼此造成伤害。非病原微生物中的一种可以是来自能够内化、水解和/或代谢膳食多糖的第一物种(例如，酵母或细菌)。第一物种可以是双歧杆菌(Bifidobacterium)。双歧杆菌(bifidobacteria)可以是长双歧杆菌(B.longum)(例如，长双歧杆菌婴儿亚种(B.longum subsp.infantis)、长双歧杆菌长亚种(B.longumsubsp.longum))、短双歧杆菌(B.breve)、或假小链双歧杆菌(B.pseudocatenulatum)。

在一些实施方式中，第一物种是长双歧杆菌婴儿亚种(B.longumsubsp.infantis)。长双歧杆菌婴儿亚种(B.infantis)可以被激活。长双歧杆菌婴儿亚种(B.infantis)的激活在PCT/US2015/057226中描述，其通过引用全文纳入本文

在一些实施方式中，第二非病原微生物来自能够消耗和代谢至少一种类型的FSM的第二物种(例如，酵母或细菌)。在一些实施方式中，第二物种是片球菌(Pediococcus)、乳杆菌(Lactobacillus)、或双歧杆菌(bifidobacteria)。在一些实施方式中，第二物种可以是但是并不限于婴儿双歧杆菌(B.infantis)、短双歧杆菌(B.breve)、两歧双歧杆菌(B.bifidum)、长双歧杆菌(B.longum)、青春双歧杆菌(B.adolescentis)、动物双歧杆菌(B.animalis)、戊糖片球菌(P.pentosaceus)、斯氏片球菌(P.stilesii)、乳酸片球菌(P.acidilacti)、阿氏片球菌(P.argentinicus)、克氏片球菌(P.claussenii)、罗伊乳杆菌(L.reuteri)、嗜酸乳杆菌(L.acidophilus)、植物乳杆菌(L.planatarum)、干酪乳杆菌(L.casei)、鼠李糖乳杆菌(L.rhamnosus)、短乳杆菌(L.brevis)、发酵乳杆菌(L.fermentum)、卷曲乳杆菌(L.crispatus)、约氏乳杆菌(L.johnsonii)、加氏乳杆菌(L.gasseri)、粘膜乳杆菌(L.mucosae)、和/或唾液乳杆菌(L.salivarius)。

在一些实施方式中，第二物种是根据婴儿哺乳动物实际出现或潜在出现的生态失调的原因和实际出现或潜在出现的生态失调中第二物种对消耗FSM的偏好进行选择的。例如，第二物种可以根据微生物对FSM消化的偏好的能力进行选择(如下表1所述)。尽管微生物也许能够消化和代谢FSM，但是除非其它食物来源不存在，微生物可能并不倾向于消化FSM。

表1：常见肠道微生物群和消耗游离糖的偏好表

在一些实施方式中，在实际出现或潜在出现的生态失调中的FSM通过对婴儿哺乳动物粪便样品中存在的FSM进行测量来确定，或通过检查动物饮食中的复杂多糖来确定。随后，可以根据消耗婴儿哺乳动物粪便样品中测量到的FSM的偏好对第二物种进行选择。可以确定婴儿哺乳动物在粪便中含有每克婴儿哺乳动物粪便干重量中至少1ug、至少5ug、至少10ug、至少15ug、至少20ug、至少25ug、至少50ug、至少75ug、至少100ug FSM(N-乙酰葡萄糖胺、岩藻糖、或唾液酸)的量的FSM。

在一些实施方式中，在实际出现或潜在出现生态失调中的FSM通过确定病原性微生物和病原性微生物偏好的游离糖消耗来确定。例如，众所周知艰难梭菌(Clostridiumdifficile)消耗唾液酸。因此，例如，如果婴儿哺乳动物易感和/或暴露于，例如艰难梭菌(C.difficile)丰富的环境中，可以根据消耗唾液酸的偏好选择第二物种。

组合物可以包括非病原微生物的第一物种，其占非病原微生物总量的约5％到约95％。例如，第一物种可以占非病原微生物总量的5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、或95％(例如，约10％到约90％、或约20％到约80％)。组合物可以包括非病原微生物的第二物种，其占非病原微生物总量的约5％到约95％。例如，第二物种可以占非病原微生物总量的5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、或95％(例如，约10％到约90％、或约20％到约80％)。在一些实施方式中，非病原微生物的总量是每克组合物干重10亿到大约1千万、到大约5千亿cfu。

