CN119301158A - 抗her2/抗cd47分子及其用途 - Google Patents

Abstract

本文提供抗CD47/抗HER2多肽复合物、编码多肽复合物的可变结构域的核酸分子、用于表达多肽复合物的表达载体和宿主细胞。本公开进一步提供了用于生产多肽复合物的方法及其用途。

Description

抗HER2/抗CD47分子及其用途

交叉引用

本申请要求2022年3月25日提交的国际专利申请号PCT/CN2022/082951的优先权。该申请的全部内容通过引用并入本文。

技术领域

本申请总体上涉及抗体。更具体地，本申请涉及特异性结合HER2和CD47的双特异性抗体、其制备方法及其用途。

背景技术

分化簇47(CD47)是约50kDa的免疫球蛋白超家族膜蛋白，由单个细胞外V-setIgSF结构域、具有五个跨膜部分的早老素结构域和短胞质结构域组成。CD47与其配体(在巨噬细胞等髓系细胞上表达的信号调节蛋白alpha(SIRPα))相互作用，然后发出抗吞噬(“不要吃我”)信号以逃避免疫监视[1-2]。CD47是普遍存在的细胞表面糖蛋白，在大多数正常细胞类型上表达，并且在多种恶性肿瘤中过表达，包括急性髓系白血病(AML)、非霍奇金淋巴瘤(NHL)、非小细胞肺癌(NSCC)、乳腺癌(BC)和胃癌(GC)。因此，CD47可作为癌症治疗的先天免疫检查点靶标，以通过阻断CD47-SIRPα相互作用来关闭“不要吃我”的信号[3]。

HER2(也称为erb-b2受体酪氨酸激酶2或ERBB2)与HER1(也称为EGFR)、HER3和HER4一起，都是表皮生长因子受体(EGFR)家族的成员。这些受体以同二聚体或异二聚体的形式发挥作用，激活多种细胞通路，例如丝裂原激活蛋白激酶(MAPK)通路和磷脂酰肌醇-3-激酶(PI3K)通路，然后刺激细胞生长、存活和分化[4]。

CD47高表达与患有各种癌症的患者的不良预后相关，CD47和Her2的共表达可能导致Her2⁺癌症(例如BC、GC)在Her2靶向治疗后的疾病进展[5-6]。专门设计的CD47xHer2双特异性抗体(BsAb)可能会优先靶向Her2+/CD47+双阳性肿瘤细胞，并最大限度地减少对CD47单阳性正常细胞的影响，以减少全身性CD47抗原介导的沉没效应和血液毒性。阻断CD47/SIRPα信号传导可以通过增加肿瘤细胞的抗体依赖性细胞吞噬作用(ADCP)并进一步刺激适应性免疫来增强Her2靶向治疗的抗肿瘤功效。此外，BsAb的IgG1 Fc可以维持对Her2⁺肿瘤细胞的抗体依赖性细胞毒性(ADCC)。

虽然Her2过表达的转移性乳腺癌和胃癌患者最初对Her2靶向治疗有反应，但大多数最初对曲妥珠单抗有反应的晚期Her2阳性实体瘤(例如乳腺癌)患者最终获得治疗耐药性并复发(尽管Her2基因扩增或过度表达持续存在)，并且Her2阳性复发/难治性癌症患者存在很高的未得到满足的医疗需求。因此，CD47xHer2 BsAb可能为Her2阳性BC、GC和其他实体瘤提供新的治疗选择。

本公开提供了双靶向CD47和HER2并阻断CD47和HER2的双重功能的双特异性抗体。

发明概述

本公开提供了这些和其他目的，其在广义上涉及提供具有改善功效的抗体的化合物、方法、组合物和制品。本公开提供的益处广泛适用于抗体治疗和诊断领域，并且可以与其他治疗和诊断剂(例如与多种靶标反应的抗体)结合使用。

本公开提供了针对CD47和HER2的双特异性多肽复合物或双特异性抗体。它还提供了编码抗CD47/抗HER2抗体的核酸分子、表达载体和用于表达双特异性抗体的宿主细胞。本公开还提供了制备抗CD47/抗HER2抗体(CD47xHer2 BsAb)以及在体内和体外验证其功能的方法。本公开的双特异性抗体提供了用于预防或治疗包括增殖性病症和免疫病症的疾病的非常有效的药剂。

在一个方面，本公开提供了双特异性多肽复合物或其抗原结合部分，其包含特异性结合HER2的第一抗原结合部分(即，HER2结合部分)和特异性结合CD47的第二抗原结合部分(即CD47结合部分)。

在一些实施方案中，本公开提供了双特异性多肽复合物或其抗原结合部分，其包含特异性结合HER2的第一抗原结合部分(即，HER2结合部分)和特异性结合CD47的第二抗原结合部分(即，CD47结合部分)，其中第一抗原结合部分包含：

含有SEQ ID NO:1的氨基酸序列的重链互补决定区(HCDR)1、含有SEQ ID NO:2的氨基酸序列的HCDR2、含有SEQ ID NO:3的氨基酸序列的HCDR3、含有SEQ ID NO:4的氨基酸序列的轻链互补决定区(LCDR)1、含有SEQ ID NO:5的氨基酸序列的LCDR2、以及含有SEQ IDNO:6的氨基酸序列的LCDR3；和

第二抗原结合部分包含：

含有SEQ ID NO:7的氨基酸序列的HCDR1、含有SEQ ID NO:8的氨基酸序列的HCDR2、含有SEQ ID NO:9的氨基酸序列的HCDR3、含有SEQ ID NO:10的氨基酸序列的LCDR1、含有SEQ ID NO:11的氨基酸序列的LCDR2、以及含有SEQ ID NO:12的氨基酸序列的LCDR3。

在一些实施方案中，第一抗原结合部分和第二抗原结合部分是Fab形式。

在一些实施方案中，第一抗原结合部分包含可操作地连接至第一T细胞受体(TCR)恒定区(称为C1或CBeta)的第一重链可变结构域(VH1)和可操作地连接至第二TCR恒定区(称为C2或CAlpha)的第一轻链可变结构域(VL1)；并且第二抗原结合部分包含可操作地连接至抗体重链CH1结构域的第二VH(VH2)和可操作地连接至抗体轻链恒定(CL)结构域的第二VL(VL2)，其中C1和C2能够形成一个或多个非天然链间二硫键。双特异性多肽复合物或其抗原结合部分中的C1和C2结构域的位置可以互换。

在一些其他实施方案中，第一抗原结合部分包含可操作地连接至抗体重链CH1结构域的第一重链可变结构域(VH1)和可操作地连接至抗体轻链恒定区(CL)的第一轻链可变结构域(VL1)；并且第二抗原结合部分包含可操作地连接至第一T细胞受体(TCR)恒定区(C1)的第二VH(VH2)和可操作地连接至第二TCR恒定区(C2)的第二VL(VL2)，其中C1和C2能够形成一个或多个非天然链间二硫键。双特异性多肽复合物或其抗原结合部分中的C1和C2结构域的位置可以互换。

在一些实施方案中，第一VH包含SEQ ID NO:13的氨基酸序列或与SEQ ID NO:13具有至少85％、90％或95％同一性的氨基酸序列，且第一VL包含SEQ ID NO:14的氨基酸序列或与SEQ ID NO:14具有至少85％、90％或95％同一性的氨基酸序列；和/或

第二VH包含SEQ ID NO:15的氨基酸序列或与SEQ ID NO:15具有至少85％、90％或95％同一性的氨基酸序列，且第二VL包含氨基酸序列SEQ ID NO:16或与SEQ ID NO:16具有至少85％、90％或95％同一性的氨基酸序列。

双特异性多肽复合物可进一步包含Fc区，如人IgG(IgG1、IgG2、IgG3或IgG4)Fc区，如人IgG1 Fc区、IgG2 Fc区或IgG4 Fc区。Fc区可以是天然Fc区或工程化Fc区。例如，人IgG1Fc区可以被工程化以包含“旋钮入孔”结构或本领域常规已知的其他修饰。任选地，Fc区可以选自以下之一：(a)人IgG1 Fc区，其被工程化以包含“旋钮入孔”结构；(b)人IgG4 Fc区，其被工程化以包含“旋钮入孔”结构和S228P突变；和(c)工程化以包含S228P突变和M252Y/S254T/T256E突变的人IgG4 Fc区。

在一些实施方案中，双特异性多肽复合物包含一个CD47结合部分和一个HER2结合部分。例如，双特异性多肽复合物包含两条重链和两条轻链，其中第一重链包含如VH1-C1-铰链-Fc的从N端到C端可操作地连接的结构域，第二重链包含如VH2-CH1-铰链-Fc的从N端到C端可操作地连接的结构域，第一轻链包含如VL1-C2的从N端到C端可操作地连接的结构域，并且第二轻链包含如VL2-C1的从N端到C端可操作地连接的结构域。作为双特异性多肽复合物的替代实例，从N端到C端，第一重链包含如VH1-CH1-铰链-Fc的可操作地连接的结构域，第二重链包含如VH2-C1-铰链-Fc的可操作地连接的结构域，第一轻链包含如VL1-CL的可操作地连接的结构域，并且第二轻链包含如VL2-C2的可操作地连接的结构域。双特异性多肽复合物或其抗原结合部分中的C1和C2结构域的位置可以互换。

在一些实施方案中，本文公开的双特异性多肽复合物包含：

分别包含SEQ ID NO:19和20的第一和第二重链，分别包含SEQ ID NO:21和22的第一和第二轻链。

在一些实施方案中，双特异性多肽复合物包含两个CD47结合部分和两个HER2结合部分。例如，双特异性多肽复合物包含两条重链和四条轻链，其中从N端到C端：第一和第二重链各自包含如VH1-C1-VH2-CH1-铰链-Fc、VH2-CH1-VH1-C1-铰链-Fc、VH1-C1-铰链-Fc-VH2-CH1或VH2-CH1-铰链-Fc-VH1-C1中的可操作地连接的结构域，第一和第二轻链各自包含如VL1-C2中的可操作地连接的结构域，并且第三和第四轻链各自包含如VL2-C1中的可操作地连接的结构域。或者，双特异性多肽复合物包含两条重链和四条轻链，其中从N-末端到C-末端：第一和第二重链各自包含如VH1-CH1-VH2-C1-铰链-Fc、VH2-C1-VH1-CH1-铰链-Fc、VH1-CH1-铰链-Fc-VH2-C1或VH2-C1-铰链-Fc-VH1-CH1中的可操作地连接的结构域，第一和第二轻链各自包含如VL1-CL中的可操作地连接的结构域，并且第三和第四轻链各自包含如VL2-C2中的可操作地连接的结构域。双特异性多肽复合物或其抗原结合部分中的C1和C2结构域的位置可以互换。

在一些实施方案中，双特异性多肽复合物包含一个CD47结合部分和两个HER2结合部分。例如，双特异性多肽复合物包含两条重链和三条轻链，其中从N端到C端：第一重链包含如VH2-CH1-VH1-C1-铰链-Fc或VH1-C1-铰链-Fc-VH2-CH1中的可操作地连接的结构域，第二重链包含如VH1-C1-铰链-Fc中的可操作地连接的结构域，第一和第二轻链各自包含如VL1-C2中的可操作地连接的结构域，并且第三轻链包含如VL2-C1中的可操作地连接的结构域。或者，第一重链包含如VH2-C1-VH1-CH1-铰链-Fc或VH1-CH1-铰链-Fc-VH2-C1中的可操作地连接的结构域，第二重链包含如VH1-CH1-铰链-Fc中的可操作地连接的结构域，第一和第二轻链各自包含如VL1-CL中的可操作地连接的结构域，并且第三轻链包含如VL2-C2中的可操作地连接的结构域。双特异性多肽复合物或其抗原结合部分中的C1和C2结构域的位置可以互换。

在一些实施方案中，双特异性多肽复合物包含两个CD47结合部分和一个HER2结合部分。例如，双特异性多肽复合物包含两条重链和三条轻链，其中从N端到C端：第一重链包含如VH1-C1-VH2-CH1-铰链-Fc或VH2-CH1-铰链-Fc-VH1-C1中的可操作地连接的结构域，第二重链包含如VH2-CH1-铰链-Fc中的可操作地连接的结构域，第一轻链包含如VL1-C2中的可操作地连接的结构域，并且第二和第三轻链各自包含如VL2-CL中的可操作地连接的结构域。或者，第一重链包含如VH1-CH1-VH2-C1-铰链-Fc或VH2-C1-铰链-Fc-VH1-CH1中的可操作地连接的结构域，第二重链包含如VH2-C1-铰链-Fc中的可操作地连接的结构域，第一轻链包含如VL1-CL中的可操作地连接的结构域，并且第二和第三轻链各自包含如VL2-C2中的可操作地连接的结构域。双特异性多肽复合物或其抗原结合部分中的C1和C2结构域的位置可以互换。

可操作地连接或“-”可以经由直接连接或经由肽接头，例如GS接头，例如(GS)n、(GGS)n、(GGGS)n、(GGGS)n、(GGGGS)n、(GGGGS)n、(GGGS)n，其中n是1-9的整数。双特异性多肽复合物可以是人源化抗体或全人抗体。在一些实施方案中，双特异性多肽复合物是全人抗体。

在一个方面，本文公开了分离的核酸分子，其包含编码双特异性多肽复合物或其抗原结合部分的核酸序列。

在一个方面，本文公开了包含如上所述的核酸分子的载体。在一个方面，本文公开了包含如上所述的核酸分子或载体的宿主细胞。

在一个方面，本文公开了药物组合物，其包含双特异性多肽复合物或其抗原结合部分和药学上可接受的载剂。

在一个方面，本文公开了用于产生双特异性多肽复合物的方法，包括以下步骤：

-在合适的条件下培养包含编码多肽复合物的核酸序列的宿主细胞；和

-从宿主细胞中分离多肽复合物。

在一个方面，本文公开了用于调节受试者中HER2和/或CD47相关免疫应答的方法，其包括向受试者施用如本文公开的双特异性多肽复合物或其抗原结合部分或药物组合物。

在一个方面，本文公开了用于抑制受试者中肿瘤细胞(诸如CD47和/或HER2阳性的肿瘤细胞)生长的方法，其包括向受试者施用有效量的如本文公开的双特异性多肽复合物或其抗原结合部分或药物组合物。

在一个方面，本文公开了用于在受试者中诱导巨噬细胞介导的肿瘤细胞吞噬作用的方法，其包括向受试者施用有效量的如本文公开的双特异性多肽复合物或其抗原结合部分或药物组合物。

在一个方面，本文公开了用于在受试者中诱导对(或针对)肿瘤细胞的自然杀伤细胞介导的细胞毒性的方法，其包括向受试者施用有效量的如本文公开的双特异性多肽复合物或其抗原结合部分或药物组合物。

在一个方面，本文公开了用于诊断、预防或治疗受试者中的癌症的方法，其包括向受试者施用有效量的双特异性多肽复合物或其抗原结合部分或药物组合物。在一些实施方案中，癌症是HER2和/或CD47阳性癌症，并且选自结肠癌、结肠直肠癌、乳腺癌、肺癌(包括NSCLC和小细胞肺癌)、宫颈癌、肾癌、胶质母细胞瘤、卵巢癌、胰腺癌、前列腺癌、食道癌、胃癌、黑色素瘤、肝癌、头颈癌、皮肤癌、膀胱癌、脑癌、支气管癌、胆管癌、子宫内膜癌、室管膜瘤、神经胶质瘤、未知原发性来源的癌症、髓母细胞瘤、鼻咽癌、神经母细胞瘤、鳞状细胞癌、视网膜母细胞瘤、肉瘤、睾丸癌、胸腺瘤、甲状腺癌、脐尿管癌、子宫癌、阴道癌、星形细胞瘤、基底细胞癌及其组合。

在一些进一步的实施方案中，癌症是乳腺癌、胃癌、肺癌、皮肤癌或结肠直肠癌。

在一个方面，本文公开了用于诊断、预防或治疗受试者中的癌症的组合物，其包含有效量的本文公开的双特异性多肽复合物或其抗原结合部分。

在一个方面，本文公开了双特异性多肽复合物或其抗原结合部分用于以下的用途：

i)调节HER2和/或CD47相关的免疫应答；和/或

ii)诱导巨噬细胞介导的肿瘤细胞吞噬作用；和/或

iii)诱导自然杀伤细胞介导的肿瘤细胞细胞毒性；和/或

iv)抑制肿瘤细胞的生长，例如CD47和/或HER2阳性的肿瘤细胞。

在一个方面，本文公开了双特异性多肽复合物或其抗原结合部分用于诊断、治疗或预防癌症的用途。

在一个方面，本文公开了双特异性多肽复合物或其抗原结合部分在制备用于以下药物中的用途：

i)调节HER2和/或CD47相关的免疫应答；

ii)诱导巨噬细胞介导的肿瘤细胞吞噬作用；

iii)诱导自然杀伤细胞介导的肿瘤细胞细胞毒性；和/或

iv)抑制肿瘤细胞的生长，例如CD47和/或HER2阳性的肿瘤细胞。

在一个方面，本文公开了双特异性多肽复合物或其抗原结合部分在制备用于诊断、治疗或预防癌症的药物中的用途。

如本文所公开的双特异性多肽复合物或其抗原结合部分可以与用于癌症免疫疗法的化疗剂、放射和/或其他药剂组合施用，并且可以与用于癌症免疫疗法的化疗剂、放射和/或其他药剂一起用于组合疗法。

在一个方面，本文公开了试剂盒，其中所述试剂盒包含容器，所述容器包含如上所述的双特异性多肽复合物或其抗原结合部分。

上述内容是概述，必然包含细节的简化、概括和省略；因此，本领域技术人员将理解，该发明内容仅是说明性的，并不旨在以任何方式进行限制。

附图说明

图1示出了W308032双特异性抗体以WuXiBody E17形式的示意图。从N端到C端，第一重链，VH1-Cbeta-铰链-Fc；第二重链，VH2-CH1-铰链-Fc；第一轻链，VL1-CAlpha；和第二轻链，VL2-CL。

图2-3分别示出了W308032-U5T6.E17-57.uIgG1的SDS-PAGE和SEC-HPLC表征。

图4-6分别显示了W308032-U5T6.E17-57.uIgG1的DSF、DLS和HIC-HPLC表征。

图7A-7F显示了通过SPR测定的W308032-U5T6.E17-57.uIgG1分别对人Her2蛋白(A：第1轮，B：第2轮，C：第3轮)和人CD47蛋白(D：第1轮，E：第2轮，F：第3轮)的结合亲和力。

图8A-8B显示了W308032-U5T6.E17-57.uIgG1在没有抗原沉没的情况下(图8A)或在被人血细胞沉没之后(图8B)与SK-BR-3的结合。

图9A-9B显示了W308032-U5T6.E17-57.uIgG1在没有抗原沉没的情况下(图9A)或在被Jurkat细胞沉没之后(图9B)与SK-BR-3的结合。

图10A-10B显示了W308032-U5T6.E17-57.uIgG1在没有抗原沉没的情况下(图10A)或在被Jurkat细胞沉没之后(图10B)与HCC1954的结合。

图11显示了W308032-U5T6.E17-57.uIgG1与人血细胞的结合。

图12显示了W308032-U5T6.E17-57.uIgG1与Jurkat细胞的结合。

图13A-13B显示了在没有抗原沉没的情况下(图13A)或在被人血细胞沉没之后(图13B)，W308032-U5T6.E17-57.uIgG1对SK-BR-3上CD47配体的阻断。

图14A-14B显示了在没有抗原沉没的情况下(图14A)或在被Jurkat细胞沉没之后(图14B)，W308032-U5T6.E17-57.uIgG1对SK-BR-3上CD47配体的阻断。

图15显示了W308032-U5T6.E17-57.uIgG1对Jurkat细胞上CD47配体的阻断。

图16A-16B分别显示了W308032-U5T6.E17-57.uIgG1对SK-BR-3的HER2和CD47占有率。

图17A-17B显示了两个独立实验中W308032-U5T6.E17-57.uIgG1对SK-BR-3的ADCP。

图18-19分别显示了W308032-U5T6.E17-57.uIgG1对HCC1954(图18)和NCI-N87(图19)的ADCP。

图20-21分别显示了W308032-U5T6.E17-57.uIgG1对人血细胞(图20)和Jurkat细胞(图21)的ADCP。

图22-24分别显示了W308032-U5T6.E17-57.uIgG1对SK-BR-3(图22)、HCC1954(图23)和NCI-N87(图24)的ADCC。

图25显示了W308032-U5T6.E17-57.uIgG1对Jurkat细胞的ADCC。

图26-27分别显示了W308032-U5T6.E17-57.uIgG1对SK-BR-3(图26)和NCI-N87(图27)增殖的抑制作用。

图28显示了W308032-U5T6.E17-57.uIgG1对人血细胞的血凝作用。

图29显示了W308032-U5T6.E17-57.uIgG1的热稳定性结果。

图30显示了HCC1954异种移植模型中抗HER2和抗CD47疗法的组合抗肿瘤作用。

图31显示了HCC1954异种移植模型中不同剂量水平的W308032-U5T6.E17-57.uIgG1的抗肿瘤作用。

图32显示了HCC1954异种移植模型中与帕妥珠单抗的组合疗法的抗肿瘤作用。

图33显示了HCC1954异种移植模型中第36天的肿瘤重量的总结。注：双因素方差分析Bonferroni后检验，*p<0.05；**p<0.01。

图34显示了NCI-N87异种移植模型中抗Her2和抗CD47疗法的组合抗肿瘤作用。

图35显示了NCI-N87异种移植模型中W308032-U5T6.E17-57.uIgG1的抗肿瘤作用的总结。

图36显示了NCI-N87异种移植模型中与紫杉醇的组合疗法的抗肿瘤作用的总结。

图37显示了JIMT-1异种移植模型中与紫杉醇的组合疗法的抗肿瘤作用的总结。

图38显示了最后一次给药后肿瘤反弹的总结。虚线表示分组时的平均初始肿瘤体积。

图39显示了W308032-U5T6.E17-57.uIgG1和曲妥珠单抗的啮齿动物药代动力学总结。

发明详述

而本公开可以以许多不同的形式实施，本文公开的是举例说明本公开的原理的具体说明性实施方案。应当强调的是，本公开不限于所示的具体实施方案。此外，本文使用的任何章节标题仅用于组织目的，并且不应被解释为限制所描述的主题。

