CN116270584A - 一种三氟甲基烯基酯类化合物在制备抗溃疡性结肠炎药物中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明属于医药领域，公开了一种三氟甲基烯基酯类化合物在制备抗溃疡性结肠炎药物中的应用，所述化合物具有式1所示化学结构：

Description

一种三氟甲基烯基酯类化合物在制备抗溃疡性结肠炎药物中 的应用

技术领域

本发明涉及医药领域，涉及一种三氟甲基烯基酯类化合物在制备抗溃疡性结肠炎药物中的应用，具体是一种三氟甲基烯基酯类化合物BFL-16在制备抗溃疡性结肠炎药物以及在抑制脂多糖诱导巨噬细胞炎症药物中的应用。

背景技术

当机体受到外来病原体刺激时，会引起各种炎症介质过量释放以及炎症细胞过度激活。巨噬细胞作为机体抗击外来物侵袭的重要一关，当巨噬细胞受到外来刺激被激活后会产生大量的NO，进一步诱导炎症细胞因子的产生。因此，抑制巨噬细胞释放NO和炎症细胞因子，有利于预防或治疗炎症。不适当或过度的炎症则会损害组织、引发多种疾病，例如常见的心血管疾病、自身免疫性疾病和恶性肿瘤等。

溃疡性结肠炎(ulcerative colitis，UC)是一种主要累及直肠、结肠粘膜的特发性肠道炎症性疾病，以慢性、反复发作，病因不明为其特征，临床表现主要为腹泻、腹痛、粘液血便等；可伴有多种自身免疫性疾病发生，如结节性红斑、关节炎、强直性脊柱炎、硬化性胆管炎、自身免疫性溶血性贫血等。该病发病率和患病率在我国有明显增加趋势。

目前认为结肠黏膜免疫功能失调，促炎性细胞因子分泌增多，导致炎症级联放大反应是其主要的发病机制。常用的治疗药物有氨基水杨酸类药物、糖皮质激素、免疫抑制剂和一些中药，但至今尚无理想的药物，开发标本兼治、安全有效的药物具有积极的现实意义。

化合物三氟甲基烯基酯BLF-16(式1)是由一分子三氟甲基酮化合物和一分子非甾体抗炎药(NSAID)布洛芬拼合而成的前药结构。据报道，三氟甲基酮类化合物具有多种生物活性，包括抗炎、抗神经退行性疾病、抗心血管疾病，尚未发现其他方面的应用，因此，研究新型化合物在制备抗溃疡性结肠炎药物方面的治疗潜力，为将来的人类结肠炎患者提供了更多的选择性。

发明内容

本发明目的在于提供化合物BLF-16的新用途，所述的化合物BLF-16的结构如下式所示：

一种三氟甲基烯基酯类化合物在制备抗溃疡性结肠炎药物中的应用。

进一步的，所述抗溃疡性结肠炎药物包括药学上可接受的盐、水合物或溶剂合物外，还包含药用辅料。所述药用辅料是指常规的药用赋形剂，如溶剂、崩解剂、助悬剂、防腐剂、着色剂和粘合剂中的一种或两种组合。

