CN116217533A - 一种类黄酮醇化合物及其抑制病毒引起肺纤维化的应用 - Google Patents
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Abstract
一种类黄酮醇化合物及其抑制病毒引起肺纤维化的应用,涉及生物医药。一种类黄酮醇化合物以Smad3为作用靶点,通过与Smad3结合,阻断其被TGF‑β受体TβRI磷酸化,抑制Smad3入核激活下游纤维化相关基因,阻断成纤维细胞激活和胶原分泌,抑制细胞因子IL‑6、IL‑8和趋化因子CXCL10、CCL2的mRNA表达水平,缓解炎症因子风暴,用于治疗新冠病毒SARS‑CoV‑2编码的N蛋白及其不同变体引发的肺纤维化药物,为SARS‑CoV‑2引发的肺纤维化提供新的治疗靶点和干预手段。化合物RMY‑205用于其他与Smad3通路相关引起的多种器官细胞纤维化治疗药物及抑制新霉素诱导的小鼠肾脏纤维化药物。
Description
技术领域
本发明属于生物医药技术领域,尤其是涉及一种类黄酮醇化合物及其抑制病毒引起肺纤维化的应用。
背景技术
新冠病毒SARS-CoV-2基因组具有14个功能性开放式阅读框(ORFs),包含两个非编码区域和多个编码蛋白的区域(Gordon,D.E等Nature,2020,583,459–468),含有16种负责RNA合成的非结构蛋白(nsp1-nsp16),四种负责病毒组装的结构蛋白(突刺蛋白S、包膜蛋白E、膜蛋白M和核衣壳蛋白N)以及九种辅助蛋白(accessoryprotein)。核衣壳蛋白N是表达最为丰富的结构蛋白之一,与其他结构蛋白不同,核衣壳蛋白主要与病毒的RNA基因组结合,形成核酸蛋白复合体,以维持RNA的正确构象,确保其顺利复制和转录。核衣壳蛋白N十分稳定,结构保守,具有高免疫原性,被认为是临床良好的诊断标志物和治疗靶点(Bai,C等Sci.China Life Sci,2021)。
特发性肺纤维化是一种慢性、长期发展的肺间质疾病,严重影响人体呼吸功能,表现为干咳和进行性呼吸困难,严重影响患者的生活质量(Martinez,F.J等Nat Rev DisPrimers,2017,3,17074)。现有的纤维化治疗药物吡非尼酮和抗肿瘤药物尼达尼布,虽然能够减缓肺功能减退的速度,但并不能够阻止疾病的进程。所以,亟待开发新的抗纤维化治疗药物并提出新的防治策略。
肺纤维化是在愈伤过程中出现的过度纤维化反应,其特征是形成成纤维细胞病灶的独特病理损伤(Wynn,T.A等Nat Med,2012,18,1028–1040)。这种损伤主要是由于产生α平滑肌激动蛋白(α-SMA)的肌成纤维细胞,嵌入富含I型胶原的细胞外基质中,并被高度异常的上皮细胞所包围。肌成纤维细胞被认为是不同纤维化过程中产生细胞外基质的效应细胞(Liu,S等Immunity,2021,54,2042-2056)。而在愈伤结束后,肌成纤维细胞不能顺利进行细胞凋亡,由此在损伤部位细胞过度积累并持续反应,这一过程被认为是纤维化持续发展的主要诱因(Selvarajah,B等Science Signaling,2021,14,1027)。
本发明涉及一种含类黄酮醇化合物的基本母核为本申请人在中国专利ZL201710970315.2公开的通式II系列衍生物。而该专利号ZL201710970315.2的发明保护的应用是肿瘤包括肝癌、子宫癌等治疗应用,与本发明申请保护的范围完全不同。
发明内容
本发明的目的在于提供一种类黄酮醇化合物及其抑制病毒引起肺纤维化的应用,所述一种类黄酮醇化合物可作为制备治疗SARS-CoV-2编码的N蛋白及其不同变体包括Alpha、Beta、Gamma、Delta、Omicron引发的肺纤维化,或者其他与Smad3通路相关引起的多种器官细胞纤维化以及新霉素诱导的小鼠肾脏纤维化的候选药物中应用。
所述一种类黄酮醇化合物,其化合物结构如通式I所示:
其中,R1、R2定义如下:
R1选自氢、卤素、羟基;
R2选自氢、卤素、羟基、氰基、乙炔基、甲基、乙基、异丙基、叔丁基、甲氧基、三氟甲氧基等。
