CN116023500B - 一种靶向全人源化cd70的嵌合抗原受体及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明属于肿瘤细胞免疫治疗技术领域，具体涉及一种靶向全人源化CD70的嵌合抗原受体及其应用。该嵌合抗原受体包括依次连接的胞外结构域、铰链区和跨膜区及胞内信号域，所述胞外结构域包括如SequenceNO.1所示的氨基酸序列或其功能性变体。所述胞外结构域还包括CD8信号肽，其包含如SequenceNO.2所示的氨基酸序列或其功能性变体。该嵌合抗原受体及其CAR‑T细胞可以有效杀伤786‑O‑Luc‑GFP靶细胞，分泌有效量的细胞因子，可以有效抑制体内肿瘤的生长，抗表达CD70靶点的肿瘤效果显著。

Description

一种靶向全人源化CD70的嵌合抗原受体及其应用

技术领域

本发明属于肿瘤细胞免疫治疗技术领域，具体涉及一种靶向全人源化CD70的嵌合抗原受体及其应用。

背景技术

CAR-T全称是嵌合抗原受体T细胞免疫疗法，嵌合抗原受体(chimeric antigenreceptor，CAR)是模拟TCR功能的人工受体，包括依次连接的包含ScFv的胞外结构域、铰链区和跨膜区及胞内信号域，胞内信号域通常为CD3ζ链或FcRγ，或与一种或多种共刺激分子相连，如4-1BB，CD28，ICOS(CD278)。CAR分子包含的ScFv对肿瘤抗原具有特异性识别的特点，通过铰链区和跨膜区进行T细胞激活细胞传递。目前临床上CAR-T治疗主要运用于血液瘤系统的肿瘤治疗。

CD70是肿瘤坏死因子受体(TNFR)超家族的成员之一，是一种Ⅱ型跨膜蛋白，主要表达于活化的T细胞、B细胞、自然杀伤细胞以及树突状细胞中。CD70的受体是CD27,CD70与CD27相互作用促进T细胞和B细胞的活化、增殖及分化，在调控免疫应答过程中发挥重要作用。CD70仅短暂的表达于活化的淋巴细胞中，但其在多种肿瘤组织中高水平表达，目前证实的高表达CD70的肿瘤组织包括肾癌、血源性恶性肿瘤、胸腺肿瘤、卵巢癌、成神经胶质细胞瘤、鼻咽癌等多种肿瘤组织。使其可能成为肿瘤免疫治疗的一个有效的靶点。

CD70相较于传统的CAR-T靶点适应症更广、安全性高，并且覆盖血液系统肿瘤和实体瘤，是具有潜力的CAR-T治疗靶点，目前还未有相关靶点药物上市。国外有相关的单抗和ScFv在研，国内尚无，开发靶向全人源化的CD70的嵌合抗原受体非常有必要，开发靶向全人源化CD70的嵌合抗原受体及CAR-T细胞制品具有极大的临床应用价值，涉及CAR-T时，所针对的抗原基因序列的选择是关键性的选择，鉴于体内基因表达的复杂性以及各种不可控隐私，选择到一个合适的可以用于CAR-T的基因是非常困难的，这是发展CAR-T技术的难点。

