CN1161107C

CN1161107C - 用于胃肠道药物传递的口服制剂

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Publication number: CN1161107C
Application number: CNB998158186A
Authority: CN
Inventors: 高田宽治
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 1998-11-27
Filing date: 1999-11-26
Publication date: 2004-08-11
Anticipated expiration: 2019-11-26
Also published as: CA2352389C; JP4497725B2; EP1135112A1; CA2352389A1; KR20010086057A; DK1135112T3; AU766293B2; AU1410100A; DE69921353D1; JP2002531394A; MXPA01005346A; WO2000032172A1; BR9916871A; HK1043545A1; ES2233106T3; KR100762475B1; EP1135112B1; DE69921353T2; ATE279914T1; US7097851B1

Abstract

用于胃肠药物传递的口服制剂包含用于把制剂粘附于在消化道中所选择的部位的粘附部位控制层、用于包含药物和粘附剂的药物运载层和用于保护在药物运载层中的药物的保护层，其中药物运载层存在于保护层与粘附部位控制层之间，且粘附部位控制层可附着于保护层。制剂能够改善具有低的生物利用度的药物的生物利用度。

Description

用于胃肠道药物传递的口服制剂

技术领域

本发明涉及用于胃肠道药物传递的口服制剂。更具体地讲，本发明涉及用于胃肠道药物传递以改善由于在消化道中低吸收而具有低的生物利用度的药物的生物利用度的口服制剂。

背景领域

人们认为口服给药后药物低的生物利用度是由以下因素引起的。(1)在制剂例如普通片剂和胶囊剂口服给药时，在从口服制剂的药物释放后，药物在消化腔与血液之间的浓度梯度立即增加，但当制剂运动到消化道的较低部位时迅速降低，它对药物吸收条件产生不利影响。(2)药物例如呋塞米从小肠上段的有限吸收部位被吸收(所谓窗口效应)，并且这样药物的普通制剂在通过吸收部位后不能呈现满意的生物利用度。(3)蛋白质或肽药物经历分泌至消化道的消化酶的强烈的水解降解，借此生物利用度降低至仅有几个百分点。(4)在从消化道吸收后，HIV蛋白酶抑制剂例如利托那韦、沙奎那韦、英地那韦和奈非那韦经肠道内皮细胞膜上表达的排泄蛋白例如P-gp活化排泄。

为改进由窗口效应引起的药物的低的生物利用度，Akiyama等开发出粘膜粘附颗粒制剂(Pharmaceutical Research，12卷，第397-405页，1995)。

作为改善口服给药后蛋白质和肽的生物利用度的常规技术，同时防止在胃和小肠中水解降解的主要目的，已由Saffran博士等开发出结肠可溶性偶氮类聚合物包衣的胰岛素片剂、来自Cortex公司的乳剂、由Takada开发的用于制备口服制剂的技术、由Takada开发的结肠传递技术和脂质体制剂(Takada，Pharm，Tech.Japan，1988，第1299-1307页；Takada，Pharm，Tech.Japan，1991，第512-52页；Takada，Pharm，Tech.Japan，1995，第1335-1344页；Ko等，Nippon Rinsho[Japan Clinicals]，1998，第595-600页)等。

US 4765983公开了一种用于口腔粘膜的粘附药物类型，当该药物类型用于口腔感染部位时可提供抗炎和止痛作用。

WO9824412 A2公开了能在结肠区域命中疾病或持续治疗的肠溶包衣颗粒制剂，还公开了使用该制剂治疗结肠壁病症的方法。

发明公开

在粘膜粘附颗粒制剂中，药物分子不能免于存在于消化道中的消化酶侵袭。在以上肽或蛋白质口服制剂中，完成防止蛋白质或肽免于存在于小肠腔中的消化酶侵袭是困难的。

本发明的目的是提供用于药物传递(有时称作药物传递系统(DDS)制剂)的口服制剂，其通过经使用凝胶形成的聚合物和水不溶性的聚合物制备贴剂(patch)使生物利用度得以改善，口服给药后其粘附于消化道粘膜并防止存在于消化道的消化酶渗透，保护贴剂中的药物分子免于小肠腔中的消化酶侵袭，且通过粘附于粘膜长时间地保留浓度梯度。

本发明者进行多项研究以达到前述的目的，并已成功开发出用于胃肠药物传递的口服制剂，它包括三层，每层都有具体的功能。在这些发现的基础上，得到本发明。

本发明提供用于胃肠药物传递的口服制剂，其包括用于把制剂粘附于在消化道中所选择部位的粘附部位控制层、用于包含药物和粘附剂的药物运载层、用于保护在药物运载层中的药物的保护层，其中药物运载层存在于保护层与粘附部位控制层之间，且粘附部位控制层可附着于保护层。

本发明的一个实施方案提供用于胃肠药物传递的口服制剂，其中粘附部位控制层、药物运载层和保护层中的每一个以薄膜形式存在，且将这三个层层压成片。在该实施方案中，粘附部位控制层、药物运载层和保护层的厚度每一个优选为20至100μm。

本发明另一个实施方案提供用于胃肠药物传递的口服制剂，其中保护层以半球形形式存在，并且药物运载层存在于半球形形式的保护层的内部空间，且其中粘附部位控制层覆盖于半球形形式的保护层的出口部分。在该实施方案中，所述半球的内部深度优选为50至500μm，半球的出口部分的内径优选为20至800μm，且保护层和粘附部位控制层的厚度优选为20至100μm。