R1、R2及其相应的衍生物可在制备抑制新冠病毒等引起肺纤维化药物中应用。
本发明涉及合成技术方案如下:
在本发明的化合物中合适的卤素取代基包括F、Cl和Br。并且,所述卤素可任意被一个或多个以下基团取代。
优选的,所述一种类黄酮醇化合物的结构为:
所述类黄酮醇化合物可在制备治疗SARS-CoV-2编码的N蛋白引起的肺纤维化药物中的应用。
所述类黄酮醇化合物可用于制备治疗SARS-CoV-2编码的N蛋白或其不同变体包括Alpha、Beta、Gamma、Delta、Omicron引起的肺纤维化的药物。
所述类黄酮醇化合物可在制备治疗Smad3通路引起的多种器官细胞纤维化药物中的应用。所述器官细胞为人肺成纤维细胞、人心肌成纤维细胞、人皮肤成纤维细胞和/或人肝星状细胞。
所述类黄酮醇化合物可在制备治疗新霉素诱导的肾脏纤维化药物中的应用。
根据本发明,一种含类黄酮醇化合物可以抑制肺成纤维细胞向肌成纤维细胞转化。具体的,化合物RMY-205与Smad3结合,导致N蛋白诱导的TβRI不能磷酸化Smad3,从而抑制下游纤维化相关基因表达,阻断肺成纤维细胞向肌成纤维细胞转化,抑制肺纤维化的进程。
根据本发明,以TGF-β信号通路蛋白Smad3作为作用靶点,可用于筛选类黄酮醇化合物,以进一步开发用于治疗SARS-CoV-2编码的N蛋白及其不同变体包括Alpha、Beta、Gamma、Delta、Omicron引发的肺纤维化,或者其他与Smad3通路相关引起的多种器官成纤维细胞的纤维化以及新霉素诱导的小鼠肾脏纤维化的化合物。
本发明所述类黄酮醇化合物通过靶向Smad3,抑制其磷酸化,进而影响其下游通路的纤维化相关基因的表达,阻断成纤维细胞激活及胶原分泌;同时还抑制细胞因子IL-6、IL-8和趋化因子CXCL0、CCL2的mRNA表达水平,缓解炎症因子风暴,从而达到抑制肺纤维化的目的。本发明既可用于制备治疗新冠病毒SARS-CoV-2编码的N蛋白及其不同变体包括Alpha、Beta、Gamma、Delta、Omicron引发的肺纤维化的药物,又可用于制备治疗其他与Smad3通路相关引起的多种器官成纤维细胞纤维化以及新霉素诱导的小鼠肾脏纤维化药物,以达到抑制多种器官纤维化的目的。
附图说明
图1.N蛋白激活肺成纤维细胞。不同梯度的SARS-CoV-2编码的N蛋白在肺成纤维细胞中表达,36h后收取蛋白样品检测。结果显示梯度表达N蛋白后,肌成纤维细胞的标志蛋白α-SMA和I型胶原蛋白COL1A1的表达量也呈梯度性增强,表明N蛋白在细胞水平能够激活肺成纤维细胞。
图2.RMY-205及其衍生物WBR-2和WBR-7抑制N蛋白激活的肺成纤维细胞。SARS-CoV-2编码的N蛋白在肺成纤维细胞中表达,随后RMY-205及其衍生物WBR-2和WBR-7处理细胞36h,收取蛋白样品检测。结果显示RMY-205及其衍生物WBR-2和WBR-7可以明显抑制N蛋白诱导的肌成纤维细胞标志蛋白α-SMA与胶原蛋白COL1A1的表达,表明RMY-205及其衍生物WBR-2和WBR-7能够抑制N蛋白激活的肺成纤维细胞。
图3.RMY-205抑制N蛋白诱导的胶原蛋白分泌。SARS-CoV-2编码的N蛋白在肺成纤维细胞中表达,随后RMY-205处理细胞36h,使用天狼星红总胶原试剂盒检测分泌的胶原蛋白。结果显示RMY-205可以抑制N蛋白诱导的胶原蛋白分泌。
图4.RMY-205抑制细胞因子和趋化因子的mRNA表达水平。SARS-CoV-2编码的N蛋白在肺成纤维细胞中表达,随后RMY-205处理细胞36h,收取mRNA样品进行检测。结果显示N蛋白可以提高细胞因子IL-6、IL-8和趋化因子CXCL0、CCL2的mRNA表达水平,而RMY-205能够抑制这些因子的mRNA表达水平。
图5.等温滴定量热法验证RMY-205与Smad3的结合。通过等温滴定量热法证实RMY-205可以与TGF-β信号通路蛋白Smad3直接结合。
