CN110101693A - 丹酚酸c在制备保护缺血脑组织损伤药物中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供了丹酚酸C的新用途，具体地说，丹酚酸C可制备保护缺血脑组织损伤药物，具有良好的抗脑缺血缺氧损伤作用，且效果明显，具有开发利用价值。

Description

丹酚酸C在制备保护缺血脑组织损伤药物中的应用

技术领域

本发明涉及丹酚酸C的新用途，具体涉及丹酚酸C在制备保护缺血脑组织损伤药物中的应用。

背景技术

缺血缺氧性脑病的病因主要为各种原因导致的脑组织缺血缺氧。脑在缺氧情况下，糖酵解作用增加3-10倍，大量丙酮酸被还原成乳酸，细胞内酸中毒发展快且严重。糖酵解时仅产生少量ATP，由于能量来源不足，脑细胞不能维持细胞膜内外的离子浓度差，K⁺、Mg^{2 +}、HPO₄ ⁺自细胞内逸出，Na⁺及Ca²⁺进入细胞内，脑细胞的氧化代谢功能受到损害。缺氧时脑血管的自动调节功能降低，脑血流灌注易受全身血压下降影响而减少；血管周围的星形细胞肿胀和血管内皮细胞水泡样变性，使管腔变窄甚至闭塞。当脑血流恢复后血液仍不能流到这些缺血区，造成区域性缺血或梗塞，以后发展致脑实质不可逆性损害。缺氧时血管通透性增加，某些代谢产物在组织内积聚，以及抗利尿激素分泌增加等因素，形成脑水肿，使颅内压增高，脑血流进一步减少，引起严重的脑细胞代谢障碍，以后形成脑萎缩。

丹酚酸C来源是唇形科植物丹参(Salvia miltiorrhiza Bunge)的干燥根纯度：98％以上，检测方法HPLC。

中文名：丹酚酸C

别名：丹参酚酸C

英文名：Salvianolic acid C

分子式：C₂₆H₂₀O₁₀

分子量：492.44CAS：115841-09-3

理化性质：无定形黄色化合物,[α]14/D+70°(c＝0.12,乙醇)。

UV：

λmax(EtOH)nm(lgε):202(4.79),215(sh,4.52),288(4.40),

312(4.32),340(4.31)。FDMSm/z:493(M++1)。1HNMR。

丹参(SalviamiltiorrhizaBge.)为唇形科鼠尾草属植物，其根供药用，具有活血祛瘀、镇静安神、消肿止痛等良好功效，在心脑血管疾病如冠心病、高脂血症、脑血管疾病等的治疗中发挥着重要作用。丹参的化学成分主要可分为脂溶性成分和水溶性成分两大部分。丹参的传统应用方式为水煎液，因此，水溶性成分应是其重要的药效成分。最初分离出的水溶性成分为丹参素(β-3，4-二羟苯乳酸)，是各种丹酚酸的基本化学结构，如丹酚酸A是由一分子丹参素与两分子咖啡酸缩合而成，而丹酚酸B为三分子丹参素与一分子咖啡酸缩合而成。其它酚酸类化合物还包括丹酚酸C、丹酚酸D、丹酚酸E、丹酚酸F、丹酚酸G、丹酚酸H、丹酚酸I、迷迭香酸、紫草酸等。药理实验研究表明，丹酚酸C具有明显的抗炎和抗血小板聚集作用。而丹酚酸C在抗脑缺血缺氧损伤的药效作用方面的研究未见报道，无法得到丹酚酸C在用于制备保护缺血脑组织损伤药物的应用。因此，对其进行深入研究具有深远意义。

