CN116171284A - 用于治疗cd47相关疾病的双特异性抗体 - Google Patents

Abstract

本文公开了包括特异性地结合至CD47的第一靶向部分和特异性地结合至EpCAM或EGFR的第二靶向部分的双特异性抗体，以及包括所述双特异性抗体的药物组合物和方法。

Description

用于治疗CD47相关疾病的双特异性抗体

1.交叉引用

本申请要求2020年4月24日提交的国际专利申请号PCT/CN2020/086815的权益，其通过引用整体并入本文用于所有目的。

1.1.序列表

本申请含有以ASCII格式电子提交的并据此通过引用以其整体并入的序列表。创建于2021年4月21日的所述ASCII副本被命名为55429-708_602_SL.txt并且大小为157,978字节。

2.发明内容

本公开提供了具有CD47结合结构域和EpCAM结合结构域的双特异性蛋白(例如，双特异性抗体)。在一些实施方案中，双特异性蛋白的各种结构域具有人来源的序列，因此可能比具有非人序列的类似结构域诱导更弱的免疫应答。这些双特异性蛋白可以结合至细胞的表面上的CD47，并且可以阻断CD47-SIRPα相互作用，并允许CD47+细胞的吞噬作用。在一些实施方案中，CD47结合结构域优先结合至恶性细胞上的CD47，而不是RBC或血小板上的CD47。

EpCAM是一种肿瘤相关糖蛋白，其在一些癌细胞上高度表达，而在一些正常细胞上以较低水平或零水平表达。在一些极化的上皮细胞上，EpCAM在循环治疗性蛋白不能到达的顶端表面上表达。其在癌症中的表达模式改变为强烈的均匀膜状过表达。

在一些实施方案中，双特异性CD47×EpCAM抗体阻断不要吃我(don’t-eat-me)信号传导，从而增加CD47+/EpCAM+细胞的吞噬作用。在一些实施方案中，双特异性CD47×EpCAM抗体包括介导CD47+/EpCAM+细胞的抗体依赖性细胞毒性(ADCC)的IgG1 Fc结构域。

在某些实施方案中，本文描述了包括双特异性抗体的组合物，其中双特异性抗体包括CD47结合结构域和EpCAM结合结构域。在一些实施方案中，双特异性抗体还包括Fc结构域。在一些实施方案中，双特异性抗体对在肿瘤细胞的表面上表达的CD47的亲和力高于对在红细胞或血小板的表面上表达的CD47的亲和力。在一些实施方案中，肿瘤细胞表达EpCAM。在一些实施方案中，半最大结合至人红细胞所需的双特异性抗体的浓度大于500nM。在一些实施方案中，双特异性抗体以小于100nM的KD结合至人CD47。在一些实施方案中，双特异性抗体以1nM至100nM、1nM至50nM或5nM至50nM的KD结合至人CD47。在一些实施方案中，双特异性抗体以小于500nM的KD结合至EpCAM。在一些实施方案中，双特异性抗体以小于25nM的KD结合至EpCAM。在一些实施方案中，双特异性抗体以0.2nM至500nM、1nM至300nM、5nM至200nM或10nM至150nM的KD结合至EpCAM。在一些实施方案中，KD通过表面等离子体共振确定。在一些实施方案中，CD47结合结构域是人或工程改造的人CD47结合结构域。在一些实施方案中，CD47结合结构域包括重链可变结构域和轻链可变结构域。在一些实施方案中，CD47结合结构域包括scFv。在一些实施方案中，EpCAM结合结构域包括重链可变结构域和轻链可变结构域。在一些实施方案中，EpCAM结合结构域包括scFv。在一些实施方案中，Fc结构域是人Fc结构域。在一些实施方案中，人Fc结构域的同种型是IgG1或IgG4。在一些实施方案中，Fc结构域是异二聚体Fc结构域，其中异二聚体Fc区包括杵链(knob chain)和臼链(holechain)，形成杵臼(knob-into-hole)(KiH)结构。在一些实施方案中，杵链包括突变T366W，并且臼链包括突变T366S、L368A和Y407V，其中氨基酸位置编号根据Kabat等人的EU索引。在一些实施方案中，双特异性抗体具有不对称的三链杵臼结构。在一些实施方案中，CD47结合结构域是scFv。在一些实施方案中，EpCAM结合结构域是scFv。在一些实施方案中，CD47结合结构域包括三个重链(HC)互补决定区(CDR)：HC-CDR1、HC-CDR2和HC-CDR3；和三个轻链(LC)CDR：LC-CDR1、LC-CDR2和LC-CDR3；其中HC-CDR1包括SEQ ID NO:15，HC-CDR2包括SEQ IDNO:16，HC-CDR3包括与SEQ ID NO:17具有至少50％同一性的序列，LC-CDR1包括SEQ ID NO:18，LC-CDR2包括SEQ ID NO:19，并且LC-CDR3包括与SEQ ID NO:20具有至少50％同一性的序列。在一些实施方案中，HC-CDR3包括在K94、E95、G96、S97、F98、G99、V100b、D101和P102中的一个或多个处的氨基酸取代；并且LC-CDR3包括在Y89、S90、T91、D92、I93、S94、G95、N95a、H95b、W96和V97中的一个或多个处的氨基酸取代。在一些实施方案中，CD47结合结构域的重链可变结构域包括与SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:10或SEQ ID NO:13具有至少90％同一性的序列，并且CD47结合结构域的轻链包括与SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:11或SEQ ID NO:14具有至少90％同一性的序列。在一些实施方案中，EpCAM结合结构域包括三个重链(HC)互补决定区(CDR)：HC-CDR1、HC-CDR2和HC-CDR3以及三个轻链(LC)CDR：LC-CDR1、LC-CDR2和LC-CDR3；其中CDR由被列为HC-CDR1、HC-CDR2、HC-CDR3、LC-CDR1、LC-CDR2、LC-CDR3的序列的有序集合定义；并且其中CDR选自与以下序列具有至少90％同一性的序列：SEQ ID NO:45、SEQ IDNO:46、SEQ ID NO:47、SEQ ID NO:81、SEQ ID NO:82和SEQ ID NO:83；SEQ ID NO:48、SEQID NO:49、SEQ ID NO:50、SEQ ID NO:84、SEQ ID NO:85和SEQ ID NO:86；SEQ ID NO:51、SEQ ID NO:52、SEQ ID NO:53、SEQ ID NO:87、SEQ ID NO:88和SEQ ID NO:89；SEQ ID NO:54、SEQ ID NO:55、SEQ ID NO:56、SEQ ID NO:90、SEQ ID NO:91和SEQ ID NO:92；SEQ IDNO:57、SEQ ID NO:58、SEQ ID NO:59、SEQ ID NO:93、SEQ ID NO:94和SEQ ID NO:95；SEQID NO:60、SEQ ID NO:61、SEQ ID NO:62、SEQ ID NO:96、SEQ ID NO:97和SEQ ID NO:98；SEQ ID NO:63、SEQ ID NO:64、SEQ ID NO:65、SEQ ID NO:99、SEQ ID NO:100和SEQ ID NO:101；SEQ ID NO:66、SEQ ID NO:67、SEQ ID NO:68、SEQ ID NO:102、SEQ ID NO:103和SEQID NO:104；SEQ ID NO:69、SEQ ID NO:70、SEQ ID NO:71、SEQ ID NO:105、SEQ ID NO:106和SEQ ID NO:107；SEQ ID NO:72、SEQ ID NO:72、SEQ ID NO:74、SEQ ID NO:108、SEQ IDNO:109和SEQ ID NO:110；SEQ ID NO:75、SEQ ID NO:76、SEQ ID NO:77、SEQ ID NO:111、SEQ ID NO:112和SEQ ID NO:113；和SEQ ID NO:78、SEQ ID NO:79、SEQ ID NO:80、SEQ IDNO:114、SEQ ID NO:115和SEQ ID NO:116。在一些实施方案中，EpCAM结合结构域包括：与SEQ ID NO:21至少90％相同的序列和与SEQ ID NO:33至少90％相同的序列；与SEQ ID NO:22至少90％相同的序列和与SEQ ID NO:34至少90％相同的序列；或与SEQ ID NO:24至少90％相同的序列和与SEQ ID NO:36至少90％相同的序列。在一些实施方案中，与非特异性IgG1抗体对照相比，小于1nM或小于0.1nM的双特异性抗体将被巨噬细胞吞噬的A431细胞的百分比增加至少4倍。在一些实施方案中，介导巨噬细胞对EpCAM阳性、CD47阳性肿瘤细胞的抗体依赖性细胞吞噬作用所需的抗体的浓度在0.01nM至-3nM之间。在一些实施方案中，EpCAM阳性、CD47阳性肿瘤细胞是OVISE细胞或A431细胞。在一些实施方案中，EpCAM阳性、CD47阳性肿瘤细胞选自胰腺导管腺癌细胞、卵巢透明细胞腺癌细胞、结肠腺癌细胞、肺腺癌细胞、卵巢腺癌细胞、外阴鳞状细胞癌细胞。在一些实施方案中，100nM的双特异性抗体将细胞的表面上SIRPα与CD47的结合抑制至少30％。在一些实施方案中，细胞是CD47+EpCAM+肿瘤细胞。在一些实施方案中，细胞在其表面上表达与CFPAC-1细胞或OVISE细胞至少一样多的EpCAM蛋白。在一些实施方案中，细胞在其表面上表达至少100,000、至少300,000、至少600,000或至少1,500,000个EpCAM蛋白。在一些实施方案中，400nM的双特异性抗体在血细胞凝集测定中不诱导红细胞的溶血。

一些实施方案提供了一种复合物，其包括根据上述实施方案中任一个的所述双特异性抗体和CD47+EpCAM+靶细胞。在一些实施方案中，靶细胞在其表面上表达与HCC-44细胞至少一样多的EpCAM蛋白。在一些实施方案中，靶细胞在其表面上表达至少100,000、至少300,000、至少600,000或至少1,500,000个EpCAM蛋白。在一些实施方案中，CD47+EpCAM+靶细胞是癌细胞。在一些实施方案中，癌细胞是胰腺导管腺癌细胞、卵巢透明细胞腺癌细胞、结肠腺癌细胞、肺腺癌细胞、卵巢腺癌细胞或外阴鳞状细胞癌细胞。

一个实施方案提供了一种诱导CD47+EpCAM+靶细胞的吞噬作用的方法，该方法包括施用根据上述实施方案中任一个的所述双特异性抗体。在一些实施方案中，双特异性抗体以小于5nM、小于2nM、小于1nM、小于0.5nM、小于0.2nM、小于0.1nM或小于0.05nM的浓度施用。

一些实施方案提供了一种杀伤CD47+EpCAM+靶细胞的方法，该方法包括施用根据上述实施方案中任一个的所述双特异性抗体，其中所述双特异性抗体抑制CD47+EpCAM+靶细胞的表面上SIRPα与CD47的结合。

一些实施方案提供了一种杀伤CD47+EpCAM+靶细胞的方法，该方法包括施用根据上述实施方案中任一个的所述双特异性抗体，其中所述双特异性抗体诱导杀伤CD47+EpCAM+靶细胞的抗体依赖性细胞毒性。在一些实施方案中，抗体以0.01至1nM、0.01至0.5nM、0.01至0.25nM、0.01至0.1nM、0.01至0.05nM或小于0.01nM的浓度施用。在一些实施方案中，CD47+EpCAM+靶细胞选自A431细胞、HCC-44细胞、SKOV-3细胞、OVISE细胞或CFPAC-1细胞。在一些实施方案中，CD47+EpCAM+靶细胞选自胰腺导管腺癌细胞、卵巢透明细胞腺癌细胞、结肠腺癌细胞、肺腺癌细胞、卵巢腺癌细胞或外阴鳞状细胞癌细胞。

一些实施方案提供了一种药物，其包括根据上述实施方案中任一个的所述双特异性抗体。另一个实施方案提供了一种治疗患有癌症的个体的方法，该方法包括施用所述药物组合物。在一些实施方案中，癌症是胰腺导管腺癌、卵巢透明细胞腺癌、结肠腺癌、肺腺癌细胞、卵巢腺癌或外阴鳞状细胞癌。

3.附图说明

图1.三链杵臼EpCAM×CD47双特异性抗体的结构的示意图。

图2.通过流式细胞术确定的CFPAC-1胰腺腺癌细胞的抗体依赖性细胞吞噬作用(ADCP)。

图3.αCD47抗体VIR47的重链(图3A)和轻链(图3B)丙氨酸扫描突变体的序列比对。图3A按外观顺序分别公开了SEQ ID NO:5和141-151。图3B按外观顺序分别公开了SEQ IDNO:152-163。

图4A-4B.通过ELISA确定的双特异性抗体Bi-1与人CD47(图4A)和人EpCAM(图4B)的结合。

图5A-5B.通过双特异性或二价抗CD47抗体抑制SIRPα与OVISE细胞(图5A)或Raji细胞(图5B)的结合。

图6.用指定的双特异性、二价和/或单价抗体处理的A431细胞的抗体依赖性细胞吞噬作用(ADCP)。

图7.用指定的双特异性的二价抗体对人红细胞进行血细胞凝集。

图8A-8B.双特异性的二价抗体与红细胞(图8A)和血小板(图8B)的结合。

图9A-9B.三链杵臼抗EGFRxCD47双特异性抗体的结构的示意图。

图10A-10B.通过ELISA的huEGFR(图10A)和人CD47(图10B)上的抗CD47/EGFR双特异性抗体的结合。

图11.与各种对照相比，通过抗CD47/EGFR双特异性抗体抑制SIRPα与A431细胞的结合。

图12.与各种对照相比，通过抗CD47/EGFR双特异性抗体对A431细胞的抗体依赖性细胞吞噬作用(ADCP)。

图13A-13B.与各种对照相比，抗CD47/EGFR双特异性抗体与人RBC细胞(图13A)和人血小板细胞(图13B)的结合。

图14.与各种对照相比，皮下胃癌模型SNU-5中抗CD47/EGFR双特异性抗体的体内抗肿瘤活性。

4.具体实施方式

分化簇47(CD47)，也被称为整合素相关蛋白(IAP)，是一种约50kDa的免疫球蛋白超家族膜糖蛋白，其在多种血液癌症和实体瘤中过表达。CD47高表达通常与侵袭性更强的疾病和较差的临床结局相关。

CD47+细胞的表面上的CD47与在诸如巨噬细胞和树突状细胞的先天和适应性免疫系统的细胞上表达的信号调节蛋白α(SIRPα)相互作用。这种相互作用发出抑制吞噬作用的“不要吃我”信号，从而使CD47+细胞逃避免疫监视。

这些数据表明，CD47可以作为免疫检查点，并且表明通过关闭“不要吃我”信号，阻断CD47-SIRPα相互作用可能具有治疗价值。因此，阻断CD47已成为有前途的治疗策略，其中大量研究表明，中断CD47-SIRPα信号传导通路促进了体外和体内抗人类癌症的抗肿瘤活性。

若干种抗CD47单克隆抗体(mAb)已经显示增加急性髓性白血病细胞、非霍奇金淋巴瘤细胞、乳腺癌细胞和卵巢癌细胞的吞噬作用。在临床研究中，CD47 mAb增强了其他治疗性抗体的抗肿瘤活性。至少六种抗CD47 mAb和三种SIRPα融合蛋白正处于治疗人类血液恶性肿瘤和实体瘤的活跃的I期或II期临床试验。

抗CD47 mAb的效力受到其与还表达CD47的红细胞(RBC)的相互作用的限制。RBC充当接收器以隔绝(sequester)抗CD47抗体，从而防止它们结合到恶性CD47表达(CD47+)细胞。此外，抗CD47mAb与RBC结合导致RBC的血细胞凝集和裂解，从而导致贫血。因此，需要治疗由CD47+细胞介导的恶性疾病且具有降低的瘤外效应的改进的方法。

上皮细胞粘附分子(EpCAM)，也被称为CD236，是一种约35kDa的I型跨膜糖蛋白，其起同嗜性Ca2+非依赖性细胞间粘附分子的作用。EpCAM还参与细胞信号传导、增殖、分化、器官形态的形成和维持。在许多转移性上皮癌诸如乳腺癌、前列腺癌、卵巢癌、肺癌、结肠癌、肾癌和胃癌中发现了其过表达，这突出了其作为免疫疗法的理想靶标的潜力(Spizzo等人，Breast Cancer Res Treat，86:207-213)。

表皮生长因子受体(EGFR)，也被称为ErbB-1或HER1，是一种跨膜蛋白，其是细胞外蛋白配体的表皮生长因子家族成员的受体。EGFR是ErbB受体家族的成员，该家族是四种密切相关的受体酪氨酸激酶的亚家族：EGFR、HER2/neu、Her 3和Her4。EGFR的过表达与许多癌症相关，包括肺腺癌、肛门癌、成胶质细胞瘤以及头颈部上皮肿瘤。

在一些实施方案中，本文公开了抗CD47抗体、抗EpCAM抗体和多特异性抗体，其包括针对CD47的靶向部分和针对EpCAM的靶向部分，或其组合。在一些实施方案中，本文还描述了双特异性抗体，其包括针对CD47的第一靶向部分和针对EpCAM的第二靶向部分。本文进一步描述的另外的实施方案是用抗CD47抗体、抗EpCAM抗体和多特异性抗体(例如，双特异性CD47/EpCAM抗体)治疗癌症的方法。

在一些实施方案中，本文公开了抗CD47抗体、抗EGFR抗体和多特异性抗体，其包括针对CD47的靶向部分和针对EGFR的靶向部分或其组合。在一些实施方案中，本文还描述了双特异性抗体，其包括针对CD47的第一靶向部分和针对EGFR的第二靶向部分。本文进一步描述的另外的实施方案是用抗CD47抗体、抗EGFR抗体和多特异性抗体(例如，双特异性CD47/EGFR抗体)治疗癌症的方法。

4.1抗CD47抗体

在某些实施方案中，本文公开了一种抗CD47抗体。在一些实施方案中，本文所述的抗CD47抗体为全长抗体，包括重链(HC)和轻链(LC)。在一些情况下，HC包括选自表5的序列。在一些情况下，轻链包括选自表5的序列。在一些情况下，抗CD47抗体包括可变重链(VH)区和可变轻链(VL)区，其中VH区包括选自SEQ ID NO:15的CDR1序列；选自SEQ ID NO:16的CDR2序列和选自SEQ ID NO:17的CDR3序列；并且其中VL区分别包括CDR1、CDR2和CDR3序列SEQ ID NO:18、19和20。

在一些实施方案中，VH-CDR3和/或VL-CDR3包括一个或多个氨基酸取代，所述取代修饰与人CD47的结合亲和力。在一些情况下，氨基酸取代是丙氨酸(A)。在一些情况下，VH-CDR3包括在K₉₄、E₉₅、G₉₆、S₉₇、F₉₈、G₉₉、E₁₀₀、G_100a、V_100b、D₁₀₁和P₁₀₂处的氨基酸取代。在一种情况下，VH-CDR3包括至少一个选自以下氨基酸位置的丙氨酸取代：K₉₄、E₉₅、G₉₆、S₉₇、F₉₈、G₉₉、E₁₀₀、G_100a、V_100b、D₁₀₁和P₁₀₂。在其他情况下，VL-CDR3包括在位置Y₈₉、S₉₀、T₉₁、D₉₂、I₉₃、S₉₄、G₉₅、N_95a、H_95b、W₉₆和V₉₇处的氨基酸取代。在一种情况下，VL-CDR3包括至少一个选自以下氨基酸位置的丙氨酸取代：Y₈₉、S₉₀、T₉₁、D₉₂、I₉₃、S₉₄、G₉₅、N_95a、H_95b、W₉₆和V₉₇。

在一些实施方案中，抗CD47抗体包括VH区，其中VH区的序列包括与SEQ ID NO:5、10和13约80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的序列同一性。

在一些实施方案中，在一个或多个氨基酸位置处修饰抗CD47抗体，以修饰其结合、免疫原性或其他性质。在一些情况下，突变在重链中。在其他情况下，突变在轻链中。在一些情况下，突变在重链和轻链中。在一些实施方案中，重链的修饰的氨基酸残基选自I₆₇、F₇₉和G_82b。在一些实施方案中，轻链的修饰的氨基酸残基选自E₁₀₃和M₄。在一些情况下，重链包括至少一个选自I₆₇F、F₇₉Y、G_82bS的突变。在一些情况下，轻链包括至少一个选自E₁₀₃K和M₄L的突变。在一些实施方案中，重链包括突变I₆₇F、F₇₉Y、G_82bS。在一些实施方案中，轻链包括突变E₁₀₃K和M₄L。

在一些实施方案中，抗CD47抗体为全长抗体。在其他实施方案中，抗CD47抗体是结合片段。在一些情况下，抗CD47抗体包括抗体或其结合片段、单克隆抗体或其结合片段、嵌合抗体或其结合片段、人源化抗体或其结合片段、或工程改造的抗体或其结合片段。在一些情况下，抗CD47抗体包括单价Fab、二价Fab’2、单链可变片段(scFv)或其结合片段。

在一些实施方案中，本文所述的抗CD47抗体具有约0.02nM至约2.27nM的EC50。在一些实施方案中，本文所述的抗CD47抗体具有至少约0.02nM的EC50。在一些实施方案中，本文所述的抗CD47抗体具有至多约2.27nM的EC50。在一些实施方案中，本文所述的抗CD47抗体在体外吞噬作用测定中具有约0.02nM至约0.16nM、约0.02nM至约0.21nM、约0.02nM至约1.03nM、约0.02nM至约1.2nM、约0.02nM至约2.27nM、约0.16nM至约0.21nM、约0.16nM至约1.03nM、约0.16nM至约1.2nM、约0.16nM至约2.27nM、约0.21nM至约1.03nM、约0.21nM至约1.2nM、约0.21nM至约2.27nM、约1.03nM至约1.2nM、约1.03nM至约2.27nM或约1.2nM至约2.27nM的EC50，以确定ADCP活性，例如使用巨噬细胞和靶向癌细胞，诸如来自胰腺癌的转移性癌细胞(例如CFPAC-1细胞)，或来自卵巢癌的转移性癌细胞(例如OVISE细胞)。

在一些实施方案中，本文所述的抗CD47抗体具有约0.002nM至约0.138nM的EC50。在一些实施方案中，本文所述的抗CD47抗体具有至少约0.002nM的EC50。在一些实施方案中，本文所述的抗CD47抗体具有至多约0.138nM的EC50。在一些实施方案中，本文所述的抗CD47抗体在体外细胞毒性测定中具有约0.002nM至约0.012nM、约0.002nM至约0.053nM、约0.002nM至约0.108nM、约0.002nM至约0.138nM、约0.012nM至约0.053nM、约0.012nM至约0.108nM、约0.012nM至约0.138nM、约0.053nM至约0.108nM、约0.053nM至约0.138nM或约0.108nM至约0.138nM的EC50，以确定ADCP活性，例如使用NK92/CD16a176V效应子细胞和靶向癌细胞，诸如来自胰腺癌的转移性癌细胞(例如CFPAC-1细胞)，或来自卵巢癌的转移性癌细胞(例如OVISE细胞)。

在一些实施方案中，与CD47 BMK-1相比，本文所述的抗CD47抗体具有降低的红细胞(RBC)结合。在一些情况下，与参考抗体CD47BMK-1相比，降低的RBC结合是至少10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％或100％的降低。

在一些实施方案中，与参考抗体CD47 BMK-2、CD47 BMK-1或CD47 BMK-4相比，本文所述的抗CD47抗体具有改善的血清半衰期。在一些实施方案中，与参考抗体CD47 BMK-2或CD47 BMK-1相比，本文所述的抗CD47抗体具有改善的血清半衰期。在一些情况下，改善的血清半衰期比参考抗体CD47 BMK-2、CD47 BMK-1或CD47 BMK-4长至少30分钟、1小时、1.5小时、2小时、3小时、4小时、5小时、6小时、7小时、8小时、9小时、10小时、12小时、18小时、24小时、2天、3天、4天、5天、6天、7天、14天、30天或更长时间。在一些情况下，改善的血清半衰期比参考抗体CD47 BMK-2或CD47 BMK-1长至少30分钟、1小时、1.5小时、2小时、3小时、4小时、5小时、6小时、7小时、8小时、9小时、10小时、12小时、18小时、24小时、2天、3天、4天、5天、6天、7天、14天、30天或更长时间。

在一些情况下，本文所述的抗CD47抗体的血清半衰期为至少30分钟、1小时、1.5小时、2小时、3小时、4小时、5小时、6小时、7小时、8小时、9小时、10小时、12小时、18小时、24小时、2天、3天、4天、5天、6天、7天、14天、30天或更长。在一些情况下，本文所述的抗CD47抗体的血清半衰期为约30分钟、1小时、1.5小时、2小时、3小时、4小时、5小时、6小时、7小时、8小时、9小时、10小时、12小时、18小时、24小时、2天、3天、4天、5天、6天、7天、14天、30天或更长。

4.2抗EPCAM抗体

在某些实施方案中，本文公开了一种抗EpCAM抗体。在一些实施方案中，本文所述的抗EpCAM抗体为全长抗体，包括重链(HC)和轻链(LC)。在一些情况下，HC包括选自表8的序列。在一些情况下，轻链包括选自表9的序列。在一些情况下，抗EpCAM抗体包括可变重链(VH)区和可变轻链(VL)区，其中VH区包括选自SEQ ID NO:45、48、51、54、57、60、63、66、69、72、75、78的CDR1序列；选自SEQ ID NO:46、49、52、55、58、61、64、67、70、73、76、79的CDR2序列；以及选自SEQ ID NO:47、50、53、56、59、62、65、68、71、74、77、80的CDR3序列，并且其中VL区包括选自SEQ ID NO:81、84、87、90、93、96、99、102、105、108、111和114的CDR1序列；选自SEQ ID NO:82、85、88、91、94、97、100、103、106、109、112和115的CDR2序列；以及选自SEQ IDNO:83、86、89、92、95、98、101、104、107、110、113和116的CDR3序列。

在一些实施方案中，VH-CDR3和/或VL-CDR3包括一个或多个氨基酸取代，其修饰与人EpCAM的结合、免疫原性或一些其他特征。在一些情况下，氨基酸取代是丙氨酸(A)。在一些实施方案中，VH-CDR3是SEQ ID NO:47、50、53、56、59、62、65、68、71、74、77、80。在一些实施方案中，VH-CDR3包括至少一个丙氨酸取代。在一些实施方案中，丙氨酸取代消融了与人EpCAM的结合。

在一些实施方案中，抗EpCAM抗体包括VH区和VL区，其中VH区的序列包括与SEQ IDNO:21-32约80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的序列同一性，并且VL区的序列包括与SEQ ID NO:33-44约80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的序列同一性

在一些实施方案中，抗EpCAM抗体为全长抗体。在其他实施方案中，抗EpCAM抗体是结合片段。在一些情况下，抗EpCAM抗体包括抗体或其结合片段、单克隆抗体或其结合片段、嵌合抗体或其结合片段、或人源化抗体或其结合片段。在一些情况下，抗EpCAM抗体包括单价Fab、二价Fab’2、单链可变片段(scFv)或其结合片段。

在一些实施方案中，与参考抗体EpCAM BMK-6相比，本文所述的抗EpCAM抗体具有与人EpCAM蛋白的增强的结合。在一些情况下，与EpCAM BMK-6相比，增强的结合是KD降低至少10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、100％。

在一些实施方案中，本文所述的抗EpCAM抗体具有约0.023nM至约3.07nM的EC50。在一些实施方案中，本文所述的抗EpCAM抗体具有至少约0.023nM的EC50。在一些实施方案中，本文所述的抗EpCAM抗体具有至多约3.07nM的EC50。在一些实施方案中，本文所述的抗EpCAM抗体在体外细胞毒性测定中具有约0.023nM至约0.024nM、约0.023nM至约0.036nM、约0.023nM至约0.038nM、约0.023nM至约0.04nM、约0.023nM至约0.059nM、约0.023nM至约0.069nM、约0.023nM至约0.086nM、约0.023nM至约3.07nM、约0.024nM至约0.036nM、约0.024nM至约0.038nM、约0.024nM至约0.04nM、约0.024nM至约0.059nM、约0.024nM至约0.069nM、约0.024nM至约0.086nM、约0.024nM至约3.07nM、约0.036nM至约0.038nM、约0.036nM至约0.04nM、约0.036nM至约0.059nM、约0.036nM至约0.069nM、约0.036nM至约0.086nM、约0.036nM至约3.07nM、约0.038nM至约0.04nM、约0.038nM至约0.059nM、约0.038nM至约0.069nM、约0.038nM至约0.086nM、约0.038nM至约3.07nM、约0.04nM至约0.059nM、约0.04nM至约0.069nM、约0.04nM至约0.086nM、约0.04nM至约3.07nM、约0.059nM至约0.069nM、约0.059nM至约0.086nM、约0.059nM至约3.07nM、约0.069nM至约0.086nM、约0.069nM至约3.07nM或约0.086nM至约3.07nM的EC50，以确定ADCC活性，例如，使用NK92/CD16a176V效应细胞并靶向癌细胞，诸如来自外阴鳞状细胞癌的转移性癌细胞，例如A431细胞。

在一些实施方案中，本文所述的第一抗EpCAM抗体抑制第二抗EpCAM抗体或其片段与人EpCAM蛋白的结合。在一些实施方案中，第一抗EpCAM抗体将结合抑制0％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、95％、100％。

4.3抗EGFR抗体

在某些实施方案中，本文公开了一种抗EGFR抗体。在一些实施方案中，本文所述的抗EGFR抗体为全长抗体，其包括重链(HC)和轻链(LC)。在一些情况下，HC包括选自表15-17的序列。在一些情况下，轻链包括选自表15-17的序列。在一些情况下，抗EGFR抗体包括可变重链(VH)区和可变轻链(VL)区，其中VH区包括根据SEQ ID NO:121的CDR1；根据SEQ ID NO:122的CDR2序列和根据SEQ ID NO:123的CDR3，并且其中VL区分别包括CDR1、CDR2和CDR3序列SEQ ID NO:124、125和126。

在一些实施方案中，VH-CDR3和/或VL-CDR3包括修饰与人EGFR的结合、免疫原性或一些其他特征的一个或多个氨基酸取代。在一些情况下，氨基酸取代是丙氨酸(A)。在一些实施方案中，VH-CDR3包括至少一个丙氨酸取代。在一些实施方案中，丙氨酸取代消融了与人EGFR的结合。

在一些实施方案中，抗EGFR抗体包括VH区和VL区，其中VH区的序列包括与SEQ IDNO:127约80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的序列同一性，并且VL区的序列包括与SEQ ID NO:128约80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的序列同一性。

在一些实施方案中，抗EGFR抗体为全长抗体。在其他实施方案中，抗EGFR抗体是结合片段。在一些情况下，抗EGFR抗体包括抗体或其结合片段、单克隆抗体或其结合片段、嵌合抗体或其结合片段、或人源化抗体或其结合片段。在一些情况下，抗EGFR抗体包括单价Fab、二价Fab’2、单链可变片段(scFv)或其结合片段。

在一些实施方案中，与参考抗体相比，本文所述的抗EGFR抗体具有与人EGFR蛋白的增强的结合。在一些情况下，与参考抗体相比，增强的结合是KD降低至少10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、100％。

在一些实施方案中，本文所述的抗EGFR抗体具有约0.023nM至约3.07nM的EC50。在一些实施方案中，本文所述的抗EGFR抗体具有至少约0.023nM的EC50。在一些实施方案中，本文所述的抗EGFR抗体具有至多约3.07nM的EC50。在一些实施方案中，本文所述的抗EGFR抗体在体外细胞毒性测定中具有约0.023nM至约0.024nM、约0.023nM至约0.036nM、约0.023nM至约0.038nM、约0.023nM至约0.04nM、约0.023nM至约0.059nM、约0.023nM至约0.069nM、约0.023nM至约0.086nM、约0.023nM至约3.07nM、约0.024nM至约0.036nM、约0.024nM至约0.038nM、约0.024nM至约0.04nM、约0.024nM至约0.059nM、约0.024nM至约0.069nM、约0.024nM至约0.086nM、约0.024nM至约3.07nM、约0.036nM至约0.038nM、约0.036nM至约0.04nM、约0.036nM至约0.059nM、约0.036nM至约0.069nM、约0.036nM至约0.086nM、约0.036nM至约3.07nM、约0.038nM至约0.04nM、约0.038nM至约0.059nM、约0.038nM至约0.069nM、约0.038nM至约0.086nM、约0.038nM至约3.07nM、约0.04nM至约0.059nM、约0.04nM至约0.069nM、约0.04nM至约0.086nM、约0.04nM至约3.07nM、约0.059nM至约0.069nM、约0.059nM至约0.086nM、约0.059nM至约3.07nM、约0.069nM至约0.086nM、约0.069nM至约3.07nM或约0.086nM至约3.07nM的EC50，以确定ADCC活性，例如，使用NK92/CD16a176V效应细胞并靶向癌细胞，诸如来自外阴鳞状细胞癌的转移性癌细胞，例如A431细胞。

在一些实施方案中，本文所述的第一抗EGFR抗体抑制第二抗EGFR抗体或其片段与人EGFR蛋白的结合。在一些实施方案中，第一抗EGFR抗体将结合抑制0％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、95％、100％。

