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CN116068179B - 一种用于检测人组织型纤溶酶原激活物的胶体金试纸条 - Google Patents

一种用于检测人组织型纤溶酶原激活物的胶体金试纸条 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种用于检测人组织型纤溶酶原激活物的试纸条，包括底板，以及设置在底板上依次连接的样品垫、胶体金结合垫、硝酸纤维膜和吸水垫，硝酸纤维膜上设置有检测线；胶体金结合垫中含有结合抗体标记的胶体金颗粒；检测线中锚定捕获抗体，结合抗体和捕获抗体均可特异性地识别和结合组织型纤溶酶原激活物，并且互不干扰。本发明的胶体金试纸条，使用方便快速，能在10分钟内完成层析反应，即可用于定性检测也可用于定量检测，帮助医生在短时间内判断鼻分泌物中的tPA的情况，以确定患者术后的复发风险。本发明的试纸条操作简单，时间短，可直接在门诊进行检测，无需转到检验科。

Description

一种用于检测人组织型纤溶酶原激活物的胶体金试纸条
技术领域
本发明属生物医学检测技术领域，具体涉及一种用于检测人组织型纤溶酶原激活物的胶体金试纸条。
背景技术
慢性鼻窦炎伴鼻息肉是一种复杂且异质性的鼻窦粘膜炎症，其特征是鼻息肉的存在，估计发生在全世界1％至4％的人群中。在欧洲人和美国人中，CRSwNP的免疫学特征主要是以Th2炎症为主；而在亚洲国家，如中国和韩国，至少有一半的CRSwNP患者表现为Th1/Th17的炎症反应。
尽管手术是治疗鼻息肉的一线方法，但病人术后一年的复发率仍高达30％。如果术前可以判断病人手术后的复发情况，就可以给手术医生提示，个性化选择病人的术式以及术后的用药。前期我们研究发现，鼻分泌物中组织型纤溶酶原激活物(tPA)的蛋白水平与鼻息肉患者的术后复发有关系，可以预测鼻息肉术后的复发。
目前尚无临床型的检测鼻分泌物tPA的方法，因此我们研发的tPA试剂盒用以弥补临床检测的不足，判断病人是否术后复发，以及为术者提供个性化手术和术后治疗方案。
发明内容
为解决以上问题，本发明提供了一种用于检测组织型纤溶酶原激活物(tPA)的试纸条，包括底板，以及设置在所述底板上依次连接的样品垫、胶体金结合垫、硝酸纤维膜和吸水垫，所述硝酸纤维膜上设置有检测线；
所述胶体金结合垫中含有结合抗体标记的胶体金颗粒；所述检测线中锚定了捕获抗体，所述结合抗体和所述捕获抗体均可特异性地识别和结合组织型纤溶酶原激活物，并且所述结合抗体和所述捕获抗体与组织型纤溶酶原激活物结合的位点互不干扰。
本发明使用双抗夹心策略制备用于检测人组织型纤溶酶原激活物(tPA)的胶体金试纸条，可在短时间内快速检测目标样品中是否含有tPA，并且还能准确定量检测其含量，帮助医生快速判断鼻息肉患者术后的复发风险。
在一个优选实施方案中，所述结合抗体为纳米抗体，包含三个CDR区，序列依次如SEQ ID NO:6-8所示。
优选地，所述结合抗体的可变区序列如SEQ ID NO:5所示。
在一个优选实施方案中，所述捕获抗体为纳米抗体，包含三个CDR区，序列依次如SEQ ID NO:2-4所示。
优选地，所述捕获抗体的可变区序列如SEQ ID NO:1所示。
使用AtPA3(序列如SEQ ID NO:1所示)捕获抗体，AtPA5(序列如SEQ ID NO:5所示)作为结合抗体，可高效特异地检测出样品中的tPA。AtPA3和AtPA5均是纳米抗体，仅仅包含具有4个框架区和3个CDR的重链可变区(VHH)，其稳定性高，亲和力好，效价高，并且易于表达，有利于降低抗体制作成本。
在一个优选实施方案中，所述硝酸纤维膜上还设置有质控线，所述质控线比所述检测线远离所述胶体金结合垫。
在一个优选实施方案中，所述质控线中锚定了鼠抗羊驼IgG。
本发明的胶体金试纸条，使用方便快速，能在10分钟内完成层析反应，并用于定量检测，大大缩短了检测时间，从而帮助医生在短时间内判断患者的鼻分泌物中的tPA的情况。本发明的试纸条操作简单，时间短，可直接在门诊进行检测，无需转到检验科。
附图说明
图1为AtPA1-7与tPA的结合值统计图，结合值＝含tPA的0D450/空白OD450；
图2为AtPA3作为捕获抗体，AtPA1-2、4-7作为结合抗体进行双抗夹心ELISA检测的OD450统计图；
图3为AtPA5作为捕获抗体，AtPA1-4、6-7作为结合抗体进行双抗夹心ELISA检测的OD450统计图；
图4为本发明的试纸条的结构示意图；
图5为本发明的纸条的硝酸纤维膜的俯视图；
其中，1、底板、2、样品垫，3、胶体金结合垫，4、硝酸纤维膜，411、检测线，412、质控线，5、吸水垫。
具体实施方式
以下对本发明的原理和特征进行描述，所举实例只用于解释本发明，并非用于限定本发明的范围。
1、抗体的筛选与制备
使用全长的组织型纤溶酶原激活物(tPA)用于免疫羊驼，制备抗人TPA抗体。用250μg抗原与250μL弗氏完全佐剂混合乳化，将混合物用于免疫羊驼，完成初免。在初免2周后和4周后，对羊驼各进行一次加强免疫，加强免疫时使用1250μg抗原和250μL弗氏不完全佐剂的混合物进行。二免和三免一周后，采血测定抗血清效价。
结果显示，抗原二免和三免引发的抗血清效价分别为3.26×106和6.37×107。可见抗原诱导羊驼产生了针对相应抗原肽的高滴度抗血清。