发明内容

本发明提供了一种丹酚酸C在制备保护缺血脑组织损伤药物中的应用，有利于对丹酚酸C的深入研究，具有开发价值。

本发明的技术方案：丹酚酸C在制备保护缺血脑组织损伤药物中的应用。

前述丹酚酸C在制备保护缺血脑组织损伤药物中的应用中，所述丹酚酸C的分子式为：C₂₆H₂₀O₁₀，分子量为：492.44，结构为：

一种保护缺血脑组织损伤药物，所述药物原料中包含有丹酚酸C。

一种保护缺血脑组织损伤药物，其特征在于：所述药物主要由丹酚酸C制备而成。

前述的应用中，还包括丹酚酸C制备保护血脑屏障药物的应用。

前述的应用中，还包括丹酚酸C制备减少缺血脑组织梗死范围药物的应用。

前述的应用中，还包括丹酚酸C制备减轻缺血脑组织水肿药物的应用。

申请人对丹酚酸C抗脑缺血缺氧损伤作用进行了实验研究，并通过以下实施来进一步阐述本发明。

实验例：

1.1材料与方法

1.1.1试剂与材料

SH-SY5Y细胞：人神经母细胞瘤细胞，购自中国科学院典型培养物保藏委员会细胞库。

C57BL/6小鼠：清洁级，雄性，22-25g，购自北京维通利华实验动物有限责任公司。

丹酚酸C标准品(纯度≥98％，批号17031402)，购自于成都曼思特生物科技有限公司；

胎牛血清(FBS)：Gibco，货号10099141；

DMEM高糖培养基：Gibco，货号11995073；

DMEM无糖培养基：Gibco，货号11966025；

PBS：Gibco，货号10010-049；

台盼蓝：Gibco，货号15250061；

消化液(0.25％Trypsin+EDTA)：Gibco，货号25200072；

100×双抗(Penicillin Streptomycin)：Gibco，货号15140122，临用时用完全培养基稀释成1×；

二甲亚砜(DMSO)：国药集团，货号30072418；

噻唑蓝(MTT)：Sigma，货号M2128；

无水碳酸钠(Na2CO3)：国药集团，货号10019260；

碳酸氢钠(NaHCO3)：国药集团，货号10018960；

生理盐水：辰欣药业股份有限公司，规格500mL，批号1606210726；

戊巴比妥钠：纯度≥95.0％，批号F20030816；

TTC(2,3,5-Triphenyltetrazolium chloride)：Sigma，纯度≥95％，批号BCBL1305V；

4％多聚甲醛：Solarbio，货号P1110；

硅胶包被的栓线：L1800型，广州佳灵。

1.1.2实验仪器

分析天平：XS105型，Mettler-Toledo，瑞士；

电子天平：AL104型，Mettler-Toledo，瑞士；

离心机：Eppendorf AG 22331Hamburg，德国；

Milli-Q超纯水系统(Milli-Q Synthesis)：Milipore，美国；

pH计：S40型，Mettler-Toledo，瑞士；

CO₂细胞培养箱：3131及3111型，Thermo Scienfitic，美国；

超净工作台：1300系列Ⅱ级A2型生物安全柜，Thermo Scienfitic，美国；

倒置相差荧光显微镜：Olympus IX53或CKX41，Olympus，日本；

Tecan Infinite F200型多功能酶标仪，Tecan，奥地利；

缺氧小室：MIC-101型，Billups Rothenberg，美国。

1.1.3细胞培养

将SH-SY5Y细胞复苏之后培养于DMEM完全培养液(含89％高糖DMEM、10％FBS、1％双抗)中，并置于5％CO₂的细胞培养箱(温度为37℃，湿度适宜)中培养。当细胞贴壁生长至80％-90％时，弃去原培养基，用1mL PBS清洗两次，加入0.25％含EDTA的胰酶消化液1mL消化细胞90sec，然后立即用三倍体积的完全培养液终止消化。900rpm离心4min后，收集细胞，加入适量完全培养液重悬，台盼蓝计数，按1:6的比例传代分瓶培养。

1.1.4丹酚酸C对SH-SY5Y神经细胞存活率的影响

取对数生长期的SH-SY5Y细胞，消化计数后接种于96孔板上，种板密度为1×10⁴/孔。让细胞在DMEM完全培养液中贴壁生长24h后，弃去原培养基，进行给药操作。由于后期OGD/R实验所用的为无糖DMEM培养液，所以用无糖DMEM来稀释药物。给药组以100μL/孔加入梯度稀释的丹酚酸C供试液，即将丹酚酸C标准品溶于DMSO中配制成200mmol/L的母液，采用无糖DMEM培养液稀释至终浓度为100、50、25和12.5μmol/L进行给药，对照组以100μL/孔加入无糖DMEM，将细胞置于37℃、5％CO₂的细胞培养箱中孵育14h后弃去药液，每孔加入100μL终浓度为0.5mg/mL的MTT溶液，于培养箱中避光孵育4h，然后吸净上清液，每孔加入100μLDMSO，于振荡器上37℃振荡混匀10min。采用Tecan Infinite F200型多功能酶标仪在580nm波长条件下测定各组吸光度(Absorbance，A)，计算不同浓度给药组的细胞存活率，具体公式为：细胞存活率(％)＝(A_给药组/A_对照组)×100％。平行三次实验，汇总作图(以3次实验的平均值和标准误作图)。