药物运载层优选为用药物浸泡的多孔薄片底物、或为含有药物的凝胶或腊的薄片或薄膜。

药物运载层优选还包含一种或多种选自吸收促进剂、蛋白酶抑制剂和转运蛋白抑制剂的成分。

保护层优选为由水不溶性聚合物或腊制备的薄膜或胶囊。

粘附部位控制层优选为用肠聚合物制备的薄膜。

所述药物优选为生理活性蛋白或肽。

所述药物优选为G-CSF、干扰素或英地那韦。

本发明另一方面提供通过在胶囊中填充前述制剂制备的口服胶囊制剂。口服胶囊制剂优选为肠胶囊。

绘图的简短描述

图1显示静脉注射1mg和口服30mg以胃肠(GI)-粘膜传递系统形式存在的FL给予巴格犬后的血浆荧光素(FL)浓度-时间曲线。在图中，□：HP-55^R系统。○：Eudragit^R L100系统和◇：Eudragit^R S100系统。每个值表示三或四个对象的平均值±S.E.。

图2显示静脉注射和口服给予以GI-粘膜传递系统形式存在的125μg的G-CSF至巴格犬后的总白细胞(WBC)动力学。在图中，□：HP-55^R系统。○：Eudragit^R L100系统和◇：Eudragit^R S100系统。每个值表示三个对象的平均值±S.E.。

图3显示在口服给予以Eudragit^R L100 GI-粘膜传递系统形式存在的125μg的G-CSF至巴格犬后，HCO-60^R和柠檬酸对WBC动力学的影响。在图中，△：HCO-60/柠檬酸(100/100)。□：HCO-60/柠檬酸(100/150)。○：HCO-60/柠檬酸(100/200)和◇：HCO-60/柠檬酸(50/200)。每个值表示三个对象的平均值±S.E.。

图4显示在口服给予以Eudragit^R L100 GI-粘膜传递系统的形式存在的125μg的G-CSF至巴格犬后血清G-CSF浓度-时间曲线。每个值表示三个对象的平均值±S.E.。

图5显示十二指肠内给予(a)HP-55^R、(b)Eudragit^R L100、(c)Eudragit^R S100 GI-粘膜传递系统后在大鼠肠道中的分布。将小肠分为五个部分且每一个部分的长度为12-15cm。

实施本发明的优选实施方案

用于本发明胃肠药物传递的口服制剂的特征在于，所述制剂包含用于使制剂粘附于消化道中选择部位的粘附部位控制层，用于包含有药物的药物运载层和用于保护在药物运载层中的药物的保护层，且药物运载层存在于保护层与粘附部位控制层之间，并且粘附部位控制层可附着于保护层。

当口服给予本发明制剂时，粘附部位控制层溶解于消化道中的特定部位。由粘附部位控制层在消化道中的特定部位的这种溶解控制药物运载层粘附于消化道的粘膜部位。口服给予制剂后，保护层阻止消化汁免于侵袭到药物运载层中且使药物运载层免于释放药物，并且在制剂附着于消化道粘膜后，也阻止消化汁和消化酶免于渗透到药物运载层中。通过保护药物分子免于消化酶的侵袭和在长时间内保留浓度梯度，来改善口服给予药物的生物利用度

粘附部位控制层包含阻止药物早期破裂释放并在消化道中选择的特定贴剂(粘合)部位溶解的物质。一般由pH依赖的肠聚合物例如羟基丙基甲基纤维素邻苯二甲酸酯(HP-55^R)、丙烯酸甲酯共聚物(Eudragit^R L)、丙烯酸甲酯共聚物-LD(Eudragit^R LD)和甲基丙烯酸共聚物-S(Eudragit^R S)制备粘附部位控制层。粘附部位控制层的厚度一般为20至100μm，优选为30至70μm，且更优选为40至50μm。

药物运载层为中间层，其存在于保护层与粘附部位控制层之间。药物运载层包含药物和粘合剂。当粘附部位控制层在消化道的选择部位溶解时，粘合剂用于将药物运载层粘附于消化道的粘膜上。

包含在药物运载层中的药物的类型不受具体限制，且优选为那些当口服给药时具有低的生物利用度的药物。这些药物在胃肠道吸收，特别是在肠道吸收为优选。实例包括生理活性蛋白质或肽(例如，粒细胞集落刺激因子(G-CSF)、干扰素包括干扰素-α、β和γ、促红细胞生成素、白介素、生长激素、钙调蛋白和胰岛素)、以及DNA或RNA包括寡-或多-核苷酸(DNA可以质粒形式存在)、芳香族类、抗原或抗体(例如肉毒杆菌毒素)和细胞(例如胰岛)。更具体地讲，实例包括G-CSF、英地那韦和干扰素。

通过使增塑剂混合到以下聚合物或胶中，包括：例如羧基乙烯基聚合物、丙烯酸酯/丙烯辛酸酯共聚物、2-乙基己基丙烯酸酯/乙烯基吡咯烷酮共聚物、丙烯酸酯silkbroin共聚物树脂、丙烯酸甲酯/2-乙基己基丙烯酸酯共聚物树脂、阿拉伯胶、聚(乙烯醇)、聚乙烯吡咯烷酮、甲基纤维素、聚异戊二烯、聚丙烯酸酯和聚丙烯酸钠，随后用水捏合混合物，可制备用于将药物运载层粘附到消化道粘膜上的粘合剂。例如，通过捏合0.8g的Hiviswako^R 103、250μl的PEG 400和2ml纯化水，可制备粘合剂。

当载体用作药物运载层时，载体的实例包括用药物浸泡的多孔底物例如聚酯纤维、薄布、薄纸和合成纸或合成纤维素聚合物或肠聚合物制备的薄膜。

当凝胶层用作药物运载层时，通过使药物的水溶液、药物的粉末、或药物的固体分散液、或微囊或者毫微(nano-)囊药物与凝胶形成的聚合物例如羧基乙烯基聚合物的浓溶液混合，可制备凝胶层。为替代凝胶层，可使用经将药物和粘合剂例如Hiviswako 103^R加入到亲水性蜡例如聚乙二醇400(PEG 400)中制备的亲水性蜡。当把毫微囊化或微囊化应用于药物时，使用羟基丙基甲基纤维素邻苯二甲酸酯(HP-55^R)作为毫微囊或微囊的壁以在附着到胃肠壁后产生药物的迅速释放。

