CN116178532A

CN116178532A - 一种古尔图病毒核蛋白的单克隆抗体及其应用

Info

Publication number: CN116178532A
Application number: CN202310044505.7A
Authority: CN
Inventors: 钱进; 沈姝; 邓菲; 付丽艳; 吴晓丽; 王志英; 程桂荣
Original assignee: Wuhan Institute of Virology of CAS
Current assignee: Wuhan Institute of Virology of CAS
Priority date: 2023-01-30
Filing date: 2023-01-30
Publication date: 2023-05-30
Anticipated expiration: 2043-01-30
Also published as: CN116178532B

Abstract

本发明提供了一种古尔图病毒核蛋白的单克隆抗体及其应用，涉及到生物技术和病毒学领域，本发明筛选得到的单克隆抗体具有广谱性，可以识别古尔图病毒的核蛋白，尤其是可以识别古尔图病毒核蛋白中的6肽抗原表位，还可以交叉识别大别班达病毒的核蛋白，本发明进一步明确了单克隆抗体能够识别的抗原表位的氨基酸序列。本发明提供的单克隆抗体可以用于制备班达病毒和大别班达病毒相关的检测试剂，有利于在这2种病毒感染的辅助诊断，对班达病毒属中古尔图病毒和大别班达病毒的基础研究、临床研究、流调等具有重要的意义。

Description

一种古尔图病毒核蛋白的单克隆抗体及其应用

技术领域

本发明涉及生物技术和病毒学技术领域，具体涉及一种古尔图病毒的单克隆抗体以及所述单克隆抗体的应用，尤其是应用到古尔图病毒及大别班达病毒的共同检测，特别是应用于古尔图病毒的相关检测及抗古尔图病毒的相关药物。

背景技术

古尔图病毒(Guertu bandavirus,GTV)是一种新发蜱传病毒，2018年在新疆采集的草原革蜱(Dermacentor nuttalli ticks)标本中分离到古尔图病毒，主要宿主即为新疆古尔图地区的草原革蜱，草原革蜱是中国西部某地区的一种优势蜱种，也是古尔图病毒的主要传播媒介，其平均阳性率为7.89％，高于中国中部长角血蜱携带SFTSV的阳性率(2.1～5.4％)，体内外试验证明古尔图病毒可以感染多种哺乳动物和人源细胞系，并可导致小鼠脑部、肺部、肾脏、脾脏发生病变，对新疆古尔图地区人体血清的检测也已证明古尔图病毒可以在蜱虫、动物、人类之间发生传播，是一种具有潜在危险性的新发病毒。古尔图病毒的基因组由单股、负链RNA组成，分为大(L)、中(M)、小(S)三段，分别编码RNA依赖的聚合酶、前体包膜糖蛋白(Glycoprotein，包括Gn和Gc，简称GP蛋白)和核蛋白(Nuclear protein，NP)，GP蛋白具有重要的病毒侵入宿主细胞的受体结合位点和抗原表位，能够刺激机体产生特异性免疫反应；核蛋白能够刺激机体发生早期体液免疫和细胞免疫，并且在感染早期体内仅仅只能够测定到NP蛋白。

大别班达病毒(原名发热伴血小板减少综合征病毒Severe fever withthrombocytopenia syndrome Virus，SFTSV)是与古尔图病毒进化关系最接近的一种新发蜱传病毒，均属于布尼亚病毒目(Bunyavirales)，白纤病毒科(Phenuiviridae)，班达病毒属(bandavirus)。2010年，从不明原因发热伴血小板减少综合征(Severe fever withthrombocytopenia syndrome，SFTS)病例样本中发现并命名SFTSV，目前已在中国中东部的湖北、河南、浙江、山东等地区以及日本、韩国均有流行，感染人体后会引发高热、厌食、肌肉疼痛、寒战、淋巴结肿大、白细胞减少、血小板减少等临床症状，病死率约5％～30％。主要通过蜱虫叮咬的方式传播，也有文献报道过出现人传人的事件。根据最新的《人间传染的病原微生物目录(征求意见稿)》，国家卫生健康委员会将“大别班达病毒”等5种病毒的危害程度从原来的“第二类”，调整新增到“第三类”中。

