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CN116261459A - 用于抑制ythdf1的组合物和方法 - Google Patents

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CN116261459A
CN116261459A CN202180047177.5A CN202180047177A CN116261459A CN 116261459 A CN116261459 A CN 116261459A CN 202180047177 A CN202180047177 A CN 202180047177A CN 116261459 A CN116261459 A CN 116261459A
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CN
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cancer
ythdf1
cells
tumor
compound
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CN202180047177.5A
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罗成
徐萌
陈示洁
李亦林
陈彦韬
蒋华良
陈凯先
蒋战鹏
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Hangzhou Lingzhi Pharmaceutical Technology Co ltd
Shanghai Kangqian Biotechnology Co ltd
Shanghai Institute of Materia Medica of CAS
Original Assignee
Hangzhou Lingzhi Pharmaceutical Technology Co ltd
Shanghai Kangqian Biotechnology Co ltd
Shanghai Institute of Materia Medica of CAS
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Abstract

提供用于减弱YTHDF1活性的组合物和方法，以及用于促进免疫应答的组合物和方法。例如，提供一种YTH N6‑甲基腺苷RNA结合蛋白1(YTHDF1)减弱剂，其中所述减弱剂包括一种化合物，且在与YTHDF1结合时，所述化合物与YTHDF1的至少一个残基结合。

Description

用于抑制YTHDF1的组合物和方法
背景技术
针对肿瘤新抗原的自发性T细胞致敏对于免疫疗法的临床疗效至关重要。但是，在许多患者中，新抗原识别不足以诱导完全肿瘤排斥所需的持续的T细胞应答。鉴定影响肿瘤新抗原免疫应答性的分子途径可为改善免疫疗法的应答提供靶点。例如，m6A是最丰富的内部mRNA修饰，负责多种细胞类型mRNA的转录后调控。此外，m6A可通过m6A结合蛋白包含YTH结构域的家族蛋白1(YTHDF1)影响mRNA的翻译效率。以前的研究显示，在免疫系统(例如，抗原呈递细胞)的各种细胞中减弱YTHDF1的活性可有助于诱导充分和持续的抗肿瘤免疫应答。但是，减弱YTHDF1活性的有效组合物和方法仍然是迫切需要的。
发明内容
本申请提供用于减弱YTHDF1活性的组合物和方法。本申请还提供经修饰的抗原呈递细胞(mAPC)，诸如经修饰的树突状细胞，具有增强的活性。本申请的组合物和mAPC可用于以下的一种或多种目的：激活APC(诸如DC)；产生具有增强的抗肿瘤活性的免疫细胞；防止和/或逆转免疫细胞(诸如T细胞)的耗竭；治疗与有需要的受试者中的抗原表达相关的疾病、病症或病况；在有需要的受试者中治疗癌症；在有需要的受试者中刺激T细胞介导的对癌细胞和/或肿瘤抗原的免疫应答；在有需要的受试者中提供抗肿瘤免疫；增加和/或改善肿瘤浸润性T细胞的增殖和/或活性；增加和/或改善肿瘤特异性T细胞的增殖和/或活性；增强T细胞的细胞因子的产生；12)增强肿瘤免疫疗法的抗肿瘤反应；13)抑制肿瘤生长，抑制肿瘤细胞的增殖，和/或杀死肿瘤细胞。本申请还提供用于增强免疫应答的方法和组合物，该组合物结合了本申请的YTHDF1减弱剂和第二活性药剂，诸如免疫检查点抑制剂。
YTHDF1是YTH结构域家族的成员，是经m6A修饰的“阅读器”。例如，通过与翻译起始因子相互作用，YTHDF1有助于提高mRNA的翻译效率。此外，YTHDF1的失调可打破原癌基因和肿瘤抑制因子之间的表达平衡，暗示YTHDF1与肿瘤发生之间的联系。据报道，YTHDF1的过表达与一些恶性肿瘤如结直肠癌(CRC)和肝细胞癌(HCC)有关。此外，发现Ythdf1缺陷(Ythdf1-/-)小鼠表现出提高的抗肿瘤免疫应答，表明YTHDF1是新的潜在治疗靶点。YTHDF1也被发现与T细胞耗竭标记基因的表达有关。在T细胞中缺乏YTHDF1的小鼠对淋巴瘤、实体瘤(诸如黑素瘤和结肠癌)和其他类型的癌症显示出更好的抗肿瘤免疫。YTHDF1缺陷小鼠中的肿瘤浸润性T细胞功能增强。此外，拯救T细胞耗竭的分化以朝向记忆样或干细胞样CD8+T细胞的命运。
一方面，本申请提供一种YTH N6-甲基腺苷RNA结合蛋白1(YTHDF1)减弱剂，该药剂包含一种化合物，当与YTHDF1结合时，化合物结合至少一个残基，对应于选自SEQ ID NO:1的氨基酸残基372-392、479-494和526-535的残基。
在一些实施方案中，当与YTHDF1结合时，包含YTHDF1减弱剂的化合物结合至少一个残基，对应于以下残基：SEQ ID NO:1的N378、F382、W384、F480和H528。
在一些实施方案中，包含YTHDF1减弱剂的化合物能够阻断YTHDF1与m6A的结合。
在一些实施方案中，包含YTHDF1减弱剂的化合物基本上不与m6A竞争结合YTHDF1。
在一些实施方案中，YTHDF1减弱剂包括式I化合物、式I化合物的前药、代谢物、衍生物或上述任一者的药学上可接受的盐、酯或酰胺：
Figure BDA0004016647150000021
(式1)，其中R1选自C1-50烃基、C1-50经取代烃基、C1-50杂烃基和C1-50经取代杂烃基。
在一些实施方案中，式I中的R1为(CO)-R2，且R2为任选经取代的烯基。在一些实施方案中，R2为CH＝CH-R3，且R3为任选经取代的芳基。在一些实施方案中，R3为式II
Figure BDA0004016647150000022
其中其中A为任选经取代的呋喃或
Figure BDA0004016647150000023
R6为羟基，且R5为任选经取代的烯基。
在一些实施方案中，在式II中，A为
Figure BDA0004016647150000024
且R4为
Figure BDA0004016647150000025
在一些实施方案中，在式II中，A为
Figure BDA0004016647150000026
R6为羟基，R5为CH＝CH-R7，且R7为
Figure BDA0004016647150000027
在一些实施方案中，包含本申请的YTHDF1减弱剂的化合物包含至少两个二羟基苯基部分。
在一些实施方案中，包含本申请的YTHDF1减弱剂的化合物包含至少三个二羟基苯基部分。
在一些实施方案中，YTHDF1减弱剂包括式III的化合物、式III化合物的前药、代谢物、衍生物或上述任一者的药学上可接受的盐、酯或酰胺：
Figure BDA0004016647150000031
(式III)，其中A为任选经取代的呋喃或
Figure BDA0004016647150000032
R6为羟基，且R5为任选经取代的烯基。
在一些实施方案中，在式III中，A为
Figure BDA0004016647150000033
且R4为
Figure BDA0004016647150000034
在一些实施方案中，在式III中，A为
Figure BDA0004016647150000035
R6为羟基，R5为CH＝CH-R7，且R7为
Figure BDA0004016647150000036
在一些实施方案中，化合物包含下列任一种化合物、下列任一种化合物的前药、代谢物、衍生物或上述任一者的药学上可接受的盐、酯或酰胺：
Figure BDA0004016647150000037
在一些实施方案中，化合物包含下列任一种化合物、下列任一种化合物的前药、代谢物、衍生物或上述任一者的药学上可接受的盐、酯或酰胺：
Figure BDA0004016647150000041
在一些实施方案中，化合物包括下列任一种化合物、下列任一种化合物的前药、代谢物、衍生物或上述任一者的药学上可接受的盐、酯或酰胺：
Figure BDA0004016647150000042
在一些实施方案中，包含YTHDF1减弱剂的化合物是来源于植物的。
在一些实施方案中，在植物提取物中提供包含YTHDF1减弱剂的化合物。在一些实施方案中，植物为鼠尾草属植物。在一些实施方案中，植物为丹参(Danshen)。
一方面，本申请提供一种经修饰的抗原呈递细胞(mAPC)，其中mAPC已用本申请的YTHDF1减弱剂处理和/或包含本申请的YTHDF1减弱剂。在一些实施方案中，mAPC是经修饰的树突状细胞(mDC)。
一方面，本申请提供一种组合物，组合物包含本申请的YTHDF1减弱剂和/或本申请的mAPC。在一些实施方案中，本申请的组合物包含药学上可接受的载剂。在一些实施方案中，组合物是疫苗组合物。
在一些实施方案中，组合物进一步包含第二活性成分。在一些实施方案中，第二活性成分是抗癌剂。
在一些实施方案中，第二活性成分包含癌症免疫疗法。在一些实施方案中，第二活性成分包含免疫检查点抑制剂。在一些实施方案中，第二活性成分包括选自以下的药剂：抗PD-L1抗体或其抗原结合部分、抗PD-1抗体或其抗原结合部分、抗CTLA-4抗体或其抗原结合部分以及IDO抑制剂。
在一些实施方案中，第二活性成分包括帕博利珠单抗(pembrolizumab)、纳武利尤单抗(nivolumab)、西米普利单抗(cemiplimab)、阿替利珠单抗(atezolizumab)、阿维鲁单抗(avelumab)、度伐利尤单抗(durvalumab)、伊匹单抗(ipilimumab)和/或上述任一者的抗原结合片段或衍生物。
在一些实施方案中，第二活性成分能够在接受它的受试者中引起一种或多种肿瘤抗原的增加。
在一些实施方案中，肿瘤抗原选自CEA、gp100、MAGE家族蛋白、DAGE、GAGE、RAGE、NY-ESO 1、Melan-A/MART 1、TRP-1、TRP-2、酪氨酸酶、HER-2/neu、MUC-1、p53、KSA、PSA、PSMA及其片段和修饰形式。
在一些实施方案中，第二活性成分包含在单独的容器中，并且未与mAPC或YTHDF1减弱剂混合。
一方面，本申请提供一种减弱YTHDF1活性的方法，包括施用有效量的本申请的YTHDF1减弱剂。
在一些实施方案中，该方法是体内方法。在一些实施方案中，该方法是体外方法。在一些实施方案中，该方法是离体方法。
一方面，本申请提供一种确定候选药剂是否为YTHDF1减弱剂的方法，包括：使候选药剂与YTHDF1突变体接触，其中该YTHDF1突变体在一个或多个残基处包括一个或多个氨基酸取代、缺失和/或添加，该残基对应于选自SEQ ID NO:1的残基372-392、479-494和526-535的残基。
在一些实施方案中，YTHDF1突变体在一个或多个残基处包括一个或多个氨基酸取代、缺失和/或添加，该残基对应于选自SEQ ID NO:1的残基N378、F382、W384、F480和H528的残基。
在一些实施方案中，该方法进一步包括确定候选药剂是否与YTHDF1突变体特异性结合。
一方面，本申请提供一种试剂盒，其包含本申请的YTHDF1突变体。
一方面，本申请提供化合物在制备YTHDF1减弱剂中的用途，其中，在与YTHDF1结合时，该化合物与至少一个残基结合，该残基对应于选自SEQ ID NO:1的氨基酸残基372-392、479-494和526-535的残基。
在一些实施方案中，在与YTHDF1结合时，该化合物与下列残基对应的至少一个残基结合：SEQ ID NO:1的N378、F382、W384、F480和H528。
在一些实施方案中，化合物能够阻断YTHDF1与m6A的结合。
在一些实施方案中，化合物基本上不与m6A竞争结合YTHDF1。
在一些实施方案中，化合物包含式I化合物、式I化合物的前药、代谢物、衍生物或上述任一者的药学上可接受的盐、酯或酰胺：
Figure BDA0004016647150000061
(式I)，其中R1选自C1-50烃基、C1-50经取代烃基、C1-50杂烃基和C1-50经取代杂烃基。
在一些实施方案中，在式I化合物中，R1为(CO)-R2，且R2为任选经取代的烯基。在一些实施方案中，R2为CH＝CH-R3，且R3为任选经取代的芳基。
在一些实施方案中，R3为式II
Figure BDA0004016647150000062
其中A为任选经取代的呋喃或
Figure BDA0004016647150000063
R6为羟基，且R5为任选经取代的烯基。
在一些实施方案中，在式II中，A为
Figure BDA0004016647150000064
且R4为
Figure BDA0004016647150000065
在一些实施方案中，在式II中，A为
Figure BDA0004016647150000066
R6为羟基，R5为CH＝CH-R7，且R7为
Figure BDA0004016647150000067
在一些实施方案中，化合物包含至少两个二羟基苯基部分。
在一些实施方案中，化合物包含至少三个二羟基苯基部分。
在一些实施方案中，化合物包含式III的化合物、式III化合物的前药、代谢物、衍生物，或上述任一者的药学上可接受的盐、酯或酰胺：
Figure BDA0004016647150000068
(式III)，其中A为任选经取代的呋喃或
Figure BDA0004016647150000069
R6为羟基，且R5为任选经取代的烯基。
在一些实施方案中，在式III中，A为
Figure BDA0004016647150000071
且R4为
Figure BDA0004016647150000072
在一些实施方案中，A为
Figure BDA0004016647150000073
R6为羟基，R5为CH＝CH-R7，且R7为
Figure BDA0004016647150000074
在一些实施方案中，化合物包含下列化合物中的任一种、下列任一种化合物的前药：
Figure BDA0004016647150000075
在一些实施方案中，化合物是来源于植物的。在一些实施方案中，在植物提取物中提供化合物。在一些实施方案中，植物为鼠尾草属植物。在一些实施方案中，植物为丹参(Danshen)。
一方面，本申请提供激活APC的方法，该方法包括向该APC施用本申请的YTHDF1减弱剂。
一方面，本申请提供激活DC的方法，该方法包括向该DC施用本申请的YTHDF1减弱剂。
一方面，本申请提供治疗有需要的受试者中与抗原表达相关的疾病、病症或病况的方法，包括向该受试者施用：本申请的YTHDF1减弱剂；本申请的mAPC；和/或本申请的组合物。
在该方法的一些实施方案中，该抗原是肿瘤抗原。
在该方法的一些实施方案中，该抗原是选自以下的肿瘤抗原：CEA、gp100、MAGE家族蛋白、DAGE、GAGE、RAGE、NY-ESO 1、Melan-A/MART 1、TRP-1、TRP-2、酪氨酸酶、HER-2/neu、MUC-1、p53、KSA、PSA、PSMA及其片段和修饰形式。
在该方法的一些实施方案中，该疾病、病症或病况是癌症。
在一些实施方案中，该癌症选自血液肿瘤、淋巴瘤和实体肿瘤。
在一些实施方案中，该癌症选自黑素瘤、乳腺癌、肺癌、卵巢癌、脑癌、肝癌、宫颈癌、结肠癌、结直肠癌、肾癌、皮肤癌、头颈癌、骨癌、食管癌、膀胱癌、子宫癌、淋巴癌、胃癌、胰腺癌、睾丸癌、淋巴瘤和白血病。
一方面，本申请提供在有需要的受试者中治疗癌症的方法，包括向该受试者施用：本申请的YTHDF1减弱剂；本申请的mAPC；和/或本申请的组合物。在一些实施方案中，该癌症选自血液肿瘤、淋巴瘤和实体肿瘤。在一些实施方案中，该癌症选自黑素瘤、乳腺癌、肺癌、卵巢癌、脑癌、肝癌、宫颈癌、结肠癌、结直肠癌、肾癌、皮肤癌、头颈癌、骨癌、食管癌、膀胱癌、子宫癌、淋巴癌、胃癌、胰腺癌、睾丸癌、淋巴瘤和白血病。
一方面，本申请提供在有需要的受试者中刺激T细胞介导的对癌细胞和/或肿瘤抗原的免疫应答的方法，包括向该受试者施用：本申请的YTHDF1减弱剂；本申请的mAPC；和/或本申请的组合物。在一些实施方案中，该肿瘤抗原选自CEA、gp100、MAGE家族蛋白、DAGE、GAGE、RAGE、NY-ESO 1、Melan-A/MART 1、TRP-1、TRP-2、酪氨酸酶、HER-2/neu、MUC-1、p53、KSA、PSA、PSMA及其片段和修饰形式。
一方面，本申请提供在有需要的受试者中抗肿瘤免疫的方法，包括向该受试者施用：本申请的YTHDF1减弱剂；本申请的mAPC；和/或本申请的组合物。
一方面，本申请提供在有需要的受试者中预防和/或逆转T细胞耗竭的方法，包括向该受试者施用：本申请的YTHDF1减弱剂；本申请的mAPC；和/或本申请的组合物。
一方面，本申请提供在有需要的受试者中增强T细胞活性的方法，包括向该受试者施用：本申请的YTHDF1减弱剂；本申请的mAPC；和/或本申请的组合物。在一些实施方案中，该T细胞包括肿瘤浸润性T细胞。在一些实施方案中，该T细胞包括肿瘤特异性T细胞。
在本申请的该方法的一些实施方案中，该受试者是癌症患者。在一些实施方案中，该癌症选自血液肿瘤、淋巴瘤和实体肿瘤。在一些实施方案中，该癌症选自黑素瘤、乳腺癌、肺癌、卵巢癌、脑癌、肝癌、宫颈癌、结肠癌、结直肠癌、肾癌、皮肤癌、头颈癌、骨癌、食管癌、膀胱癌、子宫癌、淋巴癌、胃癌、胰腺癌、睾丸癌、淋巴瘤和白血病。
在一些实施方案中，该受试者已接受，正在接受和/或将接受抗癌治疗。在一些实施方案中，该抗癌治疗包括癌症免疫疗法。在一些实施方案中，该抗癌治疗包括免疫检查点抑制剂。在一些实施方案中，该抗癌治疗包括选自以下的药剂：抗PD-L1抗体或其抗原结合部分、抗PD-1抗体或其抗原结合部分、抗CTLA-4抗体或其抗原结合部分以及IDO抑制剂。在一些实施方案中，该抗癌治疗包括帕博利珠单抗、纳武利尤单抗、西米普利单抗、阿替利珠单抗、阿维鲁单抗、度伐利尤单抗、伊匹单抗和/或上述任一者的抗原结合片段或衍生物。在一些实施方案中，该抗癌治疗能够在该受试者中引起一种或多种肿瘤抗原的增加。在一些实施方案中，该肿瘤抗原选自CEA、gp100、MAGE家族蛋白、DAGE、GAGE、RAGE、NY-ESO 1、Melan-A/MART 1、TRP-1、TRP-2、酪氨酸酶、HER-2/neu、MUC-1、p53、KSA、PSA、PSMA及其片段和修饰形式。
在一些实施方案中，该方法进一步包括向受试者施用一种或多种额外的抗癌治疗。在一些实施方案中，额外的抗癌治疗包括癌症免疫疗法。在一些实施方案中，额外的抗癌治疗包括免疫检查点抑制剂。在一些实施方案中，额外的抗癌治疗包括选自以下的药剂：抗PD-L1抗体或其抗原结合部分、抗PD-1抗体或其抗原结合部分、抗CTLA-4抗体或其抗原结合部分以及IDO抑制剂。在一些实施方案中，额外的抗癌治疗包括帕博利珠单抗、纳武利尤单抗、西米普利单抗、阿替利珠单抗、阿维鲁单抗、度伐利尤单抗、伊匹单抗和/或上述任一者的抗原结合片段或衍生物。在一些实施方案中，额外的抗癌治疗能够在该受试者中引起一种或多种肿瘤抗原的增加。在一些实施方案中，肿瘤抗原选自CEA、gp100、MAGE家族蛋白、DAGE、GAGE、RAGE、NY-ESO 1、Melan-A/MART 1、TRP-1、TRP-2、酪氨酸酶、HER-2/neu、MUC-1、p53、KSA、PSA、PSMA及其片段和修饰形式。
一方面，本申请提供本申请的YTHDF1减弱剂、本申请的mAPC和/或本申请的组合物在制备用于以下一种或多种目的组合物和/或药物中的用途：1)激活APC；2)激活DC；3)产生具有增强的抗肿瘤活性的免疫细胞；4)预防和/或逆转免疫细胞(诸如T细胞)的耗竭；5)在有需要的受试者中治疗与抗原表达相关的疾病、病症或病况；6)在有需要的受试者中治疗癌症；7)在有需要的受试者中刺激T细胞介导的对癌细胞和/或肿瘤抗原的免疫应答；8)在有需要的受试者中提供抗肿瘤免疫；9)增加和/或改善肿瘤浸润性T细胞的增殖和/或活性；10)增加和/或改善肿瘤特异性T细胞的增殖和/或活性；11)增强T细胞的细胞因子产生；12)增强肿瘤免疫疗法的抗肿瘤反应；以及13)抑制肿瘤生长、抑制肿瘤细胞的增殖和/或杀死肿瘤细胞。
在一些实施方案中，癌症或肿瘤选自血液肿瘤、淋巴瘤和实体肿瘤。在一些实施方案中，癌症或肿瘤选自黑素瘤、乳腺癌、肺癌、卵巢癌、脑癌、肝癌、宫颈癌、结肠癌、结直肠癌、肾癌、皮肤癌、头颈癌、骨癌、食管癌、膀胱癌、子宫癌、淋巴癌、胃癌、胰腺癌、睾丸癌、淋巴瘤和白血病。
一方面，本申请提供本申请的YTHDF1减弱剂、本申请的mAPC和/或本申请的组合物结合额外的活性成分在制备用于以下一种或多种的药物中的用途：1)激活APC；2)激活DC；3)产生具有增强的抗肿瘤活性的免疫细胞；4)预防和/或逆转免疫细胞(诸如T细胞)的耗竭；5)在有需要的受试者中治疗与抗原表达相关的疾病、病症或病况；6)在有需要的受试者中治疗癌症；7)在有需要的受试者中刺激T细胞介导的对癌细胞和/或肿瘤抗原的免疫应答；8)在有需要的受试者中提供抗肿瘤免疫；9)增加和/或改善肿瘤浸润性T细胞的增殖和/或活性；10)增加和/或改善肿瘤特异性T细胞的增殖和/或活性；11)增强T细胞的细胞因子产生；12)增强肿瘤免疫疗法的抗肿瘤反应；以及13)抑制肿瘤生长、抑制肿瘤细胞的增殖和/或杀死肿瘤细胞。
在一些实施方案中，额外的活性成分包括癌症免疫疗法。在一些实施方案中，额外的活性成分包括免疫检查点抑制剂。在一些实施方案中，额外的活性成分包括选自以下的药剂：抗PD-L1抗体或其抗原结合部分、抗PD-1抗体或其抗原结合部分、抗CTLA-4抗体或其抗原结合部分以及IDO抑制剂。在一些实施方案中，额外的活性成分包括帕博利珠单抗、纳武利尤单抗、西米普利单抗、阿替利珠单抗、阿维鲁单抗、度伐利尤单抗、伊匹单抗和/或上述任一者的抗原结合片段或衍生物。在一些实施方案中，额外的活性成分能够在接受它的受试者中引起一种或多种肿瘤抗原的增加。在一些实施方案中，肿瘤抗原选自CEA、gp100、MAGE家族蛋白、DAGE、GAGE、RAGE、NY-ESO 1、Melan-A/MART 1、TRP-1、TRP-2、酪氨酸酶、HER-2/neu、MUC-1、p53、KSA、PSA、PSMA及其片段和修饰形式。
通过以下详细描述，本公开的其他方面和优点对于本领域技术人员将变得显而易见，其中仅显示和描述了本公开的说明性实施方案。将认识到，本公开能够其他和不同实施方案，并且其若干细节能够在各个明显方面修改而全部不会脱离本公开。因此，附图和描述被视为说明性的而非限制性的。
通过引用并入
本说明书中提及的所有公布、专利和专利申请均以引用的方式并入本文，其程度如同每个单独的公布、专利或专利申请被具体地且单独地指示以引用的方式并入一般。
附图简单说明
在随附的权利要求书中具体说明本申请的新颖特征。通过参考下文的详细描述和附图(本文中也称为“图”)，将获得对本申请的特征和优势更好的理解，下文的详细描述阐述了采用本申请的原理的说明性实施方案，其中：
图1a-1b说明了SAA的抑制活性。图1c说明了SAC的抑制活性。图1d说明了SAA与YTHDF1的结合。
