CN116096240A

CN116096240A - 用于制备发酵食品的乳酸菌组合物

Info

Publication number: CN116096240A
Application number: CN202180039128.7A
Authority: CN
Inventors: B·科尔森; S·布洛赫; 盖尔·莱蒂·布克霍恩; N·克里斯滕森; 玛丽-阿涅斯·索斯; L·马夏尔; A·德皮耶里; F·拉雷雷
Original assignee: Section Hansen Co ltd; Gervais Danone SA
Current assignee: Section Hansen Co ltd; Gervais Danone SA
Priority date: 2020-05-29
Filing date: 2021-05-31
Publication date: 2023-05-09
Also published as: BR112022024304A2; EP4156949A1; US20230200406A1; JP2023528345A; WO2021240015A1

Abstract

本发明涉及用于生产发酵乳制品的组合物，包含：(i)起子培养物，包含葡萄糖发酵嗜热链球菌(St)菌株和葡萄糖发酵德氏乳杆菌保加利亚亚种(Lb)菌株，和(ii)葡萄糖缺陷型嗜热链球菌(St)菌株，其中所述St菌株是半乳糖发酵的，并且在编码葡糖激酶蛋白的glcK基因的DNA序列中携带突变，该突变使葡糖激酶蛋白失活或对该基因的表达具有负面作用。

Description

用于制备发酵食品的乳酸菌组合物

技术领域

本发明涉及用于生产诸如酸奶等发酵乳制品的组合物和方法。特别是，本发明涉及用于减少后酸化的组合物和方法。

背景技术

目前大多数用于生产发酵乳制品的方法可以用以下步骤来表征：

(a)通过添加包含能够代谢从存在于乳中的乳糖获得的葡萄糖的乳酸菌(lacticacid bacteria,LAB)的起子培养物，对乳基质进行发酵。

(b)在发酵过程中，LAB代谢葡萄糖并产生乳酸(酸化)，乳酸导致pH从最初的6.4-6.8(对于牛乳)下降到pH 3.8-4.7。

(c)一旦所讨论的发酵制品达到所需的pH，则通过快速冷却发酵的乳制品终止发酵。

例如，这种方法用于生产酸奶和酸奶饮料。

如果不冷却乳制品以终止发酵，该过程将继续进行，并导致产品在达到目标pH后进一步酸化，即后酸化。

快速冷却的一个缺点是，它会导致产品的质地损失。因此，省略快速冷却的步骤是可取的，而且会进一步节省单元操作，从而降低生产成本。

尽管在生产发酵乳制品的方法中存在快速冷却步骤，但仍然观察到后酸化，即在所需pH值时终止发酵后LAB产生乳酸。后酸化被认为是生产发酵乳制品的方法中最重要的问题之一。发酵乳制品在储存期间(包括加工、包装、运输和储存)pH值的进一步降低会导致酸度升高和保质期缩短的问题。

因此，后酸化对酸奶的保质期也有不利影响。根据不同的国家，酸奶的保质期从30天到50天不等。在这段时间内，后酸化会改变酸奶的质量，导致产品变酸(风味改变)和乳清高度分离(质地改变)。通常，在储存期间通过将产品保持在4℃和8℃的温度之间，来尽可能地保持酸奶的质量。在这个温度下，细菌只会有低活性。然而，在许多国家，在储存期间难以维持冷链。

因此，保质期延长的酸奶(ESL酸奶)的生产备受关注，尤其是在难以维持冷链的国家。生产ESL酸奶的现有方法包括发酵后的热处理步骤(通常为65℃30sec)。该处理导致用于发酵的细菌数量以及酵母和霉菌的数量显著降低。加热步骤还抑制了酸奶中存在的酶的活性。因此，该产品可以获得长达9个月的保质期，其中没有观察到或仅观察到低的后酸化和后风味变化。

然而，热处理对酸奶的质量有负面作用，并会导致风味和质地的改变。热处理的另一个负面作用是，通过诸如益生菌等活细菌存在而获得的健康益处受到削弱或丧失。

控制后酸化的一种方法是，用相对酸性的pH来生产乳制品。在这些方法中，LAB的进一步生长和乳酸的产生受到酸性pH的抑制。然而，乳酸的进一步产生只是受到抑制，而不是完全终止，这种方法显然不适合生产口味温和的发酵乳制品。

假设后酸化由保加利亚乳杆菌(L.bulgaricus)代谢活性的控制，并由肽的摄取引起，并且生成了具有氨基酸代谢缺陷的菌株来控制后酸化(US2010/0021586和WO2006/042862A1)。现有技术已经描述了控制后酸化的其他方法，包括基于使用以弱后酸化活性为特征的特定LAB菌株的方法(WO2010/139765)。

最小化后酸化的可选方法是基于在发酵期间控制蛋白质与乳糖的比例、控制缓冲能力以及将缓冲能力和pH维持在预定范围内(WO2013/169205)。然而，这种方法需要测定发酵过程中的许多工艺参数，并可能需要在发酵培养基中添加蛋白质或乳糖或缓冲剂，以确保在发酵过程中保持预定范围。

WO2013/160413公开了嗜热链球菌(Streptococcus thermophilus)菌株和德氏乳杆菌保加利亚亚种(Lactobacillus delbrueckii subsp.bulgaricus)菌株，所述菌株具有用于食品的天然增甜和降低发酵乳的乳糖含量的增强的特性，并公开了筛选和分离此类菌株的方法。

WO2015/193459公开了生产发酵乳制品的方法，该方法通过在发酵过程中耗尽乳基质中所含的乳糖而获得后酸化水平减少，导致在随后的储存过程中起子培养物不生长或生长极少。一个实施方案使用四种具有葡萄糖代谢缺陷的乳酸菌菌株的混合物，另一个实施方案使用乳糖缺陷型乳酸菌菌株混合物。

本发明的目的是，提供用于生产后酸化减少的发酵乳制品的组合物。

发明内容

本发明实现了这一目的，本发明关于用于生产发酵乳制品的组合物，包含：

(i)起子培养物，包含葡萄糖发酵嗜热链球菌(St)菌株和葡萄糖发酵德氏乳杆菌保加利亚亚种(Lb)菌株；和

(ii)葡萄糖缺陷型嗜热链球菌(St)菌株，其中所述St菌株是半乳糖发酵的，并且在编码葡糖激酶蛋白的glcK基因的DNA序列中携带突变，该突变使葡糖激酶蛋白失活或对该基因的表达具有负面作用。

众所周知，对于用于生产包含传统嗜热链球菌菌株和传统德氏乳杆菌保加利亚亚种菌株的发酵乳制品的传统起子培养物而言，在储存期间，即从乳的乳酸菌发酵结束到消费时，即使在冷藏温度下，也存在后酸化风险。这种后酸化是由乳酸菌在储存期间继续生长所致，导致发酵乳制品进一步酸化，以及形成异味，例如游离氨基酸，例如谷氨酸。

已经令人惊讶地发现，通过向传统起子培养物中加入葡萄糖缺陷型嗜热链球菌菌株，可以显著减少发酵乳制品中传统起子培养物的后酸化。这是一个非常令人惊讶的发现，因为是在怀有完全不同目的的情况下开发了葡萄糖缺陷型嗜热链球菌菌株，即增加发酵乳制品的天然甜味水平，而对后酸化的任何影响以前都没有被认识到，是出乎意料的。此外，葡萄糖缺陷型嗜热链球菌菌株不仅本身不会引起后酸化，而且还会明显减少传统起子培养物菌株的后酸化，这种效果是以前没有认识到的，并且是无法预测的。特别是，常规起子培养物菌株后酸化减少背后的机制并不明显，也非显而易见。

本发明的另一个优点是，葡萄糖阴性嗜热链球菌菌株会将乳基质的部分乳糖转化为葡萄糖，为发酵乳制品提供天然甜味，从而减少向产品加糖的需要，并降低乳基质的乳糖含量，使乳糖不耐受消费者受益。

在第二方面，本发明关于生产发酵乳制品的方法，包括用本发明的组合物接种和发酵乳基质。

在第三方面，本发明关于通过本发明的方法获得的发酵乳制品。

在第四方面，本发明关于本发明的组合物在制备发酵乳制品中的用途。

具体实施方式

定义

如本文所用，术语“乳酸菌”缩写为“LAB”，是指发酵糖，同时产生酸(包括乳酸作为主要产生的酸、乙酸和丙酸)的革兰氏阳性、微需氧或厌氧菌。工业上最有用的乳酸菌见于目“乳杆菌目(Lactobacillales)”，其包括乳球菌属的物种(Lactococcus spp.)、链球菌属的物种(Streptococcus spp.)、乳杆菌属的物种(Lactobacillus spp.)、明串珠菌属的物种(Leuconostoc spp.)、片球菌属的物种(Pediococcus spp.)、短杆菌属的物种(Brevibacterium spp.)、肠球菌属的物种(Enterococcus spp.)以及丙酸菌属的物种(Propionibacterium spp.)。乳酸菌，包括乳杆菌属物种和嗜热链球菌属物种的细菌，通常以用于批量起子繁殖的冷冻或冻干培养物形式或以所谓“直投式起子(DVS)”培养物的形式，提供给乳制品行业，用于直接接种到发酵容器或发酵桶中，用于生产乳制品，例如发酵乳制品。这种培养物一般称为“起子培养物”或“启子”。