取三免一周后的外周血，分离外周血单核细胞(PBMC)，提取RNA，反转录后使用通用引物扩增，并克隆至噬菌粒上，转化TG1菌株，建立噬菌体库用于筛选单克隆抗体。在经过多轮筛选后，我们得到7个具有高特异性和亲和力的单克隆抗体，AtPA1-7。如图1所示，这7个单克隆抗体在4×10-3μg/mL的浓度下结合值均达到2以上。进一步研究抗体组合，结果如图2和3所示，AtPA3与AtPA5组成抗体对，并且AtPA3作为捕获抗体，AtPA5作为结合抗体时，用于双抗夹心方式的免疫检测。
分析AtPA3和AtPA5的序列，结果显示，AtPA3的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示，包括3个CDR区，CDR1-3的氨基酸序列分别如SEQ ID NO:2-4所示。AtPA5的氨基酸序列如SEQID NO:5所示，包括3个CDR区，CDR1-3的氨基酸序列分别如SEQ ID NO:6-8所示。
使用tPA突变体库进行进一步研究发现，AtPA1和3的识别位点位于tPA氨基酸序列的N端，AtPA2和7位于tPA的中部，AtPA4-6的识别位点位于tPA的C端。由此推测，AtPA3和AtPA5由于识别位点相距较远，抗体的结合不发生相互影响，因此有利于配对用于双抗体夹心检测。并且，根据我们的实验显示，使用AtPA3作为捕获抗体，AtPA5作为结合抗体的情形下，结合值达到20以上，远高于其他组合。
2、tPA定量检测试纸条的制备及其使用方法
tPA试纸条的结构如图4和5所示，包括长方形的底板1，以及设置在所述底板1上依次搭接的样品垫2、胶体金结合垫3、硝酸纤维膜4和吸水垫5。在一个优选实施方案中，样品垫2与胶体金结合垫3之间的交界面增大，以提高样品扩散效率。由于交界处，样品垫2在上，胶体金结合垫3在下，在重力的作用下有利于样品从样品垫2扩散到胶体金结合垫3上。
样品垫2为经过磷酸缓冲液处理的玻璃纤维膜，所述磷酸缓冲液为含有1-5％BSA和表面活性剂的磷酸缓冲液。
胶体金结合垫3为涂覆了抗体AtPA5标记的胶体金颗粒的玻璃纤维膜。胶体金结合垫3中含有胶体金颗粒，胶体金颗粒上结合抗体AtPA5。滴加在样品垫2中的样品如果存在tPA，tPA扩散至胶体金结合垫3中后，可通过AtPA5耦合胶体金颗粒。带有胶体金颗粒的tPA继续向硝酸纤维膜4扩散，并在硝酸纤维膜4上聚集显示。
胶体金颗粒标记AtPA5抗体的方法如下：
1)胶体金的配制：用双蒸水将1％的氯金酸溶液稀释成0.01％，煮沸，加入柠檬酸三钠溶液，继续煮沸，知道液体呈亮红色，停止加热，补足因煮沸而损失的水分，即得到胶体金；
2)在胶体金加入AtPA5抗体，混匀后静置，离心取沉淀，洗涤两遍后，得到标记了AtPA5的胶体金颗粒。将标记了AtPA5的胶体金颗粒喷涂在玻璃纤维膜上，制备成胶体金结合垫3。
硝酸纤维膜4上设置有检测线411。检测线411上锚定了包被抗体AtPA3，带有胶体金颗粒的tPA在硝酸纤维膜4上扩散时，遇到检测线411时，与检测线411中锚定的包被抗体AtPA3结合，聚集于检测线411上，带有胶体金颗粒的tPA在检测线上聚集越多，则显色越深。
硝酸纤维膜4上还设置有质控线412，质控线412比检测线411远离胶体金结合垫3。质控线412上锚定了鼠抗羊驼IgG。当胶体金颗粒扩散至质控线412处时，聚集于质控线412上。因此，胶体金颗粒在扩散过程中，先遇到检测线411，结合了tPA的胶体金颗粒聚集于检测线411上，没有结合tPA的胶体金颗粒继续向前扩散，在遇到质控线412时，聚集于质控线412上。由于胶体金颗粒丰度远大于tPA，因此无论样品中是否存在tPA，质控线412都将显色。
硝酸纤维膜4的制备方法如下：
1)将硝酸纤维膜在封闭液中封闭60min，封闭液为含有1％BSA和0.1％吐温-20的0.01M的磷酸缓冲液(pH 7.0)；
2)将捕获抗体AtPA3和鼠抗羊驼IgG分别加入到点膜稀释液中，得到AtPA3点膜液和鼠抗羊驼IgG抗体点膜液，将AtPA3点膜液和鼠抗羊驼IgG点膜液分别按2μL/cm的量喷涂在相隔5mm的检测线和质控线上。其中，点膜稀释液为含有0.15M氯化钠、10mM乙二胺四乙酸、1g/L叠氮钠和25g/L甲醇的0.01M的磷酸缓冲液(pH 7.4)。AtPA3点膜液的浓度为1.25μg/mL，鼠抗羊驼IgG点膜液的浓度为1.5μg/L。
定性检测时，将棉片放入病人的双侧鼻腔，放置5分钟，之后取出棉片放于5mL EP管中，并向其加入2mL无菌生理盐水，放置5分钟。用镊子取出棉片放于10mL注射器中，将液体挤压到另一EP管。将EP管以1500g的转速离心10分钟，之后将上清转移到另一EP管用于检测tPA的水平。
取50μL鼻腔分泌物上清加入到50μL样品预处理溶液中，搅拌混匀后，滴加在检测试纸条的样品垫的加样区，于20-30℃下进行层析5min。通过观察检测线和质控线即可确定样品中是否含有tPA。即，当检测线和质控线都显色时，样品中含有tPA；当检测线不显色，质控线显色时，样品中不含tPA。
定量检测时，需要准备色值读数系统。将层析反应后的试纸条放置在色值读数系统的扫描装置下进行扫描，扫描后的图像经过色值读数系统进行处理和判定，可得出tPA的浓度。
以上所述仅为本发明的较佳实施例，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (5)