本文所述的任何种组合物可以干燥粉末、悬浮于油中的干燥粉末、或细菌培养物的悬浮液的形式存在。组合物可以包括总量为每克干重大约1千万到5千亿cfu的活菌。干粉可以被冷冻干燥或喷雾干燥。冷冻干燥的组合物优选地在有合适的冷冻保护剂存在的条件下被冷冻。冷冻保护剂可以是，例如，葡萄糖、乳糖、棉子糖、蔗糖、海藻糖、侧金盏花醇(adonitol)、甘油、甘露醇、甲醇、聚乙二醇、丙二醇、核糖醇(ribitol)、海藻酸盐、牛血清白蛋白、肉碱、柠檬酸盐、半胱氨酸、葡聚糖、二甲亚砜、谷氨酸钠、甘氨酸甜菜碱、糖原、亚牛磺酸(hypotaurine)、蛋白胨、聚乙烯吡咯烷酮或牛磺酸。组合物同样还包括从约5％到90％的膳食多糖，其来源于哺乳动物，包括但不限于人类、猪、或牛。

在一实施方式中，组合物能够在膳食多糖上生长，其中在组合物的培养物已经停止生长后，膳食多糖中少于20％的唾液酸含量和20％的岩藻糖含量以FSM保留。在另一实施方式中，组合物能够在膳食多糖上生长，其中，在组合物的培养物已经停止生长后，膳食多糖中少于10％的唾液酸含量和10％的岩藻糖含量的以FSM保留。在一个优选的实施方式中，组合物能够在膳食多糖上生长，其中，在组合物的培养物已经停止生长后，乳汁寡糖中少于5％的唾液酸含量和5％的岩藻糖含量以FSM保留。在一个最优选的实施方式中，组合物能够在膳食多糖上生长，其中，在组合物的培养物已经停止生长后，乳汁寡糖中少于1％的唾液酸含量和1％的岩藻糖含量以FSM保留。

在一些实施方式后中，非病原微生物的第一物种含有编码唾液酸酶或岩藻糖苷酶的基因，非病原微生物的第二物种含有编码唾液酸或岩藻糖转运体的基因。在另一实施方式中，其中一种物种含有编码复合寡糖转运体的基因。在一些实施方式中，其中一种活细菌物种是长双歧杆菌(Bifidobacterium longum)，并且最优选的实施方式中，其中一种或两种活细菌物种是长双歧杆菌婴儿亚种(Bifidobacterium longum subspecies infantis)。

在本发明的各实施方式中，可以通过多种方法中的任一种使其中一种或两种细菌物种不能存活，这些方法包括但不限于加热、冻结声波降解法、渗透冲击、低pH、高pH、或葡萄糖醛处理。在这样的情况下，细胞表面上的膳食多糖和/或FSM结合蛋白仍然完整并且不能存活的细菌细胞可以结合膳食多糖/糖类，但是不能将其代谢。

在各种实施方式中，FSM转运子(例如但不限于唾液酸或岩藻糖转运体、或膳食多糖结合蛋白)的一个或多个基因可以在重组细胞中表达，以存活的或不能存活的方式提供给需要降低其粪便FSM水平的对象。在另一实施方式中，负责FSM摄取的某些基因也可在其它细菌或酵母菌株中过度表达，进一步促进生物体在哺乳动物的下结肠中消耗任何残留的FSM的能力。在另一实施方式中，特异性膳食多糖结合分子(例如，某些细胞表面凝集素或为结合FSM，优选唾液酸和岩藻糖所选择的选择素)的基因也可整合到重组生物体内，从而隔绝FSM并且避免病原菌将FSM作为能源使用。此外，特异性非蛋白糖结合分子，例如但不限于环糊精、葡聚糖硫酸酯等也可用在隔绝FSM的组合物中。

在一些实施方式中，可以将其它生物来源，例如其它任何能够摄入残留的FSM的非病原菌包括在内。这些生物体可以通过在FSM(例如，但不限于N-乙酰葡萄糖胺、岩藻糖、葡萄糖酸盐和唾液酸或这些糖类的组合)上就生长进行筛选获得。这样的生物体可以通过以下方式获得：首先通过本领域所熟知的标准方法，例如但不限于紫外线诱变和化学诱变，对细菌的非病原菌株进行诱变处理，然后利用单一糖类进行正选择过程，识别那些在摄入和代谢这样的FSM方面具有组成型活性的突变菌株。

在其它实施方式中，本文所述的任何一种组合物以包装在或没有包装在缓释制剂中口服提供。可以配制缓释制剂，从而使组合物成功通过胃的低PH和上小肠中的其他消化酶和去污剂，以向大肠提供膳食多糖结合分子有效递送。或者，这些物质可以通过使用例如但不限于栓剂、灌肠剂、或灌肠的方式经肛门提供，将这些物质以一种类似粪便移植的方式直接提供到结肠内。