除非本文另有说明或与上下文明显矛盾，否则在描述本发明的背景下(特别是在以下权利要求的背景下)对术语“一(a/an)”和“该/所述(the)”以及类似指示符的使用，应解释为涵盖单数和复数。除非另有说明，否则术语“包含”、“具有”、“包括”和“含有”应理解为开放式术语(即意味着“包括但不限于”)。除非本文另有说明，否则本文对数值范围的叙述仅仅是作为单独提及落在该范围内的每个单独数值的速记方法，并且每个单独数值都并入说明书中，如同其在本文被单独叙述一样。除非本文另有说明或与上下文有明显矛盾，否则本文描述的所有方法可以按任何合适的顺序进行。除非另外要求保护，否则对本文提供的任何和所有实例或示例性语言(例如，“诸如/例如”)的使用，只是为了更好地阐明本发明，并不对本发明的范围构成限制。说明书中的任何语言都不应被解释为表明任何非要求保护的元素对本发明的实施是必不可少的。

就本发明而言，表述“增加甜味”是指与在编码葡糖激酶蛋白的glcK基因的DNA序列中不携带突变的母菌株所产生的甜味相比，甜味增加，其中该突变使葡糖激酶蛋白失活或对该基因的表达具有负面作用。

表述“CFU”是指菌落形成单位。

就本发明而言，与乳酸菌菌株有关的表述“传统”是指葡萄糖发酵菌株。

本发明组合物的葡萄糖缺陷型嗜热链球菌菌株

在一些国家，酸奶的法律定义要求存在嗜热链球菌和德氏乳杆菌保加利亚亚种菌株。这两个物种都能生成合适数量的乙醛，乙醛是酸奶中重要的风味成分。

为了满足食品工业的要求，理想的是，开发新菌株，特别是在发酵制品中直接产生更多天然甜味(内在甜味)而不贡献额外的热量的嗜热链球菌菌株和德氏乳杆菌保加利亚亚种菌株。

嗜热链球菌是商业乳发酵中最广泛使用的乳酸菌之一，其中，该生物体通常用作混合起子培养物的一部分，其他成分是乳杆菌物种，例如用于酸奶的德氏乳杆菌保加利亚亚种。

嗜热链球菌只发酵乳糖分子的葡萄糖部分，并且当使用嗜热链球菌时，半乳糖在发酵乳制品中积累。在酸奶中，其中高酸浓度限制了发酵，游离半乳糖仍然存在。

为了确保嗜热链球菌菌株的生长性能尽可能最佳，已将嗜热链球菌的半乳糖发酵菌株暴露于选择性试剂2-脱氧葡萄糖。通常，抗2-脱氧葡萄糖抗性突变体在编码葡糖激酶的基因(glcK)基因和编码葡萄糖转运的基因中具有突变。分离出的抗2-脱氧葡萄糖的突变菌株DSM 28889和DSM 32227在葡糖激酶基因中有突变。除了葡糖激酶基因的突变外，DSM28889和DSM 32227都有意味着分泌的葡萄糖不会再被转运回细胞中的突变。

本文中的术语“抗2-脱氧葡萄糖”定义为，具体突变细菌菌株在40℃下孵育20小时后，在含有20mM 2-脱氧葡萄糖的M17培养基平板上进行划线培养时，具有生长成菌落的能力。培养基中2-脱氧葡萄糖的存在会阻止非突变菌株的生长，而突变菌株的生长不受影响或受到的影响不显著。可在抗性评估中用作敏感参考菌株使用的非突变菌株优选包括菌株DSM 25838和DSM 22934。

令人惊讶的是，尽管酸化时间受到推迟，但单独的抗2-脱氧葡萄糖突变体仍然完全能够酸化乳。因此，它们在发酵乳的应用中很有用，并且它们保留了母菌株酸化乳的能力，这是酸奶的特点。此外，发现当用突变体接种包含0.05％蔗糖的9.5％ B-乳并在40℃下发酵至少20小时时，突变体分泌了大量葡萄糖。同时，发酵乳中剩余非常低水平的乳糖。因此，使用这种菌株生产发酵乳制品对乳糖不耐受的人可具有重要意义。

因此，最终的发酵乳的内在甜味指数得以增加，这可以按Godshall(1988.FoodTechnology 42(11):71-78)的描述计算。

在本发明的一个方面，嗜热链球菌菌株是嗜热链球菌的半乳糖发酵突变菌株，其中该突变菌株在编码葡糖激酶蛋白的glcK基因的DNA序列中携带突变，其中该突变使编码的葡糖激酶蛋白失活或对该基因的表达具有负面作用。测量葡糖激酶活性水平或葡糖激酶基因表达水平的方法是容易知道的(Porter et al.(1982)Biochim.Biophys.Acta,709:178–186)，包括使用商业可得的试剂盒进行的酶测定和利用容易获得的材料进行的转录组学或定量PCR。

在本发明的优选实施方案中，本发明的葡萄糖缺陷型嗜热链球菌菌株是抗2-脱氧葡萄糖的。在本发明的优选实施方案中，本发明的抗2-脱氧葡萄糖嗜热链球菌菌株是DSM28889或DSM 32227。

本文所用的细菌“菌株”是指在生长或繁殖时基因保持不变的细菌。包括相同细菌的多样性。

本文所用术语“半乳糖发酵嗜热链球菌菌株”是指能够在M17培养基+2％半乳糖中/上生长的嗜热链球菌菌株。本文将半乳糖发酵嗜热链球菌菌株定义为，当以1％从过夜培养物中接种并在37℃下孵育24小时时，将含有2％半乳糖作为唯一碳水化合物的M17肉汤的pH降低到5.5或更低的嗜热链球菌菌株。

本文所用术语“突变使葡糖激酶蛋白失活”是指导致“失活的葡糖激酶蛋白”的突变，即如果存在于细胞中就不能发挥正常功能的葡糖激酶蛋白，以及阻止葡糖激酶蛋白形成或导致葡糖激酶蛋白降解的突变。

特别是，失活的葡糖激酶蛋白是，与功能性葡糖激酶蛋白相比，不能促进葡萄糖磷酸化为葡萄糖-6-磷酸，或者以明显降低的速率促进葡萄糖磷酸化为葡萄糖-6-磷酸的蛋白。与编码功能性葡糖激酶蛋白的基因相比，编码这种失活的葡糖激酶蛋白的基因在该基因的可读框(ORF)中包含突变，其中所述突变可以包括但不限于缺失、移码突变、引入终止密码子或导致氨基酸取代从而改变蛋白的功能特性的突变，或减少或消除该基因的转录或翻译的启动子突变。

在优选的实施方案中，该突变使葡糖激酶蛋白的活性(葡萄糖磷酸化为葡萄糖-6-磷酸的速率)减少至少50％，例如至少60％，例如至少70％，例如至少80％，例如至少90％。

葡糖激酶活性可以通过Pool等人(2006.Metabolic Engineering 8:456-464)描述的葡糖激酶酶促测定来测定。

本文所用术语“功能性葡糖激酶蛋白”是指(如果存在于细胞中)促进葡萄糖磷酸化为葡萄糖-6-磷酸的葡糖激酶蛋白。特别是，功能性葡糖激酶蛋白可以由包含ORF的基因编码，该ORF的序列对应于SEQ ID NO.1中位置1-966，或与对应于SEQ ID NO.1中位置1-966的序列具有至少85％的同一性，例如至少90％的同一性，例如至少95％的同一性，例如至少98％的同一性，例如至少99％的同一性。

两条序列的同一性百分比可以通过使用数学算法来确定，例如Karlin和Altschul(1990.Proc.Natl.Acad.Sci.USA 87；2264)的算法，Karlin和Alt-schul(1993.Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90；5873-5877)描述的改良算法；My-ers和Miller(1988.CABIOS 4；11-17)的算法；Needleman和Wunsch(1970.J.Mol.Biol.48；443-453)的算法；和Pearson和Lipman(1988.Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85；2444-2448)的算法。基于这些数学算法确定核酸或氨基酸序列同一性的计算机软件也是可用的。例如，核苷酸序列的比较可以用BLASTN程序进行，得分＝100，字长＝12。氨基酸序列的比较可以用BLASTX程序进行，得分＝50，字长＝3。对于BLAST程序的其余参数，可以使用默认参数。

在许多国家，将转基因生物(genetically modified organism,GMO)用于发酵乳制品是不被接受的。本发明相反提供了可以在发酵乳制品中提供理想的葡萄糖积累的天然存在的或诱导的突变菌株。因此，在本发明的优选实施方案中，突变菌株是天然存在的突变体或诱导的突变体。

本文所用“突变细菌”或“突变菌株”是指在基因组(DNA)中包含野生型DNA中不存在的一个或多个突变的天然(自发的、天然存在的)突变细菌或诱导的突变细菌。“诱导的突变体”是指通过人为处理而诱导突变的细菌，例如用化学诱变剂、紫外线或伽马射线等进行处理。相反，“自发突变体”或“天然存在的突变体”没有经过人为诱变。在本文中突变细菌是非GMO(非转基因生物)，即没有经过重组DNA技术修饰。