4.4双特异性抗体

在一些实施方案中，双特异性抗体包括对CD47具有特异性的第一靶向部分和对肿瘤细胞具有特异性的第二靶向部分。在一些实施方案中，第二靶向部分对由肿瘤细胞表达的抗原具有特异性。在一些情况下，由肿瘤细胞表达的抗原是肿瘤相关抗原(TAA)。在一些实施方案中，肿瘤相关抗原包括但不限于：ACVR2、HER2/neu、CD20、EGFR、CD3、CD22、CD80、CD23、EpCAM、CD2、CD3、CD19、间皮素、Mum-1、β-连环蛋白、CDK4、p53、Ras、CDC27、α-辅肌动蛋白-4、TRP1/gp75、Wilm、EphA3、前列腺酸性磷酸酶(PAP)、甲胎蛋白(AFP)、9D7、细胞周期蛋白-B₁、癌胚抗原(CEA)、gp100/pmel17、BRCA1/2、VEGFR、TGF-βRII、MUC-1、上皮肿瘤抗原(ETA)、酪氨酸酶、黑色素瘤相关抗原(MAGE)、碳酸酐酶IX、细胞毒性T淋巴细胞抗原4、叶酸结合蛋白A-33、前列腺特异性抗原(PSA)、生存素、EGFRvIII、黑色素细胞衍生肽、多种黑色素瘤相关肽、宫颈癌抗原HPV-16-E7、PRAME、SSX-2、CA125、MART、CS-1、BING-4、纤连蛋白、CML66、MC1R、钙激活氯通道2、未成熟层粘连蛋白受体和hTERT。在某些实施方案中，TAA在细胞表面上表达。

在某些实施方案中，本文描述了一种双特异性抗CD47和抗EpCAM抗体或其结合片段。在一些情况下，双特异性抗CD47和抗EpCAM抗体包括至少一个特异性地结合至CD47的靶向部分和至少一个特异性地结合至EpCAM的靶向部分。在一些情况下，双特异性抗体为二价、三价、四价或多于四价。在一些情况下，双特异性抗体具有多于一个的与CD47结合的结合位点。在一些情况下，双特异性抗体具有多于一个的与EpCAM结合的结合位点。在一些情况下，双特异性抗体或其结合片段是双特异性抗体缀合物、杂交双特异性IgG、仅可变结构域双特异性抗体、CH1/CL融合蛋白、Fab融合蛋白、非免疫球蛋白融合蛋白、Fc修饰的IgG、附加的和Fc修饰的IgG、修饰的Fc和CH3融合蛋白、附加的IgG-HC融合蛋白、Fc融合蛋白、CH3融合蛋白、IgE/IgM CH2融合蛋白或F(ab’)2融合蛋白。

在某些实施方案中，本文描述了双特异性抗CD47和抗EGFR抗体或其结合片段。在一些情况下，双特异性抗CD47和抗EGFR抗体包括至少一个特异性地结合至CD47的靶向部分和至少一个特异性地结合至EGFR的靶向部分。在一些情况下，双特异性抗体为二价、三价、四价或多于四价。在一些情况下，双特异性抗体具有多于一个的与CD47结合的结合位点。在一些情况下，双特异性抗体具有多于一个的与EGFR结合的结合位点。在一些情况下，双特异性抗体或其结合片段是双特异性抗体缀合物、杂交双特异性IgG、仅可变结构域双特异性抗体、CH1/CL融合蛋白、Fab融合蛋白、非免疫球蛋白融合蛋白、Fc修饰的IgG、附加的和Fc修饰的IgG、修饰的Fc和CH3融合蛋白、附加的IgG-HC融合蛋白、Fc融合蛋白、CH3融合蛋白、IgE/IgM CH2融合蛋白或F(ab’)2融合蛋白。

在一些情况下，双特异性抗体还包括在框架区中(例如在CH1结构域、CH2结构域、CH3结构域、铰链区或其组合中)的一个或多个突变。在一些情况下，一个或多个突变是为了稳定抗体和/或增加半衰期。在一些情况下，一个或多个突变是为了调节Fc受体相互作用、增加ADCC或抗体依赖性细胞吞噬作用(ADCP)。在其他情况下，一个或多个突变是为了减少或消除Fc效应子功能，诸如FcγR结合、ADCC或ADCP。在另外的情况下，一个或多个突变是为了调节糖基化。在一些情况下，一个或多个突变增强稳定性、增加半衰期、减少糖基化和/或调节Fc受体相互作用，例如增加或减少ADCC和/或ADCP。

在一些情况下，双特异性抗体包括IgG1框架。在一些实施方案中，抗CD47或抗EpCAM或EGFR抗体的恒定区在一个或多个氨基酸位置处被修饰以改变Fc受体相互作用。调节或改变Fc受体相互作用的示例性残基包括但不限于G236、S239、T250、M252、S254、T256、K326、A330、I332、E333A、M428、H433或N434(Kabat编号；Kabat等人，1991Sequences ofProteins of Immunological Interest的EU索引)。在一些情况下，突变包括G236A、S239D、T250Q、M252Y、S254T、T256E、K326W、A330L、I332E、E333A、E333S、M428L、H433K或N434F。

在一些实施方案中，改变Fc受体相互作用的在IgG1恒定区的一个或多个氨基酸位置处的修饰导致增加的半衰期。在一些情况下，在一个或多个氨基酸位置处的修饰包括T250、M252、S254、T256、M428、H433、N434或其组合；例如，包括T250Q/M428L或M252Y/S254T/T256E和H433K/N434F。

在一些实施方案中，上述双特异性抗体包括杵臼(KIH)形式。在一些情况下，KIH位于Fc区，其中CH3结构域内的残基基于WO96/027011；Ridgway等人，Protein Eng.9(1996)617-621；或Merchant等人，Nat.Biotechnol.16(1998)677-681的公开内容被任选地修饰。在一些情况下，CH3结构域对中的一个是“杵”链，而另一个是“臼”链，并且任选地引入额外的二硫键以进一步稳定抗体和/或增加产量。

在一些情况下，双特异性抗体是IgG1，并且“杵”链的CH3结构域包括T366W突变，并且“臼”链的CH3结构域包括突变T366S、L368A和Y407V。在一些情况下，“杵”链的CH3结构域还包括Y349C突变，其与“臼”链的CH3结构域中的E356C或S354C形成链间二硫键。

在一些情况下，“杵”链的CH3结构域包括R409D和K370E突变，并且“臼”链的CH3结构域包括D399K和E357K。在一些情况下，“杵”链的CH3结构域还包括T366W突变，并且“臼”链的CH3结构域还包括突变T366S、L368A和Y407V。

在一些实施方案中，改变Fc受体相互作用的在IgG1恒定区中的一个或多个氨基酸位置处的修饰导致增加的ADCC和/或ADCP。在一些情况下，在一个或多个氨基酸位置处的修饰包括S239、K326、A330、I332、E333或其组合。在一些情况下，用于增加的ADCC和/或ADCP的在一个或多个氨基酸位置处的修饰包括，例如，E333A、S239D/A330L/I332E或K326W/E333S。在一些情况下，用于增加的ADCC的在一个或多个氨基酸位置处的修饰包括S239D/A330L/I332E。在一些情况下，用于增加的ADCP的在一个或多个氨基酸位置处的修饰包括K326W/E333S。

在一些实施方案中，IgG1恒定区是非岩藻糖基化的(afucosylated)。在其他实施方案中，IgG1在不能进行岩藻糖基化的细胞中表达。在一些实施方案中，细胞是哺乳动物细胞，诸如中国仓鼠卵巢细胞系。在一些实施方案中，细胞不能表达岩藻糖基转移酶8(FUT8)。

在一些实施方案中，双特异性抗体包括IgG2框架。在一些情况下，IgG2框架中的一个或多个氨基酸位置被修饰以改变Fc受体相互作用，例如，以增加ADCC和/或CDC。在一些情况下，IgG2框架中的一个或多个氨基酸位置被修饰，以稳定抗体和/或增加半衰期。在一些情况下，IgG2框架中的一个或多个氨基酸位置被修饰以调节糖基化。在一些情况下，IgG2恒定区是非岩藻糖基化的。在一些实施方案中，IgG2恒定区在不能进行岩藻糖基化的细胞中表达。在一些实施方案中，细胞是哺乳动物细胞，诸如中国仓鼠卵巢细胞系。在一些实施方案中，细胞不能表达岩藻糖基转移酶8(FUT8)。

在一些实施方案中，双特异性抗体包括IgG3框架。在一些情况下，IgG3框架中的一个或多个氨基酸位置被修饰以改变Fc受体相互作用，例如，以增加ADCC和/或ADCP。在一些情况下，IgG3框架中的一个或多个氨基酸位置被修饰，以稳定抗体和/或增加半衰期。在一些情况下，IgG3框架中的一个或多个氨基酸位置被修饰以调节糖基化。在一些情况下，抗体的恒定区在氨基酸R435处被修饰以延长半衰期，例如R435H(Kabat编号)。在一些情况下，恒定区在残基N297处被去糖基化。在一些情况下，IgG3恒定区在不能进行岩藻糖基化的细胞中表达。在一些实施方案中，细胞是哺乳动物细胞，诸如中国仓鼠卵巢细胞系。在一些实施方案中，细胞不能表达岩藻糖基转移酶8(FUT8)。

在一些实施方案中，双特异性抗体包括IgG4框架。在一些情况下，IgG4框架中的一个或多个氨基酸位置被修饰以改变Fc受体相互作用，例如，以增加ADCC和/或ADCP。例如，在一些实施方案中，增加ADCC的突变包括S239D、I332E和A330L(氨基酸编号根据Kabat等人的EU索引)，诸如美国专利第8,093,359号中所述。在一些情况下，IgG4框架中的一个或多个氨基酸位置被修饰，以稳定抗体和/或增加半衰期。在一些情况下，IgG4框架中的一个或多个氨基酸位置被修饰以调节糖基化。在一些情况下，恒定区在铰链区处被修饰，以防止或减少链交换。在一些情况下，被修饰的氨基酸是S228(例如，S228P)。在一些情况下，IgG4恒定区在不能进行岩藻糖基化的细胞中表达。在一些实施方案中，细胞是哺乳动物细胞，如中国仓鼠卵巢细胞系。在一些实施方案中，细胞不能表达岩藻糖基转移酶8(FUT8)。

在一些实施方案中，人IgG恒定区被修饰以改变其ADCC和/或ADCP活性，例如，用Natsume等人，2008Cancer Res，68(10):3863-72；Idusogie等人，2001J Immunol，166(4):2571-5；Moore等人，2010mAbs，2(2):181-189；Lazar等人，2006PNAS，103(11):4005-4010，Shields等人，2001JBC，276(9):6591-6604；Stavenhagen等人，2007，Cancer Res，67(18):8882-8890；Stavenhagen等人，2008Advan.Enzyme Regul，48:152-164；Alegre等人，1992JImmunol，148:3461-3468中描述的；在Kaneko和Niwa，2011Biodrugs，25(1):1-11中综述的氨基酸修饰。

在一些实施方案中，人IgG恒定区被修饰以诱导异二聚化。例如，在CH3结构域内在Thr366处具有氨基酸修饰(其当被更大体积的氨基酸例如Trp(T366W)取代时)能够优先与在位置Thr366、Leu368和Tyr407处具有较小体积氨基酸的氨基酸修饰的第二CH3结构域配对，例如分别为Ser、Ala和Val(T366S/L368A/Y407V)。在一些情况下，经由CH3修饰的异二聚化通过二硫键的引入而进一步稳定，例如通过在相反的CH3结构域上将Ser354改变为Cys(S354C)并将Y349改变为Cys(Y349C)(综述于Carter，2001Journal of ImmunologicalMethods，248:7-15)。

在一些情况下，本文所述的双特异性抗体具有减少的糖基化或缺乏糖基化，但在氨基酸Asn297(Kabat编号)处未被修饰。在这些情况下，糖基化例如通过在缺乏翻译后糖基化能力的宿主细胞中产生抗体来消除，所述宿主细胞为例如细菌或酵母衍生系统或经修饰的哺乳动物细胞表达系统。在一些实施方案中，细胞是哺乳动物细胞，诸如中国仓鼠卵巢细胞系。在一些实施方案中，细胞不能表达岩藻糖基转移酶8(FUT8)。在某些方面，此类系统是无细胞表达系统。

在一些实施方案中，包含结合CD47的第一组分和结合EpCAM的第二组分的双特异性蛋白对它们相应的靶抗原具有不同的亲和力(KD)，如通过表面等离子体共振测量的。

在一些情况下，第一组分以约0.1nM至约100nM、约0.15nM至约95nM、约0.2nM至约90nM、0.25nM至约85nM、约0.3nM至约80nM、约0.35nM至约75nM、约0.4nM至约70nM、约0.5nM至约70nM、约0.6nM至约60nM、约0.7nM至约50nM、约0.8nM至约40nM、约0.9nM至约30nM、约1nM至约20nM、约1.5nM至约10nM、约0.01nM至约25nM、约0.01nM至约20nM、约0.01nM至约10nM、约0.01nM至约5nM、约0.02nM至约20nM、约0.04nM至约20nM、约0.06nM至约20nM、约0.08nM至约20nM或约0.1nM至约20nM的KD结合至人CD47。

在一些情况下，第二组分以约0.1nM至约500nM、约0.2nM至约500nM、约1nM至约300nM、约5nM至约200nM或约10nM至约150nM的KD结合至人EpCAM。

4.5人源化

在一些实施方案中，双特异性抗体及其结合片段源自非人(例如兔或小鼠)抗体。在一些情况下，非人抗体的人源化形式含有维持原始抗原特异性的最小非人序列。在一些情况下，人源化抗体是人免疫球蛋白(受体抗体)，其中受体抗体的CDR被非人免疫球蛋白(供体抗体)诸如大鼠、兔或小鼠供体的CDR的残基代替，所述非人免疫球蛋白具有期望的特异性、亲和力、亲合力(avidity)、结合动力学和/或能力。在一些情况下，人免疫球蛋白的一个或多个框架区(FR)残基被供体抗体的相应非人残基代替。

4.6与靶细胞结合的双特异性抗体

在一些实施方案中，包含结合CD47的第一组分和结合EpCAM的第二组分的本公开的双特异性抗体以与仅与CD47或EpCAM中的一种二价的抗体对细胞的结合亲和力相比高至少2-50倍、10-100倍、2倍、5倍、10倍、25倍、50倍或100倍或者20-50％、50-100％、20％、25％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或100％或更高的亲和力(例如，优先结合)结合到在其表面上表达双特异性蛋白的靶抗原的细胞。

在一些实施方案中，本文提供的双特异性蛋白与在其表面上表达比CD47更高水平的EpCAM的靶细胞结合。例如，靶细胞表面上EpCAM与CD47蛋白表达的比率为约1、1.5、2.0、2.5、5、10、15、20、25、50、100或大于200，如通过流式细胞术测量的。

在一些实施方案中，本文提供的双特异性蛋白与在其表面上表达比EpCAM更高水平的CD47的靶细胞结合。例如，靶细胞表面上CD47与EpCAM蛋白表达的比率为约1、1.5、2.0、2.5、5、10、15、20、50、100或大于200，如通过流式细胞术测量的。

在一些实施方案中，本文提供的双特异性蛋白与在其表面上表达相等水平的CD47和EpCAM的靶细胞结合。例如，在靶细胞表面上CD47与EpCAM蛋白表达的比率为约1，如通过流式细胞术测量的。

在一些情况下，细胞表达约35,000个CD47蛋白至约250,000个CD47蛋白。在一些情况下，细胞表达至少约35,000个CD47蛋白。在一些情况下，细胞表达至多约250,000个CD47蛋白。在一些情况下，细胞表达约35,000个CD47蛋白至约40,000个CD47蛋白、约35,000个CD47蛋白至约45,000个CD47蛋白、约35,000个CD47蛋白至约60,000个CD47蛋白、约35,000个CD47蛋白至约100,000个CD47蛋白、约35,000个CD47蛋白至约150,000个CD47蛋白、约35,000个CD47蛋白至约250,000个CD47蛋白、约40,000个CD47蛋白至约45,000个CD47蛋白、约40,000个CD47蛋白至约60,000个CD47蛋白、约40,000个CD47蛋白至约120,000个CD47蛋白、约40,000个CD47蛋白至约150,000个CD47蛋白、约40,000个CD47蛋白至约250,000个CD47蛋白、约45,000个CD47蛋白至约60,000个CD47蛋白、约45,000个CD47蛋白至约120,000个CD47蛋白、约45,000个CD47蛋白至约150,000个CD47蛋白、约45,000个CD47蛋白至约250,000个CD47蛋白、约60,000个CD47蛋白至约120,000个CD47蛋白、约60,000个CD47蛋白至约150,000个CD47蛋白、约60,000个CD47蛋白至约250,000个CD47蛋白、约120,000个CD47蛋白至约150,000个CD47蛋白、约120,000个CD47蛋白至约250,000个CD47蛋白或约150,000个CD47蛋白至约250,000个CD47蛋白。在一些情况下，CD47蛋白在细胞的表面上表达。在一些情况下，细胞是肿瘤细胞。在一些情况下，细胞来源于胰腺导管腺癌、卵巢透明细胞腺癌、结肠腺癌、肺腺癌、卵巢腺癌或外阴鳞状细胞癌。在一些情况下，通过流式细胞术来测量在细胞上表达的CD47蛋白的数量。在一些情况下，通过定量流式细胞术来测量在细胞上表达的CD47蛋白的数量。

在一些情况下，细胞表达约35,000个EpCAM蛋白至约2×10⁷个EpCAM蛋白。在一些情况下，细胞表达至少约35,000个EpCAM蛋白。在一些情况下，细胞表达至多约2×10⁷个EpCAM蛋白。在一些情况下，细胞表达约35,000个EpCAM蛋白至约85,000个EpCAM蛋白、约35,000个EpCAM蛋白至约170,000个EpCAM蛋白、约35,000个EpCAM蛋白至约300,000个EpCAM蛋白、约35,000个EpCAM蛋白至约400,000个EpCAM蛋白、约35,000个EpCAM蛋白至约650,000个EpCAM蛋白、约35,000个EpCAM蛋白至约750,000个EpCAM蛋白、约35,000个EpCAM蛋白至约1,500,000个EpCAM蛋白、约35,000个EpCAM蛋白至约1,900,000个EpCAM蛋白、约35,000个EpCAM蛋白至约4×10⁶个EpCAM蛋白、约35,000个EpCAM蛋白至约6×10⁶个EpCAM蛋白、约35,000个EpCAM蛋白至约7×10⁶个EpCAM蛋白、约35,000个EpCAM蛋白至约15×10⁶个EpCAM蛋白、约35,000个EpCAM蛋白至约2×10⁷个EpCAM蛋白、约85,000个EpCAM蛋白至约170,000个EpCAM蛋白、约85,000个EpCAM蛋白至约300,000个EpCAM蛋白、约85,000个EpCAM蛋白至约400,000个EpCAM蛋白、约85,000个EpCAM蛋白至约650,000个EpCAM蛋白、约85,000个EpCAM蛋白至约750,000个EpCAM蛋白、约85,000个EpCAM蛋白至约1,500,000个EpCAM蛋白、约85,000个EpCAM蛋白至约1,900,000个EpCAM蛋白、约85,000个EpCAM蛋白至约4×10⁶个EpCAM蛋白、约85,000个EpCAM蛋白至约6×10⁶个EpCAM蛋白、约85,000个EpCAM蛋白至约7×10⁶个EpCAM蛋白、约85,000个EpCAM蛋白至约15×10⁶个EpCAM蛋白、约85,000个EpCAM蛋白至约2×10⁷个EpCAM蛋白、约170,000个EpCAM蛋白至约300,000个EpCAM蛋白、约170,000个EpCAM蛋白至约400,000个EpCAM蛋白、约170,000个EpCAM蛋白至约650,000个EpCAM蛋白、约170,000个EpCAM蛋白至约750,000个EpCAM蛋白、约170,000个EpCAM蛋白至约1,500,000个EpCAM蛋白、约170,000个EpCAM蛋白至约1,900,000个EpCAM蛋白、约170,000个EpCAM蛋白至约4×10⁶个EpCAM蛋白、约170,000个EpCAM蛋白至约6×10⁶个EpCAM蛋白、约170,000个EpCAM蛋白至约7×10⁶个EpCAM蛋白、约170,000个EpCAM蛋白至约15×10⁶个EpCAM蛋白、约170,000个EpCAM蛋白至约2×10⁷个EpCAM蛋白、约300,000个EpCAM蛋白至约400,000个EpCAM蛋白、约300,000个EpCAM蛋白至约650,000个EpCAM蛋白、约300,000个EpCAM蛋白至约750,000个EpCAM蛋白、约300,000个EpCAM蛋白至约1,500,000个EpCAM蛋白、约300,000个EpCAM蛋白至约1,900,000个EpCAM蛋白、约300,000个EpCAM蛋白至约4×10⁶个EpCAM蛋白、约300,000个EpCAM蛋白至约6×10⁶个EpCAM蛋白、约300,000个EpCAM蛋白至约7×10⁶个EpCAM蛋白、约300,000个EpCAM蛋白至约15×10⁶个EpCAM蛋白、约300,000个EpCAM蛋白至约2×10⁷个EpCAM蛋白、约400,000个EpCAM蛋白至约650,000个EpCAM蛋白、约400,000个EpCAM蛋白至约750,000个EpCAM蛋白、约400,000个EpCAM蛋白至约1,500,000个EpCAM蛋白、约400,000个EpCAM蛋白至约1,900,000个EpCAM蛋白、约400,000个EpCAM蛋白至约4×10⁶个EpCAM蛋白、约400,000个EpCAM蛋白至约6×10⁶个EpCAM蛋白、约400,000个EpCAM蛋白至约7×10⁶个EpCAM蛋白、约400,000个EpCAM蛋白至约15×10⁶个EpCAM蛋白、约400,000个EpCAM蛋白至约2×10⁷个EpCAM蛋白、约650,000个EpCAM蛋白至约750,000个EpCAM蛋白、约650,000个EpCAM蛋白至约1,500,000个EpCAM蛋白、约650,000个EpCAM蛋白至约1,900,000个EpCAM蛋白、约650,000个EpCAM蛋白至约4×10⁶个EpCAM蛋白、约650,000个EpCAM蛋白至约6×10⁶个EpCAM蛋白、约650,000个EpCAM蛋白至约7×10⁶个EpCAM蛋白、约650,000个EpCAM蛋白至约15×10⁶个EpCAM蛋白、约650,000个EpCAM蛋白至约2×10⁷个EpCAM蛋白、约750,000个EpCAM蛋白至约1,500,000个EpCAM蛋白、约750,000个EpCAM蛋白至约1,900,000个EpCAM蛋白、约750,000个EpCAM蛋白至约4×10⁶个EpCAM蛋白、约750,000个EpCAM蛋白至约6×10⁶个EpCAM蛋白、约750,000个EpCAM蛋白至约7×10⁶个EpCAM蛋白、约750,000个EpCAM蛋白至约15×10⁶个EpCAM蛋白、约750,000个EpCAM蛋白至约2×10⁷个EpCAM蛋白、约1,500,000个EpCAM蛋白至约1,900,000个EpCAM蛋白、约1,500,000个EpCAM蛋白至约4×10⁶个EpCAM蛋白、约1,500,000个EpCAM蛋白至约6×10⁶个EpCAM蛋白、约1,500,000个EpCAM蛋白至约7×10⁶个EpCAM蛋白、约1,500,000个EpCAM蛋白至约15×10⁶个EpCAM蛋白、约1,500,000个EpCAM蛋白至约2×10⁷个EpCAM蛋白、约1,900,000个EpCAM蛋白至约4×10⁶个EpCAM蛋白、约1,900,000个EpCAM蛋白至约6×10⁶个EpCAM蛋白、约1,900,000个EpCAM蛋白至约7×10⁶个EpCAM蛋白、约1,900,000个EpCAM蛋白至约15×10⁶个EpCAM蛋白、约1,900,000个EpCAM蛋白至约2×10⁷个EpCAM蛋白、约4×10⁶个EpCAM蛋白至约6×10⁶个EpCAM蛋白、约4×10⁶个EpCAM蛋白至约7×10⁶个EpCAM蛋白、约4×10⁶个EpCAM蛋白至约15×10⁶个EpCAM蛋白、约4×10⁶个EpCAM蛋白至约2×10⁷个EpCAM蛋白、约6×10⁶个EpCAM蛋白至约7×10⁶个EpCAM蛋白、约6×10⁶个EpCAM蛋白至约15×10⁶个EpCAM蛋白、约6×10⁶个EpCAM蛋白至约2×10⁷个EpCAM蛋白或约15×10⁶个EpCAM蛋白至约2×10⁷个EpCAM蛋白。在一些情况下，EpCAM蛋白在细胞的表面上表达。在一些情况下，细胞是肿瘤细胞。在一些情况下，细胞来源于胰腺导管腺癌、卵巢透明细胞腺癌、结肠腺癌、肺腺癌、卵巢腺癌或外阴鳞状细胞癌。在一些情况下，通过流式细胞术来测量在细胞上表达的EpCAM蛋白的数量。在一些情况下，通过定量流式细胞术来测量在细胞上表达的EpCAM蛋白的数量。

在一些实施方案中，与具有一个或多个CD47结合结构域的二价蛋白和/或具有一个或多个EpCAM结合结构域的二价蛋白相比，具有CD47结合结构域和EpCAM结合结构域的双特异性蛋白对表达CD47和EpCAM的细胞具有增强的亲和力。在一些情况下，双特异性蛋白对表达CD47的细胞具有的亲和力比结合至CD47的二价蛋白或结合至EpCAM的二价蛋白高1.5、2、3、4、5或10倍。在一些实施方案中，与具有CD47结合结构域的二价蛋白相比，具有CD47结合结构域和EpCAM结合结构域的双特异性蛋白对表达比EpCAM更高水平的CD47的细胞具有增强的亲和力。在一些情况下，与结合至CD47的二价蛋白相比，双特异性蛋白对EpCAM表达高于CD47表达的细胞具有1.5、2、3、4、5或10倍高的亲和力。

在一些实施方案中，与CD47 BMK-1、CD47 BMK-2或CD47 BMK-4相比，具有CD47结合结构域和EpCAM结合结构域的双特异性抗体具有降低的红细胞(RBC)结合。在一些情况下，与CD47 BMK-1相比，降低的RBC结合是至少10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％或100％的降低。在一些情况下，与CD47 BMK-2相比，降低的RBC结合是至少10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％或100％的降低。在一些情况下，与CD47BMK-4相比，降低的RBC结合是至少10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％或100％的降低。

在一些实施方案中，包含结合CD47的第一组分和结合EGFR的第二组分的本公开的双特异性抗体以与仅与CD47或EGFR中的一种二价的抗体对细胞的结合亲和力相比高至少2-50倍、10-100倍、2倍、5倍、10倍、25倍、50倍或100倍或者20-50％、50-100％、20％、25％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或100％或更高的亲和力(例如，优先结合)结合到在其表面上表达双特异性蛋白的靶抗原的细胞。

在一些实施方案中，本文提供的双特异性蛋白与在其表面上表达比CD47更高水平的EGFR的靶细胞结合。例如，靶细胞表面上EGFR与CD47蛋白表达的比率为约1、1.5、2.0、2.5、5、10、15、20、25、50、100或大于200，如通过流式细胞术测量的。

在一些实施方案中，本文提供的双特异性蛋白与在其表面上表达比EGFR更高水平的CD47的靶细胞结合。例如，靶细胞表面上CD47与EGFR蛋白表达的比率为约1、1.5、2.0、2.5、5、10、15、20、50、100或大于200，如通过流式细胞术测量的。

在一些实施方案中，本文提供的双特异性蛋白与在其表面上表达相等水平的CD47和EGFR的靶细胞结合。例如，靶细胞表面上CD47与EGFR蛋白表达的比率为约1，如通过流式细胞术测量的。

在一些情况下，细胞表达约35,000个CD47蛋白至约250,000个CD47蛋白。在一些情况下，细胞表达至少约35,000个CD47蛋白。在一些情况下，细胞表达至多约250,000个CD47蛋白。在一些情况下，细胞表达约35,000个CD47蛋白至约40,000个CD47蛋白、约35,000个CD47蛋白至约45,000个CD47蛋白、约35,000个CD47蛋白至约60,000个CD47蛋白、约35,000个CD47蛋白至约100,000个CD47蛋白、约35,000个CD47蛋白至约150,000个CD47蛋白、约35,000个CD47蛋白至约250,000个CD47蛋白、约40,000个CD47蛋白至约45,000个CD47蛋白、约40,000个CD47蛋白至约60,000个CD47蛋白、约40,000个CD47蛋白至约120,000个CD47蛋白、约40,000个CD47蛋白至约150,000个CD47蛋白、约40,000个CD47蛋白至约250,000个CD47蛋白、约45,000个CD47蛋白至约60,000个CD47蛋白、约45,000个CD47蛋白至约120,000个CD47蛋白、约45,000个CD47蛋白至约150,000个CD47蛋白、约45,000个CD47蛋白至约250,000个CD47蛋白、约60,000个CD47蛋白至约120,000个CD47蛋白、约60,000个CD47蛋白至约150,000个CD47蛋白、约60,000个CD47蛋白至约250,000个CD47蛋白、约120,000个CD47蛋白至约150,000个CD47蛋白、约120,000个CD47蛋白至约250,000个CD47蛋白或约150,000个CD47蛋白至约250,000个CD47蛋白。在一些情况下，CD47蛋白在细胞的表面上表达。在一些情况下，细胞是肿瘤细胞。在一些情况下，细胞来源于胰腺导管腺癌、卵巢透明细胞腺癌、结肠腺癌、肺腺癌、卵巢腺癌或外阴鳞状细胞癌。在一些情况下，通过流式细胞术来测量在细胞上表达的CD47蛋白的数量。在一些情况下，通过定量流式细胞术来测量在细胞上表达的CD47蛋白的数量。

在一些情况下，细胞表达约35,000个EGFR蛋白至约2×10⁷个EGFR蛋白。在一些情况下，细胞表达至少约35,000个EGFR蛋白。在一些情况下，细胞表达至多约2×10⁷个EGFR蛋白。在一些情况下，细胞表达约35,000个EGFR蛋白至约85,000个EGFR蛋白、约35,000个EGFR蛋白至约170,000个EGFR蛋白、约35,000个EGFR蛋白至约300,000个EGFR蛋白、约35,000个EGFR蛋白至约400,000个EGFR蛋白、约35,000个EGFR蛋白至约650,000个EGFR蛋白、约35,000个EGFR蛋白至约750,000个EGFR蛋白、约35,000个EGFR蛋白至约1,500,000个EGFR蛋白、约35,000个EGFR蛋白至约1,900,000个EGFR蛋白、约35,000个EGFR蛋白至约4×10⁶个EGFR蛋白、约35,000个EGFR蛋白至约6×10⁶个EGFR蛋白、约35,000个EGFR蛋白至约7×10⁶个EGFR蛋白、约35,000个EGFR蛋白至约15×10⁶个EGFR蛋白、约35,000个EGFR蛋白至约2×10⁷个EGFR蛋白、约85,000个EGFR蛋白至约170,000个EGFR蛋白、约85,000个EGFR蛋白至约300,000个EGFR蛋白、约85,000个EGFR蛋白至约400,000个EGFR蛋白、约85,000个EGFR蛋白至约650,000个EGFR蛋白、约85,000个EGFR蛋白至约750,000个EGFR蛋白、约85,000个EGFR蛋白至约1,500,000个EGFR蛋白、约85,000个EGFR蛋白至约1,900,000个EGFR蛋白、约85,000个EGFR蛋白至约4×10⁶个EGFR蛋白、约85,000个EGFR蛋白至约6×10⁶个EGFR蛋白、约85,000个EGFR蛋白至约7×10⁶个EGFR蛋白、约85,000个EGFR蛋白至约15×10⁶个EGFR蛋白、约85,000个EGFR蛋白至约2×10⁷个EGFR蛋白、约170,000个EGFR蛋白至约300,000个EGFR蛋白、约170,000个EGFR蛋白至约400,000个EGFR蛋白、约170,000个EGFR蛋白至约650,000个EGFR蛋白、约170,000个EGFR蛋白至约750,000个EGFR蛋白、约170,000个EGFR蛋白至约1,500,000个EGFR蛋白、约170,000个EGFR蛋白至约1,900,000个EGFR蛋白、约170,000个EGFR蛋白至约4×10⁶个EGFR蛋白、约170,000个EGFR蛋白至约6×10⁶个EGFR蛋白、约170,000个EGFR蛋白至约7×10⁶个EGFR蛋白、约170,000个EGFR蛋白至约15×10⁶个EGFR蛋白、约170,000个EGFR蛋白至约2×10⁷个EGFR蛋白、约300,000个EGFR蛋白至约400,000个EGFR蛋白、约300,000个EGFR蛋白至约650,000个EGFR蛋白、约300,000个EGFR蛋白至约750,000个EGFR蛋白、约300,000个EGFR蛋白至约1,500,000个EGFR蛋白、约300,000个EGFR蛋白至约1,900,000个EGFR蛋白、约300,000个EGFR蛋白至约4×10⁶个EGFR蛋白、约300,000个EGFR蛋白至约6×10⁶个EGFR蛋白、约300,000个EGFR蛋白至约7×10⁶个EGFR蛋白、约300,000个EGFR蛋白至约15×10⁶个EGFR蛋白、约300,000个EGFR蛋白至约2×10⁷个EGFR蛋白、约400,000个EGFR蛋白至约650,000个EGFR蛋白、约400,000个EGFR蛋白至约750,000个EGFR蛋白、约400,000个EGFR蛋白至约1,500,000个EGFR蛋白、约400,000个EGFR蛋白至约1,900,000个EGFR蛋白、约400,000个EGFR蛋白至约4×10⁶个EGFR蛋白、约400,000个EGFR蛋白至约6×10⁶个EGFR蛋白、约400,000个EGFR蛋白至约7×10⁶个EGFR蛋白、约400,000个EGFR蛋白至约15×10⁶个EGFR蛋白、约400,000个EGFR蛋白至约2×10⁷个EGFR蛋白、约650,000个EGFR蛋白至约750,000个EGFR蛋白、约650,000个EGFR蛋白至约1,500,000个EGFR蛋白、约650,000个EGFR蛋白至约1,900,000个EGFR蛋白、约650,000个EGFR蛋白至约4×10⁶个EGFR蛋白、约650,000个EGFR蛋白至约6×10⁶个EGFR蛋白、约650,000个EGFR蛋白至约7×10⁶个EGFR蛋白、约650,000个EGFR蛋白至约15×10⁶个EGFR蛋白、约650,000个EGFR蛋白至约2×10⁷个EGFR蛋白、约750,000个EGFR蛋白至约1,500,000个EGFR蛋白、约750,000个EGFR蛋白至约1,900,000个EGFR蛋白、约750,000个EGFR蛋白至约4×10⁶个EGFR蛋白、约750,000个EGFR蛋白至约6×10⁶个EGFR蛋白、约750,000个EGFR蛋白至约7×10⁶个EGFR蛋白、约750,000个EGFR蛋白至约15×10⁶个EGFR蛋白、约750,000个EGFR蛋白至约2×10⁷个EGFR蛋白、约1,500,000个EGFR蛋白至约1,900,000个EGFR蛋白、约1,500,000个EGFR蛋白至约4×10⁶个EGFR蛋白、约1,500,000个EGFR蛋白至约6×10⁶个EGFR蛋白、约1,500,000个EGFR蛋白至约7×10⁶个EGFR蛋白、约1,500,000个EGFR蛋白至约15×10⁶个EGFR蛋白、约1,500,000个EGFR蛋白至约2×10⁷个EGFR蛋白、约1,900,000个EGFR蛋白至约4×10⁶个EGFR蛋白、约1,900,000个EGFR蛋白至约6×10⁶个EGFR蛋白、约1,900,000个EGFR蛋白至约7×10⁶个EGFR蛋白、约1,900,000个EGFR蛋白至约15×10⁶个EGFR蛋白、约1,900,000个EGFR蛋白至约2×10⁷个EGFR蛋白、约4×10⁶个EGFR蛋白至约6×10⁶个EGFR蛋白、约4×10⁶个EGFR蛋白至约7×10⁶个EGFR蛋白、约4×10⁶个EGFR蛋白至约15×10⁶个EGFR蛋白、约4×10⁶个EGFR蛋白至约2×10⁷个EGFR蛋白、约6×10⁶个EGFR蛋白至约7×10⁶个EGFR蛋白、约6×10⁶个EGFR蛋白至约15×10⁶个EGFR蛋白、约6×10⁶个EGFR蛋白至约2×10⁷个EGFR蛋白或约15×10⁶个EGFR蛋白至约2×10⁷个EGFR蛋白。在一些情况下，EGFR蛋白在细胞的表面上表达。在一些情况下，细胞是肿瘤细胞。在一些情况下，细胞来源于胰腺导管腺癌、卵巢透明细胞腺癌、结肠腺癌、肺腺癌、卵巢腺癌或外阴鳞状细胞癌。在一些情况下，通过流式细胞术来测量在细胞上表达的EGFR蛋白的数量。在一些情况下，通过定量流式细胞术来测量在细胞上表达的EGFR蛋白的数量。