进一步的，所述抗溃疡性结肠炎药物采用的剂型选自下组：液体制剂、固体制剂、半固体制剂、气体制剂。

进一步的，所述抗溃疡性结肠炎药物的剂型选自下组：口服给药剂型，如胶囊剂、片剂、散剂、颗粒剂、口服液；皮肤给药剂型、鼻黏膜给药剂型、直肠给药剂型。

进一步的，所述抗溃疡性结肠炎药物制备的溶液型、胶体型、乳剂型、混悬型制剂。

进一步的，所述的抗溃疡性结肠炎药物为改善疾病临床症状，如改善体重，降低疾病活动指数，增加结肠长度的药物。

进一步的，所述的抗溃疡性结肠炎药物为降低促炎因子水平、提高抗炎细胞因子水平的药物。

进一步的，所述的抗溃疡性结肠炎药物具有降低炎症相关蛋白如诱导型NO合成酶、基质金属蛋白酶、促炎白细胞介素的表达作用。

进一步的，所述三氟甲基烯基酯类化合物可以配置为0.5％羧甲基纤维素钠混悬液。

进一步的，所述三氟甲基烯基酯类化合物的羧甲基纤维素钠混悬液的配制方法为：称取5g的CMC-Na，取1000mL的去离子水，多次少量的加CMC-Na，边加边搅拌，即可获得浓度为0.5％的羧甲基纤维素钠(CMC-Na)溶液；称取10mg的BLF-16充分溶解于0.1mL的0.5％CMC-Na溶液中，即可获得浓度为100mg/mL的溶液，放置于实验室低温冰箱4℃储存，溶液在14天内稳定、有效，应避免反复冻融。

进一步的，所述三氟甲基烯基酯类化合物的羧甲基纤维素钠混悬液的使用方法为：每日小鼠灌胃给药，剂量为10mg/kg/d，给药体积为0.1mL/20g，每天一次，提前一天给药，连续给药7天。

与现有技术相比本发明具有以下优点：

(1)本发明以化合物BLF-16为活性成分。

(2)化合物BLF-16具有良好的体内外抗溃疡性结肠炎的活性、呈剂量依赖性抑制脂多糖诱导巨噬细胞炎症因子的产生，具有良好的药用前景。

附图说明

图1为化合物BLF-16对DSS(葡聚糖硫酸钠)诱导的BALB/c小鼠体重变化的影响，*P＜0.05，同DSS组相比；

图2为化合物BLF-16对DSS(葡聚糖硫酸钠)诱导的BALB/c小鼠DAI指数变化的影响，*P＜0.05，同DSS组相比；

图3为化合物BLF-16对DSS(葡聚糖硫酸钠)诱导的BALB/c小鼠结肠长度变化的影响，*P＜0.05，同DSS组相比；

图4为化合物BLF-16对DSS(葡聚糖硫酸钠)诱导的BALB/c小鼠脏器指数的影响，*P＜0.05，同DSS组相比；

图5为化合物BLF-16对DSS(葡聚糖硫酸钠)诱导的BALB/c小鼠结肠组织中IL-4含量的影响，*P＜0.05，同DSS组相比；

图6为化合物BLF-16对DSS(葡聚糖硫酸钠)诱导的BALB/c小鼠结肠组织中IL-1β含量的影响，*P＜0.05，同DSS组相比；

图7为化合物BLF-16对DSS(葡聚糖硫酸钠)诱导的BALB/c小鼠结肠组织中iNOS蛋白表达的影响，*P＜0.05，同DSS组相比；

图8、图9为化合物BLF-16对DSS(葡聚糖硫酸钠)诱导的BALB/c小鼠结肠组织中IL-1β蛋白表达的影响；

图10为化合物BLF-16对DSS(葡聚糖硫酸钠)诱导的BALB/c小鼠结肠组织中MMP-2蛋白表达的影响；

图11为化合物BLF-16对LPS(脂多糖)诱导的RAW264.7巨噬细胞活力的影响；

图12为化合物BLF-16对LPS(脂多糖)诱导的RAW264.7巨噬细胞N0释放率的影响，*P＜0.05，同LPS组相比；

图13为化合物BLF-16对LPS(脂多糖)诱导的RAW264.7巨噬细胞iNOS蛋白表达的影响，*P＜0.05，同LPS组相比；

图14为化合物BLF-16对LPS(脂多糖)诱导的RAW264.7巨噬细胞IL-1β分泌的影响，*P＜0.05，同LPS组相比；

图15为化合物BLF-16对LPS(脂多糖)诱导的RAW264.7巨噬细胞iNOS免疫荧光定位的影响，iNOS荧光染色在LPS模型组增强，与LPS组相比，BLF-16处理组的iNOS表达减弱。