在多个实施方式中，可以通过给予哺乳动物本文所述的任何组合物，改善该生态失调哺乳动物的健康状态。可以确定哺乳动物在粪便中具有每克哺乳动物粪便干重量至少1ug、至少5ug、至少10ug、至少15ug、至少20ug、至少25ug、至少50ug、至少75ug、至少100ugFSM(N-乙酰葡萄糖胺、岩藻糖、或唾液酸)的量的FSM。可以将本文所述任何组合物给予该哺乳动物。可以给予哺乳动物包括非病原微生物的组合物，该非病原微生物包括1千万到5000亿cfu每克的量的能够代谢或隔绝FSM的活细菌。

在一些实施方式中，确定婴儿哺乳动物粪便中出现FSM或婴儿哺乳动物饮食中复合多糖的组合物，并将该出现报告。可以根据FSM或可能的FSM(膳食多糖的成分)的出现制定给予组合物的建议。可以建议将本文所述任何组合物给予婴儿哺乳动物。组合物可以包括能够代谢或隔绝FSM的非病原微生物。可以将组合物后续给予哺乳动物，用于治疗该哺乳动物。接受治疗的婴儿哺乳动物可以是但是不限于：人、牛、猪、兔、山羊、绵羊、猫、狗、马、或骆驼。

可以对婴儿哺乳动物粪便中出现的FSM进行评价。出现在粪便中FSM在1ug到100mg/g粪便干重水平的个体将会作为使用本发明所述组合物进行治疗的候选者。在一优选的实施方式中，粪便FSM的水平将是5ug到50mg/g粪便干重，并且在最优选的实施方式中，粪便FSM的水平将是5ug到5mg/g粪便干重。

本发明的一个实施方式可以包括如下步骤；1)适合通过本发明治疗的对象是通过在粪便中出现至少5ug/g粪便干重水平的FSM，或其它形式的肠道问题确定的；2)制备可以隔绝和/或消耗FSM的组合物；和3)将FSM隔绝组合物和/或FSM消耗组合物给予需要降低FSM水平的对象。

实施例

实施例1.易发生病原菌爆发哺乳动物对象的确定例如，通过本领域熟知的标准方法对对象粪便的常规样品中出现的N-乙酰葡萄糖胺、唾液酸、葡萄糖酸盐和/或岩藻糖进行分析(参见例如，Le Pare等，“快速量化食品中的功能性碳水化合物(RapidQuantification of Functional Carbohydrates in Food Products)”,食品与营养科学(2014)(Food and Nutrition Sciences(2014)),第五卷,第71-78页)。如果分析的结果显示出现超过5ug/g粪便干重水平的任何FSM，那么该对象是治疗的候选者。

实施例2.FSM隔绝组合物的制备长双歧杆菌婴儿亚种(B.infantis)的样品通过在培养基上对阴道分娩、母乳喂养的人类婴儿的粪便的培养进行分离，该培养基含有作为生物体生长的唯一能源的人类乳汁寡糖(HMO)。或者，可从商业培养物保藏中心，如弗吉尼亚州马纳萨斯的美国典型培养物保藏中心(ATCC)中获得长双歧杆菌婴儿亚种(B.infantis)的菌株。可以消耗N-乙酰葡萄糖胺、唾液酸、葡萄糖酸盐或岩藻糖的双歧杆菌(Bifidobacterium)、乳杆菌(Pediococcus)、或片球菌(Lactobacillus)物种，例如但不限于长双歧杆菌(B.longum)、短双歧杆菌(B.breve)、假小链双歧杆菌(B.pseudocatenulatum)、齿双歧杆菌(B.dentium)、戊糖片球菌(P.pentosaceus)、斯氏片球菌(P.stilesii)、乳酸片球菌(P.acidilacti)、阿氏片球菌(P.argentinicus)、克氏片球菌(P.claussenii)、罗伊乳杆菌(L.reuteri)、植物乳杆菌(L.plantarum)、戊糖乳杆菌(L.pentosus)、唾液乳杆菌(L.salivarius)、卷曲乳杆菌(L.crispatus)、克氏乳杆菌(L.coleohominis)、胃窦乳杆菌(L.antri)、清酒乳杆菌(L.sakei)和干酪乳杆菌(L.casei)与长双歧杆菌婴儿亚种(B.infantis)联用。两种生物体的纯培养物分别使用传统商业发酵技术在体积大于500L的发酵罐中生长，并且生长培养基可能包括哺乳动物乳汁复合膳食多糖和/或FSM作为碳源成分。每个细胞肉汤都通过离心分离进行浓缩，并在冷冻和随后的减压空气干燥(例如:冷冻干燥)之前分别与冷冻保护组分，例如但不限于海藻糖混合。干燥后，两种纯培养物以1:5到5:1的比例混合。