在一些实施方案中，与具有一个或多个CD47结合结构域的二价蛋白和/或具有一个或多个EGFR结合结构域的二价蛋白相比，具有CD47结合结构域和EGFR结合结构域的双特异性蛋白对表达CD47和EGFR的细胞具有增强的亲和力。在一些情况下，双特异性蛋白对表达CD47的细胞的亲和力比结合至CD47的二价蛋白或结合至EGFR的二价蛋白高1.5、2、3、4、5或10倍。在一些实施方案中，与具有CD47结合结构域的二价蛋白相比，具有CD47结合结构域和EGFR结合结构域的双特异性蛋白对表达比EGFR更高水平的CD47的细胞具有增强的亲和力。在一些情况下，与结合至CD47的二价蛋白相比，双特异性蛋白对EGFR表达高于CD47表达的细胞具有1.5、2、3、4、5或10倍高的亲和力。

在一些实施方案中，与CD47 BMK-1或CD47 BMK-4相比，具有CD47结合结构域和EGFR结合结构域的双特异性抗体具有降低的红细胞(RBC)结合。在一些情况下，与CD47BMK-1相比，降低的RBC结合是至少10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％或100％的降低。在一些情况下，与CD47 BMK-4相比，降低的RBC结合是至少10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％或100％的降低。

4.7双特异性抗体对靶细胞的免疫活性

在一些实施方案中，与具有CD47结合结构域的二价抗体和/或具有EpCAM结合结构域的二价抗体相比，具有CD47结合结构域和EpCAM结合结构域的双特异性抗体针对表达CD47的细胞具有更高的免疫活性。在一些情况下，双特异性抗体具有比具有CD47结合结构域的二价抗体和/或具有EpCAM结合结构域的二价抗体高1.5、2、3、4、5或10倍的免疫活性。双特异性抗体的各种免疫活性可以在体外测定诸如ADCC测定和ADCP测定中测量。在一些情况下，双特异性抗体具有比具有CD47结合结构域的二价抗体和/或具有EpCAM结合结构域的二价抗体高1.5、2、3、4、5或10倍的ADCC活性。在一些情况下，双特异性抗体具有比具有CD47结合结构域的二价抗体和/或具有EpCAM结合结构域的二价抗体高1.5、2、3、4、5或10倍的ADCP活性。

在一些实施方案中，与具有CD47结合结构域的二价抗体和/或具有EpCAM结合结构域的二价抗体相比，具有CD47结合结构域和EpCAM结合结构域的双特异性抗体针对表达CD47的细胞具有更高的免疫活性。在一些情况下，双特异性抗体具有比具有CD47结合结构域的二价抗体和/或具有EpCAM结合结构域的二价抗体高10-20％、21-30％、31-40％、41-50％或至少51％的免疫活性。双特异性抗体的各种免疫活性可以在体外测定诸如ADCC测定和ADCP测定中测量。在一些情况下，双特异性抗体具有比具有CD47结合结构域的二价抗体和/或具有EpCAM结合结构域的二价抗体高10-20％、21-30％、31-40％、41-50％或至少51％的ADCC活性。在一些情况下，双特异性抗体具有比具有CD47结合结构域的二价抗体和/或具有EpCAM结合结构域的二价抗体高10-20％、21-30％、31-40％、41-50％或至少51％的ADCP活性。

在一些实施方案中，本文描述了一种双特异性抗体，其包括特异性地结合至CD47的第一靶向部分和特异性地结合至EpCAM的第二靶向部分。在一些情况下，与通过参考抗体CD47 BMK-1的ADCP效应相比，双特异性抗体还包括增强的ADCP效应。在一些情况下，与通过参考抗体CD47 BMK-1的ADCC效应相比，双特异性抗体还包括增强的ADCC效应。在一些情况下，增强的ADCP比参考抗体CD47 BMK-1的ADCP效应高至少2倍、3倍、4倍或更多。在一些情况下，增强的ADCP比参考抗体CD47 BMK-1的CD47 BMK-1效应高至少30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或更多。在一些情况下，增强的ADCC比参考抗体CD47 BMK-1的ADCC效应高至少2倍、3倍、4倍、5倍或更多。在一些情况下，增强的ADCC比参考抗体CD47 BMK-1的ADCC效应高至少30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或更多。

在一些实施方案中，本文描述了双特异性抗体，其包括特异性地结合至CD47的第一组分和特异性地结合至EpCAM的第二组分，其中所述双特异性抗体比包括第一组分或第二组分的二价抗体更有效地介导ADCC，其中ADCC活性使用体外细胞毒性测定来确定。在一些实施方案中，双特异性抗体在体外ADCC测定中介导比包括第一组分或第二组分的二价抗体高至少约5％、至少约10％、至少约20％、至少约30％、至少约40％、至少约50％、至少约75％、至少约100％的最大细胞毒性。在一些实施方案中，双特异性抗体在体外ADCC测定中介导比包括第一组分或第二组分的二价抗体高至少2倍、至少3倍、至少4倍、至少5倍或至少10倍的最大细胞毒性。

在一些实施方案中，本文描述了双特异性抗体，其包括特异性地结合至CD47的第一组分和特异性地结合至EpCAM的第二组分，其中所述双特异性抗体比包括第一组分或第二组分的二价抗体更有效地介导抗体依赖性细胞吞噬作用(ADCP)，其中ADCP活性使用基于体外FACS的吞噬作用测定来确定。在一些实施方案中，双特异性抗体在体外ADCP测定中介导比包括第一组分或第二组分的二价抗体高至少约5％、至少约10％、至少约20％、至少约30％、至少约40％、至少约50％、至少约75％、至少约100％的最大吞噬作用。

在一些情况下，与通过参考抗体CD47 BMK-1的免疫细胞的杀伤相比，双特异性抗体还包括通过免疫细胞的减少的细胞杀伤。在一些情况下，与在参考抗体CD47 BMK-1的存在下的免疫细胞存活力相比，细胞杀伤提高约10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或更高。在一些情况下，免疫细胞是天然杀伤细胞。在一些情况下，免疫细胞是吞噬细胞。在一些情况下，免疫细胞是巨噬细胞。

免疫活性也可以在细胞系衍生的异种移植物测定中测量，其中将转化的细胞注射到小鼠中并形成肿瘤。在一些情况下，与具有相同CD47结合结构域的二价蛋白和/或具有相同EpCAM结合结构域的二价蛋白相比，具有CD47结合结构域和EpCAM结合结构域的双特异性蛋白更大程度地抑制包括表达CD47的细胞的肿瘤的生长。在一些情况下，与具有CD47结合结构域的二价蛋白和/或具有EpCAM结合结构域的二价蛋白相比，双特异性蛋白对异种移植物肿瘤生长表现出1.5、2、3、4、5或10倍高的抑制。

在一些实施方案中，与具有CD47结合结构域的二价抗体和/或具有EGFR结合结构域的二价抗体相比，具有CD47结合结构域和EGFR结合结构域的双特异性抗体针对表达CD47的细胞具有更高的免疫活性。在一些情况下，双特异性抗体具有比具有CD47结合结构域的二价抗体和/或具有EGFR结合结构域的二价抗体高1.5、2、3、4、5或10倍的免疫活性。双特异性抗体的各种免疫活性可以在体外测定诸如ADCC测定和ADCP测定中测量。在一些情况下，双特异性抗体具有比具有CD47结合结构域的二价抗体和/或具有EGFR结合结构域的二价抗体高1.5、2、3、4、5或10倍的ADCC活性。在一些情况下，双特异性抗体具有比具有CD47结合结构域的二价抗体和/或具有EGFR结合结构域的二价抗体高1.5、2、3、4、5或10倍的ADCP活性。

在一些实施方案中，与具有CD47结合结构域的二价抗体和/或具有EGFR结合结构域的二价抗体相比，具有CD47结合结构域和EGFR结合结构域的双特异性抗体针对表达CD47的细胞具有更高的免疫活性。在一些情况下，双特异性抗体具有比具有CD47结合结构域的二价抗体和/或具有EGFR结合结构域的二价抗体高10-20％、21-30％、31-40％、41-50％或至少51％的免疫活性。双特异性抗体的各种免疫活性可以在体外测定诸如ADCC测定和ADCP测定中测量。在一些情况下，双特异性抗体具有比具有CD47结合结构域的二价抗体和/或具有EGFR结合结构域的二价抗体高10-20％、21-30％、31-40％、41-50％或至少51％的ADCC活性。在一些情况下，双特异性抗体具有比具有CD47结合结构域的二价抗体和/或具有EGFR结合结构域的二价抗体高10-20％、21-30％、31-40％、41-50％或至少51％的ADCP活性。

在一些实施方案中，本文描述了一种双特异性抗体，其包括特异性地结合至CD47的第一靶向部分和特异性地结合至EGFR的第二靶向部分。在一些情况下，与通过参考抗体CD47 BMK-1的ADCP效应相比，双特异性抗体还包括增强的ADCP效应。在一些情况下，与通过参考抗体CD47 BMK-1的ADCC效应相比，双特异性抗体还包括增强的ADCC效应。在一些情况下，增强的ADCP比参考抗体CD47 BMK-1的ADCP效应高至少2倍、3倍、4倍或更多。在一些情况下，增强的ADCP比参考抗体CD47 BMK-1的CD47 BMK-1效应高至少30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或更多。在一些情况下，增强的ADCC比参考抗体CD47 BMK-1的ADCC效应高至少2倍、3倍、4倍、5倍或更多。在一些情况下，增强的ADCC比参考抗体CD47 BMK-1的ADCC效应高至少30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或更多。

在一些实施方案中，本文描述了双特异性抗体，其包括特异性地结合至CD47的第一组分和特异性地结合至EGFR的第二组分，其中所述双特异性抗体比包括第一组分或第二组分的二价抗体更有效地介导ADCC，其中ADCC活性使用体外细胞毒性测定来确定。在一些实施方案中，双特异性抗体在体外ADCC测定中介导比包括第一组分或第二组分的二价抗体高至少约5％、至少约10％、至少约20％、至少约30％、至少约40％、至少约50％、至少约75％、至少约100％的最大细胞毒性。在一些实施方案中，双特异性抗体在体外ADCC测定中介导比包括第一组分或第二组分的二价抗体高至少2倍、至少3倍、至少4倍、至少5倍或至少10倍的最大细胞毒性。

在一些实施方案中，本文描述了双特异性抗体，其包括特异性地结合至CD47的第一组分和特异性地结合至EGFR的第二组分，其中所述双特异性抗体比包括第一组分或第二组分的二价抗体更有效地介导抗体依赖性细胞吞噬作用(ADCP)，其中ADCP活性使用基于体外FACS的吞噬作用测定来确定。在一些实施方案中，双特异性抗体在体外ADCP测定中介导比包括第一组分或第二组分的二价抗体高至少约5％、至少约10％、至少约20％、至少约30％、至少约40％、至少约50％、至少约75％、至少约100％的最大吞噬作用。

在一些情况下，与通过参考抗体CD47 BMK-1的免疫细胞的杀伤相比，双特异性抗体还包括通过免疫细胞的减少的细胞杀伤。在一些情况下，与在参考抗体CD47 BMK-1的存在下的免疫细胞存活力相比，细胞杀伤提高约10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或更高。在一些情况下，免疫细胞是天然杀伤细胞。在一些情况下，免疫细胞是吞噬细胞。在一些情况下，免疫细胞是巨噬细胞。

免疫活性也可以在细胞系衍生的异种移植物测定中测量，其中将转化的细胞注射到小鼠中并形成肿瘤。在一些情况下，与具有相同CD47结合结构域的二价蛋白和/或具有相同EGFR结合结构域的二价蛋白相比，具有CD47结合结构域和EGFR结合结构域的双特异性蛋白更大程度地抑制包括表达CD47的细胞的肿瘤的生长。在一些情况下，与具有CD47结合结构域的二价蛋白和/或具有EGFR结合结构域的二价蛋白相比，双特异性蛋白对异种移植物肿瘤生长表现出1.5、2、3、4、5或10倍高的抑制。

如本文所用，“抗体依赖性细胞介导的细胞毒性”和“ADCC”是指细胞介导的反应，其中非特异性细胞毒性细胞(例如，天然杀伤(NK)细胞、嗜中性粒细胞和巨噬细胞)识别靶细胞上的结合抗体并随后引起靶细胞的裂解。在一个实施方案中，靶细胞是人类细胞，诸如肿瘤细胞(例如骨髓瘤细胞)。在一些实施方案中，肿瘤细胞来源于腺癌、淋巴瘤、癌。在一些情况下，腺癌为胰腺导管腺癌、卵巢透明细胞腺癌、结肠腺癌、肺腺癌或卵巢腺癌。在其他情况下，癌是外阴鳞状细胞癌。虽然不希望受任何特定作用机制的束缚，但介导ADCC的细胞毒性细胞通常表达Fc受体(FcR)。用于介导ADCC的细胞NK细胞表达FcγRIII，而单核细胞表达FcγRI、FcγRII、FcγRIII和/或FcγRIV。造血细胞上的FcR表达总结在Ravetch和Kinet，Annu.Rev.Immunol.9:457-92(1991)中。

为了评估本文所述的双特异性蛋白的ADCC活性，在一些实施方案中进行体外ADCC测定，诸如使用癌细胞系的细胞毒性测定。用于此类测定的有用的效应细胞包括但不限于外周血单核细胞(PBMC)和天然杀伤(NK)细胞。可替代地或另外地，在一些实施方案中，在体内(例如在动物中)评估感兴趣的双特异性蛋白的ADCC活性。

“抗体依赖性细胞吞噬作用”或“ADCP”是指吞噬细胞(例如巨噬细胞)消除抗体包被的靶细胞的能力。在一些实施方案中，吞噬作用测定用于测量ADCP效应。

在一些实施方案中，本文所述的结合CD47和EpCAM的双特异性蛋白介导CD47+/EpCAM+癌细胞的指数生长群体中至少50％细胞的抗体依赖性细胞吞噬作用。在一些实施方案中，肿瘤细胞来源于腺癌、淋巴瘤、癌。在一些情况下，腺癌为胰腺导管腺癌、卵巢透明细胞腺癌、结肠腺癌、肺腺癌或卵巢腺癌。

在一些实施方案中，本文所述的结合CD47和EpCAM的双特异性蛋白介导CD47-SIRPα相互作用的抑制。在一些实施方案中，双特异性抗体将SIRPα与CD47的结合抑制至少50％。在一些实施方案中，通过ELISA来测量结合抑制。在一些实施方案中，用CD47+细胞测量结合抑制。在一些实施方案中，CD47+细胞是CD47+EpCAM+肿瘤细胞。

在一些实施方案中，双特异性抗体具有降低的与CD47+非肿瘤细胞诸如红细胞和血小板的结合。在一些情况下，与参考抗体CD47 BMK-1相比，与CD47+非肿瘤细胞的结合降低10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、100％。在一些情况下，通过红细胞(RBC)结合测定或流式细胞术测定来测量与CD47+非肿瘤细胞的双特异性抗体结合。

在一些实施方案中，诱导RBC裂解所需的双特异性抗体的浓度比参考抗体CD47BMK-1的溶血作用高至少2倍、3倍、4倍或更高。

4.8抗体或其结合片段的产生

在一些实施方案中，本文所述的多肽(例如抗体及其结合片段)是使用本领域已知的可用于合成多肽(例如抗体)的任何方法生产的，特别是通过化学合成或通过重组表达，并且优选地通过重组表达技术生产。

在一些情况下，抗体或其结合片段被重组表达，并且编码抗体或其结合片段的核酸由化学合成的寡核苷酸组装(例如，如Kutmeier等人，1994，BioTechniques 17:242中所述)，这涉及合成含有编码抗体的序列部分的重叠寡核苷酸，退火和连接这些寡核苷酸，然后通过PCR扩增连接的寡核苷酸。

可替代地，通过使用可与序列的3’端和5’端杂交的合成引物的PCR扩增或通过使用对特定基因序列具有特异性的寡核苷酸探针的克隆，编码抗体的核酸分子任选地从合适的来源(例如，抗体cDNA文库，或从表达免疫球蛋白的任何组织或细胞产生的cDNA文库)产生。

在一些情况下，抗体或其结合任选地通过对动物(诸如小鼠)进行免疫以产生多克隆抗体来产生，或更优选地，通过产生单克隆抗体来产生，例如，如Kohler和Milstein(1975，Nature 256:495-497)所述，或如Kozbor等人，(1983，Immunology Today 4:72)或Cole等人(1985Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy，Alan R.Liss,Inc.，第77-96页)所述。可替代地，编码抗体的至少Fab部分的克隆任选地通过针对结合特异性抗原的Fab片段的克隆筛选Fab表达文库(例如，如Huse等人，1989，Science 246:1275-1281中所述)，或者通过筛选抗体文库(参见，例如，Clackson等人，1991，Nature 352:624；Hane等人，1997Proc.Natl.Acad.Sci.USA 94:4937)获得。

在一些实施方案中，使用通过将来自适当抗原特异性的小鼠抗体分子的基因与来自适当生物活性的人类抗体分子的基因一起剪接而开发的用于生产“嵌合抗体”的技术(Morrison等人，1984，Proc.Natl.Acad.Sci.81:851-855；Neuberger等人，1984，Nature312:604-608；Takeda等人，1985，Nature 314:452-454)。嵌合抗体是这样的分子：在该分子中，不同的部分来源于不同的动物物种，诸如那些具有来自鼠单克隆抗体的可变区和人免疫球蛋白恒定区的那些。

在一些实施方案中，描述用于生产单链抗体的技术(美国专利第4,694,778号；Bird，1988，Science 242:423-42；Huston等人，1988，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85:5879-5883；和Ward等人，1989，Nature 334:544-54)适于产生单链抗体。通过经由氨基酸桥连接Fv区的重链和轻链片段来形成单链抗体，产生单链多肽。也可以任选地使用在大肠杆菌中装配功能性Fv片段的技术(Skerra等人，1988，Science 242:1038-1041)。

在一些实施方案中，通过常规技术(例如，电穿孔、脂质体转染和磷酸钙沉淀)将包括抗体的核苷酸序列的表达载体或抗体的核苷酸序列转移至宿主细胞，然后通过常规技术培养转染的细胞以产生抗体。在特定实施方案中，抗体的表达由组成型启动子、诱导型启动子或组织特异性启动子调节。

在一些实施方案中，使用多种宿主-表达载体系统来表达本文所述的抗体或其结合片段。此类宿主表达系统代表通过其产生抗体的编码序列并随后纯化的载体，但也代表当用合适的核苷酸编码序列转化或转染时原位表达抗体或其结合片段的细胞。这些包括但不限于用含有抗体或其结合片段编码序列的重组噬菌体DNA、质粒DNA或粘粒DNA表达载体转化的微生物诸如细菌(例如，大肠杆菌和枯草芽孢杆菌)；用含有抗体或其结合片段编码序列的重组酵母表达载体转化的酵母(例如，毕赤酵母(Saccharomyces Pichia))；用含有抗体或其结合片段编码序列的重组病毒表达载体(例如杆状病毒)感染的昆虫细胞系统；用重组病毒表达载体(例如花椰菜花叶病毒(CaMV)和烟草花叶病毒(TMV))感染或用含有抗体或其结合片段编码序列的重组质粒表达载体(例如Ti质粒)转化的植物细胞系统；或携带重组表达构建体的哺乳动物细胞系统(例如COS、CHO、BH、293、293T、3T3细胞)，所述重组表达构建体含有来源于哺乳动物细胞的基因组的启动子(例如，金属硫蛋白启动子)或来源于哺乳动物病毒的启动子(例如，腺病毒晚期启动子；痘苗病毒7.5K启动子)。

对于重组蛋白的长期高产率生产，稳定表达是优选的。在一些情况下，稳定地表达抗体的细胞系任选地被工程改造。用由合适的表达控制元件(例如，启动子、增强子、序列、转录终止子、聚腺苷酸化位点等)和选择性标志物控制的DNA转化宿主细胞，而非使用含有病毒复制起点的表达载体。在引入外源DNA后，允许工程改造的细胞在富集的培养基中生长1-2天，然后转移到选择性培养基中。重组质粒中的选择性标志物赋予对选择的抗性，并允许细胞将质粒稳定地整合到它们的染色体中，并生长以形成病灶(foci)，该病灶继而被克隆并扩增到细胞系中。该方法可以有利地用于对表达抗体或其结合片段的细胞系进行工程改造。

在一些情况下，使用多种选择系统，包括但不限于单纯疱疹病毒胸苷激酶(Wigler等人，1977，Cell 11:223)，次黄嘌呤-鸟嘌呤磷酸核糖转移酶(Szybalska&Szybalski，192，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 48:202)和腺嘌呤磷酸核糖转移酶(Lowy等人，1980，Cell 22:817)基因分别用于tk细胞、hgprt细胞或aprt细胞。此外，抗代谢物抗性被用作选择下列基因的基础：dhfr，其赋予对甲氨蝶呤的抗性(Wigler等人，1980，Proc.Natl.Acad.Sci.USA77:357；O'Hare等人，1981，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 78:1527)；gpt，其赋予对霉酚酸的抗性(Mulligan&Berg，1981，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 78:2072)；neo，其赋予对氨基糖苷类G-418的抗性(Clinical Pharmacy 12:488-505；Wu和Wu，1991，Biotherapy 3:87-95；Tolstoshev，1993，Ann.Rev.Pharmacol.Toxicol.32:573-596；Mulligan，1993，Science260:926-932；以及Morgan和Anderson，1993，Ann.Rev.Biochem.62:191-217；1993年5月，TIB TECH 11(5):155-215)和hygro，其赋予对潮霉素的抗性(Santerre等人，1984，Gene30:147)。可以使用的重组DNA技术领域中公知的方法在Ausubel等人(编著，1993，CurrentProtocols in Molecular Biology，John Wiley&Sons，纽约；Kriegler，1990，GeneTransfer and Expression,实验室手册，Stockton Press，纽约；以及在Dracopoli等人(编著)，1994，Current Protocols in Human Genetics第12和13章，John Wiley&Sons，纽约；Colberre-Garapin等人，1981，J.Mol.Biol.150:1)中描述。

在一些情况下，抗体的表达水平通过载体扩增而增加(有关综述，参见Bebbington和Hentschel，the use of vectors based on gene amplification for the expressionof cloned genes in mammalian cells in DNA cloning，第3卷(Academic Press，纽约，1987))。当表达抗体的载体系统中的标志物是可扩增的时，宿主细胞的培养物中存在的抑制剂水平的增加将增加标志物基因的拷贝数。由于扩增的区域与抗体的核苷酸序列相关，因此抗体的产生也将增加(Crouse等人，1983，Mol.Cell Biol.3:257)。

在一些情况下，使用本领域已知的用于纯化抗体的任何方法，例如，通过色谱法(例如，离子交换、亲和(特别是通过在蛋白质A之后对特异性抗原的亲和)和尺寸柱色谱法)、离心、差速溶解度，或通过用于纯化蛋白质的任何其他标准技术。

4.9表达载体

在一些实施方案中，载体包括来源于真核来源或原核来源的任何合适的载体。在一些情况下，载体由细菌(例如，大肠杆菌)、昆虫、酵母(例如，巴斯德毕赤酵母(Pichiapastoris))、藻类或哺乳动物来源获得。示例性的细菌载体包括pACYC177、pASK75、pBAD载体系列、pBADM载体系列、pET载体系列、pETM载体系列、pGEX载体系列、pHAT、pHAT2、pMal-c2、pMal-p2、pQE载体系列、pRSET A、pRSET B、pRSET C、pTrcHis2系列、pZA31-Luc、pZE21-MCS-1、pFLAG ATS、pFLAG CTS、pFLAG MAC、pFLAG Shift-12c、pTAC-MAT-1、pFLAG CTC或pTAC-MAT-2。

示例性的昆虫载体包括pFastBac1、pFastBac DUAL、pFastBac ET、pFastBac HTa、pFastBac HTb、pFastBac HTc、pFastBac M30a、pFastBact M30b、pFastBac、M30c、pVL1392、pVL1393、pVL1393M10、pVL1393 M11、pVL1393 M12、FLAG载体诸如pPolh-FLAG1或pPolh-MAT2、或MAT载体诸如pPolh-MAT1或pPolh-MAT2。

在一些情况下，酵母载体包括

pDEST^TM 14载体、

pDEST^TM15载体、

pDEST^TM 17载体、

pDEST^TM 24载体、

pYES-DEST52载体、pBAD-DEST49

目标载体、pAO815毕赤酵母载体、pFLD1巴斯德毕赤酵母载体、pGAPZA巴斯德毕赤酵母载体、pGAPZB巴斯德毕赤酵母载体、pGAPZC巴斯德毕赤酵母载体、pPIC3.5K毕赤酵母载体、pPIC6A毕赤酵母载体、pPIC6B毕赤酵母载体、pPIC6C毕赤酵母载体、pPIC9K毕赤酵母载体、pTEF1/Zeo、pYES2酵母载体、pYES2/CT酵母载体、pYES2/NTA酵母载体、pYES2/NT B酵母载体、pYES2/NT C酵母载体或pYES3/CT酵母载体。

示例性的藻类载体包括pChlamy-4载体或MCS载体。

哺乳动物载体的实例包括瞬时表达载体或稳定表达载体。哺乳动物瞬时表达载体可以包括pRK5、p3xFLAG-CMV 8、pFLAG-Myc-CMV 19、pFLAG-Myc-CMV 23、pFLAG-CMV 2、pFLAG-CMV 6a、pFLAG-CMV 6b、pFLAG-CMV 6c、pFLAG-CMV 5.1、pFLAG-CMV 5a、pFLAG-CMV5b、pFLAG-CMV 5c、p3xFLAG-CMV 7.1、pFLAG-CMV 20、p3xFLAG-Myc-CMV 24、pCMV-FLAG-MAT1、pCMV-FLAG-MAT2、pBICEP-CMV 3或pBICEP-CMV 4。哺乳动物稳定表达载体可以包括pFLAG-CMV 3、p3xFLAG-CMV 9、p3xFLAG-CMV 13、pFLAG-Myc-CMV 21、p3xFLAG-Myc-CMV 25、pFLAG-CMV 4、p3xFLAG-CMV 10、p3xFLAG-CMV 14、pFLAG-Myc-CMV 22、p3xFLAG-Myc-CMV26、pBICEP-CMV 1或pBICEP-CMV 2。

在一些情况下，无细胞系统是来自细胞的细胞质组分和/或细胞核组分的混合物，并且用于体外核酸合成。在一些情况下，无细胞系统利用原核细胞组分或真核细胞组分。有时，在基于例如果蝇细胞、非洲爪蟾卵(Xenopus egg)或HeLa细胞的无细胞系统中获得核酸合成。示例性的无细胞系统包括但不限于大肠杆菌S30 Extract系统、大肠杆菌T7S30系统或

4.10宿主细胞

在一些实施方案中，宿主细胞包括任何合适的细胞，诸如天然来源的细胞或遗传修饰的细胞。在一些情况下，宿主细胞是生产宿主细胞。在一些情况下，宿主细胞是真核细胞。在其他情况下，宿主细胞是原核细胞。在一些情况下，真核细胞包括真菌(例如酵母细胞)、动物细胞或植物细胞。在一些情况下，原核细胞是细菌细胞。细菌细胞的实例包括革兰氏阳性细菌或革兰氏阴性细菌。有时，革兰氏阴性细菌是厌氧的、杆状的或两者。

在一些情况下，革兰氏阳性细菌包括放线菌门(Actinobacteria)、厚壁菌门(Firmicutes)或软壁菌门(Tenericutes)。在一些情况下，革兰氏阴性细菌包括产水菌门(Aquificae)、异常球菌-栖热菌门(Deinococcus-Thermus)、纤维杆菌门-绿菌门/拟杆菌门(Fibrobacteres–Chlorobi/Bacteroidetes)(FCB群)、梭杆菌门(Fusobacteria)、芽单胞菌门(Gemmatimonadetes)、硝化螺旋菌门(Nitrospirae)、浮霉菌门-疣微菌门/衣原体门(Planctomycetes–Verrucomicrobia/Chlamydiae)(PVC群)、变形菌门(Proteobacteria)、螺旋体门(Spirochaetes)或互养菌门(Synergistetes)。其他细菌可以是酸杆菌门(Acidobacteria)、绿弯菌门(Chloroflexi)、产金菌门菌(Chrysiogenetes)、蓝细菌(Cyanobacteria)、脱铁杆菌门(Deferribacteres)、网团菌门(Dictyoglomi)、热脱硫杆菌门(Thermodesulfobacteria)或热袍菌门(Thermotogae)。细菌细胞可以是大肠杆菌(Escherichia coli)、肉毒梭菌(Clostridium botulinum)或大肠杆菌(Coli bacilli)。

示例性的原核宿主细胞包括但不限于BL21、Mach1^TM、DH10B^TM、TOP10、DH5α、DH10Bac^TM、OmniMax^TM、MegaX^TM、DH12S^TM、INV110、TOP10F’、INVαF、TOP10/P3、ccdB Survival、PIR1、PIR2、Stbl2^TM、Stbl3^TM或Stbl4^TM。

在一些情况下，动物细胞包括来自脊椎动物或来自无脊椎动物的细胞。在一些情况下，动物细胞包括来自海洋无脊椎动物、鱼、昆虫、两栖动物、爬行动物或哺乳动物的细胞。在一些情况下，真菌细胞包括酵母细胞，诸如啤酒酵母、面包酵母或葡萄酒酵母。

真菌包括子囊菌(ascomycete)，诸如酵母、霉菌、丝状真菌、担子菌或接合菌。在一些情况下，酵母包括子囊菌门(Ascomycota)或担子菌门(Basidiomycota)。在一些情况下，子囊菌门包括酵母亚门(Saccharomycotina)(真正的酵母，例如酿酒酵母(面包酵母))或外囊菌亚门(Taphrinomycotina)(例如裂殖酵母纲(Schizosaccharomycetes)(裂殖酵母))。在一些情况下，担子菌亚门包括伞菌亚门(Agaricomycotina)(例如，银耳纲(Tremellomycetes))或柄锈菌亚门(Pucciniomycotina)(例如，微球黑粉菌纲(Microbotryomycetes)。