具体实施方式

为了使本领域技术人员更好地理解本发明的技术方案能予以实施，下面结合具体实施例对本发明作进一步说明，但所举实施例不不以任何方式限制本发明。

下述实施例中所述试验方法，如无特殊说明，均为常规方法；所述试剂和材料，如无特殊说明，均可从商业途径获得。

一、化合物BLF-16消化道给药混悬液制剂的制备

称取5g的CMC-Na，取1000mL的去离子水，多次少量的加CMC-Na，边加边搅拌，即可获得浓度为0.5％的羧甲基纤维素钠(CMC-Na)溶液。

称取10mg的BLF-16充分溶解于0.1mL的0.5％CMC-Na溶液中，即可获得浓度为100mg/mL的溶液，放置于实验室低温冰箱4℃储存，溶液在14天内稳定、有效，应避免反复冻融。

二、化合物BLF-16制剂灌胃给药改善DSS(葡聚糖硫酸钠)诱导的小鼠溃疡性结肠炎。

实验材料

(1)试剂：DSS(葡聚糖硫酸钠)购自上海源叶生物科技有限公司。

(2)动物：清洁级BALB/c小鼠(雄性)，体重18–22g，购自辽宁长生生物技术股份有限公司。

(3)仪器：台式高速冷冻离心机，赛默飞世尔科技公司；分析天平，梅特勒托利多仪器有限公司。

(4)药物溶液：BLF-16的0.5％羧甲基纤维素钠混悬液；4％的DSS水溶液。

动物实验方法：实验前禁食不禁水24h，将15只小鼠平均分为3组，每组5只小鼠,分别为对照组(control组)、DSS诱导组(DSS组)、BLF-16处理组(BLF-16组)，DSS组和BLF-16组以4％DSS自由饮水7天。空白对照组在实验期间全程给予普通自来水饮水。BLF-16组每日灌胃给药，剂量为10mg/kg/d，给药体积为0.1mL/20g，每天一次，提前一天给药。每日称取小鼠体重，测量相关数据，在实验的第8天处死小鼠，取材进行相关实验。

实施例1：BLF-16改善DSS(葡聚糖硫酸钠)诱导的小鼠溃疡性结肠炎。

实验方法：在动物实验的每天，称取各组小鼠的体重,绘制体重变化曲线；每日计算小鼠的疾病活动指数(DAI)以及在实验结束取材后测量每组小鼠结肠长度。

实验结果：BLF-16处理组的小鼠体重下降最少，BLF-16能够抑制DSS诱导的溃疡性结肠炎引起的体重减轻(图1)。BLF-16处理组的小鼠疾病活动指数(DAI)最小，说明BLF-16能抑制DSS诱导的溃疡性结肠炎的疾病活动(图2)。BLF-16处理组的小鼠结肠长度长于DSS诱导的溃疡性结肠炎组小鼠，说明BLF-16抑制了DSS诱导导致的溃疡性结肠炎导致的结肠短缩。正常小鼠、DSS诱导小鼠以及BLF-16处理小鼠的各组间效应差别具有统计学意义(图3)。BLF-16组小鼠脏器指数与对照组小鼠有相同趋势，与模型组小鼠有相反趋势，说明BLF-16可以提高小鼠的免疫力(图4)。

实施例2：BLF-16抑制DSS(葡聚糖硫酸钠)诱导的溃疡性结肠炎小鼠的炎症因子的产生。

(1)BLF-16抑制葡聚糖硫酸钠诱导的溃疡性结肠炎小鼠的血清中促炎因子IL-1β、促进抗炎因子IL-4的产生。

实验方法：在动物实验结束时眼球摘除取血置于1.5mL EP管中，静置30min后，1500rpm离心15min，取上清，按照说明书，利用ELISA试剂盒，测定血清中IL-1β、IL-4的含量。

实验结果：ELISA实验结果显示，BLF-16处理的DSS诱导小鼠，其血清中的IL-1β含量较DSS诱导小鼠低，IL-4含量较DSS诱导小鼠高，各组间差异存在统计学差异。

实验显示BLF-16能够有效的抑制DSS诱导导致的IL-1β升高，说明BLF-16能够抑制溃疡性结肠炎过程中促炎因子的上升；BLF-16能够有效的抑制DSS诱导导致的IL-4降低，说明BLF-16能够促进溃疡性结肠炎过程中抗炎因子的上升(图5-6)。