图2a-2c说明了SAA与YTHDF1结合的ITC结合曲线。
图3a说明了SAA和YTHDF1之间的SPR结合分析结果。图3b-3c说明了SAA和YTHDF1之间的MST结合分析结果。
图4a-4b说明了SAA和含有m6A的mRNA之间竞争性结合分析的结果。
图5a说明了HDX MS实验结果的残差图。图5b说明了HDX MS实验结果的蝴蝶图。
图6说明了HDX MS实验结果的热力图。
图7说明了YTHDF1的局部氘吸收动力学。在右侧，纵轴表示氘吸收的百分比，且横轴指示HDX过程的持续时间。使用配对t检验比较氘吸收的变化，且P<0.05(*)被认为具有统计学意义。
图8a-8i说明了相关肽的局部交换动力学分析。纵轴表示氘吸收的百分比，且横轴指示HDX过程的持续时间。
图9说明了SAA对YTHDF1突变体和截短体的抑制活性。通过FP分析确定SAA的IC50值。数据表示为平均值±s.e.m。
图10a-10j说明了通过FP分析测定的YTHDF1突变体和C-末端截短体的IC50值。SAA通过两倍梯度稀释从100M稀释。
图11a-11g说明了通过FP分析测定的YTHDF1和其突变体或C-末端截短体的Kd值。蛋白质通过两倍梯度稀释从200M稀释。
图12a-12b说明了在293T细胞中SAA与YTHDF1的结合。CETSA分析在293T细胞系中进行，温度范围如指示地为39.0℃至59.0℃。以GAPDH为内参，通过免疫印迹法检测YTHDF1的表达量。且根据免疫印迹法(图12a)，相对表达量显示在图12b中。
图13a-13b说明了依赖T细胞和DC的SAA的抗肿瘤作用。
图14a-14b说明了在体外SAA对肿瘤细胞生长的作用。
图15a说明了SAA对Rag1-/-小鼠的作用。图15b-15c说明了SAA通过DC增强T细胞交叉致敏的能力。
图16a-16b说明了SAA通过DC增强T细胞直接致敏的能力。
图17a说明了SAA靶向DC以抑制肿瘤生长。图17b-17c说明了SAA可增强肿瘤浸润性T细胞的活性。
图18a说明了经SAA处理的组的PD-1low细胞群体比DMSO组表达更多的CXCR5。图18b说明了经SAA处理的小鼠的肿瘤浸润性终末期耗竭性T细胞(PD-1+Tim-3+)的百分比下降。图18c说明了SAA结合抗PD-L1抗体的抗肿瘤作用。
图19说明了SAA和SAC的抗肿瘤作用。
图20说明了SAA连同PD-1阻断的抗肿瘤作用。
图21说明了过继转移经SAA处理的FLT3L DC表现出持续的抗肿瘤功能。
具体实施方式
尽管本文中已显示和描述了本申请的各种实施方案，但本领域技术人员将显而易见，这些实施方案均是以示例的方式提供的。在不偏离本申请的情况下，本领域技术人员可进行多种修改、改变和替换。应了解，可采用对本文所述的本申请的实施方案的各种替代方案。
一方面，本申请提供一种YTH N6-甲基腺苷RNA结合蛋白1(YTHDF1)减弱剂。YTHDF1减弱剂可包含化合物，当与YTHDF1结合时，化合物可结合至少一个残基，对应于选自SEQ IDNO:1的氨基酸残基372-392、479-494和526-535的残基。
一方面，本申请提供一种经修饰的抗原呈递细胞(mAPC)。mAPC可已用本申请的YTHDF1减弱剂处理。在一些实施方案中，mAPC可包含本申请的YTHDF1减弱剂。mAPC可为经修饰的树突状细胞(mDC)。
一方面，本申请提供一种组合物(诸如药物组合物)。组合物可包含本申请的YTHDF1减弱剂。可替代地，或此外，组合物可包含本申请的mAPC。组合物可包含药学上可接受的载剂。在某些情形下，组合物可为疫苗组合物。
在某些情形下，组合物可包含额外的或第二活性成分。在本申请中，术语“附加活性成分”和“第二活性成分”可以互换使用。
额外的第二活性成分可包含在单独的容器中，并且未与本申请的mAPC或YTHDF1减弱剂混合。
在某些情形下，额外的活性成分可与本申请的mAPC和/或YTHDF1减弱剂包含在相同的包装或相同的容器。在某些情形下，额外的活性成分可包含在单独的容器中，例如，额外的活性成分可与本申请的mAPC和/或YTHDF1减弱剂包含在不同的容器。在某些情形下，额外的活性成分与本申请的mAPC和/或YTHDF1减弱剂不直接接触(例如，不混合)，即使它们可存在于相同的容器或相同的包装中。
一方面，本申请提供一种减弱YTHDF1活性的方法，该方法可包括施用有效量的本申请的YTHDF1减弱剂。
一方面，本申请提供一种确定候选药剂是否为YTHDF1减弱剂的方法。该方法可包括：使候选药剂与YTHDF1突变体接触。YTHDF1突变体在一个或多个残基处可包括一个或多个氨基酸取代、缺失和/或添加，该残基对应于选自SEQ ID NO:1的残基372-392、479-494和526-535的残基。
一方面，本申请提供一种试剂盒。该试剂盒可包含本申请的YTHDF1突变体。
一方面，本申请提供一种化合物在制备YTHDF1减弱剂中的用途。在与YTHDF1结合时，化合物可与至少一个残基结合，该残基对应于选自SEQ ID NO:1的氨基酸残基372-392、479-494和526-535的残基。
一方面，本申请提供激活APC的方法。该方法可包括向APC施用本申请的YTHDF1减弱剂。
一方面，本申请提供激活DC的方法。该方法可包括向DC施用本申请的YTHDF1减弱剂。
一方面，本申请提供治疗有需要的受试者中与抗原表达相关的疾病、病症或病况的方法。该方法可包括向受试者施用：本申请的YTHDF1减弱剂；本申请的mAPC；和/或本申请的组合物。
一方面，本申请提供抑制肿瘤生长、抑制肿瘤细胞的增殖和/或杀死肿瘤细胞的方法。该方法可包括向肿瘤和/或肿瘤细胞施用：本申请的YTHDF1减弱剂；本申请的mAPC；和/或本申请的组合物。
一方面，本申请提供在有需要的受试者中治疗癌症的方法。该方法可包括向受试者施用：本申请的YTHDF1减弱剂；本申请的mAPC；和/或本申请的组合物。
一方面，本申请提供(例如，在有需要的受试者中)刺激T细胞介导的对癌细胞和/或肿瘤抗原的免疫应答的方法。该方法可包括向受试者施用：本申请的YTHDF1减弱剂；本申请的mAPC；和/或本申请的组合物。
一方面，本申请提供在有需要的受试者中提供抗肿瘤免疫的方法。该方法可包括向受试者施用：本申请的YTHDF1减弱剂；本申请的mAPC；和/或本申请的组合物。
一方面，本申请提供在有需要的受试者中预防和/或逆转免疫细胞(诸如免疫效应细胞，例如T细胞)的耗竭的方法。该方法可包括向受试者施用：本申请的YTHDF1减弱剂；本申请的mAPC；和/或本申请的组合物。
一方面，本申请提供在有需要的受试者中增强免疫细胞活性，诸如免疫效应细胞(例如T细胞)的方法。该方法可包括向受试者施用：本申请的YTHDF1减弱剂；本申请的mAPC；和/或本申请的组合物。在一些实施方案中，免疫细胞包括肿瘤浸润性T细胞。在一些实施方案中，免疫细胞包括肿瘤特异性T细胞。
一方面，本申请提供本申请的YTHDF1减弱剂、本申请的mAPC和/或本申请的组合物在制备用于以下一种或多种目的组合物和/或药物中的用途：1)激活APC；2)激活DC；3)产生具有增强的抗肿瘤活性的免疫细胞；4)预防和/或逆转免疫细胞(诸如免疫效应细胞，例如T细胞)的耗竭；5)在有需要的受试者中治疗与抗原表达相关的疾病、病症或病况；6)在有需要的受试者中治疗癌症；7)在有需要的受试者中刺激免疫细胞(例如免疫效应细胞，诸如T细胞)介导的对癌细胞和/或肿瘤抗原的免疫应答；8)在有需要的受试者中提供抗肿瘤免疫；9)增加和/或改善免疫细胞(例如，免疫效应细胞，诸如T细胞，例如肿瘤浸润性T细胞)的增殖和/或活性；10)增加和/或改善肿瘤特异性免疫细胞(例如免疫效应细胞，诸如T细胞)的增殖和/或活性；11)增强T细胞的细胞因子产生；12)增强肿瘤免疫疗法的抗肿瘤反应；以及13)抑制肿瘤生长、抑制肿瘤细胞的增殖和/或杀死肿瘤细胞。
一方面，本申请提供本申请的YTHDF1减弱剂、本申请的mAPC和/或本申请的组合物结合额外的活性成分在制备用于以下一种或多种目的的药物中的用途：1)激活APC；2)激活DC；3)产生具有增强的抗肿瘤活性的免疫细胞；4)预防和/或逆转免疫细胞(诸如免疫效应细胞，例如T细胞)的耗竭；5)在有需要的受试者中治疗与抗原表达相关的疾病、病症或病况；6)在有需要的受试者中治疗癌症；7)在有需要的受试者中刺激免疫细胞(例如免疫效应细胞，诸如T细胞)介导的对癌细胞和/或肿瘤抗原的免疫应答；8)在有需要的受试者中提供抗肿瘤免疫；9)增加和/或改善免疫细胞(例如，免疫效应细胞，诸如T细胞，例如肿瘤浸润性T细胞)的增殖和/或活性；10)增加和/或改善肿瘤特异性免疫细胞(例如免疫效应细胞，诸如T细胞)的增殖和/或活性；11)增强T细胞的细胞因子产生；12)增强肿瘤免疫疗法的抗肿瘤反应；以及13)抑制肿瘤生长、抑制肿瘤细胞的增殖和/或杀死肿瘤细胞。
如本文所用，术语“包含”、“包括”、“具有(having)”、“具有(has)”、“可”、“含有”及其变化形式通常是指不排除其他行为或结构可能性的开放式过渡性短语、术语或词汇。单数形式的“一(a/an)”和“所述”包括复数引用物。
关于本文中数字范围的叙述，明确涵盖其间具有相同精度的每个中间数字。例如，对于6-9的范围而言，除6和9以外还涵盖7和8，而对于6.0-7.0的范围而言，明确涵盖数字6.0、6.1、6.2、6.3、6.4、6.5、6.6、6.7、6.8、6.9和7.0。因此，范围格式的描述仅为方便和简单起见，而不应解释为对本申请的发明范围的硬性限制。范围的描述应理解为具体公开所有可能的子范围以及该范围内的个别数值。例如，描述诸如1至6的范围应理解为具体公开诸如1至3、1至4、1至5、2至4、2至6、3至6等子范围以及该范围内的个别数值，例如1、2、2.7、3、4、5、5.3和6。又例如，诸如95-100％(例如，95-96％、95-97％、95-98％、95-99％、95-99.5％或更高)同一性的范围包括具有95％、96％、97％、98％或99％同一性的某些事物，且包括诸如96-99％、96-98％、96-97％、97-99％、97-98％和98-99％同一性的子范围。无论范围的广度如何，这都适用。
与数量相关使用的修饰语“约”包括规定的值并具有上下文指示的含义(例如，它包括至少与特定数量的测量相关的误差程度)。修饰语“约”也应被理解为公开了由两个端点的绝对值所定义的范围。例如，“约2至约4”的表达也公开了“2至4”的范围。在提到诸如量、持续时间等可测量值时，术语“约”的意思是涵盖规定值±20％的差异，或在某些情形下为±10％的差异，或在某些情形下为±5％的差异，或在某些情形下为±1％的差异，或在某些情形下为±0.1％的差异，因为这些差异都是适当的。
如本文所用，术语“受试者”通常是指人类或动物。例如，可以指任何脊椎动物，包括(但不限于)哺乳动物(例如，奶牛、猪、骆驼、马、山羊、兔、绵羊、仓鼠、豚鼠、猫、狗、大鼠和小鼠、非人灵长类动物(例如，猴，诸如食蟹猴、黑猩猩等)和人类)。在一些方面，受试者为人类。
术语“治疗(treat/treated/treating)”在本文中可互换使用，且通常是指目的在于减缓(减轻)不希望的生理状况、病症或疾病，或获得有益的或期望的临床结果的治疗方法。在本公开的一些方面，有益的或期望的临床结果包括(但不限于)缓解症状；减轻病况、病症或疾病的程度；稳定病况、病症或疾病的状态(不恶化)；延迟病况、病症或疾病的发作或减缓病况、病症或疾病的发展；改善病况、病症或疾病状态；以及缓解(无论是部分缓解还是完全缓解、无论可检测还是不可检测)或增强或改善病况、病症或疾病。治疗还包括与未接受治疗时的预期生存期相比延长生存期。
术语“修饰(modified/modify/modification)”在本文中可互换使用，且通常是指引入或产生改变或变化。当用在基因的情况下时，所述修饰可包括在细胞的活性和/或功能方面产生变化的任何常规方法。例如，通过将细胞(例如，抗原呈递细胞)暴露于能够调节细胞的活性和/或功能的药剂。
术语“减弱(attenuating/attenuation/attenuated)”可互换使用，且如本文中所用，可以是指抑制或减少靶基因或靶蛋白(诸如YTHDF1或YTHDF1的标靶)的量，或抑制或减小靶基因或靶蛋白(诸如YTHDF1或YTHDF1的标靶)的活性。所述减弱可以通过使用例如抗体或其衍生物、抗体药物偶联物、融合蛋白、小分子、反义分子、dsRNA、siRNA、shRNA、适配体和/或gRNA(例如，与基因编辑系统(诸如CRIPSR/Cas9)组合)来实现。又例如，可通过使抗原呈递细胞(例如，树突状细胞)与YTHDF1的抑制剂(诸如本申请的化合物)接触来抑制/阻断YTHDF1结合和/或识别经m6A修饰的mRNA，从而减弱YTHDF1。
如本文所用，术语“小分子”通常是指除多肽和核酸以外，可用以影响生物过程，尤其是调节m6A mRNA修饰(例如YTHDF1的活性)的任何化学或其他部分。小分子可包括目前已知和使用的任何数量的治疗剂，或者可以在此类分子库中合成以用于筛选生物学功能的治疗剂。小分子与大分子的区别在于大小。小分子可具有小于约5,000道尔顿(Da)、诸如小于约2,500Da、小于约1,000Da或小于约500Da的分子量。小分子可包括(但不限于)有机化合物及其肽模拟物和偶联物。
本文使用的术语“氨基酸”广义上来说是指任何可被并入多肽链的化合物和/或物质。在一些实施方案中，氨基酸具有通用结构H2N-C(H)(R)-COOH。在一些实施方案中，氨基酸是天然存在的氨基酸。在一些实施方案中，氨基酸是合成氨基酸；在一些实施方案中，氨基酸是d-氨基酸；在一些实施方案中，氨基酸是1-氨基酸。“标准氨基酸”是指天然存在的肽中常见的20种标准1-氨基酸中的任一种。“非标准氨基酸”是指除标准氨基酸以外的任何氨基酸，不论它是合成制备的还是从天然来源获得的。本文使用的“合成氨基酸”涵盖经化学修饰的氨基酸，包括但不限于盐、氨基酸衍生物(诸如酰胺类)和/或取代。氨基酸(包括肽中的羧基和/或氨基末端氨基酸)可通过甲基化、酰胺化、乙酰化、保护基团和/或其他化学基团的取代进行修饰，该修饰可改变肽的循环半衰期，而不会对其活性产生不利影响。氨基酸可参与二硫键。氨基酸可包含一种或多种翻译后修饰，诸如与一种或多种化学实体(例如甲基基团、乙酸盐基团、乙酰基基团、磷酸盐基团、甲酰基部分、类异戊二烯基基团、硫酸盐基团、聚乙二醇部分、脂质部分、碳水化合物部分、生物素部分等)缔合。术语“氨基酸”与“氨基酸残基”互换使用，且可指游离氨基酸和/或肽的氨基酸残基。
本文使用的术语“YTHDF1”通常指YTH N6-甲基腺苷RNA结合蛋白1或其功能片段，其特异性识别并结合含有N6-甲基腺苷(m6A)的RNA，并调节mRNA稳定性。可在公共数据库中发现人和鼠的氨基酸和核酸序列，诸如GenBank、UniProt和Swiss-Prot。例如，可以登录号NP_060268.2发现人YTHDF1的氨基酸序列，并且可以登录号NM_017798.4发现编码它们的mRNA序列。
本文使用的术语“YTHDF1突变体”通常指编码YTHDF1的核酸分子或YTHDF1蛋白，其与对应的编码YTHDF1的亲本或参考(例如，野生型)核酸分子或对应的亲本或参考(例如，野生型)YTHDF1蛋白质相比具有一种或多种突变。
就YTHDF1突变蛋白而言，该突变蛋白具有至少一个与亲本或参考多肽(包括但不限于野生型YTHDF1多肽)的氨基酸序列不同的氨基酸残基。突变蛋白中的突变可包括一个或多个氨基酸的缺失、取代和/或添加。突变大小的范围可从单个氨基酸至多肽的大片段。在一些实施方案中，插入通过添加多肽片段改变多肽中氨基酸的数量。在一些实施方案中，缺失通过去除多肽片段改变氨基酸的数量。在一些实施方案中，小的缺失可去除多肽中的一个或几个氨基酸。在一些实施方案中，取代用不同的氨基酸替换多肽中的一个氨基酸。取代可为保守的氨基酸取代，或非保守的氨基酸取代。“保守的氨基酸取代”是指通常存在于序列中的氨基酸被具有相似大小、电荷、极性和/或化学性质的不同氨基酸替换。保守取代的实例包括诸如异亮氨酸、缬氨酸和亮氨酸的非极性(疏水性)残基被另一个非极性残基替换。类似地，保守取代的实例包括精氨酸和赖氨酸、谷氨酰胺和天冬酰胺，以及诸如甘氨酸或丝氨酸的极性(亲水性)残基被另一个极性残基取代。此外，诸如赖氨酸、精氨酸或组氨酸的碱性残基被另一个碱性残基取代或诸如天冬氨酸或谷氨酸的一个酸性残基被另一个酸性残基取代是保守取代。“非保守取代”的实例可包括诸如异亮氨酸、缬氨酸、亮氨酸、丙氨酸、甲硫氨酸的非极性(疏水)氨基酸残基被诸如半胱氨酸、谷氨酰胺、谷氨酸或赖氨酸的极性(亲水)残基取代，和/或极性残基被非极性残基取代。
术语“癌症”和“肿瘤”在本文中可互换使用，且通常是指具有异常细胞不可控生长特征的疾病。两种术语均包括实体肿瘤和液体肿瘤，例如弥漫性或循环性肿瘤。包括恶化前以及恶性癌症和肿瘤。
如本文所述的短语“与抗原表达相关的疾病、病症或病况”通常包括(但不限于)与抗原表达相关的疾病或与表达抗原的细胞相关的病况，例如，诸如癌症或恶性肿瘤的增殖性疾病。或诸如脊髓发育不良、骨髓增生异常综合症或前白血病的癌前病变；或与表达或过表达某种抗原(诸如存在于细菌、病毒或细胞(例如非癌症细胞)中的抗原)的细胞相关的非癌症相关适应症。如本文所述的与抗原表达相关的非癌症相关适应症包括(但不限于)，例如自身免疫性疾病、发炎性病症和移植。
如本文所述的短语“与肿瘤抗原的表达相关的疾病、病症或病况”通常包括(但不限于)与肿瘤抗原的表达相关的疾病或与表达肿瘤抗原的细胞相关的病况，例如，诸如癌症或恶性肿瘤的增殖性疾病，或诸如脊髓发育不良、骨髓增生异常综合症或前白血病的癌前病变；或与表达肿瘤抗原的细胞相关的非癌症相关适应症。在一种实施方式中，如本文所述的与肿瘤抗原的表达相关的癌症是血液肿瘤。在一种实施方式中，如本文所述的与肿瘤抗原的表达相关的癌症是实体癌。如本文所述的与肿瘤抗原的表达相关的其他疾病包括(但不限于)例如如本文所述的与肿瘤抗原的表达相关的非典型和/或非经典癌症、恶性肿瘤、癌前病变或增殖性疾病。如本文所述的与肿瘤抗原的表达相关的非癌症相关适应症包括(但不限于)例如自体免疫疾病、发炎性病症和移植。在某些实施方式中，肿瘤抗原表达细胞表达或在任意时间表达过编码肿瘤抗原的mRNA。在一种实施方式中，肿瘤抗原表达细胞产生肿瘤抗原蛋白(例如，野生型或突变型)，并且可存在正常量、增加量或减少量的肿瘤抗原蛋白。
如本文所用，术语“活性”和“激活”通常是指细胞的特殊功能。T细胞的活性例如可为溶细胞活性或辅助细胞活性，包括分泌细胞因子。抗原呈递细胞的活性例如可以是加工和/或呈递抗原以供某些淋巴细胞(诸如，T细胞)识别。
如本文所用，术语“免疫效应细胞”通常是指在免疫应答中，例如在促进免疫效应应答中所涉及的细胞。免疫效应细胞的实例包括T细胞，例如α/βT细胞和γ/δT细胞、B细胞、天然杀手(NK)细胞、天然杀手T(NKT)细胞、肥大细胞和骨髓衍生的吞噬细胞。如本文所用，“免疫效应功能或免疫效应应答”通常是指例如免疫效应细胞增强或促进靶细胞的免疫攻击的功能或应答。例如，免疫效应功能或应答是指T或NK细胞促进杀死靶细胞或抑制靶细胞的生长或增殖的特性。在T细胞的情况下，初级刺激和共刺激是免疫效应功能或应答的实例。
本文使用的术语“抗原呈递细胞”或“APC”通常指能够在其上或其表面显示抗原的细胞(例如免疫细胞)或一组细胞(例如一组免疫细胞)。显示的抗原可与主要组织相容性复合物(MHC)复合，并且在该抗原被显示前可对其进行处理。APC的实例包括但不限于巨噬细胞、B细胞和树突状细胞(诸如朗格汉斯细胞)。在淋巴细胞(例如T细胞)识别通过APC呈递的抗原后，可启动或增强细胞免疫应答。APC可将大分子量抗原分解成10至30个氨基酸片段，用于装载到HLAI类和II类分子上。
本文使用的术语“树突状细胞”或“DC”通常指一种抗原呈递细胞。DC可作为先天性和适应性免疫系统之间的信使。例如，DC可存在于与外部环境接触的组织中，诸如皮肤、鼻子的内层、肺、胃和肠道。也可在血液中以不成熟的状态发现它们。一旦被激活，它们可迁移到淋巴结中与诸如T细胞和B细胞的其他免疫细胞相互作用，以启动和塑造适应性免疫应答。未成熟的树突状细胞也被称为隐匿细胞。DC可以是来源于骨髓(BM)的白细胞。它们也可来自BM和血液使用诸如粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)和Flt3配体的生长因子的各种组合在体外繁殖。DC可特异性捕获和处理抗原，从而将蛋白质转化为在主要组织相容性复合物(MHC)分子上呈递的肽，这些MHC分子被诸如T细胞的其他免疫细胞识别。DC可为异质性的，例如髓样和浆细胞样DC；虽然所有的DC都能够进行抗原摄取、加工和呈递给初始T细胞，但DC亚型可具有不同的标记物，且针对它们的世代，其位置、迁移途径、详细的免疫功能以及对感染或炎性刺激的依赖性不同。在适应性免疫应答的发展过程中，DC的表型和功能可在启动耐受、记忆和/或极化的辅助性T细胞1(Th1)、Th2和Th17分化中起重要作用。
在本申请的上下文中，使用常见核酸碱基的以下缩写。“A”指的是腺苷，“C”指的是胞嘧啶，“G”指的是鸟苷，“T”指的是胸苷，且“U”指的是尿苷。
如本文所用，术语“核酸”或“多核苷酸”通常是指脱氧核糖核酸(DNA)或核糖核酸(RNA)，或其DNA或RNA的组合，以及其单链或双链形式的聚合物。术语“核酸”包括基因、cDNA或mRNA。在一种实施方式中，核酸分子是合成的(例如，化学合成)或重组的。除非特别限制，否则该术语涵盖含有天然核苷酸的类似物或衍生物的核酸，其与参考核酸具有类似的结合特性并且以与天然存在的核苷酸类似的方式进行代谢。除非另外规定，否则特定的核酸序列也隐含地涵盖其经保守修饰的变体(例如，简并密码子取代)、等位基因、直系同源物、SNP和互补序列以及明确指出的序列。具体而言，可通过产生其中一个或多个选定(或所有)密码子的第三位被混合碱基和/或脱氧肌苷残基取代的序列来实现简并密码子取代(Batzer等人，Nucleic Acid Res.19:5081(1991)；Ohtsuka等人，J.Biol.Chem.260:2605-2608(1985)；和Rossolini等人，Mol.Cell.Probes 8:91-98(1994))。
术语“癌症相关抗原”和“肿瘤抗原”在本文中可互换使用，且通常是指与正常细胞相比优先完整地或以片段的形式(例如，MHC/肽)在癌细胞表面上表达且适用于使药剂优先靶向癌细胞的分子(通常是蛋白、糖水化合物或脂质)。在某些实施方式中，肿瘤抗原是一种由正常细胞和癌细胞都表达的标志物。在某些实施方式中，癌症相关抗原是与在正常细胞中相比，在癌细胞中过表达的细胞表面分子，例如比在正常细胞中过表达1倍、过表达2倍、过表达3倍或3倍以上。在某些实施方式中，癌症相关抗原是在癌细胞中不当合成的细胞表面分子，例如与在正常细胞上表达的分子相比含有缺失、添加或突变的分子。在某些实施方式中，癌症相关抗原将完整地或以片段的形式(例如，MHC/肽)只在癌细胞的细胞表面上表达，而不在正常细胞的表面上合成或表达。
如本文所用，术语“特异性结合”通常是指识别并结合存在于样品中的同源结合配体蛋白，但基本上不识别或结合样品中的其他分子的分子(例如，小分子、抗体或配体)。在某些实施方式中，本发明的分子可以小于约10-5M(例如，小于约9×10-6M、小于约8×10-6M、小于约7×10-6M、小于约6×10-6M、小于约5×10-6M、小于约4×10-6M、小于约3.5×10-6M、小于约3×10-6M、小于约2.5×10-6M、小于约2×10-6M、小于约1×10-6M、小于约5×10-7M、小于约2×10-7M、小于约10-7M、小于约5×10-8M、小于约2×10-8M、小于约10-8M、小于约5×10-9M、小于约4×10-9M、小于约3×10-9M、小于约2×10-9M或小于约10-9M)的结合亲和力(Kd)特异性地结合靶分子。