另外，通过把吸收促进剂例如聚氧乙基化蓖麻油衍生物、癸酸和乌索脱氧胆酸等配制到药物运载层中，可进一步改善药物的生物利用度。或者，通过在药物运载层中配制蛋白酶抑制剂例如抑肽酶，能够有效抑制肽或蛋白质药物的水解降解且还能够改善药物的生物利用度。或者，通过把掺入到所吸收的药物(例如维拉帕米和环孢素)的排泄中的转运蛋白抑制剂像P-gp配制到药物运载层中，能够改善药物的生物利用度。

如以下解释的那样，在本发明中使用的药物运载层可以薄膜形式存在或可存在于保护层制备的半球形的内部空间中。当药物运载层以薄膜形式存在时，薄膜的厚度一般为20至100μm，优选为30至70μm，且更优选为40至50μm。

保护层(衬里层)的功能是用于保护药物运载层中的药物且以薄膜或壁例如半球形的形式存在，它是由水不溶性聚合物、腊或它们的混合物制备的，以抑制药物渗透到药物运载层和消化酶中。例如通过使用水不溶性药用聚合物如乙基纤维素、氨基烷基异丁烯酸酯共聚物(Eudragit RS)、乙酸纤维素、甲壳质和脱乙酰壳多糖、或腊例如硬脂酸、硬脂醇、白色蜂腊、可可脂、硬脂肪、纯的紫胶、多氧基40硬脂酸酯、鲸腊醇和聚氧乙基十二烷基醚，可制备保护层。保护层的厚度一般为20至100μm，优选为30至70μm，且更优选为40至50μm。当保护层以半球形形式存在时，半球的大小不受具体地限制。例如，半球的内部深度为50至500μm，且半球的内径(口径)为20至800μm，优选为50至500μm，且更优选为100至300μm。

按照本发明，药物运载层存在于保护层与粘附部位控制层之间。其中药物运载层存在于保护层与粘附部位控制层的那些实例包括(1)其中粘附部位控制层、药物运载层和保护层分别以薄膜形式存在，且这三层按照顺序层压(在下文称作第一个实施方案的制剂)和(2)其中保护层以半球形形式存在，药物运载层存在于半球形的内部空间中，且粘附部位控制层覆盖于半球的出口部分(在下文称作第二个实施方案的制剂)。以下将详细描述用于制备以上提及的在第一个和第二个实施方案中的制剂的方法，它们为本发明的典型实例。

为制备第一个实施方案的制剂，通过使用以上提及的水不溶性聚合物或腊，形成用于保护层的薄膜。更具体的讲，将水不溶性聚合物或腊溶于有机溶剂例如乙醇中，把生成的溶液浇(cast)在聚四氟乙烯板上，且蒸发溶剂。例如，将550mg乙基纤维素和150μl柠檬酸三乙酯溶于5ml二氯甲烷和甲醇(4∶1)的混合物中并把生成的溶液浇铸在聚四氟乙烯板上。

接着，如以上解释的那样，在保护层上形成药物运载层。在保护层上可应用粘合剂并然后把含有药物的载体附着于其上以形成药物运载层，或者，可将药物和粘合剂(例如凝胶形成的聚合物)混合并然后应用于保护层上。

作为粘附部位控制层，可使用由如同以上解释的肠聚合物制备的具有20至100μm厚度的薄膜，例如，将225mg的HP-55^R(Shin-etsu化学工业有限公司)和25μl柠檬酸三乙酯溶于5ml二氯甲烷和甲醇(4∶1)的混合物中，且把生成的溶液浇铸在聚四氟乙烯板上以形成薄膜。作为另一个实例，使用通过将225mg的Eudragit^R S100或Eudragit^R L100和150μl柠檬酸三乙酯溶于二氯甲烷和甲醇(4∶1)的混合物中并把生成的溶液浇铸在聚四氟乙烯板上来制备的薄膜。通过把这样的薄膜附着在含有粘合剂等的药物运载层上且把三层的薄膜切割成适当的大小，可制备本发明第一个实施方案的制剂。另外，为防止药物等从处于保护层与粘附部位控制层之间的药物运载层的边缘泄漏，优选通过喷洒水不溶性物质例如硬脂酸细的粉末来密封制剂。

迄今为止，薄膜贴剂制剂的大小并不受限制，所述制剂能够填充到明胶胶囊或肠聚合物制备的肠胶囊中。例如，所述大小可为3×3mm的正方形和直径5mm的圆形。当填充到成堆的胶囊中时，为防止薄膜彼此粘合或粘牢，优选通过喷撒硅酸镁粉末应用润滑处理。

为制备在第二个实施方案中的制剂，通过把水不溶性聚合物或腊制备的微型胶囊或微囊切割成一半，可制备在本发明中使用的以半球形的形式存在的保护层。以常规方法经使用水不溶性聚合物例如乙基纤维素或Eudragit RS100，制备微型胶囊或微囊，且然后在中心把生成的胶囊切割成两片，把内部刮出以制备以半球(碗状)形式存在的空心半微型胶囊或半微囊，它们用作保护层。为制备药物运载层，将药物与凝胶形成的聚合物混合并填充到半微型胶囊或半微囊中。通过使用凝胶形成的聚合物把肠聚合物制备的薄膜附着于半微型胶囊或半微囊的上面部分以使半微囊盖帽，可形成粘附部位控制层。或者，以常规方法通过使用水不溶性聚合物例如乙基纤维素或Eudragit^R RS100，可制备含有药物和粘附聚合物的微型胶囊或微囊且在中心把生成的胶囊切割成两片。然后，通过使用凝胶形成的聚合物把肠聚合物制备的薄膜附着于半微型胶囊或半微囊的上面部分以使半微囊盖帽，可形成粘附部位控制层。