1.1.5丹酚酸C抗SH-SY5Y神经细胞氧糖剥夺/复氧损伤作用研究

取对数生长期的SH-SY5Y细胞，消化计数后接种于96孔板中，种板密度为1×10⁴/孔。让细胞在DMEM完全培养液中贴壁生长24h后，弃去原培养基，给药组以100μL/孔加入梯度稀释的丹酚酸C供试液，具体操作方法同1.1.4，模型组(即氧糖剥夺/复氧损伤，Oxygen-glucose Deprivation/Reoxygenation，OGD/R组)以100μL/孔加入无糖DMEM。然后将细胞置于缺氧小室中，用氮气(N₂)替换缺氧小室中的空气，具体操作为：持续通入N₂5min后，夹紧缺氧小室排气管。每隔10sec松开排气管一次，如此反复5min，最后一次充气10sec后立即夹紧进气管与排气管。将缺氧小室置于37℃、1％O₂的缺氧培养箱中孵育12h后，从小室中取出细胞培养板放置于正常培养箱(37℃、5％CO₂)中复氧2h，建立OGD/R模型。另设正常对照组(Control)，以100μL/孔加入DMEM高糖完全培养基，始终放置于正常培养箱中同步孵育。然后采用MTT法测定各组的吸光度值，具体操作方法同2.2.4。计算不同浓度给药组的给药保护率，具体公式为：给药保护率(％)＝(A_给药组-A_模型组)/(A_{正常对照组}-A_模型组)×100％。平行三次实验，汇总作图。

1.1.6丹酚酸C抗小鼠脑缺血再灌注损伤作用研究

体重22-25g的雄性C57BL/6小鼠适应环境3天后，根据体重将其随机分为3组，每组3只。

采用栓线法阻断小鼠右侧大脑中动脉血管，建立小鼠大脑中动脉栓塞(middlecerebral artery occlusion，MCAO)模型。小鼠术前正常饮食，正常饮水。手术当天，小鼠腹腔注射1％戊巴比妥钠麻醉。仰卧位固定，颈部正中切口，分离右侧肌肉与腺体，暴露右侧颈总动脉(Common Cartied Artery，CCA)、颈外动脉(External Cartied Artery，ECA)与颈内动脉(Internal Cartied Artery，ICA)，三者交叉处形成“Y”字形叉口。在CCA近心端结扎，远心端用手术缝合线打个松结，从CCA开一小口，插入硅胶栓线，沿ICA方向进线约10mm左右感受到轻微阻力，系紧远心端手术线以固定栓线。从插入栓线开始计时，1.5h后，轻轻抽出栓线，实现再灌，立即腹腔注射40mg/kg的丹酚酸C溶液或生理盐水，每日注射1次，连续注射两天。假手术组(Sham组)进行MCAO手术但不插栓线，手术后腹腔注射生理盐水。

手术过程中以及小鼠清醒前，均需使用加热垫或保温箱使小鼠肛温保持在37℃，伤口用碘伏消毒。小鼠清醒后进行神经功能评分，随后置于有清洁垫料的饲养箱中，自由饮食、饮水。