实施例3.需要补充使用组合物的对象的治疗。选择粪便FSM浓度大于5ug/g粪便干重(gdw)的人类婴儿用本发明的组合物进行补充。制备包括1千万到1000亿cfu/gdw的长双歧杆菌婴儿亚种(B.infantis)和1千万到1000亿cfu/gdw的乳杆菌种(Lactobacillus sp.)的混合物。该组合物以1千万到1000亿cfu/gdw/天的剂量的混合双歧杆菌(Bifidobacterium)和乳杆菌(Lactobacillus)提供。将该混合物提供给需要进行为期至少5天的补充的婴儿。

实施例4.在马驹严重出血性腹泻暴发期间，对在大型马育种棚里新出生的马驹进行监测。发现这些马驹对艰难梭菌(Clostridium difficile)的培养和毒素阳性。在爆发的初期，有17只马驹出生，其中15只动物患病并需要干预，根据Merck兽医手册中所述护理标准。护理标准涉及以15–20mg/kg,PO,tid-qid剂量给予甲硝唑治疗。并且还可涉及给予大量介入性聚离子流体，补充电解质(钾、镁、和钙)，血浆或合成胶体，用于降低渗透压，抗炎剂，例如氟尼辛葡甲铵，和如果马的白细胞减少并且在受损的GI道上有细菌转移的有风险时给予广谱抗生素。

在17只马驹中，15只出现持续3到4天的稀粪或腹泻，2只因感染死亡。观察到爆发后改变了护理方案，在新生马驹出生12小时后开始每12小时向其提供3x10¹² CFU的长双歧杆菌(Bifidobacterium longum)EVBL001和5x10⁹ CFU的植物乳杆菌(Lactobacillusplantarum)EVLP001的制剂。在出生12小时给予该制剂的2只马驹仍然表现出腹泻，但是相较于标准护理的3到4天，它们在8小时内恢复。护理方案变为在这些动物出生时给予EVBL001和EVLP001，并在之后每12小时再次给予。没有任何在出生之时给予该药剂的马驹表现出腹泻(n＝6)。

对于最终出现感染、接受治疗的两只动物，恢复时间大约是8小时，显著短于给予标准护理方案的动物所需的3到4天通常恢复时间。在接受治疗的动物中没有出现不良事件，剂量均良好耐受。对于两个群体(标准护理和益生素治疗)的菲希尔精确检验(Fisher’sexact test)显示出艰难梭菌(C.difficile)感染发生率上的显著差异(表1)。

表1.用菲希尔精确检验分析出的2x2相依表，其表明相对于标准护

理(对照组)，接受益生菌混合物治疗的(治疗组)患病动物显著减少。

尝试了两种方案：在第一种方案中，在动物出生后12小时给予剂量，但是这一方案并没有显著地减少腹泻的发生率(给予小n)，尽管将严重程度(持续时间)极大地缩短到12小时或更短(p＝0.0074，菲希尔精确检验，与被腹泻持续时间隔离的腹泻马驹群体比较)。第二方案，在出生时给予剂量，显著减少了腹泻的发生率(p＝0.0025)。所有的动物都在出生时给予6.6mg/kg的头孢噻呋(Excede)，这并不影响与腹泻相关的健康状况。此外，接受治疗的群体并未出现马驹热泻，其通常影响50％以上的动物，并且在大约10％的病例中需要治疗(Weese和Rousseau2005)。如果将超过50％的风险外推到假设的8只动物的群体中以匹配观察的8只动物；该方案显著地减少了马驹热泻(p＝0.0256)。

上述结果表明给予包括双歧杆菌(Bifidobacteria)(例如，长双歧杆菌婴儿亚种(B.longum subspecies infantis)和乳杆菌(Lactobacillus)(例如，植物乳杆菌(L.plantarum)的组合物有效降低了新生马驹的生态失调发作以及随后危及生命的腹泻，其中乳杆菌(Lactobacillus)是被选择用以消耗已知病原体(例如，梭菌种(Clostridiumspecies)优选消耗的FSM的。该实施例并不限于新生马驹，但其展示了给予本文所述组合物可以有效降低或消除哺乳动物体内的生态失调发作。