“野生型菌株”是指自然界中发现的细菌的非突变形式。

诸如“具有增甜特性的菌株”、“可以在发酵乳制品中提供理想的葡萄糖积累的菌株”和“使食品天然变甜的特性增强的菌株”等术语，在本文中可互换使用，以表征在乳制品发酵中使用本发明的菌株的有利方面。

在优选的实施方案中，本发明的嗜热链球菌的突变菌株当以10⁶-10⁷CFU/ml的浓度接种于9.5％ B-乳中并在40℃下生长至少20小时时，将9.5％ B-乳中葡萄糖的量增加到至少5mg/mL。

在另一个优选的实施方案中，本发明的嗜热链球菌的突变菌株当以10⁶-10⁷CFU/ml的浓度接种于包含0.05％蔗糖的9.5％ B-乳中并在40℃下生长至少20小时时，将包含0.05％蔗糖的9.5％ B-乳中葡萄糖的量增加到至少5mg/mL。

在本发明的上下文中，9.5％ B-乳是指用复原低脂脱脂乳粉制成干物质含量为9.5％，在99℃下巴氏杀菌30min，然后冷却到40℃的煮沸乳。

在本发明更优选的实施方案中，该突变菌株导致葡萄糖的量增加到至少6mg/ml，例如至少7mg/ml，例如至少8mg/ml，例如至少9mg/ml，例如至少10mg/ml，例如至少11mg/ml，例如至少12mg/ml，例如至少13mg/ml，例如至少14mg/ml，例如至少15mg/ml，例如至少20mg/ml，例如至少25mg/ml。

当用本发明的10⁶-10⁷CFU/ml的嗜热链球菌菌株接种9.5％ B-乳，并用本发明的嗜热链球菌菌株在40℃下发酵至少20小时时，本发明的突变嗜热链球菌菌株向该乳中分泌葡萄糖。优选，当用本发明的10⁶-10⁷CFU/ml的嗜热链球菌菌株接种9.5％ B-乳，并用嗜热链球菌菌株在40℃下发酵至少20小时时，单独的这种突变菌株将向B-乳中分泌至少5mg/ml的葡萄糖。尽管酸化到pH 5的时间推迟了2-5小时，但该菌株仍然完全能够酸化乳。最终的发酵乳所含乳糖低于发酵乳的15mg/ml。因此，最终的发酵乳的内在甜味指数更高，约为2倍或以上。在本发明的一个实施方案中，葡萄糖缺陷型糖嗜热链球菌菌株可以是乳糖阳性或乳糖缺陷的，然而优选所述菌株是乳糖阳性的。

在又一个实施方案中，本发明的突变菌株可以通过其生长模式来表征。这可以通过发现突变菌株在M17培养基+2％半乳糖中的生长速率高于在M17培养基+2％葡萄糖中生长速率来说明。生长速率是以指数生长的培养物在600纳米处的光密度(OD₆₀₀)随时间的发展来测量的。

在优选的实施方案中，在M17培养基+2％半乳糖中的生长速率比在M17培养基+2％葡萄糖中高至少5％，例如高至少10％，例如高至少15％，例如高至少20％。

glcK基因中的突变

在一个优选的实施方案中，突变导致SEQ ID NO.2中第249编码甘氨酸的密码子替换为编码精氨酸的密码子。优选，glcK基因中的突变导致SEQ ID NO.1中第745位的G替换为A。菌株DSM 28889具有这样突变。

在优选的实施方案中，突变导致SEQ ID NO.2中第72位编码丝氨酸的密码子替换为编码脯氨酸的密码子(未显示)。优选，glcK基因中的突变导致SEQ ID NO.1中第214位的T替换为C(未显示)。

在另一个优选的实施方案中，突变导致SEQ ID NO.2中第141位编码苏氨酸的密码子替换为编码异亮氨酸的密码子(未显示)。

优选，glcK基因中的突变导致SEQ ID NO.1中第422位的C替换为T(未显示)。

应当强调的是，glcK基因其他位点的其他突变类型可以使嗜热链球菌的glcK基因失活。

本文所用表述“编码葡糖激酶的glcK基因”是指编码具有葡糖激酶活性的蛋白质的任何DNA序列，包括SEQ ID NO.:1的DNA序列编码的具体葡糖激酶。葡糖激酶催化葡萄糖转化为葡萄糖-6-磷酸的反应。

减少葡萄糖转运到细胞中的突变

在优选的实施方案中，葡萄糖缺陷型嗜热链球菌菌株携带减少葡萄糖转运到细胞中的突变。

本文所用术语“减少葡萄糖转运到细胞中的突变”是指，编码参与葡萄糖转运的蛋白质的基因中导致葡萄糖在细胞环境中积累的突变。

当培养基是乳基质时，嗜热链球菌菌株培养基中的葡萄糖水平可以容易地用技术人员已知的方法测量。

在优选的实施方案中，突变将葡萄糖向细胞中的转运减少至少50％，例如至少60％，例如至少70％，例如至少80％，例如至少90％。

葡萄糖向细胞中的转运可以通过Cochu等人(2003.Appl Environ Mi-crobiol 69(9)；5423-5432)描述的葡萄糖摄取试验来测定。

优选地，嗜热链球菌菌株在编码葡萄糖转运蛋白成分的基因中携带突变，其中该突变使葡萄糖转运蛋白失活或对该基因的表达具有负面作用。

该成分可以是葡萄糖转运蛋白的对葡萄糖转运至关重要的任何成分。例如，考虑的是，嗜热链球菌中葡萄糖/甘露糖PTS的任何成分失活将导致葡萄糖转运蛋白功能失活。

本文所用术语“突变使葡萄糖转运蛋白失活”是指导致“失活的葡萄糖转运蛋白”的突变，失活的葡萄糖转运蛋白是如果存在于细胞中，受损害且不能发挥其正常功能的葡萄糖转运蛋白，以及阻止葡萄糖转运蛋白形成或导致葡萄糖转运蛋白降解的突变。

特别是，失活的葡萄糖转运蛋白是，与功能性葡萄糖转运蛋白相比，不能促进葡萄糖跨质膜转运或以明显降低的速率促进葡萄糖跨质膜转运的蛋白。与编码功能性葡萄糖转运蛋白的基因相比，编码这种失活的葡萄糖转运蛋白的基因在该基因的可读框(ORF)中包含突变，其中所述突变可以包括但不限于缺失、移码突变、引入终止密码子或导致氨基酸取代从而改变该蛋白的功能特性的突变，或减少或消除该基因的转录或翻译的启动子突变。

在优选的实施方案中，突变将葡萄糖转运蛋白的活性(葡萄糖的转运速率)减少了至少50％，例如至少60％，例如至少70％，例如至少80％，例如至少90％。

葡萄糖转运蛋白的活性可以通过Cochu等人(2003.Appl Environ Mi-crobiol 69(9)；5423-5432)描述的葡萄糖摄取试验来测定。

本文所用术语“功能性葡萄糖转运蛋白”是指，如果存在于细胞中，促进葡萄糖跨质膜转运的葡萄糖转运蛋白。

在优选的实施方案中，本发明的葡萄糖缺陷型嗜热链球菌菌株在编码葡萄糖/甘露糖磷酸转移酶系统的IID^Man蛋白的manN基因的DNA序列中携带突变，其中该突变使IID^Man蛋白失活或对该基因的表达具有负面作用。DSM 28889在编码葡萄糖/甘露糖磷酸转移酶系统的IID^Man蛋白的manN基因的第79位具有苏氨酸到脯氨酸的改变。优选，该manN基因中的突变导致SEQ ID NO.3中第235位的A替换为C。因此，在优选的实施方案中，本发明的嗜热链球菌菌株在编码葡萄糖/甘露糖磷酸转移酶系统的IID^Man蛋白的manN基因的DNA序列中携带突变，其中所述突变导致SEQ ID NO.4中第79位的苏氨酸替换为脯氨酸。

在本发明的另一个优选实施方案中，本发明的嗜热链球菌菌株在编码葡萄糖/甘露糖磷酸转移酶系统的IIC^Man蛋白的manM基因的DNA序列中携带突变，其中所述突变使IIC^Man蛋白失活或对该基因的表达具有负面作用。在具体的优选实施方案中，所述突变导致葡萄糖/甘露糖磷酸转移酶系统的IIC^Man蛋白的SEQ ID NO.6中第209位编码谷氨酸的密码子替换为终止密码子(未显示)。优选，所述突变导致SEQ ID NO.5中第625位的G取代为T。

在本发明的优选实施方案中，葡萄糖缺陷型嗜热链球菌菌株选自由以下组成的组：DSM 32227；DSM 28889；DSM 25850；DSM 25851；DSM 26722以及通过使用保藏的菌株之一作为母菌株而得到的其衍生的突变菌株，其中所述突变体保留或进一步改善了其母菌株的葡萄糖分泌特性。