小鼠醒后以及取材前，对模型进行神经功能评价，选取其中评分为1-3分的小鼠入组。

0分：无明显的神经功能缺损症状。

1分：轻微神经功能缺损；不能完全伸展对侧前爪，小鼠被提尾悬空时由于缺血对侧前肢力弱，呈屈曲、抬高、肩部内收，肘关节伸直，同时身体也会转向缺血对侧。

2分：中度局灶性神经功能缺损；小鼠爬行时向缺血对侧转圈。

3分：重度局灶性神经功能缺损；缺血对侧肢体不能承受体重，小鼠站立时向缺血对侧倾倒。

4分：严重神经功能缺损；无自主活动、意识障碍或呈筒样滚动。

采用TTC染色法测定梗死面积。小鼠断颈椎处死，快速断头后小心的取出脑组织，在-20℃冰箱中冷冻20-30min。切除嗅球、小脑和低位脑干后，从前脑与视交叉中点连线处向后将脑组织作冠状切片，切为2mm左右的薄片，共5片。脑片置于0.25％的TTC中，37℃避光染色30min左右，每隔5min翻动一下脑片使染色均匀。染色完成后正常区为红色，缺血区为白色，缺血半暗带为粉白色。随后用4％多聚甲醛固定脑片24h，拍照，采用IPP6.0软件计算梗死面积。每只小鼠大脑相对梗死面积如下：

相对梗死面积＝SUM_梗死面积/SUM_{切片总面积}×100％

1.1.7统计学分析

数据均以均值±标准误(SEM)表示。采用GraphPadPrism 7对细胞活力进行作图和统计分析，使用IPP 6.0软件进行图像处理。组间差异采用单因素方差分析(one-wayANOVA)及Dunnett's后验分析或T检验，当P<0.05时，表示差异显著。

1.2结果与讨论

1.2.1丹酚酸C对SH-SY5Y神经细胞存活率的影响

采用MTT法检测丹酚酸C对SH-SY5Y细胞的无毒浓度范围，用于后续其药效作用评价。结果如图1所示：丹酚酸C浓度在12.5—100μmol/L时，细胞存活率均在90％以上，表明在该浓度范围内丹酚酸C对SH-SY5Y神经细胞无明显细胞毒作用，后续可以在该浓度范围内考察其对OGD/R损伤的SH-SY5Y细胞的保护作用。

1.2.2丹酚酸C抗SH-SY5Y神经细胞OGD/R损伤作用

本研究采用OGD/R模型，进一步考察丹酚酸C对OGD/R损伤的SH-SY5Y神经细胞的保护作用。结果如图2所示：与正常对照组(Control)相比，模型组(OGD/R)的细胞活力显著降低(图2)，表明缺氧缺糖12h，复氧2h能对神经细胞SH-SY5Y造成严重损伤。然而，与模型组(OGD/R)相比，丹酚酸C在100μmol/L的浓度下，能显著提高OGD/R损伤的SH-SY5Y细胞的活力，其保护率为65.73％(图3)，且该保护率高于阳性药人参皂苷Rd，表明丹酚酸C具有明显的抗神经细胞OGD/R损伤作用。

1.2.3丹酚酸C抗小鼠脑缺血再灌注损伤的作用

小鼠MCAO造模2天，每日腹腔注射丹酚酸C标准品溶液或生理盐水，2天后断颈椎处死，TTC染色结果及小鼠梗死率如图4和5所示，染色后白色部分为梗死区域，红色部位为正常区域，中间有一粉色过渡带为缺血半暗带。由图可知，与假手术(Sham)组相比，模型组具有较大的梗死范围，梗死面积为24.95％，证明小鼠MCAO模型造模成功；而与模型组相比，丹酚酸C给药组的梗死面积为8.91％，较模型组显著降低，表明丹酚酸C对MCAO小鼠的脑缺血缺氧损伤具有保护作用。

1.3总结

本研究采用神经细胞OGD/R损伤模型及小鼠MCAO模型，研究了丹酚酸C抗脑缺血缺氧损伤的药效作用。结果发现，丹酚酸C在体外具有明显的抗神经细胞OGD/R损伤作用；而在小鼠MCAO模型上，与模型组相比，丹酚酸C能显著地降低小鼠脑梗死面积，表明丹酚酸C具有良好的抗脑缺血缺氧损伤作用，可进一步开发用于制备保护缺血脑组织损伤的药物。

与现有技术相比，本发明提供了丹酚酸C在制备保护缺血脑组织损伤药物中的应用，有利于对丹酚酸C的深入研究，具有开发价值。

附图说明

图1是实验例中丹酚酸C对SH-SY5Y细胞存活率的影响，平行三次实验，汇总作图；

图2是实验例中MTT法检测丹酚酸C对OGD/R损伤的SH-SY5Y细胞保护作用的各组吸光度值，统计分析采用one-way ANOVA及Dunnett's后验分析，^##P<0.01模型组vs.正常对照组；^*P<0.05给药组vs.模型组，^**P<0.01给药组vs.模型组，平行三次实验，汇总作图。