或者，为大量制备在第二个实施方案中的制剂，以与第一个实施方案的制剂中使用的制备保护层的相似的方法，通过使用水不溶性聚合物或腊形成薄膜。生成的薄膜放在具有许多在花排列(flowerarrangement)中使用的微米顺序规则排序的凸出物例如青蛙的多刺的物体上。经微型机技术制备的金属模具也可用作在其上面放置薄膜的物体。在加热至高温下，使薄膜静置数小时，然后将其冷却以制备具有50至500μm的深度和20至800μm的口径的微容器形式存在的具有许多空腔的薄膜。

为把药物填充到在薄膜上形成的微容器样(micro-container-like)的空腔中，可使用固相方法和液相方法两种方法。在固相方法中，于固体条件下以固定的量把药物与粘合剂混合并然后把生成的混合物填充到微容器样的空腔中。在液相方法中，借助固相方法把粘合剂注射到这些空腔中，并借助微量注射器把药物溶液注射到这些空腔中。

然后，提供粘附部位控制层(由肠聚合物制备的薄膜)以使覆盖微容器样的空腔的上部。通过预先在粘附部位控制层上应用粘合剂，可将粘附部位控制层与具有微容器样的空腔的薄膜彼此相互粘附，且应用于具有微容器样的由药物填充的空腔的薄膜。当药物具有耐热性时，通过加热压制的方法，粘附部位控制层可与具有微容器样的由药物填充的空腔的薄膜粘附。

将生成的薄膜切割成小片，薄膜具有许多填充有药物的空腔且用粘附部位控制层覆盖这些空腔，每片含有一个腔以制备在本发明第二个实施方案中的制剂。可进行机械切割或通过使用显微镜下的激光切割。

参照以下实施例将更具体阐释本发明。然而，本发明范围不局限于以下实施例。

实施例

实施例A

材料

从Kirin Brewery有限公司(东京，日本)得到G-CSF溶液(500μgmL^-1)。从Shin-etsu化学工业有限公司(东京，日本)得到羟基丙基甲基纤维素邻苯二甲酸酯(HP-55)。从Higuchi公司(东京，日本)得到Eudragit S100和L100(Rohm Pharm，Darmstadt，德国)。从Wako纯化学工业有限公司(Osaka，日本)得到羧基乙烯基聚合物(Hiviswako103)、乙基纤维素(EC，10cp)和柠檬酸三乙酯。从Nikko化学有限公司(东京，日本)得到聚氧乙基化蓖麻油衍生物，60μmol(HCO-60)。从Nacalai Tesque公司(Kyoto，日本)得到聚乙二醇(PEG)400、苏丹黑、蔗糖和柠檬酸。从Kanto化学有限公司(东京，日本)得到荧光素(FL)、甲醇和二氯甲烷。从Kyowa化学工业有限公司(Takamatsu，日本)得到硅酸镁。从Yoshida有限公司(Himeji，日本)得到明胶胶囊(0号)。从Nippon Nousan有限公司(Yokohama，日本)得到用于该研究的雄性巴格犬(10.0-12.5kg)和标准固体市售食品餐(实验室D储备液)。从SLC(Hamamatsu，日本)得到大鼠。所使用的所有其它的材料属于试剂级别且被接受使用。

制备GI粘膜粘附传递系统

通过铸型/溶剂蒸发技术，从含有增塑剂的EC溶液制备衬里层(保护层)。通过将550mg EC溶解于5ml二氯甲烷和甲醇(4∶1)的混合物中并加入150mg柠檬酸三乙酯以使EC增塑，制备增塑聚合物溶液(11％，W/V)。为制备用于在大鼠的GI道中保留/转送的试验薄膜，向混合物中加入3.5mg苏丹黑。将已增塑的EC溶液浇铸在10×10cm聚四氟乙烯板上，且在6℃下蒸发溶剂12小时。在从板上除去后，在80℃下经热结合将相同大小的药物运载层、纤维素膜粘附。之后，把含有药物运载层的衬里层切割为1.0×10.0cm。EC薄膜本身的厚度为48.3±2.7μm，且总厚度为115.3±0.9μm。

通过相同的方法，从肠聚合物HP-55、Eudragit L100和S100也可分别制备pH敏感的表面层(粘附部位控制层)。即将550mg的HP-55和50μl柠檬酸三乙酯溶解于10ml二氯甲烷和甲醇(4∶1)的混合物中。相似地将550mg的Eudragit L100或Eudragit S100溶解于加有100μl柠檬酸三乙酯的10ml二氯甲烷和甲醇(1∶1)的混合物中。把每一种溶液浇铸在10×10cm聚四氟乙烯板上，在6℃下制备pH敏感的薄膜12小时。在从板上除去后，把pH敏感的薄膜切割为1.0×10.0cm。肠薄膜的厚度对HP-55为39.0±2.5μm，对Eudragit L100为36.3±2.2μm和对Eudragit S100为37.7±2.2μm。通过使0.8gHiviswako 103、250μl PEG 400和2ml水混合，制备粘膜粘附胶。在粘合好后，把胶均匀铺在pH敏感的表面层上。

如下进行药物填充；首先，用400μl含有柠檬酸(100、150或200mg)和HCO-60(50或100mg)的溶液润湿药物运载层并在50℃下充分干燥2小时。之后，将药物溶液填充到药物运载层上。为FL的研究，将200μl的FL溶液(150mg/ml)填充。为G-CSF的研究，将浓度为500μg/ml的180μl或250μl的G-CSF溶液填充。在冰箱中将簿层(sheet)充分干燥12小时后，借助Hiviswako胶把pH敏感的表面层粘附到药物运载层上。将三个分层的膜切割为3.0×3.0mm小片，且用微粉化的硬脂酸和硅酸镁处理小的薄膜，以覆盖于薄膜的边缘并防止薄膜彼此粘着。最后，将薄膜填充到含有作为赋形剂的微粉化蔗糖的0号HP-55胶囊中。如下制备HP-55胶囊。用二氯甲烷和甲醇(4∶1)的混合物溶解HP-55。把所得到的4.0w/v％溶液分别填充到0号明胶胶囊的体和帽中。蒸发后，通过溶解明胶层得到HP-55帽和体。