实施例5.为了理解肠道微生物群与猪膳食多糖的关系，进行了监测猪粪便微生物群从出生到断奶的时间变化实验。粪便微生物群种群在动物哺乳期间保持稳定，但是在断奶后，当膳食多糖从食物中去除时候显著变化。在这一转变中发现的主要分类学变化是在肠杆菌科(Enterobacteriaceae)(包括大肠杆菌(E.coli))和拟杆菌科(Bacteroidaceae)(其中包括对于肠道微生物群常见的属，拟杆菌属(Bacteroides))(图2)。图2是显示了拟杆菌(Bacteroidaceae)种群的相对丰富(以黄色标记)，和用蓝色标记，肠杆菌(Enterobacteriaceae)在幼猪粪便中强相关(r2＝0.661,p<0.001)的堆叠柱形图。断奶动物中的群落加框表示。

公开的拟杆菌(Bacteroides)基因组包括编码唾液酸酶的序列，其可以将唾液酸部分从唾液乳糖中分离并为大肠杆菌(E.coli)在摄乳动物肠道中旺盛生长创造机会，因为在此处如果没有这种酶的活性，大肠杆菌可能并不能在此旺盛生长。同样地，β己糖胺酶将N-乙酰葡萄糖胺单体从复合多糖中移除的作用以这样的方式同样为大肠杆菌生成了一个小环境，就像通过同样消耗N-乙酰葡萄糖胺单体发现猪崽分离的大肠杆菌(E.coli)(图1)。为了证实这些酶确实在动物中存在，对微生物DNA基因组进行宏基因组测序以测定生态系统的总代谢能力，并且为关键代谢角色分配分类标识。具体而言，证明了从猪膳食多糖中释放唾液酸和N-乙酰葡萄糖胺是由肠道微生物群的种群驱动的。

编码唾液酸酶和β己糖胺酶的基因被发现属于肠道微生物群的成员。发现这些特异性酶所处的细菌的分类标识主要是与摄乳猪相关的拟杆菌，其在猪断奶后减弱(图3A)。此外，当动物的饮食变为含有较少此类糖的饮食时，可映射到唾液酸酶的测序读数的总丰度下降，这表明该酶在功能上与猪乳汁饮食有关，而不与主要由燕麦组成的断奶饮食有关的种群相关(图3B)。

使用Velvet将可以被分类为唾液酸酶并在拟杆菌中被分类标记的读数组装以产生全长假想唾液酸酶序列。发现来自该组装中的一个毗连群中包括属于脆弱拟杆菌(Bacteroides fragilis)的全长唾液酸酶编码基因，并且以99％的核苷酸相同性与该基因序列匹配，并且用于产生可以从总粪便DNA样品中扩增该序列的引物。

基因的PCR扩增。构建匹配假想唾液酸酶的引物。这些引物成功地从总粪便DNA中扩增序列，随后对其进行测序。经过验证的序列与从宏基因组读数生成的假想序列100％匹配。

平行地，通过在拟杆菌胆汁七叶甙(Bacteroides Bile Esculin)琼脂——一种用于拟杆菌(Bacteroides)分离的选择和识别培养基上进行分离，从乳猪粪便样品中分离了代表性的拟杆菌(Bacteroides)菌株。通过使用之前设计的相同引物进行PCR发现分离的拟杆菌(Bacteroides)菌株包括唾液酸酶，并且通过后续的DNA测序验证。观察到拟杆菌(Bacteroides)在唾液乳糖上的生长，因为该生物体明显地具有了功能性唾液酸酶(数据没有显示)。

此外，在摄乳和断奶饮食之间比较这些粪便样品中的唾液酸浓度，发现其在具有较高拟杆菌(和由此唾液酸酶)丰度的样品中其显著较高(图4)。图5从另一角度显示了这些数据。在肠杆菌(Enterobacteriaceae)相对丰度高的天数里，粪便中出现高唾液酸浓度。在肠杆菌低的天数里，唾液酸浓度低。图5：图表显示了猪的平均肠杆菌(Enterobacteriaceae)种群随时间的变化(左轴，柱，摄乳，蓝色；断奶，红色)和游离唾液酸的浓度，p<0.001(右轴，须，哺乳，蓝色；断奶，红色)在不同饮食中显著不同(p<0.001)。图6显示这种影响主要局限在猪崽的盲肠和结肠中。在大肠中有较多的拟杆菌(Bacteroides)，但在随后的粪便中有相等的肠杆菌(Enterobacteriaceae)爆发，这表明拟杆菌(Bacteroides)的确正在生成供肠杆菌(Enterobacteriaceae)消耗的基质(即，唾液酸和其它)。图6显示了14天龄摄乳猪肠道内拟杆菌(Bacteroidales)和肠道菌(Enterobacteriaes)的生物地理学相对丰度。