示例性的酵母或丝状真菌包括例如以下属：酵母属、裂殖酵母属(Schizosaccharomyces)、假丝酵母属(Candida)、毕赤酵母属(Pichia)、汉逊酵母属(Hansenula)、克鲁维酵母属(Kluyveromyces)、接合酵母属(Zygosaccharomyces)、耶氏酵母属(Yarrowia)、丝孢酵母属(Trichosporon)、红螺菌属(Rhodosporidi)、曲霉属(Aspergillus)、镰孢属(Fusarium)或木霉属(Trichoderma)。示例性的酵母或丝状真菌包括例如以下的物种：酿酒酵母、粟酒裂殖酵母、产朊假丝酵母、博伊丁假丝酵母(Candidaboidini)、白色假丝酵母、热带假丝酵母、类星形假丝酵母(Candida stellatoidea)、光滑假丝酵母、克柔假丝酵母(Candida krusei)、近平滑假丝酵母(Candida parapsilosis)、季也蒙假丝酵母(Candida guilliermondii)、维斯假丝酵母(Candida viswanathii)、葡萄牙假丝酵母(Candida lusitaniae)、胶红酵母(Rhodotorula mucilaginosa)、甲醇毕赤酵母(Pichia metanolica)、安格斯毕赤酵母(Pichia angusta)、巴斯德毕赤酵母、异常毕赤酵母(Pichia anomala)、多形汉逊酵母(Hansenula polymorpha)、乳酸克鲁维酵母(Kluyveromyces lactis)、鲁氏接合酵母(Zygosaccharomyces rouxii)、耶氏解脂酵母(Yarrowia lipolytica)、茁芽丝孢酵母(Trichosporon pullulans)、类酵母红冬孢-黑曲霉(Rhodosporidium toru-Aspergillus niger)、构巢曲霉(Aspergillus nidulans)、泡盛曲霉(Aspergillus awamori)、米曲霉(Aspergillus oryzae)、里氏木霉(Trichodermareesei)、耶氏解脂酵母、布鲁塞尔酒香酵母(Brettanomyces bruxellensis)、星形假丝酵母(Candida stellata)、粟酒裂殖酵母、戴尔有孢圆酵母(Torulaspora delbrueckii)、拜氏接合酵母(Zygosaccharomyces bailii)、新型隐球酵母(Cryptococcus neoformans)、加特隐球酵母(Cryptococcus gattii)或布拉酵母(Saccharomyces boulardii)。

示例性的酵母宿主细胞包括但不限于巴斯德毕赤酵母菌株诸如GS115、KM71H、SMD1168、SMD1168H和X-33；和酿酒酵母酵母菌株诸如INVSc1。

在一些情况下，额外的动物细胞包括从软体动物、节肢动物、环节动物或海绵动物获得的细胞。在一些情况下，额外的动物细胞是哺乳动物细胞，例如来自灵长类、猿、马、牛、猪、犬、猫或啮齿动物的细胞。在一些情况下，啮齿动物包括小鼠、大鼠、仓鼠、沙鼠、仓鼠、灰鼠、花枝鼠(fancy rat)或豚鼠。

示例性的哺乳动物宿主细胞包括，但不限于，293A细胞系、293FT细胞系、293F细胞、293H细胞、CHO DG44细胞、CHO-S细胞、CHO-K1细胞、Expi293F^TM细胞、Flp-In^TM T-REx^TM293细胞系、Flp-In^TM-293细胞系、Flp-In^TM-3T3细胞系、Flp-In^TM-BHK细胞系、Flp-In^TM-CHO细胞系、Flp-In^TM-CV-1细胞系、Flp-In^TM-Jurkat细胞系、FreeStyle^TM 293-F细胞、FreeStyle^TM CHO-S细胞、GripTite^TM 293MSR细胞系、GS-CHO细胞系、HepaRG^TM细胞、T-REx^TMJurkat细胞系、Per.C6细胞、T-REx^TM-293细胞系、T-REx^TM-CHO细胞系和T-REx^TM-HeLa细胞系。

在一些情况下，哺乳动物宿主细胞是稳定的细胞系，或已经将感兴趣的遗传材料并入到其自身基因组中并在许多代细胞分裂之后具有表达遗传材料的产物的能力的细胞系。在一些情况下，哺乳动物宿主细胞是瞬时的细胞系，或尚未将感兴趣的遗传材料并入到其自身基因组中并在许多代细胞分裂后不具有表达遗传材料的产物的能力的细胞系。

示例性的昆虫宿主细胞包括但不限于果蝇S2细胞、Sf9细胞、Sf21细胞、HighFive^TM细胞和

细胞。

在一些情况下，植物细胞包括来自藻类的细胞。示例性的昆虫细胞系包括，但不限于，来自莱茵衣藻(Chlamydomonas reinhardtii)137c或细长聚球藻(Synechococcuselongatus)PPC 7942的菌株。

4.11某些术语

除非另有定义，否则本文使用的所有技术和科学术语具有与所要求保护的主题所属领域的技术人员通常理解的相同的含义。应当理解，前面的一般描述和下面的详细描述仅仅是示例性和解释性的，并且不限制任何要求保护的主题。在本申请中，除非另有特别说明，否则单数的使用包含复数。必须注意的是，如在说明书和所附权利要求书中所使用的，单数形式“一(a)”、“一个(an)”和“所述(the)”包含复数指代物，除非上下文另有明确说明。在本申请中，“或”的使用意指“和/或”，除非另有说明。此外，术语“包括(including)”以及诸如“包括(include)”、“包括(includes)”和“包括(included)”的其他形式的使用不是限制性的。

如本文所使用的，范围和量可以表示为“约”特定值或范围。约也包括确切的量。因此，“约5μL”意指“约5μL”以及“5μL”。通常，术语“约”包括将预期在实验误差范围内的量。

本文使用的章节标题仅用于组织目的，并且不被解释为限制所述的主题。

“抗体”和“免疫球蛋白”(Igs)是具有相同结构特征的糖蛋白。这些术语是同义使用的。在一些情况下，免疫球蛋白的抗原特异性是已知的。

术语“抗体”以最广泛的意义使用，并且覆盖完全组装的抗体、可以结合抗原的抗体片段(例如，Fab、F(ab’)2、Fv、单链抗体、双抗体、抗体嵌合体、杂交抗体、双特异性抗体等)，以及包括前述的重组肽。

如本文所用的术语“单克隆抗体”和“mAb”是指从基本上均一的抗体群体中获得的抗体，即，组成该群体的单独的抗体是相同的，除了可能以少量存在的可能的天然发生的突变。

术语“双特异性抗体”用于指特异性地结合到至少两种不同抗原的抗体，并且包括仅可以特异性地结合至两种不同抗原的抗体，并且还包括可以特异性地结合至两种不同抗原的抗体，并且进一步包括一个或多个特异性地结合至第三、第四或更多抗原的额外结合结构域或者缀合到一个或多个特异性地结合至第三、第四或更多抗原的额外结合结构域。

“天然抗体”和“天然免疫球蛋白”通常是约150,000道尔顿的异四聚体糖蛋白，其由两条相同的轻(L)链和两条相同的重(H)链组成。每条轻链通过一个共价二硫键与重链相连，而在不同免疫球蛋白同种型的重链之间二硫键的数量变化。每条重链和轻链也具有规则间隔的链内二硫键。每条重链在一端具有可变结构域(VH)，随后是多个恒定结构域。每条轻链在一端具有可变结构域(VL)并且在其另一端具有恒定结构域；轻链的恒定结构域与重链的第一恒定结构域对齐，并且轻链的可变结构域与重链的可变结构域对齐。特定的氨基酸残基被认为形成轻链和重链可变结构域之间的界面。

术语“可变”是指可变结构域的某些部分在抗体之间的序列上有很大差异的事实。可变区赋予抗原结合特异性。然而，变异并不是均匀地分布在抗体的整个可变结构域中。它集中在轻链和重链可变结构域两者中被称为互补决定区(CDR)或高变区的三个区段中。可变结构域的更高度保守的部分位于框架(FR)区。天然重链和轻链的可变结构域各自包括四个FR区，主要采用β-折叠片层结构，由三个CDR连接，其形成连接β-折叠片层结构的环并且在一些情况下形成β-折叠片层结构的一部分。每条链中的CDR通过FR区保持紧密结合在一起，并且与来自另一条链的CDR一起，有助于抗体的抗原结合位点的形成(参见，Kabat等人(1991)NIH PubL.第91-3242期，第I卷，第647-669页)。恒定结构域不直接参与抗体与抗原的结合，但表现出各种效应子功能，诸如Fc受体(FcR)结合、抗体参与抗体依赖性细胞毒性、补体依赖性细胞毒性的启动和肥大细胞脱粒。

术语“高变区”当在本文中使用时是指抗体中负责抗原结合的氨基酸残基。高变区包括来自“互补决定区”或“CDR”的氨基酸残基(即轻链可变结构域中的残基24-34(L1)、50-56(L2)和89-97(L3)以及重链可变结构域中的残基31-35(H1)、50-65(H2)和95-102(H3)；Kabat等人(1991)Sequences of Proteins of Immunological Interest，第5版，公共卫生署，美国国立卫生研究院，马里兰州贝塞斯达(Bethesda，Md))和/或来自“高变环”的那些残基(即，轻链可变结构域中的残基26-32(L1)、50-52(L2)和91-96(L3)以及重链可变结构域中的残基(H1)、53-55(H2)和96-101(13))；Clothia和Lesk，(1987)J.Mol.Biol，196:901-917)。“框架”或“FR”残基是除高变区残基之外的可变结构域残基，如本文所认为的。

“抗体片段”包括完整抗体的一部分，优选地完整抗体的抗原结合区或可变区。抗体片段的实例包括Fab、Fab、F(ab’)2和Fv片段；双抗体；线性抗体(Zapata等人，(1995)Protein Eng.10:1057-1062)；单链抗体分子；和由抗体片段形成的双特异性抗体。抗体的木瓜蛋白酶消化产生两个相同的抗原结合片段，被称为“Fab”片段，每个片段具有单个抗原结合位点；和残余的“Fc”片段，其名称反映了其容易结晶的能力。胃蛋白酶处理产生F(ab’)2片段，其具有两个抗原结合位点并且仍然能够交联抗原。

“Fv”是含有完整抗原识别和结合位点的最小抗体片段。该区域由一个重链可变结构域和一个轻链可变结构域的二聚体以紧密的非共价缔合组成。正是在这种构型中，每个可变结构域的三个CDR相互作用，以在VH-VL二聚体的表面上定义抗原结合位点。总的来说，六个CDR赋予针对抗体的抗原结合特异性。然而，即使单个可变结构域(或仅包括对抗原具有特异性的三个CDR的Fv的一半)也具有识别和结合抗原的能力，尽管亲和力低于整个结合位点。

Fab片段还含有轻链的恒定结构域和重链的第一恒定结构域(CH1)。Fab片段与Fab’片段的不同之处在于在重链CH1结构域的羧基末端处增加几个残基，包括来自抗体铰链区的一个或多个半胱氨酸。Fab’-SH是本文中Fab’的名称，其中恒定结构域的半胱氨酸残基带有游离硫醇基团。Fab’片段是通过还原F(ab’)2片段的重链二硫键产生的。抗体片段的其他化学偶联也是已知的。

基于其恒定结构域的氨基酸序列，来自任何脊椎动物物种的抗体(免疫球蛋白)的“轻链”可以被归入两种明显不同的类型中的一种，被称为κ(κ)和λ(λ)。

根据其重链的恒定结构域的氨基酸序列，免疫球蛋白可以被归入不同类别。存在五大类人免疫球蛋白：IgA、IgD、IgE、IgG、IgM和IgY，并且这些中的若干种可以被进一步分为亚类(同种型)，例如IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1和IgA2。对应于不同类别的免疫球蛋白的重链恒定结构域分别被称为α、δ、ε、γ和μ。不同类别的免疫球蛋白的亚基结构和三维构型是熟知的。不同的同种型具有不同的效应子功能。例如，人IgG1和IgG3同种型具有ADCC(抗体依赖性细胞介导的细胞毒性)活性。

在一些情况下，抗体的CDR根据(i)Kabat编号系统(Kabat等人(197)Ann.NYAcad.Sci.190:382-391和Kabat等人(1991)Sequences of Proteins of ImmunologicalInterest，第5版，美国卫生和公众服务部(U.S.Department of Health and HumanServices)，NIH出版，第91-3242期)；或(ii)Chothia编号方案，其在本文中将被称为“Chothia CDR”(参见，例如，Chothia和Lesk，1987，J.Mol.Biol，196:901-917；Al-Lazikani等人，1997，J.Mol.Biol，273:927-948；Chothia等人，1992，J.Mol.Biol，227:799-817；Tramontano A等人，1990，J.Mol.Biol，215(1):175-82；和美国专利第7,709,226号)；或(iii)ImMunoGeneTics(IMGT)编号系统，例如，如Lefranc,M.-P.，1999，The Immunologist，7:132-136和Lefranc,M.-P.等人，1999，Nucleic Acids Res，27:209-212(“IMGT CDR”)中所述；或(iv)MacCallum等人，1996，J.Mol.Biol，262:732-745。还参见，例如，Martin,A.，“Protein Sequence and Structure Analysis of Antibody Variable Domains”，Antibody Engineering，Kontermann和Diibel编著，第31章，第422-439页，Springer-Verlag，柏林(2001)。

关于Kabat编号系统，抗体重链分子内的CDR通常存在于氨基酸位置31至35处，其任选地可以包含一个或两个额外的氨基酸，接着是35(在Kabat编号方案中被称为35A和35B)(CDRl)、氨基酸位置50至65(CDR2)和氨基酸位置95至102(CDR3)。使用Kabat编号系统，抗体轻链分子内的CDR通常存在于氨基酸位置24至34(CDRl)、氨基酸位置50至56(CDR2)和氨基酸位置89至97(CDR3)。如本领域技术人员所熟知的，使用Kabat编号系统，由于FR和/或CDR的缩短或延长，抗体可变结构域的实际线性氨基酸序列可以含有更少或额外的氨基酸，因此，氨基酸的Kabat数量不一定与其线性氨基酸数量相同。

术语“嵌合”抗体是指这样的抗体：其中重链和/或轻链的一部分来源于特定来源或物种，而重链和/或轻链的剩余部分来源于不同来源或物种。

如本文所用的，术语“人类抗体”或“人源化抗体”旨在包括具有来源于人类种系免疫球蛋白序列的可变区和恒定区的抗体。人类抗体在现有技术中是熟知的(van Dijk、M.A.和van de Winkel、J.G.，Curr.Opin.Chem.Biol.，5(2001)368-374)。在一些情况下，人类抗体也在转基因动物(例如小鼠)中产生，所述转基因动物在免疫接种后能够在缺乏内源性免疫球蛋白产生的情况下产生人类抗体的全谱或选择。在此类种系突变小鼠中转移人类种系免疫球蛋白基因阵列将导致在抗原攻击时产生人类抗体(参见，例如，Jakobovits,A.等人，Natl.Acad.Sci.USA，90(1993)2551-2555；Jakobovits,A.等人，Nature，362(1993)255-258；Bruggemann,M.等人，Year Immunol.，7(1993)，33-40)。在另外的情况下，人类抗体也在噬菌体展示文库中产生(Hoogenboom,H.R.和Winter,G.，J.Mol.Biol.，227(1992)381-388；Marks,J.D.等人，J.Mol.Biol.222(1991)，581-597)。Cole等人和Boerner等人的技术也可用于制备人类单克隆抗体(Cole等人，Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy，Alan R.Liss，第77页(1985)；和Boerner,P.等人，J.Immunol.，147(1991)86-95)。

如本文所用，术语“重组人类抗体”旨在包括通过重组手段制备、表达、产生或分离的所有人类抗体，诸如从宿主细胞(诸如NSO或CHO细胞)分离的抗体，或从对于人免疫球蛋白基因是转基因的动物(例如小鼠)分离的抗体，或使用转染到宿主细胞中的重组表达载体表达的抗体。此类重组人类抗体具有重排形式的可变区和恒定区。在一些情况下，重组人类抗体已经经历体内体细胞超突变。因此，重组抗体的VH区和VL区的氨基酸序列是这样的序列：其虽然来源于人类种系VH和VL序列并与之相关，但可能不天然存在于体内的人类抗体种系谱内。

如本文所用，术语“个体”、“对象”和“患者”意指任何哺乳动物。在一些实施方案中，哺乳动物是人类。在一些实施方案中，哺乳动物是非人类。这些术语中没有一个要求或局限于由医疗保健工作者(例如，医生、注册护士、执业护士、医师助理、护理员或临终关怀工作者)的监督(例如，持续或间歇)表征的情况。

如本文所用的，与序列相关的术语“氨基酸序列同一性百分比(％)”被定义为在比对序列并引入间隙(gap)(如有必要)以实现最大百分比序列同一性之后，候选序列中与特定序列中的氨基酸残基相同的氨基酸残基的百分比，并且不将任何保守取代视为序列同一性的一部分。用于确定氨基酸序列同一性百分比的目的的比对可以通过本领域技术范围内的各种方式实现，例如，使用可公开获得的计算机软件，诸如EMBOSS MATCHER、EMBOSSWATER、EMBOSS STRETCHER、EMBOSS NEEDLE、EMBOSS LALIGN、BLAST、BLAST-2、ALIGN或Megalign(DNASTAR)软件。本领域技术人员可以确定用于测量比对的合适参数，包括在被比较的序列的全长上实现最大比对所需的任何算法。

本发明的实施方案的以下列表被认为公开了本发明的各种特征，这些特征可以被认为是它们所讨论的特定实施方案所特有的，或者这些特征可与如在其他实施方案中所列出的各种其他特征组合。因此，仅仅因为在一个特定实施方案下讨论了特征，并不一定将该特征的使用限制于该实施方案。

实施方案A1.一种双特异性抗体，其包括CD47结合结构域和EpCAM结合结构域。

实施方案A2.根据实施方案A1所述的双特异性抗体，其还包括Fc结构域。

实施方案A3.根据实施方案A1或A2所述的双特异性抗体，其中所述双特异性抗体对在肿瘤细胞的表面上表达的CD47的亲和力高于对在红细胞或血小板的表面上表达的CD47的亲和力。

实施方案A4.根据实施方案A3所述的双特异性抗体，其中所述肿瘤细胞表达EpCAM。

实施方案A5.根据实施方案A1至A4中任一个所述的双特异性抗体，其中半最大结合至人红细胞所需的所述双特异性抗体的浓度大于500nM。

实施方案A6.根据实施方案A1至A5中任一个所述的双特异性抗体，其中双特异性抗体以小于100nM的KD结合至人CD47。

实施方案A7.根据实施方案A6所述的双特异性抗体，其中所述双特异性抗体以1nM至100nM、1nM至50nM或5nM至50nM的KD结合至人CD47。

实施方案A8.根据实施方案A1至A7中任一个所述的双特异性抗体，其中所述双特异性抗体以小于500nM的KD结合至EpCAM。

实施方案A9.根据实施方案A8所述的双特异性抗体，其中所述双特异性抗体以0.2nM至500nM、1nM至300nM、5nM至200nM或10nM至150nM的KD结合至EpCAM。

实施方案A10.根据实施方案A6至A9中任一个所述的双特异性抗体，其中KD通过表面等离子体共振确定。

实施方案A11.根据实施方案A1至A10中任一个所述的双特异性抗体，其中所述CD47结合结构域是人或工程改造的人CD47结合结构域。

实施方案A12.根据实施方案A1至A11中任一个所述的双特异性抗体，其中所述CD47结合结构域包括重链可变结构域和轻链可变结构域。

实施方案A13.根据实施方案A1至A11中任一个所述的双特异性抗体，其中所述CD47结合结构域包括scFv。

实施方案A14.根据实施方案A1至A13中任一个所述的双特异性抗体，其中所述EpCAM结合结构域包括重链可变结构域和轻链可变结构域。

实施方案A15.根据实施方案A1至A13中任一个所述的双特异性抗体，其中所述EpCAM结合结构域包括scFv。

实施方案A16.根据实施方案A1至A15中任一个所述的双特异性抗体，其中所述Fc结构域是人Fc结构域。

实施方案A17.根据实施方案A16所述的双特异性抗体，其中所述人Fc结构域的同种型是IgG1或IgG4。

实施方案A18.根据实施方案A1至A17中任一个所述的双特异性抗体，其中所述Fc结构域是异二聚体Fc结构域，其中异二聚体Fc区包括杵链和臼链，形成杵臼(KiH)结构。

实施方案A19.根据实施方案A18所述的双特异性抗体，其中所述杵链包括突变T366W，并且所述臼链包括突变T366S、L368A和Y407V，其中氨基酸位置编号根据Kabat等人的EU索引。

实施方案A20.根据实施方案A1至A19中任一个所述的双特异性抗体，其中所述双特异性抗体具有不对称的三链杵臼结构。

实施方案A21.根据实施方案A20所述的双特异性抗体，其中所述CD47结合结构域是scFv。

实施方案A22.根据实施方案A20所述的双特异性抗体，其中所述EpCAM结合结构域是scFv。

实施方案A23.根据实施方案A1至A22中任一个所述的双特异性抗体，其中所述CD47结合结构域包括三个重链(HC)互补决定区(CDR)：HC-CDR1、HC-CDR2和HC-CDR3；和三个轻链(LC)CDR：LC-CDR1、LC-CDR2和LC-CDR3；其中HC-CDR1包括SEQ ID NO:15，HC-CDR2包括SEQ ID NO:16，HC-CDR3包括与SEQ ID NO:17具有至少50％同一性的序列，LC-CDR1包括SEQID NO:18，LC-CDR2包括SEQ ID NO:19，并且LC-CDR3包括与SEQ ID NO:20具有至少50％同一性的序列。

实施方案A24.根据实施方案A23所述的双特异性抗体，其中HC-CDR3包括在K94、E95、G96、S97、F98、G99、V100b、D101和P102中的一个或多个处的氨基酸取代；并且LC-CDR3包括在Y89、S90、T91、D92、I93、S94、G95、N95a、H95b、W96和V97中的一个或多个处的氨基酸取代。

实施方案A25.根据实施方案A1至A24中任一个所述的双特异性抗体，其中所述CD47结合结构域的所述重链可变结构域包括与SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:10或SEQ ID NO:13具有至少90％同一性的序列，并且所述CD47结合结构域的所述轻链包括与SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:11或SEQ ID NO:14具有至少90％同一性的序列。

实施方案A26.根据实施方案A1至A25中任一个所述的双特异性抗体，其中所述EpCAM结合结构域包括三个重链(HC)互补决定区(CDR)：HC-CDR1、HC-CDR2和HC-CDR3以及三个轻链(LC)CDR：LC-CDR1、LC-CDR2和LC-CDR3；其中所述CDR由被列为HC-CDR1、HC-CDR2、HC-CDR3、LC-CDR1、LC-CDR2、LC-CDR3的序列的有序集合定义；并且其中所述CDR选自与以下序列具有至少90％同一性的序列：

SEQ ID NO:45、SEQ ID NO:46、SEQ ID NO:47、SEQ ID NO:81、SEQ ID NO:82和SEQID NO:83；

SEQ ID NO:48、SEQ ID NO:49、SEQ ID NO:50、SEQ ID NO:84、SEQ ID NO:85和SEQID NO:86；

SEQ ID NO:51、SEQ ID NO:52、SEQ ID NO:53、SEQ ID NO:87、SEQ ID NO:88和SEQID NO:89；

SEQ ID NO:54、SEQ ID NO:55、SEQ ID NO:56、SEQ ID NO:90、SEQ ID NO:91和SEQID NO:92；

SEQ ID NO:57、SEQ ID NO:58、SEQ ID NO:59、SEQ ID NO:93、SEQ ID NO:94和SEQID NO:95；

SEQ ID NO:60、SEQ ID NO:61、SEQ ID NO:62、SEQ ID NO:96、SEQ ID NO:97和SEQID NO:98；

SEQ ID NO:63、SEQ ID NO:64、SEQ ID NO:65、SEQ ID NO:99、SEQ ID NO:100和SEQ ID NO:101；

SEQ ID NO:66、SEQ ID NO:67、SEQ ID NO:68、SEQ ID NO:102、SEQ ID NO:103和SEQ ID NO:104；

SEQ ID NO:69、SEQ ID NO:70、SEQ ID NO:71、SEQ ID NO:105、SEQ ID NO:106和SEQ ID NO:107；

SEQ ID NO:72、SEQ ID NO:72、SEQ ID NO:74、SEQ ID NO:108、SEQ ID NO:109和SEQ ID NO:110；

SEQ ID NO:75、SEQ ID NO:76、SEQ ID NO:77、SEQ ID NO:111、SEQ ID NO:112和SEQ ID NO:113；和

SEQ ID NO:78、SEQ ID NO:79、SEQ ID NO:80、SEQ ID NO:114、SEQ ID NO:115和SEQ ID NO:116。

实施方案A27.根据实施方案A1至A26中任一个所述的双特异性抗体，其中所述EpCAM结合结构域包括：

与SEQ ID NO:21至少90％相同的序列，和

与SEQ ID NO:33至少90％相同的序列；

与SEQ ID NO:22至少90％相同的序列，和

与SEQ ID NO:34至少90％相同的序列；或

与SEQ ID NO:24至少90％相同的序列，和

与SEQ ID NO:36至少90％相同的序列。

实施方案A28.根据实施方案A1至A27中任一个所述的双特异性抗体，其中与非特异性IgG1抗体对照相比，小于1nM或小于0.01nM的所述双特异性抗体将被巨噬细胞吞噬的A431细胞的百分比增加至少4倍。

实施方案A29.根据实施方案A28所述的双特异性抗体，其中介导巨噬细胞对EpCAM阳性、CD47阳性肿瘤细胞的抗体依赖性细胞吞噬作用所需的抗体的浓度在0.01nM至-3nM之间。

实施方案A30.根据实施方案A29所述的双特异性抗体，其中所述EpCAM阳性、CD47阳性肿瘤细胞是OVISE细胞或A431细胞。

实施方案A31.根据实施方案A29所述的双特异性抗体，其中所述EpCAM阳性、CD47阳性肿瘤细胞选自胰腺导管腺癌细胞、卵巢透明细胞腺癌细胞、结肠腺癌细胞、肺腺癌细胞、卵巢腺癌细胞、外阴鳞状细胞癌细胞。

实施方案A32.根据实施方案A1至A28中任一个所述的双特异性抗体，其中100nM的所述双特异性抗体将细胞的表面上SIRPα与CD47的结合抑制至少30％。

实施方案A33.根据实施方案A32所述的双特异性抗体，其中所述细胞是CD47+EpCAM+肿瘤细胞。

实施方案A34.根据实施方案A33所述的双特异性抗体，其中所述细胞在其表面上表达与HCC-44细胞至少一样多的EpCAM蛋白。

实施方案A35.根据实施方案A33所述的双特异性抗体，其中所述细胞在其表面上表达至少100,000、至少300,000、至少600,000或至少1,500,000个EpCAM蛋白。

实施方案A36.根据实施方案A1至A33中任一个所述的双特异性抗体，其中400nM的所述双特异性抗体在血细胞凝集测定中不诱导红细胞的溶血。

实施方案A37.一种复合物，其包括根据实施方案A1至A36中任一个所述的双特异性抗体和CD47+EpCAM+靶细胞。

实施方案A38.根据实施方案A37所述的复合物，其中所述靶细胞在其表面上表达与HCC-44细胞至少一样多的EpCAM蛋白。

实施方案A39.根据实施方案A37所述的复合物，其中所述靶细胞在其表面上表达至少100,000、至少300,000、至少600,000或至少1,500,000个EpCAM蛋白。

实施方案A40.根据实施方案A37至A39中任一个所述的复合物，其中所述CD47+EpCAM+靶细胞是癌细胞。

实施方案A41.根据实施方案A40所述的复合物，其中所述癌细胞是胰腺导管腺癌细胞、卵巢透明细胞腺癌细胞、结肠腺癌细胞、肺腺癌细胞、卵巢腺癌细胞或外阴鳞状细胞癌细胞。

实施方案A42.一种诱导CD47+EpCAM+靶细胞的吞噬作用的方法，所述方法包括施用根据实施方案A1至A36中任一个所述的双特异性抗体。

实施方案A43.根据实施方案A42所述的方法，其中所述双特异性抗体以小于5nM、小于2nM、小于1nM、小于0.5nM、小于0.2nM、小于0.1nM或小于0.05nM的浓度施用。

实施方案A44.一种杀伤CD47+EpCAM+靶细胞的方法，所述方法包括施用根据实施方案A1至A36中任一个所述的双特异性抗体，其中所述双特异性抗体抑制所述CD47+EpCAM+靶细胞的表面上SIRPα与CD47的结合。

实施方案A45.一种杀伤CD47+EpCAM+靶细胞的方法，所述方法包括施用根据实施方案A1至A36中任一个所述的双特异性抗体，其中所述双特异性抗体诱导杀伤所述CD47+EpCAM+靶细胞的抗体依赖性细胞毒性。

实施方案A46.根据实施方案A45所述的方法，其中所述抗体以0.01-1nM、0.01-0.5nM、0.01-0.25nM、0.01-0.1nM、0.01-0.05nM或小于0.01nM的浓度施用。

实施方案A47.根据实施方案A45或A46所述的方法，其中所述CD47+EpCAM+靶细胞选自A431细胞、HCC-44细胞、SKOV-3细胞、OVISE细胞或CFPAC-1细胞。

实施方案A48.根据实施方案A45或A46所述的方法，其中所述CD47+EpCAM+靶细胞选自胰腺导管腺癌细胞、卵巢透明细胞腺癌细胞、结肠腺癌细胞、肺腺癌细胞或外阴鳞状细胞癌细胞。

实施方案A49.一种药物，其包括根据实施方案A1至A36中任一个所述的双特异性抗体。

实施方案A50.一种治疗患有癌症的个体的方法，所述方法包括施用根据实施方案A49所述的药物组合物。

实施方案A51.根据实施方案A50所述的方法，其中所述癌症是胰腺导管腺癌、卵巢透明细胞腺癌、结肠腺癌、肺腺癌细胞或外阴鳞状细胞癌。

实施方案B1.一种双特异性抗体，其包括CD47结合结构域和EGFR结合结构域。

实施方案B2.根据实施方案B1所述的双特异性抗体，其还包括Fc结构域。

实施方案B3.根据实施方案B1或B2所述的双特异性抗体，其中所述双特异性抗体对在肿瘤细胞的表面上表达的CD47的亲和力高于对在红细胞或血小板的表面上表达的CD47的亲和力。

实施方案B4.根据实施方案B3所述的双特异性抗体，其中所述肿瘤细胞表达EGFR。

实施方案B5.根据实施方案B1至B4中任一个所述的双特异性抗体，其中半最大结合至人红细胞所需的所述双特异性抗体的浓度大于500nM。

实施方案B6.根据实施方案B1至B5中任一个所述的双特异性抗体，其中双特异性抗体以小于100nM的KD结合至人CD47。

实施方案B7.根据实施方案B6所述的双特异性抗体，其中所述双特异性抗体以1nM至100nM、1nM至50nM或5nM至50nM的KD结合至人CD47。

实施方案B8.根据实施方案B1至B7中任一个所述的双特异性抗体，其中所述双特异性抗体以小于25nM的KD结合至EGFR。

实施方案B9.根据实施方案B8所述的双特异性抗体，其中所述双特异性抗体以0.2nM至25nM、0.2nM至10nM、0.2nM至2nM或2nM至10nM的KD结合至EGFR。

实施方案B10.根据实施方案B6至B9中任一个所述的双特异性抗体，其中KD通过表面等离子体共振确定。

实施方案B11.根据实施方案B1至B10中任一个所述的双特异性抗体，其中所述CD47结合结构域是人或工程改造的人CD47结合结构域。

实施方案B12.根据实施方案B1至B11中任一个所述的双特异性抗体，其中所述CD47结合结构域包括重链可变结构域和轻链可变结构域。

实施方案B13.根据实施方案B1至B11中任一个所述的双特异性抗体，其中所述CD47结合结构域包括scFv。

实施方案B14.根据实施方案B1至B13中任一个所述的双特异性抗体，其中所述EGFR结合结构域包括重链可变结构域和轻链可变结构域。

实施方案B15.根据实施方案B1至B13中任一个所述的双特异性抗体，其中所述EGFR结合结构域包括scFv。

实施方案B16.根据实施方案B1至B15中任一个所述的双特异性抗体，其中所述Fc结构域是人Fc结构域。

实施方案B17.根据实施方案B16所述的双特异性抗体，其中所述人Fc结构域的同种型是IgG1或IgG4。

实施方案B18.根据实施方案B1至B17中任一个所述的双特异性抗体，其中所述Fc结构域是异二聚体Fc结构域，其中异二聚体Fc区包括杵链和臼链，形成杵臼(KiH)结构。

实施方案B19.根据实施方案B18所述的双特异性抗体，其中所述杵链包括突变T366W，并且所述臼链包括突变T366S、L368A和Y407V，其中氨基酸位置编号根据Kabat等人的EU索引。

实施方案B20.根据实施方案B1至B19中任一个所述的双特异性抗体，其中所述双特异性抗体具有不对称的三链杵臼结构。

实施方案B21.根据实施方案B20所述的双特异性抗体，其中所述CD47结合结构域是scFv。

实施方案B22.根据实施方案B20所述的双特异性抗体，其中所述EGFR结合结构域是scFv。

实施方案B23.根据实施方案B1至B22中任一个所述的双特异性抗体，其中所述CD47结合结构域包括三个重链(HC)互补决定区(CDR)：HC-CDR1、HC-CDR2和HC-CDR3；和三个轻链(LC)CDR：LC-CDR1、LC-CDR2和LC-CDR3；其中HC-CDR1包括SEQ ID NO:15，HC-CDR2包括SEQ ID NO:16，HC-CDR3包括与SEQ ID NO:17具有至少50％同一性的序列，LC-CDR1包括SEQID NO:18，LC-CDR2包括SEQ ID NO:19，并且LC-CDR3包括与SEQ ID NO:20具有至少50％同一性的序列。

实施方案B24.根据实施方案B23所述的双特异性抗体，其中HC-CDR3包括在K94、E95、G96、S97、F98、G99、V100b、D101和P102中的一个或多个处的氨基酸取代；并且LC-CDR3包括在Y89、S90、T91、D92、I93、S94、G95、N95a、H95b、W96和V97中的一个或多个处的氨基酸取代。

实施方案B25.根据实施方案B1至B24中任一个所述的双特异性抗体，其中所述CD47结合结构域的所述重链可变结构域包括与SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:10或SEQ ID NO:13具有至少90％同一性的序列，并且所述CD47结合结构域的所述轻链包括与SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:11或SEQ ID NO:14具有至少90％同一性的序列。