巴格犬的药物代谢动力学研究

在每一个实验中，使三只成年雄性巴格犬禁食过夜12小时，但允许自由接近水。然而，在实验期间，直到给予受试制剂4小时后才给予水。在所有研究中，每只犬口服接受一种受试胶囊。给药4小时后，给予450g市售固体食品餐和水。研究期间不给予另外的食物。在相同天数的时间内，进行所有试验以排除受到昼夜节律的影响。在上午10∶30，用20ml水进行给药。给药前30分钟，从颈静脉内取出对照组血样0.5ml。每只犬接受一含有30mg的FL或125μg的G-CSF胶囊。口服给予受试制剂后，在0、1、2、3、4、5和6小时从颈静脉中收集0.5ml血样用于FL研究，并在0、1、1.5、2、3、4、6和8小时研究G-CSF。将用于G-CSF的ELISA试验的血样收集在EDTA中。在12,000rpm下，经离心血样5分钟得到用于FL试验的血浆部分或用于G-CSF的血清部分。于-80℃下，在冷冻器中立即冷冻这些血浆和血清样品直到分析。一周后，将FL或G-CSF的静脉溶液注射到相同的犬中。受试溶液浓度为1.0mg/ml(FL)和500μg/ml(G-CSF)。静脉剂量分别为10mg(FL)和125μg/kg(G-CSF)。给药后，在0、5、10、20、30、40分钟、1和2小时收集血样。在-80℃下也贮存血浆样品直到分析。

G-CSF在巴格犬中的药效学研究

两周后口服给予含有125或90μg的G-CSF的受试GI粘膜粘附传递系统至相同的巴格犬并在0、1、2、3、4、5、6、8、10和12小时从颈静脉收集0.5ml血样。最后血液取样刚完成后，所有血样用于分析总白细胞(WBC)数目。另外，也在给药后次日清晨、24小时收集血样，并测量WBC数。

在大鼠GI道中薄膜的保留和转运的测定

实验前，将体重300-350g雄性wistar大鼠禁食12小时。可自由饮水。在轻度乙醚麻醉下，在胃邻近幽门处进行开口术并通过该切口把10片其大小为1.0×2.0mm的受试薄膜给予十二指肠。为检测在GI道上的小薄膜，用黑色染料苏丹黑把薄膜的衬里层染色。缝合腹腔后，将每只大鼠留在笼子中。在给药后1、2、3、4、5和6小时，处死每只大鼠。分离出胃和全部长度的小肠并把胃和小肠两者铺展在薄片上。把幽门括约肌至回盲肠的全部小肠分为5份并在GI道中的剩余的薄膜进行目测检查并记录。之后，用数码相机DC-3Z(理光有限公司，东京，日本)照像并捕捉图象，并使用Cap View软件(Logitec，东京，日本)数字化且用PhotoDeluxe软件(Adobe)分析。使用数字彩色印刷机(索尼，东京，日本)打印出图片。

试验方法

血浆FL浓度

按照荧光分光光度法，测定血浆中的FL浓度。向200μl的犬血浆样品中，加入0.5ml甲醇。充分混合后，在12,000rpm下，将生成的混合物离心5分钟。向上清液中加入1ml的0.1N NaOH溶液和2ml蒸馏水并使用岛津RF-500荧光分光光度计，用468nm的激发波长和512nm的发射波长测定荧光密度。

对G-CSF的酶联免疫吸附测定

以如下酶联免疫吸附测定方法，测量血清G-CSF浓度。向平底96孔板的每孔中加入100μl蛋白质溶液后，向每孔中加入通过把已知量G-CSF加入到空白犬血清中制备的100μl血清样品或G-CSF标准溶液。在室温下，将96孔板孵育3小时。孵育后，用缓冲液洗涤96孔板。向每孔中加入200μl结合于碱性磷酸酶的抗G-CSF多克隆抗体并孵育2小时。洗涤后，加入50μl的NADPH并孵育1小时。加入含有乙醇和INT-紫(violet)的缓冲溶液并孵育0.5小时。加入2N硫酸后，在490nm下，使用微板读数器测定每孔的光密度。就我们的试验而言，我们使用偶合三级log-logit转化的权重最小二乘方回归方法。

总白细胞(WBC)计数

通过测量循环WBC计数评价G-CSF的药理作用。使用基质溶解剂稀释和均化后，将经20μl的EDTA处理的血样用于测量WBC。使用自动微细胞计数器(Sysmex，F-500)将基质溶解的血细胞计数。用一份血样进行三次测量。将WBC数目表达为相对值，该值通过使给药后在每一个时间点上的WBC数目除以各自的值即给药前的WBC数目来测定。

数据分析

从血浆药物浓度-时间数据测定以下药代动力学参数。Cmax为最大药物浓度，Tmax为达到Cmax所需的时间，并且这些值作为测量值得到。使用达到最后测量的药物浓度的线性梯形规则，计算静脉和口服给药后的血浆或血清药物浓度-时间曲线下的面积(AUC)和第一时间曲线下的面积(AUMC)。经AUMC/AUC计算口服给药后平均残留时间(MRT)。经以下等式BA＝AUC_口服·Dose_静脉/AUC_静脉·Dose_口服，从Dose_i.v.、AUC_i.v.和AUC_oral计算生物利用度程度(BA)。

从以下等式计算G-CSF的口服剂量的药物利用度(PA)：F＝(AUC_{0-48，口服}×Dose_静脉)/(AUC_{0-48，静脉}×Dose_口服)，其中AUC_{0-48，口服}为每一只接受G-CSF GI粘膜粘附传递系统或静脉溶液的犬的时间0至48小时药理学效应-时间曲线下各自的面积。Dose_静脉和AUC_{0-48，静脉}分别为平均剂量和所有静脉给予G-CSF溶液的犬在时间0至48小时药理学效应-时间曲线下面积。至于静脉给予G-CSF溶液，当效果回复到给药前水平时，测量时间0至48小时的药理作用。