Kd通常可指解离速率与结合速率的比值(koff/kon)，可以通过使用本领域中已知的任何常规方法来确定，包括(但不限于)表面等离子共振法、微量热泳动法、HPLC-MS方法和流式细胞术(诸如FACS)方法。在某些实施方式中，Kd值可通过使用流式细胞术来适当确定。
如本文所用，术语“抗癌剂”通常是指能够抑制和/或预防肿瘤或癌细胞生长的药剂。
如本文所用，术语“CTLA-4”通常是指来源于任何脊椎动物来源，包括哺乳动物，诸如灵长类动物(例如，人、猴)和啮齿动物(例如，小鼠和大鼠)的细胞毒性T-淋巴细胞相关蛋白4及其功能性片段。人类CTLA-4的示例性序列包括智人(人类)CTLA-4蛋白(NCBI参考序列号AAL07473.1)。CTLA-4的示例性序列包括食蟹猴(猴)CTLA-4蛋白(NCBI参考序列号XP_005574071.1)。如本文所用，术语“CTLA-4”通常欲涵盖任意形式的CTLA-4，例如，1)天然未加工的CTLA-4分子、“全长”CTLA-4链或天然存在的CTLA-4变体，包括例如剪接变体或等位基因变体；2)由在细胞中加工产生的任意形式的CTLA-4；或3)通过重组方法产生的全长、片段(例如，截短形式、胞外/跨膜结构域)或经修饰形式(例如，突变形式、糖基化/聚乙二醇化、His-标签/免疫荧光融合形式)的CTLA-4亚基。
术语“抗-CTLA-4抗体”、“抗-CTLA-4结合结构域”或“CTLA-4结合结构域”指的是能特异性结合CTLA-4(例如，人类或猴CTLA-4)的抗体或抗原结合结构域。
如本文所用，术语“PD-1”通常是指程序性细胞死亡蛋白，属于免疫球蛋白超家族且作为共抑制受体负向调节免疫系统。PD-1是CD28/CTLA-4家族的成员，且具有两种已知配体，包括PD-L1和PD-L2。人类PD-1的代表性氨基酸序列以NCBI登录号NP_005009.2公开，且编码人类PD-1的代表性核酸序列以NCBI登录号NM_005018.2显示。
如本文所用，术语“PD-L1”通常是指程序性细胞死亡配体1(PD-L1，参见例如Freeman等人，(2000)J.Exp.Med.192:1027)。人类PD-L1的代表性氨基酸序列以NCBI登录号NP_054862.1公开，且编码人类PD-L1的代表性核酸序列以NCBI登录号NM_014143.3显示。PD-L1与其在激活T细胞、B细胞和骨髓细胞上表达的受体PD-1或B7-1结合。PD-L1与其受体的结合诱导信号转导，从而抑制TCR介导的对细胞因子产生和T细胞增殖的激活。因此，PD-L1在诸如妊娠、自体免疫疾病、组织同种异体移植等特定事件期间在抑制免疫系统方面具有重要作用，并且被认为允许肿瘤或癌细胞绕过免疫检查点并逃避免疫应答。
如本文所用，术语“抗-PD-1抗体”、“抗-PD-1结合结构域”或“PD-1结合结构域”通常是指能以足以提供诊断和/或治疗用途的亲和力特异性结合PD-1(例如，人类或猴PD-1)的抗体或抗原结合结构域。
如本文所用，术语“抗肿瘤免疫”通常是指在由免疫细胞识别癌症抗原时诱导的免疫应答。
如本文所用，术语“癌症免疫疗法”通常是指旨在激发或增强患者对癌细胞的免疫应答的任何疗法。例如，癌症免疫疗法包括(但不限于)癌症抗原特异性主动免疫疗法、用免疫调节剂(例如，免疫抑制剂的激活剂或抑制剂，或检查点抑制剂的抑制剂)进行的治疗，或用癌细胞或来源于癌细胞的抗原混合物进行的治疗(用来源于癌细胞系的抗原进行的治疗)。癌症免疫疗法包括通过诱导、增强或抑制免疫应答来刺激或恢复免疫系统对抗癌症的能力的治疗性治疗。癌症免疫疗法通过增加靶标的免疫细胞识别或通过减少与疾病相关的免疫抑制作用，导致针对疾病特异性抗原的免疫活性靶向。
如本文所用，术语“肿瘤浸润性T细胞”通常是指浸润肿瘤的T细胞。肿瘤浸润性T细胞可对自体肿瘤抗原展示出天然反应性。在肿瘤基质和/或肿瘤本身中可见这类细胞。
如本文所用，术语“IDO抑制剂”通常是指能抑制吲哚胺2,3-双加氧酶(IDO)的活性并由此逆转IDO介导的免疫抑制作用的药剂。IDO抑制剂可抑制IDO1和/或IDO2(INDOL1)。IDO抑制剂可为可逆的或不可逆的IDO抑制剂。“可逆的IDO抑制剂”为在催化位点或非催化位点可逆地抑制IDO酶活性的化合物，且“不可逆的IDO抑制剂”为通过与酶形成共价键不可逆地破坏IDO酶活性的化合物。
如本文所用，术语“免疫检查点抑制剂”通常是指直接地或间接地、部分地或完全地抑制免疫检查点路径的任何分子。通常认为免疫检查点路径的功能是开启或关闭免疫系统的各个方面，尤其是T细胞，而且也包括例如骨髓细胞、NK细胞和B细胞。在激活T细胞之后，大量抑制性受体可上调并存在于T细胞表面上，以便在适当时间抑制免疫应答。免疫检查点路径的实例包括(不限于)PD-1/PD-L1、CTLA-4/B7-1、TIM-3、LAG3、B7-H1、H4、HAVCR2、IDO1、CD276和VTCN1、B7-H3、B7-H4、CD47和KIR。例如，免疫检查点抑制剂或调节剂的非限制性实例包括完全人类单克隆抗，诸如BMS-936558/MDX-1106、BMS-s936559/MDX-1105、伊匹单抗和/或前述任一者的抗原结合片段或衍生物/Yervoy、曲美木单抗(tremelimumab)、BMS-986016、度伐利尤单抗、MEDI4736、乌瑞芦单抗(Urelumab)、CDX-1127和阿维鲁单抗；人源化抗体，诸如CT-011、IV1K-3475、Hu5F9-G4、CC-90002、MBG453、TSR-022和阿替利珠单抗；以及融合蛋白，诸如AMP-224和TTI-621，及其他。免疫检查点调节剂(激动剂)的其他非限制性实例包括针对例如CD40、OX40、GITR、CD137(4-1BB)、CD27、ICOS和TRAIL的抗体。根据本发明，一种或多种免疫检查点调节剂可独立地为多肽或编码多肽的核酸分子；所述多肽包含能够结合靶向免疫检查点和/或抑制配体与所述靶向免疫检查点结合的结构域以便发挥拮抗剂功能(即，能够拮抗免疫检查点介导的抑制信号)或激动剂功能(即，能够增强免疫检查点介导的刺激信号)。所述一种或多种免疫检查点调节剂可独立地选自肽(例如，肽配体)、天然受体的可溶性结构域、RNAi、反义分子、抗体和蛋白支架。例如，免疫检查点调节剂可为抗体。在本发明上下文中，免疫检查调节剂抗体以最广泛的意义使用，且包括例如天然存在的和人工改造的以及能够结合靶免疫检查点或表位的全长抗体或其功能片段或类似物(因此保留靶标结合部分)。所述抗体可为任意来源，例如人类抗体、人源化抗体、动物抗体(例如，啮齿动物或骆驼抗体)或嵌合抗体。所述抗体可为任意同型，尤其优选的是IgG1或lgG4同型。另外，所述抗体可为糖基化或非糖基化的。本领域中已知用于评估抗体对免疫检查点的结合能力的标准分析方法，包括例如ELISA、西方墨点法(Western blot)、RIA和流式细胞术。抗体的结合动力学(例如，结合亲和力)也可以通过本领域中已知的标准分析方法来评估，诸如通过Biacore分析。在提及免疫检查点抑制剂的应用中，也可使用免疫检查点调节剂，除了由上下文的措辞明显可知并非这种情况的那些情况以外。
如本文所用，术语“耗竭”通常是指T细胞耗竭，这是在许多慢性感染和癌症过程中发生的一种T细胞功能障碍状态。T细胞耗竭的特征是T细胞效应子功能较差、抑制性受体持续表达和/或转录状态不同于功能性效应子或记忆T细胞的转录状态。耗竭阻碍了对感染和肿瘤的最佳控制。T细胞耗竭可表现为T细胞功能的逐步和渐进式丧失。如本文所用，“逆转耗竭”通常是指恢复耗竭T细胞的至少一些减弱的或减小的抗肿瘤活性的活性或能力。逆转耗竭还可以包括防止T细胞被耗竭。
如本文所用，术语“T细胞介导的免疫应答”通常是指受T细胞共刺激的调节影响的免疫应答。示例性的免疫应答包括T细胞应答，例如细胞因子产生和细胞毒性。另外，T细胞介导的免疫应答还包括受T细胞激活间接影响的免疫应答，例如抗体产生(体液应答)和细胞因子反应性细胞(例如巨噬细胞)的激活。
本文使用的术语“肿瘤特异性T细胞”通常指能够特异性攻击和/或破坏肿瘤细胞的T淋巴细胞。例如，它们可被赋予特定的受体(例如T细胞受体)，该受体可与存在于肿瘤细胞表面的抗原结合，诸如肿瘤相关抗原。每个肿瘤特异性T细胞可识别单一的肿瘤抗原，且一组肿瘤特异性T细胞可被赋予针对多种肿瘤抗原的多样性受体。
本文使用的术语“基本上不与之竞争结合”通常是指一个分子或药剂与目标物的结合不会以任何显著方式影响另一个分子或药剂与相同目标物的结合(例如，达到小于约50％、小于约40％、小于约35％、小于约30％、小于约25％、小于约20％、小于约15％、小于约14％、小于约13％、小于约12％、小于约11％、小于约10％、小于约9％、小于约8％、小于约7％、小于约6％、小于约5％、小于约4％、小于约3％、小于约2％、小于约1％、小于约0.5％、小于约0.5％、小于约0.5％或小于的程度)，例如，在通常用于确定这种结合(例如，在本文实例中描述的分析中)的分析中确定。
如本文所用，术语“抗原”或“Ag”通常是指激发免疫应答的分子。这种免疫应答可涉及抗体产生或特异性免疫活性细胞的活化，或这两者。本领域普通技术人员将会理解，任何大分子(包括几乎所有的蛋白质或肽)均可以充当抗原。此外，抗原可以来源于重组DNA或基因组DNA。本领域普通技术人员将会理解，在本文中使用术语“抗原”时，包含编码引发免疫应答的蛋白质的核苷酸序列或部分核苷酸序列的任何DNA因此编码该“抗原”。此外，本领域技术人员将会理解，抗原不必完全由基因的全长核苷酸序列编码。抗原不必由“基因”编码。抗原可以是合成的、或可以来源于生物样品、或者还可能是除多肽以外的大分子。这种生物样品可包括(但不限于)具有其他生物学组分的组织样品、肿瘤样品、细胞或流体。
如本文所用，术语“抗癌”或“抗肿瘤”通常是指可以通过多种方式表现出来的生物学效应，包括(但不限于)例如肿瘤体积减小、癌细胞数量减少、转移数量减少、预期寿命增加、癌细胞增殖减少、癌细胞存活减少或与癌症病况相关的多种生理症状改善。“抗癌”或“抗肿瘤”效应也可以表现为起初预防癌症发生的能力。
本文使用的术语“烃基”通常指完全由氢原子和碳原子组成的部分；这样的部分可包括脂肪族和/或芳香族部分。该部分可包含1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、30、40、50个或更多的碳原子。烃基的实例包括但不限于烷基，诸如C1-6烷基(例如C1、C2、C3或C4烷基，例如甲基、乙基、丙基、异丙基、正丁基、仲丁基或叔丁基)；被芳基(例如苄基)或环烷基(例如环丙基甲基)取代的C1-6烷基；环烷基(例如环丙基、环丁基、环戊基或环己基)；芳基(例如苯基、萘基或芴基)等。
本文使用的术语“杂烃基”通常指任选包括一个或多个杂原子的烃基基团。杂原子可为除C以外的任何原子，诸如O、S或N。
本文使用的术语“烯基”通常指具有2、3、4、5、6个或更多碳原子并且在适用的情况下另外具有至少一个E或Z立体化学的双键的直链或支链烷基部分。该术语包括参考诸如乙烯基、2-丙烯基、1-丁烯基、2-丁烯基、3-丁烯基、1-戊烯基、2-戊烯基、3-戊烯基、1-己烯基、2-己烯基和3-己烯基等的组。
本文使用的术语“芳基”通常指包含6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16个或更多环碳原子的芳环系统。芳基往往是苯基，但可为多环环系统，该系统具有两个或超过两个的环，至少其中一个是芳香环。该术语包括参考诸如苯基、萘基、芴基、薁基、茚基、蒽基等的组。
本文使用的术语“前药”通常指在体内迅速转化为亲本化合物的化合物，例如在血液中通过水解。
本文使用的术语“疫苗”通常指针对特定抗原(诸如肿瘤抗原或微生物的抗原)或包含所述抗原的组织、细胞或生物体提供主动获得性免疫的制剂。疫苗可为预防性(以预防或改善未来疾病或病症的影响)，或治疗性(以治疗已经发生的疾病或病症，诸如癌症)。
YTHDF1减弱剂
本申请的YTHDF1减弱剂可包括化合物。
这样的化合物可为大分子。大分子可为天然存在或化学合成的有机或无机分子，其大于或等于约1000道尔顿至约或大于1、2、3、5、7、10或更多万亿道尔顿。大分子可含有两个或超过两个的单体亚基或其衍生物，这些单体亚基或其衍生物通过共价键、离子键或其他化学相互作用(诸如氢键合、离子配对、碱基配对或通过电荷极化形成的电荷之间的配对)连接。这些单体亚基可互不相同，或彼此相同，以及在一些实施方案中，可形成聚合物。大分子也可为可形成三级和/或四级结构的分子，不管它是否有超过一个的亚基和/或是聚合物。大分子的实例包括多核苷酸，核酸分子包括DNA、RNA、(包括siRNA、snRNA、tRNA、反义RNA和核酶)、肽核酸(PNA)、多肽、糖肽、蛋白质、碳水化合物或脂质，或其衍生物或组合，例如，分别含有肽核酸部分或糖蛋白的核酸分子。大分子的实例进一步包括大分子组装体，例如病毒、病毒颗粒、噬菌体、类病毒、朊病毒及其组合和缀合物。
这样的化合物可为小分子。小分子可为小于约1000道尔顿，从约或为1000道尔顿至约或为950、900、850、800、750、700、650、600、550、500、450、400、375、350、325、300、275、250、225、200、175、150、125、100、75、70、65、60、55、50、45、40、35、30、25、20、15、10、5或更小的道尔顿的天然存在或化学合成的有机或无机分子。小分子可为任何不是大分子的分子，诸如蛋白质或核酸。“小分子”可包括含有两个或更多个单体亚基的分子，诸如二肽或二核苷酸。
这样的化合物可包含或为多肽。在某些情形下，这样的化合物可包含或为核酸分子。例如，这样的化合物可包含抗体或其衍生物、抗体-药物缀合物和/或融合蛋白。
例如，化合物能够减弱YTHDF1蛋白质的活性。例如，化合物可直接或间接地(例如通过其他分子)与YTHDF1蛋白质的一个或多个残基结合。这种结合可引起YTHDF1蛋白质的结构和/或功能发生构象变化。
化合物可与YTHDF1(例如，人YTHDF1)、其片段或衍生物特异性结合。YTHDF1蛋白质可包含SEQ ID NO:1中所示的氨基酸序列。在某些情形下，YTHDF1、其片段或衍生物可至少包含与SEQ ID NO:1的残基N378、F382、W384、F480和/或H528对应的氨基酸残基。在某些情形下，YTHDF1、其片段或衍生物可至少包含与SEQ ID NO:1的残基372-392、479-494和/或526-535对应的氨基酸残基。在某些情形下，化合物可与YTHDF1或其片段或衍生物结合(例如，特异性结合)，其中该YTHDF1、其片段或衍生物可包含SEQ ID NO:1-3、9-13和16-18中任一者所示的氨基酸序列。在某些情形下，化合物不会与包含SEQ ID NO:4-8中任一者所示的氨基酸序列的YTHDF1或其片段或衍生物特异性结合(或，基本上不结合)。
在某些情形下，本申请的化合物可与包含SEQ ID NO:4-8中任一者所示的氨基酸序列的YTHDF1、其片段或衍生物结合，其Kd值高于约10-6M(例如，高于约5×10-6M、高于约10-5M、高于约5×10-5M、高于约10-4M、高于约5×10-4M、高于约10-3M、高于约5×10-3M或更高)。可使用本领域中任何常用的方法确定该Kd值，诸如等温滴定量热(ITC)分析、表面等离子共振(SPR)分析和/或微量热泳动(MST)分析。
在某些情形下，本申请的化合物可与YTHDF1及其片段或衍生物(例如，在本应用中描述的那些包含/具有SEQ ID NO:1-3，9-13和16-18中任一者所示的氨基酸序列)结合，其Kd值小于约10-5M(例如，小于约9x10-6M、小于约8x10-6M、小于约7x10-6M、小于约6x10-6M、小于约5x10-6M、小于约4x10-6M、小于约3.5x10-6M、小于约3x10-6M、小于约2.5x10-6M、小于约2x10-6M、小于约1x10-6M、小于约5x10-7M、小于约2x10-7M、小于约10-7M、小于约5x10-8M、小于约2x10-8M、小于约10-8M、小于约5x10-9M、小于约4x10-9M、小于约3x10-9M、小于约2x10-9M、或小于约10-9M)。可使用本领域中任何常用的方法确定该Kd值，诸如等温滴定量热(ITC)分析、表面等离子共振(SPR)分析和/或微量热泳动(MST)分析。
在某些情形下，在与YTHDF1结合时，化合物与至少一个残基(例如，至少2个、至少3个、至少4个、至少5个、至少6个、至少7个、至少8个、至少9个、至少10个、至少15个、至少20个、至少25个、至少30个、至少35个、至少40个或更多残基)结合(例如，特异性结合)，该残基对应于选自SEQ ID NO：1的氨基酸残基372-392、479-494和526-535的残基。在某些情形下，当化合物与YTHDF1结合时，该化合物可与多个残基结合，并且结合的残基中至少有一个(例如，至少2个、至少3个、至少4个、至少5个、至少6个、至少7个、至少8个、至少9个、至少10个、至少15个、至少20个、至少25个、至少30个、至少35个、至少40个或更多残基)可对应于选自SEQ ID NO:1的氨基酸残基372-392、479-494和526-535的残基。
在某些情形下，在与YTHDF1结合时，化合物与至少一个残基(例如，至少2个、至少3个、至少4个或至少5个)结合，该残基对应于选自以下的残基：SEQ ID NO:1的N378、F382、W384、F480和H528。
化合物包含YTHDF1减弱剂，该YTHDF1减弱剂可能够阻断YTHDF1(例如，人YTHDF1)及其片段或衍生物与m6A的结合。YTHDF1蛋白质可包含SEQ ID NO:1中所示的氨基酸序列。在某些情形下，YTHDF1及其片段或衍生物可至少包含与SEQ ID NO:1的N378、F382、W384、F480和/或H528残基对应的氨基酸残基。在某些情形下，YTHDF1及其片段或衍生物可至少包含与SEQ ID NO:1的372-392、479-494和/或526-535残基对应的氨基酸残基。
在某些情形下，化合物可阻断YTHDF1及其片段或衍生物与m6A的结合，其中该YTHDF1及其片段或衍生物可包含SEQ ID NO:1-3、9-13和16-18中任一者所示的氨基酸序列。
在某些情形下，化合物显著地或基本上不会阻断YTHDF1及其片段或衍生物与m6A的结合，其中该YTHDF1及其片段或衍生物可包含SEQ ID NO:4-8中中任一者所示的氨基酸序列。
在某些情形下，本申请的化合物可阻断YTHDF1及其片段或衍生物与m6A的结合，其IC50值高于约7.5μM(例如，高于约8μM、高于约8.5μM、高于约9μM、高于约9.5μM、高于约10μM、高于约10.5μM、高于约11μM、高于约11.5μM、高于约12μM，或更高)，其中该YTHDF1及其片段或衍生物可包含SEQ ID NO:4-8中任一者所示的氨基酸序列。可使用本领域中任何常用的方法确定IC50值，诸如荧光偏振(FP)分析，和/或基于AlphaScreen的分析。
在某些情形下，本申请的化合物可阻断YTHDF1及其片段或衍生物与m6A的结合，其IC50值低于约7.5μM(例如，低于约6.5μM、低于约6μM、低于约5.5μM、低于约5μM、低于约4.5μM、低于约4μM、低于约3.5μM、低于约3μM、低于约2.5μM、低于约2μM、低于约1.5μM、低于约1μM、低于约0.9μM、低于约0.8μM、低于约0.7μM、低于约0.6μM、低于约0.5μM、低于约0.4μM、低于约0.3μM、低于约0.2μM、低于约0.1μM或更低)，其中该YTHDF1及其片段或衍生物可包含SEQ ID NO:1-3，9-13和16-18中任一者所示的氨基酸序列。可使用本领域中任何常用的方法确定IC50值，诸如荧光偏振(FP)分析，和/或基于AlphaScreen的分析。
在某些情形下，包含YTHDF1减弱剂的化合物基本上不与m6A竞争结合YTHDF1。例如，如在分析中确定，该分析通常用于确定这种结合(例如，如在基于AlphaScreen的分析中所示)，通过添加(小于约50％、小于约40％、小于约35％、小于约30％、小于约25％、小于约20％、小于约15％、小于约14％、小于约13％、小于约12％、小于约11％、小于约10％、小于约9％、小于约8％、小于约7％、小于约6％、小于约5％、小于约4％、小于约3％、小于约2％、小于约1％、小于约0.5％或更少)的m6A，影响(例如，减少)该化合物与YTHDF1及其片段或衍生物的结合。例如，如在分析中确定，该分析通常用于确定这种结合(例如，如在基于AlphaScreen的分析中所示)，通过添加(小于约50％、小于约40％、小于约35％、小于约30％、小于约25％、小于约20％、小于约15％、小于约14％、小于约13％、小于约12％、小于约11％、小于约10％、小于约9％、小于约8％、小于约7％、小于约6％、小于约5％、小于约4％、小于约3％、小于约2％、小于约1％、小于约0.5％或更少)的本申请的化合物，影响(例如，减少)m6A与YTHDF1及其片段或衍生物的结合。
在某些情形下，YTHDF1减弱剂所包含的化合物可为丹酚酸，诸如丹酚酸A(SAA)、丹酚酸C(SAC)，其前药、代谢物、衍生物，或上述任一者的药学上可接受的盐、酯或酰胺或它们的任何组合。
在某些情形下，YTHDF1减弱剂可包含式I的化合物、式I的化合物的前药、代谢物、衍生物，或上述任一者的药学上可接受的盐、酯或酰胺：
Figure BDA0004016647150000281
其中R1可选自C1-50烃基、C1-50经取代烃基、C1-50杂烃基和C1-50经取代杂烃基。
在某些情形下，式I中的R1可为(CO)-R2，且R2可为任选经取代的烯基。在某些情形下，R2可为CH＝CH-R3，且R3可为任选经取代的芳基。在某些情形下，R3可为式II
Figure BDA0004016647150000282
其中A可为任选经取代的呋喃或
Figure BDA0004016647150000283
R6可为羟基，且R5可为任选经取代的烯基。
在某些情形下，在式II中，A可为
Figure BDA0004016647150000284
且R4可为
Figure BDA0004016647150000285
在某些情形下，在式II中，A可为
Figure BDA0004016647150000286
R6可为羟基，R5为CH＝CH-R7，且R7可为
Figure BDA0004016647150000287
在某些情形下，本申请的YTHDF1减弱剂所包含的化合物可包含至少两个二羟基苯基部分。
在某些情形下，YTHDF1减弱剂所包含的化合物可包含至少三个二羟基苯基部分。
在某些情形下，YTHDF1减弱剂可包含式III的化合物、式III的化合物的前药、代谢物、衍生物，或上述任一者的药学上可接受的盐、酯或酰胺：
Figure BDA0004016647150000291
(式III)，其中A可为任选经取代的呋喃或
Figure BDA0004016647150000292
且R6可为羟基，且R5可为任选经取代的烯基。
在某些情形下，在式III中，A可为
Figure BDA0004016647150000293
且R4可为
Figure BDA0004016647150000294
在某些情形下，在式III中，A可为
Figure BDA0004016647150000295
R6可为羟基，R5可为CH＝CH-R7，且R7可为
Figure BDA0004016647150000296
在某些情形下，YTHDF1减弱剂可包含下列化合物中的任一种、下列任一种化合物的前药、代谢物、衍生物，或前述任一者的药学上可接受的盐、酯或酰胺：
Figure BDA0004016647150000297