实施方案B26.根据实施方案B1至B25中任一个所述的双特异性抗体，其中所述EGFR结合结构域包括三个重链(HC)互补决定区(CDR)：HC-CDR1、HC-CDR2和HC-CDR3以及三个轻链(LC)CDR：LC-CDR1、LC-CDR2和LC-CDR3；其中所述CDR由被列为HC-CDR1、HC-CDR2、HC-CDR3、LC-CDR1、LC-CDR2、LC-CDR3的序列的有序集合定义；并且其中所述CDR选自与以下序列具有至少90％同一性的序列：

SEQ ID NO:121、SEQ ID NO:122、SEQ ID NO:123、SEQ ID NO:124、SEQ ID NO:125和SEQ ID NO:126。

实施方案B27.根据实施方案B1至B26中任一个所述的双特异性抗体，其中所述EGFR结合结构域包括：

与SEQ ID NO:127至少90％相同的序列，和

与SEQ ID NO:128至少90％相同的序列。

实施方案B28.根据实施方案B1至B27中任一个所述的双特异性抗体，其中与非特异性IgG1抗体对照相比，小于1nM或小于0.01nM的所述双特异性抗体将被巨噬细胞吞噬的A431细胞的百分比增加至少4倍。

实施方案B29.根据实施方案B28所述的双特异性抗体，其中介导巨噬细胞对EGFR阳性、CD47阳性肿瘤细胞的抗体依赖性细胞吞噬作用所需的抗体的浓度在0.01nM至-3nM之间。

实施方案B30.根据实施方案B29所述的双特异性抗体，其中所述EGFR阳性、CD47阳性肿瘤细胞是OVISE细胞或A431细胞。

实施方案B31.根据实施方案B29所述的双特异性抗体，其中所述EGFR阳性、CD47阳性肿瘤细胞选自表皮样癌细胞、结肠直肠腺癌细胞、胰腺腺癌细胞、肺鳞状细胞癌细胞或胃癌细胞。

实施方案B32.根据实施方案B1至B28中任一个所述的双特异性抗体，其中100nM的所述双特异性抗体将细胞的表面上SIRPα与CD47的结合抑制至少30％。

实施方案B33.根据实施方案B32所述的双特异性抗体，其中所述细胞是CD47+EGFR+肿瘤细胞。

实施方案B34.根据实施方案B33所述的双特异性抗体，其中所述细胞在其表面上表达与HCC-44细胞至少一样多的EGFR蛋白。

实施方案B35.根据实施方案B33所述的双特异性抗体，其中所述细胞在其表面上表达至少100,000、至少300,000、至少600,000或至少1,500,000个EGFR蛋白。

实施方案B36.根据实施方案B1至B33中任一个所述的双特异性抗体，其中400nM的所述双特异性抗体在血细胞凝集测定中不诱导红细胞的溶血。

实施方案B37.一种复合物，其包括根据实施方案B1至B36中任一个所述的双特异性抗体和CD47+EGFR+靶细胞。

实施方案B38.根据实施方案B37所述的复合物，其中所述靶细胞在其表面上表达与HCC-44细胞至少一样多的EGFR蛋白。

实施方案B39.根据实施方案B37所述的复合物，其中所述靶细胞在其表面上表达至少100,000、至少300,000、至少600,000或至少1,500,000个EGFR蛋白。

实施方案B40.根据实施方案B37至B39中任一个所述的复合物，其中所述CD47+EGFR+靶细胞是癌细胞。

实施方案B41.根据实施方案B40所述的复合物，其中所述癌细胞是表皮样癌细胞、结肠直肠腺癌细胞、胰腺腺癌细胞、肺鳞状细胞癌细胞或胃癌细胞。

实施方案B42.一种诱导CD47+EGFR+靶细胞的吞噬作用的方法，所述方法包括施用根据实施方案B1至B36中任一个所述的双特异性抗体。

实施方案B43.根据实施方案B42所述的方法，其中所述双特异性抗体以小于5nM、小于2nM、小于1nM、小于0.5nM、小于0.2nM、小于0.1nM或小于0.05nM的浓度施用。

实施方案B44.一种杀伤CD47+EGFR+靶细胞的方法，所述方法包括施用根据实施方案B1至B36中任一个所述的双特异性抗体，其中所述双特异性抗体抑制CD47+EGFR+靶细胞的表面上SIRPα与CD47的结合。

实施方案B45.一种杀伤CD47+EGFR+靶细胞的方法，所述方法包括施用根据实施方案B1至B36中任一个所述的双特异性抗体，其中所述双特异性抗体诱导杀伤CD47+EGFR+靶细胞的抗体依赖性细胞毒性。

实施方案B46.根据实施方案B45所述的方法，其中所述抗体以0.01-1nM、0.01-0.5nM、0.01-0.25nM、0.01-0.1nM、0.01-0.05nM或小于0.01nM的浓度施用。

实施方案B47.根据实施方案B45或B46所述的方法，其中所述CD47+EGFR+靶细胞选自A431细胞、NCI-H747细胞、ASPC-1细胞、EBC-1细胞或SNU-5细胞。

实施方案B48.根据实施方案B45或B46所述的方法，其中所述CD47+EGFR+靶细胞选自表皮样癌细胞、结肠直肠腺癌细胞、胰腺腺癌细胞、肺鳞状细胞癌细胞或胃癌细胞。

实施方案B49.一种药物，其包括根据实施方案B1至B36中任一个所述的双特异性抗体。

实施方案B50.一种治疗患有癌症的个体的方法，所述方法包括施用根据实施方案B49所述的药物组合物。

实施方案B51.根据实施方案B50所述的方法，其中所述癌症是表皮样癌、结肠直肠腺癌、胰腺腺癌、肺鳞状细胞癌或胃癌。

实施方案C1.一种双特异性抗体，其包括CD47结合结构域和肿瘤相关抗原结合结构域，其中所述CD47结合结构域包括三个重链(HC)互补决定区(CDR)：HC-CDR1、HC-CDR2和HC-CDR3；和三个轻链(LC)CDR：LC-CDR1、LC-CDR2和LC-CDR3；其中HC-CDR1包括SEQ ID NO:15，HC-CDR2包括SEQ ID NO:16，HC-CDR3包括与SEQ ID NO:17具有至少50％同一性的序列，LC-CDR1包括SEQ ID NO:18，LC-CDR2包括SEQ ID NO:19，并且LC-CDR3包括与SEQ ID NO:20具有至少50％同一性的序列。

实施方案C2.根据实施方案C1所述的双特异性抗体，其中所述肿瘤相关抗原结合结构域结合至肿瘤相关抗原，所述肿瘤相关抗原包括ACVR2、HER2/neu、CD20、EGFR、CD3、CD22、CD80、CD23、EpCAM、CD2、CD3、CD19、间皮素、Mum-1、β-连环蛋白、CDK4、p53、Ras、CDC27、α-辅肌动蛋白-4、TRP1/gp75、Wilm、EphA3、前列腺酸性磷酸酶(PAP)、甲胎蛋白(AFP)、9D7、细胞周期蛋白-B₁、癌胚抗原(CEA)、gp100/pmel17、BRCA1/2、VEGFR、TGF-βRII、MUC-1、上皮肿瘤抗原(ETA)、酪氨酸酶、黑色素瘤相关抗原(MAGE)、碳酸酐酶IX、细胞毒性T淋巴细胞抗原4、叶酸结合蛋白A-33、前列腺特异性抗原(PSA)、生存素、EGFRvIII、黑色素细胞衍生肽、多种黑色素瘤相关肽、宫颈癌抗原HPV-16-E7、PRAME、SSX-2、CA125、MART、CS-1、BING-4、纤连蛋白、CML66、MC1R、钙激活氯通道2、未成熟层粘连蛋白受体和hTERT。

实施方案C3.根据实施方案C1或C2所述的双特异性抗体，其中所述双特异性抗体对在肿瘤细胞的表面上表达的CD47的亲和力高于对在红细胞或血小板的表面上表达的CD47的亲和力。

实施方案C4.根据实施方案C3所述的双特异性抗体，其中所述双特异性抗体还包括Fc结构域。

实施方案C5.根据实施方案C1至C4中任一个所述的双特异性抗体，其中半最大结合至人红细胞所需的所述双特异性抗体的浓度大于500nM。

实施方案C6.根据实施方案C1至C5中任一个所述的双特异性抗体，其中双特异性抗体以小于100nM的KD结合至人CD47。

实施方案C7.根据实施方案C6所述的双特异性抗体，其中所述双特异性抗体以1nM至100nM、1nM至50nM或5nM至50nM的KD结合至人CD47。

实施方案C8.根据实施方案C2至C7中任一个所述的双特异性抗体，其中所述双特异性抗体以小于500nM的KD结合至肿瘤相关抗原。

实施方案C9.根据实施方案C8所述的双特异性抗体，其中所述双特异性抗体以0.2nM至500nM、1nM至300nM、5nM至200nM或10nM至150nM的KD结合至肿瘤相关抗原。

实施方案C10.根据实施方案C6至C9中任一个所述的双特异性抗体，其中KD通过表面等离子体共振确定。

实施方案C11.根据实施方案C1至C10中任一个所述的双特异性抗体，其中所述CD47结合结构域是人或工程改造的人CD47结合结构域。

实施方案C12.根据实施方案C1至C11中任一个所述的双特异性抗体，其中所述CD47结合结构域包括重链可变结构域和轻链可变结构域。

实施方案C13.根据实施方案C1至C11中任一个所述的双特异性抗体，其中所述CD47结合结构域包括scFv。

实施方案C14.根据实施方案C1至C13中任一个所述的双特异性抗体，其中所述肿瘤相关抗原结合结构域包括重链可变结构域和轻链可变结构域。

实施方案C15.根据实施方案C1至C13中任一个所述的双特异性抗体，其中所述肿瘤相关抗原结合结构域包括scFv。

实施方案C16.根据实施方案C1至C15中任一个所述的双特异性抗体，其中所述Fc结构域是人Fc结构域。

实施方案C17.根据实施方案C16所述的双特异性抗体，其中所述人Fc结构域的同种型是IgG1、IgG2或IgG4。

实施方案C18.根据实施方案C1至C17中任一个所述的双特异性抗体，其中所述Fc结构域是异二聚体Fc结构域，其中异二聚体Fc区包括杵链和臼链，形成杵臼(KiH)结构。

实施方案C19.根据实施方案C18所述的双特异性抗体，其中所述杵链包括突变T366W，并且所述臼链包括突变T366S、L368A和Y407V，其中氨基酸位置编号根据Kabat等人的EU索引。

实施方案C20.根据实施方案C1至C19中任一个所述的双特异性抗体，其中所述双特异性抗体具有不对称的三链杵臼结构。

实施方案C21.根据实施方案C20所述的双特异性抗体，其中所述CD47结合结构域是scFv。

实施方案C22.根据实施方案C20所述的双特异性抗体，其中所述肿瘤相关抗原结合结构域是scFv。

实施方案C23.根据实施方案C1至C22中任一个所述的双特异性抗体，其中所述肿瘤相关抗原包括：ACVR2、HER2/neu、CD20、EGFR、CD3、EphA3和EpCAM。

实施方案C24.根据实施方案C1至C23中任一个所述的双特异性抗体，其中HC-CDR3包括在K94、E95、G96、S97、F98、G99、V100b、D101和P102中的一个或多个处的氨基酸取代；并且LC-CDR3包括在Y89、S90、T91、D92、I93、S94、G95、N95a、H95b、W96和V97中的一个或多个处的氨基酸取代。

实施方案C25.根据实施方案C1至C24中任一个所述的双特异性抗体，其中所述CD47结合结构域的所述重链可变结构域包括与SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:10或SEQ ID NO:13具有至少90％同一性的序列，并且所述CD47结合结构域的所述轻链包括与SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:11或SEQ ID NO:14具有至少90％同一性的序列。

实施方案C26.根据实施方案C23至C25中任一个所述的双特异性抗体，其中所述肿瘤相关抗原结合结构域包括三个重链(HC)互补决定区(CDR)：HC-CDR1、HC-CDR2和HC-CDR3以及三个轻链(LC)CDR：LC-CDR1、LC-CDR2和LC-CDR3；其中所述CDR由被列为HC-CDR1、HC-CDR2、HC-CDR3、LC-CDR1、LC-CDR2、LC-CDR3的序列的有序集合定义；并且其中所述CDR选自与以下序列具有至少90％同一性的序列：

SEQ ID NO:45、SEQ ID NO:46、SEQ ID NO:47、SEQ ID NO:81、SEQ ID NO:82和SEQID NO:83；

SEQ ID NO:48、SEQ ID NO:49、SEQ ID NO:50、SEQ ID NO:84、SEQ ID NO:85和SEQID NO:86；

SEQ ID NO:51、SEQ ID NO:52、SEQ ID NO:53、SEQ ID NO:87、SEQ ID NO:88和SEQID NO:89；

SEQ ID NO:54、SEQ ID NO:55、SEQ ID NO:56、SEQ ID NO:90、SEQ ID NO:91和SEQID NO:92；

SEQ ID NO:57、SEQ ID NO:58、SEQ ID NO:59、SEQ ID NO:93、SEQ ID NO:94和SEQID NO:95；

SEQ ID NO:60、SEQ ID NO:61、SEQ ID NO:62、SEQ ID NO:96、SEQ ID NO:97和SEQID NO:98；

SEQ ID NO:63、SEQ ID NO:64、SEQ ID NO:65、SEQ ID NO:99、SEQ ID NO:100和SEQ ID NO:101；

SEQ ID NO:66、SEQ ID NO:67、SEQ ID NO:68、SEQ ID NO:102、SEQ ID NO:103和SEQ ID NO:104；

SEQ ID NO:69、SEQ ID NO:70、SEQ ID NO:71、SEQ ID NO:105、SEQ ID NO:106和SEQ ID NO:107；

SEQ ID NO:72、SEQ ID NO:72、SEQ ID NO:74、SEQ ID NO:108、SEQ ID NO:109和SEQ ID NO:110；

SEQ ID NO:75、SEQ ID NO:76、SEQ ID NO:77、SEQ ID NO:111、SEQ ID NO:112和SEQ ID NO:113；和

SEQ ID NO:78、SEQ ID NO:79、SEQ ID NO:80、SEQ ID NO:114、SEQ ID NO:115和SEQ ID NO:116。

实施方案C27.根据实施方案C1至C26中任一个所述的双特异性抗体，其中所述肿瘤相关抗原结合结构域包括：

与SEQ ID NO:21至少90％相同的序列，和

与SEQ ID NO:33至少90％相同的序列；

与SEQ ID NO:22至少90％相同的序列，和

与SEQ ID NO:34至少90％相同的序列；或

与SEQ ID NO:24至少90％相同的序列，和

与SEQ ID NO:36至少90％相同的序列。

实施方案C28.根据实施方案C1至C25中任一个所述的双特异性抗体，其中所述肿瘤相关抗原结合结构域包括三个重链(HC)互补决定区(CDR)：HC-CDR1、HC-CDR2和HC-CDR3以及三个轻链(LC)CDR：LC-CDR1、LC-CDR2和LC-CDR3；其中所述CDR由被列为HC-CDR1、HC-CDR2、HC-CDR3、LC-CDR1、LC-CDR2、LC-CDR3的序列的有序集合定义；并且其中所述CDR选自与以下序列具有至少90％同一性的序列：

SEQ ID NO:121、SEQ ID NO:122、SEQ ID NO:123、SEQ ID NO:124、SEQ ID NO:125和SEQ ID NO:126。

实施方案C29.根据实施方案C1至C25中任一个所述的双特异性抗体，其中所述肿瘤相关抗原结合结构域包括：

与SEQ ID NO:127至少90％相同的序列，和

与SEQ ID NO:128至少90％相同的序列。

实施方案C30.根据实施方案C1至C29中任一个所述的双特异性抗体，其中与非特异性IgG1抗体对照相比，小于1nM或小于0.01nM的所述双特异性抗体将被巨噬细胞吞噬的A431细胞的百分比增加至少4倍。

实施方案C31.一种药物，其包括根据实施方案C1至C30中任一个所述的双特异性抗体。

实施方案C32.一种治疗患有癌症的个体的方法，所述方法包括施用根据实施方案C31所述的药物组合物。

5.实施例

这些实施例仅提供用于说明目的，而不限制本文提供的权利要求的范围。

5.1实施例1.基准抗体和试剂

本研究中使用的基准抗体和试剂的序列从专利文献中解析并克隆到人IgG1主链中，如表1所示。

表1.基准试剂。

5.2实施例2.CD47+EpCAM+细胞系

从美国典型培养物保藏中心(ATCC)获得表达CD47和/或EpCAM的肿瘤衍生细胞系，并且在含有10％胎牛血清的培养基中在含5％CO2的37℃培养箱中生长。CFPAC-1细胞在IMDM培养基中培养，Raji细胞在RPMI-1640培养基中培养，并且A431细胞在DMEM培养基中培养。

通过流式细胞术来测量CD47和EpCAM的细胞表面表达。收获肿瘤细胞，离心并以1×10⁶个细胞/mL的浓度重悬于FACS缓冲液(PBS+2％FBS)中。将100μL的细胞悬浮液分配到96孔板的每个孔中，将100μL的10μg/mL的CD47 BMK-1或EpCAM BMK-6添加到孔中，并在4℃下温育1小时。用FACS缓冲液洗涤细胞三次。在第三次洗涤后，将细胞重悬于100μL 1:500稀释的AlexaFluor-488小鼠抗人IgG1 Fc二级抗体(英杰公司(Invitrogen)，目录号A10631)中，并在4℃下在黑暗中温育1小时。通过以2000RPM离心5分钟，用200μL的PBS洗涤细胞三次。在最后一次洗涤后，将细胞重悬于300μL的冷PBS中，并在FACSVerse^TM(BD生物科学(BDBiosciences))流式细胞仪上分析。表2示出了在这些细胞系中CD47和EpCAM的相对细胞表面表达水平。

表2.本研究中使用的癌细胞系及其CD47和EpCAM表达水平。

N/A：不可获得

*Puro等人，Molecular Cancer Therapeutics，2016年12月26日在线公布。

^Casaletto等人，PNAS 116(15)7533-7542，2019年3月。

人CD47稳定细胞系通过分别用编码全长人CD47基因的pLVX-IRES-Puro慢病毒表达载体(Clontech，目录号632183)转染CHOK1细胞产生。

5.3实施例3.双特异性CD47×EpCAM抗体诱导CD47+EpCAM+细胞的吞噬作用

用衍生自CD47 BMK-2的CD47结合结构域、衍生自EpCAM BMK-5的EpCAM结合scFv结构域和IgG1 Fc结构域构建双特异性抗体，所述双特异性抗体具有抑制重链二聚体的形成的不对称杵臼结构(Carter，J.Immunol.Protein engineering，第9卷，第7期，第617-621页，1996)。这种抗体的形式被称为三链杵臼(3C-KIH)CD47×EpCAM scFv(图1)。额外的双特异性抗体设计描述于Klein等人，mAbs 4(6)653-663，2012中。该抗体的多肽组分的氨基酸序列在表3中示出。

表3.概念验证的CD47×EpCAM双特异性抗体的多肽链序列。

在抗体依赖性细胞吞噬作用(ADCP)测定中测试双特异性抗体。从人类供体中分离外周血单核细胞(PBMC)。使用没有CD16耗竭的人单核细胞富集试剂盒(加拿大干细胞技术有限公司(STEMCELL)，目录号19058)来富集单核细胞。通过在含有20ng/ml的人巨噬细胞集落刺激因子(M-CSF，派普泰克(Peprotech)，目录号3-25-10)的完全培养基(RPMI 1640+10％FBS)中培养单核细胞，将分离的单核细胞分化成巨噬细胞。每三天更换一次培养基。在含有M-CSF的培养基中培养7天后，收集巨噬细胞并计数。收集靶肿瘤细胞并用D-PBS洗涤两次以除去剩余的FBS。洗涤的肿瘤细胞以5-10×10⁶/mL的细胞浓度重悬于PBS中。癌细胞用终浓度为3μM的CFSE(ebiosciences，目录号65-0580-84)染色，并立即混合。细胞在室温下在黑暗中染色10分钟。通过加入4-5体积的冷完全培养基并在冰上温育5分钟来终止染色。用RPMI 1640+10％FBS洗涤染色的细胞三次。将细胞重悬于1ml RPMI 1640+10％FBS中，计数，然后稀释或浓缩至3×10⁵个细胞/mL。将50μl细胞接种到96孔深U形板(爱思进(Axygen)，目录号P-DW-20-C)中，其中每个孔含有1.5×10⁴个细胞。向每个孔中加入50μl稀释的抗体。向每个孔中加入100μl的巨噬细胞(1.5×10⁴个细胞)，并在37℃、5％CO2下温育1.5小时。在温育后，用2ml的在D-PBS中的2％FBS洗涤细胞一次。加入100μl稀释的Fc阻断剂(人TruStain FcX(Fc受体阻断溶液)，Biolegend目录号422302)，并且将细胞在室温下温育10分钟。向每个孔中加入20μl稀释的抗人CD11b抗体，并在4℃下在黑暗中温育30分钟。用2％FBS-D-PBS洗涤细胞一次。通过CFSE/CD11b双阳性细胞的出现在流式细胞仪中检测吞噬作用，所述双阳性细胞指示吞噬肿瘤细胞的巨噬细胞。

双特异性抗体促进CFPAC-1胰腺癌细胞、OVISE卵巢癌细胞、CW-2结肠癌细胞和HCC44肺癌细胞的吞噬作用。CFPAC-1细胞的示例性结果在图2中呈现。在表4中呈现了具有额外对照的四种细胞系的总结。

表4.双特异性CD47×EpCAM抗体诱导CD47+、EpCAM+癌细胞系的抗体依赖性细胞吞噬作用。

*n.d.：未检测

在所有四种细胞系中，双特异性抗体比具有相同抗CD47结合结构域的二价抗CD47抗体更有效地促进吞噬作用。非特异性IgG1同种型对照抗体不促进任何测试的CD47+细胞的吞噬作用。

EpCAM BMK-5(单价和二价)还通过其IgG1结构域与吞噬细胞上的Fcγ受体相互作用，从而直接促进吞噬作用来促进吞噬作用。这种效应在具有高EpCAM表达的OVISE和CW-2细胞中更加明显。

5.4实施例4.工程改造和测试抗CD47结合结构域

VIR47是从

大鼠中鉴定的抗CD47抗体。与天然人IgG4的序列相比，VIR47的可变结构域被移植到具有S₂₂₈P取代的人IgG4框架(IgG4.SPL)上。VIR47有效地阻断CD47与SIRPα之间的相互作用。VIR47 mAb与RBC具有相对较弱的结合(诱导RBC的吞噬作用的降低的能力)，并且不诱导人RBC的血细胞凝集。在PCT/CN2019/113296(其通过引用整体并入本文)中描述了VIR47。

为了增强Fcγ受体相互作用，VIR47的IgG4 Fc结构域被IgG1 Fc结构域代替。此外，通过用在最接近的人类种系直系同源物的序列的相应位置处发现的氨基酸替换大鼠来源的氨基酸，进一步工程改造了VIR47的框架区。根据Kabat编号(Kabat等人1991Sequencesof Proteins of Immunological Interest的EU索引)，已知这些优化的VIR47的变体中的两种为VIR47.V7(HC：F₇₉Y、G_82bS；LC：E₁₀₃K)和VIR47.V8(HC：I₆₇F、F₇₉Y、G_82bS；LC：M₄L、E₁₀₃K)。VIR47和相关mAb的重链和轻链的序列在表5中示出。VIR47的互补决定区(CDR)在表6中呈现。

表5.源自VIR47的抗CD47结合结构域的多肽序列。CDR被加划线并加粗。

表6.VIR47的CDR序列

IgG1形式和工程改造的变体通过基于ELISA的结合测定、结合至表达CD47的细胞的流式细胞术定量以及使用Biacore仪器通过表面等离子体共振测量结合动力学来表征。

5.4.1人CD47的产生

将编码人CD47的胞外结构域(ECD)的DNA克隆到pRK5中(ATCC目录号209784)。将所得的具有C末端6xHis标签(SEQ ID NO:129)的构建体转染到Expi293F细胞。在72小时后，通过在4℃下以2000rpm离心5分钟来收获表达CD47的细胞。收集上清液。Ni-NTA(德国凯杰(Qiagen)，目录号30410)树脂用缓冲液A(137mM NaCl，2.7mM KCl，10mM Na2HPO4，2mMKH2PO4，pH 7.4)预平衡，并与上清液在旋转器上在4℃下温育2小时。将树脂填充在NiSepharose excel(通用电气(GE)，目录号GE17371201)中，并用缓冲液A洗涤，直到通过考马斯亮蓝(Coomassie-Brilliant Blue)G-250没有观察到信号(OD595，约20-30柱体积(CV))。使用3柱体积(CV)的缓冲液B(137mM NaCl，2.7mM KCl，10mM Na₂HPO₄，2mM KH₂PO₄，pH 7.4，250mM咪唑)洗脱靶蛋白质。SuperdexTX 200increase柱(通用电气，目录号GE28-9909-44)用缓冲液A预平衡，然后将洗脱液装载到柱上。用缓冲液A洗涤柱，并收集级分。在12％SDS-PAGE上分离不同的级分，并且组合期望的级分并用缓冲液C(137mM NaCl，2.7mM KCl，10mMNa₂HPO₄，2mM KH₂PO₄，pH 7.4)中和。通过使用分子截止值为30kDa的超滤管(亚米康(Amicon)，目录号42409)浓缩靶蛋白质，然后等分并使用液体N2快速冷冻，并在-80℃下储存。

5.4.2通过ELISA测量的抗体与抗原的结合

在4℃下用1μg/ml重组CD47包被96孔板过夜。在洗涤3次后，在37℃下用300μl的在PBST中的1％BSA封闭板1小时。加入连续稀释的抗体，并在37℃下温育1小时。然后用PBST洗涤该板4次，并与1:5000稀释的过氧化物酶标记的山羊抗人IgG(Fab特异性)二级抗体(西格玛(Sigma)，目录号A0293)在37℃下温育1小时。用PBST再次洗涤该板4次，在室温下与3,3′,5,5′-四甲基联苯胺(TMB)底物一起温育15分钟，用1N HCl终止，然后在450nM处读取。通过ELISA，VIR47及其IgG1、V7和V8变体与人CD47具有相当的结合。

5.4.3通过流式细胞术测量的抗体与细胞的结合

通过流式细胞术对与CD47+细胞系结合的抗体进行定量。在细胞上，CD47 ECD以其天然取向存在，具有天然糖基化。将收获的细胞以2000rpm离心5分钟，重悬于10-15ml冰冷的培养基中，然后计数。将细胞重悬于浓度为3×10⁶个细胞/mL的封闭缓冲液(PBS加上2％FBS)中。将100μL的细胞悬浮液分配到96孔板的每个孔中。用封闭缓冲液将纯化的抗体稀释至期望的浓度，并将100μL稀释的抗体加入到孔中，并在4℃下温育1小时。然后用PBS加上2％FBS洗涤细胞3次。在第三次洗涤后，将细胞重悬于100μL的1:500稀释的Alexa Fluor488标记的小鼠抗人IgG1 Fc二级抗体(Invitrogen，目录号A10631)中，并在4℃下在黑暗中温育1小时。然后通过以2000rpm离心5分钟，用200μL PBS洗涤细胞3次。在最后一次洗涤后，将细胞重悬于300μL的冷PBS中，并在FACSVerse^TM(BD Biosciences)流式细胞仪上分析。

在流式细胞术测定中，VIR47及其IgG1、V7和V8变体以相当的亲和力与表达人CD47的CHO细胞结合。

5.4.4表面等离子体共振结合测定

在Biacore 8K仪器(通用电气医疗(GE Healthcare))上评估抗CD47抗体的结合动力学。Biacore系列S CM5传感器芯片用单克隆鼠抗人IgG(Fc)抗体(来自GE Healthcare的人类抗体捕获试剂盒)固定。抗体被捕获在每个流动池中。以30μL/分钟的流速注射每种抗原的系列3倍稀释液。每个样品在室温(25℃)下在结合1分钟并解离10分钟的情况下进行分析。在每次注射后，芯片用3M MgCl2再生。同时拟合k_开和k_关的1:1Langmuir模型用于动力学分析。单体抗原流过固定的抗体产生不受抗体效价影响的结合结果。

通过表面等离子体共振，VIR47及其IgG1、V7和V8变体对人CD47具有相似的结合亲和力，其中KD值在5至50nM之间。CD47 BMK-1与人CD47结合的KD在1nM至5nM之间。

5.4.5抗体依赖性细胞吞噬作用

在OVISE卵巢癌细胞上测试了IgG1形式的VIR47及其工程改造的变体的ADCP活性，并与基准αCD47抗体进行比较。这三种形式的VIR47具有彼此相似的ADCP活性，但活性低于BMK-1基准。

5.4.6抗体依赖性细胞毒性

在表达高水平的CD47的CFPAC-1胰腺癌细胞上测试了抗CD47抗体介导抗体依赖性细胞毒性(ADCC)的能力。用平衡的盐溶液或培养基洗涤细胞一次，并将细胞的数量调节至1×10⁶个细胞/ml。然后将2μL的BATDA荧光增强配体(珀金埃尔默(Perkin Elmer)，目录号C136-100)加入到每毫升的细胞中，并在37℃下在细胞培养箱中温育20分钟。在温育后，对细胞进行离心，吸出培养基。用PBS洗涤标记的细胞4次。在最后一次洗涤后，将细胞重新悬浮在培养基中，并调节至5×10⁴个细胞/ml。然后将200μL细胞悬浮液添加到96孔板的每个孔中，以使每个孔的细胞数量达到1×10⁴。通过取出标记的靶细胞的等分试样、离心并将上清液转移到空孔中来确定背景释放。读数是背景释放。将1×10⁴个标记的靶细胞转移到无菌96孔测定板上。用含有10％FBS的RPMI-1640连续稀释抗体。将50μL连续稀释的抗体加入到含有靶细胞的测定板中，并在37℃、5％CO2下温育5-10分钟。收获效应细胞NK92/CD16a176V，并悬浮在含有10％FBS的RPMI-1640中。将50μl/孔效应细胞以不同的效应细胞与靶标的比率加入到测定板的每个孔中。设置对照：靶标自发(靶细胞+100μL培养基)；目标最大值(靶细胞+100μL培养基+10μL裂解缓冲液)；背景(100μL标记的靶细胞上清液和100μL稀释培养基)。将板在37℃下在潮湿的5％CO2气氛中温育2小时。在温育结束时，将10μL的裂解缓冲液(Perkin Elmer，目录号4005-0010)加入到最大释放孔中。将板以500g离心5分钟。将来自每个孔的20μL的上清液转移到平底检测板上。然后将200μL的铕溶液(PerkinElmer，目录号C135-100)加入到检测板的每个孔中。该板在室温下以250rpm摇动15分钟，然后在5小时内在时间分辨荧光计中测量荧光。

VIR47及其IgG1、V7和V8变体具有相当的ADCC活性。如所预期的，IgG4形式基本上没有活性。

5.4.7与红细胞的结合和血细胞凝集

与在红细胞或血小板上表达的CD47形式相比，优选结合到在肿瘤细胞上表达的CD47形式的CD47结合结构域对于增强治疗剂的安全性概况是期望的。

通过将新鲜人全血以200g离心10分钟来进行RBC结合测定。收集的RBC用PBS洗涤两次，并使用流式细胞术计数。将1×10⁶个细胞分配到96孔培养板的每个孔中。加入连续稀释的抗CD47抗体，并在4℃下温育1小时。用FACS缓冲液(PBS+2％FBS)洗涤细胞两次。添加二级抗体(Alexa

488山羊抗人IgG(H+L))，并在4℃下温育1小时。将细胞洗涤两次，并重悬于200μL的FACS缓冲液中，并且通过流式细胞术进行分析。

血细胞凝集测定通过稀释人红细胞(RBC)并在圆底96孔板中用CD47抗体滴定(从100μg/ml开始)在37℃下温育RBC持续2小时来进行。与非血凝的RBC相比，通过交联的RBC的存在证明了血细胞凝集，其表现为雾状，因为它们不沉降到孔的底部。

选择VIR47是因为其低RBC结合性和无血细胞凝集活性。IgG1形式和工程改造的变体共享这些特性。特别是，与CD47 BMK-1基准相比，对于RBC结合需要>20倍高浓度的VIR47及其变体。此外，即使在最高测试浓度(666.7nM)下，也未检测到任何VIR47变体的血细胞凝集。

5.5实施例5.VIR47的丙氨酸扫描

为了优化VIR47抗CD47抗体的结合亲和力，通过重链和轻链CDR3结构域的丙氨酸扫描诱变产生VIR47的IgG1形式的变体，如图3A和图3B所示。这些变体与人CD47的结合通过ELISA来测量，并且与亲本VIR47 IgG1抗体进行比较，如表7所示。

表7.通过ELISA来确定αCD47 mAb VIR47的CDR3丙氨酸扫描变体与人CD47的结合。对于huCD47的EC50范围—A：0.01nM-0.15nM；B：0.15nM-0.4nM；C：0.4nM-5nM；D：≥5nM。

5.6实施例6.工程改造和测试抗EpCAM结合结构域

通过用带有C末端Fc标签的人EpCAM蛋白(近岸蛋白(Novoprotein)，目录号CM50)结合带有C末端Fc标签的cyno-EpCAM蛋白(义翘神州(Sino Biological)，目录号90299-C02H)对小鼠进行免疫来产生抗EpCAM抗体。使用在(美国专利第5,597,725号)中描述的方法，使用B细胞来产生鼠杂交瘤。使用带有C末端His标签的人EpCAM通过ELISA进行初步筛选。通过ELISA对带有C末端His标签的人EpCAM(Novoprotein，目录号C339)进行二次筛选。还通过流式细胞术分析表达人EpCAM或不表达EpCAM的CHO-K1细胞来测试抗体的结合。表达对人EpCAM具有特异性的抗体的杂交瘤用于产生嵌合抗体。