因此，数据可以总结为：(a)发现摄乳猪肠道中肠杆菌(Enterobacteriaceae)种群与拟杆菌(Bacteroides)的丰度相关(r2＝0.661,p<0.001)，(b)并且肠杆菌(Enterobacteriaceae)种群自身不可以消耗唾液酸化的猪乳汁寡糖，但是(c)拟杆菌(Bacteroides)具有能够从猪乳汁寡糖中释放唾液酸的酶，其(d)与粪便中唾液酸丰度的增长有关，其(e)这些肠杆菌(Enterobacteriaceae)可以消耗。

对这些知识的综合是，从猪膳食多糖中释放的FSM导致了摄乳猪肠道内肠杆菌(Enterobacteriaceae)种群的增加，创造了腹泻病原体可以繁殖的环境。具体地，通过减少单糖、双糖、或寡聚糖的丰度，其可以包括来自膳食多糖中的葡萄糖、半乳糖、N-乙酰葡萄糖胺、唾液酸、或岩藻糖，能够消耗这些多糖、它们的分解产物、或单糖的肠杆菌(Enterobacteriaceae)和其他潜在致病生物体的种群和腹泻可以预防或在严重程度上减少。

这可以通过降低肠道中这些单体或由这些单体组成的多糖浓度的任何方式实现。例如，可引入组成型并且竞争性消耗这些游离的成分或多糖的益生菌微生物。

从猪粪便中分离的罗伊氏乳杆菌(Lactobacillus reuteri)菌株能够在葡萄糖酸盐上生长。该菌株生长至高细胞浓度，并且在预实验中每天使用10¹⁰CFU饲喂14天龄猪崽三天。饲喂之前和之后的两天收集粪便样品，并且通过16rRNA扩增子测序分析。重要的是，相较于基线样品(图7)，肠杆菌(Enterobacteriaceae)的相对种群显著地减少，尽管这些种群在与之前研究中年龄匹配的猪的摄乳期间保持稳定(图2)。因此，给予罗伊氏乳杆菌(Lactobacillus reuteri)有效减少了变形菌种群。具体地，图7显示了通过饲喂乳杆菌(Lactobacillus)UCD14261治疗14天龄猪使得肠杆菌(Enterobacteriaceae)种群显著减少。

即使在相同的窝中，也确定了猪崽群体中的区别。一些动物(7/11)含有较高的肠杆菌(Enterobacteriaceae)种群(p<0.05)，其平均是低肠杆菌(Enterobacteriaceae)动物(4/11动物)中群落平均值的两倍(图8)。图8给出了了在饲喂乳杆菌(Lactobacillus)之前，“处于风险的(At risk)”或高肠杆菌(Enterobacteriaceae)的猪相较于“NR”或“没有风险的(No risk)”猪之间的不同差异。这些猪崽对补充的罗伊氏乳杆菌(Lactobacillusreuteri)UCD14261响应不同，其中含有高肠杆菌(Enterobacteriaceae)种群的动物(被称之为“处于风险的”(AR)动物)在饲喂乳杆菌之后这些生物体表现出显著地下降(图9)，低肠杆菌(Enterobacteriaceae)动物中的种群没有受到很大影响。这些“处于风险的”动物具有显著较低的初始乳杆菌(Lactobacillaceae)种群(p<0.05)，这有助于解释为什么较高的肠杆菌(Enterobacteriaceae)种群可以生长，以及为什么乳杆菌(Lactobacillaceae)的补充导致其减少，其中肠杆菌(Enterobacteriaceae)种群与低肠杆菌(Enterobacteriaceae)动物没有显著不同。图9显示了“处于风险的”(AR)或高肠杆菌(Enterobacteriaceae)的猪可以通过饲喂乳杆菌(Lactobacillaceae)救治成类似于没有风险的或没有反应的动物。字母表示显著组(significance groups)(a、b；p<0.05)。图10表示PMO消耗模型。

所有涉及动物的实验在实验进行之前都由加利福尼亚大学戴维斯分校动物护理和使用委员会论证和批准(批准号17776、18279)。整个研究过程中，所有的动物都被安置在加州大学戴维斯分校专门用于饲养猪的一个受控访问的特异性无病原体的设施中。来自加州大学兽群的三只健康的成年怀孕母猪被选中进行了这项研究。在分娩后，按照标准做法，将这些婴儿猪与母猪共同安置，并标记耳标作为识别。允许这些猪崽自由摄乳直到21天龄之后断奶。将猪崽从母猪身边移走并转移到单独的住处，并在21天龄之后以标准启动饲料喂养(哈伯德饲料，美国明尼苏达州曼加多(Hubbard Feeds Mankato,MN USA))。允许动物随意饮水和进食。在母猪喂养它们的一窝幼崽时收集乳汁，并将其储存在-80C中。