在本发明的上下文中，术语“其衍生的菌株”应理解为通过例如基因工程、辐射和/或化学处理等手段从起始菌株或母菌株中衍生的或可以衍生的菌株。“其衍生的菌株”也可以是自发产生的突变体。优选，“其衍生的菌株”是功能等同突变体，例如，具有与其母菌株基本相同或改进的特性(例如，关于质构或半乳糖发酵)的突变体。特别是，术语“其衍生的菌株”是指通过使本发明的菌株经受任何常规使用的诱变处理而获得的菌株，包括用化学诱变剂例如甲磺酸乙酯(EMS)或N-甲基-N'-硝基-N-硝基胍(NTG)处理，紫外光，或是指自发产生的突变体。突变体可能已经过几次诱变处理(单次处理应当理解为一个诱变步骤，然后是筛选/选择步骤)，但本发明优选进行不超过20次，或不超过10次，或不超过5次处理(或筛选/选择步骤)。在优选的实施方案中，与母菌株相比，突变体细菌基因组中少于1％、少于0.1％、少于0.01％、少于0.001％或甚至少于0.0001％的核苷酸被另一个核苷酸取代、缺失或插入。

在另一个实施方案中，本发明的葡萄糖缺陷型嗜热链球菌菌株是乳糖发酵的。因此，本发明的优点是，葡萄糖阴性嗜热链球菌菌株会将乳基质的部分乳糖转化为葡萄糖，为发酵乳制品提供天然甜味，从而减少向产品中添加糖的需要，并降低乳基质的乳糖含量，使乳糖不耐受消费者受益。

获得葡萄糖缺陷型嗜热链球菌菌株的方法

获得葡萄糖缺陷型嗜热链球菌菌株的方法包括提供半乳糖发酵菌株的步骤，即能够使用半乳糖作为碳水化合物源的菌株。

半乳糖发酵菌株可以通过包括以下步骤的方法获得：将待测细菌划线培养在琼脂平板上，例如M17琼脂平板上，该平板包含规定浓度的半乳糖作为唯一的碳水化合物源，例如2％，并鉴别能够在这些平板上生长的菌落。

半乳糖发酵嗜热链球菌菌株能够在M17培养基+2％半乳糖中生长，并在本文中定义为：当以1％从过夜培养物中接种并在37℃下孵育24小时时，它们有能力将含有2％半乳糖作为唯一碳水化合物的M17肉汤的pH降低到5.5或更低。这种半乳糖阳性菌株已描述于WO2011/026863(Chr.Hansen A/S)和WO2011/092300(Chr.Hansen A/S)。

抗2-脱氧葡萄糖的半乳糖发酵菌株可以通过将菌株在M17培养基+2％半乳糖中的生长模式与在M17培养基+2％葡萄糖中的生长模式相互关联来进行鉴定。

筛选和分离嗜热链球菌葡萄糖缺陷型菌株的方法，包括以下步骤：

a)提供半乳糖发酵嗜热链球菌母菌株；

b)从衍生自该母菌株的突变嗜热链球菌菌株池中选择并分离抗2-脱氧葡萄糖突变嗜热链球菌菌株池；以及

c)如果突变嗜热链球菌菌株在M17培养基+2％半乳糖中的生长速率高于在M17培养基+2％葡萄糖中的生长速率，则从抗2-脱氧葡萄糖突变嗜热链球菌菌株池中选择并分离该突变嗜热链球菌菌株。

在一个实施方案中，该方法进一步包括步骤a1)使母菌株经受诱变，例如使母菌株经受化学诱变剂和/或物理诱变剂。

在另一个实施方案中，该方法进一步包括步骤d)如果嗜热链球菌菌株在M17培养基+2％蔗糖中的生长速率较高，并且与在M17培养基+2％葡萄糖中母菌株的生长速率相比是降低的，则从步骤c)中获得的抗2-脱氧葡萄糖嗜热链球菌菌株池中选择并分离该嗜热链球菌菌株。优选，嗜热链球菌菌株的生长速率为零，或与母菌株的生长速率相比至少减少到5％以下，10％以下，15％以下，20％以下，25％以下，30％以下，35％以下，40％以下，45％以下，50％以下。

嗜热链球菌菌株的葡萄糖缺陷可能是由于编码葡糖激酶蛋白的glcK基因中核苷酸序列的改变所致。这种改变可以是突变、插入和/或缺失。

在本发明的一个实施方案中，葡萄糖缺陷型嗜热链球菌菌株包含glcK基因核苷酸序列中的突变、插入和/或缺失。

本发明组合物的葡萄糖发酵菌株

本发明组合物的葡萄糖发酵嗜热链球菌菌株可以是任何适合生产发酵乳制品的常规嗜热链球菌菌株。

在本发明的一个实施方案中，葡萄糖发酵嗜热链球菌菌株是乳糖发酵嗜热链球菌菌株或乳糖缺陷型嗜热链球菌菌株。

在本发明的一个实施方案中，葡萄糖发酵嗜热链球菌菌株是以登录号DSM 19242保藏于DSMZ的菌株或其衍生的葡萄糖发酵突变菌株。

本发明组合物的葡萄糖发酵德氏乳杆菌保加利亚亚种菌株可以是任何适合生产发酵乳制品的常规德氏乳杆菌保加利亚亚种菌株。

在本发明的一个实施方案中，葡萄糖发酵德氏乳杆菌保加利亚亚种菌株是乳糖缺陷型德氏乳杆菌保加利亚亚种菌株。

在本发明的一个实施方案中，葡萄糖发酵德氏乳杆菌保加利亚亚种菌株选自由以下组成的组：以登录号DSM 28910、DSM 22586保藏于DSMZ的菌株；以及其衍生的葡萄糖发酵突变菌株。

术语“乳糖代谢缺陷”、“乳糖缺陷型”在本发明的上下文中用于表征部分或完全丧失使用乳糖作为细胞生长或维持细胞活力来源的能力的LAB。各LAB能够代谢一种或多种选自蔗糖、半乳糖、葡萄糖、果糖和/或另一种可发酵碳水化合物的非乳糖碳水化合物。由于这些碳水化合物并非以足以支持乳糖缺陷型突变体发酵的量天然存在于乳中，因此有必要在乳中添加这些碳水化合物。乳糖缺陷型和部分乳糖缺陷型LAB可以表征为在含有乳糖和X-Gal的培养基上的白色菌落。

就本发明而言，术语“X-Gal”是指5-溴-4-氯-3-吲哚基-β-D-吡喃半乳糖苷，它是β-半乳糖苷酶的致色底物，该酶将X-Gal水解为无色的半乳糖和5-溴-4-氯-吲哚基，后者自发地二聚化，形成蓝色颜料。

在本发明的具体实施方案中，乳糖缺陷型菌株是能够代谢选自由以下组成组的非乳糖碳水化合物的嗜热链球菌菌株和/或德氏乳杆菌保加利亚亚种菌株：蔗糖、半乳糖、葡萄糖和果糖，优选蔗糖。在本发明的具体实施方案中，乳糖缺陷型菌株是能够代谢半乳糖的嗜热链球菌菌株和/或德氏乳杆菌保加利亚亚种菌株。

在本发明组合物的具体实施方案中，德氏乳杆菌保加利亚亚种菌株选自由以下组成组：以登录号DSM 28910保藏于DSMZ的菌株；以及其衍生的突变菌株，该突变菌株的进一步特征是在含有乳糖和X-Gal的培养基上产生白色菌落的能力。

乳糖缺陷型菌株可以通过突变从合适的乳糖发酵母菌株中获得。在合适的培养基上，例如具有1％乳糖和200mg/ml X-Gal的MRS琼脂平板上，紫外线诱变后，作为白色菌落(表示乳糖缺陷型表型)，选择乳糖缺陷型菌株。乳糖发酵菌株具有β-半乳糖苷酶活性，由于β-半乳糖苷酶活性，乳糖阳性菌株的菌落呈现蓝色。作为用于产生乳糖缺陷型菌株的乳糖发酵母菌株，可以使用以登录号DSM 19252保藏于DSMZ的德氏乳杆菌保加利亚亚种菌株。

组合物

本发明涉及用于生产发酵乳制品的组合物，包含：

(ii)葡萄糖缺陷型嗜热链球菌(St)菌株，其中所述St菌株是半乳糖发酵的，并且在编码葡糖激酶蛋白的glcK基因的DNA序列中携带突变，该突变使葡糖激酶蛋白失活或对所述基因的表达具有负面作用。

在一个实施方案中，本发明提供了用于生产发酵乳制品的组合物，其中与由不含(ii)的葡萄糖缺陷型嗜热链球菌(St)菌株的组合物制备的发酵乳制品相比，发酵乳制品的后酸化减少。

在一个实施方案中，与由不含(ii)的葡萄糖缺陷型嗜热链球菌(St)菌株的组合物制备的发酵乳制品相比，发酵乳制品的后酸化减少了高于5％，高于10％，高于15％，高于20％，高于25％，高于30％，高于35％，高于40％，高于45％，或高于50％。

本发明的组合物包含10⁴至10¹²CFU(菌落形成单位)/g的葡萄糖缺陷型嗜热链球菌菌株，例如10⁵至10¹¹CFU/g，例如10⁶至10¹⁰CFU/g，或例如10⁷至10⁹CFU/g的葡萄糖缺陷型嗜热链球菌菌株。