5.6.1抗EpCAM结合结构域的序列

通过将EpCAM特异性鼠VH区与人IgG1恒定区融合来产生嵌合抗体。通过ELISA评估结合，并且经由流式细胞术分析评估细胞结合。来自这些研究的基准抗体是EpCAM BMK-6，表8-11总结了重链和轻链的结合结构域的多肽序列及其相应的CDR。

表8：抗EpCAM重链结合结构域的多肽序列。CDR被加下划线并加粗。

表9：抗EpCAM轻链结合结构域的多肽序列。CDR被加下划线并加粗。

表10：CDR序列抗EpCAM重链结合结构域。

表11：CDR序列抗EpCAM轻链结合结构域。

5.6.2抗EpCAM结合结构域的结合亲和力

嵌合抗EpCAM抗体与人EpCAM结合，其中通过ELISA，EC50值在0.1nM至1nM的范围内。

用转染人EpCAM的CHO-K1细胞通过流式细胞术测试嵌合抗体与细胞表面EpCAM的结合。mAb-1、mAb-2、mAb-8、mAb-8、mAb-28、mAb-30、mAb-33、mAb-35、mAb-36、mAb-39和EpCAMBMK-6与CHO-K1-huEpCAM细胞结合，其中EC50在0.5nM至10nM之间。

还测试了所选的嵌合抗体与表达EpCAM的肿瘤细胞系的表面结合的能力。在流式细胞术测定中，mAb-1、mAb-2、mAb-8、mAb-21和EpCAM BMK-6与MCF-7、Caco-2和A431细胞结合，其中EC50小于20nM。

通过表面等离子体共振来测量嵌合抗体与人EpCAM(Novoprotein#C339)的胞外结构域(ECD)的结合亲和力。在本测定中，mAb-1、mAb-2、mAb-4、mAb-8和EpCAM BMK-6具有在2nM至10nM范围内的结合亲和力，并且mAb-28、mAb33和mAb35具有在0.2nM至2nM范围内的结合亲和力。

5.7实施例7.具有工程改造的结合结构域的双特异性CD47×EpCAM抗体

5.7.1双特异性抗体结构

用衍生自VIR47.V8的工程改造的scFv CD47结合结构域和包括Mab-1、Mab-2或Mab-8的EpCAM结合结构域构建三链杵臼形式的双特异性抗体。这些抗体的重链多肽的序列在表12中示出，并且3C-KIH EpCAM×CD47 scFv双特异性抗体的多肽组成在表13中示出。

表12. 3C-KIH EpCAM-CD47 scFv双特异性抗体的重链多肽序列。

表13. 3C-KIH EpCAM-CD47 scFv双特异性抗体的多肽组成。

5.7.2结合活性

通过ELISA将这些双特异性抗体与人CD47和人EpCAM的结合与具有相同结合结构域的二价抗体的结合进行比较。如所预期的，Bi-1、Bi-2和Bi-8 CD47×EpCAM双特异性抗体与CD47和EpCAM两者结合。图4示出了Bi-1与CD47(图4A)和EpCAM(图4B)的结合。

5.7.3抑制CD47与固定化的SIRPα的结合

通过ELISA测试CD47与固定化的SIRPα蛋白结合的抑制。96孔板的孔用每孔100μl的1μg/ml的在PBS中的CD47 BMK-4包被，并在4℃下温育过夜。第二天，用每孔300μl封闭缓冲液(在PBST中的1％BSA)在37℃下封闭该板1.5小时。然后用PBST洗涤板三次。从30μg/ml开始制备mAb的系列1:5稀释液，并在总共50μl的封闭缓冲液中与huCD47-His(0.11μg/ml)混合，并加入到包被的板中。在37℃下温育1小时后，用PBST洗涤板三次。将100μl的稀释1:5000的THETM His抗体[HRP](金斯瑞(Genscript)，目录号A00612)加入到每个孔中，然后在37℃下温育45分钟。将100μl的TMB(InnoReagents，目录号TMB-S-003)加入到每个孔中，并且在室温下显色5分钟。使用50μl的1N HCl猝灭反应。板上的反应产物在450nM处定量。

通过ELISA测量CD47×EpCAM双特异性抗体抑制CD47与SIRPα结合的能力，并与CD47 BMK-1进行比较。Bi-1、Bi-2和Bi-8双特异性抗体抑制SIRPα与CD47蛋白的结合。具有两个CD47结合结构域的CD47BMK-1抗体在比双特异性抗体低5倍至50倍的浓度下抑制SIRPα与CD47蛋白的结合。

5.7.4抑制SIRPΑ与CD47+细胞的结合

收获肿瘤细胞，离心，然后以2×10⁶个细胞/mL的浓度重悬于FACS缓冲液(PBS加上2％FBS)中。将100μL的细胞悬浮液分配到96孔板的每个孔中。将板在300g下离心5分钟，并弃去上清液。将细胞用每孔50μl连续稀释的双特异性或二价抗CD47抗体和恒定量的SIRPα-mIgG2a融合蛋白(对于Raji细胞为0.2μg/ml；对于OVISE细胞为2.5μg/ml)在FACS缓冲液中在4℃下孵育1小时。然后，用FACS缓冲液洗涤板两次，并用100μL的Alexa Fluor 488驴抗小鼠IgG(H+L)二级抗体(Invitrogen，目录号A21202，1:1000)在4℃下在黑暗中温育1小时。在用FACS缓冲液洗涤两次后，用300μL FACS缓冲液重悬板，并通过流式细胞术进行分析。

双特异性抗体Bi-2抑制SIRPα与CD47+/EpCAM+OVISE细胞的结合，其中EC50小于αCD47 VIR47.V8(一种具有相同CD47结合结构域的二价抗体)的EC50(图5A)。相比之下，Bi-2和Bi-8在抑制SIRPα与Raji细胞结合方面效果差得多，Raji细胞是CD47+，但表达比OVISE细胞低>40倍的EpCAM(图5B；参见表2)。这些结果证明了EpCAM表达对于双特异性CD47×EpCAM抗体特异性靶向CD47+/EpCAM+细胞的重要性，以及双特异性CD47×EpCAM抗体抑制CD47+/EpCAM+细胞上CD47/SIRPa相互作用的能力。

5.7.5 CD47+EpCAM+癌细胞系的吞噬作用

在ADCP测定中测试了Bi-1、Bi-2和Bi-8促进A431外阴癌细胞的吞噬作用的能力，并与具有相同CD47或EpCAM结合结构域的二价IgG1抗体进行了比较。所有三种双特异性抗体都促进A431细胞的吞噬作用。与非特异性IgG1对照相比，吞噬作用增加>10倍。Bi-1、Bi-2和Bi-8双特异性抗体比具有相同抗CD47结合结构域的二价αCD47抗体(>10nM)具有更低的EC50值(0.01-3nM)。作为实例的Bi-2的结果在图6中示出。抗EpCAM mAb可能独立于CD47-SIRPα不要吃我信号发挥作用，并通过与吞噬细胞上的Fc受体直接相互作用来促进吞噬作用。

5.7.6与非肿瘤细胞的减少的脱靶结合

在血细胞凝集和流式细胞术测定中测试了Bi-1、Bi-2和Bi-8CD47×EpCAM双特异性抗体的肿瘤外效应。如图7所示，与CD47 BMK-1基准抗体相比，具有源自VIR47的CD47结合结构域的二价和双特异性抗体不诱导RBC的血细胞凝集。

在流式细胞术测定中，在高达500nM的浓度下，未检测到Bi-1、Bi-2或Bi-8与RBC的结合。在大约1nM的EC50的情况下检测到CD47BMK-1基准抗体的显著结合。亲本二价抗CD47抗体VIR47.V8 mAb具有比CD47 BMK-1显著更小的结合，并且在较低的浓度下具有比CD47BMK-3基准抗体更低的结合，作为实例的Bi-2的结果在图8A中示出。

在血小板上，在100nM和更高的浓度下检测到适量的Bi-1、Bi-2和Bi-8结合，如图8B所示。Bi-1、Bi-2和Bi-8具有比抗CD47基准试剂(包括CD47 BMK-1和CD47 BMK-3mAb)中的任何一种更少的与血小板的结合。此外，亲本抗CD47 VIR47.V8抗体比两种基准抗CD47抗体具有更低的亲和力。

5.7.7抗体依赖性细胞毒性

CD47×EpCAM双特异性抗体也可以通过抗体依赖性细胞毒性(ADCC)介导其治疗效果。使用具有不同CD47和EpCAM表达水平的癌细胞系测量ADCC活性，如表14所示。Bi-1、Bi-2和Bi-8在所有测试的CD47+EpCAM+细胞系中具有ADCC活性。具有最高EpCAM亲和力的Bi-8具有最高的ADCC活性。亲本抗CD47抗体VIR47.V8在所有细胞系中具有比Bi-8更低的ADCC，并且在除SKOV-3卵巢癌细胞之外的所有细胞系中具有比Bi-2更低的ADCC活性，具有中等EpCAM亲和力，SKOV-3卵巢癌细胞具有相对更高的CD47表达和更低的EpCAM表达。

表14.双特异性和二价抗体针对癌细胞系的抗体依赖性细胞毒性活性。

结果以EC50(nM)值表示。

*n.d.：未确定；N/A：不适用(未测试)

5.8实施例8：抗CD47/抗EGFR双特异性抗体的产生

使用来自抗CD47抗体VIR47.V8和抗EGFR抗体西妥昔单抗(Cetuximab)序列的V_H和V_L序列，设计并产生了具有不同结合化学计量比和几何结构的抗CD47/EGFR双特异性抗体。合成了相应的重链(HC)和轻链(LC)DNA，并将其克隆到pRK5哺乳动物表达载体(ATCC)中。然后将每对HC和LC在CHO细胞中共转染。通过离心(4℃，4000rpm持续40分钟)收获条件培养基，然后过滤以除去细胞碎片。将澄清的培养基装载到MabSelect SuRe柱(GE，17-5438)上，该柱用缓冲液A(25mM Tris，150mM NaCl，pH 8.0)进行预平衡。依次用5柱体积的缓冲液A、然后用30柱体积的缓冲液B(缓冲液A+0.1％Triton X100+0.1％Triton X114)、然后用15柱体积的缓冲液A洗涤柱。用缓冲液C(100mM柠檬酸钠，150mM NaCl，pH 3.0)洗脱抗体，并立即用缓冲液D(200mM精氨酸，137mM琥珀酸，pH 5.0)中和抗体。用pH7.4的PBS缓冲液透析最终产物，浓缩，并通过MILLEX-MP 0.22um(MILLIPORE)过滤。

图9A-9B示出了为评估而产生的并且被称为西妥昔单抗.Fab/VIR47.V8.scFv.双特异性(9A)和VIR47.V8.Fab/西妥昔单抗.双特异性(9B)的双特异性格式，并且氨基酸和核苷酸序列在表15-17中提供。

表15.如通过Kabat定义确定的西妥昔单抗(抗EGFR)的CDR序列。

表16.西妥昔单抗.Fab/VIR47.V8 scFv.双特异性

表17.VIR47.V8.Fab/西妥昔单抗.scFv.双特异性

5.9实施例9：通过ELISA测量的抗体与抗原的结合

96孔板用1μg/ml重组huCD47或huEGFR在4℃下包被过夜。在洗涤3次后，在37℃下用300μl的在PBST中的1％BSA封闭板1小时。加入连续稀释的抗体，并在37℃下温育1小时。然后用PBST洗涤该板4次，并与1:5000稀释的过氧化物酶标记的山羊抗人IgG(Fab特异性)二级抗体(Sigma，目录号A0293)在37℃下温育1小时。用PBST再次洗涤该板4次，在室温下与3,3′,5,5′-四甲基联苯胺(TMB)底物温育15分钟，用1N HCl终止，然后在450nM处读取。图10A-10B分别示出了抗CD47/EGFR双特异性抗体在人CD47和人EGFR上的ELISA结合结果。

5.10实施例10：抑制SIRPα与CD47+细胞的结合

收获肿瘤细胞，离心，然后以2×10⁶个细胞/mL的浓度重悬于FACS缓冲液(PBS加上2％FBS)中。将100μL的细胞悬浮液分配到96孔板的每个孔中。将板在300g下离心5分钟，弃去上清液。将细胞与50μL每孔连续稀释的双特异性或二价抗CD47抗体和恒定量的SIRPα-mIgG2a融合蛋白(对于A431细胞为1μg/ml)在FACS缓冲液中在4℃下温育1小时。然后，将板用FACS缓冲液洗涤两次，并与100μL的Alexa Fluor 488驴抗小鼠IgG(H+L)二级抗体(Invitrogen，目录号A21202，1:1000)在4℃下在黑暗中温育1小时。在用FACS缓冲液洗涤两次后，用300μL的FACS缓冲液重悬板，并通过流式细胞术进行分析。

图11示出了A431细胞上抗CD47/EGFR双特异性抗体的SIRPα阻断结果，其显示了CD47以及EGFR的高表达，具有指导EGFR，双特异性VIR47.V8/西妥昔单抗显示出优于VIR47.V8的SIRPα阻断活性5.11实施例11：抗体依赖性细胞吞噬作用

在抗体依赖性细胞吞噬作用(ADCP)测定中测试双特异性抗体。从人类供体中分离外周血单核细胞(PBMC)。使用没有CD16耗竭的人单核细胞富集试剂盒(STEMCELL，目录号19058)富集单核细胞。通过在含有20ng/ml的人巨噬细胞集落刺激因子(M-CSF，Peprotech，目录号3-25-10)的完全培养基(RPMI 1640+10％FBS)中培养单核细胞，将分离的单核细胞分化成巨噬细胞。每三天更换一次培养基。在含有M-CSF的培养基中培养7天后，收集巨噬细胞并计数。收集靶肿瘤细胞并用D-PBS洗涤两次以除去剩余的FBS。洗涤的肿瘤细胞以5-10×10⁶/mL的细胞浓度重悬于PBS中。癌细胞用终浓度为3μM的CFSE(ebiosciences，目录号65-0580-84)染色，并立即混合。细胞在室温下在黑暗中染色10分钟。通过加入4-5体积的冷完全培养基并在冰上温育5分钟来终止染色。用RPMI 1640+10％FBS洗涤染色的细胞三次。将细胞重悬于1ml RPMI 1640+10％FBS中并计数，然后将细胞数量调整至3×10⁵个细胞/mL。将50μl细胞接种到96孔深U形板(Axygen，目录号P-DW-20-C)中，其中每个孔含有1.5×10⁴个细胞。向每个孔中加入50μl稀释的抗体。向每个孔中加入100μl的巨噬细胞(1.5×10⁴个细胞)，并在37℃、5％CO2下温育1.5小时。在温育后，用2ml的在D-PBS中的2％FBS洗涤细胞一次。加入100μl稀释的Fc阻断剂(人TruStain FcX(Fc受体阻断溶液)，Biolegend目录号422302)，并且将细胞在室温下温育10分钟。向每个孔中加入20μl稀释的抗人CD11b抗体，并在4℃下在黑暗中温育30分钟。用2％FBS-D-PBS洗涤细胞一次。通过CFSE/CD11b双阳性细胞的出现在流式细胞仪中检测吞噬作用，所述双阳性细胞指示吞噬肿瘤细胞的巨噬细胞。

在图12中，与VIR47.V8二价抗体和BMK-1相比，双特异性抗体西妥昔单抗/VIR47.V8显示出更好的ADCP活性。

5.12实施例12：抗体与红细胞/血小板的结合和血细胞凝集

通过将新鲜人全血以200g离心10分钟来进行RBC结合测定。收集的RBC用PBS洗涤两次，并使用流式细胞术计数。将1×10⁶个细胞分配到96孔培养板的每个孔中。加入连续稀释的抗CD47抗体，并在4℃下温育1小时。用FACS缓冲液(PBS+2％FBS)洗涤细胞两次。添加二级抗体(Alexa

488山羊抗人IgG(H+L))，并在4℃下温育1小时。将细胞洗涤两次，并重悬于200μL的FACS缓冲液中，并且通过流式细胞术进行分析。

血细胞凝集测定通过稀释人红细胞(RBC)并在圆底96孔板中用CD47抗体滴定(从100μg/ml开始)在37℃下温育RBC持续2小时来进行。与非血凝的RBC相比，通过交联的RBC的存在证明了血细胞凝集，其表现为雾状，因为它们不沉降到孔的底部。

在图13A-13B中，与CD47 BMK-1基准抗体及其亲本VIR47.V8二价抗体相比，双特异性抗体西妥昔单抗/VIR47.V8显示出更少的RBC和血小板结合。此外，即使在最高测试浓度(666.7nM；数据未显示)下，也未检测到VIR47.V8/西妥昔单抗的血细胞凝集。

5.13实施例13：在SNU-5胃癌异种移植模型中研究了CD47×EGFR双特异性抗体的体内抗肿瘤活性。

在37℃下，在空气中在5％CO₂的气氛中，在补充有20％热灭活胎牛血清的Iscove氏改良Dulbecco氏培养基中培养SNU-5肿瘤细胞。收获在指数生长期生长的肿瘤细胞用于肿瘤接种。对6-7周龄的雌性CB17/SCID小鼠(上海灵昌生物技术有限公司(ShanghaiLingchang Biotechnology))皮下接种在0.2mL的补充有Matrigel(1:1)的PBS中的10⁷个细胞以用于肿瘤发育。使用卡尺装置测量肿瘤体积，并用以下公式计算：肿瘤体积＝(长度×宽度²)/2。在肿瘤接种后第6天，当平均肿瘤体积达到约175mm³时，按照肿瘤体积将动物随机分成每组6只动物。测试抗体以10mg/kg的剂量通过团注尾静脉注射施用，每周一次，连续五周。每周测量两次肿瘤体积。如果动物的肿瘤体积超过3000mm³或者如果它们经历了超过20％的体重减轻，则对它们进行人道安乐死。

结果总结在图14中。用双特异性抗体CD47×EGFR和二价CD47抗体的治疗导致完全肿瘤消退，而用西妥昔单抗抗体的治疗仅抑制肿瘤生长。此外，CD47×EGFR双特异性抗体组和CD47抗体组中的所有小鼠都保持无肿瘤，直到研究结束。这些数据证明CD47×EGFR双特异性抗体优于其针对表达EGFR和CD47的胃癌的单特异性亲本西妥昔单抗的体内抗肿瘤活性。

虽然本文已经示出和描述了本发明的优选实施方案，但对本领域的技术人员显而易见的是，此类实施方案仅作为实例提供。这并不意味着本发明受说明书中提供的特定实例的限制。虽然已经参考前述说明书描述了本发明，但是本文的实施方案的描述和说明并不意味着以限制的意义来解释。在不脱离本发明的情况下，本领域的技术人员将会想到许多变化、改变和替换。此外，应当理解，本发明的所有方面不限于本文阐述的特定描述、配置或相对比例，其取决于多种条件和变量。应当理解，在实施本发明时，可以采用本文描述的本发明的实施方案的各种替代方案。因此，预期本发明还将覆盖任何此类替代、修改、变化或等同项。所附权利要求旨在限定本发明的范围，并且由此涵盖这些权利要求及其等同项的范围内的方法和结构。

序列表

<110> 维尔托索宾科公司

<120> 用于治疗CD47相关疾病的双特异性抗体

<130> 55429-708.602

<140>

<141>

<150> PCT/CN2020/086815

<151> 2020-04-24

<160> 163

<170> PatentIn 版本 3.5

<210> 1

<211> 450

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的描述: 合成的

多肽

<400> 1

Gln Met Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Thr Gly Ser

1 5 10 15

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Gly Trp Ile Asp Pro Asp Gln Gly Asp Thr Glu Tyr Ala Gln Lys Phe

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225 230 235 240

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245 250 255

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<210> 2

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<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的描述: 合成的

多肽

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<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的描述: 合成的

多肽

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<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的描述: 合成的

多肽

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<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的描述: 合成的

多肽

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<211> 214

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的描述: 合成的

多肽

<400> 6

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<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的描述: 合成的

多肽

<400> 7

Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

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180 185 190

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355 360 365

Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu

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Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu

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Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys

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Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu

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435 440 445

Lys

<210> 8

<211> 214

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的描述: 合成的

多肽

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Thr Ala Arg Ile Thr Cys Ser Gly Asp Ala Leu Pro Lys Lys Tyr Ala

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Tyr Trp Tyr Gln Gln Lys Ser Gly Gln Ala Pro Val Leu Val Ile Tyr

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Glu Asp Asn Lys Arg Pro Ser Gly Ile Pro Glu Arg Phe Ser Gly Ser

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Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Tyr Ser Thr Asp Ile Ser Gly Asn His

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Ala Ala Pro Ser Val Thr Leu Phe Pro Pro Ser Ser Glu Glu Leu Gln

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<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的描述: 合成的

多肽

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Lys

<210> 10

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<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的描述: 合成的

多肽

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<210> 11

<211> 214

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的描述: 合成的

多肽

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1 5 10 15

Thr Ala Arg Ile Thr Cys Ser Gly Asp Ala Leu Pro Lys Lys Tyr Ala

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50 55 60

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65 70 75 80

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210

<210> 12

<211> 449

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的描述: 合成的

多肽

<400> 12

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1 5 10 15

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Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser

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355 360 365

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370 375 380

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385 390 395 400

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405 410 415

Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu

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435 440 445

Lys

<210> 13

<211> 119

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的描述: 合成的

多肽

<400> 13

Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asn Phe

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<210> 14

<211> 214

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的描述: 合成的

多肽

<400> 14

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1 5 10 15

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210

<210> 15

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<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的描述: 合成的

肽

<400> 15

Asn Phe Ala Met Ser

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<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的描述: 合成的

肽

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Gly

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<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的描述: 合成的

肽

<400> 17

Glu Gly Ser Phe Gly Glu Gly Val Asp Pro

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<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的描述: 合成的

肽

<400> 18

Ser Gly Asp Ala Leu Pro Lys Lys Tyr Ala Tyr

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<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的描述: 合成的

肽

<400> 19

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<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的描述: 合成的

肽

<400> 20

Tyr Ser Thr Asp Ile Ser Gly Asn His Trp Val

1 5 10

<210> 21

<211> 123

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的描述: 合成的

多肽

<400> 21

Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Glu Leu Val Lys Pro Gly Thr

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<210> 22

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<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的描述: 合成的

多肽

<400> 22

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Lys Gly

1 5 10 15

Ser Leu Lys Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Asn Thr Tyr

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Ala Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

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<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的描述: 合成的

多肽

<400> 23

Gln Val Gln Leu Gln Gln Pro Gly Ala Glu Leu Val Arg Pro Gly Thr

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Ser Val Lys Leu Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr

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<210> 24

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<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的描述: 合成的

多肽

<400> 24

Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Ala Arg Pro Gly Ala

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Ser Val Gln Leu Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr

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<210> 25

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<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的描述: 合成的

多肽

<400> 25

Asp Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Gln

1 5 10 15

Ser Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Thr Gly Tyr Ser Ile Thr Ser Asp

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Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ala

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<210> 26

<211> 116

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的描述: 合成的

多肽

<400> 26

Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Ala Arg Pro Gly Ala

1 5 10 15

Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr

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115

<210> 27

<211> 113

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的描述: 合成的

多肽

<400> 27

Glu Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala

1 5 10 15

Ser Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Tyr

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Ala

<210> 28

<211> 115

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的描述: 合成的

多肽

<400> 28

Glu Val Leu Leu Gln Gln Ser Val Ala Asp Leu Val Arg Pro Gly Ala

1 5 10 15

Ser Val Lys Leu Ser Cys Thr Ala Ser Gly Leu Asn Ile Lys Asn Thr

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Leu Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Thr Ala Ile Tyr Tyr Cys

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100 105 110

Val Ser Ser

115

<210> 29

<211> 115

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的描述: 合成的

多肽

<400> 29

Glu Val Gln Leu Gln Gln Ser Val Ala Glu Leu Val Arg Pro Gly Ala

1 5 10 15

Ser Val Lys Leu Ser Cys Thr Ala Ser Gly Phe Asn Ile Lys Asn Thr

20 25 30

Tyr Met His Trp Val Lys Gln Arg Pro Glu Gln Gly Leu Glu Trp Ile

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Gly Arg Ile Ala Pro Ala Asn Gly Asn Thr Lys Tyr Ala Pro Lys Phe

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Leu Gln Leu Gly Ser Leu Thr Ser Glu Asp Thr Ala Ile Tyr Tyr Cys

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100 105 110

Val Ser Ser

115

<210> 30

<211> 117

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的描述: 合成的

多肽

<400> 30

Gln Val Gln Val Gln Gln Ser Gly Pro Glu Leu Val Lys Pro Gly Thr

1 5 10 15

Ser Val Lys Ile Ser Cys Lys Thr Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Tyr

20 25 30

Tyr Ile Thr Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile

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Gly Trp Ile Phe Pro Gly Arg Gly Ile Ser Phe Tyr Asn Glu Asn Phe

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Lys Asp Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Lys Ser Ser Asn Thr Ala Phe

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100 105 110

Ile Thr Val Ser Ala

115

<210> 31

<211> 115

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的描述: 合成的

多肽

<400> 31

Glu Val Gln Leu Gln Gln Ser Val Ala Glu Leu Val Arg Pro Gly Ala

1 5 10 15

Ser Val Lys Leu Ser Cys Thr Ala Ser Gly Phe Asn Ile Lys Asn Thr

20 25 30

Tyr Met His Trp Val Lys Gln Arg Pro Glu Gln Gly Leu Glu Trp Ile

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Val Ser Ser

115

<210> 32

<211> 116

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的描述: 合成的

多肽

<400> 32

Gln Ile Gln Leu Val Gln Ser Gly Pro Glu Leu Lys Lys Pro Gly Glu

1 5 10 15

Thr Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr

20 25 30

Gly Val Thr Trp Val Lys Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Lys Trp Met

35 40 45

Gly Trp Ile Asn Thr Tyr Ser Gly Val Pro Thr Tyr Ala Asp Asp Phe

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Ala Phe Ser Leu Glu Thr Ser Ala Ser Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Ile Asn Asn Leu Lys Asn Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Phe Cys

85 90 95

Ala Arg Ser His Ser Asn Tyr Asp Phe Trp Gly Gln Gly Thr Thr Leu

100 105 110

Thr Val Ser Ser

115

<210> 33

<211> 107

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的描述: 合成的

多肽

<400> 33

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Leu Gly

1 5 10 15

Glu Arg Val Ser Leu Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Ile Gly Asn Ser

20 25 30

Leu Asn Trp Leu Gln Gln Lys Pro Asp Gly Thr Ile Lys Arg Leu Ile

35 40 45

Tyr Val Thr Ser Arg Leu Asp Ser Gly Val Pro Lys Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Arg Ser Gly Ser Asp Tyr Phe Phe Thr Ile Ser Ser Leu Glu Ser

65 70 75 80

Glu Asp Phe Ala Asp Tyr Tyr Cys Leu Gln Tyr Ala Ser Ser Pro Phe

85 90 95

Thr Phe Gly Ser Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys

100 105

<210> 34

<211> 107

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的描述: 合成的

多肽

<400> 34

Asp Ile Leu Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ile Leu Ser Val Ser Pro Gly

1 5 10 15

Glu Arg Val Ser Phe Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Gly Thr Ser

20 25 30

Leu His Trp Tyr Gln Gln Arg Thr Asn Gly Ser Pro Arg Leu Leu Ile

35 40 45

Lys Tyr Ala Ser Glu Ser Ile Ser Gly Ile Pro Ser Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Ser Ile Asn Ser Val Glu Ser

65 70 75 80

Glu Asp Ile Ala Asp Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Asn Ser Trp Pro Tyr

85 90 95

Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys

100 105

<210> 35

<211> 112

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的描述: 合成的

多肽

<400> 35

Asp Val Leu Leu Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu Ser Val Ser Leu Gly

1 5 10 15

Asp Gln Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Phe Val His Ile

20 25 30

Asn Gly Asn Thr Tyr Leu Glu Trp Phe Leu Gln Lys Pro Gly Leu Ser

35 40 45

Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro

50 55 60

Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile

65 70 75 80

Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Leu Gly Ile Tyr Tyr Cys Phe Gln Gly

85 90 95

Ser His Val Pro Leu Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys

100 105 110

<210> 36

<211> 106

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的描述: 合成的

多肽

<400> 36

Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ile Thr Ala Ala Ser Leu Gly

1 5 10 15

Gln Lys Val Thr Ile Thr Cys Ser Ala Ser Ser Ser Val Ser Asp Met

20 25 30

His Trp Tyr Gln Gln Lys Ser Gly Thr Ser Pro Lys Pro Trp Ile Tyr

35 40 45

Glu Ile Ser Lys Leu Ala Ser Gly Val Pro Thr Arg Phe Ser Gly Ser

50 55 60

Gly Ser Gly Thr Ser Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Ser Met Glu Ala Glu

65 70 75 80

Asp Ala Ala Ile Tyr Tyr Cys Gln His Trp Ser Tyr Pro Leu Met Thr

85 90 95

Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys

100 105

<210> 37

<211> 112

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的描述: 合成的

多肽

<400> 37

Asp Val Val Met Thr Gln Thr Pro Leu Thr Leu Ser Val Thr Ile Gly

1 5 10 15

Gln Pro Ala Ser Ile Ser Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Asp Ser

20 25 30

Asp Gly Lys Thr Tyr Leu Asn Trp Leu Leu Gln Arg Pro Gly Gln Ser

35 40 45

Pro Lys Arg Leu Ile Tyr Leu Val Ser Lys Leu Asp Ser Gly Val Pro

50 55 60

Asp Arg Phe Thr Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile

65 70 75 80

Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Leu Gly Val Tyr Tyr Cys Trp Gln Gly

85 90 95

Thr His Phe Pro Gln Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys

100 105 110

<210> 38

<211> 112

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的描述: 合成的

多肽

<400> 38

Asp Ile Val Met Thr Gln Ala Ala Phe Ser Asn Pro Val Thr Leu Gly

1 5 10 15

Thr Ser Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Lys Ser Leu Leu His Ser

20 25 30

Asn Gly Phe Thr Tyr Leu His Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser

35 40 45

Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Gln Met Ser Ser Leu Ala Ser Gly Val Pro

50 55 60

Asp Arg Phe Ser Ser Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Arg Ile

65 70 75 80

Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Ala Gln Asn

85 90 95

Leu Glu Leu Pro Arg Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys

100 105 110

<210> 39

<211> 112

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的描述: 合成的

多肽

<400> 39

Asp Val Leu Met Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val Ser Leu Gly

1 5 10 15

Asp Gln Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Ile Val Asp Ser

20 25 30

Asp Gly Ser Thr Tyr Leu Glu Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser

35 40 45

Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro

50 55 60

Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile

65 70 75 80

Ser Gly Val Glu Ala Glu Asp Leu Gly Val Tyr Tyr Cys Phe Gln Gly

85 90 95

Ser His Val Pro Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys

100 105 110

<210> 40

<211> 111

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的描述: 合成的

多肽

<400> 40

Asp Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly

1 5 10 15

Gln Arg Ala Thr Ile Ser Cys Arg Ala Ser Glu Ser Val Asp Asn Ser

20 25 30

Gly Ile Ser Phe Met His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro

35 40 45

Lys Leu Leu Ile Tyr Arg Ala Ser Asn Leu Glu Ser Gly Ile Pro Ala

50 55 60

Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Arg Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Asn

65 70 75 80

Pro Val Glu Thr Asp Asp Val Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Tyr

85 90 95

Glu Asn Pro Trp Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys

100 105 110

<210> 41

<211> 111

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的描述: 合成的

多肽

<400> 41

Asp Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly

1 5 10 15

Gln Arg Ala Thr Ile Ser Cys Arg Ala Ser Glu Ser Val Asp Asn Tyr

20 25 30

Gly Ile Ser Phe Met His Trp Phe Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro

35 40 45

Lys Leu Leu Ile Phe Arg Ala Ser Ser Leu Glu Ser Gly Ile Pro Ala

50 55 60

Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Arg Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Asn

65 70 75 80

Pro Val Glu Thr Asp Asp Val Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Tyr

85 90 95

Lys Asp Pro Trp Thr Phe Gly Gly Ala Thr Lys Leu Glu Ile Lys

100 105 110

<210> 42

<211> 106

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的描述: 合成的

多肽

<400> 42

Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ile Thr Ala Ala Phe Leu Gly

1 5 10 15

Gln Lys Val Thr Ile Thr Cys Ser Ala Ser Ser Ser Val Ser Tyr Ile

20 25 30

His Trp Tyr Gln Gln Lys Ser Asp Thr Ser Pro Lys Pro Trp Ile Tyr

35 40 45

Glu Ile Ser Lys Leu Ala Ser Gly Val Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser

50 55 60

Gly Ser Gly Thr Ser Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Ser Met Glu Ala Glu

65 70 75 80

Asp Ala Ala Ile Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp Asn Tyr Pro Leu Ile Thr

85 90 95

Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys

100 105

<210> 43

<211> 111

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的描述: 合成的

多肽

<400> 43

Asp Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Thr Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly

1 5 10 15

Gln Arg Ala Thr Ile Ser Cys Arg Ala Ser Glu Ser Val Asp Asn Tyr

20 25 30

Gly Ile Ser Phe Met His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro

35 40 45

Lys Leu Leu Ile Tyr Arg Ala Ser Ser Leu Glu Ser Gly Ile Pro Ala

50 55 60

Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Arg Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Asn

65 70 75 80

Pro Val Glu Ser Asp Asp Val Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Tyr