目前，关于大别班达病毒(SFTSV)的单克隆抗体，相关研究利用噬菌体抗体文库，从大别班达病毒恢复期病人体内分离出400余株针对大别班达病毒核蛋白的单克隆抗体，凸显了核蛋白在诱导体液免疫中的重要地位，展示了开发以核蛋白为靶点的单抗作为新型病毒检测手段的重要性。还有相关研究利用大别班达病毒感染小鼠的脾细胞与骨髓瘤细胞融合，筛选并获得了针对大别班达病毒核蛋白的单克隆抗体并建立了夹心法ELISA检测方法，用于大别班达病毒病人血清的检测。但是，目前尚无古尔图病毒核蛋白单克隆抗体的研究报告，也没有针对古尔图病毒的特异性检测手段。由于古尔图病毒和大别班达病毒都属于RNA病毒，基因组复制缺少校对机制，病毒自身突变容易导致毒力、适应宿主能力和流行病学的改变，不同毒株可能重组产生适应其他媒介的新病毒，从而改变流行的分布范围，导致新发疾病的产生。此外，预防这2个病毒感染的有效药物和疫苗仍处在研究阶段，也没有行之有效的诊断方法或诊断试剂。因此，针对古尔图病毒等新发病毒的感染提供一种简便、快速、灵敏度高的检测试剂或治疗药物，成为目前临床诊断/治疗该类疾病要解决的首要问题。为了预防古尔图病毒日后可能发生的流行、传播及与同种属病毒的交叉感染，开展该病毒的单克隆抗体研究对于古尔图病毒以及班达病毒属其他成员的防治工作具有重大意义。

发明内容

本发明的目的在于至少部分地克服现有技术的不足，提供了一种识别古尔图病毒的广谱的单克隆抗体。

本发明的目的还在于填补了国内针对古尔图病毒检测试剂的空白，提供了3种古尔图病毒检测方法和用于古尔图病毒检测的试剂。

本发明的目的还在于提供了一种古尔图病毒的单克隆抗体，为古尔图病毒感染的辅助诊断提供一种备选抗体的研究基础。

为达到上述目的或目的之一，本发明提供了如下技术方案：

第一方面，本发明提供了一种古尔图病毒核蛋白的单克隆抗体，所述单克隆抗体能够识别具有SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列的线性表位，又能识别具有SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列的空间表位。

第二方面，所述单克隆抗体的重链可变区的3个互补决定区CDR(HCDR1、HC DR2、HCDR3)分别具有如下氨基酸序列：SEQ ID NO.6所示的HCDR1；SEQ IDNO.7所示的HCDR2；SEQID NO.8所示的HCDR3；该单克隆抗体的轻链可变区的3个互补决定区CDR(LCDR1、LCDR2、LCDR3)具有如下氨基酸序列：SEQ ID NO.9所示的LCDR1；氨基酸序列KAS所示的LCDR2；SEQID NO.10所示的LCDR3。

优选地，所述单克隆抗体的重链可变区具有SEQ ID NO.4所示的氨基酸序列。

优选地，所述单克隆抗体的重链可变区由SEQ ID NO.2所示的核酸序列编码。

优选地，所述单克隆抗体的轻链可变区具有SEQ ID NO.5所示的氨基酸序列。

优选地，所述单克隆抗体的轻链可变区由SEQ ID NO.3所示的核酸序列编码。

第三方面，本发明提供了一种含有上述古尔图病毒核蛋白的单克隆抗体的多核苷酸。

第四方面，本发明提供了一种含有上述古尔图病毒核蛋白的单克隆抗体的载体。

第五方面，本发明提供了一种含有上述古尔图病毒核蛋白的单克隆抗体的宿主细胞。

第六方面，本发明还提供了古尔图病毒核蛋白的单克隆抗体在制备多核苷酸、重组载体、表达载体、重组蛋白、遗传工程化的宿主细胞，以及古尔图病毒相关的检测试剂中的应用。

本发明的有益效果：

本发明得到了一种古尔图病毒的广谱性单克隆抗体22G1(简称单抗22G1)，该单抗22G1是源于古尔图病毒的核蛋白的单克隆抗体，能够识别古尔图病毒核蛋白中的6肽抗原表位(Linear epitope，LM)；此外，还可以交叉识别大别班达病毒的核蛋白。单抗22G1通过蛋白免疫印迹检测、间接免疫荧光检测和酶联免疫吸附检测验证，单抗22G1对古尔图病毒和大别班达病毒均能够识别，但是，单抗22G1的酶联免疫吸附检测(ELISA)结果显示单抗22G1对古尔图病毒的检测效率略高于对大别班达病毒的检测效率。