在本发明的一个实施方案中，葡萄糖缺陷型嗜热链球菌菌株是乳糖发酵的。

在一个实施方案中，该组合物的葡萄糖缺陷型热链球菌菌株不能酸化9.5％的B-乳，定义为当用10⁶-10⁷CFU/ml的葡萄糖缺陷型嗜热链球菌菌株接种9.5％的B-乳并在40℃下孵育14小时时，导致pH下降小于1.0，并且该组合物进一步包含一定量的化合物，该化合物可引发葡萄糖缺陷型嗜热链球菌菌株DSM 32227；DSM 28889；DSM 25850；DSM 25851；或DSM 26722酸化9.5％ B-乳，定义为当用10⁶-10⁷CFU/ml的葡萄糖缺陷型嗜热链球菌菌株接种9.5％ B-乳并在40℃下孵育14小时时，导致pH下降1.0或以上。在实施方案中，该化合物是蔗糖。优选，蔗糖的量为0.000001％至2％，例如0.00001％至0.2％，例如0.0001％至0.1％，例如0.001％至0.05％。

在一个实施方案中，所述组合物进一步包含10⁴至10¹²CFU/g的常规德氏乳杆菌保加利亚亚种菌株，例如10⁵至10¹¹CFU/g，例如10⁶至10¹⁰CFU/g，或例如10⁷至10⁹CFU/g的德氏乳杆菌保加利亚亚种菌株。

在一个实施方案中，所述组合物包含至少两种嗜热链球菌(St)菌株，至少三种St菌株，或至少四种St菌株。在另一个实施方案中，该组合物包含两种St菌株、三种St菌株或四种St菌株。在本发明的具体实施方案中，该组合物包含不超过三种德氏乳杆菌保加利亚亚种(Lb)菌株，优选不超过两种Lb菌株，或更优选一种Lb菌株。

在本发明的具体实施方案中，该组合物包括至少一种选自DSM 32227；DSM 28889；DSM 25850和DSM 26722的嗜热链球菌菌株以及德氏乳杆菌保加利亚亚种菌株DSM 28910。

德氏乳杆菌保加利亚亚种、嗜热链球菌和其他乳酸菌，通常用作起子培养物，在各种食品生产中发挥技术作用。在乳制品工业中，这种起子培养物用于生产发酵乳制品，例如酸奶。因此，在本发明的一个实施方案中，该组合物是起子培养物。在本发明的一个实施方案中，该组合物用作起子培养物。在本发明的一个实施方案中，该组合物用作生产酸奶的起子培养物。在本发明的一个实施方案中，该组合物用作生产后酸化减少或较低的酸奶的起子培养物。与用不含葡萄糖缺陷型嗜热链球菌菌株的类似组合物或起子培养物制备的酸奶相比，来定义后酸化水平。

本发明的组合物可以以几种形式提供。它可以是冷冻形式、干燥形式、冻干形式或液体形式。因此，在一个实施方案中，该组合物是冷冻、干燥、冻干或液体形式。

本发明的组合物可额外包含冷冻保护剂、冻干保护剂、抗氧化剂、营养素、填充剂、食用香料或其混合物。该组合物优选包含冷冻保护剂、冻干保护剂、抗氧化剂和/或营养素中的一种或多种，更优选冷冻保护剂、冻干保护剂和/或抗氧化剂，最优选冷冻保护剂或冻干保护剂，或两者。保护剂的使用，例如冷冻保护剂和冻干保护剂，是本领域技术人员已知的。合适的冷冻保护剂或冻干保护剂包括单糖、双糖、三糖和多糖(例如葡萄糖、甘露糖、木糖、乳糖、蔗糖、海藻糖、棉子糖、麦芽糊精、淀粉和阿拉伯胶(阿拉伯树胶)等)、多元醇(例如赤藓糖醇、甘油、肌醇、甘露醇、山梨醇、苏糖醇、木糖醇等)、氨基酸(例如脯氨酸、谷氨酸)、复合物质(例如脱脂乳、蛋白胨、明胶、酵母提取物)和无机化合物(例如三聚磷酸钠)。在一个实施方案中，本发明的组合物可以包含一种或多种选择由以下组成的组的冷冻保护剂：肌苷-5'-单磷酸(IMP)、腺苷-5'-单磷酸(AMP)、鸟苷-5'-单磷酸(GMP)、尿苷-5'-单磷酸(UMP)、胞苷-5'-单磷酸(CMP)、腺嘌呤、鸟嘌呤、尿嘧啶、胞嘧啶、腺苷、鸟苷、尿苷、胞苷、次黄嘌呤、黄嘌呤、次黄嘌呤、乳清苷、胸苷、肌苷以及任何此类化合物的衍生物。合适的抗氧化剂包括抗坏血酸、柠檬酸及其盐、没食子酸盐、半胱氨酸、山梨醇、甘露醇、麦芽糖。合适的营养素包括糖、氨基酸、脂肪酸、矿物质、微量元素、维生素(例如维生素B族、维生素C)。该组合物任选地包含其他物质，包括填充剂(例如乳糖、麦芽糊精)和/或食用香料。

生产发酵乳制品的方法

本发明进一步涉及生产发酵乳制品的方法，包括用本发明的组合物接种和发酵乳基质。该组合物在上文“组合物”一节中有详细描述。

在一个实施方案中，本发明涉及生产发酵乳制品的方法，包括用以下接种和发酵乳基质：

在一个实施方案中，本发明涉及生产发酵乳制品的方法，其中与由不含(ii)的葡萄糖缺陷型嗜热链球菌(St)菌株的组合物制备的发酵乳制品相比，发酵乳制品的后酸化减少。

(ii)葡萄糖缺陷型嗜热链球菌(St)菌株，其中所述St菌株是半乳糖发酵的，并且在编码葡糖激酶蛋白的glcK基因的DNA序列中携带突变，该突变使葡糖激酶蛋白失活或对该基因的表达具有负面作用，

其中，与在没有(ii)的葡萄糖缺陷型嗜热链球菌(St)菌株的情况下制备的发酵乳制品相比，发酵乳制品的后酸化减少。

术语“乳”应理解为通过对任何哺乳动物，例如奶牛、绵羊、山羊、水牛或骆驼挤奶而获得的乳分泌物。在优选的实施方案中，乳是奶牛的乳。

术语“乳基质”可以是任何可以根据本发明的方法进行发酵的未经加工和/或经过加工的乳材料。因此，有用的乳基质包括但不限于任何包含蛋白质的乳或乳类产品的溶液/悬浮液，例如全脂乳或低脂乳、脱脂乳、酪乳、复原乳粉、炼乳、干奶粉、乳清、乳清渗透物、乳糖、来自乳糖结晶的母液、浓缩乳清蛋白或奶油。显然，乳基质可以全部或部分来自任何哺乳动物，例如基本上纯的哺乳动物乳，或复原乳粉。

优选，乳基质中的至少一部分蛋白质是天然存在于乳中的蛋白质，例如酪蛋白或乳清蛋白。然而，部分蛋白质可以是不在乳中天然存在的蛋白质。

在发酵之前，可根据本领域已知的方法对乳基质进行均质化和巴氏杀菌。

本文所用“均质化”是指强烈混合，以获得可溶性悬浮液或乳液。如果在发酵前进行均质化，则进行均质化，以便将乳脂肪分解成更小的尺寸，使其不再从乳中分离出来。这可以通过在高压下迫使乳通过小孔来实现。

本文所用“巴氏杀菌”是指对乳基质进行处理，以减少或消除活生物体的存在，例如微生物。优选，通过将指定的温度维持指定的时间段来实现巴氏杀菌。指定的温度通常是通过加热达到的。可以选择温度和持续时间，以杀死或灭活某些细菌，例如有害细菌。随后可以进行快速冷却步骤。

本发明方法中的“发酵”是指通过微生物的作用将碳水化合物转化为醇或酸。优选，本发明方法中的发酵包括将乳糖转化为乳酸。用于生产发酵乳制品的发酵工艺是众所周知的，本领域技术人员将知道如何选择合适的工艺条件，例如温度、氧气、微生物的量和特性以及工艺时间。显然，选择发酵条件是为了支持本发明的实现，即获得固体或液体形式的乳制品(发酵乳制品)。

本文所用术语“发酵乳制品”是指食品或饲料产品，其中食品或饲料产品的制备涉及用乳酸菌发酵乳基质。本文所用“发酵乳制品”包括但不限于诸如以下的产品：嗜热发酵乳制品，例如酸奶，嗜温发酵乳制品，例如酸奶油和酪乳，以及发酵乳清。

在本文中术语“嗜热微生物”是指在35℃以上的温度下生长最好的微生物。工业上最有用的嗜热细菌包括链球菌属的物种和乳杆菌属的物种。在本文中术语“嗜热发酵”是指在约35℃以上的温度下发酵，例如在约35℃至约45℃之间。术语“嗜热发酵乳制品”是指通过嗜热起子培养物的嗜热发酵制备的发酵乳制品，包括诸如凝固型酸奶、搅拌型酸奶和饮用型酸奶(例如养乐多(Yakult))等发酵乳制品。

在本文中术语“嗜温微生物”是指在中等温度(15℃-35℃)下生长最好的微生物。工业上最有用的嗜温细菌包括乳球菌属的物种和明串珠菌属的物种。在本文中术语“嗜温发酵”是指在约22℃和约35℃之间的温度下发酵。术语“嗜温发酵乳制品”是指通过嗜温起子培养物的嗜温发酵制备的发酵乳制品，包括诸如以下的发酵乳制品：酪乳、酸乳、培养乳、斯美塔那(Smetana)、酸奶油、克菲尔(Kefir)和新鲜奶酪，例如夸克(quark)、特沃劳格(tvarog)和奶油奶酪。