85 90 95

Lys Asp Pro Trp Thr Phe Gly Gly Ala Thr Lys Leu Glu Ile Lys

100 105 110

<210> 44

<211> 107

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的描述: 合成的

多肽

<400> 44

Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Gln Lys Phe Met Ser Thr Thr Val Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Ser Ile Thr Cys Gln Ala Ser Gln Asn Val Gly Thr Asp

20 25 30

Val Gly Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro Lys Leu Leu Ile

35 40 45

Tyr Ser Ala Ser Asn Arg Tyr Thr Gly Val Pro Asp Arg Phe Thr Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Asn Met Gln Ser

65 70 75 80

Glu Asp Leu Ala Asp Tyr Phe Cys Gln Gln Tyr Ser Ser Tyr Pro Arg

85 90 95

Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys

100 105

<210> 45

<211> 5

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的描述: 合成的

肽

<400> 45

Ser Tyr Asp Ile Asn

1 5

<210> 46

<211> 20

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的描述: 合成的

肽

<400> 46

Trp Ile Gly Trp Ile Tyr Pro Arg Asp Gly Ser Thr Lys Tyr Asn Glu

1 5 10 15

Arg Phe Lys Gly

20

<210> 47

<211> 14

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的描述: 合成的

肽

<400> 47

Asp Pro Tyr Tyr Tyr Gly Thr Ile Tyr Gly Tyr Phe Asp Val

1 5 10

<210> 48

<211> 5

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的描述: 合成的

肽

<400> 48

Thr Tyr Ala Met His

1 5

<210> 49

<211> 19

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的描述: 合成的

肽

<400> 49

Arg Ile Arg Ser Lys Thr Tyr Asn Tyr Ala Thr Phe Tyr Ala Asp Ser

1 5 10 15

Val Lys Asp

<210> 50

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<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的描述: 合成的

肽

<400> 50

Gly Ser Ser Tyr Ala Met Asp Tyr

1 5

<210> 51

<211> 5

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的描述: 合成的

肽

<400> 51

Ser Tyr Trp Met His

1 5

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<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的描述: 合成的

肽

<400> 52

Val Ile Asp Pro Ser Asn Ser Tyr Ser Asn Tyr Asn Gln Lys Phe Lys

1 5 10 15

Gly

<210> 53

<211> 11

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的描述: 合成的

肽

<400> 53

Pro Tyr Asn His Gly Arg Asp Ala Met Asp Tyr

1 5 10

<210> 54

<211> 5

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的描述: 合成的

肽

<400> 54

Ser Tyr Gly Ile Ser

1 5

<210> 55

<211> 17

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的描述: 合成的

肽

<400> 55

Glu Ile Tyr Pro Arg Ser Asp Asn Thr Tyr Tyr Asn Glu Lys Phe Lys

1 5 10 15

Gly

<210> 56

<211> 8

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的描述: 合成的

肽

<400> 56

Arg Ala Gly Met Trp Phe Ala Tyr

1 5

<210> 57

<211> 6

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的描述: 合成的

肽

<400> 57

Ser Asp Phe Ala Trp Asn

1 5

<210> 58

<211> 16

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的描述: 合成的

肽

<400> 58

Tyr Ile Thr Tyr Ser Gly Thr Thr Ser Tyr Asn Pro Ser Leu Lys Ser

1 5 10 15

<210> 59

<211> 11

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的描述: 合成的

肽

<400> 59

Ser Phe His Phe Phe Ala Tyr Gly Phe Ala Tyr

1 5 10

<210> 60

<211> 5

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的描述: 合成的

肽

<400> 60

Ser Tyr Gly Ile Ser

1 5

<210> 61

<211> 17

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的描述: 合成的

肽

<400> 61

Glu Ile Tyr Pro Thr Arg Asp Tyr Thr Tyr Tyr Asn Glu Asn Phe Lys

1 5 10 15

Gly

<210> 62

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的描述: 合成的

肽

<400> 62

Asp Gly Pro Pro Phe Ala Tyr

1 5

<210> 63

<211> 5

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的描述: 合成的

肽

<400> 63

Asp Tyr Tyr Met Ser

1 5

<210> 64

<211> 17

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的描述: 合成的

肽

<400> 64

Glu Ile Asn Pro Asp Asn Gly Asp Thr Ser His Asn Gln Lys Phe Lys

1 5 10 15

Gly

<210> 65

<211> 4

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的描述: 合成的

肽

<400> 65

Tyr Phe Ser Tyr

1

<210> 66

<211> 5

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的描述: 合成的

肽

<400> 66

Asn Thr Tyr Ile His

1 5

<210> 67

<211> 17

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的描述: 合成的

肽

<400> 67

Arg Ile Gly Pro Ala Asn Gly Asn Thr Lys Tyr Ala Pro Lys Phe Gln

1 5 10 15

Gly

<210> 68

<211> 6

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的描述: 合成的

肽

<400> 68

Ala Tyr Tyr Arg Ile Tyr

1 5

<210> 69

<211> 5

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的描述: 合成的

肽

<400> 69

Asn Thr Tyr Met His

1 5

<210> 70

<211> 17

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的描述: 合成的

肽

<400> 70

Arg Ile Ala Pro Ala Asn Gly Asn Thr Lys Tyr Ala Pro Lys Phe Gln

1 5 10 15

Asp

<210> 71

<211> 6

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的描述: 合成的

肽

<400> 71

Ile Tyr Gln Leu Pro Tyr

1 5

<210> 72

<211> 5

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的描述: 合成的

肽

<400> 72

Asp Tyr Tyr Ile Thr

1 5

<210> 73

<211> 17

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的描述: 合成的

肽

<400> 73

Trp Ile Phe Pro Gly Arg Gly Ile Ser Phe Tyr Asn Glu Asn Phe Lys

1 5 10 15

Asp

<210> 74

<211> 8

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的描述: 合成的

肽

<400> 74

Trp Gly Gly Thr Trp Phe Ala Tyr

1 5

<210> 75

<211> 5

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的描述: 合成的

肽

<400> 75

Asn Thr Tyr Met His

1 5

<210> 76

<211> 17

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的描述: 合成的

肽

<400> 76

Arg Ile Ala Pro Ala Asn Gly Asn Thr Lys Tyr Asp Pro Lys Phe Gln

1 5 10 15

Asp

<210> 77

<211> 6

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的描述: 合成的

肽

<400> 77

Ile Tyr Gln Leu Pro Tyr

1 5

<210> 78

<211> 5

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的描述: 合成的

肽

<400> 78

Ser Tyr Gly Val Thr

1 5

<210> 79

<211> 17

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的描述: 合成的

肽

<400> 79

Trp Ile Asn Thr Tyr Ser Gly Val Pro Thr Tyr Ala Asp Asp Phe Lys

1 5 10 15

Gly

<210> 80

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的描述: 合成的

肽

<400> 80

Ser His Ser Asn Tyr Asp Phe

1 5

<210> 81

<211> 11

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的描述: 合成的

肽

<400> 81

Arg Ala Ser Gln Asp Ile Gly Asn Ser Leu Asn

1 5 10

<210> 82

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的描述: 合成的

肽

<400> 82

Val Thr Ser Arg Leu Asp Ser

1 5

<210> 83

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的描述: 合成的

肽

<400> 83

Leu Gln Tyr Ala Ser Ser Pro Phe Thr

1 5

<210> 84

<211> 11

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的描述: 合成的

肽

<400> 84

Arg Ala Ser Gln Ser Ile Gly Thr Ser Leu His

1 5 10

<210> 85

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的描述: 合成的

肽

<400> 85

Tyr Ala Ser Glu Ser Ile Ser

1 5

<210> 86

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的描述: 合成的

肽

<400> 86

Gln Gln Ser Asn Ser Trp Pro Tyr Thr

1 5

<210> 87

<211> 16

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的描述: 合成的

肽

<400> 87

Arg Ser Ser Gln Ser Phe Val His Ile Asn Gly Asn Thr Tyr Leu Glu

1 5 10 15

<210> 88

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的描述: 合成的

肽

<400> 88

Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser

1 5

<210> 89

<211> 5

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的描述: 合成的

肽

<400> 89

Phe Gln Gly Ser His

1 5

<210> 90

<211> 10

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的描述: 合成的

肽

<400> 90

Ser Ala Ser Ser Ser Val Ser Asp Met His

1 5 10

<210> 91

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的描述: 合成的

肽

<400> 91

Glu Ile Ser Lys Leu Ala Ser

1 5

<210> 92

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的描述: 合成的

肽

<400> 92

Gln His Trp Ser Tyr Pro Leu Met Thr

1 5

<210> 93

<211> 16

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的描述: 合成的

肽

<400> 93

Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Asp Ser Asp Gly Lys Thr Tyr Leu Asn

1 5 10 15

<210> 94

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的描述: 合成的

肽

<400> 94

Leu Val Ser Lys Leu Asp Ser

1 5

<210> 95

<211> 5

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的描述: 合成的

肽

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Trp Gln Gly Thr His

1 5

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<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的描述: 合成的

肽

<400> 96

Arg Ser Ser Lys Ser Leu Leu His Ser Asn Gly Phe Thr Tyr Leu His

1 5 10 15

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<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的描述: 合成的

肽

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Gln Met Ser Ser Leu Ala Ser

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<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的描述: 合成的

肽

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Ala Gln Asn Leu Glu Leu Pro Arg Thr

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<211> 16

<212> PRT

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<220>

<223> 人工序列的描述: 合成的

肽

<400> 99

Arg Ser Ser Gln Ser Ile Val Asp Ser Asp Gly Ser Thr Tyr Leu Glu

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<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的描述: 合成的

肽

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Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser

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<212> PRT

<213> 人工序列

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<223> 人工序列的描述: 合成的

肽

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Phe Gln Gly Ser His

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<212> PRT

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肽

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<223> 人工序列的描述: 合成的

肽

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Arg Ala Ser Asn Leu Glu Ser

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Gln Gln Ser Tyr Glu Asn Pro Trp Thr

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<212> PRT

<213> 人工序列

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<223> 人工序列的描述: 合成的

肽

<400> 105

Arg Ala Ser Glu Ser Val Asp Asn Tyr Gly Ile Ser Phe Met His

1 5 10 15

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肽

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Arg Ala Ser Ser Leu Glu Ser

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Gln Gln Ser Tyr Lys Asp

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Ser Ala Ser Ser Ser Val Ser Tyr Ile His

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<212> PRT

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肽

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Glu Ile Ser Lys Leu Ala Ser

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肽

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Gln Gln Trp Asn Tyr Pro Leu Ile Thr

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<211> 15

<212> PRT

<213> 人工序列

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<223> 人工序列的描述: 合成的

肽

<400> 111

Arg Ala Ser Glu Ser Val Asp Asn Tyr Gly Ile Ser Phe Met His

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<212> PRT

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<220>

<223> 人工序列的描述: 合成的

肽

<400> 112

Arg Ala Ser Ser Leu Glu Ser

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<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的描述: 合成的

肽

<400> 113

Gln Gln Ser Tyr Lys Asp

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<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

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肽

<400> 114

Gln Ala Ser Gln Asn Val Gly Thr Asp Val Gly

1 5 10

<210> 115

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<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的描述: 合成的

肽

<400> 115

Ser Ala Ser Asn Arg Tyr Thr

1 5

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<211> 9

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

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肽

<400> 116

Gln Gln Tyr Ser Ser Tyr Pro Arg Thr

1 5

<210> 117

<211> 464

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的描述: 合成的

多肽

<400> 117

Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Glu Leu Val Lys Pro Gly Thr

1 5 10 15

Ser Val Lys Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr

20 25 30

Asp Ile Asn Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile

35 40 45

Gly Trp Ile Tyr Pro Arg Asp Gly Ser Thr Lys Tyr Asn Glu Arg Phe

50 55 60

Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Thr Ser Ser Ser Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Met Glu Phe His Thr Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Phe Cys

85 90 95

Ala Arg Asp Pro Tyr Tyr Tyr Gly Thr Ile Tyr Gly Tyr Phe Asp Val

100 105 110

Trp Gly Thr Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly

115 120 125

Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly

130 135 140

Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val

145 150 155 160

Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe

165 170 175

Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val

180 185 190

Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val

195 200 205

Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys

210 215 220

Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu

225 230 235 240

Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr

245 250 255

Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val

260 265 270

Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val

275 280 285

Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser

290 295 300

Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu

305 310 315 320

Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala

325 330 335

Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro

340 345 350

Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln

355 360 365

Val Ser Leu Trp Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala

370 375 380

Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr

385 390 395 400

Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu

405 410 415

Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser

420 425 430

Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser

435 440 445

Leu Ser Pro Gly Gly Gly Gly Ser Asp Tyr Lys Asp Asp Asp Asp Lys

450 455 460

<210> 118

<211> 460

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的描述: 合成的

多肽

<400> 118

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Lys Gly

1 5 10 15

Ser Leu Lys Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Asn Thr Tyr

20 25 30

Ala Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ala Arg Ile Arg Ser Lys Thr Tyr Asn Tyr Ala Thr Phe Tyr Ala Asp

50 55 60

Ser Val Lys Asp Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ser Gln Ser Met

65 70 75 80

Leu Tyr Leu Gln Met Asn Asn Leu Lys Thr Glu Asp Thr Ala Met Phe

85 90 95

Tyr Cys Val Thr Gly Ser Ser Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly

100 105 110

Thr Ser Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe

115 120 125

Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu

130 135 140

Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp

145 150 155 160

Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu

165 170 175

Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser

180 185 190

Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro

195 200 205

Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys

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Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro

225 230 235 240

Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser

245 250 255

Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp

260 265 270

Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn

275 280 285

Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val

290 295 300

Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu

305 310 315 320

Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys

325 330 335

Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr

340 345 350

Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Trp

355 360 365

Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu

370 375 380

Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu

385 390 395 400

Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys

405 410 415

Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu

420 425 430

Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly

435 440 445

Gly Gly Gly Ser Asp Tyr Lys Asp Asp Asp Asp Lys

450 455 460

<210> 119

<211> 458

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的描述: 合成的

多肽

<400> 119

Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Ala Arg Pro Gly Ala

1 5 10 15

Ser Val Gln Leu Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr

20 25 30

Gly Ile Ser Trp Leu Lys Gln Arg Ala Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile

35 40 45

Gly Glu Ile Tyr Pro Arg Ser Asp Asn Thr Tyr Tyr Asn Glu Lys Phe

50 55 60

Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Ala Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Met Glu Leu Arg Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Phe Cys

85 90 95

Ala Arg Arg Ala Gly Met Trp Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu

100 105 110

Val Thr Val Ser Ala Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu

115 120 125

Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys

130 135 140

Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser

145 150 155 160

Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser

165 170 175

Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser

180 185 190

Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn

195 200 205

Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His

210 215 220

Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val

225 230 235 240

Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr

245 250 255

Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu

260 265 270

Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys

275 280 285

Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser

290 295 300

Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys

305 310 315 320

Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile

325 330 335

Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro

340 345 350

Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Trp Cys Leu

355 360 365

Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn

370 375 380

Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser

385 390 395 400

Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg

405 410 415

Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu

420 425 430

His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Gly Gly

435 440 445

Gly Ser Asp Tyr Lys Asp Asp Asp Asp Lys

450 455

<210> 120

<211> 491

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的描述: 合成的

多肽

<400> 120

Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asn Phe

20 25 30

Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ser Thr Ile Ser Ala Ser Gly Gly Arg Thr Phe Tyr Ala Asp Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Lys Glu Gly Ser Phe Gly Glu Gly Val Asp Pro Trp Gly Gln Gly

100 105 110

Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Arg Gly Ser

115 120 125

Thr Ser Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Ser

130 135 140

Ser Tyr Glu Leu Thr Gln Pro Pro Ser Val Ser Val Ser Pro Gly Gln

145 150 155 160

Thr Ala Arg Ile Thr Cys Ser Gly Asp Ala Leu Pro Lys Lys Tyr Ala

165 170 175

Tyr Trp Tyr Gln Gln Lys Ser Gly Gln Ala Pro Val Leu Val Ile Tyr

180 185 190

Glu Asp Asn Lys Arg Pro Ser Gly Ile Pro Glu Arg Phe Ser Gly Ser

195 200 205

Ser Ser Gly Thr Met Ala Thr Leu Thr Ile Ser Gly Ala Gln Val Glu

210 215 220

Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Tyr Ser Thr Asp Ile Ser Gly Asn His

225 230 235 240

Trp Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Ala Ser Lys Thr

245 250 255

His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser

260 265 270

Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg

275 280 285

Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro

290 295 300

Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala

305 310 315 320

Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val

325 330 335

Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr

340 345 350

Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr

355 360 365

Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu

370 375 380

Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Ser Cys

385 390 395 400

Ala Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser

405 410 415

Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp

420 425 430

Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Val Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser

435 440 445

Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala

450 455 460

Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Gly

465 470 475 480

Gly Gly Ser His His His His His His His His

485 490

<210> 121

<211> 5

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的描述: 合成的

肽

<400> 121

Asn Tyr Gly Val His

1 5

<210> 122

<211> 16

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的描述: 合成的

肽

<400> 122

Val Ile Trp Ser Gly Gly Asn Thr Asp Tyr Asn Thr Pro Phe Thr Ser

1 5 10 15

<210> 123

<211> 11

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的描述: 合成的

肽

<400> 123

Ala Leu Thr Tyr Tyr Asp Tyr Glu Phe Ala Tyr

1 5 10

<210> 124

<211> 11

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的描述: 合成的

肽

<400> 124

Arg Ala Ser Gln Ser Ile Gly Thr Asn Ile His

1 5 10

<210> 125

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的描述: 合成的

肽

<400> 125

Tyr Ala Ser Glu Ser Ile Ser

1 5

<210> 126

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的描述: 合成的

肽

<400> 126

Gln Gln Asn Asn Asn Trp Pro Thr Thr

1 5

<210> 127

<211> 119

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的描述: 合成的

多肽

<400> 127

Gln Val Gln Leu Lys Gln Ser Gly Pro Gly Leu Val Gln Pro Ser Gln

1 5 10 15

Ser Leu Ser Ile Thr Cys Thr Val Ser Gly Phe Ser Leu Thr Asn Tyr

20 25 30

Gly Val His Trp Val Arg Gln Ser Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Leu

35 40 45

Gly Val Ile Trp Ser Gly Gly Asn Thr Asp Tyr Asn Thr Pro Phe Thr

50 55 60

Ser Arg Leu Ser Ile Asn Lys Asp Asn Ser Lys Ser Gln Val Phe Phe

65 70 75 80

Lys Met Asn Ser Leu Gln Ser Asn Asp Thr Ala Ile Tyr Tyr Cys Ala

85 90 95

Arg Ala Leu Thr Tyr Tyr Asp Tyr Glu Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly

100 105 110

Thr Leu Val Thr Val Ser Ala

115

<210> 128

<211> 107

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的描述: 合成的

多肽

<400> 128

Asp Ile Leu Leu Thr Gln Ser Pro Val Ile Leu Ser Val Ser Pro Gly

1 5 10 15

Glu Arg Val Ser Phe Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Gly Thr Asn

20 25 30

Ile His Trp Tyr Gln Gln Arg Thr Asn Gly Ser Pro Arg Leu Leu Ile

35 40 45

Lys Tyr Ala Ser Glu Ser Ile Ser Gly Ile Pro Ser Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Ser Ile Asn Ser Val Glu Ser

65 70 75 80

Glu Asp Ile Ala Asp Tyr Tyr Cys Gln Gln Asn Asn Asn Trp Pro Thr

85 90 95

Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys

100 105

<210> 129

<211> 6

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的描述: 合成的

6xHis标签

<400> 129

His His His His His His

1 5

<210> 130

<211> 449

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的描述: 合成的

多肽

<400> 130

Gln Val Gln Leu Lys Gln Ser Gly Pro Gly Leu Val Gln Pro Ser Gln

1 5 10 15

Ser Leu Ser Ile Thr Cys Thr Val Ser Gly Phe Ser Leu Thr Asn Tyr

20 25 30

Gly Val His Trp Val Arg Gln Ser Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Leu

35 40 45

Gly Val Ile Trp Ser Gly Gly Asn Thr Asp Tyr Asn Thr Pro Phe Thr

50 55 60

Ser Arg Leu Ser Ile Asn Lys Asp Asn Ser Lys Ser Gln Val Phe Phe

65 70 75 80

Lys Met Asn Ser Leu Gln Ser Asn Asp Thr Ala Ile Tyr Tyr Cys Ala

85 90 95

Arg Ala Leu Thr Tyr Tyr Asp Tyr Glu Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly

100 105 110

Thr Leu Val Thr Val Ser Ala Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe

115 120 125

Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu

130 135 140

Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp

145 150 155 160

Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu

165 170 175

Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser

180 185 190

Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro

195 200 205

Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys

210 215 220

Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro

225 230 235 240

Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser

245 250 255

Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp

260 265 270

Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn

275 280 285

Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val

290 295 300

Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu

305 310 315 320

Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys

325 330 335

Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr

340 345 350

Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Trp

355 360 365

Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu

370 375 380

Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu

385 390 395 400

Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys

405 410 415

Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu

420 425 430

Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly

435 440 445

Lys

<210> 131

<211> 1347

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的描述: 合成的

多核苷酸

<400> 131

caggtgcagc tgaagcagag cggccccggc ctggtgcagc catcacagag cctgagcatc 60

acatgcacag tgagcggatt cagcctgaca aactacggcg tgcactgggt gagacagagc 120

cccggcaaag gactggagtg gctgggagtg atttggtccg gcggcaacac cgactacaac 180

acccccttca caagcaggct gagcatcaac aaggacaata gcaagagcca ggtgttcttc 240

aagatgaata gcctgcagtc caacgatacc gccatctact actgcgccag agccctgacc 300

tactacgact acgaattcgc ctactggggc cagggaaccc tggtgaccgt gagcgccgct 360

agcaccaaag gtcccagcgt gttcccactc gccccgagtt caaaatcaac ttctggaggc 420

accgccgccc tgggttgcct ggtaaaggac tacttcccag agcccgtgac cgtgagctgg 480

aactccgggg cactgacatc tggcgttcat actttcccgg ccgtgctcca gtcttcaggt 540

ctgtatagtc tctcctctgt ggtcactgtc ccatctagct ctctgggcac ccaaacctac 600

atatgcaacg ttaatcacaa gccgagcaat actaaagttg acaaaaaggt ggaacccaag 660

tcttgtgaca agacccacac gtgtcccccc tgcccggctc ctgagctgct tggcggcccc 720

agcgtctttc tctttccccc aaagccaaaa gataccttga tgatcagcag aactcccgag 780

gtgacatgcg tcgtcgtgga cgtaagccat gaagatcccg aggttaagtt caactggtat 840

gtcgatggcg tggaagtcca taatgctaag actaaacctc gcgaagagca gtacaattca 900

acttaccggg tcgtttccgt tctgaccgtg ctgcatcagg actggctgaa tggtaaagag 960

tacaagtgca aagtgtctaa caaggcactc cccgccccaa ttgagaagac tatctccaaa 1020

gctaaagggc aaccaagaga gccccaggtc tacaccctgc ccccctcaag ggatgagctt 1080

actaagaacc aggttagtct ctggtgcttg gttaaaggat tttatccaag cgatattgct 1140

gtggagtggg agtccaacgg ccagcctgag aacaattata aaaccacccc ccctgttctt 1200

gacagtgacg gtagtttctt cctgtattcc aaactgaccg tcgataagag cagatggcaa 1260

cagggaaatg tgttcagctg ctccgtgatg catgaggcgc tccataatca ttacacacaa 1320

aaaagtttgt ccctgagccc aggcaag 1347

<210> 132

<211> 214

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的描述: 合成的

多肽

<400> 132

Asp Ile Leu Leu Thr Gln Ser Pro Val Ile Leu Ser Val Ser Pro Gly

1 5 10 15

Glu Arg Val Ser Phe Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Gly Thr Asn

20 25 30

Ile His Trp Tyr Gln Gln Arg Thr Asn Gly Ser Pro Arg Leu Leu Ile

35 40 45

Lys Tyr Ala Ser Glu Ser Ile Ser Gly Ile Pro Ser Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Ser Ile Asn Ser Val Glu Ser

65 70 75 80

Glu Asp Ile Ala Asp Tyr Tyr Cys Gln Gln Asn Asn Asn Trp Pro Thr

85 90 95

Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys Arg Thr Val Ala Ala

100 105 110

Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly

115 120 125

Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala

130 135 140

Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln

145 150 155 160

Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser

165 170 175

Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr

180 185 190

Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser

195 200 205

Phe Asn Arg Gly Glu Cys

210

<210> 133

<211> 642

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的描述: 合成的

多核苷酸

<400> 133

gacatattgt tgacgcaaag cccggttata cttagtgtta gtccgggtga aagagtatct 60

ttttcttgtc gcgcttctca gtctatcgga acaaacattc attggtatca acaacggaca 120

aacggaagcc ctagacttct cataaaatac gcctcagagt ccatcagtgg cataccttct 180

cgattttcag gctctgggtc tggtactgac ttcacattgt ctatcaattc cgtcgaatct 240

gaggacatag cggactatta ttgccagcag aataataact ggccaactac ttttggtgct 300

ggaactaagt tggagcttaa gcgtacggtg gcagctccat cagtttttat cttcccacca 360

agcgacgagc aattgaagtc cggcactgcc tctgtggtgt gccttctgaa caacttctat 420

ccaagggagg ccaaggtcca gtggaaggtc gataatgcgc tgcagagcgg gaacagccaa 480

gagtcagtga ccgagcagga ctcaaaagat agcacatact ctctgagttc caccctgacc 540

ctgtcaaagg ctgactacga aaagcataag gtatacgcat gcgaagtgac ccatcagggt 600

ctctcatctc ccgtaaccaa atcttttaat agaggagaat gc 642

<210> 134

<211> 488

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的描述: 合成的

多肽

<400> 134

Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asn Phe

20 25 30

Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ser Thr Ile Ser Ala Ser Gly Gly Arg Thr Phe Tyr Ala Asp Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Lys Glu Gly Ser Phe Gly Glu Gly Val Asp Pro Trp Gly Gln Gly

100 105 110

Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Arg Gly Ser

115 120 125

Thr Ser Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Ser

130 135 140

Ser Tyr Glu Leu Thr Gln Pro Pro Ser Val Ser Val Ser Pro Gly Gln

145 150 155 160

Thr Ala Arg Ile Thr Cys Ser Gly Asp Ala Leu Pro Lys Lys Tyr Ala

165 170 175

Tyr Trp Tyr Gln Gln Lys Ser Gly Gln Ala Pro Val Leu Val Ile Tyr

180 185 190

Glu Asp Asn Lys Arg Pro Ser Gly Ile Pro Glu Arg Phe Ser Gly Ser

195 200 205

Ser Ser Gly Thr Met Ala Thr Leu Thr Ile Ser Gly Ala Gln Val Glu

210 215 220

Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Tyr Ser Thr Asp Ile Ser Gly Asn His

225 230 235 240

Trp Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly Gly Ser Gly

245 250 255

Gly Ser Gly Gly Ala Ser Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala

260 265 270

Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro

275 280 285

Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val

290 295 300

Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val

305 310 315 320

Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln

325 330 335

Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln

340 345 350

Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala

355 360 365

Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro

370 375 380

Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr

385 390 395 400

Lys Asn Gln Val Ser Leu Ser Cys Ala Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser

405 410 415

Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr

420 425 430

Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Val

435 440 445

Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe

450 455 460

Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys

465 470 475 480

Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys

485

<210> 135

<211> 1464

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的描述: 合成的

多核苷酸

<400> 135

gaggtacaac ttctggagtc aggcgggggg ctagtccaac ctgggggctc gctacggtta 60

tcttgcgccg cgtctggttt taccttcagt aactttgcca tgtcatgggt标签acaagca 120

cctggcaagg gcctcgagtg ggtatcgact atttccgcca gcggaggtcg aacattttac 180

gcagactcgg tgaaaggtcg cttcacaatt tctagggata attctaaaaa caccctgtat 240

cttcaaatga acagcctgcg tgccgaggac accgcagttt actactgcgc gaaagaaggt 300

tcatttggtg aaggcgtcga tccatggggt caggggacct标签ttacagt ttcgtccgcg 360

agcacgaagg gtcctagggg ttcgaccagc ggaggaggta gtgggggagg ctcaggtggg 420

ggagggtcca gcagctacga gctaacccaa ccaccatcag tatccgtgtc tccgggccaa 480

acggcgagaa tcacttgcag cggagacgca ctaccgaaaa agtatgctta ttggtaccaa 540

caaaaaagcg gacaggcgcc ggttctcgtc atatatgaag acaacaagcg cccttctggt 600

attccggaga ggttctccgg gtcgtcatca ggaacaatgg cgacgcttac catatcggga 660

gcacaagtag aagatgaagc ggactactac tgctattcta ctgacatctc tggaaaccac 720

tgggtcttcg gaggtggtac caagcttacc gtccttggtg gcagtggtgg ctctgggggc 780

gctagcaaga cccacacgtg tcccccctgc ccggctcctg agctgcttgg cggccccagc 840

gtctttctct ttcccccaaa gccaaaagat accttgatga tcagcagaac tcccgaggtg 900

acatgcgtcg tcgtggacgt aagccatgaa gatcccgagg ttaagttcaa ctggtatgtc 960

gatggcgtgg aagtccataa tgctaagact aaacctcgcg aagagcagta caattcaact 1020

taccgggtcg tttccgttct gaccgtgctg catcaggact ggctgaatgg taaagagtac 1080

aagtgcaaag tgtctaacaa ggcactcccc gccccaattg agaagactat ctccaaagct 1140

aaagggcaac caagagagcc ccaggtctac accctgcccc cctcaaggga tgagcttact 1200

aagaaccagg ttagtctcag ctgcgcggtt aaaggatttt atccaagcga tattgctgtg 1260

gagtgggagt ccaacggcca gcctgagaac aattataaaa ccaccccccc tgttcttgac 1320

agtgacggta gtttcttcct ggtttccaaa ctgaccgtcg ataagagcag atggcaacag 1380

ggaaatgtgt tcagctgctc cgtgatgcat gaggcgctcc ataatcatta cacacaaaaa 1440

agtttgtccc tgagcccagg caag 1464

<210> 136

<211> 460

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的描述: 合成的

多肽

<400> 136

Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asn Phe

20 25 30

Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ser Thr Ile Ser Ala Ser Gly Gly Arg Thr Phe Tyr Ala Asp Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Lys Glu Gly Ser Phe Gly Glu Gly Val Asp Pro Trp Gly Gln Gly

100 105 110

Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe

115 120 125

Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu

130 135 140

Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp

145 150 155 160

Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu

165 170 175

Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser

180 185 190

Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro

195 200 205

Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys

210 215 220

Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro

225 230 235 240

Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser

245 250 255

Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp

260 265 270

Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn

275 280 285

Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val

290 295 300

Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu

305 310 315 320

Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys

325 330 335

Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr

340 345 350

Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Trp

355 360 365

Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu

370 375 380

Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu

385 390 395 400

Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys

405 410 415

Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu

420 425 430

Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly

435 440 445

Gly Gly Gly Ser Asp Tyr Lys Asp Asp Asp Asp Lys

450 455 460

<210> 137

<211> 1380

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的描述: 合成的

多核苷酸

<400> 137

gaggtgcagc tgctggagag cgggggggga ctggtgcagc caggaggaag cctgagactg 60

agctgtgccg ccagcgggtt tacatttagc aactttgcca tgagctgggt gagacaggcc 120

cccggaaaag gactggagtg ggtgagcacc attagcgcca gcggaggaag aacattttac 180

gctgattccg tgaaggggag attcacaatc tccagagaca acagcaagaa caccctgtac 240

ctgcagatga acagcctgag agccgaggac accgccgtgt attactgcgc caaggaggga 300

tcttttggcg agggagtgga cccctggggc cagggaaccc tggtgaccgt gagcagcgct 360

agcaccaaag gtcccagcgt gttcccactc gccccgagtt caaaatcaac ttctggaggc 420

accgccgccc tgggttgcct ggtaaaggac tacttcccag agcccgtgac cgtgagctgg 480

aactccgggg cactgacatc tggcgttcat actttcccgg ccgtgctcca gtcttcaggt 540

ctgtatagtc tctcctctgt ggtcactgtc ccatctagct ctctgggcac ccaaacctac 600

atatgcaacg ttaatcacaa gccgagcaat actaaagttg acaaaaaggt ggaacccaag 660

tcttgtgaca agacccacac gtgtcccccc tgcccggctc ctgagctgct tggcggcccc 720

agcgtctttc tctttccccc aaagccaaaa gataccttga tgatcagcag aactcccgag 780

gtgacatgcg tcgtcgtgga cgtaagccat gaagatcccg aggttaagtt caactggtat 840

gtcgatggcg tggaagtcca taatgctaag actaaacctc gcgaagagca gtacaattca 900

acttaccggg tcgtttccgt tctgaccgtg ctgcatcagg actggctgaa tggtaaagag 960

tacaagtgca aagtgtctaa caaggcactc cccgccccaa ttgagaagac tatctccaaa 1020

gctaaagggc aaccaagaga gccccaggtc tacaccctgc ccccctcaag ggatgagctt 1080

actaagaacc aggttagtct ctggtgcttg gttaaaggat tttatccaag cgatattgct 1140

gtggagtggg agtccaacgg ccagcctgag aacaattata aaaccacccc ccctgttctt 1200

gacagtgacg gtagtttctt cctgtattcc aaactgaccg tcgataagag cagatggcaa 1260

cagggaaatg tgttcagctg ctccgtgatg catgaggcgc tccataatca ttacacacaa 1320

aaaagtttgt ccctgagccc aggcggcgga ggcagcgact acaaggacga cgatgataag 1380

<210> 138

<211> 645

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的描述: 合成的

多核苷酸

<400> 138

tcttacgagc tgacccagcc tccttctgtg tctgtgtctc ccggtcagac cgctagaatc 60

acctgctctg gcgacgctct gcctaagaag tacgcctact ggtaccagca gaagtccggc 120

caggctcctg tgctggtgat ttacgaggac aataagagac cctccggcat ccccgagaga 180

ttctctggat cctcctccgg aaccatggcc acactgacta tctccggcgc tcaggtggag 240

gatgaagctg attattactg ctactccacc gacatctccg gcaaccactg ggtgttcgga 300

ggtggaacaa agctgaccgt gctgggacag cctaaggctg ctccttctgt gactctgttt 360

cctcccagct ccgaggagct gcaggctaac aaagctactc tggtctgcct gatcagtgat 420

ttctaccccg gcgccgtcac cgtggcttgg aaggctgatt cttcccccgt gaaggccggt 480

gtggaaacta caacaccctc caaacagtcc aacaacaaat acgccgcctc ctcctacctg 540

tccctgacac ctgaacagtg gaagtctcac agatcctact cctgccaggt cacccacgaa 600

ggatccacag tcgagaagac cgtcgcccct acagagtgtt cttga 645

<210> 139

<211> 498

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的描述: 合成的

多肽

<400> 139

Gln Val Gln Leu Lys Gln Ser Gly Pro Gly Leu Val Gln Pro Ser Gln

1 5 10 15

Ser Leu Ser Ile Thr Cys Thr Val Ser Gly Phe Ser Leu Thr Asn Tyr

20 25 30

Gly Val His Trp Val Arg Gln Ser Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Leu