发明内容

有鉴于此，本发明目的在于提供一种靶向全人源化CD70的嵌合抗原受体，该嵌合抗原受体与运载体结合转染T细胞后，可以精准识别CD70靶点，并对靶细胞进行有效杀伤。

所述靶向CD70的嵌合抗原受体，包括胞外结构域、铰链区和跨膜区及胞内信号域，所述胞外结构域包括如SequenceNO.1所示的氨基酸序列或其功能性变体。

在某些具体实施例中，胞外结构域包括如SequenceNO.1所示的氨基酸序列或其功能性变体，即靶向CD70的ScFv，其制备方法是通过噬菌体展示技术构建全人源的单链抗体库，通过适当方法的亲和淘选，富集携带某种具有特异亲和力片段的噬菌体，测序即可获得其基因序列。为筛选到靶向CD70抗原的人源抗体，构建了全人源的单链抗体库，以正常人的PBMC为原材料，抽提总RNA反转录cDNA，扩增抗体可变区，通过连接肽(Linker)将重链可变区VH与轻链可变区VL连接起来，将其构建至噬菌粒载体，电转至展示菌株，构建抗体库，由CD70胞外段抗原对文库进行淘选，对筛选出的克隆进行鉴定，最终获得了具有特异性结合CD70抗原的ScFv。在进行构建嵌合抗原受体或其他用途时，对ScFv进行PCR人工合成即可得到大量靶向CD70的ScFv，即得到包括如SequenceNO.1所示的氨基酸序列或其功能性变体的胞外结构域。

进一步，所述胞外结构域还包括CD8信号肽，其包含如SequenceNO.2所示的氨基酸序列或其功能性变体。CD70抗体是在所述CD8信号肽的引导下定位在细胞膜上，如本领域技术人员所知，所有其他的可用于CAR或者抗体领域的信号肽都可以用于本发明中，胞外段一般包含CD8α或GM-CSFRα信号肽。

进一步，所述铰链可以来源于：IgG、CD8、CD7、CD4及其功能性变体；所述铰链区优选包含以下任选氨基酸序列中的一种或其功能性变体：SequenceNO.3、SequenceNO.4、SequenceNO.5、SequenceNO.6，可以使得得到的嵌合抗原受体起到更好的细胞杀伤效果和更好的刺激细胞因子分泌。

进一步，所述跨膜区可以来源于：CD8、CD28、CD3ε、CD4、CD16、CD137、CD80以及CD86；同理，所述跨膜区优选包含以下任选氨基酸序列中的一种或其功能性变体：SequenceNO.7、SequenceNO.8。

进一步，所述胞内信号域包含信号传导区和共刺激结构域，所述胞内信号传导区与共刺激结构域可来源于：CD3、CD137、CD28、CD27、OX40、ICOS、GITR、CD2、CD40、PD-1、PD1L、B7-H3、淋巴细胞功能相关抗原-1(LFA-1)、ICAM-1、CD7、NKG2C、CD83、CD86以及CD127；所述信号传导区优选包含SequenceNO.9或SequenceNO.34所示的氨基酸序列或其功能性变体；所述共刺激结构域优选包含以下任选的氨基酸序列中的一种或多种或其功能性变体的一种或多种：SequenceNO.10、SequenceNO.11、SequenceNO.12。

在某些具体实施例中，所述嵌合抗原受体包括以下任选组合中的一种：

组合1)：所述铰链区包含如SequenceNO.3所示的氨基酸序列或其功能性变体，所述跨膜区包含如SequenceNO.7所示的氨基酸序列或其功能性变体，所述胞内信号域包含SequenceNO.34所示的氨基酸序列或其功能性变体和SequenceNO.10的序列氨基酸序列或其功能性变体；

组合2)：所述铰链区包含如SequenceNO.4所示的氨基酸序列或其功能性变体，所述跨膜区包含如SequenceNO.8所示的氨基酸序列或其功能性变体，所述胞内信号域包含SequenceNO.34所示的氨基酸序列或其功能性变体和SequenceNO.11的所示的氨基酸序列或其功能性变体；

组合3)：所述铰链区包含如SequenceNO.6所示的氨基酸序列或其功能性变体，所述跨膜区包含如SequenceNO.8所示的氨基酸序列或其功能性变体，所述所述胞内信号域包含如SequenceNO.9所示的氨基酸序列或其功能性变体和SequenceNO.12所示的氨基酸序列或其功能性变体；

组合4)：所述铰链区包含如SequenceNO.5所示的氨基酸序列或其功能性变体，所述跨膜区包含如SequenceNO.8所示的氨基酸序列或其功能性变体，所述胞内信号域包含SequenceNO.9所示的氨基酸序列或其功能性变体和SequenceNO.12所示的氨基酸序列或其功能性变体；

组合5)：所述铰链区包含如SequenceNO.6所示的氨基酸序列或其功能性变体，所述跨膜区包含如SequenceNO.7所示的氨基酸序列或其功能性变体，所述胞内信号域包含SequenceNO.34所示的氨基酸序列或其功能性变体和SequenceNO.10所示的氨基酸序列或其功能性变体。