图6.RMY-205注射小鼠抑制肺纤维化。使用腺相关病毒AAV搭载SARS-CoV-2编码的N蛋白,以滴鼻的方式诱导小鼠肺部感染N蛋白,每三天注射一次RMY-205,40天后处死小鼠,收取肺组织蛋白和肺组织切片。结果显示N蛋白可以明显诱导小鼠肺部发生纤维化,而注射RMY-205的小鼠肺纤维化得到明显的缓解。
图7.RMY-205抑制不同SARS-CoV-2变体的N蛋白激活的肺成纤维细胞。不同SARS-CoV-2变体编码的N蛋白转染到肺成纤维细胞中表达,随后RMY-205处理细胞36h,收取蛋白样品检测。结果显示RMY-205可以抑制不同SARS-CoV-2变体包括Alpha、Beta、Gamma、Delta、Omicron编码的N蛋白诱导的α-SMA的表达,表明RMY-205能够抑制不同SARS-CoV-2变体的N蛋白激活的肺成纤维细胞。
图8.RMY-205能够抑制细胞因子和趋化因子的mRNA表达水平。不同SARS-CoV-2变体编码的N蛋白转染到肺成纤维细胞中表达,随后RMY-205处理细胞36h,收取样品进行基因表达检测。结果显示,不同的SARS-CoV-2变体包括Alpha、Beta、Gamma、Delta、Omicron编码的N蛋白能够提高细胞因子IL-6和趋化因子CXCL0、CCL2的mRNA表达水平,而RMY-205能够抑制这些因子的mRNA表达水平。
图9.RMY-205通过抑制细胞中Smad3的磷酸化水平抑制多种器官成纤维细胞的纤维化。TGF-β处理人肺成纤维细胞HFL-1、人心肌成纤维细胞AC-16、人肝星形细胞LX-2和人原代皮肤成纤维细胞,同时RMY-205处理细胞36h,收取蛋白样品检测。结果显示RMY-205可以抑制TGF-β处理导致的人肺成纤维细胞、人心肌成纤维细胞、人肝星形细胞和人原代皮肤成纤维细胞激活,表明RMY-205可能通过抑制细胞中Smad3的磷酸化水平抑制多种器官成纤维细胞的纤维化。
图10.RMY-205注射小鼠抑制新霉素诱导的肾脏纤维化。新霉素尾静脉注射诱导小鼠肾脏纤维化后,每天注射一次RMY-205,7天后处死小鼠,收取肾脏组织蛋白和肾脏组织切片。结果显示,新霉素明显诱导小鼠肾脏纤维化,而注射RMY-205的小鼠肾脏纤维化得到明显的缓解。
具体实施方式
申请人在研究新冠病毒SARS-CoV-2编码的N蛋白诱导肺成纤维细胞向肌成纤维细胞转化过程中发现,N蛋白通过促进TβRI磷酸化Smad3,诱导Smad3转运入核,从而激活下游的纤维化相关基因的表达,促进成纤维细胞激活、胶原分泌,同时还提高细胞因子IL-6、IL-8和趋化因子CXCL10和CCL2的mRNA表达水平,引起炎症因子风暴。申请人通过筛选发现一种含类黄酮醇化合物以Smad3为特异靶点,通过与Smad3结合,阻断N蛋白诱导的TβRI磷酸化Smad3,进而抑制Smad3入核调控其下游的纤维化相关基因的表达,阻断成纤维细胞激活及胶原分泌,同时还抑制细胞因子IL-6、IL-8和趋化因子CXCL0的mRNA表达水平,缓解炎症因子风暴,从而达到抑制肺纤维化的目的。同样,也发现该化合物可以抑制TGF-β诱导的Smad3通路相关引起的多种器官成纤维细胞的纤维化,包括人肺成纤维细胞、人心肌成纤维细胞、人原代皮肤成纤维细胞人和肝星形细胞,也可以抑制新霉素诱导的小鼠肾脏纤维化,提示该化合物用于治疗多种器官细胞纤维化的可能性。
该化合物通式I如下:
其中R1、R2及其相应的衍生物具有抑制新冠病毒等引起肺纤维化的应用。该化合物以Smad3为作用靶点,通过与Smad3结合,阻断其被TGF-β受体TβRI磷酸化,抑制Smad3入核激活下游纤维化相关基因,从而阻断成纤维细胞激活和胶原分泌,同时还抑制细胞因子IL-6、IL-8和趋化因子CXCL10、CCL2的mRNA表达水平,缓解炎症因子风暴,达到治疗新冠病毒SARS-CoV-2编码的N蛋白及其不同变体包括Alpha、Beta、Gamma、Delta、Omicron引发的肺纤维化目的,为SARS-CoV-2引发的肺纤维化提供新的治疗靶点和干预手段。本发明还证明了化合物RMY-205是Smad3的抑制剂,可用于其他与Smad3通路相关引起的多种器官成纤维细胞纤维化的治疗以及抑制新霉素诱导的小鼠肾脏纤维化。
本发明涉及合成技术方案如下:
在这些化合物中,基团可根据下列指导选择:
R1选自氢、卤素、羟基;
R2选自氢、卤素、羟基、氰基、乙炔基、甲基、乙基、异丙基、叔丁基、甲氧基、三氟甲氧基等
在本发明的化合物中合适的卤素取代基包括F、Cl和Br。并且,所述卤素可任意被一个或多个以下基团取代。
作为通式I化合物的任何衍生物都在本发明的范围内。
本发明中提到的任何化合物都代表该特定化合物以及其一些变体或者形式。
以下结合具体实施例,对本发明作进一步说明。应理解,以下实施例仅用于说明本发明而非用于限定本发明的范围。
实施例中未注明具体条件的实验方法,通常按照常规条件如《分子克隆:实验室手册》(New York:Cold Spring Harbor Laboratory Press,1989)中所述的条件,或按照制造厂商所建议的条件。
本发明中使用的试剂:F-12培养基,脂质体Lipoplus,RMY-205,SDS-变性胶,PVDF膜,ECL,α-SMA一抗,COL1A1一抗,Smad2/3一抗,p-Smad3一抗,HA一抗,Flag一抗,兔二抗,鼠二抗,TRIzol,Q-PCR逆转录试剂盒,IPTG,Chondrex天狼星红总胶原检测试剂盒。
实施例1
RMY-205化合物的合成
将化合物e(100mg)溶于10mL二氯甲烷中,加1mL三乙胺作缚酸剂,室温条件下边搅拌边滴加2-氟-4-溴苄基溴(55mg),搅拌4h,经薄层色谱分析以及在紫外灯光下监测反应,待反应完全后,通过减压浓缩,用正己烷∶乙酸乙酯=3∶1体系经硅胶层析柱进行分离纯化,得白色固体,收率72%。1H NMR(600MHz,氘代氯仿)ppm 8.12(dd,J=7.9,1.1Hz,1H),7.52–7.49(m,1H),7.33(t,J=7.6Hz,1H),7.31–7.30(m,1H),7.27(d,J=5.5Hz,2H),7.22(d,J=9.9Hz,1H),3.81–3.80(m,4H),3.58(s,2H),2.61–2.59(m,4H).13C NMR(151MHz,CDCl3)δ169.94,162.20,160.53,152.16,150.30,132.79,131.50,127.59,125.24,124.83,124.69,121.21,119.36,119.19,116.75,54.99,52.85,46.35.HRMS(ESI)m/z 433.05612。
实施例2
WBR-2化合物的合成
按照实施例1的方法合成得到白色固体,收率21.6%。1H NMR(600MHz,氘代氯仿)ppm7.71(dd,J=8.3,2.9Hz,1H),7.37(d,J=8.8Hz,1H),7.24(dd,J=9.0,4.0Hz,1H),7.14-7.18(m,1H),7.01(d,J=3.1Hz,1H),6.64(dd,J=8.8,3.1Hz,1H),3.76-3.81(m,4H),3.74(s,3H),3.56(s,2H),2.58-2.63(m,4H).13C NMR(150MHz,氘代氯仿)ppm 168.7,160.1,159.0,158.5,150.6,148.0,138.0,133.4,124.7,122.4,122.4,119.2,119.0,118.4,118.3,116.5,115.0,114.2,110.1,110.0,61.7,55.5,53.0,46.4.MS(ESI):m/z[M+H]+463.1。
实施例3
WBR-7化合物的合成
按照实施例1的方法合成得到白色固体,收率21.6%。1H NMR(600MHz,氘代二甲基亚砜)ppm 9.66(br.s.,1H),7.98(dd,J=7.9,1.5Hz,1H),7.59-7.66(m,1H),7.51(d,J=8.3Hz,1H),7.34-7.41(m,2H),6.99(d,J=2.9Hz,1H),6.63(dd,J=8.6,2.9Hz,1H),3.72(br.s.,4H),3.52(s,2H),2.58(t,J=4.6Hz,4H).13C NMR(150MHz,氘代二甲基亚砜)ppm169.7,157.4,152.0,151.9,138.2,133.5,131.9,125.0,124.8,124.8,122.2,118.1,117.4,116.6,112.6,61.5,53.1,46.6.MS(ESI):m/z[M+H]+431.1429.0450。