使用无菌棉拭子(普日坦医疗，美国缅因州吉尔福德(Puritan Medical,Guilford,ME USA))在猪崽出生后1、3、5、7、14、21、28、35和42天经直肠收集每只猪崽的粪便样品。拭子也用于在整个研究范围内从亲本母猪和约4cm2的部位收集粪便样品。

测序文库构建。使用Zymo研究粪便DNA试剂盒(Zymo研究公司，美国加利福尼亚州爱尔文)按照生产商的说明书从拭子中提取DNA。将提取的DNA用作PCR的模板，使用条码化引物对16S rRNA的V4区域进行扩增，如之前对细菌和内部转录间隔区(ITS)所述，从而评估真菌群落。

简而言之，使用F515引物

(5′-NNNNNNNNGTGTGCCAGCMGCCGCGGTAA-3′)和R806引物(5′-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3′)扩增16S rRNA基因的V4结构域，其中聚N(斜体的)序列是各样品独特的8nt的条码和2nt的接头序列(粗体)。在包含1X GoTaq Green主混物(普洛麦格公司、美国威斯康星州麦迪逊)、1mM MgCl2、和2pmol各引物的15μL反应中进行PCR扩增。扩增条件包括：94℃下2分钟的初始变性步骤，其后94℃ 45秒、50℃ 60秒、和72℃ 90秒的25次循环，其后在72℃下进行10分钟的单个最终延展步骤。本研究所用的所有引物总结在表S1中。使用凯杰PCR纯化柱(凯杰公司)收集和纯化扩增子，并将其提交给加利福尼亚大学戴维斯分校基因组中心DNA技术测序中心进行配对末端库制备、集群生成和在Illumina MiSeq上的250bp配对端测序。真菌和细菌的扩增子在单独的MiSeq运行中测序，如前所述使用QIIME 1.8.0对质量过滤的解复用(demultiplexed)读数进行分析，除了13_8greengenes数据库释放用于OTU采摘和分类分配和使用UCLUST对细菌序列进行比对。每个样品随机抽样7000个序列用于细菌群落分析，以确保适当的比较。忽略少于7000个序列的样品。计算了系统进化多样性(PD)全树的α多样性估计，并且通过非参数双样品t检验与Bonferroni校正和999Monte Carlo置换进行比较，用于细菌分析。β多样性通过细菌种群的加权(或不加权的，其中注明)UNIFRAC指标计算。

宏基因组测序。按照生产商说明书使用ZYMO研究粪便DNA提取试剂盒从粪便样品中提取总基因组DNA，并且使用Illumina MiSeq v3化学试剂将其准备，用于在加利福尼亚大学戴维斯分校基因组中心DNA技术测序中心的多重化150bp库的全基因组鸟枪测序(可在万维网dnatech.genomecenter.ucdavis.edu中得到)。对样品进行收集并在一式三份测序试验中进行测序。将FASTQ文件解复用、质量过滤、修整至150bp，然后从三次测序中收集每个样品的读数，每个样品得到1500万到2000万读数，然后将其提交到MGRAST管道(MGRASTpipeline)进行分析，其中去除宿主基因组DNA读数和重复读数，库16S rRNA读数，并通过预测的蛋白质序列对剩余读数进行功能性分类。分类的读数在MGRAST中进行标准化，并与使用STAMP在治疗间进行比较。

分离消耗PMG的拟杆菌(Bacteroides)和大肠杆菌(Escherichia coli)。在磷酸盐缓冲盐水(PH 7.0)中稀释粪便样品并将其铺板到预先减少的拟杆菌胆汁七叶甙琼脂(HiMedia公司，印度孟买)平板上，在37℃厌氧孵育两天，然后根据生产商的说明书使用MALDI-TOF Biotyper(布鲁克公司，美国加州弗里蒙特)再次进行培养以纯化和分类。使用引物8F和1391R的16S rRNA测序被用于确定相同性。拟杆菌在BHI-S中37℃厌氧过夜培养。拟杆菌生长在生长试验的基本培养基中，如前文所述，使用乳糖、葡萄糖、半乳糖、2,3-唾液酸乳糖、2,6-唾液酸乳糖、唾液酸作为唯一碳源(1％w/v)。