本发明得到的单抗22G1对班达病毒属的古尔图病毒和大别班达病毒的广谱性识别的活性表位主要是针对核蛋白，可以制备成班达病毒属的检测试剂，或者用于班达病毒属相关的病原体检测，可以区分样品中的病原体是否包含有古尔图病毒和大别班达病毒。本发明提供的蛋白免疫印迹检测(WB)、间接免疫荧光检测(IFA)和酶联免疫吸附检测(ELISA)这3种检测平台，可以用于对班达病毒属中古尔图病毒和大别班达病毒的基础研究、临床研究、流调等重大领域。

附图说明

图1为古尔图病毒单抗22G1的蛋白免疫印迹检测图，其中，22G1为单抗22G1，PC为阳性对照、即古尔图病毒核蛋白的多克隆抗体，NC为阴性对照、即健康小鼠血清；

图2为古尔图病毒单抗22G1的间接免疫荧光检测图，22G1为单抗22G1，PC为阳性对照、即古尔图病毒核蛋白的多克隆抗体，NC为阴性对照、即健康小鼠血清；

图3为古尔图病毒单抗22G1与截断的古尔图病毒的核蛋白16肽的蛋白免疫印迹检测图，其中，P26、27、28、29、30、31、32分别代表古尔图病毒的核蛋白8个氨基酸重复排列形成的16肽的编号，NC为阴性对照、即健康小鼠血清；

图4为古尔图病毒单抗22G1与截断的古尔图病毒的核蛋白8肽的蛋白免疫印迹检测图，其中，P33、34、35、36、37、38、39、40、41分别代表古尔图病毒的核蛋白7个氨基酸重复排列形成的8肽的编号，NC为阴性对照、即健康小鼠血清；

图5为古尔图病毒单抗22G1与原核表达的核蛋白的蛋白免疫印迹检测图，其中，PC为阳性对照、即古尔图病毒核蛋白的多克隆抗体，NC为阴性对照、即健康小鼠血清，A为重组载体pET28a-GTV-NP表达的病毒蛋白，B为重组载体pET28a-SFTSV-NP表达的病毒蛋白；

图6为古尔图病毒单抗22G1与真核表达的核蛋白的间接免疫荧光检测图，其中，PC为阳性对照、即古尔图病毒核蛋白的多克隆抗体，NC为阴性对照、即健康小鼠血清，第一行图片对应于重组载体pCAGGS-GTV-NP表达的病毒蛋白，第二行图片对应于重组载体pCAGGS-SFTSV-NP表达的病毒蛋白；

图7为古尔图病毒单抗22G1与真核表达的核蛋白的酶联免疫吸附检测结果图，横坐标为古尔图病毒单抗22G1稀释倍数的对数值(以2为底的对数值)，纵坐标为酶标仪OD_450-630测得的吸光度数值，其中，22G1-GTV代表不同单抗22G1的浓度与GTV感染的Vero细胞孵育后的ELISA检测结果，22G1-SFTSV代表不同单抗22G1的浓度与SFTSV感染Vero细胞孵育后的ELISA检测结果，Cut off线(Cut offline)＝0.024。

具体实施方式

下面结合附图详细描述本发明的示例性的实施例，其中相同或相似的表示相同的概念，比如古尔图病毒＝GTV，大别班达病毒＝发热伴血小板减少综合征病毒＝SFTSV，单克隆抗体＝单抗等。

在下面的详细描述中，为便于解释，阐述了许多具体的细节以提供对本披露实施例的全面理解。下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限定本发明的范围。