实施例4
SARS-CoV-2编码的N蛋白激活肺成纤维细胞。
实验方法如下:
1.取对数生长期的人胚肺成纤维细胞HFL-1,接种2×105个细胞于6孔培养板。
2.过夜培养后,按脂质体Lipoplus转染说明书梯度转染Flag-N质粒。
3.转染3.5h后,换全血清培养基,继续培养36h后收取蛋白样品,进行免疫印迹检测。
4.免疫印迹(Western Blot)检测:
1)弃培养液,用PBS洗三次,加入300μL细胞裂解缓冲液(50mM Tris,pH 7.4,300mMNaCl,1%NP-40,1mM PMSF和磷酸酶抑制剂Cocktail)。
2)用超声波破碎仪破碎细胞,离心(13000rpm,10min,4℃)。
3)吸出上清,加入等体积的2×loading buffer缓冲液(100mMTris-Cl(PH 6.8),4%SDS,20%甘油,200mMβ-巯基乙醇),95℃煮10min。
4)蛋白SDS-PAGE电泳:蛋白上样量为10μg,于SDS-PAGE胶中电泳,浓缩胶电压100V,待样品进入分离胶后将电压调为150V。
5)转膜:电泳完成后切下浓缩胶,以乙醇预处理的PVDF膜及滤纸浸于电转液中装配转移三明治,赶尽气泡后,于4℃电转(100V,60min)。
6)抗原抗体反应:
A.封闭:用5%的脱脂牛奶或BSA封闭1h;
B.一抗反应:封闭后加入稀释好的一抗,室温孵育1.5h;
C.二抗反应:TBST洗3次,每次5min,之后加入对应种属的二抗,室温孵育1.5h。
7)ECL检测:TBST洗3次,每次10min。ECL的A液和B液以1:1混和,滴加于PVDF膜表面,使用化学发光成像仪显影。
实验结果如图1所示。不同梯度的SARS-CoV-2编码的N蛋白在肺成纤维细胞中表达,36h后收取蛋白样品检测。结果显示梯度表达N蛋白后,肌成纤维细胞的标志蛋白α-SMA和I型胶原蛋白COL1A1的表达量也呈梯度性增强。结果证明N蛋白在细胞水平可以激活肺成纤维细胞。
实施例5
化合物RMY-205、WBR-2和WBR-7抑制SARS-CoV-2编码的N蛋白激活的肺成纤维细胞。
实验方法如下:
1.细胞接种、转染同实施例4。
2.转染3.5h后,细胞换全血清培养基,RMY-205(20μM)、WBR-2(20μM)和WBR-7(30μM)分别处理36h后收取蛋白样品,进行免疫印迹检测。
3.免疫印迹(Western Blot)检测同实施例4。
实验结果如图2所示。SARS-CoV-2编码的N蛋白在肺成纤维细胞中表达,随后RMY-205及其衍生物WBR-2和WBR-7处理细胞36h,收取蛋白样品检测。结果显示RMY-205及其衍生物WBR-2和WBR-7可以明显抑制N蛋白诱导的肌成纤维细胞标志蛋白α-SMA与胶原蛋白COL1A1的表达。结果证明RMY-205及其衍生物能够抑制N蛋白激活的肺成纤维细胞。
实施例6
化合物RMY-205抑制SARS-CoV-2编码的N蛋白诱导的胶原蛋白分泌。
实验方法如下:
1、细胞接种、转染同实施例4。RMY-205处理同实施例5。
2、取800μL细胞培养液,离心(3000rpm,10min,4℃),弃沉淀取上清500μL,加入55μLTCA于冰上沉淀30min。
3、离心(13000rpm,10min,4℃),弃上清,加入75%冰丙酮清洗,再离心(13000rpm,10min,4℃),重复3次。
4、使用Chondrex天狼星红总胶原检测试剂盒(catalog:9062)检测培养液中分泌的胶原含量。
实验结果如图3所示。SARS-CoV-2编码的N蛋白在肺成纤维细胞中表达,随后RMY-205处理细胞36h,使用天狼星红总胶原试剂盒检测分泌的胶原蛋白。成纤维细胞在激活过程中大量分泌胶原蛋白,参与愈伤过程。结果表明,SARS-CoV-2编码的N蛋白促进肺成纤维细胞的胶原分泌,RMY-205能够抑制N蛋白诱导的胶原蛋白分泌。