在某些情形下，YTHDF1减弱剂可包含下列化合物中的任一种、下列任一种化合物的前药、代谢物、衍生物，或前述任一者的药学上可接受的盐、酯或酰胺：(E)-3-(3,4-二羟基苯基)-2-((3-(2-(3,4-二羟基苯基)-7-羟基苯并呋喃-4-基)丙烯酰)氧基)丙酸，和3-(3,4-二羟基苯基)-2-((E)-3-(2-(((E)-3,4-二羟基苯乙烯基)-3,4-二羟基苯基)丙烯酰)氧基)丙酸。
在某些情形下，YTHDF1减弱剂可包含下列化合物中的任一种、下列任一种化合物的前药、代谢物、衍生物，或前述任一者的药学上可接受的盐、酯或酰胺：
Figure BDA0004016647150000301
在某些情形下，YTHDF1减弱剂可包含下列化合物中的任一种、下列任一种化合物的前药、代谢物、衍生物，或前述任一者的药学上可接受的盐、酯或酰胺：(R,E)-3-(3,4-二羟基苯基)-2-((3-(2-(3,4-二羟基苯基))-7-羟基苯并呋喃-4-基)丙烯酰)氧基)丙酸，和(S)-3-(3,4-二羟基苯基)-2-(((E)-3-(2-((E)-3,4-二羟基苯乙烯基)-3,4-二羟基苯基)丙烯酰)氧基)丙酸。
在某些情形下，YTHDF1减弱剂可包含下列化合物中的任一种、下列任一种化合物的前药、代谢物、衍生物，或前述任一者的药学上可接受的盐、酯或酰胺：
Figure BDA0004016647150000302
在某些情形下，YTHDF1减弱剂可包含下列化合物中的任一种、下列任一种化合物的前药、代谢物、衍生物，或前述任一者的药学上可接受的盐、酯或酰胺：(S,E)-3-(3,4-二羟基苯基)-2-((3-(2-(3,4-二羟基苯基))-7-羟基苯并呋喃-4-基)丙烯酰)氧基)丙酸，和(R)-3-(3,4-二羟基苯基)-2-(((E)-3-(2-((E)-3,4-二羟基苯乙烯基)-3,4-二羟基苯基)丙烯酰)氧基)丙酸。
在某些情形下，YTHDF1减弱剂可为非手性或手性的，如果YTHDF1减弱剂为手性的，它可具有一个或多个手性中心，且可为单一的(R)或(S)对映体或(R)和(S)对映体的混合物。
在某些情形下，YTHDF1减弱剂所包含的化合物可来源于植物。例如，在植物提取物中可提供该化合物，例如，作为植物提取物的一部分。例如，它可来源于鼠尾草属植物及其活性成分。
化合物可为化学制备的(例如，来自油脂化学品)，生物化学产生的(例如，在发酵过程中)，或可从植物材料中获得，接着随后任选进行化学修饰。例如，化合物可通过用羧酸对3-(3,4-二羟基苯基)乳酸进行酯化来(生物)化学制备。
在某些情形下，化合物可从植物材料中分离得到，诸如植物的根。例如，植物可属于鼠尾草属，例如丹参(Salvia miltiorrhiza)、血盆草(Salvia cavaleriei)、黄花鼠尾草(Salvia fluva)、华鼠尾草(Salvia chinensis)、南丹参(Salvia bowleyana)、红根草(Salvia prionitis)、药鼠尾草(Salvia officialis)、新疆鼠尾草(Salvia deserta)和/或云南鼠尾草(Salvia yunnanensis)。在某些情形下，化合物是从丹参(Danshen)中获得的。
经修饰的免疫细胞
本申请提供经修饰的免疫细胞(例如，APC，诸如DC)。本申请还提供修饰免疫细胞(例如，APC，诸如DC)的方法。
免疫细胞可为APC，诸如DC。APC(例如，DC)可来源于受试者的骨髓和/或淋巴结。DC可包含以下的一种或多种：驻留型CD11b+细胞(例如，CD11b+DC)、驻留型CD8α+细胞(例如，CD8α+DC)、迁移型CD11b+细胞(例如，CD11b+DC)、CD11c+细胞(例如，CD11c+DC)和迁移型CD103+细胞(例如，CD103+DC)。
经修饰的APC(例如，经修饰的DC)在交叉致敏T细胞中可表现出优于对应的未经修饰的对照APC(例如，对应的未经修饰的对照DC)的能力。
APC(例如，DC)可包含或表达一种或多种肿瘤特异性抗原(例如，本申请中提供的肿瘤/癌症相关抗原)。在某些情形下，APC(例如，DC)可与模拟剂(诸如FLT3L)共培养或用该模拟剂处理。
在某些情形下，免疫细胞可为从受试者(诸如癌症患者)中获得的APC(例如，DC)，在某些情形下，免疫细胞(例如，APC，诸如DC)可从肿瘤组织中分离出。
可已用本申请的化合物或YTHDF1减弱剂修饰免疫细胞(例如，APC，诸如DC)。
例如，在免疫细胞群体(例如，APC，诸如DC)中，可已用本申请的化合物或YTHDF1减弱剂修饰一个或多个细胞。在某些情形下，本申请的经修饰的免疫细胞(例如，mAPC，诸如mDC)可包含本申请的化合物或YTHDF1减弱剂。
在某些情形下，本申请的化合物或YTHDF1减弱剂可被允许与免疫细胞(例如，mAPC，诸如mDC)接触足以导致YTHDF1的表达和/或活性降低的一段时间(例如，至少1小时、至少2小时、至少3小时、至少4小时、至少5小时、至少6小时、至少7小时、至少8小时、至少9小时、至少10小时、至少11小时、至少12小时、至少13小时、至少14小时、至少15小时或更长)例如，可在培养免疫细胞(例如，mAPC，诸如mDC)的培养基中施用该化合物或减弱剂。
可以例如至少1μM、至少2μM、至少3μM、至少4μM、至少5μM、至少6μM、至少7μM、至少8μM、至少9μM、至少10μM、至少11μM、至少12μM或更高的浓度施用本申请的化合物或YTHDF1减弱剂。
在某些情形下，本申请的化合物或YTHDF1减弱剂不是直接应用于免疫细胞(例如，APC或DC)本身，相反，免疫细胞(例如，APC，诸如DC)可来源于(例如，从……中分化，作为……的子代等)已经接受本申请的化合物或YTHDF1减弱剂的细胞(例如，免疫细胞的祖先)或生物体。
免疫细胞可为人细胞，诸如人APC(例如，DC)。
在某些情形下，在进行扩增或其他修饰之前，可从受试者体内获得细胞来源，例如，免疫细胞(诸如APC，例如，DC)或其祖细胞。本文的术语“受试者”意在包括能引起免疫应答的生命体(例如，哺乳动物)。受试者的实例包括人类、猴子、黑猩猩、狗、猫、小鼠、大鼠和其转基因物种。免疫细胞或其祖先可从多种来源获得，包括外周血单核细胞、骨髓、淋巴结组织、脐血、胸腺组织、感染部位组织、腹水、胸腔积液、脾脏组织和/或肿瘤。
组合物
本申请的组合物可包含本申请的YTHDF1减弱剂和/或本申请的mAPC。在某些情形下，组合物可进一步包含本申请的额外/第二活性成分。
在某些情形下，组合物可为疫苗组合物。
本申请的组合物可包含一种或多种药学上可接受的赋形剂。这种药学上可接受的赋形剂可包括与本申请的一种或多种活性成分(例如，经修饰的细胞或减弱剂)结合的任一非活性材料。
例如，药学上可接受的赋形剂可包括下列一种或多种：溶剂、促渗剂、抗氧化剂、增稠剂、软膏基质、保护剂、吸附剂、去污剂、润肤剂、防腐剂、保湿剂、缓冲剂、助剂、生物利用度增强剂、载体、助流剂、甜味剂、稀释剂、染料/着色剂、风味增强剂、增溶剂(包括表面活性剂)、润湿剂、分散剂、悬浮剂、稳定剂和/或等渗剂。
在某些情形下，组合物可包含一种或多种佐剂，以增强或增加与施用该组合物相关的免疫应答。
额外/第二活性成分
本申请的化合物、YTHDF1减弱剂、细胞(例如，mAPC、mDC)和/或组合物可进一步包含额外/第二活性成分，和/或可与额外/第二活性成分结合使用。
在某些情形下，可向已接受，正在接受和/或将接受额外/第二活性成分的受试者施用本申请的化合物、YTHDF1减弱剂、细胞(例如，mAPC、mDC)和/或组合物。
在施用本申请的YTHDF1减弱剂、细胞(例如，mAPC、mDC)和/或组合物之前、同时和/或之后可施用额外的活性成分或疗法。
额外的活性成分可为抗癌剂。例如，额外的活性成分可包括癌症免疫疗法。在某些情形下，额外的活性成分可包括免疫检查点减弱剂(例如，免疫检查点抑制剂)。在某些情形下，额外的活性成分可包括选自以下的药剂：抗PD-L1抗体或其抗原结合部分、抗PD-1抗体或其抗原结合部分、抗CTLA-4抗体或其抗原结合部分以及IDO减弱剂。
例如，额外的活性成分可包括帕博利珠单抗、纳武利尤单抗、西米普利单抗、阿替利珠单抗、阿维鲁单抗、度伐利尤单抗、伊匹单抗和/或上述任一者的抗原结合片段或衍生物。例如，额外的活性成分可包括能够与帕博利珠单抗、纳武利尤单抗、西米普利单抗、阿替利珠单抗、阿维鲁单抗、度伐利尤单抗和/或伊匹单抗竞争结合相应抗原(分别为PD-1、PD-L1或CTLA-4)的抗体(包括其抗原结合部分)。在某些情形下，额外的活性成分可包括帕博利珠单抗、纳武利尤单抗、西米普利单抗、阿替利珠单抗、阿维鲁单抗、度伐利尤单抗和/或伊匹单抗中任一者的HCDR3。在某些情形下，额外的活性成分可包括帕博利珠单抗、纳武利尤单抗、西米普利单抗、阿替利珠单抗、阿维鲁单抗、度伐利尤单抗和/或伊匹单抗中任一者的LCDR3。在某些情形下，额外的活性成分可包括帕博利珠单抗、纳武利尤单抗、西米普利单抗、阿替利珠单抗、阿维鲁单抗、度伐利尤单抗和/或伊匹单抗中任一者的HCDR2。在某些情形下，额外的活性成分可包括帕博利珠单抗、纳武利尤单抗、西米普利单抗、阿替利珠单抗、阿维鲁单抗、度伐利尤单抗和/或伊匹单抗中任一者的LCDR2。在某些情形下，额外的活性成分可包括帕博利珠单抗、纳武利尤单抗、西米普利单抗、阿替利珠单抗、阿维鲁单抗、度伐利尤单抗和/或伊匹单抗中任一者的HCDR1。在某些情形下，额外的活性成分可包括帕博利珠单抗、纳武利尤单抗、西米普利单抗、阿替利珠单抗、阿维鲁单抗、度伐利尤单抗和/或伊匹单抗中任一者的LCDR1。在某些情形下，额外的活性成分可包括帕博利珠单抗、纳武利尤单抗、西米普利单抗、阿替利珠单抗、阿维鲁单抗、度伐利尤单抗和/或伊匹单抗中任一者的HCDR3、HCDR2和HCDR1。在某些情形下，额外的活性成分可包括帕博利珠单抗、纳武利尤单抗、西米普利单抗、阿替利珠单抗、阿维鲁单抗、度伐利尤单抗和/或伊匹单抗中任一者的LCDR1、LCDR2和LCDR3。在某些情形下，额外的活性成分可包括帕博利珠单抗、纳武利尤单抗、西米普利单抗、阿替利珠单抗、阿维鲁单抗、度伐利尤单抗和/或伊匹单抗中任一者的HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2和LCDR3。在某些情形下，额外的活性成分可包括帕博利珠单抗、纳武利尤单抗、西米普利单抗、阿替利珠单抗、阿维鲁单抗、度伐利尤单抗和/或伊匹单抗中任一者的重链可变区。在某些情形下，额外的活性成分可包括帕博利珠单抗、纳武利尤单抗、西米普利单抗、阿替利珠单抗、阿维鲁单抗、度伐利尤单抗和/或伊匹单抗中任一者的轻链可变区。在某些情形下，额外的活性成分可包括帕博利珠单抗、纳武利尤单抗、西米普利单抗、阿替利珠单抗、阿维鲁单抗、度伐利尤单抗和/或伊匹单抗中任一者的重链可变区和轻链可变区。
抑制方法
本申请提供抑制和/或减弱YTHDF1活性的方法。
本申请进一步提供激活免疫细胞(例如，APC，诸如DC)、产生具有增强的抗肿瘤活性的免疫细胞、预防和/或逆转免疫细胞(诸如免疫效应细胞，例如T细胞)的耗竭、增加和/或改善免疫细胞(例如，免疫效应细胞，诸如T细胞，例如，肿瘤浸润性T细胞)的增殖和/或活性、增加和/或改善肿瘤特异性免疫细胞(例如，免疫效应细胞，诸如T细胞)的增殖和/或活性、增强免疫细胞(诸如T细胞)的细胞因子产生、和/或抑制肿瘤生长、抑制肿瘤细胞的增殖和/或杀死肿瘤细胞的方法。
这种方法可包括施用本申请的YTHDF1减弱剂、细胞(例如，mAPC、mDC)和/或组合物的步骤。
例如，该方法可包括将YTHDF1或包含YTHDF1的靶细胞(例如，免疫细胞，诸如APC和/或T细胞)与本申请的YTHDF1减弱剂、细胞(例如，mAPC、mDC)和/或组合物接触。接触可离体完成。在某些情形下，接触可在体内完成。
在某些情形下，该方法可包括将本申请的YTHDF1减弱剂和/或组合物引入所述细胞(例如，免疫细胞，诸如APC和/或T细胞)。引入可离体完成。在某些情形下，引入可在体内完成。在某些情形下，引入可离体完成。
抑制剂筛选方法及试剂盒
本申请提供一种确定候选药剂是否为YTHDF1减弱剂的方法。
该方法可包括使候选药剂与YTHDF1突变体接触。
YTHDF1突变体在一个或多个残基处可包括一个或多个氨基酸取代、缺失和/或添加，该一个或多个残基对应于选自SEQ ID NO:1的残基372-392、479-494和526-535的残基。在某些情形下，YTHDF1突变体在一个或多个残基处可包括一个或多个氨基酸取代、缺失和/或添加，一个或多个残基对应于选自SEQ ID NO:1的残基N378、F382、W384、F480和H528的残基。在某些情形下，根据SEQ ID NO:1中所示的氨基酸序列，YTHDF1突变体可包括对应于下列氨基酸取代的一个或多个氨基酸取代：N378A、F382A、W384A、F480A和H528A。在某些情形下，YTHDF1突变体可包括如SEQ ID NO:4-8中任一者所示的氨基酸序列。
该方法可进一步包括确定候选药剂是否与本申请的YTHDF1突变体特异性结合。
如果候选药剂与本申请的YTHDF1突变体特异性结合，则该候选药剂不可为YTHDF1减弱剂。
该方法可进一步包括使候选药剂与对照YTHDF1、其片段或衍生物接触，以及确定该候选药剂是否与对照YTHDF1、其片段或衍生物特异性结合。在某些情形下，对照YTHDF1、其片段或衍生物可至少包含对应于SEQ ID NO:1的残基N378、F382、W384、F480和/或H528的氨基酸残基。在某些情形下，对照YTHDF1、其片段或衍生物可至少包含对应于SEQ ID NO:1的残基372-392、479-494和/或526-535的氨基酸残基。在某些情形下，对照YTHDF1、其片段或衍生物可包含对应于SEQ ID NO:1-3、9-13和16-18中任一者所示的氨基酸序列。
在某些情形下，该方法可进一步包括确定候选药剂是否与对照YTHDF1、其片段或衍生物特异性结合。
如果候选药剂不与本申请的对照YTHDF1、其片段或衍生物特异性结合，则该候选药剂不可为YTHDF1减弱剂。
如果候选药剂与本申请的对照YTHDF1、其片段或衍生物特异性结合，但不与本申请的YTHDF1突变体特异性结合，则该候选药剂可被认为是潜在的YTHDF1减弱剂。
一方面，本申请提供YTHDF1突变体(诸如本申请中描述的YTHDF1突变体)，例如用于筛选和/或确定候选药剂减弱YTHDF1的活性。
一方面，本申请提供包含本申请的YTHDF1突变体的试剂盒。试剂盒可用于例如筛选和/或确定候选药剂减弱YTHDF1的活性。
试剂盒可进一步包含额外的药剂。例如，试剂盒可包含本申请的对照YTHDF1、其片段或衍生物。
在某些情形下，试剂盒可进一步包含可用于确定候选药剂的结合亲和力的分析中(例如，等温滴定量热(ITC)分析、表面等离子共振(SPR)分析和/或微量热泳动(MST)分析)的缓冲液或药剂。
抗原
本申请的化合物、YTHDF1减弱剂、细胞(例如，mAPC、mDC)和/或组合物可用于在有需要的受试者中治疗与抗原表达相关的疾病、病症或病况，和/或可用于在有需要的受试者中刺激T细胞介导的对抗原(例如，肿瘤抗原)的免疫应答。
此外，本申请的化合物、YTHDF1减弱剂、细胞(例如，mAPC、mDC)和/或组合物可与额外/第二活性成分结合使用，该额外/第二活性成分可在接受它的受试者中引起一种或多种抗原(例如，肿瘤抗原)的增加。
抗原可为例如在人受试者中能够激发免疫应答的任何分子。免疫应答可涉及抗体的产生，或特异性免疫活性细胞的激活，或者两者兼有。任何大分子，包括几乎所有的蛋白质或多肽，都可作为抗原。抗原可来源于和/或存在于生物样品中。这样的生物样品可包括但不限于具有其他生物成分的组织样品、肿瘤样品、细胞或流体。
在本申请中，在癌细胞表面可表达癌症相关抗原或肿瘤抗原。在某些情形下，癌症相关抗原本身可为细胞内的，但是，这种抗原(肽)的片段可通过MHC(主要组织相容性复合体)呈递在癌细胞表面。
癌症/肿瘤相关抗原的实例可包括例如EGFR、HER2/neu、HER3、HER4、Ep-CAM、CEA、TrAIL、TRAIL受体1、TRAIL受体2、淋巴毒素-β受体、CCR4、CD19、CD20、CD22、CD28、CD33、CD40、CD80、CSF-1R、CTLA-4、成纤维细胞激活蛋白(FAP)、hepsin、黑素瘤相关的硫酸软骨素蛋白多糖(MCSP)、前列腺特异性膜抗原(PSMA)、VEGF受体1、VEGF受体2、IGF-1R、TSLP-R、TIE-1、TIE-2、TNF-α和类似的TNF的弱凋亡诱导剂(TWEAK)、IL-1R。
在某些情形下，癌症/肿瘤相关抗原的实例可包括例如CEA、gp100、MAGE家族蛋白、DAGE、GAGE、RAGE、NY-ESO 1、Melan-A/MART 1、TRP-1、TRP-2、酪氨酸酶、HER-2/neu、MUC-1、p53、KSA、PSA、PSMA及/或其片段和经修饰形式。
增强抗肿瘤免疫
本申请的化合物、YTHDF1减弱剂、细胞(例如，mAPC、mDC)，方法和/或组合物可用于激活免疫细胞，和/或增强免疫应答，例如抗肿瘤免疫应答。
例如，激活的免疫细胞可具有增强的(例如，增强至少约1％、至少约2％、至少约3％、至少约4％、至少约5％、至少约8％、至少约10％、至少约15％、至少约16％、至少约17％、至少约18％、至少约19％、至少约20％、至少约25％、至少约30％、至少约35％、至少约40％、至少约45％、至少约50％、至少约100％、至少约1.5倍、至少约2倍、至少约2.5倍、至少约3倍、至少约3.5倍、至少约4倍、至少约4.5倍或更多)在体内杀死肿瘤细胞或控制肿瘤生长的能力。
在某些情形下，在免疫细胞群体中，可以观察到CD4+T细胞的增殖增加(例如，增加至少约1％、至少约2％、至少约3％、至少约4％、至少约5％、至少约8％、至少约10％、至少约15％、至少约16％、至少约17％、至少约18％、至少约19％、至少约20％、至少约25％、至少约30％、至少约35％、至少约40％、至少约45％、至少约50％、至少约100％、至少约1.5倍、至少约2倍、至少约2.5倍、至少约3倍、至少约3.5倍、至少约4倍、至少约4.5倍或更多)。在某些情形下，在免疫细胞群体中，可以观察到CD8+T细胞的增殖增加(例如，增加至少约1％、至少约2％、至少约3％、至少约4％、至少约5％、至少约8％、至少约10％、至少约15％、至少约16％、至少约17％、至少约18％、至少约19％、至少约20％、至少约25％、至少约30％、至少约35％、至少约40％、至少约45％、至少约50％、至少约100％、至少约1.5倍、至少约2倍、至少约2.5倍、至少约3倍、至少约3.5倍、至少约4倍、至少约4.5倍或更多倍)。
在某些情形下，可通过肿瘤位点中或肿瘤位点周围CD8+细胞毒性T细胞数量的增加(例如，增加至少约1％、至少约2％、至少约3％、至少约4％、至少约5％、至少约8％、至少约10％、至少约15％、至少约16％、至少约17％、至少约18％、至少约19％、至少约20％、至少约25％、至少约30％、至少约35％、至少约40％、至少约45％、至少约50％、至少约100％、至少约1.5倍、至少约2倍、至少约2.5倍、至少约3倍、至少约3.5倍、至少约4倍、至少约4.5倍或更多倍)显示出增强的抗肿瘤免疫应答。
在某些情形下，可通过肿瘤浸润性CD8+细胞数量的增加(例如，增加至少约1％、至少约2％、至少约3％、至少约4％、至少约5％、至少约8％、至少约10％、至少约15％、至少约16％、至少约17％、至少约18％、至少约19％、至少约20％、至少约25％、至少约30％、至少约35％、至少约40％、至少约45％、至少约50％、至少约100％、至少约1.5倍、至少约2倍、至少约2.5倍、至少约3倍、至少约3.5倍、至少约4倍、至少约4.5倍或更多倍)显示出增强的抗肿瘤免疫应答。
在某些情形下，可通过由免疫细胞产生的细胞因子(例如IFN-γ和/或IL-2)和/或颗粒酶B增加(例如，增加至少约1％、至少约2％、至少约3％、至少约4％、至少约5％、至少约8％、至少约10％、至少约15％、至少约16％、至少约17％、至少约18％、至少约19％、至少约20％、至少约25％、至少约30％、至少约35％、至少约40％、至少约45％、至少约50％、至少约100％、至少约1.5倍、至少约2倍、至少约2.5倍、至少约3倍、至少约3.5倍、至少约4倍、至少约4.5倍或更多倍)显示出增加的免疫细胞活性。
在某些情形下，可通过免疫细胞耗竭的延迟和/或逆转(例如，延迟和/或逆转至少约1％、至少约2％、至少约3％、至少约4％、至少约5％、至少约8％、至少约10％、至少约15％、至少约16％、至少约17％、至少约18％、至少约19％、至少约20％、至少约25％、至少约30％、至少约35％、至少约40％、至少约45％、至少约50％、至少约100％、至少约1.5倍、至少约2倍、至少约2.5倍、至少约3倍、至少约3.5倍、至少约4倍、至少约4.5倍或更多倍)，诸如CD8+T细胞耗竭的延迟和/或逆转(例如，延迟和/或逆转至少约1％、至少约2％、至少约3％、至少约4％、至少约5％、至少约8％、至少约10％、至少约15％、至少约16％、至少约17％、至少约18％、至少约19％、至少约20％、至少约25％、至少约30％、至少约35％、至少约40％、至少约45％、至少约50％、至少约100％、至少约1.5倍、至少约2倍、至少约2.5倍、至少约3倍、至少约3.5倍、至少约4倍、至少约4.5倍或更多倍)，显示增加的免疫细胞活性或增强的免疫应答。
在某些情形下，可通过CXCR5的表达增加(例如，增加至少约1％、至少约2％、至少约3％、至少约4％、至少约5％、至少约8％、至少约10％、至少约15％、至少约16％、至少约17％、至少约18％、至少约19％、至少约20％、至少约25％、至少约30％、至少约35％、至少约40％、至少约45％、至少约50％、至少约100％、至少约1.5倍、至少约2倍、至少约2.5倍、至少约3倍、至少约3.5倍、至少约4倍、至少约4.5倍或更多倍)显示增加的免疫细胞活性或增强的免疫应答。表达增加的特征可表现为细胞内/细胞上的CXCR5的量/水平增加(例如，增加至少约1％、至少约2％、至少约3％、至少约4％、至少约5％、至少约8％、至少约10％、至少约15％、至少约16％、至少约17％、至少约18％、至少约19％、至少约20％、至少约25％、至少约30％、至少约35％、至少约40％、至少约45％、至少约50％、至少约100％、至少约1.5倍、至少约2倍、至少约2.5倍、至少约3倍、至少约3.5倍、至少约4倍、至少约4.5倍或更多倍)，或表现为在免疫细胞群体(例如，免疫效应细胞群体，诸如T细胞群体)中表达CXCR5的细胞的数量/百分比增加(例如，增加至少约1％、至少约2％、至少约3％、至少约4％、至少约5％、至少约8％、至少约10％、至少约15％、至少约16％、至少约17％、至少约18％、至少约19％、至少约20％、至少约25％、至少约30％、至少约35％、至少约40％、至少约45％、至少约50％、至少约100％、至少约1.5倍、至少约2倍、至少约2.5倍、至少约3倍、至少约3.5倍、至少约4倍、至少约4.5倍或更多倍)。
在某些情形下，可通过PD-1的表达减少(例如，减少至少约1％、至少约2％、至少约3％、至少约4％、至少约5％、至少约8％、至少约10％、至少约15％、至少约16％、至少约17％、至少约18％、至少约19％、至少约20％、至少约25％、至少约30％、至少约35％、至少约40％、至少约45％、至少约50％、至少约100％、至少约1.5倍、至少约2倍、至少约2.5倍、至少约3倍、至少约3.5倍、至少约4倍、至少约4.5倍或更多倍)显示出增加的免疫细胞活性或增强的免疫应答。表达减少的特征可表现为细胞内/细胞上PD-1的量/水平减少(例如，减少至少约1％、至少约2％、至少约3％、至少约4％、至少约5％、至少约8％、至少约10％、至少约15％、至少约16％、至少约17％、至少约18％、至少约19％、至少约20％、至少约25％、至少约30％、至少约35％、至少约40％、至少约45％、至少约50％、至少约100％、至少约1.5倍、至少约2倍、至少约2.5倍、至少约3倍、至少约3.5倍、至少约4倍、至少约4.5倍或更多倍)，或表现为在免疫细胞群体(例如，免疫效应细胞群体，诸如T细胞群体)中表达PD-1的细胞的数量/百分比减少(例如，减少至少约1％、至少约2％、至少约3％、至少约4％、至少约5％、至少约8％、至少约10％、至少约15％、至少约16％、至少约17％、至少约18％、至少约19％、至少约20％、至少约25％、至少约30％、至少约35％、至少约40％、至少约45％、至少约50％、至少约100％、至少约1.5倍、至少约2倍、至少约2.5倍、至少约3倍、至少约3.5倍、至少约4倍、至少约4.5倍或更多倍)。