在某些实施例中，所述嵌合抗原受体包含天然杀伤细胞受体(NKR)的一种或多种组分，因而形成NKR-CAR。NKR组分可以是来自以下任何天然杀伤细胞受体的跨膜结构域、铰链结构域或胞质结构域：杀伤细胞免疫球蛋白样受体(KIR)，例如KIR2DL1、KIR2DL2/L3、KIR2DL4、KIR2DL5A、KIR2DL5B、KIR2DS1、KIR2DS2、KIR2DS3、KIR2DS4、DIR2DS5、KIR3DL1/S1、KIR3DL2、KIR3DL3、KIR2DP1和KIR3DP1；天然细胞毒性受体(NCR)，例如，NKp30、NKp44、NKp46；免疫细胞受体的信号传导淋巴细胞活化分子(SLAM)家族，例如，CD48、CD229、2B4、CD84、NTB-A、CRA、BLAME和CD2F-10；Fc受体(FcR)，例如，CD16、和CD64；和Ly49受体，例如，LY49A、LY49C。所述的NKR-CAR分子可以与衔接分子或胞内共刺激结构域(例如，DAP12)相互作用。

本发明目的在于还提供一种编码前述的嵌合抗原受体的核酸序列，该核酸序列作为目的基因与运载体结合一同转染T细胞得到CAR-T细胞。

编码所述嵌合抗原受体中组合1)的核酸序列包含如SequenceNO.13所示的序列；或编码所述嵌合抗原受体中组合2)的核酸序列b包含如SequenceNO.14所示的序列；或编码所述嵌合抗原受体中组合3)的核酸序列c包含如SequenceNO.15所示的序列；或编码所述嵌合抗原受体中组合4)的核酸序列d包含如SequenceNO.16所示的序列；或编码所述组合5)的核酸序列e包含如SequenceNO.36所示的序列。

进一步，所述嵌合抗原受体还包括启动子，所述启动子的核酸序列如SequenceNO.18或SequenceNO.19所示。

在某些具体实施例中，所述核酸序列a的5'端连接启动子，所述启动子的核酸序列如SequenceNO.18或SequenceNO.19所示；或所述核酸序列b的5'端连接启动子，所述启动子的核酸序列如SequenceNO.19所示；或所述核酸序列c的5'端连接启动子，所述启动子的核酸序列如SequenceNO.18或SequenceNO.19所示；或所述核酸序列d的5'端连接启动子，所述启动子的核酸序列如SequenceNO.18或SequenceNO.19所示；或所述核酸序列e的5'端连接启动子，所述启动子的核酸序列如SequenceNO.19所示。

在某些具体实施例中，所述核酸序列a的5'端连接连接信号肽序列a；或所述核酸序列b的5'端连接连接信号肽序列b；或所述核酸序列c的5'端连接连接信号肽序列c；或所述核酸序列d的5'端连接连接信号肽序列d；或所述核酸序列e的5'端连接连接信号肽序列e；所述信号肽序列a、所述信号肽序列b、所述信号肽序列c、所述信号肽序列d、所述信号肽序列e的核酸序列均如SequenceNO.17所示。所述信号肽序列a的5'端连接启动子，所述启动子的核酸序列如SequenceNO.18或SequenceNO.19所示；或所述信号肽序列b的5'端连接启动子，所述启动子的核酸序列如SequenceNO.19所示；或所述信号肽序列c的5'端连接启动子，所述启动子的核酸序列如SequenceNO.18或SequenceNO.19所示；或所述信号肽序列d的5'端连接启动子，所述启动子的核酸序列如SequenceNO.18或SequenceNO.19所示；或所述信号肽序列e的5'端连接启动子，所述启动子的核酸序列如SequenceNO.19所示。

进一步，为了在本底较高的肿瘤环境中发挥CAR的肿瘤特异性的杀伤能力，可以在本发明中的CAR的结构中加上CD70干扰RNA序列。具体地，编码所述嵌合抗原受体中的核酸序列(包括或不包括启动子)还包括还包括CD70干扰RNA，所述CD70干扰RNA序列如SequenceNO.20所示。