实施例3：BLF-16能够降低溃疡性结肠炎小鼠结肠组织中炎症相关蛋白iNOS、IL-1β、MMP-2的表达。

实验方法：在动物实验结束时取各组小鼠结肠组织，结肠组织选用组织研磨液进行裂解。使用BCA蛋白质测定法测量蛋白质浓度。用8-15％SDS-PAGE凝胶分离等量的蛋白质(30-55μg)，然后将其印在聚偏二氟乙烯膜(PVDF)上。用5％的脱脂奶粉在TBST中封闭PVDF膜，并用抗iNOS、IL-1β、MMP-2抗体(1:1000稀释)和β-actin(1:10000稀释)在4℃下过夜。用辣根过氧化物酶(HRP)结合二级抗体(1:5000稀释)检测抗体1小时，并用ECL发光液(碧云天)观察抗体。使用ImageJ软件测量频带强度。

实验结果：BLF-16降低了炎症相关蛋白iNOS、IL-1β、MMP-2的表达。实验结果显示，LF-16通过降低结肠组织中炎症相关蛋白iNOS、IL-1β、MMP-2的表达，抑制溃疡性结肠炎(图7-10)。

实施例4：化合物BLF-16抑制LPS(脂多糖)诱导的RAW264.7巨噬细胞炎症反应。

材料与仪器

(1)材料：化合物BLF-16由化学实验室自行合成；小鼠RAW264.7巨噬细胞株，购于赛百慷(上海)生物技术股份有限公司；DMEM培养基购于北京索莱宝科技有限公司；胎牛血清(FBS)购于鼎国生物有限公司；脂多糖(LPS)购于北京索莱宝科技有限公司；噻唑蓝(MTT)购于北京索莱宝科技有限公司；一氧化氮(NO)检测试剂盒购于上海碧云天生物技术有限公司；iNOS抗体购于爱博泰克(ABclonal)生物科技有限公司；小鼠IL-1βELISA试剂盒购自Andygene生物科技有限公司；β-actin抗体购于Bioworld生物科技有限公司；HRP-山羊抗兔二抗购于爱博泰克(ABclonal)生物科技有限公司；HRP-山羊抗小鼠二抗购于爱博泰克(ABclonal)生物科技有限公司。

(2)仪器：分析天平，梅特勒托利多仪器有限公司；恒温水浴锅，上海一恒科学仪器有限公司；台式高速冷冻离心机，赛默飞世尔科技公司；二氧化碳细胞培养箱，赛默飞世尔科技公司；酶标仪，赛默飞世尔科技公司；电泳仪，北京六一生物技术有限公司；显影暗匣，广东粤华医疗器械厂有限公司；96孔板，北京索莱宝科技有限公司。

细胞培养：RAW264.7巨噬细胞在含有10％胎牛血清、100μg/mL链霉素和100μg/mL青霉素的DMEM高糖培养基中培养。将处于对数期的细胞以5×10⁴个/孔的密度接种于细胞培养皿(100mm)并在37℃、5％CO₂的加湿培养箱中过夜培养，用于后续实验。

药物浓度处理：将化合物BLF-16溶解在0.1％细胞级二甲基亚砜中，配制对细胞没有毒性的浓度测试其性能，BLF-16的浓度为25μmol/L、50μmol/L、100μmol/L。

实施例5：BLF-16对细胞无毒性验证。

实验方法：待RAW264.7细胞生长至对数生长期，以1×10⁴个/孔的密度接种到96孔培养板中，每孔加入200细胞悬液，每组设置6个复孔，且每次实验至少重复3次；培养12h后，弃去原培养基。分别设置正常对照组(DMEM培养基)、炎性模型组(LPS1μg/mL)、BLF-16(25、50、100μmol/L)药物处理组。待RAW264.7细胞生长至对数期,将BLF-16加入细胞中预孵育2h后，加入LPS(脂多糖)1μg/mL，继续培养24h后，每孔加入20μLMTT(5mg/mL)溶液，置于细胞培养箱中继续孵育4h，弃去上清，每孔加入150μL DMSO，放置振荡器中使结晶完全溶解，在490nm处测量吸光度值。