在某些情形下，可通过Tim3的表达减少(例如，减少至少约1％、至少约2％、至少约3％、至少约4％、至少约5％、至少约8％、至少约10％、至少约15％、至少约16％、至少约17％、至少约18％、至少约19％、至少约20％、至少约25％、至少约30％、至少约35％、至少约40％、至少约45％、至少约50％、至少约100％、至少约1.5倍、至少约2倍、至少约2.5倍、至少约3倍、至少约3.5倍、至少约4倍、至少约4.5倍或更多倍)显示出增加的免疫细胞活性或增强的免疫应答。表达减少的特征可表现为细胞内/细胞上Tim3的量/水平减少(例如，减少至少约1％、至少约2％、至少约3％、至少约4％、至少约5％、至少约8％、至少约10％、至少约15％、至少约16％、至少约17％、至少约18％、至少约19％、至少约20％、至少约25％、至少约30％、至少约35％、至少约40％、至少约45％、至少约50％、至少约100％、至少约1.5倍、至少约2倍、至少约2.5倍、至少约3倍、至少约3.5倍、至少约4倍、至少约4.5倍或更多倍)，或表现为在免疫细胞群体(例如，免疫效应细胞群体，诸如T细胞群体)中表达Tim3的细胞数量/百分比减少(例如，减少至少约1％、至少约2％、至少约3％、至少约4％、至少约5％、至少约8％、至少约10％、至少约15％、至少约16％、至少约17％、至少约18％、至少约19％、至少约20％、至少约25％、至少约30％、至少约35％、至少约40％、至少约45％、至少约50％、至少约100％、至少约1.5倍、至少约2倍、至少约2.5倍、至少约3倍、至少约3.5倍、至少约4倍、至少约4.5倍或更多倍)。
在某些情形下，可通过免疫细胞群体(例如，免疫效应细胞群体，诸如T细胞群体)中PD-1+Tim3+细胞的数量/百分比减少(例如，减少至少约1％、至少约2％、至少约3％、至少约4％、至少约5％、至少约8％、至少约10％、至少约15％、至少约16％、至少约17％、至少约18％、至少约19％、至少约20％、至少约25％、至少约30％、至少约35％、至少约40％、至少约45％、至少约50％、至少约100％、至少约1.5倍、至少约2倍、至少约2.5倍、至少约3倍、至少约3.5倍、至少约4倍、至少约4.5倍或更多倍)显示出增加的免疫细胞活性或增强的免疫应答。
疾病、病症或病况
本申请的化合物、YTHDF1减弱剂、细胞(例如，mAPC、mDC)、方法和/或组合物可用于治疗疾病、病症或病况，诸如在有需要的受试者中治疗与抗原(例如，本文描述的癌症/肿瘤相关抗原)表达相关的疾病、病症或病况。
例如，该疾病、病症或病况可为癌症。
在某些情形下，癌症可选自血液癌、淋巴瘤和实体肿瘤。
在一些实施方案中，癌症选自黑素瘤、乳腺癌、肺癌、卵巢癌、脑癌、肝癌、宫颈癌、结肠癌、结直肠癌、肾癌、皮肤癌、头颈癌、骨癌、食管癌、膀胱癌、子宫癌、淋巴癌、胃癌、胰腺癌、睾丸癌、淋巴瘤和白血病。
受试者
可向有需要的受试者(例如，人)施用本申请的化合物、YTHDF1减弱剂、细胞(例如，mAPC、mDC)、方法和/或组合物。
在某些情形下，受试者可为癌症患者。例如，受试者可为患有选自血液癌、淋巴瘤和实体肿瘤的癌症的患者。在某些情形下，受试者可为患有选自黑素瘤、结肠癌、胰腺癌、乳腺癌和肺癌的癌症的患者。
在某些情形下，受试者可已接受、正在接受和/或将接受额外的疗法。额外的疗法可为抗癌治疗。
在某些情形下，抗癌治疗可包括癌症免疫疗法。例如，抗癌治疗可包括或为免疫检查点减弱剂。在某些情形下，抗癌治疗可包括选自以下的药剂：抗PD-L1抗体或其抗原结合部分、抗PD-1抗体或其抗原结合部分、抗CTLA-4抗体或其抗原结合部分以及IDO减弱剂。在某些情形下，抗癌治疗可包括帕博利珠单抗、纳武利尤单抗、西米普利单抗、阿替利珠单抗、阿维鲁单抗、度伐利尤单抗、伊匹单抗和/或上述任一者的抗原结合片段或衍生物。
实施例
阐述以下实施例是为了向本领域一般技术人员提供关于如何制备和使用本发明的完整披露和描述，而不是为了限制本发明人认为是其发明的范围，也不是为了表示以下实验是进行的全部或唯一实验。已努力确保所使用的数字(如数量、温度等)的准确性，但应考虑到一些实验误差和偏差。除非另有说明，否则份数是重量份数，分子量是重量平均分子量，温度是以摄氏度计，压力是大气压或接近大气压。可使用标准缩写，例如，bp，碱基对；kb，千碱基；pl，皮升；s或sec，秒；min，分钟；h或hr，小时；aa，氨基酸；nt，核苷酸；i.m.，肌肉注射；i.p.，腹膜内注射；s.c.，皮下注射；等。关于实验结果(例如，在双边未配对学生t检验中)，*表示p<0.05、**表示p<0.01、***表示p<0.001、***表示p<0.0001且n.s.意思是不显著。
材料和方法
在本申请的实施例中采用以下材料与方法。
蛋白质表达与纯化
将蛋白质YTHDF1(361-559)(SEQ ID NO:2)及其突变体(SEQ ID NO:4-13)克隆到pGEx-6P-1载体(从YouBio Co,Ltd获得，目录编号：VT1258)，并将AlphaScreen分析中所用的His-YTHDF1(361-559)(SEQ ID NO:3)克隆到修饰的pET28a载体(从YouBio Co,Ltd获得，目录编号：VT1207)中。将这些载体转化进大肠杆菌BL21(DE3)细胞并在37℃培养。当OD值达到0.6～0.8时，添加1mM异丙基-β-D-硫代半乳糖苷以在16℃过夜过表达该蛋白质。首先通过谷胱甘肽亲和层析(GSTrap FF,GE Healthcare)纯化YTHDF1(361-559)及其突变体，然后与PPase在4℃孵育过夜以去除GST标签。然后，通过阳离子交换(HiTrap SP,GEHealthcare)并且最后通过Superdex 75 10/300柱(GE Healthcare)进一步纯化蛋白质。最后，将纯化的YTHDF1(361-559)和突变体保存在含有20mM Hepes(pH 7.4)和200mM NaCl的缓冲液中。针对His-YTHDF1(361-559)，通过Ni-NTA层析(HisTrap FF,GE Healthcare)、随后阳离子交换和Superdex 75 10/300柱依次纯化蛋白质。并将获得的蛋白质保存在具有相同成分的缓冲液中。
荧光偏振(FP)分析
所有YTHDF1(361-559)、经5’-FAM标记的含有m6A的mRNA(5’-FAM-UUCUUCUGUGG(m6A)CUGUG-3’,SEQ ID NO:14)和候选化合物用分析缓冲液(20mM Hepes(pH 7.4)，50mMNaCl，0.01％(v/v)tween 20，5％(v/v)甘油)稀释。针对高通量筛选(HTS)，将1.25μMYTHDF1(361-559)与80μM候选化合物在黑色384平板(Corning，3575)中于室温孵育30分钟。然后将40nM经5’-FAM标记的含有m6A的mRNA加入混合物中，并在4℃孵育1小时。使用未标记的含有m6A的mRNA作为阳性对照，且单独使用40nM经5’-FAM标记的含有m6A的mRNA以调节增益因子。最后，通过Envision Readers(PerkinElmer)测量混合物。
关于活性测试，将1.25μM YTHDF1(361-559)与稀释至指定浓度的候选化合物一起孵育30分钟。随后的步骤与HTS相似。并使用等量DMSO作为阴性对照。
AlphaScreen分析
将化合物(例如，SAA或SAC)用分析缓冲液(20mM Hepes(pH 7.4)，150mM NaCl，1mg/ml BSA，0.01％(v/v)TritonX-100)以两倍梯度的方式从200μM稀释。然后，将100nMHis-YTHDF1(361-559)与SAA或SAC在分析缓冲液中于室温孵育30分钟。然后添加10nM生物素化的含有m6A的mRNA(5’-生物素-UUCUUCUGUGG(m6A)CUGUG-3’)(SEQ ID NO:15)以与YTHDF1(361-559)结合，并使用未生物素化的含有m6A的mRNA作为阳性对照。在Alpha信号检测之前，向弱光下的白色分析孔板(OptiPlateTM-384，PerkinElmer)添加链霉亲和素供体珠和抗His受体珠，并且在4℃孵育1小时，以确保生物素标记和链霉亲和素供体珠之间以及His标记和抗His受体珠之间的充分结合。然后在Envision Readers(PerkinElmer)上检测到Alpha信号。
关于竞争分析，将化合物(例如，SAA或SAC)以相同的方式稀释，并将非生物素化的含有m6A的mRNA用分析缓冲液稀释至400nM、200nM、50nM和25nM。将200nM His-YTHDF1(361-559)与非生物素化的含有m6A的mRNA于4℃孵育10分钟。然后，添加化合物(例如，SAA或SAC)并在室温下孵育另外30分钟，以和含有m6A的mRNA竞争与蛋白质的结合。接下来，在弱光下加入20nM生物素化的含有m6A的mRNA和两种珠子，并在检测前于4℃孵育1小时。
NMR分析
使用具有低温冷却探头的Bruker Avance III谱仪(600MHz质子频率)(Brukerbiospin，德国)在25℃进行NMR CPMG实验。在磷酸盐缓冲液(20mM NaH2PO4，20mM Na2HPO4，150mM NaCl，pH 7.4，D2O)中将YTHDF1(361-559)稀释至20μM、10μM和5μM。将化合物(例如，SAA或SAC)溶于5％氘代DMSO中，至浓度为200μM。通过脉冲序列(RD-90°-(τ-180°-τ)n-ACQ)，获得溶剂抑制的1D 1H CPMG。在预饱和程序中，在循环延迟(RD)的4s持续时间内施加54.78dB脉冲以消除水体共振。然后，将90°脉冲长度调制到约11.82μs。以及最后，总共有4个虚拟扫描和64个自由感应衰减(FID)被收集进64000个采集点，这些采集点覆盖12kHz(20ppm)的谱宽，采集时间(ACQ)为2.73s。
等温滴定量热法
将纯化的YTHDF1(361-559)在透析缓冲液(20mM Hepes(pH 7.4)和200mM NaCl)中于4℃透析过夜。然后用透析缓冲液将透析的蛋白质稀释到50μM。将化合物(例如，SAA或SAC)溶解，并用透析缓冲液稀释到1mM。在Microcal ITC 200等温滴定量热仪(GEHealthcare)上于25℃进行等温滴定量热(ITC)。将200μL 50μM YTHDF1(361-559)填充在样品细胞中，并于750rpm持续搅拌；将40μL 1mM SAA填充进注射器中。在一次0.4μL注射后，首先通过间隔180s的19次2μL注射将化合物(例如，SAA或SAC)滴定进YTHDF1(361-559)。然后为了使滴定效果更明显，经过计算后将19次2μL注射改为5次2.5μL注射，然后是14次1.9μL注射。并将1mM的化合物(例如，SAA或SAC)滴定进透析缓冲液中也作为对照，以排除背景稀释的热效应。通过Microcal ORIGIN(v7.0)软件(Microcal Software)分析实验数据。
SPR结合分析
在Biacore T200仪器(GE Healthcare)上于25℃进行SPR结合分析。将YTHDF1(361-559)在10mM乙酸钠(pH 5.5)条件下通过标准胺偶联程序共价固定在CM5芯片上。然后用HBS缓冲液(20mM Hepes(pH 7.4)、200mM NaCl和0.4％(v/v)DMSO)以梯度的方式稀释化合物(例如，SAA或SAC)。然后，在30μL/min的流速下注射稀释的化合物(例如，SAA或SAC)60秒以结合固定化的YTHDF(361-559)，随后以同样的流速注射HBS缓冲液解离600秒。通过Biacore T200评估软件(GE Healthcare)进行数据分析生成化合物(例如，SAA或SAC)的平衡解离常数(Kd)值。
MST分析
使用非标定量法在微量热泳动仪(NanoTemper Technologies)上于室温进行微量热泳动(MST)分析。用MST缓冲液(20mM Hepes(pH 7.4)、200mM NaCl和0.1mM
Figure BDA0004016647150000441
F-127)以两倍梯度的方式从1mM稀释化合物(例如，SAA或SAC)。用MST缓冲液将YTHDF1(361-559)稀释至4μM。然后，将10μL化合物(例如，SAA或SAC)和10μL YTHDF1(361-559)混合在一起，并在室温下孵育20分钟。在测量之前，混合物在4℃下以13000rpm离心10分钟。最后，通过Monolith NTTM自动非标定量毛细管(NanoTemper Technologies)收集样品并开始测量。使用MO亲和分析软件V2.3(NanoTemper Technologies)由数据分析获得化合物(例如，SAA或SAC)的Kd值。
氢氘交换质谱
测量前将YTHDF1(361-559)与化合物(例如，SAA)在4℃孵育过夜。在氢氘交换质谱(HDX MS)中，YTHDF1(361-559)-apo和YTHDF1(361-559)-SAA的氢原子在含有20mM Hepes(pH 7.4)、200mM NaCl和D2O的缓冲液中，于10℃分别与氘交换0s、10s、30s、60s、1200s、3600s和14400s。并且使用含4M盐酸胍、0.5M TCEP和100mM柠檬酸(pH 2.3)的缓冲液在0.5℃终止反应。氘标记反应后，样品在4℃下被固定在柱上的胃蛋白酶消化，以获得样品的多肽。然后通过HPLC分离这些肽，并分别通过质谱进行分析。在HDExaminer软件(v2.4.1)中对HDX质谱数据进行分析，并设定±5％为阈值以挑选出显著变化的那些肽。
细胞热移位分析
根据之前报道的方案进行细胞热移位分析(CETSA)。将分析中使用的293T细胞系(ATCC)在含有10％胎牛血清(Gibco，U.S.A.)、1％青霉素/链霉素(Life Technologies)的DMEM培养基(Life Technologies)中于37℃、5％ CO2下培养。与PBS缓冲液孵育作为对照或与100μM SAA孵育，4小时之后收集293T细胞，并且分别等分为12份。将分好的部分在39℃到59℃范围内的一系列温度下加热3分钟，然后立即在4℃冷却3分钟。然后，通过用液氮冷冻-解冻裂解细胞，并且通过离心收集蛋白质样品。通过添加SDS上样，并且在99℃煮沸5分钟，制备样品以进行蛋白质印迹检测。在蛋白质印迹分析中，使用GAPDH作为内参。通过Image J软件对分析结果进行定量分析。
细胞系和小鼠
B16-OVA是由Y.-X.Fu(UT Southwestern)提供的来源于小鼠黑素瘤细胞系B16的OVA转染克隆。
E.G7-OVA是由Chen Dong(清华大学)提供的来源于鼠胸腺淋巴瘤细胞系E.G7的OVA转染克隆。
Ythdf1-/-小鼠是如之前研究(例如参见Shi,H.等人，Nature 563,249-253(2018))中描述，由发明人在实验室里产生的。
Ythdf1F/F小鼠由Bin Shen(南京医科大学)提供，以及CD11ccre小鼠购自杰克逊实验室。
OT-I小鼠为卵清蛋白特异性CD8+TCR转基因小鼠，由Xiaohuan Guo(清华大学)提供。
肿瘤接种与治疗
针对B6小鼠肿瘤生长，将5×105个B16-OVA或1×106个E.G7-OVA肿瘤细胞皮下(s.c.)接种于小鼠胁部。每两天测量肿瘤长度(a)和宽度(b)，并且通过公式ab2/2计算肿瘤体积。针对抑制剂处理，在肿瘤接种后第9天和第11天腹腔(i.p.)注射10μM SAA或DMSO。针对其他小鼠模型(rag1-/-和Ythdf1条件性敲除)，抑制剂处理的次数和剂量是相同的。针对α-PD-L1与SAA的结合治疗，将5×105个B16-OVA肿瘤细胞皮下接种于小鼠胁部。肿瘤接种后第9天施用100μgα-PD-L1抗体(克隆10F.9G2)或大鼠免疫球蛋白。在肿瘤注射后第9天和第11天以相同的方式施用10μM SAA或DMSO。
FLT3L-DC培养及抑制剂处理
从野生型和Ythdf1-/-小鼠中分离骨髓，并用红细胞裂解缓冲液处理以去除红细胞。用含有10％胎牛血清的IMDM培养基悬浮骨髓细胞。为了培养FLT3L-DC，调整细胞浓度至1×106/mL。将细胞与100ng/mL FLT3L培养9天，以得到成熟的FLT3L-DC。通过Easysep小鼠CD11c阳性选择试剂盒II纯化成熟的FLT3L-DC，然后用10μM SAA或DMSO在IMDM培养基(含有10％牛血清和100ng/mL FLT3L)中处理10小时。
DC抗原-呈递功能分析
针对体外交叉呈递研究，在第9天收获成熟的FLT3L-DC，并用Easysep小鼠CD11c阳性选择试剂盒II纯化，然后用10μM SAA或DMSO在IMDM培养基(含有10％牛血清和100ng/mLFLT3L)中处理10小时。抑制剂(例如，SAA或SAC)处理后，将FLT3L-DC与坏死的B16-OVA细胞共培养6小时。然后纯化获得抗原的DC，并将其与来自OT-1小鼠的初始T细胞以1：10的比例共培养96小时。共培养培养基为含有10％胎牛血清的1640RPMI，该胎牛血清含或不含1μg/mL OT-1(OVA 257-264)肽。针对离体DC交叉呈递分析，在第12天从经SAA处理的B16-OVA荷瘤小鼠的引流淋巴结中分选出四种类型的DC(迁移型CD11b+DC、迁移型CD103+DC、驻留型CD11b+DC和驻留型CD8+DC)。这些DC与OT-1初始T细胞在有或没有OT-1肽的情况下以1：10的比例共培养96小时。通过CBA分析检测上清液中IFN-γ的产生。
T细胞功能分析
肿瘤浸润性白细胞通过RPMI 1640培养基以每mL 5×106个重悬于96孔板中。使用佛波醇-12-肉豆蔻酸酯-13-乙酸酯(PMA)(2.5μg/mL)和离子霉素(0.5μg/mL)刺激T细胞，同时向培养基添加布雷菲德菌素A(brefeldin A)，在37℃培养2小时。在96孔板中调整来自引流淋巴结的总淋巴细胞的细胞浓度为每mL 5×106个。向孔添加1μg/mL OT-1(OVA257-264)肽，并且刺激该肽96小时。样品用CD45和CD8在冰上染色30分钟。进行细胞内染色以定量IFN-γ和颗粒酶B的产生。
流式细胞术
针对流式细胞分析和DC分选，自小鼠收集肿瘤、引流淋巴结，并用100U/mL胶原酶IV和20μg/mL脱氧核糖核酸酶I在37℃下消化40分钟。通过FACS缓冲液(PBS含有2％ FBS和1mM EDTA)停止消化，并且通过70μm细胞筛过滤样品。样品于冰上在FACS缓冲液中通过特异性抗体染色30分钟。下表1描述了抗体信息。所有样品在染色后用FACS缓冲液洗涤，在BDFortessa上分析细胞，并用AriaⅢ分选。
表1
Figure BDA0004016647150000461
Figure BDA0004016647150000471
CFSE标记
将1×107个来自初始OT-I小鼠淋巴结的淋巴细胞用PBS洗涤2次，然后重悬于1mLPBS中。将1μL CFSE Tracker加入悬浮液中，并在37℃孵育5min。然后添加5mL含10％FBS的RPMI-1640培养基以终止CFSE标记，在室温孵育5min。离心后，在室温用另一5mL RPMI-1640培养基悬浮CFSE标记的T细胞至少10min。
实施例1针对YTHDF1的抑制活性
为了发现YTHDF1的新型抑制剂，研发了基于荧光偏振(FP)分析的高通量筛选(HTS)方法，并且发现丹酚酸A(SAA)是有效的抑制剂。在FP分析中评估了SAA抑制含有m6A的mRNA与YTHDF1之间相互作用的活性，如图1a所示，获得的IC50值为2.30±0.11μM。为了进一步验证SAA的抑制活性，进行了基于AlphaScreen的分析，并且如图1b所示，获得的IC50值为0.86±0.06M，证实SAA可有效阻断m6A与YTHDF1之间的结合。
另一种丹酚酸、即丹酚酸C(SAC)对YTHDF1活性的抑制也通过FP分析进行评估，并且如图1c所示，获得的IC50值为3.95μM。
然后，进行定性和定量实验，以探索SAA和YTHDF1之间的结合。首先进行Carr–Purcell–Meiboom–Gill(CPMG)核磁共振(NMR)实验。结果如图1d所示，添加200μM的SAA后，在CPMG谱中检测到化合物的信号，并且在分别添加5μM、10μM和20μM的YTHDF1时信号减弱，指示SAA与YTHDF1之间的直接结合。
然后，评估SAA和YTHDF1之间的结合亲和力。进行等温滴定量热(ITC)分析以准确测试YTHDF1和SAA之间的平衡解离常数(Kd)。在Microcal iTC200等温滴定量热仪(GEHealthcare)上独立进行三次ITC分析。简言之，在包含20mM Hepes(pH 7.4)和200mM NaCl的缓冲液中于25℃用1mM SAA滴定新鲜纯化的YTHDF1(50μM)。如图2a-2c所示，SAA在5.71μM的Kd值下与YTHDF1结合，证实了SAA和YTHDF1之间的结合。此外，焓变(ΔH＝-3099±144.1cal/mol)小于零，表明SAA可与YTHDF1形成氢键相互作用。此外，熵变(ΔS＝13.6cal/mol/deg)大于零，表明SAA的结合可能引起YTHDF1的构象变化。
此外，进行表面等离子共振(SPR)分析和微量热泳动(MST)分析以确认SAA和YTHDF1之间的结合强度。如图3a-3c所示，从SPR分析获得的Kd值为2.52μM，以及从MST分析获得的Kd值为4.70μM，这些结果与ITC实验结果一致。
综上所述，可以得出结论，本申请的化合物(例如，SAA、SAC和本申请的其他化合物)可直接与YTHDF1结合，并在体外阻断其m6A结合活性。
实施例2非竞争性地抑制YTHDF1活性
基于AlphaScreen分析，使用200nM YTHDF1和20nM生物素化的含有m6A的mRNA，对固定浓度的非生物素化的含有m6A的mRNA进行竞争结合实验。结果如图4a-4b所示，在不存在非生物素化的含有m6A的mRNA情况下，SAA对YTHDF1的抑制活性为0.80±0.08μM，并且当50nM、100nM、200nM或400nM非生物素化的含有m6A的mRNA与YTHDF1预孵育时，该抑制活性保持不变。这些结果显示SAA抑制YTHDF1的功能，但它不与m6A竞争结合YTHDF1。
然后，进行氢氘交换质谱(HDX MS)实验，以确定SAA在YTHDF1上的结合位点。在HDXMS分析中，检验了YTHDF1-APO和YTHDF1-SAA在10s、30s、60s、1200s、3600s和14400s的HDX行为，并在残差图(图5a)、蝴蝶图(图5b)和热图(图6)分析中展示了它们之间氘吸收的变化。许多肽具有超过5％的HDX百分比变化，表明SAA与YTHDF1的结合可引起完整蛋白质结构的显著构象变化。
如图7和图8a-8i所示，YTHDF1及相关肽存在显著的结构变化，且构象变化主要发生在以下三个区域：1)m6A结合口袋，2)带有某些正电荷氨基酸的长而浅的口袋，和3)YTHDF1的C-末端α-螺旋(其经历了最显著的变化)。这些结果表明SAA与YTHDF1在这3个区域中的一个区域结合，从而引起构象变化。