在某些实施例中，为了克服实体瘤中的肿瘤微环境，可以在本发明的CAR的结构中加上缺氧启动子。

在某些具体实施例中，所述核酸序列d或所述信号肽序列d的5'端连接启动子，所述启动子的核酸序列如SequenceNO.18或SequenceNO.19所示；所述核酸序列d的3'端连接CD70干扰RNA序列，所述CD70干扰RNA序列如SequenceNO.20所示。

本发明目的在于还提供一种包含前任一所述的嵌合抗原受体的核酸序列的表达载体。

进一步，所述表达载体选自慢病毒表达载体、逆转录病毒表达载体、腺病毒表达载体、腺相关病毒表达载体、DNA载体，RNA载体、质粒中的任一种。

在某些实施例中，所述慢病毒载体选自基本上由以下组成的群组：人免疫缺陷病毒1(HIV-1)、人免疫缺陷病毒2(HIV-2)、维斯纳-梅迪病毒(visna-maedi virus，VMV)病毒、山羊关节炎-脑炎病毒(CAEV)、马传染性贫血病毒(EIAV)、猫免疫缺陷病毒(FIV)、牛免疫缺陷病毒(BIV)和猿猴免疫缺陷病毒(SIV)。

在某些实施例中，载体包含左(5')逆转录病毒LTR、Psi(Ψ)包装信号、中心多嘌呤段/DNA瓣(cPPT/FLAP)、逆转录病毒导出元件、可操作地连接到编码本发明所涵盖的CAR的多核苷酸的启动子和右(3')逆转录病毒LTR。

在某些实施例中，CAR包含乙型肝炎病毒转录后调节元件(HPRE)或土拔鼠转录后调节元件(WPRE)以及优化的土拔鼠转录后调节元件(oPRE)。

在某些实施例中，编码前述的嵌合抗原受体的核酸序列包含优化的Kozark序列。

在某些实施例中，所述基因表达载体可以包含分泌型抗PD-1ScFv；在某些实施例中，所述基因表达载体包含PD-1共轭转导肽(如PD-1-CD28-CD137-CD3信号结构)；在某些实施例中，所述基因表达载体可以包含多个CAR组合，如2个靶向不同抗原或同一抗原的不同识别位点的CAR组合。

本发明目的在于还提供一种工程化的细胞，所述细胞中转导有前任一所述的嵌合抗原受体的核酸序列或前任一所述的表达载体；优选的，所述细胞为T细胞、T细胞前体或NK细胞。

本发明目的在于还进一步提供一种细胞制品，所述细胞制品包括前任一所述的工程化的细胞。

进一步，所述细胞制品还包括其他可增强CAR表达活性的活性剂。

在某些具体实施例中，所述活性剂为免疫抑制剂，例如环孢素(cyclosporin)、硫唑嘌呤(azathioprine)、甲氨蝶呤(methotrexate)、霉酚酸酯(mycophenolate)和FK506、抗体或其它免疫清除剂(immunoablativeagents)例如CAMPATH、抗CD3抗体或其它抗体治疗、环磷酰胺(cytoxan)、氟达拉滨(fludarabine)、环孢素(cyclosporin)、FK506、雷帕霉素(rapamycin)、霉酚酸(mycophenolicacid)、类固醇(steroids)、FR901228、细胞因子和辐射。

在某些具体实施例中，增强CAR表达细胞活性的活性剂可以是阻断抑制性分子的活性剂。抑制性分子如PD1可以在一些实施方案中降低CAR表达细胞发动免疫效应子反应的能力。抑制性分子包括PD1、PD-L1、CTLA4、TIM3、LAG3、VISTA、BTLA、TIGIT,LAIR1、CD160、2B4、CEACAM(CEACAM-1、CEACAM-3、CEACAM-5)、LAG3、VISTA、BTLA、TIG、LAIR1、CD160、2B4、CD80、CD86、B7-H3(CD276)、B7-H4(VTCN1)、HVEM(TNFRSF14或CD270)、KIR、A2aR、MHC I类、MHC II类、GAL9、腺苷、TGFR(TGFRβ)和TGFRβ。所述抑制性分子的胞外结构域可以融合到跨膜结构域和胞内信号传导结构域，比如PD1 CAR。