35 40 45

Gly Val Ile Trp Ser Gly Gly Asn Thr Asp Tyr Asn Thr Pro Phe Thr

50 55 60

Ser Arg Leu Ser Ile Asn Lys Asp Asn Ser Lys Ser Gln Val Phe Phe

65 70 75 80

Lys Met Asn Ser Leu Gln Ser Asn Asp Thr Ala Ile Tyr Tyr Cys Ala

85 90 95

Arg Ala Leu Thr Tyr Tyr Asp Tyr Glu Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly

100 105 110

Thr Leu Val Thr Val Ser Ala Ala Ser Thr Lys Gly Pro Arg Gly Ser

115 120 125

Thr Ser Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Ser

130 135 140

Asp Ile Leu Leu Thr Gln Ser Pro Val Ile Leu Ser Val Ser Pro Gly

145 150 155 160

Glu Arg Val Ser Phe Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Gly Thr Asn

165 170 175

Ile His Trp Tyr Gln Gln Arg Thr Asn Gly Ser Pro Arg Leu Leu Ile

180 185 190

Lys Tyr Ala Ser Glu Ser Ile Ser Gly Ile Pro Ser Arg Phe Ser Gly

195 200 205

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Ser Ile Asn Ser Val Glu Ser

210 215 220

Glu Asp Ile Ala Asp Tyr Tyr Cys Gln Gln Asn Asn Asn Trp Pro Thr

225 230 235 240

Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys Gly Gly Ser Gly Gly

245 250 255

Ser Gly Gly Ala Ser Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro

260 265 270

Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys

275 280 285

Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val

290 295 300

Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp

305 310 315 320

Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr

325 330 335

Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp

340 345 350

Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu

355 360 365

Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg

370 375 380

Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys

385 390 395 400

Asn Gln Val Ser Leu Ser Cys Ala Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp

405 410 415

Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys

420 425 430

Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Val Ser

435 440 445

Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser

450 455 460

Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser

465 470 475 480

Leu Ser Leu Ser Pro Gly Gly Gly Gly Ser His His His His His His

485 490 495

His His

<210> 140

<211> 1494

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的描述: 合成的

多核苷酸

<400> 140

caggtgcagc tgaagcagag cggccccggc ctggtgcagc catcacagag cctgagcatc 60

acatgcacag tgagcggatt cagcctgaca aactacggcg tgcactgggt gagacagagc 120

cccggcaaag gactggagtg gctgggagtg atttggtccg gcggcaacac cgactacaac 180

acccccttca caagcaggct gagcatcaac aaggacaata gcaagagcca ggtgttcttc 240

aagatgaata gcctgcagtc caacgatacc gccatctact actgcgccag agccctgacc 300

tactacgact acgaattcgc ctactggggc cagggaaccc tggtgaccgt gagcgccgct 360

tctaccaaag gaccccgggg ctctacctcc ggcggcggaa gcggaggagg atctggagga 420

ggaggaagtt ctgacatatt gttgacgcaa agcccggtta tacttagtgt标签tccgggt 480

gaaagagtat ctttttcttg tcgcgcttct cagtctatcg gaacaaacat tcattggtat 540

caacaacgga caaacggaag ccctagactt ctcataaaat acgcctcaga gtccatcagt 600

ggcatacctt ctcgattttc aggctctggg tctggtactg acttcacatt gtctatcaat 660

tccgtcgaat ctgaggacat agcggactat tattgccagc agaataataa ctggccaact 720

acttttggtg ctggaactaa gttggagctt aagggtggca gtggtggctc tgggggcgct 780

agcaagaccc acacgtgtcc cccctgcccg gctcctgagc tgcttggcgg ccccagcgtc 840

tttctctttc ccccaaagcc aaaagatacc ttgatgatca gcagaactcc cgaggtgaca 900

tgcgtcgtcg tggacgtaag ccatgaagat cccgaggtta agttcaactg gtatgtcgat 960

ggcgtggaag tccataatgc taagactaaa cctcgcgaag agcagtacaa ttcaacttac 1020

cgggtcgttt ccgttctgac cgtgctgcat caggactggc tgaatggtaa agagtacaag 1080

tgcaaagtgt ctaacaaggc actccccgcc ccaattgaga agactatctc caaagctaaa 1140

gggcaaccaa gagagcccca ggtctacacc ctgcccccct caagggatga gcttactaag 1200

aaccaggtta gtctcagctg cgcggttaaa ggattttatc caagcgatat tgctgtggag 1260

tgggagtcca acggccagcc tgagaacaat tataaaacca ccccccctgt tcttgacagt 1320

gacggtagtt tcttcctggt ttccaaactg accgtcgata agagcagatg gcaacaggga 1380

aatgtgttca gctgctccgt gatgcatgag gcgctccata atcattacac acaaaaaagt 1440

ttgtccctga gcccaggcgg cggaggcagc caccaccacc accaccacca tcat 1494

<210> 141

<211> 119

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的描述: 合成的

多肽

<400> 141

Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asn Phe

20 25 30

Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ser Thr Ile Ser Ala Ser Gly Gly Arg Thr Phe Tyr Ala Asp Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Ile Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Phe

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Gly Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Ala Glu Gly Ser Phe Gly Glu Gly Val Asp Pro Trp Gly Gln Gly

100 105 110

Thr Leu Val Thr Val Ser Ser

115

<210> 142

<211> 119

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的描述: 合成的

多肽

<400> 142

Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asn Phe

20 25 30

Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ser Thr Ile Ser Ala Ser Gly Gly Arg Thr Phe Tyr Ala Asp Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Ile Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Phe

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Gly Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

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100 105 110

Thr Leu Val Thr Val Ser Ser

115

<210> 143

<211> 119

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的描述: 合成的

多肽

<400> 143

Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asn Phe

20 25 30

Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ser Thr Ile Ser Ala Ser Gly Gly Arg Thr Phe Tyr Ala Asp Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Ile Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Phe

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Gly Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

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100 105 110

Thr Leu Val Thr Val Ser Ser

115

<210> 144

<211> 119

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的描述: 合成的

多肽

<400> 144

Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asn Phe

20 25 30

Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ser Thr Ile Ser Ala Ser Gly Gly Arg Thr Phe Tyr Ala Asp Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Ile Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Phe

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Gly Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

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100 105 110

Thr Leu Val Thr Val Ser Ser

115

<210> 145

<211> 119

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的描述: 合成的

多肽

<400> 145

Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asn Phe

20 25 30

Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ser Thr Ile Ser Ala Ser Gly Gly Arg Thr Phe Tyr Ala Asp Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Ile Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Phe

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Gly Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

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100 105 110

Thr Leu Val Thr Val Ser Ser

115

<210> 146

<211> 119

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的描述: 合成的

多肽

<400> 146

Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asn Phe

20 25 30

Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

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Ser Thr Ile Ser Ala Ser Gly Gly Arg Thr Phe Tyr Ala Asp Ser Val

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Thr Leu Val Thr Val Ser Ser

115

<210> 147

<211> 119

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的描述: 合成的

多肽

<400> 147

Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asn Phe

20 25 30

Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

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65 70 75 80

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100 105 110

Thr Leu Val Thr Val Ser Ser

115

<210> 148

<211> 119

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的描述: 合成的

多肽

<400> 148

Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asn Phe

20 25 30

Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ser Thr Ile Ser Ala Ser Gly Gly Arg Thr Phe Tyr Ala Asp Ser Val

50 55 60

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65 70 75 80

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100 105 110

Thr Leu Val Thr Val Ser Ser

115

<210> 149

<211> 119

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的描述: 合成的

多肽

<400> 149

Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asn Phe

20 25 30

Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

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Ser Thr Ile Ser Ala Ser Gly Gly Arg Thr Phe Tyr Ala Asp Ser Val

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65 70 75 80

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85 90 95

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100 105 110

Thr Leu Val Thr Val Ser Ser

115

<210> 150

<211> 119

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的描述: 合成的

多肽

<400> 150

Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asn Phe

20 25 30

Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ser Thr Ile Ser Ala Ser Gly Gly Arg Thr Phe Tyr Ala Asp Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Ile Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Phe

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Gly Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

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100 105 110

Thr Leu Val Thr Val Ser Ser

115

<210> 151

<211> 119

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的描述: 合成的

多肽

<400> 151

Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asn Phe

20 25 30

Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ser Thr Ile Ser Ala Ser Gly Gly Arg Thr Phe Tyr Ala Asp Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Ile Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Phe

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Gly Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Lys Glu Gly Ser Phe Gly Glu Gly Val Asp Ala Trp Gly Gln Gly

100 105 110

Thr Leu Val Thr Val Ser Ser

115

<210> 152

<211> 108

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的描述: 合成的

多肽

<400> 152

Ser Tyr Glu Met Thr Gln Pro Pro Ser Val Ser Val Ser Pro Gly Gln

1 5 10 15

Thr Ala Arg Ile Thr Cys Ser Gly Asp Ala Leu Pro Lys Lys Tyr Ala

20 25 30

Tyr Trp Tyr Gln Gln Lys Ser Gly Gln Ala Pro Val Leu Val Ile Tyr

35 40 45

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50 55 60

Ser Ser Gly Thr Met Ala Thr Leu Thr Ile Ser Gly Ala Gln Val Glu

65 70 75 80

Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Tyr Ser Thr Asp Ile Ser Gly Asn His

85 90 95

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100 105

<210> 153

<211> 108

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的描述: 合成的

多肽

<400> 153

Ser Tyr Glu Met Thr Gln Pro Pro Ser Val Ser Val Ser Pro Gly Gln

1 5 10 15

Thr Ala Arg Ile Thr Cys Ser Gly Asp Ala Leu Pro Lys Lys Tyr Ala

20 25 30

Tyr Trp Tyr Gln Gln Lys Ser Gly Gln Ala Pro Val Leu Val Ile Tyr

35 40 45

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50 55 60

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65 70 75 80

Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Ala Ser Thr Asp Ile Ser Gly Asn His

85 90 95

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100 105

<210> 154

<211> 108

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的描述: 合成的

多肽

<400> 154

Ser Tyr Glu Met Thr Gln Pro Pro Ser Val Ser Val Ser Pro Gly Gln

1 5 10 15

Thr Ala Arg Ile Thr Cys Ser Gly Asp Ala Leu Pro Lys Lys Tyr Ala

20 25 30

Tyr Trp Tyr Gln Gln Lys Ser Gly Gln Ala Pro Val Leu Val Ile Tyr

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65 70 75 80

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100 105

<210> 155

<211> 108

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的描述: 合成的

多肽

<400> 155

Ser Tyr Glu Met Thr Gln Pro Pro Ser Val Ser Val Ser Pro Gly Gln

1 5 10 15

Thr Ala Arg Ile Thr Cys Ser Gly Asp Ala Leu Pro Lys Lys Tyr Ala

20 25 30

Tyr Trp Tyr Gln Gln Lys Ser Gly Gln Ala Pro Val Leu Val Ile Tyr

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Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Tyr Ser Ala Asp Ile Ser Gly Asn His

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100 105

<210> 156

<211> 108

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的描述: 合成的

多肽

<400> 156

Ser Tyr Glu Met Thr Gln Pro Pro Ser Val Ser Val Ser Pro Gly Gln

1 5 10 15

Thr Ala Arg Ile Thr Cys Ser Gly Asp Ala Leu Pro Lys Lys Tyr Ala

20 25 30

Tyr Trp Tyr Gln Gln Lys Ser Gly Gln Ala Pro Val Leu Val Ile Tyr

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65 70 75 80

Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Tyr Ser Thr Ala Ile Ser Gly Asn His

85 90 95

Trp Val Phe Gly Gly Gly Thr Glu Leu Thr Val Leu

100 105

<210> 157

<211> 108

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的描述: 合成的

多肽

<400> 157

Ser Tyr Glu Met Thr Gln Pro Pro Ser Val Ser Val Ser Pro Gly Gln

1 5 10 15

Thr Ala Arg Ile Thr Cys Ser Gly Asp Ala Leu Pro Lys Lys Tyr Ala

20 25 30

Tyr Trp Tyr Gln Gln Lys Ser Gly Gln Ala Pro Val Leu Val Ile Tyr

35 40 45

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Ser Ser Gly Thr Met Ala Thr Leu Thr Ile Ser Gly Ala Gln Val Glu

65 70 75 80

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85 90 95

Trp Val Phe Gly Gly Gly Thr Glu Leu Thr Val Leu

100 105

<210> 158

<211> 108

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的描述: 合成的

多肽

<400> 158

Ser Tyr Glu Met Thr Gln Pro Pro Ser Val Ser Val Ser Pro Gly Gln

1 5 10 15

Thr Ala Arg Ile Thr Cys Ser Gly Asp Ala Leu Pro Lys Lys Tyr Ala

20 25 30

Tyr Trp Tyr Gln Gln Lys Ser Gly Gln Ala Pro Val Leu Val Ile Tyr

35 40 45

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50 55 60

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65 70 75 80

Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Tyr Ser Thr Asp Ile Ala Gly Asn His

85 90 95

Trp Val Phe Gly Gly Gly Thr Glu Leu Thr Val Leu

100 105

<210> 159

<211> 108

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的描述: 合成的

多肽

<400> 159

Ser Tyr Glu Met Thr Gln Pro Pro Ser Val Ser Val Ser Pro Gly Gln

1 5 10 15

Thr Ala Arg Ile Thr Cys Ser Gly Asp Ala Leu Pro Lys Lys Tyr Ala

20 25 30

Tyr Trp Tyr Gln Gln Lys Ser Gly Gln Ala Pro Val Leu Val Ile Tyr

35 40 45

Glu Asp Asn Lys Arg Pro Ser Gly Ile Pro Glu Arg Phe Ser Gly Ser

50 55 60

Ser Ser Gly Thr Met Ala Thr Leu Thr Ile Ser Gly Ala Gln Val Glu

65 70 75 80

Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Tyr Ser Thr Asp Ile Ser Ala Asn His

85 90 95

Trp Val Phe Gly Gly Gly Thr Glu Leu Thr Val Leu

100 105

<210> 160

<211> 108

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的描述: 合成的

多肽

<400> 160

Ser Tyr Glu Met Thr Gln Pro Pro Ser Val Ser Val Ser Pro Gly Gln

1 5 10 15

Thr Ala Arg Ile Thr Cys Ser Gly Asp Ala Leu Pro Lys Lys Tyr Ala

20 25 30

Tyr Trp Tyr Gln Gln Lys Ser Gly Gln Ala Pro Val Leu Val Ile Tyr

35 40 45

Glu Asp Asn Lys Arg Pro Ser Gly Ile Pro Glu Arg Phe Ser Gly Ser

50 55 60

Ser Ser Gly Thr Met Ala Thr Leu Thr Ile Ser Gly Ala Gln Val Glu

65 70 75 80

Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Tyr Ser Thr Asp Ile Ser Gly Ala His

85 90 95

Trp Val Phe Gly Gly Gly Thr Glu Leu Thr Val Leu

100 105

<210> 161

<211> 108

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的描述: 合成的

多肽

<400> 161

Ser Tyr Glu Met Thr Gln Pro Pro Ser Val Ser Val Ser Pro Gly Gln

1 5 10 15

Thr Ala Arg Ile Thr Cys Ser Gly Asp Ala Leu Pro Lys Lys Tyr Ala

20 25 30

Tyr Trp Tyr Gln Gln Lys Ser Gly Gln Ala Pro Val Leu Val Ile Tyr

35 40 45

Glu Asp Asn Lys Arg Pro Ser Gly Ile Pro Glu Arg Phe Ser Gly Ser

50 55 60

Ser Ser Gly Thr Met Ala Thr Leu Thr Ile Ser Gly Ala Gln Val Glu

65 70 75 80

Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Tyr Ser Thr Asp Ile Ser Gly Asn Ala

85 90 95

Trp Val Phe Gly Gly Gly Thr Glu Leu Thr Val Leu

100 105

<210> 162

<211> 108

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的描述: 合成的

多肽

<400> 162

Ser Tyr Glu Met Thr Gln Pro Pro Ser Val Ser Val Ser Pro Gly Gln

1 5 10 15

Thr Ala Arg Ile Thr Cys Ser Gly Asp Ala Leu Pro Lys Lys Tyr Ala

20 25 30

Tyr Trp Tyr Gln Gln Lys Ser Gly Gln Ala Pro Val Leu Val Ile Tyr

35 40 45

Glu Asp Asn Lys Arg Pro Ser Gly Ile Pro Glu Arg Phe Ser Gly Ser

50 55 60

Ser Ser Gly Thr Met Ala Thr Leu Thr Ile Ser Gly Ala Gln Val Glu

65 70 75 80

Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Tyr Ser Thr Asp Ile Ser Gly Asn His

85 90 95

Ala Val Phe Gly Gly Gly Thr Glu Leu Thr Val Leu

100 105

<210> 163

<211> 108

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的描述: 合成的

多肽

<400> 163

Ser Tyr Glu Met Thr Gln Pro Pro Ser Val Ser Val Ser Pro Gly Gln

1 5 10 15

Thr Ala Arg Ile Thr Cys Ser Gly Asp Ala Leu Pro Lys Lys Tyr Ala

20 25 30

Tyr Trp Tyr Gln Gln Lys Ser Gly Gln Ala Pro Val Leu Val Ile Tyr

35 40 45

Glu Asp Asn Lys Arg Pro Ser Gly Ile Pro Glu Arg Phe Ser Gly Ser

50 55 60

Ser Ser Gly Thr Met Ala Thr Leu Thr Ile Ser Gly Ala Gln Val Glu

65 70 75 80

Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Tyr Ser Thr Asp Ile Ser Gly Asn His

85 90 95

Trp Ala Phe Gly Gly Gly Thr Glu Leu Thr Val Leu

100 105

Claims (68)

1.一种双特异性抗体，其包括CD47结合结构域和EpCAM结合结构域，其中所述双特异性抗体对在肿瘤细胞的表面上表达的CD47的亲和力高于对在红细胞或血小板的表面上表达的CD47的亲和力。

2.根据权利要求1所述的双特异性抗体，其还包括Fc结构域。

3.根据权利要求1所述的双特异性抗体，其中所述肿瘤细胞表达EpCAM。

4.根据权利要求1所述的双特异性抗体，其中半最大结合至人红细胞所需的所述双特异性抗体的浓度大于500nM。

5.根据权利要求1所述的双特异性抗体，其中所述双特异性抗体以通过表面等离子体共振确定的小于100nM的KD结合至人CD47。

6.根据权利要求1所述的双特异性抗体，其中所述双特异性抗体以通过表面等离子体共振确定的1nM至100nM、1nM至50nM或5nM至50nM的KD结合至人CD47。

7.根据权利要求1所述的双特异性抗体，其中所述双特异性抗体以通过表面等离子体共振确定的小于500nM的KD结合至EpCAM。

8.根据权利要求1所述的双特异性抗体，其中所述双特异性抗体以通过表面等离子体共振确定的0.2nM至500nM、1nM至300nM、5nM至200nM或10nM至150nM的KD结合至EpCAM。

9.根据权利要求1所述的双特异性抗体，其中所述CD47结合结构域是人或工程改造的人CD47结合结构域。

10.根据权利要求1所述的双特异性抗体，其中所述CD47结合结构域包括重链可变结构域和轻链可变结构域。

11.根据权利要求1所述的双特异性抗体，其中所述CD47结合结构域包括scFv。

12.根据权利要求1所述的双特异性抗体，其中所述EpCAM结合结构域包括重链可变结构域和轻链可变结构域。

13.根据权利要求1所述的双特异性抗体，其中所述EpCAM结合结构域包括scFv。

14.根据权利要求2所述的双特异性抗体，其中所述Fc结构域是人Fc结构域。

15.根据权利要求14所述的双特异性抗体，其中所述人Fc结构域的同种型是IgG1或IgG4。

16.根据权利要求15所述的双特异性抗体，其中所述Fc结构域是异二聚体Fc结构域，其中异二聚体Fc区包括杵链和臼链，形成杵臼(KiH)结构。

17.根据权利要求16所述的双特异性抗体，其中所述杵链包括突变T366W，并且所述臼链包括突变T366S、L368A和Y407V，其中氨基酸位置编号根据Kabat等人的EU索引。

18.根据权利要求1所述的双特异性抗体，其中所述双特异性抗体具有不对称的三链杵臼结构。

19.根据权利要求1所述的双特异性抗体，其中所述CD47结合结构域是Fab，并且所述EpCAM结合结构域是scFv。

20.根据权利要求1所述的双特异性抗体，其中所述CD47结合结构域是scFv，并且所述EpCAM结合结构域是Fab。

21.根据权利要求1所述的双特异性抗体，其中所述CD47结合结构域包括三个重链(HC)互补决定区(CDR)：HC-CDR1、HC-CDR2和HC-CDR3；和三个轻链(LC)CDR：LC-CDR1、LC-CDR2和LC-CDR3；其中HC-CDR1包括SEQ ID NO:15，HC-CDR2包括SEQ IDNO:16，HC-CDR3包括与SEQID NO:17具有至少50％同一性的序列，LC-CDR1包括SEQ ID NO:18，LC-CDR2包括SEQ IDNO:19，并且LC-CDR3包括与SEQ ID NO:20具有至少50％同一性的序列。

22.根据权利要求21所述的双特异性抗体，其中HC-CDR3包括在K94、E95、G96、S97、F98、G99、V100b、D101和P102中的一个或多个处的氨基酸取代；并且LC-CDR3包括在Y89、S90、T91、D92、I93、S94、G95、N95a、H95b、W96和V97中的一个或多个处的氨基酸取代。

23.根据权利要求10所述的双特异性抗体，其中所述CD47结合结构域的所述重链可变结构域包括与SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:10或SEQ ID NO:13具有至少90％同一性的序列，并且所述CD47结合结构域的所述轻链包括与SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:11或SEQ IDNO:14具有至少90％同一性的序列。

24.根据权利要求1所述的双特异性抗体，其中所述EpCAM结合结构域包括三个重链(HC)互补决定区(CDR)：HC-CDR1、HC-CDR2和HC-CDR3以及三个轻链(LC)CDR：LC-CDR1、LC-CDR2和LC-CDR3；其中所述CDR由被列为HC-CDR1、HC-CDR2、HC-CDR3、LC-CDR1、LC-CDR2、LC-CDR3的序列的有序集合定义；并且其中所述CDR选自与以下序列具有至少90％同一性的序列：

SEQ ID NO:45、SEQ ID NO:46、SEQ ID NO:47、SEQ ID NO:81、SEQ ID NO:82和SEQ IDNO:83；

SEQ ID NO:48、SEQ ID NO:49、SEQ ID NO:50、SEQ ID NO:84、SEQ ID NO:85和SEQ IDNO:86；

SEQ ID NO:51、SEQ ID NO:52、SEQ ID NO:53、SEQ ID NO:87、SEQ ID NO:88和SEQ IDNO:89；

SEQ ID NO:54、SEQ ID NO:55、SEQ ID NO:56、SEQ ID NO:90、SEQ ID NO:91和SEQ IDNO:92；

SEQ ID NO:57、SEQ ID NO:58、SEQ ID NO:59、SEQ ID NO:93、SEQ ID NO:94和SEQ IDNO:95；

SEQ ID NO:60、SEQ ID NO:61、SEQ ID NO:62、SEQ ID NO:96、SEQ ID NO:97和SEQ IDNO:98；

SEQ ID NO:63、SEQ ID NO:64、SEQ ID NO:65、SEQ ID NO:99、SEQ ID NO:100和SEQ IDNO:101；

SEQ ID NO:66、SEQ ID NO:67、SEQ ID NO:68、SEQ ID NO:102、SEQ ID NO:103和SEQID NO:104；

SEQ ID NO:69、SEQ ID NO:70、SEQ ID NO:71、SEQ ID NO:105、SEQ ID NO:106和SEQID NO:107；

SEQ ID NO:72、SEQ ID NO:72、SEQ ID NO:74、SEQ ID NO:108、SEQ ID NO:109和SEQID NO:110；

SEQ ID NO:75、SEQ ID NO:76、SEQ ID NO:77、SEQ ID NO:111、SEQ ID NO:112和SEQID NO:113；和

SEQ ID NO:78、SEQ ID NO:79、SEQ ID NO:80、SEQ ID NO:114、SEQ ID NO:115和SEQID NO:116。

25.根据权利要求1所述的双特异性抗体，其中所述EpCAM结合结构域包括：

与SEQ ID NO:21至少90％相同的序列，和

与SEQ ID NO:33至少90％相同的序列；

与SEQ ID NO:22至少90％相同的序列，和

与SEQ ID NO:34至少90％相同的序列；或

与SEQ ID NO:24至少90％相同的序列，和

与SEQ ID NO:36至少90％相同的序列。

26.根据权利要求1所述的双特异性抗体，其中与非特异性IgG1抗体对照相比，小于1nM或小于0.1nM或小于0.01nM的所述双特异性抗体将被巨噬细胞吞噬的A431细胞的百分比增加至少4倍。

27.根据权利要求1所述的双特异性抗体，其中介导巨噬细胞对EpCAM阳性、CD47阳性肿瘤细胞的抗体依赖性细胞吞噬作用所需的抗体的浓度在0.01nM至-3nM之间。

28.根据权利要求27所述的双特异性抗体，其中所述EpCAM阳性、CD47阳性肿瘤细胞是OVISE细胞或A431细胞。

29.根据权利要求27所述的双特异性抗体，其中所述EpCAM阳性、CD47阳性肿瘤细胞选自胰腺导管腺癌细胞、卵巢透明细胞腺癌细胞、结肠腺癌细胞、肺腺癌细胞、卵巢腺癌细胞、外阴鳞状细胞癌细胞。

30.根据权利要求1所述的双特异性抗体，其中100nM的所述双特异性抗体将所述肿瘤细胞的表面上SIRPα与CD47的结合抑制至少30％。

31.根据权利要求1所述的双特异性抗体，其中所述肿瘤细胞是CD47+EpCAM+肿瘤细胞。

32.根据权利要求1所述的双特异性抗体，其中所述肿瘤细胞在其表面上表达与HCC-44细胞至少一样多的EpCAM蛋白。

33.根据权利要求1所述的双特异性抗体，其中所述肿瘤细胞在其表面上表达至少100,000、至少300,000、至少600,000或至少1,500,000个EpCAM蛋白。

34.根据权利要求1所述的双特异性抗体，其中400nM的所述双特异性抗体在血细胞凝集测定中不诱导红细胞的溶血。

35.一种双特异性抗体，其包括CD47结合结构域和EGFR结合结构域，其中所述双特异性抗体对在肿瘤细胞的表面上表达的CD47的亲和力高于对在红细胞或血小板的表面上表达的CD47的亲和力。

36.根据权利要求35所述的双特异性抗体，其还包括Fc结构域。

37.根据权利要求35所述的双特异性抗体，其中所述肿瘤细胞表达EGFR。

38.根据权利要求35所述的双特异性抗体，其中半最大结合至人红细胞所需的所述双特异性抗体的浓度大于500nM。

39.根据权利要求35所述的双特异性抗体，其中双特异性抗体以通过表面等离子体共振确定的小于100nM的KD结合至人CD47。

40.根据权利要求35所述的双特异性抗体，其中所述双特异性抗体以通过表面等离子体共振确定的1nM至100nM、1nM至50nM或5nM至50nM的KD结合至人CD47。

41.根据权利要求35所述的双特异性抗体，其中所述双特异性抗体以通过表面等离子体共振确定的小于500nM的KD结合至EGFR。

42.根据权利要求35所述的双特异性抗体，其中所述双特异性抗体以通过表面等离子体共振确定的0.2nM至500nM、0.2nM至200nM、0.2nM至20nM、0.2nM至2nM或2nM至10nM的KD结合至EGFR。

43.根据权利要求35所述的双特异性抗体，其中所述CD47结合结构域是人或工程改造的人CD47结合结构域。

44.根据权利要求43所述的双特异性抗体，其中所述CD47结合结构域包括重链可变结构域和轻链可变结构域。

45.根据权利要求44所述的双特异性抗体，其中所述CD47结合结构域包括scFv。

46.根据权利要求35所述的双特异性抗体，其中所述EGFR结合结构域包括重链可变结构域和轻链可变结构域。

47.根据权利要求46所述的双特异性抗体，其中所述EGFR结合结构域包括scFv。

48.根据权利要求36所述的双特异性抗体，其中所述Fc结构域是人Fc结构域。

49.根据权利要求36所述的双特异性抗体，其中所述人Fc结构域的同种型是IgG1、IgG2或IgG4。

50.根据权利要求36所述的双特异性抗体，其中所述Fc结构域是异二聚体Fc结构域，其中异二聚体Fc区包括杵链和臼链，形成杵臼(KiH)结构。

51.根据权利要求50所述的双特异性抗体，其中所述杵链包括突变T366W，并且所述臼链包括突变T366S、L368A和Y407V，其中氨基酸位置编号根据Kabat等人的EU索引。

52.根据权利要求50所述的双特异性抗体，其中所述双特异性抗体具有不对称的三链杵臼结构。

53.根据权利要求35所述的双特异性抗体，其中所述CD47结合结构域是scFv。

54.根据权利要求35所述的双特异性抗体，其中所述EGFR结合结构域是scFv。

55.根据权利要求35所述的双特异性抗体，其中所述CD47结合结构域包括三个重链(HC)互补决定区(CDR)：HC-CDR1、HC-CDR2和HC-CDR3；和三个轻链(LC)CDR：LC-CDR1、LC-CDR2和LC-CDR3；其中HC-CDR1包括SEQ ID NO:15，HC-CDR2包括SEQ ID NO:16，HC-CDR3包括与SEQ ID NO:17具有至少50％同一性的序列，LC-CDR1包括SEQ ID NO:18，LC-CDR2包括SEQID NO:19，并且LC-CDR3包括与SEQ ID NO:20具有至少50％同一性的序列。

56.根据权利要求55所述的双特异性抗体，其中HC-CDR3包括在K94、E95、G96、S97、F98、G99、V100b、D101和P102中的一个或多个处的氨基酸取代；并且LC-CDR3包括在Y89、S90、T91、D92、I93、S94、G95、N95a、H95b、W96和V97中的一个或多个处的氨基酸取代。

57.根据权利要求44所述的双特异性抗体，其中所述CD47结合结构域的所述重链可变结构域包括与SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:10或SEQ ID NO:13具有至少90％同一性的序列，并且所述CD47结合结构域的所述轻链包括与SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:11或SEQ IDNO:14具有至少90％同一性的序列。

58.根据权利要求35所述的双特异性抗体，其中所述EGFR结合结构域包括三个重链(HC)互补决定区(CDR)：HC-CDR1、HC-CDR2和HC-CDR3以及三个轻链(LC)CDR：LC-CDR1、LC-CDR2和LC-CDR3；其中所述CDR由被列为HC-CDR1、HC-CDR2、HC-CDR3、LC-CDR1、LC-CDR2、LC-CDR3的序列的有序集合定义；并且其中所述CDR选自与以下序列具有至少90％同一性的序列：

SEQ ID NO:121、SEQ ID NO:122、SEQ ID NO:123、SEQ ID NO:124、SEQ ID NO:125和SEQ ID NO:126。

59.根据权利要求35所述的双特异性抗体，其中所述EGFR结合结构域包括：

与SEQ ID NO:127至少90％相同的序列，和

与SEQ ID NO:128至少90％相同的序列。

60.根据权利要求35所述的双特异性抗体，其中与非特异性IgG1抗体对照相比，小于1nM或小于0.01nM的所述双特异性抗体将被巨噬细胞吞噬的A431细胞的百分比增加至少4倍。

61.根据权利要求35所述的双特异性抗体，其中介导巨噬细胞对EGFR阳性、CD47阳性肿瘤细胞的抗体依赖性细胞吞噬作用所需的所述双特异性抗体的浓度在0.01nM至-3nM之间。

62.根据权利要求61所述的双特异性抗体，其中所述EGFR阳性、CD47阳性肿瘤细胞是OVISE细胞或A431细胞。

63.根据权利要求61所述的双特异性抗体，其中所述EGFR阳性、CD47阳性肿瘤细胞选自表皮样癌、结肠直肠腺癌、胰腺腺癌、肺鳞状细胞癌或胃癌。

64.根据权利要求35所述的双特异性抗体，其中100nM的所述双特异性抗体将细胞的表面上SIRPα与CD47的结合抑制至少30％。

65.根据权利要求64所述的双特异性抗体，其中所述细胞是CD47+EGFR+肿瘤细胞。

66.根据权利要求65所述的双特异性抗体，其中所述细胞在其表面上表达与LS1034细胞至少一样多的EGFR蛋白。

67.根据权利要求65所述的双特异性抗体，其中所述细胞在其表面上表达至少50,000、至少100,000、至少300,000、至少600,000或至少1,500,000个EGFR蛋白。

68.根据权利要求35所述的双特异性抗体，其中400nM的所述双特异性抗体在血细胞凝集测定中不诱导红细胞的溶血。

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