除非本文另有定义，否则与本公开相关的科学和技术术语应具有本领域普通技术人员通常理解的含义。此外，除非上下文另有要求，否则单数术语应包括复数并且复数术语应包括单数。更具体地，如本说明书和所附权利要求中所使用的，单数形式“一(a)”、“一个(an)”和“该(the)”包括复数指示物，除非上下文另外明确指出。因此，例如，提及“一种蛋白质”包括多种蛋白质；提及“一个细胞”包括细胞的混合物等。在本申请中，使用“或”表示“和/或”，除非另有说明。此外，使用术语“包含(comprising)”以及其他形式，例如“包含(comprises)”和“包含(comprised)”，不是限制性的。另外，说明书和所附权利要求中提供的范围包括两个端点以及端点之间的所有点。

一般而言，与本文所述的细胞和组织培养、分子生物学、免疫学、微生物学、遗传学以及蛋白质和核酸化学和杂交相关使用的命名法和技术是本领域众所周知的和常用的。除非另有说明，否则本公开的方法和技术通常根据本领域熟知的常规方法以及如在本说明书中引用和讨论的各种一般性和更具体的参考文献中所描述的。参见,例如,Abbas et al.,Cellular and Molecular Immunology,6^th ed.,W.B.Saunders Company(2010)；SambrookJ.&Russell D.Molecular Cloning:A Laboratory Manual,3rd ed.,Cold Spring HarborLaboratory Press,Cold Spring Harbor,N.Y.(2000)；Ausubel et al.,Short Protocolsin Molecular Biology:A Compendium of Methods from Current Protocols inMolecular Biology,Wiley,John&Sons,Inc.(2002)；Harlow and Lane UsingAntibodies:A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor Laboratory Press,ColdSpring Harbor,N.Y.(1998)；和Coliganet al.,Short Protocols in Protein Science,Wiley,John&Sons,Inc.(2003)。与本文描述的分析化学、合成有机化学以及医学和药物化学相关使用的命名法以及其实验室程序和技术是本领域众所周知的和常用的。本文描述的方法、组合物和/或装置和/或其他主题的其他方面、特征和优点将在本文阐述的教导中变得显而易见。此外，本申请全文引用的所有参考文献、专利和公开的专利申请的内容均通过引用整体并入本文。

定义

为了更好地理解本公开，相关术语的定义和解释提供如下。

如本文所用，术语“抗体”或“Ab”以最广泛的含义使用，并且涵盖表现出期望生物学或结合活性的任何形式的抗体。其涵盖但不限于人源化抗体、全人抗体、嵌合抗体和单结构域抗体。本文公开的双特异性多肽复合物也属于抗体。常见的抗体通常包含重链和轻链。重链可分为μ、δ、γ、α和ε，它们分别将抗体的同种型定义为IgM、IgD、IgG、IgA和IgE。每条重链由重链可变区(V_H)和重链恒定区(C_H)组成。重链恒定区由3个结构域组成(C_H1、C_H2和C_H3)。每条轻链由轻链可变区(V_L)和轻链恒定区(C_L)组成。如本文所证明的，可以对恒定区进行各种修饰或者可以将它们替换为其他免疫球蛋白衍生的恒定区。V_H和V_L区域可以进一步分为高变区(称为互补决定区(CDR))，其由相对保守的区域(称为框架区(FR))间隔。每个V_H和V_L由以下顺序的3个CDR和4个FR组成：从N端到C端，FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4。每个重链/轻链对的可变区(V_H和V_L)分别形成抗原结合位点。框架区和CDR的范围可以使用本领域已知的方法来精确鉴定，例如通过Kabat定义、Chothia定义、AbM定义、EU定义和/或接触定义，所有这些都是本领域众所周知。参见，例如：Kabat,E.A.,et al.(1991)Sequences ofProteins of Immunological Interest,Fifth Edition,U.S.Department of Health andHuman Services,NIH Publication No.91-3242,Chothia et al.,(1989)Nature 342:877；Chothia,C.et al.(1987)J.Mol.Biol.196:901-917,Al-lazikani et al(1997)J.Molec.Biol.273:927-948；Edelman et al.,Proc Natl Acad Sci U S A.1969May,63(1):78-85；和Almagro,J.Mol.Recognit.17:132-143(2004)。另请参见hgmp.mrc.ac.uk和bioinf.org.uk/abs。根据不同定义的编号之间的对应或比对可以例如在www.imgt.org/上找到(也参见Giudicelli V et al.IMGT,the international ImMunoGeneTicsdatabase.Nucleic Acids Res.(1997)25:206–11；和Lefranc MP et al.,IMGT uniquenumbering for immunoglobulin and T cell receptor variabledomains and Igsuperfamily V-like domains.Dev Comp Immunol.(2003)27:55–77)。抗体可以是不同的抗体同种型，例如IgG(例如IgG1、IgG2、IgG3或IgG4亚型)、IgA1、IgA2、IgD、IgE或IgM抗体。

如本文所用，术语“抗原结合部分”是指由包含一个或多个CDR的抗体的一部分形成的抗体片段，或结合抗原但不包含完整天然抗体结构的任何其他抗体片段。抗原结合部分的实例包括但不限于可变结构域、可变区、双抗体、Fab、Fab’、F(ab’)2、Fv片段、单链Fv片段(scFv)、二硫键稳定的Fv片段(dsFv)、(dsFv)2、双特异性dsFv(dsFv-dsFv’)、二硫键稳定的双抗体(ds双抗体)、多特异性抗体、骆驼化单结构域抗体、单可变结构域(即VHH)、纳米抗体、结构域抗体和二价结构域抗体。抗原结合部分能够结合亲本抗体所结合的相同抗原。在某些实施方案中，抗原结合部分可以包含移植至来自一种或多种不同人抗体的框架区的来自特定人抗体的一个或多个CDR。关于抗原结合部分的更详细的形式描述于Spiess et al,(2015)Molecular Immunology 67:95-106,和Brinkman et al.,mAbs,9(2),pp.182–212(2017)，其以其整体并入本文。

术语抗体的“抗原结合部分”或“抗原结合片段”在本申请的上下文可以互换使用，是指包含本文公开的全长抗体或多肽复合物的片段的多肽，其保留了与全长抗体特异性结合的抗原特异性结合的能力，和/或与全长抗体竞争结合相同抗原的能力。通常，参见Fundamental Immunology,Ch.7(Paul,W.,ed.,the second edition,Raven Press,N.Y.(1989)，其出于所有目的通过引用并入本文。

关于抗体，“Fab”是指抗体中由通过二硫键与单个重链的可变区和第一恒定区缔合的单个轻链(可变区和恒定区两者)组成的部分。在某些实施方案中，轻链和重链的恒定区均被TCR恒定区替换。

关于抗体，“Fc”(可结晶片段的缩写)是指抗体的包含以下的部分：经由二硫键结合到第二重链的第二(CH2)和第三(CH3)恒定区的第一重链的第二和第三恒定区。如本文所用的Fc区还可以包含铰链区的一部分或全部。术语“铰链”或“铰链区”是指IgG和IgA免疫球蛋白类别的重链中心部分中的柔性氨基酸延伸段，其通过二硫键连接这2条链，并且如本文所用，可以包括天然铰链区作为整体、部分、同源物或其功能等同物。抗体的Fc区负责ADCC和CDC等多种效应功能，但通常不在抗原结合中发挥功能。抗体通过其Fc结构域启动和调节效应功能的能力是其体内保护活性的关键组成部分。尽管抗体的中和活性以前被认为仅仅是Fab-抗原相互作用的结果，但很明显，它们的体内活性高度依赖于IgG Fc结构域与其同源受体，表达于效应白细胞表面的Fcγ受体(FcγR)的相互作用。

如本文所用，术语“人源化抗体”是指其中衍生自另一种哺乳动物物种(例如小鼠)种系的CDR序列已被移植到人框架序列上的抗体。可以在人框架序列内进行额外的框架区修饰。

如本文所用，术语“人抗体”或“全人抗体”旨在包括具有可变区的抗体，其中框架区和CDR区均衍生自人种系免疫球蛋白序列。此外，如果抗体含有恒定区，则该恒定区也衍生自人种系免疫球蛋白序列。人抗体可以包括不由人种系免疫球蛋白序列编码的氨基酸残基(例如，通过体外随机或位点特异性诱变或通过体内体细胞突变引入的突变)。然而，如本文所用，术语“人抗体”不旨在包括其中衍生自另一种哺乳动物物种(例如小鼠)种系的CDR序列已被移植到人框架序列上的抗体。

术语“可操作地连接(operably link)”和“可操作地连接(operably linked)”是指两个或更多个感兴趣的生物序列，在有或没有间隔子或接头下，以使得它们处于允许它们以预期方式发挥功能的关系的方式并置。当涉及用于多肽时，其旨在表示多肽序列以允许连接产物具有预期生物学功能的方式连接。例如，抗体可变区可以可操作地连接至恒定区，以提供具有抗原结合活性的稳定产物。该术语还可以用于多核苷酸。例如，当编码多肽的多核苷酸可操作地连接至调节序列(例如，启动子、增强子、沉默子序列等)时，其旨在表示多核苷酸序列以允许多肽从多核苷酸的调节表达的方式连接。术语可操作地连接(operably linked)，当在本文中用于描述连接形成多肽的结构域时，可以由“-”表示，并且可以指结构域之间的直接连接或经由接头连接，接头长度包含1-30个氨基酸，例如单个氨基酸或一系列(G4S)n接头，其中n＝1-5(1、2、3、4或5)。

如本文所用，术语“Ka”旨在指特定抗体-抗原相互作用的缔合速率，而如本文所用的术语“Kd”旨在指特定抗体-抗原相互作用的解离速率。如本文所用的术语“K_D”旨在指特定抗体-抗原相互作用的解离常数，其由Kd与Ka的比率(即Kd/Ka)获得，并且以摩尔浓度(M)表示。用于测定抗体的K_D的优选方法是通过使用表面等离子体共振，优选使用生物传感器系统，例如系统。

如本文使用的术语“特异性结合(specific binding)”或“特异性结合(specifically binds)”是指两个分子之间的非随机结合反应，例如抗体和抗原之间的非随机结合反应。如本文所用，术语IgG抗体的“高亲和力”是指抗体对靶抗原具有以下K_D：1×10^-7M或更小，更优选5×10^-8M或更小，甚至更优选1×10^-8M或更小，甚至更优选5×10^-9M或更小，甚至更优选1×10^-9M或更小，并且甚至更优选5×10^-10M或更小，例如通过SPR所测量的。

如本文所用，术语“EC₅₀”，也称为“半数最大有效浓度”，是指在指定的暴露时间后，引起基线和最大值之间一半反应的药物、抗体或毒物浓度。在本申请的上下文中，EC₅₀以“nM”为单位表示。

如本文所用，术语“IC₅₀”，也称为“半数最大抑制浓度”，是指药物、抗体或其他物质的半数最大抑制浓度。它是药物、抗体或其他物质抑制生物或生化功能的有效性的度量。在本申请的上下文中，IC₅₀以“nM”为单位表示。

如本文所用，“抑制结合”或“阻断结合”的能力是指抗体将两个分子(例如，人CD47和CD47配体SIRPα)之间的结合相互作用抑制至任何可检测程度的能力。在一些实施方案中，如本文公开的抗体以以下IC₅₀阻断CD47与SIRPα之间的结合：不超过1nM、不超过0.8nM、不超过0.6nM、不超过0.4nM或不超过0.3nM。

如本文所用，术语“表位”是指免疫球蛋白或抗体特异性结合的抗原上的部分。“表位”也称为“抗原决定簇”。表位或抗原决定簇一般由氨基酸、碳水化合物或糖侧链等分子的化学活性表面基团组成，通常具有特定的三维结构和特定的电荷特性。例如，表位通常包含处于独特空间构象的至少3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14或15个连续或不连续的氨基酸，其可以是“线性的”或“构象的”。参见，例如，Epitope Mapping Protocols in Methods inMolecular Biology,Vol.66,G.E.Morris,Ed.(1996)。

如本文所用，术语“分离的”是指通过人工手段从天然状态获得的状态。如果某种“分离的”物质或组分在自然界中存在，则可能是因为其自然环境发生了变化，或者该物质从自然环境中分离出来，或者两者兼而有之。例如，某种未分离的多核苷酸或多肽天然存在于某种活体动物体内，从这种天然状态分离出的具有高纯度的相同多核苷酸或多肽称为分离的多核苷酸或多肽。术语“分离的”既不排除混合的人工或合成物质，也不排除不影响分离物质活性的其他不纯物质。

如本文所用，术语“分离的抗体”旨在指基本上不含具有不同抗原特异性的其他抗体的抗体(例如，特异性结合CD47和HER2蛋白的分离的双特异性抗体基本上不含具有不同靶向抗原或表位的抗体)。然而，特异性结合人CD47蛋白和HER2蛋白的分离抗体可能与其他抗原(例如来自其他物种的CD47或HER2蛋白)具有交叉反应性。此外，分离的抗体可以基本上不含其他细胞材料和/或化学物质。

如本文所用，术语“载体”是指可具有插入其中的多核苷酸的核酸媒介物。当载体允许表达由插入其中的多核苷酸编码的蛋白质时，该载体被称为表达载体。载体可以具有通过转化、转导或转染到宿主细胞而在宿主细胞中表达的携带的遗传物质元件。载体是本领域技术人员熟知的，包括但不限于质粒、噬菌体、粘粒、人工染色体例如酵母人工染色体(YAC)、细菌人工染色体(BAC)或P1衍生的人工染色体(PAC)；噬菌体如λ噬菌体或M13噬菌体和动物病毒。可用作载体的动物病毒包括但不限于逆转录病毒(包括慢病毒)、腺病毒、腺相关病毒、疱疹病毒(例如单纯疱疹病毒)、痘病毒、杆状病毒、乳头瘤病毒、乳多空病毒(如SV40)。载体可包含用于控制表达的多个元件，包括但不限于启动子序列、转录起始序列、增强子序列、筛选元件和报告基因。另外，载体可以包含复制起点。

如本文所用，术语“宿主细胞”是指可以将载体引入其中的细胞，包括但不限于原核细胞如大肠杆菌或枯草芽孢杆菌，真菌细胞如酵母细胞或曲霉属，昆虫细胞如S2果蝇细胞或Sf9，和动物细胞如成纤维细胞、CHO细胞、COS细胞、NSO细胞、HeLa细胞、BHK细胞、HEK293细胞或人细胞。

如本文所用，术语“同一性”是指两个或更多个多肽分子或两个或更多个核酸分子的序列之间的关系，如通过比对和比较序列确定的。“同一性百分比”表示所比较的分子中的氨基酸或核苷酸之间相同残基的百分比，并且是基于所比较的最小分子的大小来计算的。对于这些计算，比对中的空位(如果有的话)优选地通过特定的数学模型或计算机程序(即“算法”)来解决。可用于计算比对的核酸或多肽的同一性的方法包括描述于以下的那些：Computational Molecular Biology,(Lesk,A.M.,ed.),1988,New York:OxfordUniversity Press；Biocomputing Informatics and Genome Projects,(Smith,D.W.,ed.),1993,New York:Academic Press；Computer Analysis of Sequence Data,Part I,(Griffin,A.M.,and Griffin,H.G.,eds.),1994,New Jersey:Humana Press；von Heinje,G.,1987,Sequence Analysis in Molecular Biology,New York:Academic Press；Sequence Analysis Primer,(Gribskov,M.and Devereux,J.,eds.),1991,New York:M.Stockton Press；和Carillo et al,1988,SIAMJ.Applied Math.48:1073。

如本文所用，术语“免疫原性”是指刺激生物体中特异性抗体或致敏淋巴细胞形成的能力。它不仅是指抗原刺激特定免疫细胞活化、增殖、分化以最终生成免疫效应物例如抗体或致敏淋巴细胞的特性，还指机体免疫系统受到抗原刺激后，可以形成抗体或致敏T淋巴细胞的特异性免疫应答。免疫原性是抗原最重要的特性。抗原能否成功诱导宿主生成免疫应答取决于三个因素：抗原的特性、宿主的反应性和免疫手段。

如本文所用，术语“转染(transfection)”或“转染(transfect)”是指将核酸引入真核细胞，特别是哺乳动物细胞中的过程。转染的方案和技术包括但不限于脂质转染以及化学和物理方法例如电穿孔。许多转染技术是本领域众所周知的并且在本文中公开。参见，例如，Graham et al.,1973,Virology 52:456；Sambrook et al.,2001,MolecularCloning:A Laboratory Manual,supra；Davis et al.,1986,Basic Methods inMolecular Biology,Elsevier；Chu et al,1981,Gene13:197。

如本文所用，术语“SPR”或“表面等离子共振”，是指并包括允许在生物传感器矩阵内通过检测蛋白质浓度的变化来分析实时生物特异性相互作用的光学现象，例如使用BIAcore系统(Pharmacia Biosensor AB,Uppsala,Sweden and Piscataway,N.J.)。对于进一步描述，请参见实施例5和U.,et al.(1993)Ann.Biol.Clin.51:19-26；U.,et al.(1991)Biotechniques11:620-627；Johnsson,B.,et al.(1995)J.Mol.Recognit.8:125-131；和Johnnson,B.,et al.(1991)Anal.Biochem.198:268-277。

如本文所用，术语“荧光激活细胞分选”或“FACS”是指特殊类型的流式细胞术。它提供了基于每个细胞的特定光散射和荧光特征将生物细胞的异质混合物分选到两个或更多个容器(一次一个细胞)中的方法(FlowMetric.“Sorting Out Fluorescence ActivatedCell Sorting”.Retrieved 2017-11-09.)。用于进行FACS的仪器是本领域技术人员已知的并且是公众可商购获得的。此类仪器的例子包括来自Becton Dickinson(Foster City,Calif.)的FACS Star Plus、FACScan和FACSort仪器，来自Coulter Epics Division(Hialeah,Fla.)的Epics C和来自Cytomation(Colorado Springs,Colo.)的MoFlo。

术语“受试者”包括任何人或非人动物，优选人。

如本文所用的涉及疾病或病况的术语“与HER2相关(associated with HER2)”或“与HER2相关(related to HER2)”，是指由HER2(例如，人HER2)的表达或活性的增加或减少引起、加剧或以其他方式与之相关的任何疾病或病况。

如本文所用，术语“癌症”是指任何肿瘤或恶性细胞生长、增殖或转移介导的实体瘤和非实体瘤例如白血病并引发医学病况。

如本文在治疗病况的上下文中所用，术语“治疗(treatment)”、“治疗(treating)”或“被治疗(treated)”，通常涉及治疗和疗法，无论是对人还是对动物，其中实现某些期望的治疗效果，例如抑制病况的进展，包括进展速率的降低、进展速率的停止、病况的消退、病况的改善和病况的治愈。对于癌症，“治疗”可以指抑制或减缓肿瘤或恶性细胞的生长、增殖或转移，或其某种组合。对于肿瘤，“治疗”包括去除全部或部分肿瘤、抑制或减缓肿瘤生长和转移、减少肿瘤数量、预防或延迟肿瘤发展或其一些组合。

如本文在预防病况的上下文中所用，术语“预防(prevent)”、“预防(preventing)”或“预防(prevention)”，通常是指预防或延迟疾病的发作，或预防其临床或亚临床症状在受试者(无论是人还是动物)中的出现，例如，预防疾病在易患该病况或疾病但尚未诊断出患有该病况或疾病的受试者中发生。

如本文所用，术语“治疗有效量”涉及活性化合物或包含活性化合物的材料、组合物或剂型的量，当根据期望的治疗方案施用时，其有效地产生与合理的益处/风险比相称的一些期望的治疗效果。具体地，“治疗有效量”，是指有效治疗人CD47/HER2相关疾病或病况的量或浓度的抗体。

如本文所用，本公开中的“宿主细胞”是指引入了外源多核苷酸的细胞。

如本文所用，术语“药学上可接受的”是指媒介物、稀释剂、赋形剂和/或其盐与制剂中的其他成分化学上和/或物理上相容，并且与接受者生理相容。

如本文所用，术语“药学上可接受的载剂和/或赋形剂”是指在药理学上和/或生理学上与受试者和活性剂相容的载剂和/或赋形剂，其是本领域公知的(参见，例如，Remington’s Pharmaceutical Sciences.Edited by Gennaro AR,19thed.Pennsylvania:Mack Publishing Company,1995)，并且包括但不限于pH调节剂、表面活性剂、佐剂和离子强度增强剂。例如，所述pH调节剂包括但不限于磷酸盐缓冲剂；表面活性剂包括但不限于阳离子、阴离子或非离子表面活性剂，例如Tween-80；离子强度增强剂包括但不限于氯化钠。