在优选的实施方案中，接种的嗜热链球菌细胞的浓度为每毫升乳基质10⁴至10⁹CFU嗜热链球菌细胞，例如每毫升乳基质10⁴CFU至10⁸CFU嗜热链球菌细胞。

在本发明方法的另一个优选实施方案中，嗜热链球菌菌株不能酸化9.5％ B-乳，定义为当用10⁶-10⁷CFU/ml的嗜热链球菌菌株接种9.5％ B-乳并在40℃下孵育14小时时，导致pH下降小于1.0，并且向乳基质添加有效引发嗜热链球菌菌株酸化9.5％ B-乳的量的化合物，定义为当用10⁶-10⁷CFU/ml的嗜热链球菌菌株接种9.5％ B-乳并在40℃下孵育14小时时，导致pH下降1.0或更多。优选，该化合物是蔗糖。优选，蔗糖的量为0.000001％至2％，例如0.00001％至0.2％，例如0.0001％至0.1％，例如0.001％至0.05％。

在本发明的上下文中，酸奶起子培养物是细菌培养物，所述细菌培养物包含至少一种德氏乳杆菌保加利亚亚种菌株和至少一种嗜热链球菌菌株。据此，术语“酸奶”是指可通过用包含德氏乳杆菌保加利亚亚种菌株和嗜热链球菌菌株的组合物接种和发酵乳而获得的发酵乳制品。

在另一个实施方案中，本发明涉及减少发酵乳制品中后酸化的方法，该发酵乳制品是由包含葡萄糖发酵嗜热链球菌(St)菌株和葡萄糖发酵德氏乳杆菌保加利亚亚种(St)菌株的起子培养物制备的，所述方法通过向乳基质中添加葡萄糖缺陷型嗜热链球菌(St)菌株，其中所述St菌株是半乳糖发酵的，并且在编码葡糖激酶蛋白的glcK基因的DNA序列中携带突变，该突变使葡糖激酶蛋白失活或对该基因的表达具有负面作用。在一个实施方案中，葡萄糖缺陷型St菌株可以是乳糖发酵的。

在本发明的任一实施方案中，起子培养物和葡萄糖缺陷型嗜热链球菌(St)菌株可以作为混合物或作为成套产品(kit-of-part)添加。

发酵乳制品

本发明还涉及包含本发明的组合物的发酵乳制品。在优选的实施方案中，发酵乳制品可以是酸奶、奶酪、酸奶油和酪乳，以及发酵乳清。优选，发酵乳制品是酸奶。

在一个实施方案中，本发明涉及发酵乳制品，其中与由不含(ii)的葡萄糖缺陷型嗜热链球菌(St)菌株的组合物制备的发酵乳制品相比，发酵乳制品的后酸化减少。

在一个实施方案中，发酵乳制品是通过生产发酵乳制品的方法制作的，该方法包括用根据本发明的组合物接种和发酵乳基质。在一个实施方案中，本发明的组合物包含一种或多种葡萄糖缺陷型嗜热链球菌菌株、一种或多种葡萄糖发酵嗜热链球菌菌株和一种或多种葡萄糖发酵德氏乳杆菌保加利亚亚种菌株。

在一个实施方案中，该组合物的一种或多种葡萄糖缺陷型嗜热链球菌菌株选自由以下组成的组：DSM 32227；DSM 28889；DSM 25850；DSM 25851；DSM 26722；以及其衍生的葡萄糖缺陷型突变菌株。

在一个实施方案中，该组合物的一种或多种葡萄糖发酵嗜热链球菌菌株选自由以下组成的组：DSM 19242；DSM 22935；以及其衍生的葡萄糖发酵突变菌株。

在一个实施方案中，该组合物的一种或多种葡萄糖发酵德氏乳杆菌保加利亚亚种菌株选自由以下组成的组：DSM 28910；DSM 22586；以及其衍生的葡萄糖发酵突变菌株。

在一个实施方案中，发酵乳制品包含一种或多种选自DSM 28889的菌株，以及一种或多种选自DSM 19242和DSM 22586的菌株。

在一个实施方案中，发酵乳制品包含菌株DSM 28889、DSM 19242和DSM 22586。

在一个实施方案中，发酵乳制品包含菌株DSM 28889和DSM 22935。

本发明组合物的用途

本发明涉及根据本发明的组合物用于制备发酵乳制品的用途。

在一个实施方案中，本发明涉及本发明组合物的用途，其中与由不含葡萄糖缺陷型嗜热链球菌(St)菌株的组合物制备的发酵乳制品相比，发酵乳制品的后酸化减少。

在一个实施方案中，本发明涉及，与在没有(ii)的葡萄糖缺陷型嗜热链球菌(St)菌株的情况下制备的发酵乳制品相比，(i)和(ii)用于减少发酵乳制品后酸化的用途：

在一个实施方案中，本发明涉及，与在没有葡萄糖缺陷型嗜热链球菌(St)菌株的情况下制备的发酵乳制品相比，葡萄糖缺陷型嗜热链球菌(St)菌株用于减少发酵乳制品后酸化的用途，其中所述St菌株是半乳糖发酵的，并且在编码葡糖激酶蛋白的glcK基因的DNA序列中携带突变，该突变使葡糖激酶蛋白失活或对该基因的表达具有负面作用。葡萄糖缺陷型St菌株可以是乳糖发酵的。

下面通过非限制性实施例来描述本发明的实施方案。

序列表

SEQ ID NO.1显示了菌株DSM 28889的突变的葡糖激酶基因的DNA序列。

SEQ ID NO.2显示了SEQ ID NO.1编码的氨基酸序列。

SEQ ID NO.3显示了菌株DSM 28889的突变的ManN基因的DNA序列。

SEQ ID NO.4显示了SEQ ID NO.3编码的氨基酸序列。

SEQ ID NO.5显示了菌株DSM 28889的ManM基因(未突变)的DNA序列。

SEQ ID NO.6显示了SEQ ID NO.5编码的氨基酸序列。

实施例

材料和方法

培养基：

对于嗜热链球菌，所用的培养基是本领域技术人员已知的M17培养基。

表1：M17琼脂培养基具有每升H₂O如下的成分，最终pH为pH 7.1±0.2(25℃)：

琼脂	12.75g
		抗坏血酸	0.5g
酪蛋白胨(胰蛋白酶)	2.5g
		五水β-甘油磷酸二钠	19g
水合硫酸镁	0.25g
		肉膏	5g
肉蛋白胨(胃蛋白酶)	2.5g
		大豆蛋白胨(木瓜蛋白酶)	5g
酵母提取物	2.5g

表2：M17肉汤具有每升H₂O如下的成分，最终pH为7.0±0.2(25℃)：

抗坏血酸	0.5g
		硫酸镁	0.25g
肉膏	5g
		肉蛋白胨(胃蛋白酶)	2.5g
甘油磷酸钠	19g
		大豆蛋白胨(木瓜蛋白酶)	5g
胰蛋白胨	2.5g
		酵母提取物	2.5g

加入的碳源是无菌乳糖20g/L、葡萄糖20g/L或半乳糖20g/L。

如技术人员所知，M17培养基是被认为适合嗜热链球菌生长的培养基。此外，如技术人员所理解的，在本发明的上下文中，M17浓缩物可以由不同的供应商提供，并且独立于具体供应商，人们将(在标准的测量不确定度内)得到对本文相关目的细胞的2-脱氧葡萄糖抗性的相同的本文相关结果。

用于培养德氏乳杆菌保加利亚亚种的培养基是MRS-IM培养基。MRS-IM以琼脂平板或肉汤的形式使用。

表3：MRS-IM琼脂培养基具有每升H₂O如下的成分。高压灭菌后在25℃下将pH调整为6.9±0.1。

表4：以下实施例中用于液体培养物的MRS-IM肉汤具有每升H₂O如下的成分。高压灭菌后在25℃下将pH调整为6.9±0.1。首先将碳源，即乳糖20g/L或葡萄糖20g/L，无菌过滤，然后添加到高压灭菌的肉汤中。

胰蛋白胨	Oxoid L 42	10.0g
			酵母提取物	Oxoid L 21	5.0g
吐温80	Merck nr 8.22187	1.0g
			K₂HPO₄	Merck nr 105104	2.6g
醋酸钠	Merck nr 106267	5.0g
			柠檬酸氢二铵	Merck nr 101154	2.0g
MgSO₄,7H2O	Merck nr 105882	0.2g
			MnSO₄,H2O	Merck nr 105941	0.05g
琼脂	SO-BI-GEL	13.0g

上述MRS-IM培养基可以在一定程度上变化，而不影响培养基支持德氏乳杆菌保加利亚亚种生长的能力。此外，如技术人员所理解的，MRS-IM浓缩物或上述各种成分可以从不同的供应商获得并用于制备MRS-IM培养基。这些培养基将同样地用于下面的实施例中，特别是用于2-脱氧葡萄糖抗性选择试验中。

实施例1：在不添加和添加葡萄糖缺陷型嗜热链球菌菌株DSM 28889的情况下商业酸奶培养物的后酸化

培养物

培养物1:Premium 4

培养物2:Premium 4+DSM 28889

DSM 28889是葡萄糖缺陷型、半乳糖发酵和乳糖发酵嗜热链球菌菌株。

Premium 4是由Chr.Hansen A/S销售的商业酸奶起子培养物，包含两种葡萄糖发酵嗜热链球菌菌株和一种葡萄糖发酵德氏乳杆菌保加利亚亚种菌株。所有三种菌株都是乳糖发酵的。