下述实施例中所使用的实验方法，如无特殊说明均为常规方法，所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。其中，弗氏完全佐剂、弗氏不完全佐剂、HAT培养基等购自美国的SIGMA-Aldrich；无血清DMEM培养基、QIXzol核酸提取试剂等购自湖北新纵科病毒疾病工程技术有限公司；PEG购自美国的Glpbio公司；Vero等细胞购自ATCC；HRP标记山羊抗鼠或兔IgG二抗、HRP标记的山羊抗兔IgG H&L荧光二抗等抗体购自艾博抗(上海)贸易有限公司(abcam)；化学发光成像分析仪Image Quant^TM LAS4000购自美国的GEHealthcare；TOPO-Blunt平末端克隆试剂盒(TOPO-Blunt Cloning Kit)购自南京诺唯赞生物科技股份有限公司；高内涵细胞成像分析系统购自美国的PerkinElmer公司；本发明中涉及的引物均委托生工生物工程(上海)股份有限公司合成；本发明序列测定委托北京擎科生物科技有限公司(武汉分公司)完成；古尔图病毒(GTV)和大别班达病毒(SFTSV)由中科院武汉病毒研究所国家病毒资源库保存。然而明显地，一个或多个实施例在没有这些具体细节的情况下也可以被实施，实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。

下述实施例中未作具体说明的分子生物学实验方法，均参照《分子克隆实验指南》(第三版)J.萨姆布鲁克一书中所列的具体方法进行，或者按照试剂盒和产品说明书进行。本发明实施的应用对象来源于待检测的生物制品，属于无生命的样本；所述检测的直接目的，是为了保证待检测的生物制品的安全性，从而有利于完善生物制品的质量控制标准，不存在获得疾病的诊断结果或健康状况的过程。因此，本发明不属于疾病的诊断方法，符合《专利法》对专利保护客体的基本要求。

本发明提供了一种古尔图病毒的单克隆抗体、制备方法及其应用，通过经古尔图病毒免疫小鼠的脾细胞与骨髓瘤细胞细胞融合技术，以古尔图病毒的灭活病毒为靶标，筛选到本发明所述能够分泌单抗22G1的细胞株；通过分子生物学技术，鉴定了单抗22G1识别线性表位的氨基酸序列、以及单抗22G1自身的氨基酸序列和编码的核酸序列，分别构建了含有古尔图病毒和大别班达病毒的真核和原核表达载体，得到的重组载体分别构建了蛋白免疫印迹检测(WB)、间接免疫荧光检测(IFA)和酶联免疫吸附检测(ELISA)这3个检测平台，进一步验证了单抗22G1即能够识别古尔图病毒的核蛋白，还能够交叉识别大别班达病毒的核蛋白；而且单抗22G1既能够识别核蛋白的线性表位，还能够识别核蛋白的空间表位，具有广谱识别能力。下面描述本发明的具体实施例，具体内容如下：

实施例1、单抗22G1的制备

本发明将浓缩的、灭活古尔图病毒免疫小鼠后，分离的脾细胞与骨髓瘤细胞在饲养细胞上进行细胞融合，以古尔图病毒感染细胞为阳性孔靶标，筛选出杂交瘤细胞株，最终从阳性孔中筛选出分泌抗古尔图病毒的核蛋白的单克隆细胞株22G1。在制备杂交瘤细胞株的过程中，包括动物免疫、分离脾细胞、细胞融合及单克隆化，具体制备流程如下：

1)动物免疫

根据制定的动物免疫方案，选择6-8周龄的SPF级C57/BL6小鼠为免疫动物，免疫原为浓缩的、灭活的古尔图病毒；用等体积的弗氏(不)完全佐剂乳化病毒后，通过腹腔及皮下多点注射的方式进行两次免疫，每次免疫间隔两周，免疫体积为200μL/只，其中，病毒量为8×10⁷TCID₅₀/只。

2)分离脾细胞

取免疫后的的C57/BL6小鼠，麻醉后眼眶放血处死，将处死的小鼠于75％酒精中浸泡5分钟，然后在生物安全柜中使用无菌器械解剖小鼠，取小鼠脾脏，剥去周围结缔组织，置于无菌的匀浆器中，先加入5mL无血清DMEM培养基研磨，再加入10mL无血清DMEM培养基充分混匀，静置10分钟后取研磨上清，1000rpm离心10分钟后弃上清，沉淀加入10mL无血清DMEM培养基重悬细胞，用台盼蓝对洗涤后的脾细胞进行计数，取免疫脾细胞悬液(1×10⁸)备用。