如本文所用，术语“佐剂”是指非特异性免疫增强剂，当其与抗原一起递送至生物体或预先递送至生物体时，其可以增强生物体中对抗原的免疫应答或改变免疫应答的类型。佐剂的种类有很多种，包括但不限于铝佐剂(例如氢氧化铝)、弗氏佐剂(例如弗氏完全佐剂和弗氏不完全佐剂)、小棒状杆菌、脂多糖、细胞因子等。弗氏佐剂是目前动物实验中最常用的佐剂。氢氧化铝佐剂在临床试验中应用较多。

双特异性多肽复合物

本文提供的双特异性多肽复合物包括双特异性抗体及其抗原结合部分。如本文所用，术语“多肽复合物”可以与“抗体”互换使用。在一些实施方案中，双特异性抗体及其抗原结合部分具有针对HER2(例如，人、食蟹猴和小鼠HER2)的第一特异性，和针对CD47(例如，人、食蟹猴和小鼠CD47)的第二特异性。此类抗体在本文中可称为例如“抗HER2/抗CD47”或“抗CD47/HER2”或“抗CD47xHER2”或“CD47xHER2”双特异性抗体或其他类似术语。

在一些实施方案中，本文的双特异性抗体包含特异性结合CD47的第一抗原结合部分(CD47结合部分)和特异性结合HER2的第二抗原结合部分(HER2结合部分)。考虑到组装抗体的稳定性、表达水平、结合能力和其他功能，第一和第二抗原结合部分可以是Fab、scFv或VHH形式等。例如，HER2结合部分是Fab、scFv或VHH形式，CD47结合部分是Fab形式；或者，CD47结合部分是Fab、scFv或VHH形式，并且HER2结合部分是Fab形式。在一些实施方案中，HER2结合部分和CD47结合部分均为Fab形式，形成双特异性抗体的两个臂。

在一些实施方案中，本文公开的双特异性抗体包含多于一种特异性结合CD47的抗原结合部分和/或多于一种特异性结合HER2的抗原结合部分。通常，对于双特异性抗体，所述多于一个抗原结合部分具有相同的可变区(从而靶向相同的抗原/表位)，或者在可变区和恒定区(如果存在)中完全相同。例如，抗体可包含两个相同的CD47结合部分和一个HER2结合部分，或一个CD47结合部分和两个相同的HER2结合部分，或两个相同的CD47结合部分和两个相同的HER2结合部分。另外，当存在两个CD47结合部分或两个HER2结合部分时，优选地，两个CD47结合部分和/或两个HER2结合部分不在同一链上。

在一些具体实施方案中，CD47结合部分为Fab形式，其包含可操作地连接至抗体重链CH1结构域的第一VH和可操作地连接至抗体轻链恒定(CL)结构域的第一VL，并且HER2结合部分也为Fab形式，但包含可操作地连接至第一T细胞受体(TCR)恒定区(C1)的第二重链可变结构域(VH)和可操作地连接至第二TCR恒定区(C2)的第二轻链可变结构域(VL)。换句话说，在第二抗原结合部分中，通常采用的CH1结构域和CL结构域被一对TCR恒定区替换。C1和C2的位置可以互换。

或者，CD47结合部分可以包含可操作地连接至第一T细胞受体(TCR)恒定区(C1)的第一重链可变结构域(VH)和可操作地连接至第二TCR恒定区(C2)的第一轻链可变结构域(VL)，其中C1和C2的位置可以互换，而HER2结合部分可以包含可操作地连接至抗体重链CH1结构域的第二VH和可操作地连接至抗体轻链恒定(CL)结构域的第二VL。

引入TCR恒定区来替换常用的CH1和CL结构域已显示可以增加所生成的抗体形式的稳定性和表达水平。TCR恒定区在将两个亲本抗体组装成具有所期望化合价和功能性的双特异性分子中的用途的详细描述已经公开于WO2019/057122中，其全部内容通过引用并入本文。TCR恒定区(Cbeta/CAlpha)的替换产生了嵌合Fab，其具有与常规抗体Fab正交的独特轻-重链界面。不同形式的嵌合Fab和常规Fab的组装可以产生具有不同结构和化合价的各种双特异性分子。

第一TCR恒定区和第二TCR恒定区经由非天然链间二硫键缔合。抗原结合部分中的一对TCR恒定区包括分别在轻链和重链中的TCR alpha和beta恒定区(野生型或优选工程化的)。双特异性抗体中的TCR恒定区能够通过非天然二硫键彼此缔合形成二聚体。

TCR，即T细胞受体，是异二聚体T细胞表面蛋白，属于免疫球蛋白超家族，类似于具有单重链和单轻链的半抗体。天然TCR具有细胞外部分、跨膜部分和细胞内部分。TCR的胞外结构域具有膜近端恒定区和膜远端可变区。

野生型人TCR beta和alpha链恒定区的序列可以在NCBI登录号A0A5B9(www.uniprot.org/uniprot/A0A5B9)和NCBI登录号P01848(www.uniprot.org/uniprot/ P01848)中找到。用于构建本文双特异性抗体的一对TCR恒定区衍生自野生型TCR恒定区，具有一个或多个氨基酸的一个或多个取代、添加或缺失。

如本申请所示，双特异性抗体包含工程化的TCR beta链恒定区，其序列如SEQ IDNO:17所示；和工程化的TCR alpha链恒定区，其序列如SEQ ID NO:18所示。

应当理解，TCR恒定区的变体不限于上述序列，只要它们能够稳定VH和VL区以形成抗原结合部分即可。用于构建WuXiBody抗体形式的多个C1和C2变体已在PCT/CN2021/072601中公开，其全部内容通过引用并入本文。

在一些实施方案中，TCR beta链恒定区替换CH1结构域并且TCR alpha链恒定区替换CL结构域。或者，它们可以与轻链中的TCR beta链恒定区和重链中的TCR alpha链恒定区互换。

用TCR恒定区替换CH1和CL结构域带来的好处是显著的。在双特异性抗体中，包含具有至少一个非天然二硫键的抗原结合部分的C1和C2可以重组表达并组装成所期望的构象，这稳定了TCR恒定区二聚体，同时提供了抗体可变区的良好抗原结合活性。此外，发现包含抗原结合部分的C1和C2能够很好地耐受常规抗体工程化，例如糖基化位点的修饰和一些天然序列的去除。此外，由于抗原结合部分中TCR恒定区的存在，这种形式的双特异性抗体可以容易地表达和组装，并且抗原结合序列的错配最小或基本上没有错配。

在一些具体实施方案中，本文公开的双特异性抗体在每个臂中包含一个HER2结合部分和一个CD47结合部分，即每个抗体包含两个HER2结合部分和两个CD47结合部分。Fc区可以位于抗体的C端，可操作地连接至Fc区N端的CD47结合部分或HER2结合部分。或者，Fc区可以位于CD47结合部分和HER2结合部分之间。此类双特异性抗体可以构建为具有两条相同重链的同二聚体。

根据一些示例性实施方案，本文的双特异性多肽复合物包含两条重链和四条轻链，其中从N端到C端：

(a)第一和第二重链各自包含如VH1-C1-VH2-CH1-铰链-Fc(VH1-C1来自HER2结合部分，VH2-CH1来自CD47结合部分)中的可操作地连接的结构域；两条轻链包含如VL1-C2(VL1-C2来自HER2结合部分)中的可操作地连接的结构域；并且其他两条轻链包含如VL2-CL(VL2-CL来自CD47结合部分)中的可操作地连接的结构域；

(b)第一和第二重链各自包含如VH2-CH1-VH1-C1-铰链-Fc(VH1-C1来自HER2结合部分，VH2-CH1来自CD47结合部分)中的可操作地连接的结构域；两条轻链包含如VL1-C2(VL1-C2来自HER2结合部分)中的可操作地连接的结构域；并且其他两条轻链包含如VL2-CL(VL2-CL来自CD47结合部分)中的可操作地连接的结构域；

(c)第一和第二重链各自包含如VH1-C1-铰链-Fc-VH2-CH1(VH1-C1来自HER2结合部分，VH2-CH1来自CD47结合部分)中的可操作地连接的结构域；两条轻链包含如VL1-C2(VL1-C2来自HER2结合部分)中的可操作地连接的结构域；并且其他两条轻链包含如VL2-CL(VL2-CL来自CD47结合部分)中的可操作地连接的结构域；

(d)第一和第二重链各自包含如VH2-CH1-铰链-Fc-VH1-C1(VH1-C1来自HER2结合部分，VH2-CH1来自CD47结合部分)中的可操作地连接的结构域；两条轻链包含如VL1-C2(VL1-C2来自HER2结合部分)中的可操作地连接的结构域；并且其他两条轻链包含如VL2-CL(VL2-CL来自CD47结合部分)中的可操作地连接的结构域；

(e)第一和第二重链各自包含如VH1-CH1-VH2-C1-铰链-Fc(VH1-CH1来自HER2结合部分，VH2-C1来自CD47结合部分)中的可操作地连接的结构域；两条轻链各自包含如VL1-CL(VL1-CL来自HER2结合部分)中的可操作地连接的结构域；并且其他两条轻链各自包含如VL2-C2(VL2-C2来自CD47结合部分)中的可操作地连接的结构域；

(f)第一和第二重链各自包含如VH2-C1-VH1-CH1-铰链-Fc(VH1-CH1来自HER2结合部分，VH2-C1来自CD47结合部分)中的可操作地连接的结构域；两条轻链各自包含如VL1-CL(VL1-CL来自HER2结合部分)中的可操作地连接的结构域；并且其他两条轻链各自包含如VL2-C2(VL2-C2来自CD47结合部分)中的可操作地连接的结构域；

(g)第一和第二重链各自包含如VH1-CH1-铰链-Fc-VH2-C1(VH1-CH1来自HER2结合部分，VH2-C1来自CD47结合部分)中的可操作地连接的结构域；两条轻链各自包含如VL1-CL(VL1-CL来自HER2结合部分)中的可操作地连接的结构域；并且其他两条轻链各自包含如VL2-C2(VL2-C2来自CD47结合部分)中的可操作地连接的结构域；或

(h)第一和第二重链各自包含如VH2-C1-铰链-Fc-VH1-CH1(VH1-CH1来自HER2结合部分，VH2-C1来自CD47结合部分)中的可操作地连接的结构域；两条轻链各自包含如VL1-CL(VL1-CL来自HER2结合部分)中的可操作地连接的结构域；并且其他两条轻链各自包含如VL2-C2(VL2-C2来自CD47结合部分)中的可操作地连接的结构域。

在一些具体的实施方案中，本文公开的双特异性抗体包含每个抗体一个HER2结合部分和两个CD47结合部分，或每个抗体两个HER2结合部分和一个CD47结合部分。

根据一些示例性实施方案，本文的双特异性多肽复合物包含两条重链和三条轻链，其中从N端到C端：

(a)第一重链包含如VH1-C1-VH2-CH1-铰链-Fc中的可操作地连接的结构域，第二重链包含如VH2-CH1-铰链-Fc中的可操作地连接的结构域；第一轻链包含如VL1-C2中的可操作地连接的结构域，并且第二和第三轻链包含如VL2-CL中的可操作地连接的结构域；

(b)第一重链包含如VH2-CH1-铰链-Fc-VH1-C1中的可操作地连接的结构域，第二重链包含如VH2-CH1-铰链-Fc中的可操作地连接的结构域；第一轻链包含如VL1-C2中的可操作地连接的结构域，并且第二和第三轻链包含如VL2-CL中的可操作地连接的结构域；

(c)第一重链包含如VH2-CH1-VH1-C1-铰链-Fc中的可操作地连接的结构域，第二重链包含如VH1-C1-铰链-Fc中的可操作地连接的结构域；第一和第二轻链各自包含如VL1-C2中的可操作地连接的结构域，并且第三轻链包含如VL2-CL中的可操作地连接的结构域；

(d)第一重链包含如VH1-C1-铰链-Fc-VH2-CH1中的可操作地连接的结构域，第二重链包含如VH1-C1-铰链-Fc中的可操作地连接的结构域；第一和第二轻链各自包含如VL1-C2中的可操作地连接的结构域，并且第三轻链包含如VL2-CL中的可操作地连接的结构域；

(e)第一重链包含如VH1-CH1-VH2-C1-铰链-Fc中的可操作地连接的结构域，第二重链包含如VH2-C1-铰链-Fc中的可操作地连接的结构域；第一轻链包含如VL1-CL中的可操作地连接的结构域，并且第二和第三轻链包含如VL2-C2中的可操作地连接的结构域；

(f)第一重链包含如VH2-C1-铰链-Fc-VH1-CH1中的可操作地连接的结构域，第二重链包含如VH2-C1-铰链-Fc中的可操作地连接的结构域；第一轻链包含如VL1-CL中的可操作地连接的结构域，并且第二和第三轻链包含如VL2-C2中的可操作地连接的结构域；

(g)第一重链包含如VH2-C1-VH1-CH1-铰链-Fc中的可操作地连接的结构域，第二重链包含如VH1-CH1-铰链-Fc中的可操作地连接的结构域，第一和第二轻链各自包含如VL1-CL中的可操作地连接的结构域，并且第三轻链包含如VL2-C2中的可操作地连接的结构域；或者

(h)第一重链包含如VH1-CH1-铰链-Fc-VH2-C1中的可操作地连接的结构域，第二重链包含如VH1-CH1-铰链-Fc中的可操作地连接的结构域，第一和第二轻链各自包含如VL1-CL中的可操作地连接的结构域，并且第三轻链包含如VL2-C2中的可操作地连接的结构域。

在一些具体的实施方案中，本文公开的双特异性抗体在一个臂中包含一个HER2结合部分和在另一个臂中包含一个CD47结合部分。图1所示的是包含以下结构(E17)的双特异性抗体：从N端到C端，在第一条重链中，VH1-C1-铰链-Fc；在第二重链中，VH2-CH1-铰链-Fc；在第一条轻链中，VL1-C2；以及在第二条轻链中，VL2-CL。VH1和VL1分别指形成HER2结合位点的第一VH和VL，并且VH2和VL2分别指形成CD47结合位点的第二VH和VL。“-”表示可操作地连接，通常经由包含肽键的接头或具有约1-30个氨基酸的肽接头。肽接头可以是一系列(G4S)n，其中n＝1-5。

取决于双特异性形式和/或编号便利性，本文公开的编号序列，例如第一或第二，可以不同。例如，第一VH可以被编号为第二VH，第一VL可以被编号为第二VL。作为另一个实例，取决于偏好和/或便利性，第二抗原结合部分可以被编号为第一抗原结合部分，第一抗原结合部分可以被编号为第二抗原结合部分。

双特异性多肽复合物的CDR和可变区

在一些实施方案中，双特异性多肽复合物或其抗原结合部分包含特异性结合HER2(优选人HER2)的第一抗原结合部分和特异性结合CD47(优选人CD47)的第二抗原结合部分，其中第一和第二抗原结合部分分别衍生自抗CD47抗体和抗HER2抗体。亲本抗体可能已经开发并为公众所知，或者从头开发。“衍生自”在本文中通常表示抗原结合部分包含亲本抗体的CDR序列或高度同源的CDR序列，优选地，包含亲本抗体的可变区。抗原结合部分还可以包含保留抗原结合特异性的亲本抗体的CDR序列的变体。例如，与亲本抗体的原始CDR序列相比，可以修饰一个或多个CDR区中的一个或两个氨基酸以降低糖基化和脱酰胺风险。

具体地，在本文示例的双特异性抗体中，HER2结合部分包含：

A)一个或多个选自由以下组成的组的重链CDR(HCDR)：

(i)HCDR1，其包含SEQ ID NO:1的氨基酸序列或与SEQ ID NO:1相比添加、缺失和/或取代不超过1、2或3个氨基酸的氨基酸序列；

(ii)HCDR2，其包含SEQ ID NO:2的氨基酸序列或与SEQ ID NO:2相比添加、缺失和/或取代不超过1、2或3个氨基酸的氨基酸序列；和

(iii)HCDR3，其包含SEQ ID NO:3的氨基酸序列或与SEQ ID NO:3相比添加、缺失和/或替换不超过1、2或3个氨基酸的氨基酸序列；

B)一个或多个选自由以下组成的组的轻链CDR(LCDR)：

(i)LCDR1，其包含SEQ ID NO:4的氨基酸序列或与SEQ ID NO:4相比添加、缺失和/或取代不超过1、2或3个氨基酸的氨基酸序列；

(ii)LCDR2，其包含SEQ ID NO:5的氨基酸序列或与SEQ ID NO:5相比添加、缺失和/或取代不超过1、2或3个氨基酸的氨基酸序列；和

(iii)LCDR3，其包含SEQ ID NO:6的氨基酸序列或与SEQ ID NO:6相比添加、缺失和/或取代不超过1、2或3个氨基酸的氨基酸序列；或者

C)A)的一个或多个HCDR和B)的一个或多个LCDR；和

CD47结合部分包含：

A’)一个或多个选自由以下组成的组的HCDR：

(i)HCDR1，其包含SEQ ID NO:7的氨基酸序列或与SEQ ID NO:7相比添加、缺失和/或取代不超过1、2或3个氨基酸的氨基酸序列；

(ii)HCDR2，其包含SEQ ID NO:8的氨基酸序列或与SEQ ID NO:8相比添加、缺失和/或取代不超过1、2或3个氨基酸的氨基酸序列；和

(iii)HCDR3，其包含SEQ ID NO:9的氨基酸序列或与SEQ ID NO:9相比添加、缺失和/或取代不超过1、2或3个氨基酸的氨基酸序列；

B’)一个或多个选自由以下组成的组的LCDR：

(i)LCDR1，其包含SEQ ID NO:10的氨基酸序列或与SEQ ID NO:10相比添加、缺失和/或取代不超过1、2或3个氨基酸的氨基酸序列；

(ii)LCDR2，其包含SEQ ID NO:11的氨基酸序列或与SEQ ID NO:11相比添加、缺失和/或取代不超过1、2或3个氨基酸的氨基酸序列；和

(iii)LCDR3，其包含SEQ ID NO:12的氨基酸序列或与SEQ ID NO:12相比添加、缺失和/或取代不超过1、2或3个氨基酸的氨基酸序列；或者

C’)A’)的一个或多个HCDR以及B’)的一个或多个LCDR。

抗体序列中的可变区和CDR可根据本领域已开发的一般规则或通过将序列与已知可变区的数据库比对来鉴定。CDR描述于Kabat et al.,J.Biol.Chem.252:6609-6616(1977)；Kabat et al.,U.S.Dept.of Health and Human Services,“Sequences ofproteins of immunological interest”(1991)；描述于Chothia et al.,J.Mol.Biol.196:901-917(1987)；和MacCallum et al.,J.Mol.Biol.262:732-745(1996)，其中当相互比较时，定义包括氨基酸残基的重叠或子集。然而，应用任何定义来指代本文所公开的抗体的CDR都旨在落入本申请的范围内。下表2所示的CDR由Kabat和IMGT编号系统定义。然而，Chothia、MacCallum和本领域已知的其他方法也可用于定义CDR。用于鉴定这些区域的方法描述于例如Kontermann and Dubel,eds.,Antibody Engineering,Springer,NewYork,NY,2001和Dinarello et al.,Current Protocols in Immunology,John Wiley andSons Inc.,Hoboken,NJ,2000。抗体序列的示例性数据库描述于以下并且可以通过以下来评估：“Abysis”网站www.bioinf.org.uk/abs(由英国伦敦伦敦大学学院生物化学和分子生物学系的A.C.Martin维护)，以及VBASE2网站www.vbase2.org，如Retteret al.,Nucl.Acids Res.,33(Database issue):D671-D674(2005)所描述的。优选地，使用Abysis数据库来分析序列，该数据库整合了来自Kabat、IMGT和蛋白质数据库(PDB)的序列数据与来自PDB的结构数据。参见Andrew C.R.Martin博士的抗体工程实验室手册(AntibodyEngineering Lab Manual)书中抗体可变结构域的蛋白质序列和结构分析(ProteinSequence and Structure Analysis of Antibody Variable Domains)章节(Ed.:Duebel,S.and Kontermann,R.,Springer-Verlag,Heidelberg,ISBN-13:978-3540413547，也可在网站bioinforg.uk/abs上获得)。Abysis数据库网站还包括已开发用于鉴定可根据本文的教导使用的CDR的一般规则。

在一些具体实施方案中，HER2结合部分包含重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)，其中

(a)VH包含：如SEQ ID NO:1所示的HCDR1；如SEQ ID NO:2所示的HCDR2；和如SEQID NO:3所示的HCDR3；并且

(b)VL包含：如SEQ ID NO:4所示的LCDR1；如SEQ ID NO:5所示的LCDR2；和如SEQID NO:6所示的LCDR3。

在一些具体实施方案中，CD47结合部分包含重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)，其中

(a)VH包含：如SEQ ID NO:7所示的HCDR1；如SEQ ID NO:8所示的HCDR2；和如SEQID NO:9所示的HCDR3；并且

(b)VL包含：如SEQ ID NO:10所示的LCDR1；如SEQ ID NO:11所示的LCDR2；和如SEQID NO:12所示的LCDR3。

在一些实施方案中，双特异性抗体或其抗原结合部分包含特异性结合HER2的第一抗原结合部分，其中第一抗原结合部分包含：

(A)重链可变区：

(i)包含SEQ ID NO:13的氨基酸序列；

(ii)包含与SEQ ID NO:13至少85％、90％或95％相同(优选地，至少90％，更优选地，至少95％(例如，95％、96％、97％、98％或99％))的氨基酸序列；或