进一步，多种另外的治疗剂可以与本文所述的组合物联合使用。例如，潜在有用的另外的治疗剂包括P D-1抑制剂，例如纳武单抗(nivolumab)派姆单抗(pembrolizumab)派姆单抗、阿巴伏单抗(pidilizumab)和阿特珠单抗(Atezolizumab)。

具体地，适合于与本发明组合使用的另外的治疗剂包括但不限于伊布替尼(ibrutinib)奥法木单抗(ofa tumuma b)利妥昔单抗(rituxima b)贝伐单抗(beva cizumab)曲妥珠单抗(tras tuzuma b)t ra s tuz uma bem ta ns i ne伊马替尼(ima ti n ib)西妥昔单抗(c e t u x i m a b)帕尼单抗(pa n i t u m u m a b)卡妥索单抗(Catumaxomab)、替伊莫单抗(ibritumomab)、奥法木单抗、托西莫单抗(tositumomab)、本妥昔单抗(brentuximab)、阿仑单抗(alemtuzumab)、吉妥珠单抗(gemtuzumab)、厄洛替尼(erlotinib)、吉非替尼(gefitinib)、凡德他尼(vandetanib)、阿法替尼afatinib)、拉帕替尼(lapatinib)、来那替尼(neratinib)、阿昔替尼(axitinib)、马赛替尼(masitini b)、帕唑帕尼(pa zopa ni b)、舒尼替尼(sunitini b)、索拉非尼(sorafenib)、toceranib、来他替尼(lestaurtinib)、阿昔替尼(axitinib)、西地尼布(cediranib)、乐伐替尼(lenvatinib)、尼达尼布(nintedanib)、帕唑帕尼(pazopanib)、瑞格非尼(regorafenib)、司马沙尼(semaxanib)、索拉非尼(sorafenib)、舒尼替尼(sunitinib)、tivozanib、toceranib、凡德他尼、恩曲替尼(entrectinib)、卡博替尼(cabozantinib)、伊马替尼(imatinib)、达沙替尼(dasatinib)、尼洛替尼(nilotinib)、帕纳替尼(pona tini b)、雷多替尼(rad otini b)、博舒替尼(bosutini b)、来他替尼(lestaurtinib)、鲁索替尼(ruxolitinib)、pacritinib、考比替尼(cobimetinib)、司美替尼(selumetinib)、曲美替尼(trametinib)、binimetinib、阿雷替尼(alectinib)、色瑞替尼(ceritinib)、克唑替尼(crizotinib)、阿柏西普(aflibercept)、adipotide、地尼白介素。

进一步，所述细胞制品还可以与一些治疗手段组合使用，所述治疗手段可以是手术、化疗、放射。

本发明目的在于还进一步提供一种药物组合物，所述药物组合物中包括前任一所述的嵌合抗原受体的核酸序列或前任一所述的表达载体或前任一所述的工程化的细胞。

本发明目的在于还提供一种前任一所述的嵌合抗原受体或前任一所述的嵌合抗原受体的核酸序列或前任一所述的表达载体或前任一所述的工程化的细胞或前任一所述的细胞制品或前任一所述的药物组合物在制备抗肿瘤药物中的应用。

具体地，所述抗肿瘤药物包含但不限于抗肾癌药物、抗血源性恶性肿瘤药物、抗胸腺肿瘤药物、抗卵巢癌药物、抗成神经胶质细胞瘤药物、抗鼻咽癌药物。

本发明中，术语“功能性变体”通常是指包括与其具有基本上相同的功能(例如，可以具备所述嵌合抗原受体的性质)，且与其具有至少85％(例如，至少85％，至少90％，至少91％，至少92％，至少93％，至少94％，至少95％，至少96％，至少97％，至少98％，至少99％，或至少100％)序列同一性的氨基酸序列。在某些实施方式中，所述氨基酸序列的变体为与其具有基本上相同的功能。