1.一种用于检测人组织型纤溶酶原激活物的试纸条，其特征在于，包括底板(1)，以及设置在所述底板(1)上依次连接的样品垫(2)、胶体金结合垫(3)、硝酸纤维膜(4)和吸水垫(5)，所述硝酸纤维膜(4)上设置有检测线(41)；
所述胶体金结合垫(3)中含有结合抗体标记的胶体金颗粒；所述检测线(41)中锚定了捕获抗体，所述结合抗体和所述捕获抗体均可特异性地识别和结合组织型纤溶酶原激活物，并且所述结合抗体和所述捕获抗体与组织型纤溶酶原激活物结合的位点互不干扰；
所述结合抗体为纳米抗体，包含三个CDR区，序列依次如SEQ ID NO:6-8所示；
所述捕获抗体为纳米抗体，包含三个CDR区，序列依次如SEQ ID NO:2-4所示。
2.根据权利要求1所述的试纸条，其特征在于，所述结合抗体的序列如SEQ ID NO:5所示。
3.根据权利要求1所述的试纸条，其特征在于，所述捕获抗体的序列如SEQ ID NO:1所示。
4.根据权利要求1-3中任一项所述的试纸条，其特征在于，所述硝酸纤维膜(4)上还设置有质控线(42)，所述质控线(42)比所述检测线(41)远离所述胶体金结合垫(3)。
5.根据权利要求4所述的试纸条，其特征在于，所述质控线(42)中锚定了鼠抗羊驼IgG。
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CB02 Change of applicant information
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Country or region after: China

Address after: 430030 No. 1095 Jiefang Avenue, Hubei, Wuhan

Applicant after: Tongji Hospital affiliated to Tongji Medical College of Huazhong University of Science & Technology

Applicant after: Delin medical technology (Wuhan) Co.,Ltd.

Address before: Room 3-2, Building 1, Baijinkezi, the intersection of Hongtu Avenue and Yintan Road, Jiangjun Road Street, Dongxihu District, Wuhan City, Hubei Province 430000

Applicant before: Delin medical technology (Wuhan) Co.,Ltd.

Country or region before: China

Applicant before: Tongji Hospital affiliated to Tongji Medical College of Huazhong University of Science & Technology

GR01 Patent grant
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