(iii)包含与SEQ ID NO:13相比具有一个或多个(例如，一个、两个、三个或更多个，优选一个、两个或三个，更优选一个或两个)氨基酸的添加、缺失和/或取代的氨基酸序列；和/或

(B)轻链可变区：

(i)包含SEQ ID NO:14的氨基酸序列；

(ii)包含与SEQ ID NO:14至少85％、至少90％或至少95％相同(优选地，至少90％，更优选地，至少95％(例如，95％、96％、97％、98％或99％))的氨基酸序列；或

(iii)包含与SEQ ID NO:14相比具有一个或多个(例如，一个、两个、三个或更多个，优选一个、两个或三个，更优选一个或两个)氨基酸的添加、缺失和/或取代的氨基酸序列。

在一些进一步的实施方案中，双特异性抗体或其抗原结合部分包含特异性结合CD47的第二抗原结合部分，其中第二抗原结合部分包含：

(A)重链可变区：

(i)包含SEQ ID NO:15的氨基酸序列；

(ii)包含与SEQ ID NO:15至少85％、90％或95％相同(优选地，至少90％，更优选地，至少95％(例如，95％、96％、97％、98％或99％))的氨基酸序列；或

(iii)包含与SEQ ID NO:15相比具有一个或多个(例如，一个、两个、三个或更多个，优选一个、两个或三个，更优选一个或两个)氨基酸的添加、缺失和/或取代的氨基酸序列；和/或

(B)轻链可变区：

(i)包含SEQ ID NO:16的氨基酸序列；

(ii)包含与SEQ ID NO:16至少85％、至少90％或至少95％相同(优选地，至少90％，更优选地，至少95％(例如，95％、96％、97％、98％或99％))的氨基酸序列；或

(iii)包含与SEQ ID NO:16相比具有一个或多个(例如，一个、两个、三个或更多个，优选一个、两个或三个，更优选一个或两个)氨基酸的添加、缺失和/或取代的氨基酸序列。

两个氨基酸序列之间的同一性百分比可以使用E.Meyers和W.Miller(Comput.Appl.Biosci.，4:11-17(1988))的算法确定，该算法已经并入ALIGN程序(2.0版)中，使用PAM120重量残基表，空位长度罚分12和空位罚分4。另外，两个氨基酸序列之间的同一性百分比可以通过Needleman和Wunsch(J.Mol.Biol.48：444-453(1970))的算法来确定，该算法已并入GCG软件包(可在http://www.gcg.com获得)中的GAP程序中，使用Blossum 62矩阵或PAM250矩阵，空位权重为16、14、12、10、8、6或4并且长度权重为1、2、3、4、5或6。

另外地或替代性地，本公开的蛋白质序列还可用作“查询序列”以针对公共数据库进行搜索以例如鉴定相关序列。这种搜索可以使用Altschul,et al.(1990)J.MoI.Biol.215:403-10的XBLAST程序(2.0版)进行。可以使用XBLAST程序进行BLAST蛋白质搜索，得分＝50，字长＝3以获得与本公开的抗体分子同源的氨基酸序列。为了获得用于比较目的的空位比对，可以使用空位BLAST，如Altschul et al,(1997)Nucleic AcidsRes.25(17):3389-3402中所描述。当利用BLAST和空位BLAST程序时，可以使用相应程序的默认参数(例如XBLAST和NBLAST)。参见www.ncbi.nlm.nih.gov。

在一些具体实施方案中，HER2结合部分的重链可变区由SEQ ID NO:13的氨基酸序列组成，HER2结合部分的轻链可变区由SEQ ID NO:14的氨基酸序列组成，和/或CD47结合部分的重链可变区由SEQ ID NO:15的氨基酸序列组成，CD47结合部分的轻链可变区由SEQ IDNO:16的氨基酸序列组成。

在其他实施方案中，重链可变区和/或轻链可变区的氨基酸序列可以与上述相应序列至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％，优选至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％，更优选至少95％、96％、97％、98％或99％相同。

在一些进一步的实施方案中，双特异性抗体或其抗原结合部分可以含有重链和/或轻链可变区中氨基酸的保守取代或修饰。本领域应当理解，可以进行某些不会消除抗原结合的保守序列修饰。参见，例如Brummell et al.(1993)Biochem 32:1180-8；de Wildtet al.(1997)Prot.Eng.10:835-41；Komissarov et al.(1997)J.Biol.Chem.272:26864-26870；Hall et al.(1992)J.Immunol.149:1605-12；Kelley and O’Connell(1993)Biochem.32:6862-35；Adib-Conquy et al.(1998)Int.Immunol.10:341-6和Beers et al.(2000)Clin.Can.Res.6:2835-43。

如上所述，本文所用的术语“保守取代”是指不会不利地影响或改变包含氨基酸序列的蛋白质/多肽的基本性质的氨基酸取代。例如，可以通过本领域已知的标准技术引入保守取代，例如定点诱变和PCR介导的诱变。保守氨基酸取代包括其中一个氨基酸残基被具有相似侧链的另一个氨基酸残基取代的取代，例如，在物理上或功能上与相应氨基酸残基相似(例如，具有相似的大小、形状、电荷、化学性质包括形成共价键或氢键的能力等)的残基。具有相似侧链的氨基酸残基家族已在本领域中定义。这些家族包括具有碱性侧链的氨基酸(例如赖氨酸、精氨酸和组氨酸)、具有酸性侧链的氨基酸(例如天冬氨酸和谷氨酸)、具有不带电荷的极性侧链的氨基酸(例如甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、半胱氨酸、色氨酸)、具有非极性侧链的氨基酸(例如丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸)、具有β-支链侧链的氨基酸(例如苏氨酸、缬氨酸、异亮氨酸)和具有芳族侧链的氨基酸(例如酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、组氨酸)。因此，相应的氨基酸残基优选被来自相同侧链家族的另一个氨基酸残基取代。鉴定氨基酸保守取代的方法是本领域熟知的(参见例如Brummell et al.,Biochem.32:1180-1187(1993)；Kobayashi et al.,Protein Eng.12(10):879-884(1999)；和Burks et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 94:412-417(1997)，其通过引用并入本文)。

双特异性多肽复合物的抗原结合

优选地，本公开的双特异性多肽复合物能够结合人HER2和CD47。抗体与HER2和CD47的结合可以使用本领域中公认的一种或多种技术来评估，例如ELISA或FACS，其分别测量抗体与可溶性HER2/CD47蛋白或在细胞表面上表达的HER2/CD47蛋白的结合。例如，可以通过流式细胞术测定来测试抗体，其中抗体与表达人HER2或人CD47的细胞系反应，例如已转染以在其细胞表面表达HER2或CD47的CHO细胞，或HER2或CD47阳性细胞系，或HER2和CD47双阳性细胞系。

另外地或替代性地，可以在BIAcore结合测定中测试抗体的结合，包括结合动力学(例如，K_D值)。例如，本公开的抗体以1×10^-9M或更小的K_D结合人HER2蛋白；以8×10^-10M或更小的K_D结合人HER2蛋白；以6×10^-10M或更小的K_D结合人HER2蛋白；以4×10^-10M或更小的K_D结合人HER2蛋白；以2×10^-10M或更小的K_D结合人HER2蛋白；或以1.5×10^-10M或更小的K_D结合人HER2蛋白，如通过表面等离子共振测量的。

BsAb的功能

本文公开的双特异性抗体的特征在于特定的功能特征或特性。在一些实施方案中，抗体具有以下特性中的一种或多种：

(a)与对照抗体相比，以高亲和力特异性结合HER2，并以相对较低的亲和力特异性结合CD47；

(b)与靶细胞结合，不受抗原沉没效应(例如，人血细胞或Jurkat细胞)的影响；

(c)与红细胞(RBC)的结合可忽略不计，避免诱导人RBC的血凝和吞噬作用；

(d)与对照抗体相比，与Jurkat细胞的结合大大降低(例如，降低～200倍)；

(e)有效阻断CD47/HER2双阳性细胞上的CD47与SIRPα的结合，而不受抗原沉没效应(例如，人血细胞或Jurkat细胞的)影响；

(f)对CD47单阳性细胞几乎没有CD47配体阻断作用；

(g)在CD47/HER2双阳性细胞上具有比对照抗体显著更高的CD47占有率；

(h)与抗CD47和抗HER2单一疗法的组合相比，对CD47/HER2双阳性细胞具有显著增加的ADCP功效，而对人血细胞几乎不显示ADCP功效；

(i)对CD47/HER2双阳性细胞具有有效的ADCC功效，而对Jurkat细胞显示出较弱的ADCC功效；

(j)对CD47/HER2双阳性细胞增殖具有有效的抑制作用；

(k)显著抑制HER2阳性癌症模型中的肿瘤细胞生长；和

(l)与对照抗体具有更好或相当的啮齿动物药代动力学。

在一些实施方案中，对照抗体是单克隆抗体。在一些实施方案中，对照抗体是抗CD47抗体。在一些实施方案中，对照抗体是单克隆抗CD47抗体，例如莫洛利单抗。在一些实施方案中，对照抗体是抗HER2抗体。在一些实施方案中，对照抗体是单克隆抗HER2抗体，例如曲妥珠单抗或帕尼单抗。

在一些实施方案中，本文公开的双特异性多肽复合物与单特异性抗HER2抗体或其他抗HER2/CD47双特异性抗体相比对HER2具有更高的结合亲和力。在一些实施方案中，本文公开的双特异性多肽复合物具有比单特异性抗HER2抗体或其他抗HER2/CD47双特异性抗体高至少10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或100％的对HER2的结合亲和力，如K_D中所测量的。

在一些实施方案中，本文公开的双特异性多肽复合物与单特异性抗CD47抗体或其他抗HER2/CD47双特异性抗体相比对CD47具有较低的结合亲和力。在一些实施方案中，本文公开的双特异性多肽复合物具有比单特异性抗CD47抗体或其他抗HER2/CD47双特异性抗体低至少10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或100％的对CD47的结合亲和力，如K_D中所测量的。

在一些实施方案中，本文公开的双特异性多肽复合物与单特异性抗-HER2抗体相比对HER2具有更高的结合亲和力，和/或与单特异性抗-CD47抗体相比对CD47具有更低的结合亲和力。在一些实施方案中，本文公开的双特异性多肽复合物与曲妥珠单抗相比对HER2具有更高或相当的结合亲和力，并且与莫洛利单抗相比对CD47具有更低的结合亲和力。

在一些实施方案中，本文公开的双特异性多肽复合物与其他抗HER2/CD47双特异性抗体相比对HER2具有更高的结合亲和力，和/或与其他抗HER2/CD47双特异性抗体相比对CD47具有较低的结合亲和力。

不受抗原沉没效应影响

针对细胞膜相关抗原的抗体通常会经历靶标介导的清除，称为抗原沉没效应。已知CD47的广泛表达会由于抗原沉没效应而降低肿瘤处抗CD47mAb的生物利用度，并且还存在脱靶毒性的风险，最显著地来自显示CD47高表达的红细胞的交联。

CD47在正常组织上的表达可能会产生“抗原沉没”，其阻止抗CD47治疗抗体到达体内预期的肿瘤细胞靶标。如本文所证明的，可以规避该问题的一种策略是采用对CD47具有降低的亲和力的BsAb。这些BsAb保留了阻断CD47-SIRPα相互作用的能力，但需要与第二种肿瘤抗原结合以实现高亲和力结合。

本文公开的BsAb显示了靶向CD47和HER2可以将CD47-SIRPα阻断特异性引导至共表达HER2的细胞，并且BsAb表现出用单特异性抗CD47抗体或单特异性抗HER2抗体未观察到的治疗协同作用。本文对CD47(具有降低的亲和力)和HER2(具有高亲和力)特异的BsAb显示出可忽略不计的RBC抗原沉没，并且对CD47和HER2双阳性癌细胞表现出结合特异性和有效的功能作用。

阻断CD47与SIRPα的结合

CD47通常表达在正常健康细胞的表面，并迁移造血干细胞以阻止吞噬作用，并且在几乎所有血液肿瘤和实体瘤中上调，以规避免疫监视并逃避吞噬作用。破坏CD47和SIRPa之间的相互作用使吞噬细胞能够“吃掉”并摧毁癌细胞。CD47阻断使肿瘤相关巨噬细胞重新极化为促炎、抗肿瘤状态，并且吞噬细胞清除恶性细胞为新抗原呈递到适应性免疫系统提供了额外的途径。

信号调节蛋白alpha(SIRPα，也称为CD172a)是CD47的受体，主要表达于巨噬细胞表面。已知CD47与SIRPα相互作用，因此可以逃避免疫监视。本公开的抗体可以调节，例如阻断、抑制、减少、拮抗、中和或以其他方式干扰CD47与SIRPα的结合。通过使用本文所描述的抗体阻断CD47-SIRPα相互作用可以改善或克服免疫逃逸，从而产生潜在的临床益处。

如实施例中所证明的，本文描述的双特异性抗体可以有效阻断CD47配体与CD47/HER2双阳性细胞系的结合，即阻断CD47与SIRPα的相互作用，而在CD47单阳性细胞系(例如，Jurkat细胞)上不显示CD47配体阻断。此外，对CD47/HER2双阳性细胞系的阻断作用不受例如人血细胞或Jurkat细胞引起的抗原沉没效应的影响。

与人红细胞(RBC)的结合较弱，以避免血凝

CD47的普遍表达，尤其是在RBC上的表达，限制了抗CD47抗体疗法的使用。据报道，许多抗CD47抗体会引起人红细胞血凝。在临床前研究中，由于红细胞清除率升高，短暂性溶血性贫血与抗CD47疗法相关。

本公开的抗体显示出与人红细胞的可忽略不计的结合并且避免了血凝的不期望影响。与对照抗CD47抗体相比，本文的双特异性抗体还显示出对Jurkat细胞降低约200倍的结合。一致地，由本文的双特异性抗体诱导的针对人RBC的吞噬作用将比对照抗体温和得多。

ADCP或ADCC活性的介导

术语“抗体依赖性细胞吞噬作用”或“ADCP”是具有吞噬潜力的效应细胞(例如单核细胞和巨噬细胞)可以内化靶细胞的细胞过程。一旦被吞噬，靶细胞就驻留在吞噬体中，该吞噬体与溶酶体融合，经由氧依赖性或非依赖机制开始降解靶细胞。该功能依赖于调理作用，或用抗体鉴定靶细胞，然后抗体也充当靶细胞和吞噬细胞之间的桥梁。机制上，抗体通过其抗原识别结构域结合靶细胞上的同源抗原，然后用其Fc区将吞噬细胞募集到靶标上。一旦与吞噬细胞的Fc受体结合，靶细胞就会被吞噬并降解。这个过程还导致效应细胞产生可溶性因子，帮助起始和驱动免疫应答。

如本文所用，术语“抗体依赖性细胞介导的细胞毒性”或“ADCC”是指细胞毒性形式，其中分泌的Ig与存在于某些细胞毒性细胞(例如，自然杀伤(NK)细胞、中性粒细胞和巨噬细胞)上的Fc受体(FcR)结合，使得这些细胞毒性效应细胞能够特异性结合携带抗原的靶细胞并随后用细胞毒素杀伤靶细胞。抗体“武装”细胞毒性细胞并且是这种杀伤所绝对必要的。介导ADCC的主要细胞NK细胞仅表达FcγRIII，而单核细胞表达FcγRI、FcγRII和FcγRIII。造血细胞上的FcR表达总结在Ravetch and Kinet,Annu.Rev.Immunol 9:457-92(1991)的第464页的表3中。为了评估感兴趣分子的ADCC活性，可以进行体外ADCC测定，例如美国专利号5,500,362或5,821,337中描述的测定。用于此类测定的有用效应细胞包括外周血单核细胞(PBMC)和自然杀伤(NK)细胞。替代性地或另外地，可以在体内评估感兴趣分子的ADCC活性，例如在Clynes et al.PNAS(USA)95:652-656(1998)中公开的动物模型中。

如本文所公开的，ADCP可以是抗CD47治疗性抗体的作用机制。本文的双特异性抗体对CD47/HER2双阳性细胞显示出有效的ADCP功效。此外，本公开的这些抗体可以诱导针对CD47/HER2双阳性肿瘤细胞的有效ADCC活性。另一方面，BsAb对CD47单阳性细胞具有很小或非常弱的ADCP或ADCC功效，表明与HER2的结合对于本文中这些抗体的效应功能是必需的。

协同效应

本文公开的双特异性抗体组合了CD47和HER2双重结合活性，与单一疗法例如单独的曲妥珠单抗、帕尼单抗或莫洛利单抗相比，表现出协同效应。

本公开已经证明，在小鼠的HCC1954乳腺癌模型或NCI-N87异种移植模型中，与单独的抗HER2 mAb或抗CD47 mAb相比，施用本文公开的双特异性抗体实现了显著改善的肿瘤生长抑制。本文公开的双特异性抗体与另一种抗HER2 mAb的组合在相同剂量水平下进一步改善了抗肿瘤作用。

Fc区

本文公开的双特异性抗体的Fc区优选是人IgG Fc区。IgG Fc区可以是任何同种型，包括但不限于IgG1、IgG2、IgG3或IgG4。在某些实施方案中，Fc区是IgG1同种型。

在本公开的双特异性抗体的上下文中，与野生型Fc区相比，Fc区可包含一个或多个氨基酸改变(例如，插入、缺失或取代)。本公开涵盖双特异性抗原结合分子，其在Fc区中包含一或多个修饰以获得所期望的功能，例如促进异二聚化的“旋钮入孔”结构，或改变Fc与FcRn或FcγR之间的结合相互作用的修饰的Fc区。

如本文所用，术语“旋钮入孔”是指工程化抗体Fc区的CH3结构域以在每条重链中产生“旋钮”或“孔”以促进异二聚化。可以通过将第一CH2/CH3多肽中的小氨基酸残基替换为较大的氨基酸残基来获得旋钮，并且可以通过将大的残基替换为较小的氨基酸残基来获得孔。有关旋钮进入孔的突变位点的详细信息，请参见Spiess et al.,2015,同上和Brinkmann et al.,2017，同上；美国专利申请US2003078385A1。一般来说，根据Kabat等人的EU编号，“旋钮”是通过在一条重链上用大残基W替换T366来构建的，而相应的“孔”是由另一条重链上的T366S、L368A和Y407V的三重突变形成的。在一些实施方案中，“孔”突变是Y349C、T366S、L368A和/或Y407V，并且“旋钮”突变是S354C和/或T366W。在一些实施方案中，包含C1的双特异性抗体的重链具有“孔”结构，而包含C2的重链具有“旋钮”结构。或者，包含C1的双特异性抗体的重链具有“旋钮”结构，而包含C2的重链具有“孔”结构。

在某些实施方案中，双特异性抗体的第一重链包含含有S354C和T366W取代(旋钮)的Fc区，并且双特异性抗体的第二重链包含含有Y349C、T366S、L368A和Y407V取代(孔)的IgG1同种型的Fc区。在一些其他实施方案中，双特异性抗体的第一重链包含IgG4同种型的Fc区，其中Fc区包含S354C和T366W取代(旋钮)，并且双特异性抗体的第二重链包含IgG4同种型的Fc区，其中Fc区包含Y349C、T366S、L368A和Y407V取代(孔)。

另外，Fc区可包含改变抗体依赖性细胞毒性(ADCC)或其他效应功能的一种或多种氨基酸修饰(例如，Leu234Ala/Leu235Ala或LALA)。在某些实施方案中，Fc修饰包含LALA突变，即，L234A和L235A的突变(根据Kabat等人中的EU编号)。LALA突变可能是最常用于破坏抗体效应功能的突变，例如，消除Fc与特异性FcγR的结合，降低由PBMC和单核细胞介导的ADCC活性。此外，还发现通过在Fc区引入YTE(M252Y/S254T/T256E)和LS(M428L/N434S)可以增强治疗潜力，因而半衰期增加，保护持续时间延长。还发现S228P突变防止体内和体外IgG4 Fab臂交换，如使用新型定量免疫测定和生理基质制备的组合所证明的(J Biol Chem2015Feb 27；290(9)：5462-9)。

本文公开的双特异性抗体可以包含选自以下之一的Fc区：

(a)人IgG1 Fc区，其被工程化以包含“旋钮入孔”结构；

(b)人IgG4 Fc区，其被工程化以包含“旋钮入孔”结构和任选地S228P突变；和

(c)人IgG4 Fc区，其被工程化以包含S228P突变和任选地M252Y/S254T/T256E突变。

当指免疫球蛋白重链恒定区中的残基时，通常使用“EU编号系统”或“EU索引”(例如，Kabat等人报道的EU索引，同上)。“Kabat中的EU编号”或“Kabat中的EU索引”是指人IgG1EU抗体的残基编号。除非本文另有说明，否则提及抗体恒定结构域中的残基编号是指通过EU编号系统进行的残基编号。

编码BsAb的核酸分子

在一些方面，本公开涉及分离的核酸分子，其包含编码双特异性抗体或其抗原结合部分的一条或多条链的核酸序列。

本公开的核酸可以使用标准分子生物学技术获得。对于由杂交瘤(例如，如下文进一步描述的由携带人免疫球蛋白基因的转基因小鼠制备的杂交瘤)表达的抗体，编码由杂交瘤制备的抗体的轻链和重链的cDNA可以通过标准PCR扩增或cDNA克隆技术获得。对于从免疫球蛋白基因文库(例如，使用噬菌体展示技术)获得的抗体，可以从基因文库回收编码此类抗体的核酸。