实施例7
化合物RMY-205抑制SARS-CoV-2编码的N蛋白诱导的细胞因子mRNA表达水平。
实验方法如下:
1.细胞接种、转染同实施例4。RMY-205处理同实施例5。
2.总RNA提取
1)将细胞培养液上清弃去后直接加入1mL Trizol,吹打数次转移至1.5mL离心管。
2)加入200μl三氯甲烷,涡旋振荡30s,室温静置5min。
3)离心(12000g,15min,4℃)。上清转至新管,加三倍体积异丙醇,混匀,静置5-10min。
4)离心(12000g,10min,4℃)。去上清,加75%乙醇。
5)离心(7500g,5min,4℃)。去上清,晾干。
6)RNase free水溶解RNA,-80℃保存。
3.逆转录
1)在PCR管中加入2μg总RNA,2μl 5×gDNA Buffer,用RNase free水补充至10μl,混匀,置于PCR仪中42℃,3min。
2)向上一步反应后的PCR管中加入5μl RNase free水,2μl 10×Fast RT Buffer,1μl RT Enzyme Mix,2μl FQ-RT Primer Mix,混匀,置于PCR仪42℃,15min,随后95℃,3min。
3)得到cDNA-20℃保存。
4.将cDNA稀释5倍后作为模板,按照以下体系配制PCR反应体系:5μl SYBR Mix,1μl 2μM引物,4μl cDNA模板。使用Bio-rad CFX96进行实施荧光定量PCR检测。
实验结果如图4所示。SARS-CoV-2编码的N蛋白在肺成纤维细胞中表达,随后RMY-205处理细胞36h,收取mRNA样品进行检测。实验结果表明,SARS-CoV-2编码的N蛋白能够提高细胞因子IL-6、IL-8和趋化因子CXCL10、CCL2的mRNA表达水平,RMY-205能够抑制这些因子的mRNA表达水平。
实施例8
等温滴定量热法鉴定RMY-205与Smad3直接结合。
实验方法如下:
1.蛋白提取及纯化
1)将GST-Smad3转化至大肠杆菌BL21中,从平板上挑取单克隆菌落于无抗性的LB培养基中活化,37℃培养至菌浓度为OD=0.8。
2)将1mL菌液加入400mL氨卞抗性的LB培养基中,37℃培养至菌液浓度为OD=0.8。
3)加IPTG至终浓度为0.2mM,22℃,180rpm诱导16h。
4)菌液离心,弃上清,加入30mL PBT(20mM Tris-HCl,300mM NaCl,5mMβ-巯基乙醇,10%甘油,pH 8.0)重菌,超声破碎30s,间隔1min,重复20次。
5)将裂解液转移至50mL离心管,(13000rpm,30min,4℃),收集上清,加入400μL谷胱甘肽琼脂糖珠,4℃摇床孵育3h。
6)将琼脂糖珠转移至2mL离心管,加入PBT清洗,4℃摇床孵育10min,重复三次。
7)离心(3000rpm,1min,4℃),去上清。加入400μLElution buffer(10mM GSH,50mMTris-HCL,PH 8.0),4℃孵育30min洗脱蛋白,共收集蛋白400μg。
2.使用微量量热仪Malvern ITC-200检测RMY-205与Smad3结合,吸取400μL去离子水至滴定池,抽吸5次,弃废液,重复20次至滴定池中不再吹打出泡沫,然后吸取400μL蛋白溶液至滴定池。
3.吸取200μL去离子水至参比池,上下抽吸5次,弃废液,重复20次至参比池中无泡沫,吸取200μL去离子水至参比池。
4.泵吸去离子水和无水乙醇各两次清洗滴定针。
5.排空滴定针中残留的液体,将其放入装有滴定蛋白的离心管中。
6.吸取完成后,将滴定针放入滴定池中,开始滴定。
7.测定完成后,使用MicroCal Analysis Launcher程序进行曲线拟合。
实验结果如图5所示。等温滴定量热法验证RMY-205与Smad3的结合。结果显示,RMY-205可以与TGF-β信号通路蛋白Smad3直接结合。
实施例9