3)细胞融合及单克隆化

将免疫脾细胞悬液(1×10⁸)与骨髓瘤细胞(2×10⁷)(数量比例为脾细胞:骨髓瘤细胞＝5:1)充分混匀，1600rpm离心10分钟，弃上清，得混合细胞。将装有混合细胞的离心管置于37℃水浴环境下，缓慢加入1mL预热的50％PEG，边加边混匀，然后在5分钟内缓慢加入预热的DMEM培养基10mL，于37℃静置10分钟后，1000rpm离心8分钟，弃上清。将装有混合细胞的离心管用50mLHAT培养基重悬，将含有混合细胞的悬液均匀铺在96孔细胞板中，每孔加入细胞悬液100μL，经有限稀释后使96孔细胞板中的每个孔为单细胞状态，置于37℃，5％CO₂细胞培养箱中培养7-10天，取融合细胞上清，意料之外地从阳性孔中筛选出了单抗22G1，用于进行下一步单克隆抗体的验证。

实施例2、单抗22G1的验证

1)蛋白免疫印迹检测(WB)

取古尔图病毒感染Vero细胞并在Vero细胞内扩增，收集古尔图病毒感染后的Vero细胞与细胞上清，分别加入β-丙内酯灭活后，将病毒蛋白经12％SDS-PAGE凝胶电泳分离，转移到0.2μm聚偏二氟乙烯膜上，用PBS配置的5％(w/v)脱脂奶粉于37℃封闭1小时，PCR检测显示古尔图病毒在Vero细胞和细胞上清中均有阳性扩增。

阳性对照为兔抗古尔图病毒核蛋白的多克隆抗体，用一抗稀释液1：2000稀释；阴性对照为健康鼠血清，用一抗稀释液1：2000稀释；取上述融合细胞上清作为一抗，分别加入上述封闭后的聚偏二氟乙烯膜上，于37℃孵育2小时后，使用TBS-T洗涤3遍后，分别加入以1：2000稀释的HRP标记山羊抗鼠或兔IgG抗体，再次于37℃孵育1小时后进行免疫印迹显示，在化学发光成像分析仪Image Quant LAS4000上成像。

筛选得到的单抗22G1，与灭活后分离的古尔图病毒的蛋白免疫印迹检测结果如图1所示，证明单抗22G1能够识别灭活后从凝胶分离得到的古尔图病毒，即单抗22G1可以识别古尔图病毒核蛋白的线性表位。

2)间接免疫荧光检测(IFA)

病毒培养：将Vero细胞以1×10⁴/孔均匀铺至96孔细胞板中，按照100μ/孔加入含2％胎牛血清的DMEM培养基，待细胞密度长至80％以上时，弃上清；按照感染复数MOI＝1加入100μL含古尔图病毒的细胞上清，于37℃、5％CO₂的细胞培养箱中培养3天。

原位固定：取出细胞板，将细胞板先用无菌的PBS洗涤1遍，按照300μL/孔加入4％多聚甲醛，固定15分钟后，再次用PBS洗涤3遍；固定后的细胞板，按照100μL/孔加入0.4％TritonX-100，透化10分钟，再次用PBS洗涤4遍；透化后的细胞板，按照100μL/孔加入5％BSA，于37℃封闭1小时，弃掉封闭液。

IFA检测：阳性对照为兔抗古尔图病毒核蛋白的多克隆抗体，用1％BSA以1：2000稀释；阴性对照为健康鼠血清，用1％BSA以1：2000稀释；取上述分泌单抗22G1的融合细胞上清作为一抗，按照100μ/孔加入上述处理好的96孔细胞板，于37℃孵育2小时；二抗为HRP标记的山羊抗兔IgG(H+L)荧光抗体，用1％BSA以1：2000稀释，按照50μL/孔加入稀释后的二抗，37℃孵育1小时；之后按照50μL/孔加入荧光染料Hoechest 33258，室温放置5分钟，用高内涵细胞成像分析系统观察结果。

筛选得到的单抗22G1，与灭活的、原位固定的古尔图病毒的间接免疫荧光检测结果如图2所示，证明单抗22G1能够有效识别古尔图病毒的空间表位。

实施例3、单抗22G1的识别的抗原表位

1)截短的古尔图病毒核蛋白的短肽

根据古尔图病毒的核蛋白的氨基酸序列，制备成32个截短的16肽，编号记为P1～P32。前后两个16肽包含8个相同的氨基酸排列，且后一个编号的16肽的第一个氨基酸与前一个编号的16肽的第九个氨基酸相同，如此依次排列组合制备成32个16肽。