通过将编码VH的核酸可操作地连接至编码重链恒定区(CH1、CH2和CH3或TCR beta恒定区)的另一个DNA分子，可以将编码VH区的分离的核酸转化为全长重链基因。人重链恒定区基因的序列是本领域已知的(参见例如Kabat等人(1991)，同上)，并且涵盖这些区域的DNA片段可以通过标准PCR扩增获得。重链恒定区可以是IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA、IgE、IgM或IgD恒定区，但更优选是IgG1或IgG4恒定区。

通过将编码VL的DNA可操作地连接至编码轻链恒定区CL或TCR alpha恒定区的另一个DNA分子，可以将编码VL区的分离的核酸转化为全长轻链基因(以及Fab轻链基因)。人轻链恒定区基因的序列是本领域已知的(参见例如Kabat等人，同上)，并且涵盖这些区域的DNA片段可以通过标准PCR扩增获得。在一些实施方案中，轻链恒定区可以是kappa或lambda恒定区。

一旦获得编码VH和VL区段的DNA片段，这些DNA片段可以通过标准重组DNA技术进一步操作，例如将可变区基因转化为全长抗体链基因、Fab片段基因或scFv基因。在这些操作中，编码VL或VH的DNA片段可操作地连接至编码另一种蛋白质的另一个DNA片段，例如抗体恒定区或柔性接头。如本文所用，术语“可操作地连接”旨在表示两个DNA片段被连接，使得由两个DNA片段编码的氨基酸序列保持在读框内。

在一些具体实施方案中，分离的核酸分子包含选自由以下组成的组的一种或多种核酸序列：

(A)编码CD47结合部分的重链序列或HER2结合部分的重链序列的核酸序列；

(B)编码与HER2结合部分的重链序列可操作地连接的CD47结合部分的重链序列的核酸序列；

(C)编码CD47结合部分的轻链序列的核酸序列；

(D)编码HER2结合部分的轻链序列的核酸序列；

(E)(A)-(D)的任何组合；和

(F)在高严格条件下与(A)-(E)的核酸序列的互补链杂交的核酸序列。

在一些具体实施方案中，分离的核酸分子包含编码SEQ ID NO:19的核酸序列。在一些具体实施方案中，分离的核酸分子包含编码SEQ ID NO:20的核酸序列。在一些具体实施方案中，分离的核酸分子包含编码SEQ ID NO:21的核酸序列。在一些具体实施方案中，分离的核酸分子包含编码SEQ ID NO:22的核酸序列。

示例性的高严格条件包括在45℃下在5X SSPE和45％甲酰胺中杂交，以及在65℃下在0.1X SSC中最终洗涤。，本领域应理解等同严格性的条件可通过改变温度和缓冲液或盐浓度来实现，如Ausubel,et al.(Eds.),Protocols in Molecular Biology,JohnWiley&Sons(1994),pp.6.0.3to 6.4.10所描述。杂交条件的修改可以根据经验确定或基于探针的鸟苷/胞嘧啶(GC)碱基配对的长度和百分比精确计算。杂交条件可以如Sambrook,etal,(Eds.),Molecular Cloning:A laboratory Manual.Cold Spring Harbor LaboratoryPress:Cold Spring Harbor,New York(1989),pp.9.47to 9.51中所描述计算。

载体和宿主细胞

可以使用本领域已知的重组技术将编码双特异性多肽复合物的核酸分子插入载体中以用于进一步克隆(DNA的扩增)或用于表达。在一些实施方案中，抗体可以通过本领域已知的同源重组产生。编码单克隆抗体的DNA使用常规程序(例如，通过使用能够特异性结合编码抗体重链的基因的寡核苷酸探针)容易地分离和测序。许多载体是可用的。载体组分通常包括但不限于以下中的一种或多种：信号序列、复制起点、一种或多种标志物基因、增强子元件、启动子(例如SV40、CMV、EF-1α)和转录终止序列。选择性标志物基因有助于选择载体已导入其中的宿主细胞(参见例如美国专利号4,399,216；4,634,665和5,179,017)。例如，典型地，选择标志物基因赋予已导入载体的宿主细胞对药物如G418、潮霉素或甲氨蝶呤的抗性。选择性标志物基因可以包括二氢叶酸还原酶(DHFR)基因(用于具有甲氨蝶呤选择/扩增的dhfr-宿主细胞)和neo基因(用于G418选择)。

在一些实施方案中，载体系统包括哺乳动物、细菌、酵母系统等，并且包含质粒，例如但不限于pALTER、pBAD、pcDNA、pCal、pL、pET、pGEMEX、pGEX、pCI、pCMV、pEGFP、pEGFT、pSV2、pFUSE、pVITRO、pVIVO、pMAL、pMONO、pSELECT、pUNO、pDUO、Psg5L、pBABE、pWPXL、pBI、p15TV-L、pPro18、pTD、pRS420、pLexA、pACT2.2等以及其他实验室和市售的载体。合适的载体可以包括质粒或病毒载体(例如，复制缺陷型逆转录病毒、腺病毒和腺相关病毒)。在本发明的一个实施方案中，载体可以是pET，例如含有六组氨酸标签和c-Myc标签基因的pETbac。

可将包含编码双特异性多肽复合物的核酸序列的载体导入宿主细胞用于克隆或基因表达。因此，本公开还涉及产生本公开的双特异性多肽复合物的重组真核或原核宿主细胞，例如转染瘤。

用于克隆或表达本文载体中的DNA的合适宿主细胞是原核细胞、酵母或高等真核细胞，例如哺乳动物细胞。用于表达本公开的抗体的哺乳动物宿主细胞包括中国仓鼠卵巢(CHO细胞)(包括dhfr CHO细胞，其描述于Urlaub and Chasin,(1980)Proc.Natl.Acad.ScLUSA 77:4216-4220，与DHFR选择性标志物一起使用，例如，如R.J.Kaufman and P.A.Sharp(1982)J.MoI.Biol.159:601-621中所描述)、COS细胞和SP2细胞。具体地，对于与NSO骨髓瘤细胞一起使用，另一种表达系统是WO 87/04462、WO 89/01036和EP 338,841中公开的GS基因表达系统。还包括由SV40(COS-7，ATCC CRL 1651)转化的猴肾CV1系；人胚胎肾系(293或亚克隆用于悬浮培养生长的293细胞，Graham et al.,J.Gen Virol.36:59(1977))；小仓鼠肾细胞(BHK，ATCC CCL 10)；中国仓鼠卵巢细胞/-DHFR(CHO，Urlaub et al.,1980,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 77:4216)；小鼠支持细胞(TM4，Mather，1980，Biol.Reprod.23：243-251)；猴肾细胞(CV1 ATCC CCL 70)；非洲绿猴肾细胞(VERO-76，ATCC CRL-1587)；人宫颈癌细胞(HELA，ATCC CCL2)；犬肾细胞(MDCK，ATCC CCL 34)；水牛大鼠肝细胞(BRL 3A，ATCC CRL 1442)；人肺细胞(W138，ATCC CCL 75)；人肝细胞(Hep G2，HB 8065)；小鼠乳腺肿瘤(MMT 060562，ATCC CCL51)；TRI细胞(Mather et al.,1982,Annals N.Y.Acad.Sci.383:44-68)；MRC 5细胞；FS4细胞；小鼠骨髓瘤细胞，如NSO(例如RCB0213，1992，Bio/Technology10:16 9)和SP2/0细胞(例如SP2/0-Ag14细胞，ATCC CRL 1581)；大鼠骨髓瘤细胞，如YB2/0细胞(例如YB2/3HL.P2.G11.16 AG.20细胞，ATCC CRL 1662)；PER.C 6细胞；和人肝癌细胞系(Hep G2)。CHO细胞是可用于本文的细胞系之一，其中CHO-K1、DUK-B11、CHO-DP12、CHO-DG44(Somatic Cell and Molecular Genetics 12:555(1986))和Lec13是示例性宿主细胞系。在CHO-K1、DUK-B11、DG44或CHO-DP12宿主细胞的情况下，这些可以被改变，使得它们缺乏岩藻糖基化其中表达的蛋白质的能力。

用于此目的的合适的原核生物包括真细菌，例如革兰氏阴性或革兰氏阳性生物体，例如，肠杆菌科(Enterobacteriaceae)如埃希氏菌属(Escherichia)，例如大肠杆菌(E.coli)、肠杆菌属(Enterobacter)、欧文氏菌属(Erwinia)、克雷伯氏菌属(Klebsiella)、变形杆菌属(Proteus)、沙门氏菌属(Salmonella)例如鼠伤寒沙门氏菌(Salmonellatyphimurium)、沙雷氏菌属(Serratia)例如粘质沙雷氏菌(Serratia marcescans)和志贺氏菌属(Shigella)，以及杆菌(Bacilli)例如枯草芽孢杆菌(B.subtilis)和地衣芽孢杆菌(B.licheniformis)、假单胞菌属(Pseudomonas)如铜绿假单胞菌(P.aeruginosa)和链霉菌属(Streptomyces)。

除了原核生物之外，真核微生物如丝状真菌或酵母也是双特异性抗体编码载体的合适克隆或表达宿主。酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)或普通面包酵母是低等真核宿主微生物中最常用的。然而，许多其他属、种和菌株通常可获得并可用于本文，例如粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomyces pombe)；克鲁维酵母属(Kluyveromyces)宿主，例如乳酸克鲁维酵母(K.lactis)、脆弱克鲁维酵母(K.fragilis)(ATCC 12,424)、保加利亚克鲁维酵母(K.bulgaricus)(ATCC 16,045)、威氏克鲁维酵母(K.Wickeramii)(ATCC 24,178)、沃尔蒂克鲁维酵母(K.waltii)(ATCC 56,500)、果蝇克鲁维酵母(K.drosophilarum)(ATCC 36,906)、耐热克鲁维酵母(K.thermotolerans)和马克斯克鲁维酵母(K.marxianus)；亚罗酵母属(yarrowia)(EP 402,226)；巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)(EP 183,070)；念珠菌属(Candida)；雷氏木霉(Trichoderma reesia)(EP 244,234)；粗糙脉孢菌(Neurosporacrassa)；许旺酵母属(Schwanniomyces)如西方许旺酵母(Schwanniomycesoccidentalis)；和丝状真菌，例如脉孢菌属(Neurospora)、青霉属(Penicillium)、弯颈霉属(Tolypocladium)和曲霉属(Aspergillus)宿主，例如构巢曲霉(A.nidulans)和黑曲霉(A.niger)。

用于表达本文提供的双特异性多肽复合物的其他合适的宿主细胞衍生自多细胞生物体。无脊椎动物细胞的例子包括植物和昆虫细胞。已经从来自宿主如草地夜蛾(Spodopterafrugiperda)(毛虫)、埃及伊蚊(Aedes aegypti)(蚊子)、白纹伊蚊(Aedesalbopictus)(蚊子)、黑腹果蝇(Drosophila melanogaster)(果蝇)和家蚕(Bombyxmori)鉴定了许多杆状病毒株和变体以及相应的许可的昆虫宿主细胞。用于转染的多种病毒株是公开可获得的，例如，苜蓿银纹夜蛾(Autographacalifornica)NPV的L-1变种和家蚕NPV的Bm-5株，并且这样的病毒可以用作根据本公开的病毒，特别是用于草地夜蛾(Spodopterafrugiperda)细胞的转染。棉花、玉米、马铃薯、大豆、矮牵牛(petunia)、番茄和烟草的植物细胞培养物也可用作宿主。

用上述表达或克隆载体转化宿主细胞以产生抗体，并在适当修饰以诱导启动子、选择转化体或扩增编码期望序列的基因的常规营养培养基中培养。

用于产生本文提供的双特异性多肽复合物的宿主细胞可以在多种培养基中培养。市售培养基如Ham’s F10(Sigma)、最小必需培养基(MEM)(Sigma)、RPMI-1640(Sigma)和Dulbecco’s改良Eagle’s培养基(DMEM)(Sigma)适合于培养宿主细胞。此外，描述于以下的任一培养基可用作宿主细胞的培养基：Ham et al.,Meth.Enz.58:44(1979)、Barnes etal.,Anal.Biochem.102:255(1980)、美国专利号4,767,704；4,657,866；4,927,762；4,560,655；或5,122,469；WO 90/03430；WO 87/00195；或美国专利Re.30,985。任何这些培养基都可以根据需要补充激素和/或其他生长因子(如胰岛素、转铁蛋白或表皮生长因子)、盐(如氯化钠、钙、镁和磷酸盐)、缓冲液(如HEPES)、核苷酸(如腺苷和胸苷)、抗生素(如GENTAMYCINTM药物)、微量元素(定义为通常以微摩尔范围内的终浓度存在的无机化合物)和葡萄糖或等效能量源。还可以包括本领域技术人员已知的适当浓度的任何其他必要的补充剂。培养条件，例如温度、pH等，是先前与选择用于表达的宿主细胞一起使用的那些，并且对于普通技术人员来说是显而易见的。

当使用重组技术时，抗体可以在细胞内、周质空间中产生，或直接分泌到培养基中。如果抗体在细胞内产生，作为第一步，去除颗粒碎片(宿主细胞或裂解片段)，例如通过离心或超滤。Carter et al.,Bio/Technology 10:163-167(1992)描述了分离分泌到大肠杆菌周质空间的抗体的方法。简而言之，在乙酸钠(pH 3.5)、EDTA和苯甲基磺酰氟(PMSF)存在下将细胞糊解冻约30min。细胞碎片可以通过离心去除。当抗体分泌到培养基中时，通常首先使用市售蛋白质浓缩过滤器(例如Amicon或Millipore Pellicon超滤单元)浓缩来自此类表达系统的上清液。蛋白酶抑制剂例如PMSF可以被包括在任何前述步骤中以抑制蛋白水解，并且可以包括抗生素以防止外来污染物的生长。

从细胞制备的抗体可以使用例如羟基磷灰石层析、凝胶电泳、透析、DEAE-纤维素离子交换层析、硫酸铵沉淀、盐析和亲和层析来纯化，其中亲和层析是优选的纯化技术。

在任何初步纯化步骤之后，可以使用pH在约2.5-4.5之间的洗脱缓冲液使包含感兴趣的抗体和污染物的混合物经历低pH疏水相互作用层析，优选地在低盐浓度(例如，来自约0-0.25M盐)下进行。

药物组合物

在一些方面，本公开涉及药物组合物，其包含本文公开的双特异性多肽复合物和药学上可接受的载剂。

组合物的组分

药物组合物可以任选地含有一种或多种额外的药物活性成分，例如另一种抗体或药物。本公开的药物组合物还可以与例如另一种免疫刺激剂、抗癌剂、抗病毒剂或疫苗以组合疗法施用，使得双特异性多肽复合物增强针对疫苗的免疫应答。药学上可接受的载剂可包括例如药学上可接受的液体、凝胶或固体载剂、水性介质、非水性介质、抗微生物剂、等渗剂、缓冲剂、抗氧化剂、麻醉剂、悬浮剂/分散剂、螯合剂、稀释剂、佐剂、赋形剂或无毒辅助物质、其他本领域已知的各种组分组合或更多。

合适的组分可包括例如抗氧化剂、填充剂、粘合剂、崩解剂、缓冲剂、防腐剂、润滑剂、调味剂、增稠剂、着色剂、乳化剂或稳定剂例如糖和环糊精。合适的抗氧化剂可包括例如甲硫氨酸、抗坏血酸、EDTA、硫代硫酸钠、铂、过氧化氢酶、柠檬酸、半胱氨酸、巯基甘油、巯基乙酸、巯基山梨糖醇、丁基甲基苯甲醚、丁基化羟基甲苯和/或丙基半乳酸酯。如本文所公开，含有抗体的组合物包含一种或多种抗氧化剂例如甲硫氨酸，以减少抗体的氧化。氧化还原可以防止或减少结合亲和力的降低，从而增强抗体稳定性并延长保质期。因此，在一些实施方案中，本公开提供了包含一种或多种抗体和一种或多种抗氧化剂例如甲硫氨酸的组合物。本发明还提供了多种方法，其中将抗体与一种或多种抗氧化剂例如甲硫氨酸混合，从而可以防止其抗体被氧化，以延长其保质期和/或增加活性。

为了进一步说明，药学上可接受的载剂可以包括，例如，水性媒介物，例如氯化钠注射液、林格氏注射液、等渗右旋糖注射液、无菌水注射液、或右旋糖和乳酸林格氏注射液，非水性媒介物，例如植物来源的固定油、棉籽油、玉米油、芝麻油或花生油，抑细菌或抑真菌浓度的抗菌剂，等渗剂如氯化钠或右旋糖，缓冲剂如磷酸盐或柠檬酸盐缓冲剂，抗氧化剂如硫酸氢钠，局部麻醉剂如盐酸普鲁卡因，悬浮剂和分散剂如羧甲基纤维素钠、羟丙基甲基纤维素或聚乙烯吡咯烷酮，乳化剂如聚山梨醇酯80(吐温-80)，螯合剂如EDTA(乙二胺四乙酸)或EGTA(乙二醇四乙酸)，乙醇、聚乙二醇、丙二醇、氢氧化钠、盐酸、柠檬酸或乳酸。用作载剂的抗微生物剂可以添加到多剂量容器中的药物组合物中，所述容器包括苯酚或甲酚、汞剂、苯甲醇、氯丁醇、对羟基苯甲酸甲酯和丙酯、硫柳汞、苯扎氯铵和苄索氯铵。合适的赋形剂可包括例如水、盐水、右旋糖、甘油或乙醇。合适的无毒辅助物质可包括例如润湿剂或乳化剂、pH缓冲剂、稳定剂、溶解增强剂或例如乙酸钠、脱水山梨糖醇单月桂酸酯、三乙醇胺油酸酯或环糊精的药剂。

施用、剂型和剂量

本公开的药物组合物可以通过多种途径体内施用至有需要的受试者，包括但不限于口服、静脉内、动脉内、皮下、肠胃外、鼻内、肌内、颅内、心内、心室内、气管内、口腔、直肠、腹膜内、皮内、外部、透皮和鞘内，或以其他方式通过植入或吸入。本主题的组合物可以配制成固体、半固体、液体或气体形式的制剂；包括但不限于片剂、胶囊剂、粉剂、颗粒剂、软膏剂、溶液剂、栓剂、灌肠剂、注射剂、吸入剂和气雾剂。可以根据预期的应用和治疗方案选择适当的制剂和施用途径。

用于肠内施用的合适制剂包括硬或软明胶胶囊、丸剂、片剂(包括包衣片剂)、酏剂、混悬剂、糖浆剂或吸入剂及其控释形式。

适于肠胃外施用(例如，通过注射)的制剂包括水性或非水性、等渗、无热原、无菌液体(例如，溶液、悬浮液)，其中活性成分溶解、悬浮或以其他方式提供(例如，在脂质体或其他微粒中)。此类液体可另外含有其它药学上可接受的成分，如抗氧化剂、缓冲剂、防腐剂、稳定剂、抑菌剂、悬浮剂、增稠剂和使制剂与预期接受者的血液(或其它相关体液)等渗的溶质。赋形剂的实例包括例如水、醇、多元醇、甘油、植物油等。用于此类制剂的合适等渗载剂的实例包括氯化钠注射液、林格氏溶液或乳酸林格氏注射液。类似地，特定给药方案，即剂量、时间和重复，将取决于特定个体和该个体的病史，以及经验考虑因素，例如药代动力学(例如，半衰期、清除率等)。

施用频率可以在治疗过程中确定和调整，并且基于减少增殖性或致瘤性细胞的数量、维持此类肿瘤细胞的减少、减少肿瘤性细胞的增殖或延迟转移的发展。在一些实施方案中，可以调整或减弱施用的剂量以控制潜在的副作用和/或毒性。替代性地，主题治疗组合物的持续连续释放制剂可能是合适的。

本领域技术人员应当理解，合适的剂量可以因患者而异。确定最佳剂量通常涉及治疗益处水平与任何风险或有害副作用的平衡。所选择的剂量水平将取决于多种因素，包括但不限于特定化合物的活性、施用途径、施用时间、化合物的排泄速率、治疗持续时间、组合使用的其他药物、化合物和/或材料、病况的严重程度以及患者的物种、性别、年龄、体重、病症、一般健康状况和既往病史。化合物的量和施用途径最终将由医师、兽医或临床医生自行决定，但一般来说，剂量的选择将在作用部位达到局部浓度，从而达到期望效果，且不会造成实质性的有害或有毒副作用。

一般来说，双特异性多肽复合物可以以各种范围施用。在一些实施方案中，本文提供的双特异性多肽复合物可以以约0.01mg/kg至约100mg/kg(例如，约0.01mg/kg、约0.5mg/kg、约1mg/kg、约2mg/kg、约5mg/kg、约10mg/kg、约15mg/kg、约20mg/kg、约25mg/kg、约30mg/kg、约35mg/kg、约40mg/kg、约45mg/kg、约50mg/kg、约55mg/kg、约60mg/kg、约65mg/kg、约70mg/kg、约75mg/kg、约80mg/kg、约85mg/kg、约90mg/kg、约95mg/kg或约100mg/kg)的治疗有效剂量施用。在这些实施方案的某些中，抗体以约50mg/kg或更低的剂量施用，并且在这些实施方案的某些中，剂量为10mg/kg或更低、5mg/kg或更低、1mg/kg或更低、0.5mg/kg或更低、或0.1mg/kg或更低。在某些实施方案中，施用剂量可以在治疗过程中改变。例如，在某些实施方案中，初始施用剂量可以高于后续施用剂量。在某些实施方案中，施用剂量可以在治疗过程中根据受试者的反应而变化。