统计

所有数值表达为它们的平均值±S.E.。当p＜0.05(单侧t-检验)时，统计差异假定为具有可重现性。

结果

用FL配制的GI粘膜粘附传递系统的药物代谢动力学研究

为研究以GI粘膜粘附传递系统口服给药后的FL药物代谢动力学，制备包含30mg的FL的GI粘膜粘附传递系统并给予三只巴格犬。

在该GI粘膜粘附传递系统的研究中，使用三种类型的pH敏感表面层。它们为HP-55、Eudragit L100和S100。口服给予这三种类型的GI粘膜粘附传递系统后，得到如在图1中显示的血浆FL浓度对时间的分布。在HP-55和Eudragit L100两者粘膜粘附传递系统情况下，在口服给予犬之后1小时和1.5小时，血浆FL浓度开始增加且分别在2和3小时达到峰值水平Cmax。然而，在Eudragit S100的GI粘膜粘附传递系统情况中，存在大约2小时的吸收滞后时间。此后，血浆FL浓度开始增加并在5小时达到Cmax。用这些数据进行非室性药代动力学分析并且结果显示在表1中。在HP-55和EudragitL100的GI粘膜粘附传递系统之间AUC值不存在显著性差异。然而，来自Eudragit S100的GI粘膜粘附传递系统的AUC明显小于它们，因为存在大的吸收滞后时间，原因是传递至小肠的下部且FL的吸收在口服后8小时内并不结束。因为该研究是探索性研究，进行血液取样至8小时。为测定来自三种GI粘膜粘附传递系统的FL的生物利用度，静脉给予FL至相同的犬，所得结果显示在图1中。通过比较静脉注射相同量的FL后得到的AUC值，经计算来自所述三种制剂的FL的生物利用度分别为79.1±7.59％、85.1±7.85％和56.1±8.16％。

表1

FL以粘膜粘附传递系统形式给予巴格犬后的药代动力学参数

Cmax Tmax AUC MRT(h) BA(％)

(μg/ml) (h) (μg/ml)

HP-55 0.40±0.03 2.33±0.82 1.24±0.12 3.45±0.18 79.1±7.59

Eudragit L 0.41±0.04 3.33±0.41 1.34±0.12 3.38±0.26 85.1±7.85

Eudragit S 0.40±0.02 5.00±0.00 0.88±0.13 4.32±0.17 56.1±8.16

每个值表示三种研究对象的平均值±S.E.。

用G-CSF配制的GI粘膜粘附传递系统的药效学研究

基于FL的研究，GI粘膜粘附传递系统被应用于蛋白质。因为我们进行许多关于以包含有克隆传递系统的口服传递系统形式配制的G-CSF的药效学评价研究，G-CSF被用作模型蛋白质。将125μg量的G-CSF配制成三种GI粘膜粘附传递系统并口服给予犬。图2显示G-CSF的药理活性的时间过程。在HP-55 GI粘膜粘附传递系统的情况下，给药后，与给药前水平相比较，WBC增加1.4倍。然而，在Eudragit L100粘膜粘附传递系统中，WBC更比HP-55 GI粘膜粘附传递系统的值增加1.7倍。在Eudragit S100 GI粘膜粘附传递系统的情况中，WBC并非像在Eudragit L100 GI粘膜粘附传递系统所观察到的那样增加。为测定来自三种粘膜粘附传递系统的G-CSF的药理利用度(PA)，将相同量的G-CSF注射给予相同的犬并监测G-CSF的药理活性。插图显示结果。通过比较总WBC的成倍增加下的面积，三种GI粘膜粘附传递系统的PA分别为5.5％(HP-55 GI粘膜粘附传递系统)、23％(Eudragit L100 GI粘膜粘附传递系统)和6.0％(EudragitS100 GI粘膜粘附传递系统)。

为对G-CSF的药理作用的剂量依赖性进行试验，将90μg的G-CSF配制成Eudragit L100 GI粘膜粘附传递系统并口服给予相同的犬。结果也显示在图中。总WBC的增加小于从125μg剂量研究中预测的结果，且与给药前水平相比较最大增加为1.2倍。

在GI粘膜粘附传递系统中，配制添加剂例如表面活性剂、HCO-60和有机酸、柠檬酸。因此，为研究添加剂对G-CSF的药理活性的作用，将配制的柠檬酸的量从299mg减少至150和100mg，而表面活性剂、HCO-60的量为恒定，100mg。如在图3中显示的那样，当配制的柠檬酸的量从200mg减少至150mg时，G-CSF的PA减少。然而，经将配制的柠檬酸的量从150mg减至100mg，PA并没有明显变化。另一方面，通过将HCO-60的配制量从100mg减至50mg，HCO-60对G-CSF的PA的增强作用明显减少。

口服给予犬后G-CSF的药代动力学研究

由于含有125μg的G-CSF的Eudragit L100 GI粘膜粘附传递系统显示G-CSF的最高PA，将相同的制剂给予犬并经ELISA方法测量血浆G-CSF水平。如在图4中显示的那样，口服给药后血浆G-CSF水平开始增加并在1小时达到它的峰水平100pg/ml。之后，血浆G-CSF水平迅速下降。这些结果强烈提示G-CSF从GI道吸收并作为完整形式进入系统循环。