参考实施例2蛋白免疫印迹检测(WB)的方法，WB检测筛选出与单抗22G1反应阳性的16肽。结果如图3所示，图中代表性示出了包含阳性反应的结果，即单抗22G1识别的GTV核蛋白的16肽的编号为P31。

根据16肽编号P31的16个氨基酸序列，进一步制备成9个截短的8肽，编号为P33～P41。每个8肽从16个氨基酸序列中依次选择8个氨基酸排列形成，后一个编号的8肽的第一个氨基酸与前一个编号的8肽的第二个氨基酸相同，如此依次排列组合制备成9个8肽。根据8肽的编码核酸序列，在截短的8肽的核苷酸序列的前后分别加入BamH I和Sal I酶切位点，委托擎科生物合成DNA片段，将该合成的DNA片段克隆至pXXGST原核表达质粒载体中，之后通过电转化至大肠杆菌BL21感受态中，获得表达重组质粒的单克隆菌落。在3mL液体LB培养基中，于37℃，220rpm的条件下培养12小时；取30μL培养菌液转接至3mL新鲜液体LB培养基中，于30℃，220rpm继续扩增培养4小时，取出扩增培养的菌液于42℃，220rpm的条件下诱导蛋白表达，以5000rpm离心5分钟后去除上清液，使用200μL 1×Loading buffer重悬菌体，通过12％SDS-PAGE凝胶电泳分离蛋白，经考马斯亮蓝染色液染色后，鉴定截短的8肽的表达情况。

2)截短8肽的WB鉴定

参考实施例2蛋白免疫印迹检测(WB)的方法，WB检测筛选出与单抗22G1反应阳性的8肽。结果如图4所示，图中可见出现阳性反应的8肽的编号为P34～36，即单抗22G1识别的GTV核蛋白的8肽的编号为P34、P35和P36，即P34～36为单抗22G1识别的具体的线性表位。根据分析这截短8肽均包含SEQ ID NO.1所述的氨基酸序列：GPDGLP。

实施例4、单抗22G1的序列鉴定

培养的古尔图病毒的单抗22G1细胞株，提取总RNA，进行反转录为cDNA，将可变区(包括重链可变区和轻链可变区)片段扩增回收后，构建到克隆载体pTOPO-Blunt上，扩增培养后的克隆载体用通用引物M13F和M13R送检测序，具体流程如下：

1)核酸提取：

取上述筛选得到的单抗22G1细胞株，加入QIXzol核酸提取试剂1mL，反复吹打裂解细胞后，按照QIXzol核酸提取试剂的说明书提取总RNA。使用紫外分光光度计检测所提取的RNA浓度和纯度。

2)反转录：

取上述提取的RNA 3μg，加入Oligo(dT)(500μg/mL)、10mM dNTP Mix、5×First-StrandBuffer、0.1M DTT、RNaseOUT^TMRecombinant Ribonuclease Inhibitor(重组核糖核酸酶抑制剂)和M-MLVRT进行反转录，得到合成的cDNA。

3)扩增后测序：

可变区进行PCR扩增：取2μL cDNA作为模板，加入Orlandi等(1989)设计的扩增小鼠可变区基因的引物，使用高保真酶(2×Max MasterMix)进行PCR扩增获得目的基因片段，引物序列见下表1。

表1：可变区PCR扩增引物序列表

PCR扩增程序：95℃预变性3min；94℃变性15s，55℃退火15s，72℃延伸30s，如此30个循环；最后72℃延伸5min。

PCR产物回收：取PCR产物30～50μL进行1％琼脂糖电泳。按照DNA凝胶回收试剂盒(Gel Extraction Kit)的说明书纯化300bp左右大小的PCR产物。

克隆载体连接转化：以pTOPO-Blunt作为克隆载体，按照平末端克隆试剂盒(TOPO-Blunt Cloning Kit)的说明书分别将重链和轻链的可变区域的目的基因与pTOPO-Blunt连接。取2μL重组子转化处于感受态的DH10B受体菌,然后涂布于含100μg/mL氨苄青霉素(Ampicillin)的LB平板上，37℃过夜，即得含轻、重链的阳性菌。

阳性菌落培养后送检测序：用新鲜灭菌枪头从上述平板上挑取阳性菌各5～10个落于1mL LB培养基(含氨苄50μg/mL)中，37℃300rpm培养8～12h后，将菌液送擎科生物测序，指定测序通用引物为M13F和M13R。