然后，设计了YTHDF1突变体和C-末端截短体(具有的氨基酸序列如SEQ ID NO:4-13中所示)，并使用这些突变体和截短体以测试SAA的抑制活性。
如图9和图10f-10j所示，当使用截短体(SEQ ID NO:13)或m6A结合口袋中具有突变的突变体(例如，具有下列突变K395A(SEQ ID NO:9)、Y397A(SEQ ID NO:10)、C412A(SEQID NO:11)或R506A(SEQ ID NO:12)的突变体)时，SAA对它们与m6A结合的抑制活性与对于野生型YTHDF1观察到的抑制活性相似，正如在FP实验中测量的那样。这些结果表明C末端α-螺旋区域和m6A结合口袋对SAA结合并不是必需的。相反，如图9和图10a-10e所示，当使用在残基372-392、479-494或526-535中有一个或多个突变(例如，突变W384A、H528A、N378A、F480A或F382A)的突变体(SEQ ID NO:4-8)时，SAA对它们与m6A结合的抑制活性明显弱于SAA对野生型YTHDF1与m6A结合的抑制活性。并且通过FP分析的进一步研究显示在残基372-392、479-494或526-535中的这些突变以及C-末端截短体并不影响YTHDF1与m6A的结合亲和力(图11a-11g)。
据此，发现SAA通过变构机制，至少部分通过残基372-392、479-494或526-535中的一个或多个残基与SAA之间形成的氢键相互作用，对YTHDF1发挥非竞争性抑制活性。
实施例3 SAA与YTHDF1在293T中的结合
此外，还检验了SAA与YTHDF1在细胞中的结合。使用293T细胞系进行细胞热位移(CETSA)测定，收集293T细胞系用于在指定温度下加热。这些细胞与100μM SAA孵育4h后，用蛋白质印迹检验孵育的293T细胞中的YTHDF1蛋白质。如图12a-12b所示，与SAA孵育后，改善了YTHDF1的稳定性，并且曲线向右移动了大约2度，证实SAA可与细胞质中的YTHDF1直接结合。
实施例4体内肿瘤生长抑制
将5×105个表达卵清蛋白(OVA)的B16黑素瘤细胞皮下接种到野生型小鼠。随后在肿瘤接种后9天和11天用10μM SAA处理荷瘤小鼠，并监测肿瘤生长。如图13a所示，与对照组相比，观察到接受SAA的小鼠体内肿瘤生长要慢很多。
在另一项实验中，在野生型小鼠皮下注射1×106个E.G7-OVA细胞。然后在第9天和第11天向每只小鼠注射10μM SAA。监测肿瘤生长情况。在E.G7-OVA淋巴瘤模型中发现了类似的抑制趋势(图13b)。
如图19所示，将5×105个B16-OVA细胞皮下接种于C57BL/6小鼠(n＝17)。植入后第9天按肿瘤大小将小鼠分为3组。分别静脉注射DMSO(n＝6)、10μM SAA(n＝6)或10μM SAC(n＝5)。监测肿瘤生长情况。数据显示为平均值±s.e.m.，并且“n.s.”意为不显著，通过非配对单尾t检验，“*”p<0.05，“**”p<0.01。观察到在接受SAA或SAC的小鼠中，肿瘤生长慢很多。
实施例5对肿瘤细胞体外增殖的影响
在另一项实验中，在体外用SAA处理肿瘤细胞。简言之，在96孔板中用不同剂量的SAA分别处理5×104个B16-OVA肿瘤细胞。在所述SAA处理后12小时计算细胞数。发现即使随着SAA剂量的增加，肿瘤细胞的增殖也不受影响(图14a)。这些结果表明，SAA不是通过直接杀死肿瘤细胞发挥其抗肿瘤作用。
实施例6适应性免疫是SAA抗肿瘤活性所需要的
在另一项实验中，在96孔板中用不同剂量的SAA处理5×105个经CFSE标记的OT-IT细胞，然后用1μg/mL的OT-I肽刺激细胞24小时。通过FACS分析分裂的T细胞。如图14b所示，SAA不能影响T细胞体外增殖。
将1×105个B16-OVA细胞接种于T/B细胞缺陷型Rag1-/-小鼠，然后从第7天到第9天向每只小鼠注射10μM SAA，并且监测肿瘤生长，使用野生型小鼠作为对照组。如图15a所示，野生型小鼠中肿瘤生长停滞，但在T/B细胞缺陷型Rag1-/-小鼠中肿瘤生长没有停滞，表明适应性免疫是SAA的最大抗肿瘤治疗作用所需要的。
实施例7SAA增强了APC的交叉呈递功能
来源于骨髓的细胞(野生型或Ythdf1基因缺陷型)与FLT3L一起培养9天以得到FLT3L-DC，并且用10μM SAA将这些DC处理12小时，然后，将FLT3L-DC与坏死的B16-OVA肿瘤细胞共培养6小时。纯化CD11c+细胞，且与OT-I T细胞共培养72小时。通过IFN-γ流式细胞术微球阵列评估IFN-γ的产生。
如图15b所示，与对照组相比，经SAA处理的FLT3L-DC在交叉致敏T细胞中表现出更好的能力。为了比较SAA处理与Ythdf1基因敲除的功效，使用Ythdf1基因缺陷型DC(从Ythdf1-/-骨髓中获得)作为阳性对照。有趣的是，SAA也可促进Ythdf1-/-FLT3L-DC的交叉呈递功能。这些结果表明，本申请的化合物(例如，SAA)在体外可促进抗原呈递细胞(例如，DC)的交叉致敏功能。
此外，在第12天从经SAA处理的B16-OVA荷瘤野生型小鼠的引流淋巴结中分选出四种类型的典型DC(驻留型CD11b+、驻留型CD8α+、迁移型CD11b+和迁移型CD103+)。这些DC与OT-I T细胞共培养72小时。然后，通过IFN-γ流式细胞术微球阵列评估IFN-γ的产生。如图15c所示，与DMSO处理组相比，来自SAA处理的小鼠的所有这些DC亚型均表现出更好的T细胞交叉致敏，特别是驻留型CD8α+DC和迁移型CD103+DC。这些结果表明本申请的化合物(例如，SAA)在体内也可促进抗原呈递细胞(例如，DC)的交叉致敏功能。
实施例8 SAA在APC中发挥作用以加强免疫应答
树突状细胞可通过交叉致敏和/或直接致敏激活T细胞。在直接致敏过程中，DC可通过诸如CD80/CD86或与T细胞激活相关的细胞因子的表面共刺激分子刺激T细胞。为了评估施用SAA后直接致敏功能是否也受到影响，将来源于骨髓的细胞(野生型或Ythdf1基因缺陷型)与FLT3L一起培养9天以得到FLT3L-DC，并用10μM SAA将这些DC处理12小时，然后将FLT3L-DC与坏死的B16-OVA肿瘤细胞共培养6小时。纯化CD11c+细胞，并与添加1μg/mL OT-I肽的OT-I T细胞共培养72小时。通过IFN-γ流式细胞术微球阵列评估IFN-γ的产生。此外，在第12天从经SAA处理的B16-OVA荷瘤野生型小鼠的引流淋巴结中分选出四种类型的典型DC(驻留型CD11b+、驻留型CD8α+、迁移型CD11b+和迁移型CD103+)。这些DC与添加1μg/mL OT-I肽的OT-I T细胞共培养72小时。然后，通过IFN-γ流式细胞术微球阵列评估IFN-γ的产生。
如图16a-16b所示，虽然SAA在体外不能增强FLT3L-DC的直接致敏功能，但4种DC亚型中的3种经SAA处理后显示出改善的直接致敏能力，表明SAA可增强DC在体内的直接致敏能力。这些结果表明，本申请的化合物(例如，SAA)可在APC(例如，树突状细胞)中发挥作用，以加强免疫应答。
实施例9 APC是SAA的主要靶点
为了确定DC是否是SAA的主要靶点，向Ythdf1F/F和CD11ccreYthdf1F/F小鼠皮下注射2×106个B16-OVA细胞。然后，在第9天和第11天向每只小鼠注射10μM SAA，并监测肿瘤生长情况。如图17a所示，经SAA处理的Ythdf1F/F小鼠的肿瘤生长表现出与在CD11ccreYthdf1F/F小鼠中观察到的情况相似的情况，然而，在CD11ccreYthdf1F/F小鼠中没有发现进一步明显的肿瘤控制效果，表明DC是SAA的主要靶点。
实施例10 SAA激活肿瘤特异性T细胞
为了探索SAA处理对T细胞功能的影响，处死经SAA处理的B16-OVA荷瘤小鼠以研究肿瘤浸润性T细胞(TIL)功能。首先使用佛波醇-12-肉豆蔻酸酯-13-乙酸酯(PMA)和离子霉素以非特异性地刺激肿瘤浸润性T细胞，然后进行细胞内染色，以通过FACS定量细胞因子(例如，IFN-γ、颗粒酶B)的产生。如图17b所示，来自经SAA处理的小鼠的肿瘤浸润性T细胞分泌的细胞因子水平高于DMSO组，表明SAA可增强肿瘤浸润性T细胞的效应子功能。
然后，从引流淋巴结中分离淋巴细胞，并且用1μg/mL的OT1肽刺激这些淋巴细胞，并通过FACS分析IFN-γ产生细胞。如图17c所示，来自经SAA处理的小鼠的DLN T细胞产生的IFN-γ高于DMSO组很多。结果显示，施用SAA后引流淋巴结中有更多的肿瘤特异性T细胞被激活。
此外，发现来自SAA处理组的PD-1low群体表达的CXCR5高于DMSO组(图18a)很多，在SAA处理的情况下在肿瘤接种后14天检测到PD-1lowCXCR5high T细胞(耗竭性T细胞前体)。此外，在SAA处理的情况下在肿瘤接种后14天评估终末期耗竭性T细胞(PD-1和Tim-3双阳性细胞)，并观察到在经SAA处理的小鼠中这些肿瘤浸润性终末期耗竭性T细胞(PD-1+Tim-3+)的频率下降(图18b)，证实了增强的抗肿瘤活性。
这些结果显示在SAA处理后，T细胞在引流淋巴结中被更好地致敏，并且TIL的效应子功能被显著改善。
实施例11与免疫检查点抑制剂结合的协同效应
向野生型小鼠皮下注射5×105个B16-OVA细胞。在第9天和第11天向每只小鼠注射10μM SAA。在第9天还用100μg抗PD-L1抗体处理小鼠。随着时间的推移监测肿瘤生长情况。如图18c所示，SAA或抗PD-L1抗体单独治疗可部分抑制B16-OVA肿瘤生长，而结合治疗可显著抑制肿瘤，甚至实现完全的肿瘤消退。这些结果进一步支持SAA可通过增强的DC功能诱导改善的T细胞抗肿瘤能力，而免疫检查点抑制剂(诸如抗-PD-L1抗体)与本申请的化合物(例如，SAA)结合可激发更持久的T细胞应答。
如图20所示，将5×105个B16-OVA细胞皮下接种于C57BL/6小鼠(n＝23)。在植入后第9天根据肿瘤大小将小鼠分为两组。在植入后第9天和第11天，一组用10μM SAA(n＝6)静脉内处理，另一组用DMSO(n＝6)处理。在接种后第12天，将两组中的每一组进一步分成另外两组，然后腹腔注射200μg PD-1阻断抗体(Bio-X-cell，BE0146，克隆：RMP1-14)。对照组为PBS和DMSO处理，n＝6。向单独处理组注射具有SAA的同型对照或具有DMSO的α-PD-1，n＝6。用SAA和PD-1阻断抗体处理结合组，n＝5。监测肿瘤生长。数据显示为平均值±s.e.m.，并且“n.s.”意为不显著，通过非配对单尾t检验，“**”p<0.01，“****”p<0.00001。这些结果进一步支持免疫检查点抑制剂(诸如抗-PD-L1抗体)与本申请的化合物(例如，SAA)结合可激发更持久的T细胞应答。
实施例12SAA在APC中发挥作用以表现出持久的抗肿瘤功能
如图21所示，用DMSO或10μM SAA将成熟的FLT3L DC预处理10小时，然后将这些DC与坏死的B16-OVA共培养6小时。纯化CD11c+细胞用于过继转移。将5×105个B16-OVA细胞皮下接种于C57BL/6小鼠(n＝17)。在植入后第9天按肿瘤大小将小鼠分为3组。将1×105个经DMSO处理的FLT3L DC(n＝6)或经SAA处理的FLT3L DC(n＝5)静脉转移到荷瘤小鼠体内。首次转移7天后，进行第二批过继转移。监测肿瘤生长。数据显示为平均值±s.e.m.，并且“n.s.”意为不显著，通过非配对单尾t检验，“**”p<0.01，“****”p<0.00001。这些结果支持用本申请的化合物(例如，SAA)处理的过继转移FLT3L DC表现出持久的抗肿瘤功能。
尽管本文中已展示并描述了本申请的优选实施方案，但对于本领域技术人员来说，显然这些实施例仅以举例的方式提供。本申请并不意在受说明书中提供的具体实施例的限制。尽管已参照前述说明书对本申请进行了描述，但本文中对实施方案的描述和说明并不意味着要被解释为具有限制性意义。在不偏离本申请的情况下，本领域技术人员现将想到多种变化、改变和替换。此外，应理解的是，本申请的所有方面并不局限于本文所述的具体描述、配置或相对比例，这取决于各种条件和变量。应当理解的是，在实践本申请时，可以采用本文所述的本申请的实施方案的各种替代方案。因此，预期本申请还应涵盖任何这样的替代、修改、变化或等同物。以下的权利要求旨在界定本申请的范围，并且在这些权利要求范围内的方法和结构及其等同物将由此被涵盖。
SEQUENCE LISTING
<110> 中国科学院上海药物研究所；
杭州领知医药科技有限公司；
上海康黔生物科技有限公司
<120> 用于抑制YTHDF1的组合物和方法
<130> 0128-PA-012CN
<160> 18
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 559
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Y
<400> 1
Met Ser Ala Thr Ser Val Asp Thr Gln Arg Thr Lys Gly Gln Asp Asn
1 5 10 15
Lys Val Gln Asn Gly Ser Leu His Gln Lys Asp Thr Val His Asp Asn
20 25 30
Asp Phe Glu Pro Tyr Leu Thr Gly Gln Ser Asn Gln Ser Asn Ser Tyr
35 40 45
Pro Ser Met Ser Asp Pro Tyr Leu Ser Ser Tyr Tyr Pro Pro Ser Ile
50 55 60
Gly Phe Pro Tyr Ser Leu Asn Glu Ala Pro Trp Ser Thr Ala Gly Asp
65 70 75 80
Pro Pro Ile Pro Tyr Leu Thr Thr Tyr Gly Gln Leu Ser Asn Gly Asp
85 90 95
His His Phe Met His Asp Ala Val Phe Gly Gln Pro Gly Gly Leu Gly
100 105 110
Asn Asn Ile Tyr Gln His Arg Phe Asn Phe Phe Pro Glu Asn Pro Ala
115 120 125
Phe Ser Ala Trp Gly Thr Ser Gly Ser Gln Gly Gln Gln Thr Gln Ser
130 135 140
Ser Ala Tyr Gly Ser Ser Tyr Thr Tyr Pro Pro Ser Ser Leu Gly Gly
145 150 155 160
Thr Val Val Asp Gly Gln Pro Gly Phe His Ser Asp Thr Leu Ser Lys
165 170 175
Ala Pro Gly Met Asn Ser Leu Glu Gln Gly Met Val Gly Leu Lys Ile
180 185 190
Gly Asp Val Ser Ser Ser Ala Val Lys Thr Val Gly Ser Val Val Ser
195 200 205
Ser Val Ala Leu Thr Gly Val Leu Ser Gly Asn Gly Gly Thr Asn Val
210 215 220
Asn Met Pro Val Ser Lys Pro Thr Ser Trp Ala Ala Ile Ala Ser Lys
225 230 235 240
Pro Ala Lys Pro Gln Pro Lys Met Lys Thr Lys Ser Gly Pro Val Met
245 250 255
Gly Gly Gly Leu Pro Pro Pro Pro Ile Lys His Asn Met Asp Ile Gly
260 265 270
Thr Trp Asp Asn Lys Gly Pro Val Pro Lys Ala Pro Val Pro Gln Gln
275 280 285
Ala Pro Ser Pro Gln Ala Ala Pro Gln Pro Gln Gln Val Ala Gln Pro
290 295 300
Leu Pro Ala Gln Pro Pro Ala Leu Ala Gln Pro Gln Tyr Gln Ser Pro
305 310 315 320
Gln Gln Pro Pro Gln Thr Arg Trp Val Ala Pro Arg Asn Arg Asn Ala
325 330 335
Ala Phe Gly Gln Ser Gly Gly Ala Gly Ser Asp Ser Asn Ser Pro Gly
340 345 350
Asn Val Gln Pro Asn Ser Ala Pro Ser Val Glu Ser His Pro Val Leu
355 360 365
Glu Lys Leu Lys Ala Ala His Ser Tyr Asn Pro Lys Glu Phe Glu Trp
370 375 380
Asn Leu Lys Ser Gly Arg Val Phe Ile Ile Lys Ser Tyr Ser Glu Asp
385 390 395 400
Asp Ile His Arg Ser Ile Lys Tyr Ser Ile Trp Cys Ser Thr Glu His
405 410 415
Gly Asn Lys Arg Leu Asp Ser Ala Phe Arg Cys Met Ser Ser Lys Gly
420 425 430
Pro Val Tyr Leu Leu Phe Ser Val Asn Gly Ser Gly His Phe Cys Gly
435 440 445
Val Ala Glu Met Lys Ser Pro Val Asp Tyr Gly Thr Ser Ala Gly Val
450 455 460
Trp Ser Gln Asp Lys Trp Lys Gly Lys Phe Asp Val Gln Trp Ile Phe
465 470 475 480
Val Lys Asp Val Pro Asn Asn Gln Leu Arg His Ile Arg Leu Glu Asn
485 490 495
Asn Asp Asn Lys Pro Val Thr Asn Ser Arg Asp Thr Gln Glu Val Pro
500 505 510
Leu Glu Lys Ala Lys Gln Val Leu Lys Ile Ile Ser Ser Tyr Lys His
515 520 525
Thr Thr Ser Ile Phe Asp Asp Phe Ala His Tyr Glu Lys Arg Gln Glu
530 535 540
Glu Glu Glu Val Val Arg Lys Glu Arg Gln Ser Arg Asn Lys Gln
545 550 555
<210> 2
<211> 201
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Y
<400> 2
Gly Pro Ser Val Glu Ser His Pro Val Leu Glu Lys Leu Lys Ala Ala
1 5 10 15
His Ser Tyr Asn Pro Lys Glu Phe Glu Trp Asn Leu Lys Ser Gly Arg
20 25 30
Val Phe Ile Ile Lys Ser Tyr Ser Glu Asp Asp Ile His Arg Ser Ile
35 40 45
Lys Tyr Ser Ile Trp Cys Ser Thr Glu His Gly Asn Lys Arg Leu Asp
50 55 60
Ser Ala Phe Arg Cys Met Ser Ser Lys Gly Pro Val Tyr Leu Leu Phe
65 70 75 80
Ser Val Asn Gly Ser Gly His Phe Cys Gly Val Ala Glu Met Lys Ser
85 90 95
Pro Val Asp Tyr Gly Thr Ser Ala Gly Val Trp Ser Gln Asp Lys Trp
100 105 110
Lys Gly Lys Phe Asp Val Gln Trp Ile Phe Val Lys Asp Val Pro Asn
115 120 125
Asn Gln Leu Arg His Ile Arg Leu Glu Asn Asn Asp Asn Lys Pro Val
130 135 140
Thr Asn Ser Arg Asp Thr Gln Glu Val Pro Leu Glu Lys Ala Lys Gln
145 150 155 160
Val Leu Lys Ile Ile Ser Ser Tyr Lys His Thr Thr Ser Ile Phe Asp
165 170 175
Asp Phe Ala His Tyr Glu Lys Arg Gln Glu Glu Glu Glu Val Val Arg
180 185 190
Lys Glu Arg Gln Ser Arg Asn Lys Gln
195 200
<210> 3
<211> 238
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Y
<400> 3
His His His His His His Ser Ser Gly Leu Val Pro Arg Gly Ser His
1 5 10 15
Met Ala Ser Met Thr Gly Gly Gln Gln Met Gly Arg Gly Ser Glu Phe
20 25 30
Glu Asn Leu Tyr Phe Gln Gly Ser Val Glu Ser His Pro Val Leu Glu
35 40 45
Lys Leu Lys Ala Ala His Ser Tyr Asn Pro Lys Glu Phe Glu Trp Asn
50 55 60
Leu Lys Ser Gly Arg Val Phe Ile Ile Lys Ser Tyr Ser Glu Asp Asp
65 70 75 80
Ile His Arg Ser Ile Lys Tyr Ser Ile Trp Cys Ser Thr Glu His Gly
85 90 95
Asn Lys Arg Leu Asp Ser Ala Phe Arg Cys Met Ser Ser Lys Gly Pro
100 105 110
Val Tyr Leu Leu Phe Ser Val Asn Gly Ser Gly His Phe Cys Gly Val
115 120 125
Ala Glu Met Lys Ser Pro Val Asp Tyr Gly Thr Ser Ala Gly Val Trp
130 135 140
Ser Gln Asp Lys Trp Lys Gly Lys Phe Asp Val Gln Trp Ile Phe Val
145 150 155 160
Lys Asp Val Pro Asn Asn Gln Leu Arg His Ile Arg Leu Glu Asn Asn
165 170 175