薄膜在大鼠GI道中的停留和转运的测定

为测定三种GI粘膜粘附传递系统的粘合特性，制备三种更小的和彩色的生物粘附薄膜(1.0×2.0mm)并把受试薄膜给予大鼠的十二指肠。如在图5中显示的那样，通过腹部切口监测生物粘附薄膜的停留和转运。对HP-55生物粘附薄膜而言，给药后1和2小时，在1号小肠部分即十二指肠检测到大部分所给予的薄膜。另外，所述薄膜粘合于十二指肠大约3小时。然而，给药后4小时，10片薄膜中有8片移动到大鼠2号小肠部分，并且之后移动到小肠更低的部分。在Eudragit L100生物粘附薄膜的情况中，给药后2小时期间薄膜从1号小肠部分消失并停留在2号部分大约2小时。之后，薄膜逐渐转移到3号和4号小肠部分。另一方面，Eudragit S100生物粘附薄膜从1号部分逐渐转移到4号部分。这耗费大约3小时。然后，薄膜附着于5号部分并在那里停留大约3小时。

实施例B

实施例1

将Hiviswako 103胶应用于保护层(衬里层)的EC薄膜(16cm×1.6cm)中。把以相同大小的薄纸浸泡在药物溶液中，该溶液通过将100μl的1.25mg/ml G-CSF溶液、100mg的HCO-60(聚氧乙基化的蓖麻油衍生物)和200mg柠檬酸溶解在200μl水中来制备。将薄纸干燥并粘附于以上的EC薄膜上以得到药物运载层(中间层)。相同大小的HP-55薄膜也使用Hiviswako 103胶，并粘附于中间层上以得到粘附部位控制层(表面层)。把生成的三层分层的薄膜切割成3.0×3.0mm小片，且用硅酸镁粉末在切割表面包衣，并填充到HP-55胶囊中。把乳糖填充到空间以得到口服贴剂DDS制剂。

实施例2

除在制备药物运载层(中间层)中将100mg乌索脱氧胆酸和2,000单位抑肽酶(水解酶抑制剂)加入到药物溶液中以外，以与实施例1相似的方法制备口服贴剂DDS制剂。

实施例3

首先制备凝胶化药物运载层(中间层)。将英地那韦(100mg)与0.8ml水和100μl聚乙二醇400混合，并加入300mg Hiviswako 103。把生成的混合物充分捏合以得到胶。将包含英地那韦的胶应用于与实施例1相同大小的EC薄膜(衬里层)。使HP-55薄膜作为表面层薄膜粘附。之后，以与实施例1相同的方法进行硅酸镁处理，并把生成的薄膜和适宜量的乳糖填充到两HP-55的0号大小肠胶囊中以得到英地那韦的口服贴剂DDS制剂。

实施例4

除在制备药物运载层(中间层)中将200mg为P-gp转运蛋白抑制剂的环孢素加入到药物溶液中以外，以与实施例3相似的方法制备英地那韦的口服贴剂DDS制剂。

实施例5

将乙基纤维素(EC)(550mg)和50μl柠檬酸三乙酯溶解于5ml二氯甲烷和甲醇(4∶1)的混合物中。把生成的溶液倾入到10cm×10cm聚四氟乙烯板上，并蒸发溶剂以形成EC薄膜。把EC薄膜放入到具有最大直径200μm和深度80μm的凸起物的金属模具中，且在175℃下压制10分钟。然后把薄膜冷却至室温以形成具有微容器形式的EC薄膜。使作为药物的G-CSF(100μl)、50mg的HCO-60(聚氧乙基化蓖麻油衍生物)和200mg柠檬酸溶解于1ml水中以制备药物溶液。将药物溶液冷冻干燥，且把粉末化的药物放置于具有微容器形式的EC薄膜上并用不锈钢刮刀均匀填充到微容器中。用不锈钢刷清除残留在EC板上的粉末。为制备为肠聚合物的HP-55的表面层薄膜，将300mg的HP-55和50μl柠檬酸三乙酯溶解于10ml二氯甲烷和甲醇(4∶1)的混合物中。把生成的溶液倾入到15×15cm聚四氟乙烯板上，并蒸发溶剂以形成HP-55薄膜。作为用于粘合的胶，在研钵中，用研杵搅拌0.8g的Hiviswako 103、2ml蒸馏水和250μl聚乙二醇400。把用于粘合的胶铺展在HP-55薄膜上并且粘附到具有填充有药物的微容器的EC薄膜上。在显微镜下，将生成的分层的薄膜切割成大约500×500微米的正方形或直径大约500微米的圆形以得到具有三层分层结构的非均匀微囊制剂。使用UV激光划线机械LYH-100AA(Ushio Electronics公司)，在4倍的高调整波的YAG激光、266nm的波长、光束宽大约30μm和105mV×0.77秒的输出下，以追踪描述特性“0”的方式，通过激光进行切割。

实施例6

按照常规方法(Ohyama Takao，等，Ishoku[移植]，第34卷，第4期，第174-185页，1999)，从大鼠胰腺得到胰岛。用悬浮在0.1％羧甲基纤维素溶液中的胰岛填充微量注射器。在显微镜下，将胰岛注射进入到在经与实施例5中相似的方法用微量注射器制备的EC薄膜上的微小容器中。通过与实施例5中相似的方法制备HP-55薄膜。把Hiviswako 103胶喷洒在HP-55薄膜上并粘附到其中微小容器填充有活细胞的EC薄膜上。在显微镜下，把生成的分层的膜围绕微小容器切割成大约500×500微米的正方形或直径大约500微米的圆形物，得到具有三层结构的非均匀的微囊制剂。

实验实施例1：体内生物利用度方法的评价

口服给予巴格犬在前述实施例1至4中制备的口服贴剂DDS制剂。给药后，随时间收集循环血液并在使用G-CSF制剂的情况下检测作为药物效力指示剂的循环血中的白细胞数。G-CSF制剂和英地那韦制剂的剂量分别为125μg/犬和100mg/犬。巴格犬为体重10至11kg的雄性成年犬并在禁食条件下处理。