在任何情况下，优选地根据需要将本公开的抗体施用给有需要的受试者。施用频率可以由本领域技术人员确定，例如主治医师基于所治疗的病况、所治疗的受试者的年龄、所治疗病况的严重程度、所治疗的受试者的总体健康状态等的考虑来进行。

在某些优选的实施方案中，涉及本公开的抗体的治疗过程将包括在数周或数月的时间内多剂量的所选药物产品。更具体地，本公开的抗体可以每天、每两天、每四天、每周、每十天、每两周、每三周、每月、每六周、每两个月、每十周或每三个月施用一次。在这方面，应当理解，可以基于患者反应和临床实践来改变剂量或调整间隔。

还可以根据经验确定已给予一次或多次施用的个体中所公开的治疗组合物的剂量和方案。例如，可以向个体给予递增剂量的如本文所述产生的治疗组合物。在选定的实施方案中，剂量可以分别基于经验确定或观察到的副作用或毒性而逐渐增加或减少或减弱。为了评估所选组合物的功效，可以如前所描述追踪特定疾病、病症或病况的标志物。对于癌症，包括经由触诊或目视观察直接测量肿瘤大小，通过X射线或其他成像技术间接测量肿瘤大小；通过直接肿瘤活检和肿瘤样品显微镜检查评估改善；测量根据本文所描述的方法鉴定的间接肿瘤标志物(例如前列腺癌的PSA)或致瘤抗原、疼痛或麻痹的减轻；言语、视力、呼吸或其他与肿瘤相关的残疾的改善；食欲增加；或通过公认的测试衡量的生活质量的提高或生存期的延长。对于本领域技术人员显而易见的是，剂量将根据个体、肿瘤病况的类型、肿瘤病况的阶段、肿瘤病况是否已经开始转移到个体中的其他位置、以及过去和同时使用的治疗而变化。

用于肠胃外施用(例如，静脉内注射或输注)的相容制剂可以包含浓度为约10μg/ml至约100mg/ml的本文提供的双特异性多肽复合物。在一些实施方案中，双特异性抗原结合分子的浓度可包括20μg/ml、40μg/ml、60μg/ml、80μg/ml、100μg/ml、200μg/ml、300μg/ml、400μg/ml、500μg/ml、600μg/ml、700μg/ml、800μg/ml、900μg/ml或1mg/ml。在其他优选的实施方案中，双特异性抗原结合分子的浓度包括2mg/ml、3mg/ml、4mg/ml、5mg/ml、6mg/ml、8mg/ml、10mg/ml、12mg/ml、14mg/ml、16mg/ml、18mg/ml、20mg/ml、25mg/ml、30mg/ml、35mg/ml、40mg/ml、45mg/ml、50mg/ml、60mg/ml、70mg/ml、80mg/ml、90mg/ml或100mg/ml。

应用/适应症

本公开的双特异性多肽复合物具有多种体外和体内用途。例如，这些分子可以在体外或离体施用至培养物中的细胞，或例如在体内施用至人类受试者，以在各种情况下增强免疫力。免疫应答可以被增强、刺激或上调。

优选的受试者包括需要增强免疫应答的人类患者。该方法特别适合于治疗患有可通过增强免疫应答(例如，T细胞介导的免疫应答、肿瘤细胞的吞噬作用)来治疗的病症的人类患者。该方法特别适合于体内癌症的治疗。为了实现免疫力的抗原特异性增强，双特异性抗体可以与感兴趣的抗原一起施用，或者抗原可以已经存在于待治疗的受试者中(例如，携带肿瘤或携带病毒的受试者)。当双特异性抗体与另一种药剂一起施用时，两者可以按任一顺序或同时施用。

治疗包括癌症在内的病症

在一些方面，本公开提供了治疗受试者中的病症的方法，其包括向需要治疗的受试者(例如，人)施用治疗有效量的本文公开的抗体或其抗原结合部分。例如，该病症是癌症。

涉及CD47和/或HER2的多种癌症，无论是恶性的还是良性的以及无论是原发性的还是继发性的，都可以用本公开提供的方法来治疗或预防。癌症可以是实体癌或血液恶性肿瘤。此类癌症的实例包括肺癌如支气管源性癌(例如，鳞状细胞癌、小细胞癌、大细胞癌和腺癌)、肺泡细胞癌、支气管腺瘤、软骨瘤性错构瘤(非癌性)和肉瘤(癌性)；心脏癌如粘液瘤、纤维瘤和横纹肌瘤；骨癌如骨软骨瘤、软骨瘤、软骨母细胞瘤、软骨粘液样纤维瘤、骨样骨瘤、巨细胞瘤、软骨肉瘤、多发性骨髓瘤、骨肉瘤、纤维肉瘤、恶性纤维组织细胞瘤、尤文氏肿瘤(尤文氏肉瘤)和网状细胞肉瘤；脑癌如神经胶质瘤(例如，多形性胶质母细胞瘤)、间变性星形细胞瘤、星形细胞瘤、少突胶质细胞瘤、髓母细胞瘤、脊索瘤、神经鞘瘤、室管膜瘤、脑膜瘤、垂体腺瘤、松果体瘤、骨瘤、成血管细胞瘤、颅咽管瘤、脊索瘤、生殖细胞瘤、畸胎瘤、皮样囊肿和血管瘤；消化系统癌症如结肠癌、平滑肌瘤、表皮样癌、腺癌、平滑肌肉瘤、胃腺癌、肠脂肪瘤、肠神经纤维瘤、肠纤维瘤、大肠息肉和结肠直肠癌；肝癌如肝细胞腺瘤、血管瘤、肝细胞癌、纤维板层癌、胆管癌、肝母细胞瘤和血管肉瘤；肾癌如肾腺癌、肾细胞癌、肾上腺样瘤和肾盂移行细胞癌；膀胱癌；皮肤癌如基底细胞癌、鳞状细胞癌、黑色素瘤、卡波西肉瘤和佩吉特病；头颈癌；眼相关癌症如视网膜母细胞瘤和眼内黑素癌；男性生殖系统癌症如良性前列腺增生、前列腺癌和睾丸癌(例如精原细胞瘤、畸胎瘤、胚胎癌和绒毛膜癌)；乳腺癌；女性生殖系统癌症如子宫癌(子宫内膜癌)、宫颈癌症(宫颈癌)、卵巢癌症(卵巢癌)、外阴癌、阴道癌、输卵管癌和葡萄胎；甲状腺癌(包括乳头状、滤泡状、间变性或髓样癌)；嗜铬细胞瘤(肾上腺)；甲状旁腺的非癌性生长；胰腺癌。在一些具体实施方案中，癌症是皮肤癌(如皮肤鳞状细胞癌)、结肠癌、结肠直肠癌(如结肠直肠腺癌)、肺癌(如肺腺癌)或乳腺癌(如三阴性乳腺腺癌)。

在一些其他实施方案中，该病症是自身免疫性疾病。可用该抗体或其抗原结合部分治疗的自身免疫性疾病的实例包括自身免疫性脑脊髓炎、红斑狼疮和类风湿性关节炎。该抗体或其抗原结合部分还可用于治疗或预防感染性疾病、炎性疾病(例如过敏性哮喘)和慢性移植物抗宿主病。

与化疗联合使用

抗体可以与抗癌剂、细胞毒性剂、或化疗剂组合使用。

术语“抗癌剂”或“抗增殖剂”表示可用于治疗细胞增殖性病症如癌症的任何药剂，并且包括但不限于细胞毒性剂、细胞生长抑制剂、抗血管生成剂、减瘤剂、化学治疗剂、放射治疗和放射治疗剂、靶向抗癌剂、BRM、治疗性抗体、癌症疫苗、细胞因子、激素疗法、放射治疗和抗转移剂以及免疫治疗剂。应当理解，在如上所述的选定实施方案中，此类抗癌剂可以包含缀合物并且可以在施用之前与所公开的位点特异性抗体缔合。更具体地，在一些实施方案中，选择的抗癌剂将连接至工程化抗体的未配对的半胱氨酸，以提供如本文所述的工程化缀合物。因此，此类工程化缀合物明确预期在本公开的范围内。在其他实施方案中，所公开的抗癌剂将与包含如上所述的不同治疗剂的位点特异性缀合物组合给予。

如本文所用的术语“细胞毒性剂”是指对细胞有毒并降低或抑制细胞功能和/或引起细胞破坏的物质。在一些实施方案中，该物质是衍生自活生物体的天然存在的分子。细胞毒性剂的例子包括但不限于以下的小分子毒素或酶活性毒素：细菌的(例如，白喉毒素、假单胞菌内毒素和外毒素、葡萄球菌肠毒素A)、真菌的(例如，α-八叠球菌素(α-sarcin)、局限曲菌素(restrictocin))、植物的(例如，相思豆毒素(abrin)、蓖麻毒素、蒴果毒素、槲寄生素、商陆抗病毒蛋白、皂草素、白树毒素、苦瓜素、天花粉蛋白、大麦毒素、油桐蛋白、石竹素蛋白、美洲商陆蛋白(PAPI、PAPII和PAP-S)、苦瓜抑制剂、麻疯树毒素、巴豆毒素、肥皂草抑制剂、白树毒素、米特格林毒素、局限曲菌素、酚霉素、新霉素和单端孢菌素)或动物的(例如，细胞毒性RNA酶，例如细胞外胰腺RNA酶；DNA酶I，包括其片段和/或变体)。

出于本公开的目的，“化疗剂”包括非特异性减少或抑制癌细胞的生长、增殖和/或存活的化学化合物(例如，细胞毒性剂或细胞抑制剂)。此类化学药剂通常针对细胞生长或分裂所必需的细胞内过程，因此对通常快速生长和分裂的癌细胞特别有效。例如，长春新碱解聚微管，从而抑制细胞进入有丝分裂。一般而言，化疗剂可包括抑制或设计用于抑制癌细胞或可能癌变或产生致瘤子代(例如TIC)的细胞的任何化学药剂。此类药剂通常联合施用，并且联合通常是最有效的，例如在诸如CHOP或FOLFIRI的方案中。

可以与本公开的位点特异性构建体组合使用的抗癌剂的实例(作为位点特异性缀合物的组分或处于未缀合状态)包括但不限于烷基化剂、烷基磺酸盐、氮杂环丙烷、乙烯亚胺和甲基蜜胺、多聚乙酰、喜树碱、苔藓抑素、callystatin、CC-1065、隐藻素、尾海兔素、倍癌霉素、五加素(eleutherobin)、水鬼蕉碱(pancratistatin)、匍枝珊瑚醇(sarcodictyin)、海绵抑素、氮芥、抗生素、烯二炔抗生素、dynemicin、双膦酸盐、埃斯佩拉霉素、色蛋白烯二炔抗生素生色团、阿克拉霉素、放线菌素、安曲霉素、重氮丝氨酸、博来霉素、放线菌素、carabicin、洋红霉素、嗜癌素(carzinophilin)、色霉素、更生霉素、柔红霉素、地托比星、6-重氮-5-氧代-L-正亮氨酸、多柔比星、表柔比星、依索比星、伊达比星、马塞洛霉素、丝裂霉素、霉酚酸、诺加霉素、橄榄霉素、培洛霉素、泊非霉素、嘌呤霉素、三铁阿霉素、罗多比星、链黑菌素、链脲菌素、杀结核菌素、乌苯美司、净司他丁、佐柔比星；抗代谢物，厄洛替尼、维莫非尼、克唑替尼、索拉非尼、依鲁替尼、恩杂鲁胺、叶酸类似物、嘌呤类似物、雄激素、抗肾上腺素、叶酸补充剂(例如frolinic酸、乙酰葡醛酯、醛磷酰胺糖苷、氨基乙酰丙酸、恩尿嘧啶、安吖啶、阿莫司汀、比生群、edatraxate、defofamine、秋水仙胺、亚丝醌、elfornithine、依利醋铵、埃博霉素、依托格鲁、硝酸镓、羟基脲、香菇多糖、lonidainine、美登木素生物碱、米托胍腙、米托蒽醌、莫哌达醇、二胺硝吖啶、喷司他丁、蛋氨氮芥、吡柔比星、洛索蒽醌、鬼臼酸、2-乙基酰肼、甲基苄肼、多糖复合物(JHSNatural Products，Eugene，OR)、雷佐生；根霉素；西佐呋喃；spirogermaniun；细交链孢菌酮酸；三亚胺醌；2,2’,2"-三氯乙胺；单端孢霉烯类(尤其是T-2毒素、verracurin A、杆孢菌素A和蛇形菌素)；尿烷；长春地辛；达卡巴嗪；甘露莫司汀；二溴甘露醇；二溴卫矛醇；哌泊溴烷；gacytosine；阿糖胞苷“(Ara-C”)；环磷酰胺；硫特普；紫杉醇类、苯丁酸氮芥；吉西他滨；6-硫鸟嘌呤；巯基嘌呤；甲氨蝶呤；铂类似物、长春花碱；铂；依托泊苷(VP-16)；异环磷酰胺；米托蒽醌；长春新碱；长春瑞滨；米托蒽醌；替尼泊苷；依达曲沙；柔红霉素；氨基蝶呤；希罗达；伊班膦酸盐；伊立替康(伊立替康，CPT-11)、拓扑异构酶抑制剂RFS2000；difluorometlhylornithine；维甲酸；卡培他滨；康普瑞汀；亚叶酸；奥沙利铂；减少细胞增殖的PKC-alpha、Raf、H-Ras、HER2和VEGF-A抑制剂以及上述任何一种的药学上可接受的盐、酸或衍生物。该定义还包括用于调节或抑制激素对肿瘤的作用的抗激素剂，例如抗雌激素和选择性雌激素受体调节剂、抑制调节肾上腺中雌激素的产生的芳香酶的芳香酶抑制剂、和抗雄激素；以及曲沙他滨(1,3-二氧戊环核苷胞嘧啶类似物)；反义寡核苷酸、核酶如VEGF表达抑制剂和HER2表达抑制剂；疫苗，rIL-2；拓扑异构酶1抑制剂；rmRH；长春瑞滨(Vinorelbine)和埃斯佩拉霉素(Esperamicins)以及上述任何一种的药学上可接受的盐、酸或衍生物。

与放射治疗联合使用

本公开还提供了抗体与放射疗法的组合(即，用于在肿瘤细胞内局部诱导DNA损伤的任何机制，例如gamma-辐射、X-射线、UV-辐射、微波、电子发射等)。还考虑了使用放射性同位素定向递送至肿瘤细胞的组合疗法，并且所公开的缀合物可以与靶向抗癌剂或其他靶向手段结合使用。通常，放射疗法在约1至约2周的时间段内以脉冲形式施用。可以对患有头颈癌的受试者施用放射疗法持续约6至7周。任选地，放射治疗可以作为单剂量或作为多个连续剂量施用。

药物包装和试剂盒

还提供了包含一个或多个容器的药物包装和试剂盒，其包含一个或多个剂量的抗体。在一些实施方案中，提供单位剂量，其中单位剂量含有预定量的组合物，所述组合物包含例如抗体，具有或不具有一种或多种额外的药剂。对于其他实施方案，这样的单位剂量在用于注射的一次性预填充注射器中供应。在又一些实施方案中，单位剂量中所含的组合物可以包含盐水、蔗糖等；缓冲剂如磷酸盐等；和/或在稳定且有效的pH范围内配制。替代性地，在一些实施方案中，缀合物组合物可以冻干粉末的形式提供，其可以在添加适当的液体(例如无菌水或盐水溶液)时重构。在某些优选的实施方案中，组合物包含一种或多种抑制蛋白质聚集的物质，包括但不限于蔗糖和精氨酸。容器上或与容器相关的任何标签表明封闭的缀合物组合物用于治疗所选的肿瘤疾病病况。

本公开还提供了用于产生位点特异性缀合物和任选的一种或多种抗癌剂的单剂量或多剂量施用单位的试剂盒。该试剂盒包括容器和与容器相关的或插入到容器上的标签或包装。合适的容器包括例如瓶子、小瓶、注射器等。容器可以由多种材料例如玻璃或塑料形成，并且含有药学有效量的缀合或非缀合形式的所公开的缀合物。在其他优选实施方案中，容器包括无菌进入端口(例如容器可以是静脉内溶液袋或具有可被皮下注射针刺穿的塞子的小瓶)。此类试剂盒通常将在合适的容器中包含工程化缀合物的药学上可接受的制剂，以及任选地在相同或不同容器中的一种或多种抗癌剂。试剂盒还可以含有其他药学上可接受的制剂，用于诊断或联合治疗。例如，除了抗体之外，这样的试剂盒可以包含一系列抗癌剂中的任何一种或多种，例如化疗或放疗药物；抗血管生成剂；抗转移剂；靶向抗癌剂；细胞毒剂；和/或其他抗癌剂。

更具体地，试剂盒可以具有包含所公开的抗体、具有或不具有额外的组分的单个容器，或者它们可以具有用于每种期望药剂的不同容器。当提供组合治疗剂用于缀合时，单一溶液可以以摩尔当量组合或以一种组分多于另一种组分预混合。替代性地，在施用至患者之前，试剂盒的缀合物和任何任选的抗癌剂可以独自保存在不同的容器内。试剂盒还可以包括第二/第三容器装置，用于容纳无菌的药学上可接受的缓冲剂或其他稀释剂，例如抑菌注射用水(BWFI)、磷酸盐缓冲盐水(PBS)、林格氏溶液和右旋糖溶液。

当试剂盒的组分以一种或多种液体溶液形式提供时，液体溶液优选是水溶液，特别优选无菌水溶液或盐溶液。然而，试剂盒的组分可以以干粉提供。当试剂或组分以干粉提供时，粉末可通过添加合适的溶剂来重构。可以设想，溶剂也可以在另一个容器中提供。

如上文简要指出的，试剂盒还可以包含向患者施用抗体和任何任选组分的装置，例如一个或多个针、I.V.袋子或注射器，或者甚至是滴管、移液器或其他类似装置，制剂可以从其注射或引入动物或应用到身体的患病区域。本公开的试剂盒通常还将包括用于容纳小瓶等的装置，以及用于商业销售的严格限制的其他部件，例如，将期望的小瓶和其他设备放置和保持在其中的注射或吹塑塑料容器。

序列表总结

本申请所附的是包含许多氨基酸序列的序列表。下表A提供了所包含序列的总结。

表A

实施例

通过参考以下实施例将更容易地理解如此一般性描述的本公开，这些实施例以说明的方式提供，并不旨在限制本公开。实施例并不旨在表示以下实验是所进行的全部或仅有的实验。

实施例1

材料准备

表1提供了实施例中使用的商业可获得材料的信息。

表1：商业材料

实施例2

W308032双特异性抗体的生成

为了生成BsAb，将衍生自抗CD47抗体的CD47结合部分(CD47:T6)和源自抗-HER2抗体的HER2结合部分(HER2:U5)组合并用于构建双特异性抗体。

双特异性抗体采用E17形式构建(图1)。CAlpha和CBeta基因由Genewiz Inc.合成。轻链1是插入到含有CAlpha的线性化载体中的HER2:U5的VL序列，以及轻链2是插入到含有λ轻链恒定区的线性化载体中的CD47:T6的VL序列。重链1是插入到含有具有S354C-T366W突变的人IgG1恒定区CH2-CH3的线性化载体中的VH(HER2:U5)-CBeta DNA片段，以及重链2是插入到含有具有Y349C-T366S-L368A-Y407V突变的人IgG1恒定区CH1-CH2-CH3的线性化载体中的VH(CD47:T6)DNA片段。所有序列都被克隆到修饰的pcDNA3.4表达载体中。

根据制造商的说明，使用Expi293表达系统试剂盒将重链和轻链表达质粒共转染到Expi293细胞中。转染五天后，收集表达靶蛋白的Expi293细胞的上清液并使用Protein A柱过滤纯化。收集来自蛋白A洗脱的级分，并将pH调节至5.0，以使用CEX柱进行IEX纯化。在上样之前和之后，用50mM NaAc(pH5.0)平衡CEX柱。收集的峰级分使用50mM NaAc、500mMNaCl pH5.0以线性步骤通过UA检测，然后在PBS缓冲液中透析。通过280nm处的吸光度测定纯化蛋白质的浓度。分别通过SDS-PAGE和SEC-HPLC测试纯化蛋白的大小和纯度。

获得的抗体被命名为W308032-U5T6.E17-57.uIgG1(或缩写为“W308032-U5T6.E17”)。

表2：W308032-U5T6.E17抗体的CDR序列

实施例3

W308032抗体的体外表征

3.1蛋白质分析

通过SDS-PAGE和尺寸排阻色谱(SEC-HPLC)评估W308032抗体的大小和纯度。图2和图3以及表3显示了纯化后W308032-U5T6.E17-57.uIgG1的SDS-PAGE和SEC-HPLC表征。图2显示在非还原条件下约150kDa，以及在还原条件下约50kDa、25kDa的表观分子量。结果表明双特异性分子可以按预期组装。

表3：纯化总结

3.2差示扫描荧光法(DSF)

使用7500快速实时PCR系统(Applied Biosystems)通过DSF测定研究抗体的熔解温度(Tm)。简而言之，将19μL抗体溶液与1μL 62.5x SYPRO Orange溶液(TheromFisher-S6650)混合并添加到96孔板中。将板以2℃/min的速率从26℃加热至95℃，并收集所得荧光数据。数据收集和Tm计算由操作软件(实时PCR软件v1.3)自动执行。