4)测序结果

根据测序反馈结果，得到编码单抗22G1的重链可变区(VH)的核苷酸序列SEQ IDNO.2和轻链可变区(VL)的核苷酸序列SEQ ID NO.3；将测序结果转化为氨基酸序列后，得到的单抗22G1的重链可变区(VH)的氨基酸序列SEQ ID NO.4和轻链可变区(VL)的氨基酸序列SEQ ID NO.5；通过分析，单抗22G1的重链可变区的3个互补决定区CDR(HCDR1、HCDR2、HCDR3)的序列分别如SEQ ID NO.6、SEQ ID NO.7、SEQ ID NO.8所示；轻链可变区的3个互补决定区CDR(LCDR1、LCDR2、LCDR3)的序列分别如SEQ ID NO.9、氨基酸序列KAS、SEQ IDNO.10所示。关于单抗22G1的序列汇总如下表2所示：

表2：单抗22G1的序列清单

经Blastn序列比对分析，单抗22G1的轻链可变区属于κ型的免疫球蛋白(immunoglobulin，Ig)。

实施例5、单抗22G1的应用(检测试剂)

1)含核蛋白的重组质粒的构建和表达

通过PCR扩增技术从古尔图病毒和大别班达病毒的cDNA中扩增出古尔图病毒(GenBank序列号：KT328591)和大别班达病毒(GenBank序列号：AFJ15061)的核蛋白全长的核酸序列，分别克隆至真核表达载体pCAGGS(带有His标签)和原核表达载体pET28a的T7启动子的下游，经感受态细胞DH5α的表达分别获得4种重组质粒pCAGGS-GTV-NP、pCAGGS-SFTSV-NP、pET28a-GTV-NP和pET28a-SFTSV-NP。

将pET28a-GTV-NP和pET28a-SFTSV-NP通过电转化至大肠杆菌感受态细胞BL21中，涂布于含有100μg/mL卡那霉素(Kanamycin)的LB平板上，37℃过夜。挑取单阳性菌落于3mLLB液体培养基中，37℃，220rpm培养12小时后，取30μL菌液转接至3mL新鲜LB液体培养基中在37℃，220rpm继续扩增培养4小时，加入30μLIPTG诱导表达，于37℃，220rpm培养4小时，离心机去除菌液上清，使用200μL 1×Loading buffer重悬菌体，得菌体悬液，后续备用于实施例2所述的蛋白免疫印迹检测(WB)。

将pCAGGS-GTV-NP和pCAGGS-SFTSV-NP通过转染试剂Lipo3000转染至预先铺有Vero细胞的96孔细胞板中，在37℃、5％CO₂细胞培养箱中培养3天后，参照实施例2中间接免疫荧光检测(IFA)的方法，原位固定上述重组质粒转染的Vero细胞，经过固定、透化和封闭后的细胞板，后续分别备用于间接免疫荧光检测(IFA)和酶联免疫吸附检测(ELISA)分析。

2)单抗22G1的蛋白免疫印迹检测(WB)

取上述pET28a-GTV-NP和pET28a-SFTSV-NP表达的菌体悬液，经12％SDS PAGE凝胶电泳分离，转移到0.2um聚偏二氟乙烯膜上，参照实施例2中蛋白免疫印迹检测(WB)的方法，将单抗22G1分别与pET28a-GTV-NP和pET28a-SFTSV-NP进行WB反应，结果如图5所示，图中明显可见单抗22G1不仅可以识别pET28a-GTV-NP表达的蛋白线性表位，还可以交叉识别pET28a-SFTSV-NP表达的蛋白线性表位，即单抗22G1对古尔图病毒和大别班达病毒的核蛋白的线性表位都具有识别能力。

3)单抗22G1的间接免疫荧光检测(IFA)

取上述pCAGGS-GTV-NP和pCAGGS-SFTSV-NP转染Vero细胞后原位固定的细胞板，分别与单抗22G1孵育后，参照实施例2中间接免疫荧光检测(IFA)的方法，阳性对照分别为鼠抗古尔图病毒核蛋白的多克隆抗体和鼠抗大别班达病毒核蛋白的多克隆抗体，分别用1％BSA以1：2000稀释；阴性对照为健康鼠血清，用1％BSA以1：2000稀释。IFA检测结果如图6所示，图中明显可见单抗22G1不仅可以识别pCAGGS-GTV-NP表达蛋白的空间表位，还可以交叉识别pCAGGS-SFTSV-NP表达蛋白的空间表位，即单抗22G1对古尔图病毒和大别班达病毒的核蛋白的空间表位也都具有识别能力。