表5：酸奶生产工艺参数

乳基质	4％蛋白质、3％脂肪、5％蔗糖
		乳基质的热处理	95℃/5min.(巴氏杀菌)
发酵温度	38℃
		目标pH	4.60
接种率：标准培养基	0.02％
		接种率：标准培养基+乳糖缺陷型菌株	0.01％+0.04％
酸奶类型	凝固型酸奶

在实验室规模下，在添加和不添加葡萄糖缺陷型菌株DSM 28889(5次2个样品)的情况下测试酸奶起子培养物的酸奶生产。将乳基质加热到38℃，然后接种先前解冻并乳中稀释的培养物，接着加入到3L的桶中。将接种的乳基质倒入100g酸奶杯中(复份)，并在恒温箱中保持在38℃，然后在pH达到4.6时移至冷却室(凝固型酸奶工艺)。在第1天，将一组具有测试的样品的酸奶杯放在13℃的恒温箱中，储存到29天，而将一组相同的杯子在5℃的冷藏室中保存到29天。

结果

酸化

培养物1需要468分钟才能达到pH 4.6。培养物2需要752分钟才能达到pH 4.6。

后酸化

表6：后酸化(pH)

在存在DSM 28889的情况下，在两个测试的温度下，后酸化减少。

碳水化合物

表7：在5℃下储存21天后酸奶的碳水化合物概况(mg/g)

	蔗糖	乳糖	葡萄糖	半乳糖	果糖
						培养物1(5℃)	41,9	40,8	1,6	5,7	0,0
培养物2(5℃)	38,4	26,8	9,7	8,5	1,0

保藏和专家解决方案

申请人要求，在专利授权日之前，仅向专家提供以下所述保藏的微生物样品。

表8：根据国际承认用于专利程序的微生物保藏布达佩斯条约，在德国微生物保藏中心，布伦瑞克因霍芬街7B，D-38124(Deutsche Sammlung von Mikroorganismen undZellkulturen(DSMZ)GmbH,Inhoffenstr.7B,D-38124Braunschweig)进行了保藏。

菌株	登录号	保藏日
			嗜热链球菌	DSM 19242	29.03.2007
嗜热链球菌	DSM 22934	08.09.2009
			嗜热链球菌	DSM 22935	08.09.2009
嗜热链球菌	DSM 25838	03.04.2012
			嗜热链球菌	DSM 25850	03.04.2012
嗜热链球菌	DSM 25851	03.04.2012
			嗜热链球菌	DSM 26722	12.12.2012
嗜热链球菌	DSM 28889	04.06.2014
			嗜热链球菌	DSM 32227	08.12.2015
德氏乳杆菌保加利亚亚种	DSM 19252	03.04.2007
			德氏乳杆菌保加利亚亚种	DSM 22586	19.05.2009
德氏乳杆菌保加利亚亚种	DSM 28910	12.06.2014

参考文献

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序列表

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<130> P6774EP00

<160> 6

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 966

<212> DNA

<213> 嗜热链球菌(Streptococcus thermophilus)

<400> 1

atgagtaaga aactcttagg tattgacctt ggtggaacaa ctgttaagtt tggtattttg 60

actgcagatg gtgaagttca agaaaaatgg gctattgaaa caaatacgtt tgaaaatggt 120

agccacattg ttcctgacat tgtagaatct ttgaaacacc gtttggaatt gtatggactt 180

actgctgaag attttattgg aattggtatg ggatctccag gtgcagttga ccgagaaaat 240

aaaacagtaa cgggtgcctt taacttgaac tgggcagaaa ctcaagaagt tggctctgtt 300

attgaaaaag aacttggtat tccattcgct attgataatg atgctaatgt ggctgcactg 360

ggtgaacgtt gggttggtgc tggtgctaac aatcggaatg ttgtctttat aacattgggt 420

acaggtgttg gtggcggtgt tatcgctgat ggtaacttaa ttcatggtgt tgccggtgct 480

ggtggggaaa ttggtcacat tattgttgaa cctgacacag gatttgagtg tacttgcgga 540

aacaaggggt gtctggaaac tgtagcttca gcaacaggta ttgtacgtgt agcacatcat 600

ttggcagaaa aatacgaagg aaactcttct attaaagctg ctgtagacaa tggtgagttt 660

gtgacaagta aagatattat cgtagctgct actgaaggtg ataagtttgc tgacagcatt 720

gttgataaag tctctaaata cctcagactt gcaacagcaa acatctcaaa cattcttaac 780

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gttgaaggat actttacacg ttatgcattc ccacaagttc gccgtacaac aaaagtgaaa 900

ttagcggagc ttggaaatga tgcaggaatc attggagctg ctagtcttgc ttatagtatt 960

gacaaa 966

<210> 2

<211> 322

<212> PRT

<213> 嗜热链球菌

<400> 2

Met Ser Lys Lys Leu Leu Gly Ile Asp Leu Gly Gly Thr Thr Val Lys

1 5 10 15

Phe Gly Ile Leu Thr Ala Asp Gly Glu Val Gln Glu Lys Trp Ala Ile

20 25 30

Glu Thr Asn Thr Phe Glu Asn Gly Ser His Ile Val Pro Asp Ile Val

35 40 45

Glu Ser Leu Lys His Arg Leu Glu Leu Tyr Gly Leu Thr Ala Glu Asp

50 55 60

Phe Ile Gly Ile Gly Met Gly Ser Pro Gly Ala Val Asp Arg Glu Asn

65 70 75 80

Lys Thr Val Thr Gly Ala Phe Asn Leu Asn Trp Ala Glu Thr Gln Glu

85 90 95

Val Gly Ser Val Ile Glu Lys Glu Leu Gly Ile Pro Phe Ala Ile Asp

100 105 110

Asn Asp Ala Asn Val Ala Ala Leu Gly Glu Arg Trp Val Gly Ala Gly

115 120 125

Ala Asn Asn Arg Asn Val Val Phe Ile Thr Leu Gly Thr Gly Val Gly

130 135 140

Gly Gly Val Ile Ala Asp Gly Asn Leu Ile His Gly Val Ala Gly Ala

145 150 155 160

Gly Gly Glu Ile Gly His Ile Ile Val Glu Pro Asp Thr Gly Phe Glu

165 170 175

Cys Thr Cys Gly Asn Lys Gly Cys Leu Glu Thr Val Ala Ser Ala Thr

180 185 190

Gly Ile Val Arg Val Ala His His Leu Ala Glu Lys Tyr Glu Gly Asn

195 200 205

Ser Ser Ile Lys Ala Ala Val Asp Asn Gly Glu Phe Val Thr Ser Lys

210 215 220

Asp Ile Ile Val Ala Ala Thr Glu Gly Asp Lys Phe Ala Asp Ser Ile

225 230 235 240

Val Asp Lys Val Ser Lys Tyr Leu Arg Leu Ala Thr Ala Asn Ile Ser

245 250 255

Asn Ile Leu Asn Pro Asp Ser Val Val Ile Gly Gly Gly Val Ser Ala

260 265 270

Ala Gly Glu Phe Leu Arg Ser Arg Val Glu Gly Tyr Phe Thr Arg Tyr

275 280 285

Ala Phe Pro Gln Val Arg Arg Thr Thr Lys Val Lys Leu Ala Glu Leu

290 295 300

Gly Asn Asp Ala Gly Ile Ile Gly Ala Ala Ser Leu Ala Tyr Ser Ile

305 310 315 320

Asp Lys

<210> 3

<211> 909

<212> DNA

<213> 嗜热链球菌

<400> 3

atggctgaaa aaattcaatt atctcaagcg gatcgtaaaa aggtttggtg gcgctcacaa 60

ttcttgcaag gtgcatggaa ctatgaacgt atgcaaaact tgggttgggc ttactcactc 120

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gctcttgaag aagaaaaagc taatggtact gaaatcgaag atgcggctat ccaaggggtt 300

aaaatcggta tgatgggtcc acttgccggt atcggtgacc ctgtcttctg gttcacaatt 360

cgtccaattc ttggtgccct tggtgcatca ttggcacaag ctggtaacat tgctggtcca 420

cttatcttct tcattggttg gaaccttatc cgcatggcct tcttgtggta cactcaagaa 480

cttggttaca aagcaggttc agaaatcact aaagacatat ctggtggtat cttgaaagat 540

attactaaag gggcatcaat acttggtatg ttcatcttgg ccgtcctcgt tgaacgttgg 600

gtatctgtcg tcttcactgt aaagcttcca ggtaaagttt tgcctaaagg tgcttatatt 660

gaatggccaa aaggatatgt tactggtgac caactaaaaa ctatccttgg tcaagtcaac 720

gataagctta gctttgataa gattcaagtc gataccctac aaaaacaatt ggattcatta 780

attccaggtt tgacgggact tctccttact tttgcatgta tgtggttgct taagaagaaa 840

gtttcaccaa tcacaatcat catcggactc tttgtagttg gtattattgc aagcttcttc 900

ggaatcatg 909

<210> 4

<211> 303

<212> PRT

<213> 嗜热链球菌

<400> 4

Met Ala Glu Lys Ile Gln Leu Ser Gln Ala Asp Arg Lys Lys Val Trp

1 5 10 15

Trp Arg Ser Gln Phe Leu Gln Gly Ala Trp Asn Tyr Glu Arg Met Gln

20 25 30

Asn Leu Gly Trp Ala Tyr Ser Leu Ile Pro Ala Ile Lys Lys Leu Tyr

35 40 45

Thr Asn Lys Glu Asp Gln Ala Ala Ala Leu Lys Arg His Leu Glu Phe

50 55 60

Phe Asn Thr His Pro Tyr Val Ala Ala Pro Ile Ile Gly Val Pro Leu

65 70 75 80

Ala Leu Glu Glu Glu Lys Ala Asn Gly Thr Glu Ile Glu Asp Ala Ala

85 90 95

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Asp Pro Val Phe Trp Phe Thr Ile Arg Pro Ile Leu Gly Ala Leu Gly