Asp Asn Lys Pro Val Thr Asn Ser Arg Asp Thr Gln Glu Val Pro Leu
180 185 190
Glu Lys Ala Lys Gln Val Leu Lys Ile Ile Ser Ser Tyr Lys His Thr
195 200 205
Thr Ser Ile Phe Asp Asp Phe Ala His Tyr Glu Lys Arg Gln Glu Glu
210 215 220
Glu Glu Val Val Arg Lys Glu Arg Gln Ser Arg Asn Lys Gln
225 230 235
<210> 4
<211> 201
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Y
<400> 4
Gly Pro Ser Val Glu Ser His Pro Val Leu Glu Lys Leu Lys Ala Ala
1 5 10 15
His Ser Tyr Asn Pro Lys Glu Phe Glu Ala Asn Leu Lys Ser Gly Arg
20 25 30
Val Phe Ile Ile Lys Ser Tyr Ser Glu Asp Asp Ile His Arg Ser Ile
35 40 45
Lys Tyr Ser Ile Trp Cys Ser Thr Glu His Gly Asn Lys Arg Leu Asp
50 55 60
Ser Ala Phe Arg Cys Met Ser Ser Lys Gly Pro Val Tyr Leu Leu Phe
65 70 75 80
Ser Val Asn Gly Ser Gly His Phe Cys Gly Val Ala Glu Met Lys Ser
85 90 95
Pro Val Asp Tyr Gly Thr Ser Ala Gly Val Trp Ser Gln Asp Lys Trp
100 105 110
Lys Gly Lys Phe Asp Val Gln Trp Ile Phe Val Lys Asp Val Pro Asn
115 120 125
Asn Gln Leu Arg His Ile Arg Leu Glu Asn Asn Asp Asn Lys Pro Val
130 135 140
Thr Asn Ser Arg Asp Thr Gln Glu Val Pro Leu Glu Lys Ala Lys Gln
145 150 155 160
Val Leu Lys Ile Ile Ser Ser Tyr Lys His Thr Thr Ser Ile Phe Asp
165 170 175
Asp Phe Ala His Tyr Glu Lys Arg Gln Glu Glu Glu Glu Val Val Arg
180 185 190
Lys Glu Arg Gln Ser Arg Asn Lys Gln
195 200
<210> 5
<211> 201
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Y
<400> 5
Gly Pro Ser Val Glu Ser His Pro Val Leu Glu Lys Leu Lys Ala Ala
1 5 10 15
His Ser Tyr Asn Pro Lys Glu Phe Glu Trp Asn Leu Lys Ser Gly Arg
20 25 30
Val Phe Ile Ile Lys Ser Tyr Ser Glu Asp Asp Ile His Arg Ser Ile
35 40 45
Lys Tyr Ser Ile Trp Cys Ser Thr Glu His Gly Asn Lys Arg Leu Asp
50 55 60
Ser Ala Phe Arg Cys Met Ser Ser Lys Gly Pro Val Tyr Leu Leu Phe
65 70 75 80
Ser Val Asn Gly Ser Gly His Phe Cys Gly Val Ala Glu Met Lys Ser
85 90 95
Pro Val Asp Tyr Gly Thr Ser Ala Gly Val Trp Ser Gln Asp Lys Trp
100 105 110
Lys Gly Lys Phe Asp Val Gln Trp Ile Phe Val Lys Asp Val Pro Asn
115 120 125
Asn Gln Leu Arg His Ile Arg Leu Glu Asn Asn Asp Asn Lys Pro Val
130 135 140
Thr Asn Ser Arg Asp Thr Gln Glu Val Pro Leu Glu Lys Ala Lys Gln
145 150 155 160
Val Leu Lys Ile Ile Ser Ser Tyr Lys Ala Thr Thr Ser Ile Phe Asp
165 170 175
Asp Phe Ala His Tyr Glu Lys Arg Gln Glu Glu Glu Glu Val Val Arg
180 185 190
Lys Glu Arg Gln Ser Arg Asn Lys Gln
195 200
<210> 6
<211> 201
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Y
<400> 6
Gly Pro Ser Val Glu Ser His Pro Val Leu Glu Lys Leu Lys Ala Ala
1 5 10 15
His Ser Tyr Ala Pro Lys Glu Phe Glu Trp Asn Leu Lys Ser Gly Arg
20 25 30
Val Phe Ile Ile Lys Ser Tyr Ser Glu Asp Asp Ile His Arg Ser Ile
35 40 45
Lys Tyr Ser Ile Trp Cys Ser Thr Glu His Gly Asn Lys Arg Leu Asp
50 55 60
Ser Ala Phe Arg Cys Met Ser Ser Lys Gly Pro Val Tyr Leu Leu Phe
65 70 75 80
Ser Val Asn Gly Ser Gly His Phe Cys Gly Val Ala Glu Met Lys Ser
85 90 95
Pro Val Asp Tyr Gly Thr Ser Ala Gly Val Trp Ser Gln Asp Lys Trp
100 105 110
Lys Gly Lys Phe Asp Val Gln Trp Ile Phe Val Lys Asp Val Pro Asn
115 120 125
Asn Gln Leu Arg His Ile Arg Leu Glu Asn Asn Asp Asn Lys Pro Val
130 135 140
Thr Asn Ser Arg Asp Thr Gln Glu Val Pro Leu Glu Lys Ala Lys Gln
145 150 155 160
Val Leu Lys Ile Ile Ser Ser Tyr Lys His Thr Thr Ser Ile Phe Asp
165 170 175
Asp Phe Ala His Tyr Glu Lys Arg Gln Glu Glu Glu Glu Val Val Arg
180 185 190
Lys Glu Arg Gln Ser Arg Asn Lys Gln
195 200
<210> 7
<211> 201
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Y
<400> 7
Gly Pro Ser Val Glu Ser His Pro Val Leu Glu Lys Leu Lys Ala Ala
1 5 10 15
His Ser Tyr Asn Pro Lys Glu Phe Glu Trp Asn Leu Lys Ser Gly Arg
20 25 30
Val Phe Ile Ile Lys Ser Tyr Ser Glu Asp Asp Ile His Arg Ser Ile
35 40 45
Lys Tyr Ser Ile Trp Cys Ser Thr Glu His Gly Asn Lys Arg Leu Asp
50 55 60
Ser Ala Phe Arg Cys Met Ser Ser Lys Gly Pro Val Tyr Leu Leu Phe
65 70 75 80
Ser Val Asn Gly Ser Gly His Phe Cys Gly Val Ala Glu Met Lys Ser
85 90 95
Pro Val Asp Tyr Gly Thr Ser Ala Gly Val Trp Ser Gln Asp Lys Trp
100 105 110
Lys Gly Lys Phe Asp Val Gln Trp Ile Ala Val Lys Asp Val Pro Asn
115 120 125
Asn Gln Leu Arg His Ile Arg Leu Glu Asn Asn Asp Asn Lys Pro Val
130 135 140
Thr Asn Ser Arg Asp Thr Gln Glu Val Pro Leu Glu Lys Ala Lys Gln
145 150 155 160
Val Leu Lys Ile Ile Ser Ser Tyr Lys His Thr Thr Ser Ile Phe Asp
165 170 175
Asp Phe Ala His Tyr Glu Lys Arg Gln Glu Glu Glu Glu Val Val Arg
180 185 190
Lys Glu Arg Gln Ser Arg Asn Lys Gln
195 200
<210> 8
<211> 201
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Y
<400> 8
Gly Pro Ser Val Glu Ser His Pro Val Leu Glu Lys Leu Lys Ala Ala
1 5 10 15
His Ser Tyr Asn Pro Lys Glu Ala Glu Trp Asn Leu Lys Ser Gly Arg
20 25 30
Val Phe Ile Ile Lys Ser Tyr Ser Glu Asp Asp Ile His Arg Ser Ile
35 40 45
Lys Tyr Ser Ile Trp Cys Ser Thr Glu His Gly Asn Lys Arg Leu Asp
50 55 60
Ser Ala Phe Arg Cys Met Ser Ser Lys Gly Pro Val Tyr Leu Leu Phe
65 70 75 80
Ser Val Asn Gly Ser Gly His Phe Cys Gly Val Ala Glu Met Lys Ser
85 90 95
Pro Val Asp Tyr Gly Thr Ser Ala Gly Val Trp Ser Gln Asp Lys Trp
100 105 110
Lys Gly Lys Phe Asp Val Gln Trp Ile Phe Val Lys Asp Val Pro Asn
115 120 125
Asn Gln Leu Arg His Ile Arg Leu Glu Asn Asn Asp Asn Lys Pro Val
130 135 140
Thr Asn Ser Arg Asp Thr Gln Glu Val Pro Leu Glu Lys Ala Lys Gln
145 150 155 160
Val Leu Lys Ile Ile Ser Ser Tyr Lys His Thr Thr Ser Ile Phe Asp
165 170 175
Asp Phe Ala His Tyr Glu Lys Arg Gln Glu Glu Glu Glu Val Val Arg
180 185 190
Lys Glu Arg Gln Ser Arg Asn Lys Gln
195 200
<210> 9
<211> 201
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Y
<400> 9
Gly Pro Ser Val Glu Ser His Pro Val Leu Glu Lys Leu Lys Ala Ala
1 5 10 15
His Ser Tyr Asn Pro Lys Glu Phe Glu Trp Asn Leu Lys Ser Gly Arg
20 25 30
Val Phe Ile Ile Ala Ser Tyr Ser Glu Asp Asp Ile His Arg Ser Ile
35 40 45
Lys Tyr Ser Ile Trp Cys Ser Thr Glu His Gly Asn Lys Arg Leu Asp
50 55 60
Ser Ala Phe Arg Cys Met Ser Ser Lys Gly Pro Val Tyr Leu Leu Phe
65 70 75 80
Ser Val Asn Gly Ser Gly His Phe Cys Gly Val Ala Glu Met Lys Ser
85 90 95
Pro Val Asp Tyr Gly Thr Ser Ala Gly Val Trp Ser Gln Asp Lys Trp
100 105 110
Lys Gly Lys Phe Asp Val Gln Trp Ile Phe Val Lys Asp Val Pro Asn
115 120 125
Asn Gln Leu Arg His Ile Arg Leu Glu Asn Asn Asp Asn Lys Pro Val
130 135 140
Thr Asn Ser Arg Asp Thr Gln Glu Val Pro Leu Glu Lys Ala Lys Gln
145 150 155 160
Val Leu Lys Ile Ile Ser Ser Tyr Lys His Thr Thr Ser Ile Phe Asp
165 170 175
Asp Phe Ala His Tyr Glu Lys Arg Gln Glu Glu Glu Glu Val Val Arg
180 185 190
Lys Glu Arg Gln Ser Arg Asn Lys Gln
195 200
<210> 10
<211> 201
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Y
<400> 10
Gly Pro Ser Val Glu Ser His Pro Val Leu Glu Lys Leu Lys Ala Ala
1 5 10 15
His Ser Tyr Asn Pro Lys Glu Phe Glu Trp Asn Leu Lys Ser Gly Arg
20 25 30
Val Phe Ile Ile Lys Ser Ala Ser Glu Asp Asp Ile His Arg Ser Ile
35 40 45
Lys Tyr Ser Ile Trp Cys Ser Thr Glu His Gly Asn Lys Arg Leu Asp
50 55 60
Ser Ala Phe Arg Cys Met Ser Ser Lys Gly Pro Val Tyr Leu Leu Phe
65 70 75 80
Ser Val Asn Gly Ser Gly His Phe Cys Gly Val Ala Glu Met Lys Ser
85 90 95
Pro Val Asp Tyr Gly Thr Ser Ala Gly Val Trp Ser Gln Asp Lys Trp
100 105 110
Lys Gly Lys Phe Asp Val Gln Trp Ile Phe Val Lys Asp Val Pro Asn
115 120 125
Asn Gln Leu Arg His Ile Arg Leu Glu Asn Asn Asp Asn Lys Pro Val
130 135 140
Thr Asn Ser Arg Asp Thr Gln Glu Val Pro Leu Glu Lys Ala Lys Gln
145 150 155 160
Val Leu Lys Ile Ile Ser Ser Tyr Lys His Thr Thr Ser Ile Phe Asp
165 170 175
Asp Phe Ala His Tyr Glu Lys Arg Gln Glu Glu Glu Glu Val Val Arg
180 185 190
Lys Glu Arg Gln Ser Arg Asn Lys Gln
195 200
<210> 11
<211> 201
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Y
<400> 11
Gly Pro Ser Val Glu Ser His Pro Val Leu Glu Lys Leu Lys Ala Ala
1 5 10 15
His Ser Tyr Asn Pro Lys Glu Phe Glu Trp Asn Leu Lys Ser Gly Arg
20 25 30
Val Phe Ile Ile Lys Ser Tyr Ser Glu Asp Asp Ile His Arg Ser Ile
35 40 45
Lys Tyr Ser Ile Trp Ala Ser Thr Glu His Gly Asn Lys Arg Leu Asp
50 55 60
Ser Ala Phe Arg Cys Met Ser Ser Lys Gly Pro Val Tyr Leu Leu Phe
65 70 75 80
Ser Val Asn Gly Ser Gly His Phe Cys Gly Val Ala Glu Met Lys Ser
85 90 95
Pro Val Asp Tyr Gly Thr Ser Ala Gly Val Trp Ser Gln Asp Lys Trp
100 105 110
Lys Gly Lys Phe Asp Val Gln Trp Ile Phe Val Lys Asp Val Pro Asn
115 120 125
Asn Gln Leu Arg His Ile Arg Leu Glu Asn Asn Asp Asn Lys Pro Val
130 135 140
Thr Asn Ser Arg Asp Thr Gln Glu Val Pro Leu Glu Lys Ala Lys Gln
145 150 155 160
Val Leu Lys Ile Ile Ser Ser Tyr Lys His Thr Thr Ser Ile Phe Asp
165 170 175
Asp Phe Ala His Tyr Glu Lys Arg Gln Glu Glu Glu Glu Val Val Arg
180 185 190
Lys Glu Arg Gln Ser Arg Asn Lys Gln
195 200
<210> 12
<211> 201
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Y
<400> 12
Gly Pro Ser Val Glu Ser His Pro Val Leu Glu Lys Leu Lys Ala Ala
1 5 10 15
His Ser Tyr Asn Pro Lys Glu Phe Glu Trp Asn Leu Lys Ser Gly Arg
20 25 30
Val Phe Ile Ile Lys Ser Tyr Ser Glu Asp Asp Ile His Arg Ser Ile
35 40 45
Lys Tyr Ser Ile Trp Cys Ser Thr Glu His Gly Asn Lys Arg Leu Asp
50 55 60
Ser Ala Phe Arg Cys Met Ser Ser Lys Gly Pro Val Tyr Leu Leu Phe
65 70 75 80
Ser Val Asn Gly Ser Gly His Phe Cys Gly Val Ala Glu Met Lys Ser
85 90 95
Pro Val Asp Tyr Gly Thr Ser Ala Gly Val Trp Ser Gln Asp Lys Trp
100 105 110
Lys Gly Lys Phe Asp Val Gln Trp Ile Phe Val Lys Asp Val Pro Asn
115 120 125
Asn Gln Leu Arg His Ile Arg Leu Glu Asn Asn Asp Asn Lys Pro Val
130 135 140
Thr Asn Ser Ala Asp Thr Gln Glu Val Pro Leu Glu Lys Ala Lys Gln
145 150 155 160
Val Leu Lys Ile Ile Ser Ser Tyr Lys His Thr Thr Ser Ile Phe Asp
165 170 175
Asp Phe Ala His Tyr Glu Lys Arg Gln Glu Glu Glu Glu Val Val Arg
180 185 190
Lys Glu Arg Gln Ser Arg Asn Lys Gln
195 200
<210> 13
<211> 174
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Y
<400> 13
Gly Pro Ser Val Glu Ser His Pro Val Leu Glu Lys Leu Lys Ala Ala
1 5 10 15
His Ser Tyr Asn Pro Lys Glu Phe Glu Trp Asn Leu Lys Ser Gly Arg
20 25 30
Val Phe Ile Ile Lys Ser Tyr Ser Glu Asp Asp Ile His Arg Ser Ile
35 40 45
Lys Tyr Ser Ile Trp Cys Ser Thr Glu His Gly Asn Lys Arg Leu Asp
50 55 60
Ser Ala Phe Arg Cys Met Ser Ser Lys Gly Pro Val Tyr Leu Leu Phe
65 70 75 80
Ser Val Asn Gly Ser Gly His Phe Cys Gly Val Ala Glu Met Lys Ser
85 90 95
Pro Val Asp Tyr Gly Thr Ser Ala Gly Val Trp Ser Gln Asp Lys Trp
100 105 110
Lys Gly Lys Phe Asp Val Gln Trp Ile Phe Val Lys Asp Val Pro Asn
115 120 125