按照公式：

实验结果：不同浓度的BLF-16对RAW264.7巨噬细胞活力的影响无明显差异，结果表明BLF-16对RAW264.7巨噬细胞无毒性(图11)。

实施例6：BLF-16剂量依赖性抑制LPS诱导RAW264.7巨噬细胞NO的生成。

实验方法：通过格里斯(Griess)法检测N0含量。待RAW264.7细胞生长至对数生长期,以1X10⁴/孔的密度接种到96孔培养板中,每孔加入200μL细胞悬液,每组设置3个复孔，且每次实验至少重复3次；培养12h后,弃去原培养基。将BLF-16加入细胞中预孵育2h后,加入LPS(脂多糖)1μg/mL,继续培养24h后。培养结束后收集细胞培养液上清,用N0检测试剂盒进行NO含量的测定。将50μL上清液铺在96孔板中,并在其中加入等量的Griess试剂,然后用酶标仪测定540nm处的吸光度。使用亚硝酸钠(NaN0₂)标准品绘制标准曲线(0～100μM),根据标准曲线计算NO的含量。

实验结果：BLF-16可显著抑制LPS(脂多糖)诱导的RAW264.7巨噬细胞上清液中NO的分泌，且呈剂量依赖性(图12)。

实施例7：BLF-16剂量依赖性抑制LPS诱导RAW264.7巨噬细胞炎症相关蛋白iNOS的表达。

实验方法：用BLF-16(25～100μM)在LPS(1μg/mL)存在下24小时，用PBS洗涤RAW264.7细胞两次，并在添加1％蛋白酶抑制剂的冰冷RIPA裂解缓冲液中进行裂解。使用BCA蛋白质测定法测量蛋白质浓度。用8-15％SDS-PAGE凝胶分离等量的蛋白质(30-55μg)，然后将其印在聚偏二氟乙烯膜(PVDF)上。用5％的脱脂奶粉在TBST中封闭PVDF膜，并用抗iNOS抗体(1:1000稀释)和β-actin(1:10000稀释)在4℃下过夜。用辣根过氧化物酶(HRP)结合二级抗体(1:5000稀释)检测抗体1小时，并用ECL发光液(碧云天)观察抗体。使用ImageJ软件测量频带强度。

实验结果：BLF-16可显著抑制LPS(脂多糖)诱导的RAW264.7巨噬细胞iNOS蛋白表达量，且呈剂量依赖性(图13)。

实施例8：BLF-16剂量依赖性抑制LPS诱导RAW264.7巨噬细胞炎症因子IL-1β的分泌。

实验方法：待RAW264.7细胞生长至对数期，以1×10⁴个/孔的密度接种在96孔板中，每孔200μL细胞混悬液，每组设至少3个复孔，且每次实验至少重复3次；培养12h后，弃去原培养基。将BLF-16加入细胞中预孵育2h后，加入LPS(脂多糖)1μg/mL，继续培养24h后。培养结束后收集细胞培养液上清，用IL-1βELISA检测试剂盒进行细胞因子IL-1β含量的测定。根据ELISA试剂盒说明书，检测细胞因子含量。