化合物RMY-205抑制SARS-CoV-2编码的N蛋白诱导的小鼠肺纤维化。
实验方法如下:
1.麻醉小鼠,将搭载SARS-CoV-2编码的N蛋白的腺相关病毒,以1*1010的滴度通过滴鼻的方式,感染8周龄小鼠肺部。
2.感染三天后,RMY-205溶于生理盐水,5%tween-80助溶,按照6mg/KG和10mg/KG的剂量对小鼠腹腔注射,每七天一次。
3.40天后,处死小鼠,取小鼠左肺部组织50mg,放入1.5mL离心管中,加入1mL 2×loading buffer缓冲液与两枚钢珠,使用组织研磨仪研磨30s,重复两次后,95℃煮5min。
4.免疫印迹(Western Blot)检测同实施例4。
5.H&E染色
1)取小鼠右肺组织,放入4%甲醛中,4℃固定24h。
2)取出组织,流水冲洗6h,使用自动脱水机脱水、透明、浸蜡,石蜡包埋机包埋,储存于4℃。
3)将肺组织切片,厚5μm,65℃烤片,二甲苯脱蜡10min,梯度乙醇复水,每道2min。
4)苏木素染色1min,流水冲洗10min反蓝。
5)使用梯度酒精脱水至95%乙醇,伊红稀释五倍染色30s,100%乙醇完全脱水。
6)风干10min,中性树脂封片。
6.天狼星红染色
1)将肺组织切片,厚5μm,65℃烤片,二甲苯脱蜡10min,梯度乙醇复水,每道2min。
2)吸去多余水分,使用天狼星红原液染色10min。
3)使用95%乙醇洗去多余染料,100%乙醇脱水两min。
4)风干10min,中性树脂封片。
实验结果如图6所示。使用腺相关病毒AAV搭载SARS-CoV-2编码的N蛋白,以滴鼻的方式诱导小鼠肺部感染N蛋白,每三天注射一次RMY-205,40天后处死小鼠,收取肺组织蛋白和肺组织切片。结果表明,SARS-CoV-2编码的N蛋白诱导小鼠肺部发生明显的纤维化,包括肌成纤维细胞的标志蛋白α-SMA和胶原蛋白COL1A1表达水平提高,Smad3磷酸化水平提高,肺泡间壁明显增厚,肺部结节增多,胶原大量沉积。在RMY-205处理组的小鼠中,6mg/KG和10mg/KG均能够抑制α-SMA、COL1A1表达与Smad3的磷酸化水平,肺组织形态区域趋于正常,胶原沉积减少,注射RMY-205的小鼠肺纤维化得到明显的缓解。结果证明RMY-205可以抑制SARS-CoV-2编码的N蛋白诱导的小鼠肺部纤维化。
实施例10
化合物RMY-205抑制不同SARS-CoV-2变体包括Alpha、Beta、Gamma、Delta、Omicron编码的N蛋白激活的肺成纤维细胞。
实验方法如下:
1.细胞接种、转染同实施例4。
2.转染3.5h后,换全血清培养基,RMY-205(20μM)处理36h后收取蛋白样品,进行免疫印迹检测。
3.免疫印迹(Western Blot)检测同实施例4。
实验结果如图7所示。不同SARS-CoV-2变体编码的N蛋白转染到肺成纤维细胞中表达,随后RMY-205处理细胞36h,收取蛋白样品检测。结果表明,RMY-205可以明显抑制不同SARS-CoV-2变体包括Alpha、Beta、Gamma、Delta、Omicron编码的N蛋白诱导的肌成纤维细胞标志蛋白α-SMA的表达。结果证明RMY-205能够抑制不同SARS-CoV-2变体的N蛋白激活的肺成纤维细胞。
实施例11
化合物RMY-205抑制不同SARS-CoV-2变体包括Alpha、Beta、Gamma、Delta、Omicron编码的N蛋白诱导的细胞因子、趋化因子mRNA表达水平。
实验方法如下:
1.细胞接种同实施例4。
2.过夜培养后,按脂质体Lipoplus转染说明书转染Flag-N质粒4μg。
3.RMY-205处理同实施例5。
4.总RNA提取、逆转录同实施例8。
5.将逆转录得到的cDNA稀释5倍后作为模板,按照以下体系配制PCR反应体系:5μlSYBR Mix,1μl 2μM的引物,4μl cDNA模板。使用Bio-rad CFX96进行实施荧光定量PCR检测。