DSF结果显示Tm1达到63.1℃，Tm2达到70.1℃，表明W308032-U5T6.E17-57.uIgG1具有良好的热稳定性(图4)。

表4：DSF表征的总结

抗体名称	Tm1(℃)	Tm2(℃)	评价
				W308032-U5T6.E17-57.uIgG1	63.1	70.1	良好

3.3通过动态光散射(DLS)测量扩散相互作用参数(kD)

kD测量使用DynaPro Plate Reader III(Wyatt DynaproTM)进行研究。kD参数是DLS测定中获得的一阶扩散相互作用参数，作为分子胶体稳定性和热稳定性的指标。样品首先用0.02μm过滤器过滤，并浓缩至超过20mg/mL。用PBS缓冲液将样品稀释至最终浓度为2.5、5、10、15和20mg/mL。然后将7.5μL样品溶液添加到1536孔微孔板中。将板用ClearSealFilm密封，并以3,000rpm离心5min，使样品沉至孔底。每个样品均在两个孔中进行测试。将板放入相应位置并通过DYNAMICS操作软件(v7.8.1.3)进行数据收集。对于每个蛋白质样品收集5次采集，而每次采集时间为5s。对于每次测量，确定扩散系数并相对于蛋白质浓度作图。kD值由软件自动计算。

测定的kD为-13.0mL/g，表明W308032-U5T6.E17-57.uIgG1具有良好的胶体稳定性(图5)。

表5：DLS表征总结

抗体名称	kD(mL/g)	R^2	尺寸分布	评价
					W308032-U5T6.E17-57.uIgG1	-13.0	98.6	单分散尺寸	良好

3.4疏水相互作用色谱高效液相色谱(HIC-HPLC)

通过具有TSKgel丁基-NPR柱(Tosoh-0042168)的HPLC 1260Infinity II系统(Agilent Technologics^TM)检测抗体的疏水性。将20μL样品注入柱中，以0.5ml/min的流速分离61min。运行缓冲液为25mM磷酸钠，pH7.0(缓冲液A)和25mM磷酸钠，1.5M(NH4)2SO4，pH7.0(缓冲液D)。运行梯度为0％至100％缓冲液D，从3min至53min。用波长为280nm和230nm的UV光检测峰保留。保留时间采用HIC-HPLC分析方法分析以对20min至50min的所有峰面积进行积分。操作和分析软件是OpenLab CDS Workstation(v2.3.0.443)。

测定的保留时间为24.74min，表明W308032-U5T6.E17-57.uIgG1具有正常的疏水性(图6)。

表6：HIC-HPLC表征结果

3.5表面等离子共振(SPR)

使用Biacore 8K检测与人HER2的结合亲和力。测试抗体被捕获在预先固定有抗人IgG Fc抗体的CM5传感器芯片上。将不同浓度的人HER2蛋白以30μL/min的流速注射到传感器芯片上，持续18s的缔合期，随后是3600s的解离期。每次结合循环后，芯片用10mM甘氨酸(pH 1.5)再生。从测试传感图中减去空白表面和缓冲通道的传感图。使用Langmiur分析通过1:1结合模型拟合实验数据。使用71.0kDa的分子量来计算作为分析物的人HER2蛋白的摩尔浓度。

使用Biacore 8K检测与人CD47的结合亲和力。人CD47蛋白被捕获在预先固定有链霉亲和素的CM5传感器芯片上。将不同浓度的测试抗体以30μL/min的流速注射到传感器芯片上，持续240s的缔合期，随后是600-3600s的解离期。每次结合循环后，芯片用10mM甘氨酸(pH 1.5)再生。从测试传感图中减去空白表面和缓冲通道的传感图。使用Langmiur分析通过1:1结合模型拟合实验数据。147kDa的分子量用于计算作为分析物的测试抗体的摩尔浓度。

结果表明，W308032-U5T6.E17-57.uIgG1对人Her2保持高亲和力，对人CD47保持相对较低的亲和力，W308032-U5T6.E17-57.uIgG1对HER2的亲和力比对CD47的亲和力高约50倍(图7A-7F)。图7A-7C显示了与HER2结合的3个独立SPR结果并且图7D-7F显示了与CD47结合的3个独立SPR结果。

表7：SPR表征总结

3.6抗原沉没后与肿瘤细胞的结合

将连续稀释的抗体与人全血(1:10稀释)或Jurkat细胞(1.2～1.8×10⁶细胞/孔)在4℃下孵育1hr，然后离心并将预沉没的上清液转移到新板中。将CFSE标记的人肿瘤细胞(0.8x10⁵细胞/孔)接种到96孔U形底板中，并在4℃下以1500rpm离心4min，然后除去上清液。然后添加预沉没上清液重悬细胞，4℃孵育1hr，然后用180μL 1％ BSA-PBS洗涤两次。添加二抗Alexa647缀合的山羊抗人IgG Fc以重悬细胞，并在4℃黑暗条件下孵育0.5hr，然后用180μL 1％ BSA-PBS洗涤两次。通过FACS(BD Canto II)测量平均荧光强度(MFI)并通过FlowJo Version软件进行分析。通过CFSE对肿瘤细胞进行门控，并使用GraphPad Prism软件计算肿瘤细胞上的结合EC₅₀：非线性回归(曲线拟合)-log(激动剂)与响应-可变斜率。

被人血沉没后，W308032-U5T6.E17-57.uIgG1显示出与CD47/Her2双阳性SK-BR-3细胞的结合，EC₅₀为～27.69nM，与未被人血预沉没的结合(EC₅₀＝24.36nM)相比，其未受影响。然而，莫洛利单抗在SK-BR-3上的结合(EC₅₀＝0.36nM)在被人血沉没后(EC₅₀＝6.41nM)受到显著影响，其中EC₅₀偏移约18倍(图8A-B)。

表8：在不存在或存在人血细胞作为沉没物下，抗体与SK-BR-3细胞结合的总结

被Jurkat细胞沉没后，W308032-U5T6.E17-57.uIgG1显示出在SK-BR-3细胞上的结合，EC₅₀为～13.29nM，与未被Jurkat细胞预沉没的结合(EC₅₀＝12.55nM)相比，其未受影响。然而，莫洛利单抗与SK-BR-3的结合(EC₅₀＝0.19nM)在被Jurkat细胞沉没后(EC₅₀＝1.53nM)受到显著影响，其中EC₅₀偏移约8倍(图9A-B)。

表9：在不存在或存在Jurkat细胞作为沉没物下，抗体与SK-BR-3细胞结合的总结

还测试了抗原沉没效应对抗体与CD47/Her2双阳性HCC1954细胞结合的影响。被Jurkat细胞沉没后，W308032-U5T6.E17-57.uIgG1显示出在HCC1954细胞上的结合，EC₅₀为～30.29nM，与未被Jurkat细胞预沉没的结合(EC₅₀＝26.07nM)相比，其未受到影响。然而，莫洛利单抗与HCC1954的结合(EC₅₀＝0.44nM)在被Jurkat细胞沉没后受到影响(EC₅₀＝1.68nM)，其中EC₅₀偏移约4倍(图10A-B)。

表10：在不存在或存在Jurkat细胞作为沉没物下，抗体与HCC1954细胞结合的总结

3.7在CD47单阳性细胞上的结合

与莫洛利单抗相比，W308032-U5T6.E17-57.uIgG1显示出在人血细胞上的结合可忽略不计(图11)以及在Jurkat细胞上的结合减少约200倍(图12)。

表11：抗体与人血细胞结合的总结

表12：抗体与Jurkat细胞结合的总结

3.8抗原沉没后肿瘤细胞上CD47配体的阻断

将连续稀释的抗体与人全血(1:10稀释)或Jurkat细胞(1.2～1.8×10⁶细胞/孔)在4℃下孵育1hr，然后离心并将预沉没的上清液转移到新板中。将CFSE标记的人肿瘤细胞(0.8x10⁵细胞/孔)接种到96孔U形底板中，并在4℃下以1500rpm离心4min，然后除去上清液。然后添加预沉没的上清液和mFc标记的SIRPα(1μg/mL)以重悬细胞，并在4℃下孵育2hr，然后用180μL1％BSA-PBS洗涤两次。添加二抗Alexa647缀合的山羊抗小鼠IgG Fc以重悬细胞，并在4℃黑暗条件下孵育0.5hr，然后用180μL1％ BSA-PBS洗涤两次。MFI通过FACS(BDCanto II)测量并通过FlowJo Version软件分析。通过CFSE对肿瘤细胞进行门控，并使用GraphPad Prism软件计算对肿瘤细胞的抑制IC₅₀：非线性回归(曲线拟合)-log(拮抗剂)与响应-可变斜率。

被人血沉没后，W308032-U5T6.E17-57.uIgG1阻断CD47配体在CD47/Her2双阳性SK-BR-3细胞上的结合，其中IC₅₀为～0.30nM，与未被人血预沉没的阻断(IC₅₀＝0.25nM)相比，其未受影响。然而，莫洛利单抗在SK-BR-3(IC₅₀＝0.06nM)上的CD47配体阻断在被人血(IC₅₀＝0.93nM)沉没后受到显著影响，其中IC₅₀偏移约15倍(图13A-B)。

表13：在不存在或存在人血细胞作为沉没物下CD47配体阻断的总结

被Jurkat细胞沉没后，W308032-U5T6.E17-57.uIgG1阻断CD47配体与CD47/Her2双阳性SK-BR-3细胞的结合，其中IC₅₀为～0.98nM，与未被Jurkat细胞预沉没的阻断(IC₅₀＝1.24nM)相比，其未受影响。然而，莫洛利单抗在SK-BR-3(IC₅₀＝0.17nM)上的CD47配体阻断，在被Jurkat细胞(IC₅₀＝0.44nM)沉没后受到影响，其中IC₅₀偏移约3倍(图14A-B)。

表14：在不存在或存在Jurkat细胞作为沉没物下CD47配体阻断的总结

此外，与莫洛利单抗相比，W308032-U5T6.E17-57.uIgG1显示在Jurkat细胞上几乎没有CD47配体阻断作用(图15)。

表15：在Jurkat细胞上的CD47配体阻断作用总结

3.9肿瘤细胞上的受体占有率

将肿瘤细胞接种到96孔U形底板中，并在4℃下以1500rpm离心4min，然后除去上清液。然后添加系列稀释的双特异性抗体重悬细胞，4℃孵育1hr，然后用180μL 1％ BSA-PBS洗涤两次。将检测抗体(饱和浓度的生物素标记亲本抗体)添加到重悬细胞中，并在4℃下孵育1hr，然后用180μL1％ BSA-PBS洗涤两次。添加二抗链霉亲和素PE重悬细胞，4℃避光孵育0.5hr，然后用180μL 1％ BSA-PBS洗涤两次。MFI通过FACS(BD Canto II)测量并通过FlowJo Version软件分析。受体占有率(％)计算如下：100-(MFI_样品-MFI_阴性)/(MFI_饱和-MFI_阴性)x100。使用GraphPad Prism软件计算EC₅₀：非线性回归(曲线拟合)-log(激动剂)与响应-可变斜率。

在Her2结合臂的帮助下，W308032-U5T6.E17-57.uIgG1在CD47/Her2双阳性SK-BR-3细胞上显示出比莫洛利单抗高30％以上的最大CD47占有率(图16A-B)。

表16：SK-BR-3细胞上Her2和CD47占有率的总结

3.10针对肿瘤细胞的ADCP

使用人CD14微珠从PBMC中分离单核细胞，然后用rhM-CSF(50-100ng/mL)处理6-8天分化为巨噬细胞。简而言之，将30μLCFSE标记的肿瘤细胞、50μL巨噬细胞和20μL系列稀释的抗体接种到96孔U形底超低板中。肿瘤细胞的吞噬作用在37℃下进行2-3小时。然后将细胞用APC缀合的CD14抗体在4℃染色45min，并用1％ BSA-PBS洗涤，然后用FACS(BD CantoII)检测并用FlowJo Version软件进行分析。吞噬活性计算如下：指数％＝百分比_{CFSE+/CD14-APC+}/(百分比_{CFSE+/CD14-APC+}+百分比_{CFSE-/CD14-APC+})x100％。使用GraphPad Prism软件计算吞噬细胞EC₅₀：非线性回归(曲线拟合)-log(激动剂)与响应-可变斜率。

如图17A-B所示，在两个独立实验中，与曲妥珠单抗和莫洛利单抗的组合相比，W308032-U5T6.E17-57.uIgG1在CD47/Her2双阳性SK-BR-3细胞上显示出增加的ADCP功效。

表17A：SK-BR-3细胞上的抗体总结(研究1)

表17B：SK-BR-3细胞上的抗体总结(研究2)

如图18所示，W308032-U5T6.E17-57.uIgG1在CD47/Her2双阳性HCC1954细胞上显示出与曲妥珠单抗和莫洛利单抗组合(EC₅₀＝1.28nM,最大吞噬指数＝38.1％)相当的ADCP疗效(EC₅₀＝1.25nM，最大吞噬指数＝39.3％)。如图19所示，W308032-U5T6.E17-57.uIgG1在CD47/Her2双阳性NCI-N87细胞上显示出与曲妥珠单抗和莫洛利单抗组合(EC50＝1.77nM，最大吞噬指数＝77.5％)相当的ADCP疗效(EC₅₀＝0.13nM，最大吞噬指数＝77.8％)。

表18：HCC1954上的抗体总结

表19：NCI-N87上的抗体总结

针对CD47单阳性细胞的ADCP

W308032-U5T6.E17-57.uIgG1显示出在人血细胞上几乎没有ADCP功效(图20)以及与莫洛利单抗相比在Jurkat细胞上的低得多的ADCP活性(图21)。

表20：人血细胞上的抗体总结

表21：Jurkat细胞上的抗体总结

3.11针对肿瘤细胞的ADCC

使用CD56阳性选择试剂盒从PBMC中分离NK细胞。简而言之，将40μL肿瘤细胞、40μLNK细胞和20μL系列稀释抗体接种到96孔U形底板中。37℃孵育4hr后，将细胞混合物以1500rpm离心5min，并转移75μL上清液用于检测。根据制造商的说明，使用LDH细胞毒性检测试剂盒(Roche)测量和计算细胞死亡。使用GraphPad Prism软件计算细胞毒性EC₅₀：非线性回归(曲线拟合)-log(激动剂)与响应-可变斜率。

如图22所示，W308032-U5T6.E17-57.uIgG1在CD47/Her2双阳性SK-BR-3细胞上显示出有效的ADCC功效(EC₅₀＝21.42pM，最大细胞毒性＝61.9％)。

表22：SK-BR-3上的ADCC总结

W308032-U5T6.E17-57.uIgG1还在CD47/Her2双阳性HCC1954细胞(图23)和NCI-N87细胞(图24)上显示出有效的ADCC功效。

表23：HCC1954上的ADCC总结

表24：NCI-N87上的ADCC总结

针对CD47单阳性细胞的ADCC

W308032-U5T6.E17-57.uIgG1仅在高浓度时在Jurkat细胞上显示出非常弱的ADCC功效(图25)。

表25：Jurkat细胞上的ADCC总结

3.12对肿瘤细胞增殖的抑制作用

简而言之，将80μL肿瘤细胞接种到96孔黑壁板中。第二天，将20μL连续稀释的抗体添加细胞中，并在37℃下孵育5-6天。然后将50μL/孔的CTG溶液添加到细胞中，并在室温(RT)下孵育10min，然后使用EnVision检测。使用GraphPadPrism软件计算抑制IC50：非线性回归(曲线拟合)-log(拮抗剂)与响应-可变斜率。

W308032-U5T6.E17-57.uIgG1对CD47/Her2双阳性SK-BR-3细胞(图26)和NCI-N87细胞(图27)的增殖显示出有效的抑制作用。

表26：在SK-BR-3上的抑制作用的总结

表27：在NCI-N87上的抑制作用的总结

3.13血凝

抗凝的新鲜人全血2000rpm离心10min，弃去血浆。人血细胞用DPBS冲洗两次。简而言之，将25μL 1:25稀释的人血细胞(即使用25x原始血体积重悬细胞)和25μL系列稀释的抗体添加到U形底96孔板中，并在37℃下孵育2hr后拍照进行检测。

W308032-U5T6.E17-57.uIgG1在人血细胞上呈HA阴性，而莫洛利单抗在人血细胞上呈HA阳性(图28)。

3.14血清稳定性

新鲜人全血在不含抗凝剂的试管中于室温(RT)下静置孵育至少30min。以4000rpm离心血液10min后收集血清。将抗体与血清轻轻混合并在37℃下孵育。分别在第0天、第1天、第4天、第7天、第14天收集一等份血清处理的样品并用液氮速冻；并储存在-80℃直至准备用于分析。评估样品与肿瘤细胞的结合能力以反映其稳定性。简而言之，将肿瘤细胞接种到96孔U形底板中，并在4℃下以1500rpm离心4min，然后除去上清液。然后添加不同浓度的测试样品重悬细胞，4℃孵育1hr，然后用180μL 1％BSA-PBS洗涤两次。添加二抗Alexa647缀合的山羊抗人IgG Fc以重悬细胞，并在黑暗中于4℃下孵育0.5hr，然后用180μL 1％ BSA-PBS洗涤两次。MFI通过FACS(BD Canto II)测量并通过FlowJo Version软件分析。使用GraphPad Prism软件计算结合EC₅₀：非线性回归(曲线拟合)-log(激动剂)与响应-可变斜率。

W308032-U5T6.E17-57.uIgG1在人血清中稳定至少7天，并且显示在CD47/Her2双阳性SK-BR-3细胞上的结合没有减少。当与人血清一起孵育14天时，W308032-U5T6.E17-57.uIgG1显示在CD47/Her2双阳性SK-BR-3细胞上结合效力的轻微(小于2倍)减少(图29)。

表28：血清稳定性结果总结

实施例4

W308032抗体的体内表征

4.1啮齿动物功效

4.1.1HCC1954异种移植模型

本研究使用6-8周龄雌性CB-17SCID小鼠(北京维通利华实验动物技术有限公司)。HCC1954细胞在体外于37℃和5％CO₂空气环境下以单层培养物维持在补充有10％胎牛血清的RPMI-1640培养基中。对于异种移植模型，收获处于指数生长期的HCC1954肿瘤细胞，并在每只小鼠的右前臂腋下皮下接种HCC1954肿瘤细胞(3.0×10⁶细胞/0.2mL，1:1DPBS和基质胶(Corning))。当平均肿瘤体积达到～147mm³时，将动物随机分为12组，并接受第一剂抗体治疗(第0天)，随后每周两次腹膜内治疗，总共10次注射。对小鼠进行称重，并使用卡尺每周测量两次肿瘤生长。用公式(1/2(长×宽²)计算肿瘤体积。结果用平均值和标准误差(平均值±SEM)表示。使用Prism的双因素方差分析Bonferroni后检验来分析数据，p<0.05被认为具有统计显著性。研究中与动物处理护理和治疗相关的所有程序均按照药明生物机构动物护理和使用委员会(IACUC)批准的指南进行，并遵循实验动物护理评估和认可协会的指南(AAALAC)。HCC1954异种移植模型的分组和治疗详情如表29所示。

表29：HCC1954异种移植模型的分组和治疗

除了两只小鼠(一只来自W308032-U5T6.E17-57.uIgG1 3mg/kg组和一只来自W308032-U5T6.E17-57.uIgG1 1mg/kg组)在第28天和第17天被发现死亡外，帕妥珠单抗组的一只小鼠因肿瘤体积达到2500mm³而被安乐死，所有其他小鼠在实验过程中表现正常并缓慢增加体重，这表明抗体没有毒性(数据未显示)。

如图30所示并总结于表30中，与PBS组相比，曲妥珠单抗+莫洛利单抗(第36天，TGI76.8％)能够显著抑制肿瘤生长，从第7天有显著差异；而曲妥珠单抗(第36天，TGI 33.6％)和莫洛利单抗(第36天，TGI 18.5％)单一治疗组显示出对肿瘤生长的轻微抑制，表明CD47和Her2的协同作用。W308032-U5T6.E17-57.uIgG1(10mg/kg)显示出比曲妥珠单抗+莫洛利单抗组合稍好的功效，并且比曲妥珠单抗或莫洛利单抗单一疗法显著更好的功效(图30)。

表30：HCC1954异种移植模型第36天的TGI和P值总结(注：双因素方差分析Bonferroni后检验，*p<0.05；**p<0.01)

W308032-U5T6.E17-57.uIgG1(30mg/kg、10mg/kg、3mg/kg、1mg/kg)可以抑制肿瘤生长(第36天，TGI分别为100.1％、90.7％、75.6％、36.7％)，并且分别从第3天(30mg/kg)、第7天(10mg/kg)、第10天(3mg/kg)有显著差异，表明W308032-U5T6.E17-57.uIgG1具有剂量依赖性抗肿瘤功效(图31)。

曲妥珠单抗与帕妥珠单抗的联合疗法已被批准用于临床，并且与曲妥珠单抗单药疗法相比，显示出改善的抗肿瘤疗效。为了评估W308032-U5T6.E17-57.uIgG1是否也有潜力与帕妥珠单抗一起使用以进一步增强抗肿瘤活性，还在HCC1954异种移植模型中检查了联合疗法的抗肿瘤活性。如图32所示并总结于表30中，与PBS组相比，曲妥珠单抗+帕妥珠单抗(第36天，TGI 50.7％)和曲妥珠单抗+莫洛利单抗+帕妥珠单抗(第36天，TGI 105.2％)组合组能够显著抑制肿瘤生长，从第7天有显著差异；而曲妥珠单抗(第36天，TGI 33.6％)和帕妥珠单抗(第36天，TGI 8.76％)单药治疗组仅显示出对肿瘤生长的轻微抑制。W308032-U5T6.E17-57.uIgG1+帕妥珠单抗组合组(第36天，TGI 106.0％)显示出与曲妥珠单抗+莫洛利单抗+帕妥珠单抗组合组(第36天，TGI 105.2％)相当的抗肿瘤功效。