4)单抗22G1的酶联免疫吸附检测(ELISA)

扩增培养能够分别单抗22G1的细胞株，待细胞密度达到80％，收集细胞上清。用一抗稀释液将细胞上清原液进行倍比稀释，依次从1：2稀释至1：2¹³，将不同浓度的细胞上清稀释液作为一抗；阴性对照为健康鼠血清，用一抗稀释液以1：2000稀释；取分别被GTV和SFTSV感染(100TCID₅₀/孔)48小时后的Vero细胞经原位固定的细胞板，按照50μL/孔加入稀释好的一抗和阴性对照，于37℃孵育2小时后，用PBS-T洗涤6遍后，加入1：2000稀释的HRP标记山羊抗鼠IgG抗体，于37℃孵育1小时后，加入TMB显色液，于37℃孵育10分钟，立即加入TMB终止液，使用酶标仪进行450/630nm的双波长吸光度测定，OD_450-630值高于阴性对照2倍及以上的判定为Cut off线(Cut offline)，即Cut off线以上为阳性。

单抗22G1的酶联免疫吸附检测(ELISA)结果如图7所示，图中单抗22G1可以有效检测古尔图病毒和大别班达病毒，对古尔图病毒的检测效率高于对大别班达病毒的检测效率。

本发明提供的古尔图病毒的单抗22G1能够识别古尔图病毒和大别班达病毒的核蛋白，不仅能够识别古尔图病毒和大别班达病毒的线性表位，还能够识别古尔图病毒和大别班达病毒的空间表位。本发明提供的单抗22G1的酶联免疫吸附检测(ELISA)结果可见，单抗22G1对古尔图病毒的检测效率高于对大别班达病毒的检测效率，可以用于制备古尔图病毒和大别班达病毒相关检测试剂，有利于古尔图病毒和大别班达病毒的研究和防治。

本发明的具体实施方式已经得到详细的描述，使得本领域技术人员将会容易理解。但是根据已经公开的所有描述，可以对那些细节进行不同的修饰或替换，这些改变均在本发明的保护范围之内。本发明的全部范围由所附权利要求及其任何等同物给出。

Claims

1.一种古尔图病毒核蛋白的单克隆抗体，其特征在于：即能够识别具有SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列的线性表位，又能识别具有SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列的空间表位。

2.根据权利要求1所述的古尔图病毒核蛋白的单克隆抗体，其特征在于：所述单克隆抗体的重链可变区的3个互补决定区CDR具有如下氨基酸序列：SEQ ID NO.6所示的HCDR1；SEQID NO.7所示的HCDR2；SEQ ID NO.8所示的HCDR3；所述单克隆抗体的轻链可变区的3个互补决定区CDR具有如下氨基酸序列：SEQ ID NO.9所示的LCDR1；氨基酸序列KAS所示的LCDR2；SEQ ID NO.10所示的LCDR3。

3.根据权利要求2所述的古尔图病毒核蛋白的单克隆抗体，其特征在于：所述重链可变区具有SEQ ID NO.4所示的氨基酸序列。

4.根据权利要求2所述的古尔图病毒核蛋白的单克隆抗体，其特征在于：所述重链可变区由SEQ ID NO.2所示的核酸序列编码。

5.根据权利要求2所述的古尔图病毒核蛋白的单克隆抗体，其特征在于：所述轻链可变区具有SEQ ID NO.5所示的氨基酸序列。

6.根据权利要求2所述的古尔图病毒核蛋白的单克隆抗体，其特征在于：所述轻链可变区由SEQ ID NO.3所示的核酸序列编码。

7.一种多核苷酸，其编码权利要求1-6任一项中所述的古尔图病毒核蛋白的单克隆抗体。

8.一种载体，其包含权利要求7所述的多核苷酸。

9.一种宿主细胞，其包含权利要求8所述的载体。

10.权利要求1-6任一项中所述的古尔图病毒核蛋白的单克隆抗体，在制备古尔图病毒相关检测试剂中的应用。