图3是实验例中MTT法检测丹酚酸C对OGD/R损伤的SH-SY5Y细胞保护作用的给药保护率；根据图2结果计算；给药保护率(％)＝(A_给药组-A_模型组)/(A_{正常对照组}-A_模型组)×100％。

图4是实验例中丹酚酸C作用的小鼠大脑TTC染色图，A：Sham组；B：模型组；C：丹酚酸C组，(n＝3)；

图5是实验例中丹酚酸C对小鼠大脑梗死率的影响，n＝3，统计分析采用T检验，^*P<0.05丹酚酸C组(dfsC)vs.模型组(Model)。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明作进一步的说明，但并不作为对本发明限制的依据。

实施例1。

取丹酚酸C5g、甘露醇10g、硫代硫酸钠0.15g加入到800ml注射用水，用0.5％氢氧化钠调pH至4-6；用0.1％注射用活性炭搅拌均匀，60度保温30分钟，趁热过滤脱炭，滤液加注射用水至1000ml，除菌精滤，灌装于200支10ml西林瓶，半加塞，送入冻干机，-40度预冻2h，抽真空至10Pa-20Pa，在-25℃保温3h，-10℃保温16h，30℃干燥3h，压塞出箱，制得丹酚酸C粉针。

实施例2。

取丹酚酸C乙酯粉碎过80目筛，称取过筛后的丹酚酸C乙酯650g、喷雾干燥乳糖750g、交联聚维酮50g，亚硫酸氢钠30g混合均匀，再加入过60目筛的微粉硅胶30g混匀，最后加入硬脂酸镁15g混匀，7mm圆形浅凹冲压片。将胃溶型包衣预混剂溶于纯化水中，制成固含量为15％的包衣液，采用高效包衣机进行包衣，包衣增重3％，制得丹酚酸C乙酯包衣片。

实施例3。

取丹酚酸C钠盐、维生素C粉碎，过80目筛，称取粉碎过筛后的丹酚酸C钠盐650g、维生素C100g、微晶纤维素500g、预胶化淀粉350g，充分混合均匀，加入无水乙醇适量制成软材，20目筛制粒，40℃条件下干燥，干颗粒用20目筛整理，加入交联羧甲基纤维素钠85g、硬脂酸镁15g混合均匀得总混药粉，将总混药粉灌装于2#空心胶囊，粒重170mg，即得丹酚酸C钠盐胶囊。

实施例4。

取乙酰丹酚酸C、维生素C粉碎，过120目筛，称取350g聚乙二醇6000，水浴加热90℃，搅拌使其全部融化，称取粉碎过筛后的乙酰丹酚酸C120g、维生素C55g加入到聚乙二醇6000中，搅拌使其充分溶解；将药液置于滴丸机中，药液温度保持在80～90℃之间，将药液以30滴/分钟的速度滴入冷凝剂中(液体石蜡，3～10℃)，于出料口收集滴丸，用纱布擦掉表面的液体石蜡，室温自然晾干，即得乙酰丹酚酸C滴丸。

Claims (7)

1.丹酚酸C在制备保护缺血脑组织损伤药物中的应用。

2.根据权利要求1所述丹酚酸C在制备保护缺血脑组织损伤药物中的应用，其特征在于：所述丹酚酸C的分子式为：C₂₆H₂₀O₁₀，分子量为：492.44，结构为：

3.一种保护缺血脑组织损伤药物，其特征在于：所述药物原料中包含有丹酚酸C。

4.一种保护缺血脑组织损伤药物，其特征在于：所述药物主要由丹酚酸C制备而成。

5.根据权利要求1所述的应用，还包括丹酚酸C制备保护血脑屏障药物的应用。

6.根据权利要求1所述的应用，还包括丹酚酸C制备减少缺血脑组织梗死范围药物的应用。

7.根据权利要求1所述的应用，还包括丹酚酸C制备减轻缺血脑组织水肿药物的应用。