实验结果：BLF-16可显著抑制LPS(脂多糖)诱导的RAW264.7巨噬细胞上清液中炎性因子IL-1β的分泌，且呈剂量依赖性(图14)。

实施例9：BLF-16剂量依赖性抑制LPS诱导RAW264.7巨噬细胞炎症相关蛋白iNOS的免疫荧光表达。

实验方法：iNOS蛋白在RAW264.7细胞中的定，待RAW264.7细胞生长至对数生长期，以1×10⁵/孔的密度接种到带有玻片的6孔培养板中，每孔加入2mL细胞悬液，每组设置3个复孔，且每次实验至少重复3次；培养12h后，弃去原培养基。将BLF-16加入细胞中预孵育2h后，加入LPS(脂多糖)1μg/mL，继续培养24h。培养结束后去除细胞上清液，将已爬好细胞玻片的6孔板用PBS充分轻柔洗涤3次，每次1min；用4％的多聚甲醛固定爬片20min，PBS浸洗玻片3次，每次3min；0.5％Triton X-100(PBS配制)室温通透20min，PBS浸洗玻片3次，每次3min；在玻片上滴加2％BSA，室温封闭30min；去掉封闭液，不洗，每张玻片滴加足够量的稀释好的一抗(iNOS 1:1000)，4℃孵育过夜；去掉一抗，PBS浸洗爬片3次，每次3min，滴加稀释好的荧光二抗，加荧光二抗，室温下置于摇床孵育1h(注意避光)，PBS浸洗切片3次，每次3min；(注意：从加荧光二抗起，后面所有操作步骤都尽量在较暗处进行。)滴加DAPI避光孵育5min，对标本进行染核，PBS 3min x3次洗去多余的DAPI；用吸水纸吸干爬片上的液体，用含抗荧光淬灭剂的封片液封片，然后在荧光显微镜下观察采集图像。

实验结果：BLF-16可显著抑制LPS(脂多糖)诱导的RAW264.7巨噬细胞iNOS蛋白表达量，且呈剂量依赖性(图15)。

本发明说明书中未作详细描述的内容属于本领域专业技术人员公知的现有技术。尽管上面对本发明说明性的具体实施方式进行了描述，以便于本技术领的技术人员理解本发明，但应该清楚，本发明不限于具体实施方式的范围，对本技术领域的普通技术人员来讲，只要各种变化在所附的权利要求限定和确定的本发明的精神和范围内，这些变化是显而易见的，一切利用本发明构思的发明创造均在保护之列。

Claims (9)

1.一种三氟甲基烯基酯类化合物在制备抗溃疡性结肠炎药物中的应用。

2.如权利要求1所述的一种三氟甲基烯基酯类化合物在制备抗溃疡性结肠炎药物中的应用，其特征在于，所述抗溃疡性结肠炎药物包括药学上可接受的盐、水合物或溶剂合物，药用辅料。

3.如权利要求1所述的一种三氟甲基烯基酯类化合物在制备抗溃疡性结肠炎药物中的应用，其特征在于，所述抗溃疡性结肠炎药物为液体制剂、固体制剂、半固体制剂、气体制剂中的任意一种。

4.如权利要求1所述的一种三氟甲基烯基酯类化合物在制备抗溃疡性结肠炎药物中的应用，其特征在于，所述抗溃疡性结肠炎药物的剂型为口服给药剂型、皮肤给药剂型、鼻黏膜给药剂型、直肠给药剂型中的任意一种。

5.如权利要求1所述的一种三氟甲基烯基酯类化合物在制备抗溃疡性结肠炎药物中的应用，其特征在于，所述抗溃疡性结肠炎药物改善的疾病临床症状包括：改善体重，降低疾病活动指数，增加结肠长度。

6.如权利要求1所述的一种三氟甲基烯基酯类化合物在制备抗溃疡性结肠炎药物中的应用，其特征在于，所述抗溃疡性结肠炎药物为降低促炎因子水平、提高抗炎细胞因子水平的药物。

7.如权利要求1所述的一种三氟甲基烯基酯类化合物在制备抗溃疡性结肠炎药物中的应用，其特征在于，所述抗溃疡性结肠炎药物具有降低炎症相关蛋白：诱导型NO合成酶、基质金属蛋白酶、促炎白细胞介素的表达作用。

8.如权利要求1所述的一种三氟甲基烯基酯类化合物在制备抗溃疡性结肠炎药物中的应用，其特征在于，所述三氟甲基烯基酯类化合物配置为0.5％羧甲基纤维素钠混悬液。

9.如权利要求8所述的一种三氟甲基烯基酯类化合物在制备抗溃疡性结肠炎药物中的应用，其特征在于，所述三氟甲基烯基酯类化合物为0.5％的羧甲基纤维素钠混悬液在小鼠的使用方法是：每日灌胃给药，剂量为10mg/kg/d。

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