Asn Gln Leu Arg His Ile Arg Leu Glu Asn Asn Asp Asn Lys Pro Val
130 135 140
Thr Asn Ser Arg Asp Thr Gln Glu Val Pro Leu Glu Lys Ala Lys Gln
145 150 155 160
Val Leu Lys Ile Ile Ser Ser Tyr Lys His Thr Thr Ser Ile
165 170
<210> 14
<211> 17
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> mRNA
<220>
<221> modified_base
<222> (1)..(1)
<223> FAM labeled u
<220>
<221> modified_base
<222> (12)..(12)
<223> m6a
<400> 14
uucuucugug gacugug 17
<210> 15
<211> 17
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> mRNA
<220>
<221> modified_base
<222> (1)..(1)
<223> biotinylated u
<220>
<221> modified_base
<222> (12)..(12)
<223> m6a
<400> 15
uucuucugug gacugug 17
<210> 16
<211> 21
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Y1
<400> 16
Lys Ala Ala His Ser Tyr Asn Pro Lys Glu Phe Glu Trp Asn Leu Lys
1 5 10 15
Ser Gly Arg Val Phe
20
<210> 17
<211> 16
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Y2
<400> 17
Ile Phe Val Lys Asp Val Pro Asn Asn Gln Leu Arg His Ile Arg Leu
1 5 10 15
<210> 18
<211> 10
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Y3
<400> 18
Tyr Lys His Thr Thr Ser Ile Phe Asp Asp
1 5 10

Claims (103)

1.一种YTH N6-甲基腺苷RNA结合蛋白1(YTHDF1)减弱剂，其中所述减弱剂包括一种化合物，且在与YTHDF1结合时，所述化合物与选自SEQ ID NO:1的氨基酸残基372-392、479-494和526-535的残基对应的至少一个残基结合。
2.根据权利要求1所述的YTHDF1减弱剂，其中，在与YTHDF1结合时，所述化合物与下列残基对应的至少一个残基结合：SEQ ID NO:1的N378、F382、W384、F480和H528。
3.根据权利要求1至2中任一项所述的YTHDF1减弱剂，其中所述化合物能够阻断YTHDF1与m6A的结合。
4.根据权利要求1至3中任一项所述的YTHDF1减弱剂，其中所述化合物基本上不与m6A竞争结合YTHDF1。
5.根据权利要求1至4中任一项所述的YTHDF1减弱剂，其中所述化合物包括式I的化合物、式I化合物的前药、代谢物、衍生物，或上述任一者的药学上可接受的盐、酯或酰胺：
Figure FDA0004016647140000011
其中R1选自C1-50烃基、C1-50经取代烃基、C1-50杂烃基和C1-50经取代杂烃基。
6.根据权利要求5所述的YTHDF1减弱剂，其中R1为(CO)-R2，且R2为任选经取代的烯基。
7.根据权利要求6所述的YTHDF1减弱剂，其中R2为CH＝CH-R3，且R3为任选经取代的芳基。
8.根据权利要求7所述的YTHDF1减弱剂，其中R3为式II：
Figure FDA0004016647140000012
其中A为任选经取代的呋喃或
Figure FDA0004016647140000013
且
R6为羟基，且R5为任选经取代的烯基。
9.根据权利要求8所述的YTHDF1减弱剂，其中A为
Figure FDA0004016647140000021
且R4为
Figure FDA0004016647140000022
10.根据权利要求8所述的YTHDF1减弱剂，其中A为
Figure FDA0004016647140000023
R6为羟基，R5为CH＝CH-R7，且R7为
Figure FDA0004016647140000024
11.根据权利要求1至10中任一项所述的YTHDF1减弱剂，其中所述化合物包含至少两个二羟基苯基部分。
12.根据权利要求1至11中任一项所述的YTHDF1减弱剂，其中所述化合物包含至少三个二羟基苯基部分。
13.根据权利要求1至12中任一项所述的YTHDF1减弱剂，其中所述化合物包括式III的化合物、式III化合物的前药、代谢物、衍生物，或上述任一者的药学上可接受的盐、酯或酰胺：
Figure FDA0004016647140000025
其中A为任选经取代的呋喃或
Figure FDA0004016647140000026
且
R6为羟基，且R5为任选经取代的烯基。
14.根据权利要求13所述的YTHDF1减弱剂，其中A为
Figure FDA0004016647140000027
且R4为
Figure FDA0004016647140000028
15.根据权利要求13所述的YTHDF1减弱剂，其中A为
Figure FDA0004016647140000029
R6为羟基，R5为CH＝CH-R7，且R7为
Figure FDA0004016647140000032
16.根据权利要求1至15中任一项所述的YTHDF1减弱剂，其中所述化合物包含下列化合物中的任一种、下列任一种化合物的前药、代谢物、衍生物，或前述任一者的药学上可接受的盐、酯或酰胺：
Figure FDA0004016647140000031
17.根据权利要求1至16中任一项所述的YTHDF1减弱剂，其中所述化合物是来源于植物的。
18.根据权利要求1至17中任一项所述的YTHDF1减弱剂，其中所述化合物是在植物提取物中提供的。
19.根据权利要求17至18中任一项所述的YTHDF1减弱剂，其中所述植物是鼠尾草属植物。
20.根据权利要求17至19中任一项所述的YTHDF1减弱剂，其中所述植物是丹参。
21.一种经修饰的抗原呈递细胞(mAPC)，其中所述mAPC已用权利要求1至20中任一项所述的YTHDF1减弱剂处理。
22.根据权利要求21所述的mAPC，所述mAPC是经修饰的树突状细胞(mDC)。
23.一种组合物，其包含权利要求1至20中任一项所述的YTHDF1减弱剂，和/或权利要求21至22中任一项所述的mAPC，以及任选地药学上可接受的载剂。
24.根据权利要求23所述的组合物，所述组合物是疫苗组合物。
25.根据权利要求23至24中任一项所述的组合物，其进一步包含第二活性成分，其中所述第二活性成分是抗癌剂。
26.根据权利要求25所述的组合物，其中所述第二活性成分包含癌症免疫疗法。
27.根据权利要求25至26中任一项所述的组合物，其中所述第二活性成分包含免疫检查点抑制剂。
28.根据权利要求25至27中任一项所述的组合物，其中所述第二活性成分包括选自以下的药剂：抗PD-L1抗体或其抗原结合部分、抗PD-1抗体或其抗原结合部分、抗CTLA-4抗体或其抗原结合部分以及IDO抑制剂。
29.根据权利要求25至28中任一项所述的组合物，其中所述第二活性成分包括帕博利珠单抗、纳武利尤单抗、西米普利单抗、阿替利珠单抗、阿维鲁单抗、度伐利尤单抗、伊匹单抗和/或上述任一者的抗原结合片段或衍生物。
30.根据权利要求25至29中任一项所述的组合物，其中所述第二活性成分能够在接受它的受试者中引起一种或多种肿瘤抗原的增加。
31.根据权利要求30所述的组合物，其中所述肿瘤抗原选自CEA、gp100、MAGE家族蛋白、DAGE、GAGE、RAGE、NY-ESO 1、Melan-A/MART 1、TRP-1、TRP-2、酪氨酸酶、HER-2/neu、MUC-1、p53、KSA、PSA、PSMA及其片段和修饰形式。
32.根据权利要求25至31中任一项所述的组合物，其中所述第二活性成分包含在单独的容器中，并且未与所述mAPC或所述YTHDF1减弱剂混合。
33.一种减弱YTHDF1活性的方法，包括施用有效量的权利要求1至20中任一项所述的YTHDF1减弱剂。
34.根据权利要求33所述的方法，其中所述方法是体内方法、体外方法和/或离体方法。
35.一种确定候选药剂是否为YTHDF1减弱剂的方法，包括：
使所述候选药剂与YTHDF1突变体接触，其中所述YTHDF1突变体在一个或多个残基处包括一个或多个氨基酸取代、缺失和/或添加，所述残基对应于选自SEQ ID NO:1的残基372-392、479-494和526-535的残基。
36.根据权利要求35所述的方法，其中所述YTHDF1突变体在一个或多个残基处包括一个或多个氨基酸取代、缺失和/或添加，所述残基对应于选自SEQ ID NO:1的残基N378、F382、W384、F480和H528的残基。
37.根据权利要求35至36中任一项所述的方法，其中所述方法进一步包括确定所述候选药剂是否与所述YTHDF1突变体特异性结合。
38.一种试剂盒，其包含权利要求35至36中任一项所述的YTHDF1突变体。
39.化合物在制备YTHDF1减弱剂中的用途，其中，在与YTHDF1结合时，所述化合物与至少一个残基结合，所述残基对应于选自SEQ ID NO:1的氨基酸残基372-392、479-494和526-535的残基。
40.根据权利要求39所述的用途，其中，在与YTHDF1结合时，所述化合物与以下残基对应的至少一个残基结合：SEQ ID NO:1的N378、F382、W384、F480和H528。
41.根据权利要求39至40中任一项所述的用途，其中所述化合物能够阻断YTHDF1与m6A的结合。
42.根据权利要求39至41中任一项所述的用途，其中所述化合物基本上不与m6A竞争结合YTHDF1。
43.根据权利要求39至42中任一项所述的用途，其中所述化合物包含式I的化合物、式I化合物的前药、代谢物、衍生物或上述任一者的药学上可接受的盐、酯或酰胺：
Figure FDA0004016647140000051
其中R1选自C1-50烃基、C1-50经取代烃基、C1-50杂烃基和C1-50经取代杂烃基。
44.根据权利要求43所述的用途，其中R1为(CO)-R2，且R2为任选经取代的烯基。
45.根据权利要求44所述的用途，其中R2为CH＝CH-R3，且R3为任选经取代的芳基。
46.根据权利要求45所述的用途，其中R3具有式II：
Figure FDA0004016647140000052
其中A为任选经取代的呋喃或
Figure FDA0004016647140000053
且
R6为羟基，且R5为任选经取代的烯基。
47.根据权利要求46所述的用途，其中A为
Figure FDA0004016647140000054
且R4为
Figure FDA0004016647140000055
48.根据权利要求46所述的用途，其中A为
Figure FDA0004016647140000056
R6为羟基，R5为CH＝CH-R7，且R7为
Figure FDA0004016647140000057
49.根据权利要求39至48中任一项所述的用途，其中所述化合物包含至少两个二羟基苯基部分。
50.根据权利要求39至49中任一项所述的用途，其中所述化合物包含至少三个二羟基苯基部分。
51.根据权利要求39至50中任一项所述的用途，其中所述化合物包含式III的化合物、式III化合物的前药、代谢物、衍生物或上述任一者的药学上可接受的盐、酯或酰胺：
Figure FDA0004016647140000061
其中A为任选经取代的呋喃或
Figure FDA0004016647140000063
且
R6为羟基，且R5为任选经取代的烯基。
52.根据权利要求51所述的用途，其中A为
Figure FDA0004016647140000064
且R4为
Figure FDA0004016647140000065
53.根据权利要求51所述的用途，其中A为
Figure FDA0004016647140000066
R6为羟基，R5为CH＝CH-R7，且R7为
Figure FDA0004016647140000067
54.根据权利要求39至53中任一项所述的用途，其中所述化合物包含下列化合物中的任一种、下列任一种化合物的前药、代谢物、衍生物，或上述任一者的药学上可接受的盐、酯或酰胺：
Figure FDA0004016647140000062
55.根据权利要求39至54中任一项所述的用途，其中所述化合物是来源于植物的。
56.根据权利要求39至55中任一项所述的用途，其中所述化合物是在植物提取物中提供的。
57.根据权利要求55至56中任一项所述的用途，其中所述植物是鼠尾草属植物。
58.根据权利要求55至57中任一项所述的用途，其中所述植物是丹参。
59.一种激活APC的方法，所述方法包括向所述APC施用权利要求1至20中任一项所述的YTHDF1减弱剂。
60.一种激活DC的方法，所述方法包括向所述DC施用权利要求1至20中任一项所述的YTHDF1减弱剂。
61.一种治疗有需要的受试者中与抗原表达相关的疾病、病症或病况的方法，包括向所述受试者施用：
权利要求1至20中任一项所述的YTHDF1减弱剂；
权利要求21至22中任一项所述的mAPC；和/或
权利要求23至32中任一项所述的组合物。
62.根据权利要求61所述的方法，其中所述抗原是肿瘤抗原。
63.根据权利要求62所述的方法，其中所述抗原是选自以下的肿瘤抗原：CEA、gp100、MAGE家族蛋白、DAGE、GAGE、RAGE、NY-ESO 1、Melan-A/MART 1、TRP-1、TRP-2、酪氨酸酶、HER-2/neu、MUC-1、p53、KSA、PSA、PSMA及其片段和修饰形式。
64.根据权利要求61至63中任一项所述的方法，其中所述疾病、病症或病况是癌症。
65.根据权利要求64所述的方法，其中所述癌症选自血液肿瘤、淋巴瘤和实体肿瘤。
66.根据权利要求64所述的方法，其中所述癌症选自黑素瘤、乳腺癌、肺癌、卵巢癌、脑癌、肝癌、宫颈癌、结肠癌、结直肠癌、肾癌、皮肤癌、头颈癌、骨癌、食管癌、膀胱癌、子宫癌、淋巴癌、胃癌、胰腺癌、睾丸癌、淋巴瘤和白血病。
67.一种在有需要的受试者中治疗癌症的方法，包括向所述受试者施用：
权利要求1至20中任一项所述的YTHDF1减弱剂；
权利要求21至22中任一项所述的mAPC；和/或
权利要求23至32中任一项所述的组合物。
68.根据权利要求67所述的方法，其中所述癌症选自血液肿瘤、淋巴瘤和实体肿瘤。
69.根据权利要求67所述的方法，其中所述癌症选自黑素瘤、乳腺癌、肺癌、卵巢癌、脑癌、肝癌、宫颈癌、结肠癌、结直肠癌、肾癌、皮肤癌、头颈癌、骨癌、食管癌、膀胱癌、子宫癌、淋巴癌、胃癌、胰腺癌、睾丸癌、淋巴瘤和白血病。
70.一种在有需要的受试者中刺激T细胞介导的对癌细胞和/或肿瘤抗原的免疫应答的方法，包括向所述受试者施用：
权利要求1至20中任一项所述的YTHDF1减弱剂；
权利要求21至22中任一项所述的mAPC；和/或
权利要求23至32中任一项所述的组合物。
71.根据权利要求70所述的方法，其中所述肿瘤抗原选自CEA、gp100、MAGE家族蛋白、DAGE、GAGE、RAGE、NY-ESO 1、Melan-A/MART 1、TRP-1、TRP-2、酪氨酸酶、HER-2/neu、MUC-1、p53、KSA、PSA、PSMA及其片段和修饰形式。
72.一种在有需要的受试者中提供抗肿瘤免疫的方法，包括向所述受试者施用：
权利要求1至20中任一项所述的YTHDF1减弱剂；
权利要求21至22中任一项所述的mAPC；和/或
权利要求23至32中任一项所述的组合物。
73.一种在有需要的受试者中预防和/或逆转T细胞耗竭的方法，包括向所述受试者施用：
权利要求1至20中任一项所述的YTHDF1减弱剂；
权利要求21至22中任一项所述的mAPC；和/或
权利要求23至32中任一项所述的组合物。
74.一种在有需要的受试者中增强T细胞活性的方法，包括向所述受试者施用：
权利要求1至20中任一项所述的YTHDF1减弱剂；
权利要求21至22中任一项所述的mAPC；和/或
权利要求23至32中任一项所述的组合物。
75.根据权利要求73至74中任一项所述的方法，其中所述T细胞包括肿瘤浸润性T细胞。
76.根据权利要求73至75中任一项所述的方法，其中所述T细胞包括肿瘤特异性T细胞。
77.根据权利要求61至76中任一项所述的方法，其中所述受试者是癌症患者。
78.根据权利要求77所述的方法，其中所述癌症选自血液肿瘤、淋巴瘤和实体肿瘤。
79.根据权利要求77所述的方法，其中所述癌症选自黑素瘤、乳腺癌、肺癌、卵巢癌、脑癌、肝癌、宫颈癌、结肠癌、结直肠癌、肾癌、皮肤癌、头颈癌、骨癌、食管癌、膀胱癌、子宫癌、淋巴癌、胃癌、胰腺癌、睾丸癌、淋巴瘤和白血病。
80.根据权利要求61至79中任一项所述的方法，其中所述受试者已接受，正在接受和/或将接受抗癌治疗。
81.根据权利要求80所述的方法，其中所述抗癌治疗包括癌症免疫疗法。
82.根据权利要求80至81中任一项所述的方法，其中所述抗癌治疗包括免疫检查点抑制剂。
83.根据权利要求80至82中任一项所述的方法，其中所述抗癌治疗包括选自以下的药剂：抗PD-L1抗体或其抗原结合部分、抗PD-1抗体或其抗原结合部分、抗CTLA-4抗体或其抗原结合部分以及IDO抑制剂。
84.根据权利要求80至83中任一项所述的方法，其中所述抗癌治疗包括帕博利珠单抗、纳武利尤单抗、西米普利单抗、阿替利珠单抗、阿维鲁单抗、度伐利尤单抗、伊匹单抗和/或上述任一者的抗原结合片段或衍生物。
85.根据权利要求80至84中任一项所述的方法，其中所述抗癌治疗能够在所述受试者中引起一种或多种肿瘤抗原的增加。
86.根据权利要求85所述的方法，其中所述肿瘤抗原选自CEA、gp100、MAGE家族蛋白、DAGE、GAGE、RAGE、NY-ESO 1、Melan-A/MART 1、TRP-1、TRP-2、酪氨酸酶、HER-2/neu、MUC-1、p53、KSA、PSA、PSMA及其片段和修饰形式。
87.根据权利要求61至86中任一项所述的方法，其中所述方法进一步包括：
向所述受试者施用一种或多种额外的抗癌治疗。
88.根据权利要求87所述的方法，其中所述额外的抗癌治疗包括癌症免疫疗法。
89.根据权利要求87至88中任一项所述的方法，其中所述额外的抗癌治疗包括免疫检查点抑制剂。
90.根据权利要求87至89中任一项所述的方法，其中所述额外的抗癌治疗包括选自以下的药剂：抗PD-L1抗体或其抗原结合部分、抗PD-1抗体或其抗原结合部分、抗CTLA-4抗体或其抗原结合部分以及IDO抑制剂。
91.根据权利要求87至90中任一项所述的方法，其中所述额外的抗癌治疗包括帕博利珠单抗、纳武利尤单抗、西米普利单抗、阿替利珠单抗、阿维鲁单抗、度伐利尤单抗、伊匹单抗和/或上述任一者的抗原结合片段或衍生物。
92.根据权利要求87至91中任一项所述的方法，其中所述额外的抗癌治疗能够在所述受试者中引起一种或多种肿瘤抗原的增加。
93.根据权利要求92所述的方法，其中所述肿瘤抗原选自CEA、gp100、MAGE家族蛋白、DAGE、GAGE、RAGE、NY-ESO 1、Melan-A/MART 1、TRP-1、TRP-2、酪氨酸酶、HER-2/neu、MUC-1、p53、KSA、PSA、PSMA及其片段和修饰形式。
94.权利要求1至20中任一项所述的YTHDF1减弱剂、权利要求21至22中任一项所述的mAPC和/或权利要求23至32中任一项所述的组合物在制备用于以下一种或多种目的的组合物和/或药物中的用途：
1)激活APC；
2)激活DC；
3)产生具有增强的抗肿瘤活性的免疫细胞；
4)预防和/或逆转免疫细胞(诸如免疫效应细胞，例如T细胞)的耗竭；
5)在有需要的受试者中治疗与抗原表达相关的疾病、病症或病况；
6)在有需要的受试者中治疗癌症；
7)在有需要的受试者中刺激免疫细胞(例如免疫效应细胞，诸如T细胞)介导的对癌细胞和/或肿瘤抗原的免疫应答；
8)在有需要的受试者中提供抗肿瘤免疫；
9)增加和/或改善免疫细胞(例如，免疫效应细胞，诸如T细胞，例如肿瘤浸润性T细胞)的增殖和/或活性；
10)增加和/或改善肿瘤特异性免疫细胞(例如免疫效应细胞，诸如T细胞)的增殖和/或活性；
11)增强T细胞的细胞因子产生；
12)增强肿瘤免疫疗法的抗肿瘤反应；以及
13)抑制肿瘤生长，抑制肿瘤细胞的增殖，和/或杀死肿瘤细胞。
95.根据权利要求94所述的用途，其中所述癌症或肿瘤选自血液肿瘤、淋巴瘤和实体肿瘤。
96.根据权利要求94至95中任一项所述的用途，其中所述癌症或肿瘤选自黑素瘤、乳腺癌、肺癌、卵巢癌、脑癌、肝癌、宫颈癌、结肠癌、结直肠癌、肾癌、皮肤癌、头颈癌、骨癌、食管癌、膀胱癌、子宫癌、淋巴癌、胃癌、胰腺癌、睾丸癌、淋巴瘤和白血病。
97.权利要求1至20中任一项所述的YTHDF1减弱剂、权利要求21至22中任一项所述的mAPC和/或权利要求23至32中任一项所述的组合物结合额外的活性成分在制备用于以下一种或多种目的的药物中的用途：
1)激活APC；
2)激活DC；
3)产生具有增强的抗肿瘤活性的免疫细胞；
4)预防和/或逆转免疫细胞(诸如免疫效应细胞，例如T细胞)的耗竭；
5)在有需要的受试者中治疗与抗原表达相关的疾病、病症或病况；
6)在有需要的受试者中治疗癌症；
7)在有需要的受试者中刺激免疫细胞(例如免疫效应细胞，诸如T细胞)介导的对癌细胞和/或肿瘤抗原的免疫应答；
8)在有需要的受试者中提供抗肿瘤免疫；
9)增加和/或改善免疫细胞(例如，免疫效应细胞，诸如T细胞，例如肿瘤浸润性T细胞)的增殖和/或活性；
10)增加和/或改善肿瘤特异性免疫细胞(例如免疫效应细胞，诸如T细胞)的增殖和/或活性；
11)增强T细胞的细胞因子产生；
12)增强肿瘤免疫疗法的抗肿瘤反应；以及
13)抑制肿瘤生长、抑制肿瘤细胞的增殖和/或杀死肿瘤细胞。
98.根据权利要求97所述的用途，其中所述额外的活性成分包括癌症免疫疗法。
99.根据权利要求97至98中任一项所述的用途，其中所述额外的活性成分包括免疫检查点抑制剂。
100.根据权利要求97至99中任一项所述的用途，其中所述额外的活性成分包括选自以下的药剂：抗PD-L1抗体或其抗原结合部分，抗PD-1抗体或其抗原结合部分，抗CTLA-4抗体或其抗原结合部分，以及IDO抑制剂。
101.根据权利要求97至100中任一项所述的用途，其中所述额外的活性成分包含帕博利珠单抗、纳武利尤单抗、西米普利单抗、阿替利珠单抗、阿维鲁单抗、度伐利尤单抗、伊匹单抗和/或上述任一者的抗原结合片段或衍生物。
102.根据权利要求97至101中任一项所述的用途，其中所述额外的活性成分能够在接受它的受试者中引起一种或多种肿瘤抗原的增加。
103.根据权利要求102所述的用途，其中所述肿瘤抗原选自CEA、gp100、MAGE家族蛋白、DAGE、GAGE、RAGE、NY-ESO 1、Melan-A/MART 1、TRP-1、TRP-2、酪氨酸酶、HER-2/neu、MUC-1、p53、KSA、PSA、PSMA及其片段和修饰形式。
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