所有上述结论也被第一次治疗后第36天获得的肿瘤重量数据所证实(图33)。数据显示为平均值+SEM。

4.1.2NCI-N87异种移植模型

本研究使用4-8周龄的雌性CB-17SCID小鼠(北京维通利华实验室研究模型和服务)。NCI-N87细胞在体外于37℃和5％CO₂空气环境下以单层培养物维持在补充有10％胎牛血清的RPMI-1640培养基中。对于异种移植模型，收获指数生长期的NCI-N87肿瘤细胞，并在每只小鼠的右前腹区域皮下接种NCI-N87肿瘤细胞(1×10⁷细胞/0.1mL、1:1PBS和基质胶)。当平均肿瘤体积达到～157mm³时，将动物随机分为10组，并接受第一剂治疗(第0天)，随后每周两次腹腔注射抗体治疗，总共11次注射，除外的是每周一次腹腔注射优赫得治疗总共为6次注射。对小鼠进行称重，并使用卡尺每周测量两次肿瘤生长。用公式(1/2(长×宽²)计算肿瘤体积。

所有结果均以平均值和标准误差(平均值±SEM)表示。使用R-a语言和统计计算和图形环境(版本3.3.1)中的双因素方差分析Bonferroni后检验或单因素方差分析Dunnett多重比较检验来分析数据，p<0.05被认为具有统计显著性。所有与动物护理和使用相关的程序均根据实验动物护理评估和认证协会(AAALAC)的规定，经CrownBio机构动物护理和使用委员会(IACUC)批准。NCI-N87异种移植模型的分组和治疗详情如表31所示。

表31.NCI-N87异种移植模型的分组和治疗

如图34所示并总结于表32中，与媒介物对照组相比，赫赛汀(曲妥珠单抗，10mg/kg)+莫洛利单抗(10mg/kg)可以显著抑制肿瘤生长(第38天，TGI 111.92％)，并且W308032-U5T6.E17-57.uIgG1(10mg/kg和20mg/kg)显示出与赫赛汀+莫洛利单抗组合疗法(第38天，TGI分别为116.04％和118.17％)相当的疗效。如图35所示，W308032-U5T6.E17-57.uIgG1(5mg/kg、10mg/kg、20mg/kg、40mg/kg)显示出剂量依赖性抗肿瘤功效(第38天，TGI分别为112.22％、116.04％、118.17％、119.99％)。

曲妥珠单抗与化疗的组合已被批准用于临床，并且与曲妥珠单抗单药疗法相比，显示出改善的抗肿瘤疗效。为了评估W308032-U5T6.E17-57.uIgG1是否也有可能与化疗一起使用以进一步提高抗肿瘤活性，还在NCI-N87异种移植模型中检查了组合疗法的抗肿瘤活性。如图36所示并总结于表32中，W308032-U5T6.E17-57.uIgG1(10mg/kg)与紫杉醇(10mg/kg)组合产生显著的抗肿瘤功效，其中TGI为117.57％，这与优赫得(10mg/kg)的功效相当，其中TGI为124.19％。

表32.NCI-N87异种移植模型第38天的TGI和P值总结

4.1.3JIMT-1异种移植模型

还评估了另一种曲妥珠单抗耐药乳腺癌细胞JIMT-1异种移植模型的疗效。研究中使用了9-10周龄的雌性CB-17SCID小鼠(上海凌昌生物技术有限公司)。JIMT-1细胞在体外于37℃、5％CO₂空气环境下以单层培养物维持在补充有10％胎牛血清的DMEM培养基中。对于异种移植模型，收获处于指数生长期的JIMT-1肿瘤细胞，并在每只小鼠的右上侧腹区域皮下接种JIMT-1肿瘤细胞(5×10⁶细胞/0.1mL PBS)。当平均肿瘤体积达到～134mm³时，将动物随机分为6组，并接受第一剂治疗(第0天)，随后每周两次腹腔注射抗体治疗，总共注射10次，最后一次注射后再观察4周。对小鼠进行称重，并使用卡尺每周测量两次肿瘤生长。用公式(1/2(长×宽²)计算肿瘤体积。

所有结果均以平均值和标准误差(平均值±SEM)表示。使用Prism的双因素方差分析Bonferroni后检验或单因素方差分析Dunnett多重比较检验来分析数据，p<0.05被认为具有统计显著性。所有与动物护理和使用相关的程序均根据实验动物护理评估和认证协会(AAALAC)的规定，经CrownBio机构动物护理和使用委员会(IACUC)批准。JIMT-1异种移植模型的分组和治疗详情如表33所示。

表33.JIMT-1异种移植模型的分组和治疗

动物每周接受两次治疗，5周内总共10剂，然后在不接受治疗的情况下观察4周。第35天(最后一次给药后三天)，W308032-U5T6.E17-57.uIgG1显示出对肿瘤生长的剂量依赖性抑制，并且与曲妥珠单抗和莫洛利单抗组合的疗效相当(数据未显示)。如图37所示并总结于表34中，W308032-U5T6.E17-57.uIgG1与紫杉醇组合在肿瘤生长抑制方面显示出比双特异性抗体或曲妥珠单抗单一治疗更好的功效，这与优赫得的功效相当。

如图38所示，在第63天(最后一次给药后三十一天)，W308032-U5T6.E17-57.uIgG1与紫杉醇组合显示肿瘤体积几乎没有反弹，每组8只小鼠中有4只无肿瘤。然而，优赫得显示出相对于初始肿瘤体积的明显反弹，每组8只小鼠中只有1只没有肿瘤。

表34.JIMT-1异种移植模型第35天的TGI和P值总结

4.2啮齿动物药代动力学

本研究使用9-11周龄的雌性SD大鼠(北京维通利华实验动物技术有限公司)。动物被安置在上海模式生物中心有限公司的特定无病原体(SPF)屏障中，每个单独的通风笼(IVC)2只动物，并在抵达后适应一周。对于药代动力学(PK)研究，每只大鼠在第0天给予单剂量抗体(15mg/kg，IV推注)，并从眼睛中采集血样并转移至EDTA管中。将试管在4℃下以8000rpm(6010g)离心5分钟，然后收集血浆并储存在-20℃下。所有样品均经过唯一标识，以表明来源和收集时间。每只大鼠每次剂量的样品收集时间表显示于表35中。

表35：大鼠PK研究的样品采集时间表

使用生物分析ELISA方法测定血清中分析物的浓度。简而言之，96孔ELISA板在2～8℃下用碳酸盐-碳酸氢盐缓冲液中的重组人HER2/ErB2蛋白(His标签)作为捕获抗体包被过夜。洗涤和封闭后，添加系列稀释的血浆样品，然后使用生物素标记的重组人CD47蛋白(G1为HER2+CD47法)或羊抗人IgG-生物素(G2为HER2+Fc法)作为检测抗体。HRP-链霉亲和素和TMB底物用于显色。大约5～10分钟后通过添加2M HCl终止反应。使用微孔板分光光度计(M5e)读取450nm和540nm处的吸光度。将样品的OD值代入标准曲线，以获得血浆抗体浓度。使用Phoenix WinNonlin软件(8.1版，Pharsight，Mountain View，CA)对大鼠中抗体的血清浓度进行非房室药代动力学分析。应用线性/log梯形规则来获得PK参数。所有PK参数均在抗体浓度低于Cmax 1％的情况下计算。

如图39所示，W308032-U5T6.E17-57.uIgG1显示出与曲妥珠单抗(t1/2＝184h，表37)相当的啮齿动物PK(t1/2＝153h，表36)。

表36：W308032-U5T6.E17-57.uIgG1的药代动力学参数总结

表37：曲妥珠单抗的药代动力学参数总结

本领域技术人员还应当理解，在不背离本公开的精神或核心属性的情况下，本公开可以以其他具体形式来体现。由于本公开的前述描述仅公开了其示例性实施方案，因此应当理解的是，其他变型应当认为落入本公开的范围内。因此，本公开不限于本文已详细描述的特定实施方案。相反，应当参考所附权利要求书来指示本公开的范围和内容。

参考文献

[1]Meike E W Logtenberg,Ferenc A Scheeren,Ton N Schumacher.The CD47-SIRPa Immune Checkpoint.Immunity.2020May 19；52(5):742-752.

[2]E J Brown,W A Frazier.Integrin-associated protein(CD47)and itsligands.Trends Cell Biol.2001Mar；11(3):130-5.

[3]Mark P Chao,Irving L Weissman,Ravindra Majeti.The CD47-SIRPαpathway in cancer immune evasion and potential therapeutic implications.CurrOpin lmmunol.2012Apr；24(2):225-32.

[4]I Rubin,Y Yarden.The basic biology of HER2.Ann Oncol.2001；12Suppl1:S3-8

[5]Li-Chung Tsao et.al.CD47 blockade augmentation of trastuzumabantitumor efficacy dependent on antibody-dependent cellular phagocytosis.JCIInsight.2019Dec 19；4(24):e131882.

[6]Tiia J Honkanen et.al.Prognostic and predictive role of spatiallypositioned tumour infiltrating lymphocytes in metastatic HER2 positive breastcancer treated with trastuzumab.Sci Rep.2017Dec 21；7(1):18027.

Claims (34)

1.多肽复合物或其抗原结合部分，其包含特异性结合HER2的第一抗原结合部分和特异性结合CD47的第二抗原结合部分，其中：

所述第一抗原结合部分包含第一重链可变结构域(VH1)和第一轻链可变结构域(VL1)，所述VH1包含含有SEQ ID NO:1的氨基酸序列的重链互补决定区(HCDR)1、含有SEQ ID NO:2的氨基酸序列的HCDR2、含有SEQ ID NO:3的氨基酸序列的HCDR3，并且所述VL1包含含有SEQID NO:4的氨基酸序列的轻链互补决定区(LCDR)1、含有SEQ ID NO:5的氨基酸序列的LCDR2和含有SEQ ID NO:6的氨基酸序列的LCDR3；和

所述第二抗原结合部分包含第二重链可变结构域(VH2)和第二轻链可变结构域(VL2)，所述VH2包含含有SEQ ID NO:7的氨基酸序列的HCDR1、含有SEQ ID NO:8的氨基酸序列的HCDR2、含有SEQ ID NO:9的氨基酸序列的HCDR3，并且所述VL2包含含有SEQ ID NO:10的氨基酸序列的LCDR1、含有SEQ ID NO:11的氨基酸序列的LCDR2和含有SEQ ID NO:12的氨基酸序列的LCDR3。

2.根据权利要求1所述的多肽复合物或其抗原结合部分，其中所述第一抗原结合部分和所述第二抗原结合部分独立地选自以下形式：免疫球蛋白及其抗原结合部分，例如Fab、F(ab)’₂或scFv。

3.根据权利要求1或2所述的多肽复合物或其抗原结合部分，其中：

所述第一抗原结合部分包含可操作地连接至第一T细胞受体(TCR)恒定区(C1)的VH1和可操作地连接至第二TCR恒定区(C2)的VL1，所述第二抗原结合部分包含可操作地连接至抗体重链CH1结构域的VH2和可操作地连接至抗体轻链恒定(CL)结构域的VL2；或

所述第一抗原结合部分包含可操作地连接至抗体重链CH1结构域的VH1和可操作地连接至抗体轻链恒定(CL)结构域的VL1，所述第二抗原结合部分包含可操作地连接至C1区的VH2和可操作地连接至C2区的VL2；

其中C1和C2能够形成一个或多个非天然链间二硫键，所述非天然链间二硫键改善C1、C2和/或C1和C2之间的界面的稳定性。

4.根据权利要求1-3中任一项所述的多肽复合物或其抗原结合部分，其中VH1包含SEQID NO:13的氨基酸序列或与SEQ ID NO:13具有至少85％、90％或95％同一性的氨基酸序列，并且VL1包含SEQ ID NO:14的氨基酸序列或与SEQ ID NO:14具有至少85％、90％或95％同一性的氨基酸序列；和/或

VH2包含氨基酸序列SEQ ID NO:15或与SEQ ID NO:15具有至少85％、90％或95％同一性的氨基酸序列，并且VL2包含氨基酸序列SEQ ID NO:16或与SEQ ID NO:16具有至少85％、90％或95％同一性的氨基酸序列。

5.根据权利要求3或4所述的多肽复合物或其抗原结合部分，其中C1包含SEQ ID NO:17的氨基酸序列或与SEQ ID NO:17具有至少85％、90％或95％同一性的氨基酸序列，并且C2包含SEQ ID NO:18的氨基酸序列或与SEQ ID NO:18具有至少85％、90％或95％同一性的氨基酸序列。

6.根据前述权利要求中任一项所述的多肽复合物或其抗原结合部分，其中所述多肽复合物包含Fc区，例如人IgG Fc区。

7.根据权利要求6所述的多肽复合物或其抗原结合部分，其中所述Fc区是人IgG1、IgG2、IgG3或IgG4 Fc区。

8.根据权利要求6或7所述的多肽复合物或其抗原结合部分，其中所述Fc区是天然Fc区或工程化Fc区，例如包含选自“旋纽入孔”取代、S228P、M252Y/S254T/T256E及其组合中的一个或多个取代的Fc区。

9.根据前述权利要求中任一项所述的多肽复合物或其抗原结合部分，其包含一个、两个或更多个CD47结合部分，以及一个、两个或更多个HER2结合部分。

10.根据权利要求9所述的多肽复合物或其抗原结合部分，其包含两条重链和两条轻链，其中从N端到C端：

第一重链包含如VH1-C1-铰链-Fc中的可操作地连接的结构域，

第二重链包含如VH2-CH1-铰链-Fc中的可操作地连接的结构域，

第一轻链包含如VL1-C2中的可操作地连接的结构域，和

第二轻链包含如VL2-CL中的可操作地连接的结构域；

或

第一重链包含如VH1-CH1-铰链-Fc中的可操作地连接的结构域，

第二重链包含如VH2-C1-铰链-Fc中的可操作地连接的结构域，

第一轻链包含如VL1-CL中的可操作地连接的结构域，和

第二轻链包含如VL2-C2中的可操作地连接的结构域。

11.根据权利要求9所述的多肽复合物或其抗原结合部分，其包含两条重链和四条轻链，其中从N端到C端：

第一重链和第二重链各自包含如VH1-C1-VH2-CH1-铰链-Fc、VH2-CH1-VH1-C1-铰链-Fc、VH1-C1-铰链-Fc-VH2-CH1或VH2-CH1-铰链-Fc-VH1-C1中的可操作地连接的结构域，

第一轻链和第二轻链各自包含如VL1-C2中的可操作地连接的结构域，和第三轻链和第四轻链各自包含如VL2-CL中的可操作地连接的结构域；

或

第一重链和第二重链各自包含如VH1-CH1-VH2-C1-铰链-Fc、VH2-C1-VH1-CH1-铰链-Fc、VH1-CH1-铰链-Fc-VH2-C1或VH2-C1-铰链-Fc-VH1-CH1中的可操作地连接的结构域，

第一轻链和第二轻链各自包含如VL1-CL中的可操作地连接的结构域，和第三轻链和第四轻链各自包含如VL2-C2中的可操作地连接的结构域。

12.根据权利要求9所述的多肽复合物或其抗原结合部分，其包含两条重链和三条轻链，其中从N端到C端：

第一重链包含如VH1-C1-VH2-CH1-铰链-Fc或VH2-CH1-铰链-Fc-VH1-C1中的可操作地连接的结构域，

第二重链包含如VH2-CH1-铰链-Fc中的可操作地连接的结构域，

第一轻链包含如VL1-C2中的可操作地连接的结构域，和

第二轻链和第三轻链各自包含如VL2-CL中的可操作地连接的结构域；或

第一重链包含如VH2-CH1-VH1-C1-铰链-Fc或VH1-C1-铰链-Fc-VH2-CH1中的可操作地连接的结构域，

第二重链包含如VH1-C1-铰链-Fc中的可操作地连接的结构域，

第一轻链和第二轻链各自包含如VL1-C2中的可操作地连接的结构域，和

第三轻链包含如VL2-CL中的可操作地连接的结构域；

或

第一重链包含如VH1-CH1-VH2-C1-铰链-Fc或VH2-C1-铰链-Fc-VH1-CH1中的可操作地连接的结构域，

第二重链包含如VH2-C1-铰链-Fc中的可操作地连接的结构域，

第一轻链包含如VL1-CL中的可操作地连接的结构域，和

第二轻链和第三轻链各自包含如VL2-C2中的可操作地连接的结构域；

或

第一重链包含如VH2-C1-VH1-CH1-铰链-Fc或VH1-CH1-铰链-Fc-VH2-C1中的可操作地连接的结构域，

第二重链包含如VH1-CH1-铰链-Fc中的可操作地连接的结构域，

第一轻链和第二轻链各自包含如VL1-CL中的可操作地连接的结构域，和第三轻链包含如VL2-C2中的可操作地连接的结构域。

13.根据权利要求9-12中任一项所述的多肽复合物或其抗原结合部分，其中所述C1和C2结构域是可互换的。

14.根据权利要求3-13中任一项所述的多肽复合物或其抗原结合部分，其中可操作地连接经由直接连接或经由长度包含1-30个氨基酸的肽接头。

15.根据权利要求14所述的多肽复合物或其抗原结合部分，其中所述肽接头是GS接头，例如(GS)n、(GGS)n、(GGGS)n、(GGGS)n、(GGGGS)n、(GGGS)n、(GGGSS)n，其中n是1-9的整数。

16.根据权利要求10所述的多肽复合物或其抗原结合部分，其包含：分别包含SEQ IDNO:19和20的第一重链和第二重链，以及分别包含SEQ ID NO:21和22的第一轻链和第二轻链。

17.根据前述权利要求中任一项所述的多肽复合物或其抗原结合部分，其中所述多肽复合物是人源化抗体或全人抗体。

18.分离的核酸分子，其包含编码根据权利要求1-17中任一项所述的多肽复合物或其抗原结合部分的核酸序列。

19.载体，其包含根据权利要求18所述的核酸分子。

20.宿主细胞，其包含根据权利要求18所述的核酸分子或根据权利要求19所述的载体。

21.药物组合物，其包含根据权利要求1-17中任一项所述的多肽复合物或其抗原结合部分和药学上可接受的载剂。

22.产生根据权利要求1-17中任一项所述的多肽复合物或其抗原结合部分的方法，其包括以下步骤：

-在合适的条件下培养包含编码所述多肽复合物或其抗原结合部分的核酸序列的宿主细胞；和

-从所述宿主细胞分离所述多肽复合物。

23.用于调节受试者中HER2和/或CD47相关免疫应答的方法，其包括向所述受试者施用根据权利要求1-17中任一项所述的多肽复合物或其抗原结合部分或根据权利要求21所述的药物组合物。

24.用于抑制受试者中肿瘤细胞生长的方法，其包括向所述受试者施用有效量的根据权利要求1-17中任一项所述的多肽复合物或其抗原结合部分或根据权利要求21所述的药物组合物。

25.用于诊断、预防或治疗受试者的癌症的方法，其包括向所述受试者施用有效量的根据权利要求1-17中任一项所述的多肽复合物或其抗原结合部分或根据权利要求21所述的药物组合物。

26.根据权利要求25所述的方法，其中所述癌症是HER2和/或CD47阳性癌症。

27.根据权利要求25或26所述的方法，其中所述癌症选自结肠癌、结肠直肠癌、乳腺癌、肺癌、宫颈癌、肾癌、胶质母细胞瘤、卵巢癌、胰腺癌、前列腺癌、食道癌、胃癌、黑色素瘤、肝癌、头颈癌、皮肤癌、膀胱癌、脑癌、支气管癌、胆管癌、子宫内膜癌、神经母细胞瘤、视网膜母细胞瘤、睾丸癌、胸腺瘤、甲状腺癌、脐尿管癌、子宫癌、阴道癌、星形细胞瘤、基底细胞癌及其组合。

28.根据权利要求27所述的方法，其中所述癌症是乳腺癌或胃癌。

29.根据权利要求24-28中任一项所述的方法，其中根据权利要求1-17中任一项所述的多肽复合物或其抗原结合部分与化疗剂、放射和/或用于癌症免疫疗法的其它药剂组合施用。

30.根据权利要求1-17中任一项所述的多肽复合物或其抗原结合部分，其用于

i)调节HER2和/或CD47相关的免疫应答；

ii)诱导巨噬细胞介导的肿瘤细胞吞噬作用；

iii)诱导自然杀伤细胞介导的肿瘤细胞细胞毒性；和/或

iv)抑制肿瘤细胞的生长。

31.根据权利要求1-17中任一项所述的多肽复合物或其抗原结合部分，其用于诊断、治疗或预防癌症。

32.根据权利要求1-17中任一项所述的多肽复合物或其抗原结合部分在制备用于以下的药物中的用途：

i)调节HER2和/或CD47相关的免疫应答；

ii)诱导巨噬细胞介导的肿瘤细胞吞噬作用；

iii)诱导自然杀伤细胞介导的肿瘤细胞细胞毒性；和/或

iv)抑制肿瘤细胞的生长。

33.根据权利要求1-17中任一项所述的多肽复合物或其抗原结合部分在制备用于治疗或预防与CD47和/或HER2相关的癌症的药物中的用途。

34.试剂盒，其中所述试剂盒包含容器，所述容器包含根据权利要求1-17中任一项所述的多肽复合物或其抗原结合部分。