115 120 125

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130 135 140

Ile Gly Trp Asn Leu Ile Arg Met Ala Phe Leu Trp Tyr Thr Gln Glu

145 150 155 160

Leu Gly Tyr Lys Ala Gly Ser Glu Ile Thr Lys Asp Ile Ser Gly Gly

165 170 175

Ile Leu Lys Asp Ile Thr Lys Gly Ala Ser Ile Leu Gly Met Phe Ile

180 185 190

Leu Ala Val Leu Val Glu Arg Trp Val Ser Val Val Phe Thr Val Lys

195 200 205

Leu Pro Gly Lys Val Leu Pro Lys Gly Ala Tyr Ile Glu Trp Pro Lys

210 215 220

Gly Tyr Val Thr Gly Asp Gln Leu Lys Thr Ile Leu Gly Gln Val Asn

225 230 235 240

Asp Lys Leu Ser Phe Asp Lys Ile Gln Val Asp Thr Leu Gln Lys Gln

245 250 255

Leu Asp Ser Leu Ile Pro Gly Leu Thr Gly Leu Leu Leu Thr Phe Ala

260 265 270

Cys Met Trp Leu Leu Lys Lys Lys Val Ser Pro Ile Thr Ile Ile Ile

275 280 285

Gly Leu Phe Val Val Gly Ile Ile Ala Ser Phe Phe Gly Ile Met

290 295 300

<210> 5

<211> 828

<212> DNA

<213> 嗜热链球菌

<400> 5

atgtcagata tgtcaattat ttctgcgatt ttggtcgtag ctgttgcctt ccttgctggt 60

cttgaaagta tccttgacca attccaattc caccaaccac ttgttgcatg taccctcatc 120

ggtgctgcca caggtaacct cactgcaggt atcatgcttg gtggttctct tcaaatgatt 180

acccttgctt gggcaaacat cggtgctgcc gtagctcctg acgttgccct tgcatctgtt 240

gccgctgcca tcattttggt taaaggtggt aaatttacag ctgaaggtat cggtgttgcg 300

attgcaatag ctatcctgct tgcagttgca ggtctcttcc taactatgcc tgttcgtaca 360

gcatctattg cctttgttca tgctgcagat aaagctgcag aacacggaaa catcgctggt 420

gttgaacgtg catactacct cgctctcctt cttcaaggtt tgcgtattgc tgtgccagca 480

gcccttcttc ttgccatccc ggcccaatct gttcaacatg cccttggctt gatgcctgac 540

tggctcaccc atggtttggt tgtcggtggt ggtatggtcg tagccgttgg ttacgccatg 600

attatcaata tgatggctac tcgtgaagtt tggccattct tcgccattgg ttttgctttg 660

gcagcaatta gccaattgac acttatcgct cttagtacca ttggtgttgc catcgccttc 720

atctacctca acctttctaa acaaggtggc ggaaatggtg gcggaaatgg tggcggaact 780

tcatctggtt caggcgaccc aatcggcgat atcttggaag actactag 828

<210> 6

<211> 275

<212> PRT

<213> 嗜热链球菌

<400> 6

Met Ser Asp Met Ser Ile Ile Ser Ala Ile Leu Val Val Ala Val Ala

1 5 10 15

Phe Leu Ala Gly Leu Glu Ser Ile Leu Asp Gln Phe Gln Phe His Gln

20 25 30

Pro Leu Val Ala Cys Thr Leu Ile Gly Ala Ala Thr Gly Asn Leu Thr

35 40 45

Ala Gly Ile Met Leu Gly Gly Ser Leu Gln Met Ile Thr Leu Ala Trp

50 55 60

Ala Asn Ile Gly Ala Ala Val Ala Pro Asp Val Ala Leu Ala Ser Val

65 70 75 80

Ala Ala Ala Ile Ile Leu Val Lys Gly Gly Lys Phe Thr Ala Glu Gly

85 90 95

Ile Gly Val Ala Ile Ala Ile Ala Ile Leu Leu Ala Val Ala Gly Leu

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115 120 125

Ala Asp Lys Ala Ala Glu His Gly Asn Ile Ala Gly Val Glu Arg Ala

130 135 140

Tyr Tyr Leu Ala Leu Leu Leu Gln Gly Leu Arg Ile Ala Val Pro Ala

145 150 155 160

Ala Leu Leu Leu Ala Ile Pro Ala Gln Ser Val Gln His Ala Leu Gly

165 170 175

Leu Met Pro Asp Trp Leu Thr His Gly Leu Val Val Gly Gly Gly Met

180 185 190

Val Val Ala Val Gly Tyr Ala Met Ile Ile Asn Met Met Ala Thr Arg

195 200 205

Glu Val Trp Pro Phe Phe Ala Ile Gly Phe Ala Leu Ala Ala Ile Ser

210 215 220

Gln Leu Thr Leu Ile Ala Leu Ser Thr Ile Gly Val Ala Ile Ala Phe

225 230 235 240

Ile Tyr Leu Asn Leu Ser Lys Gln Gly Gly Gly Asn Gly Gly Gly Asn

245 250 255

Gly Gly Gly Thr Ser Ser Gly Ser Gly Asp Pro Ile Gly Asp Ile Leu

260 265 270

Glu Asp Tyr

275

Claims

1.用于生产发酵乳制品的组合物，包含：

(i)起子培养物，包含葡萄糖发酵嗜热链球菌(Streptococcus thermophi-lus)(St)菌株和葡萄糖发酵德氏乳杆菌保加利亚亚种(Lactobacillus del-brueckiisubsp.bulgaricus)(Lb)菌株；和

(ii)葡萄糖缺陷型嗜热链球菌(St)菌株，其中所述St菌株是半乳糖发酵的，并且在编码葡糖激酶蛋白的glcK基因的DNA序列中携带突变，所述突变使所述葡糖激酶蛋白失活或对所述基因的表达具有负面作用。

2.根据权利要求1所述的组合物，其中所述发酵乳制品的后酸化与由不含(ii)的所述葡萄糖缺陷型嗜热链球菌(St)菌株的组合物制备的发酵乳制品相比减少。

3.根据前述权利要求中任一项所述的组合物，其中所述葡萄糖缺陷型St菌株是抗2-脱氧葡萄糖的。

4.根据前述权利要求中任一项所述的组合物，其中所述葡萄糖缺陷型St菌株携带减少葡萄糖转运到细胞中的突变。

5.根据前述权利要求中任一项所述的组合物，其中当以10⁶-10⁷CFU/ml的浓度接种于9.5％B-乳中并在40℃下生长20小时时，所述葡萄糖缺陷型St菌株将所述9.5％B-乳中葡萄糖的量增加到至少5mg/ml。

6.根据前述权利要求中任一项所述的组合物，其中当以10⁶-10⁷CFU/ml的浓度接种于包含0.05％蔗糖的9.5％B-乳中并在40℃下生长20小时时，所述葡萄糖缺陷型St菌株将所述包含0.05％蔗糖的9.5％B-乳中葡萄糖的量增加到至少5mg/ml。

7.根据前述权利要求中任一项所述的组合物，其中所述葡萄糖发酵和/或葡萄糖缺陷型嗜热链球菌菌株是乳糖阳性的。

8.根据权利要求1-5中任一项所述的组合物，其中所述葡萄糖发酵嗜热链球菌菌株是乳糖缺陷的。

9.根据权利要求1-6中任一项所述的组合物，其中所述葡萄糖缺陷型嗜热链球菌菌株选自由以下组成的组：DSM 32227；DSM 28889；DSM25850；DSM 25851；DSM 26722；以及其衍生的突变菌株，所述突变菌株通过使用所保藏的菌株之一作为母菌株而获得，并且其中所述突变体已保留或进一步改善其母菌株的葡萄糖分泌特性。

10.根据前述权利要求中任一项所述的组合物，其中所述葡萄糖发酵德氏乳杆菌保加利亚亚种菌株选自由以下组成的组：DSM 28910；DSM22586；以及其衍生的突变菌株，所述突变菌株的进一步特征是具有在含有乳糖和X-Gal的培养基上生成白色菌落的能力。

11.生产发酵乳制品的方法，包括用根据权利要求1-10中任一项所述的组合物接种和发酵乳基质。

12.发酵乳制品，包含根据权利要求1-10中任一项所述的组合物。

13.根据权利要求1-10中任一项所述的组合物用于制备发酵乳制品的用途。