实验结果如图8所示。不同SARS-CoV-2变体编码的N蛋白转染到肺成纤维细胞中表达,随后RMY-205处理细胞36h,收取样品进行基因表达检测。结果表明,RMY-205能够抑制不同SARS-CoV-2变体包括Alpha、Beta、Gamma、Delta、Omicron编码的N蛋白诱导的细胞因子和趋化因子的mRNA表达水平。
实施例12
化合物RMY-205抑制TGF-β激活的与Smad3通路相关引起的多种器官成纤维细胞的纤维化。
实验方法如下:
1.不同种类的细胞接种同实施例4。
2.过夜培养后,细胞换全血清培养基,TGF-β(20μM)处理36h后收取蛋白样品,进行免疫印迹检测。
3.免疫印迹(Western Blot)检测同实施例4。
实验结果如图9所示。TGF-β处理人肺成纤维细胞HFL-1、人心肌成纤维细胞AC-16、人肝星形细胞LX-2和人原代皮肤成纤维细胞,同时RMY-205处理细胞36h,收取蛋白样品检测。结果表明,TGF-β可以提高不同种类器官成纤维细胞的纤维化,包括α-SMA和胶原蛋白COL1A1的表达水平、Smad3磷酸化水平,RMY-205可以抑制α-SMA和COL1A1的表达水平、以及Smad3磷酸化水平。结果证明RMY-205可以抑制TGF-β处理导致的人肺成纤维细胞、人心肌成纤维细胞、人肝星形细胞和人原代皮肤成纤维细胞的纤维化。
实施例13
RMY-205抑制新霉素诱导的小鼠肾脏纤维化。
实验方法如下:
1. 8周龄小鼠尾静脉注射新霉素,剂量为18mg/KG。
2.第二天起,RMY-205溶于生理盐水,5%tween-80助溶,按照3mg/KG的剂量对小鼠腹腔注射,每天一次。
3.10天后,处死小鼠,取小鼠左肾组织50mg,放入1.5mL离心管中,加入1mL 2×loading buffer缓冲液与两枚钢珠,使用组织研磨仪研磨30s,重复两次后,95℃煮5min。
4.免疫印迹(Western Blot)检测同实施例1。
5.天狼星红染色同实施例7。
实验结果如图10所示。新霉素尾静脉注射诱导小鼠肾脏纤维化后,每天注射一次RMY-205,7天后处死小鼠,收取肾脏组织蛋白和肾脏组织切片。结果表明,新霉素诱导小鼠肾脏发生明显的纤维化,包括肌成纤维细胞的标志蛋白α-SMA和胶原蛋白COL1A1表达水平提高,Smad3磷酸化水平提高,胶原大量沉积。在RMY-205处理组的小鼠中,α-SMA、COL1A1表达与Smad3的磷酸化水平均被明显抑制,胶原沉积也明显减少,注射RMY-205的小鼠肾脏纤维化得到明显的缓解。结果证明RMY-205可以抑制新霉素诱导的小鼠肾脏纤维化。
Claims (10)
3.如权利要求1或2所述类黄酮醇化合物在制备治疗SARS-CoV-2编码的N蛋白引起的肺纤维化药物中的应用。
4.如权利要求3所述应用,其特征在于所述类黄酮醇化合物用于制备治疗SARS-CoV-2编码的N蛋白或其不同变体包括Alpha、Beta、Gamma、Delta、Omicron引起的肺纤维化的药物。
6.如权利要求1或2所述类黄酮醇化合物在制备治疗Smad3通路引起的多种器官细胞纤维化药物中的应用。
7.如权利要求6所述应用,其特征在于所述器官细胞为人肺成纤维细胞、人心肌成纤维细胞、人皮肤成纤维细胞和/或人肝星状细胞。
9.如权利要求1或2任一项所述类黄酮醇化合物在制备治疗新霉素诱导的肾脏纤维化药物中的应用。
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JOSE ESTEBAN OBREQUE-BALBOA 等: "Flavonoid derivatives as selective ABCC1 modulators: Synthesis and functional characterization", EUROPEAN JOURNAL OF MEDICINAL CHEMISTRY, vol. 109, pages 124 - 133, XP029399582, DOI: 10.1016/j.ejmech.2015.12.010 * |
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