鉴别消耗唾液酸的乳杆菌物种。来自摄乳和断奶猪的粪便样品在含有葡萄糖、棉子糖、或核糖作为唯一碳源的Rogosa Sl培养基上培养，并在37或45℃厌氧条件下生长，从而优先地分离乳杆菌物种。使用MALDI-TOF质谱仪和BioTyper系统(布鲁克公司，美国加州弗里蒙特)分离纯化菌落并且进行初步鉴定。如前文所述提取基因组DNA，并且通过PCR在本文其它处所描述的循环和反应条件下使用引物8F和581R生成部分16S rRNA序列。分离株以物种水平分组，并且选择用于生在筛选和16S rRNA测定的代表。序列由加利福尼亚大学戴维斯分校DNA测序中心(http://dnaseq.ucdavsis.edu)进行测定并与NCBI 16S rRNA数据库进行比较以确定MALDI-BioTyper鉴定。基于能够在以(1％w/v)唾液酸或N-乙酰氨基葡萄糖作为唯一碳源的基础MRS培养基中生长的能力对代表性分离株筛选。乳糖和葡萄糖也同样作为阳性对照进行对比。对JGI-IMG数据库中可用的乳杆菌(Lactobacillus)基因组进行筛选完整的唾液酸利用库的存在。

基因组测序。选择从摄乳猪崽粪便样品中分离的具有通过宏基因组测序预测的唾液酸酶的乳杆菌(Lactobacilli)、拟杆菌种(Bacteroides spp)和含有由PCR确定的唾液酸分解代谢途径的大肠杆菌(Escherichia coli)用于在加州大学伯克利分校文森特J.科茨(Vincent J.Coates)基因组测序实验室的Illumina HiSeq上进行全基因组鸟枪测序(可在万维网qb3.berkeley.edu/qb3/gsl/index.cfm上找到)。使用Velvet将读数组装，得到>20倍的平均覆盖率，并将其上传到JGI数据库进行标识和公众认证。

检测粪便中的唾液酸酶。将粪便样品悬浮在500uL的dH2O中，并且以2500RPM涡旋30分钟，然后将其以14 000RPM离心15分钟，并将上清液从中移除。对颗粒进行两次额外的提取，最终体积1.5ml。将取出150uL移除用于使用Bradford试验的蛋白质定量，通过BSA生成标准曲线。在阴离子交换树脂上对样品进行纯化并用5mL的50mM的氯化钠洗脱，然后在500uL的dH2O中重建之前在真空中干燥。根据生产商的说明书使用商用试剂盒(阿柏堪穆剑桥公司，美国马萨诸塞州)测定唾液酸浓度。将唾液酸浓度标准化至蛋白质总浓度并且表示为mg唾液酸/mg蛋白质。

统计学分析。使用OSX的Graph Pad Prism 6(Graph Pad软件公司，美国加利福尼亚州拉荷亚)以最小p值0.05计算T检验和线性关系。

Claims (10)

1.一种包含至少两种非病原微生物的组合物，其中所述至少两种非病原微生物中的一种来自能够内化和/或代谢膳食多糖的第一物种，并且所述至少两种非病原微生物中的一种来自能够消耗和代谢游离的糖单体的第二物种。

2.如权利要求1所述的组合物，其中所述游离的糖单体包括岩藻糖、唾液酸、N-乙酰葡萄糖胺、N-乙酰半乳糖胺、葡萄糖酸盐、葡萄糖、半乳糖、乳糖、唾液酸乳糖、岩藻糖乳糖、乳糖-N-二糖、或它们的混合物。

3.如权利要求1或2中任一项所述的组合物，其中所述非病原微生物的第一物种是双歧杆菌属的成员。

4.如权利要求3所述的组合物，其中所述双歧杆菌是长双歧杆菌、短双歧杆菌、或假小链双歧杆菌。

5.如权利要求4所述的组合物，其中所述双歧杆菌是长双歧杆菌婴儿亚种。

6.如权利要求5所述的组合物，其中所述长双歧杆菌婴儿亚种是活化的。

7.如权利要求1至5中任一项所述的组合物，其中所述非病原微生物的第二物种是双歧杆菌属、乳杆菌属、和/或片球菌属的成员。

8.如权利要求7所述的的组合物，其中所述双歧杆菌是婴儿双歧杆菌、短双歧杆菌、两歧双歧杆菌、长双歧杆菌、青春双歧杆菌、动物双歧杆菌、或假小链双歧杆菌。

9.如权利要求7或8中任一项所述的组合物，其中所述乳杆菌是植物乳杆菌、干酪乳杆菌、鼠李糖乳杆菌、短乳杆菌、发酵乳杆菌、卷曲乳杆菌、约氏乳杆菌、加氏乳杆菌、粘膜乳杆菌、或唾液乳杆菌。

10.如权利要求7至9中任一项所述的组合物，其中所述片球菌是乳酸片球菌、戊糖片球菌(P.entosaceus)、斯氏片球菌(P.stilesii)、阿氏片球菌(P.argentinicus)、或克氏片球菌(P.claussenii)。

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