G-CSF制剂的治疗和药理试验的结果显示在以下表2中。

表2

给药后白细胞数目

给药前 6hr 12hr 24hr 48hr

G-CSF溶液 100 105 103 97 106

实施例1的G-CSF制剂 100 111 132 130 108

实施例2的G-CSF制剂 100 120 141 139 109

G-CSF溶液为填充在由HP-55制备的肠胶囊中的市售G-CSF注射制剂。

给药前巴格犬中的循环血液中白细胞数目定义为基线(100％)且白细胞数目的变化表示为相对值。

给予英地那韦制剂的结果显示在以下表3中。

表3

口服给药后英地那韦在循环血浆中的浓度(μg/ml)

0hr 2hr 4hr 6hr 8hr 12hr

片剂 0 0 0 0 0 0

实施例3的制剂 0 0.33 0.21 0.17 0.13 0.08

实施例4的制剂 0 0.58 0.35 0.27 0.19 0.11

实施例C

以如在实施例A中相似的方法，除用10,000,000IU/ml的干扰素-α溶液替代G-CSF溶液以外，制备含有干扰素-α的GI粘膜粘附传递系统，且每只巴格犬给予5,000,000IU的干扰素-α(0.5ml的溶液)。以如在实施例A中相似的方法，评价血清干扰素-α浓度。所得到的数据显示在以下表4中。

表4

给药后血清干扰素浓度(pg/ml)

1hr 2hr 3hr 4hr 6hr

310±58 343±61 107±37 52±11 50±17

实施例D

将乙基纤维素(EC)(550mg)和150μl柠檬酸三乙酯溶于5ml二氯甲烷和甲醇(4∶1)的混合物中。把生成的溶液浇在9.0cm×9.0cm聚四氟乙烯板上，形成EC薄膜。将EC薄膜放置于3.0cm×5.0cm的丙烯酸框板上。将100mg聚丙烯酸、1g HCO-60和2g柠檬酸溶于水以制备10ml总体积的溶液。加入1.5ml由此得到溶液和0.52ml含有750μg的p24抗原和在PBS中的150μg霍乱毒素的溶液。使样品在冰箱中贮存过夜以形成薄膜。将通过EudragitR L制备的薄膜粘合于其上，并然后把生成的分层的薄膜切割成更小尺寸的15片薄膜，且每片进一步切割成1.0mm×1.0mm。用硅酸镁粉末和硬脂酸细粉末把切割的面包衣。

工业应用

基因重组技术已能够大规模制备多种具有有用的生理活性的蛋白质和肽，但是它们的给药途径局限于注射。考虑到患者的QOL(生活质量)，剂型优选为口服制剂。然而，蛋白质和肽将经在消化道腔中接受胃和肠中胃酸、胃蛋白酶和来自胰腺的蛋白水解酶的水解降解。

按照本发明，作为保护层的水不溶性聚合物或腊防止消化道腔中蛋白水解酶的侵袭。另外，包含在药物运载层中的粘合剂(例如聚丙烯酸酯聚合物)具有抑制水解酶的活性，且能够呈现抵御存在于消化道粘膜上的水解酶引起的水解降解。此外，多种水解酶抑制剂的制剂能够使药物的作用保留更长和更强。

另外，吸收后再排泄到消化道的药物的生物利用度能够被改善。蛋白酶抑制剂的抗AIDS药物环孢素和沙奎那韦被认为是由于通过在消化道上皮细胞中表达的P-gp重新排泄到消化道中而呈现低的生物利用度，当P-gp抑制剂配制为普通制剂时，在药物吸收部位不能达到有效的抑制作用，原因是制剂沿着消化道向下移动。通过把P-gp抑制剂配制为本发明的口服有效的贴剂型DDS制剂时，使在结合部位长时间保留排泄转运蛋白抑制剂并改善药物的生物利用度成为可能。

另外，口服给予抗原不能充分吸收，并且不能得到满意的免疫作用。按照本发明，也能够开发出获得有效吸收的抗原并改进免疫效力的口服疫苗。

Claims

1.一种用于胃肠药物传递的口服制剂，其包含用于使制剂粘附于在消化道中所选择部位的粘附部位控制层、用于包含药物和粘附剂的药物运载层和用于保护在药物运载层中的药物的保护层，其中药物运载层存在于保护层与粘附部位控制层之间，且粘附部位控制层可附着于保护层。

2.权利要求1的用于胃肠药物传递的口服制剂，其中粘附部位控制层、药物运载层和保护层中的每一个以薄膜形式存在，且将所述三个层层压。

3.权利要求2的用于胃肠药物传递的口服制剂，其中粘附部位控制层、药物运载层和保护层中的每一个的厚度为20至100μm。

4.权利要求1的用于胃肠药物传递的口服制剂，其中保护层以半球形形式存在，并且药物运载层存在于以所述半球形形式的保护层的内部空间，且其中粘附部位控制层覆盖于以所述半球形形式的保护层的出口部分。

5.权利要求4的用于胃肠药物传递的口服制剂，其中半球的内部深度为50至500μm，半球的出口部分的内径为20至800μm，且保护层和粘附部位控制层中的每一个的厚度为20至100μm。

6.权利要求1的用于胃肠药物传递的口服制剂，其中药物运载层为用药物浸泡的多孔薄片底物，或为含有药物的凝胶或腊的薄片或薄膜。

7.权利要求1的用于胃肠药物传递的口服制剂，其中药物运载层还包含一种或多种选自吸收促进剂、蛋白酶抑制剂和转运蛋白抑制剂的成分。

8.权利要求1的用于胃肠药物传递的口服制剂，其中保护层为由水不溶性聚合物或腊制备的薄膜或胶囊。

9.权利要求1的用于胃肠药物传递的口服制剂，其中粘附部位控制层为由肠聚合物制备的薄膜。

10.权利要求1的用于胃肠药物传递的口服制剂，其中所述药物为生理活性蛋白或肽。

11.权利要求1的用于胃肠药物传递的口服制剂，其中药物为粒细胞集落刺激因子、干扰素或英地那韦。

12.一种口服胶囊制剂，其通过将权利要求1的制剂填充到胶囊中制备。

13.权利要求12的口服胶囊制剂，其为肠胶囊。