本发明有益效果在于

本发明提供的嵌合抗原受体及CAR-T细胞可以有效杀伤786-O-Luc-GFP靶细胞，以及可以分泌有效量的细胞因子。

本发明提供的嵌合抗原受体及CAR-T细胞可以有效抑制体内肿瘤的生长，抗表达CD70靶点的肿瘤效果显著。

附图说明

图1为不同ScFv CAR-T制剂体外细胞杀伤结果。

图2为不同ScFv CAR-T制剂体外IFN-γ细胞因子分泌结果。

图3为不同ScFv CAR-T制剂体外IL-2细胞因子分泌结果。

图4为不同ScFv CAR-T制剂活体成像荧光值变化曲线。

图5为不同ScFv CAR-T制剂的肿瘤体积生长曲线。

图6为不同ScFv CAR-T制剂的活体成像图。

图7为含CD70(1)ScFv的不同CAR-T制剂的体外阳性率检测结果。

图8为含CD70(1)ScFv的不同CAR-T制剂的体外细胞杀伤结果。

图9为含CD70(1)ScFv的不同CAR-T制剂的体外因子分泌结果。

图10为含CD70(1)ScFv的不同CAR-T制剂的体内CAR阳性率检测结果。

图11为含CD70(1)ScFv的不同CAR-T制剂的活体成像荧光值变化曲线。

图12为含CD70(1)ScFv的不同CAR-T制剂的体内肿瘤体积生长曲线。

图13为含CD70(1)ScFv的不同CAR-T制剂的活体成像图。

图14为CAR-8和CAR-9的体外阳性率检测结果。

图15为CAR-8和CAR-9的体外细胞杀伤结果。

图16为CAR-8和CAR-9的体外因子分泌结果。

具体实施方式

所举实施例是为了更好地对本发明进行说明，但并不是本发明的内容仅局限于所举实施例。所以熟悉本领域的技术人员根据上述发明内容对实施方案进行非本质的改进和调整，仍属于本发明的保护范围。

本发明实施例中,人源化CD70的制备方法为：

(1)全人源单链抗体文库的构建

Ficoll分离液进行PBMC分离，取Ficoll分离液缓缓加入采集的正常人血液，使得Ficoll分离液与正常人血液保持清晰的分离界面。将装有所述血液和分离液的50mL离心管于15℃左右离心20min。离心之后，整个液面分为四层，上层为血浆混合物，下层为红细胞和粒细胞，中层为Ficoll液体，其中在上、中层交界处有以PBMC为主的白色云雾层狭窄带，即PBMC细胞层。用新的无菌巴氏吸管吸取PBMC，获得分离的PBMC。

通过常规方法提取总RNA并反转录成cDNA。基于重链和轻链种系基因序列的相似度，分别在可变区两端设计简并引物((李晓琳，大容量非免疫人源性Fab噬菌体抗体库的构建及初步筛选，《中国协和医科大学》硕士学位论文，2007年6月)，PCR得到抗体的重链可变区基因片段和轻链可变区基因片段，通过常规的重叠PCR的方法扩增得到ScFv核酸片段(PCR方法参考《分子克隆实验指南(Molecular Cloning:A Laboratory Manual)》(第三版)，美国，Joe Sambrook，David Russell.科学出版社)，将ScFv核酸片段与噬菌粒载体pComb3xss进行连接，通过电转仪将产物转化至TGI菌株中，得到全人源单链抗体库。

(2)噬菌体展示全人源单链抗体文库制备

将文库菌液加入到新鲜的LB液体培养基中复苏，VCSM13:菌＝50:1的感染复数添加VSCM13辅助噬菌体，充分混匀，摇床中继续培养。将培养物离心弃上清，沉淀则以氨苄青霉素、卡那霉素双抗性SOB培养基重悬培养过夜。菌液于4℃8000rpm离心20min，收集上清并加入1/5体积的20％PEG 8000 2.5mmol/L NaCl溶液，冰上孵育1小时，再4℃12000rpm离心30min，将沉淀的噬菌体用PBS重悬并用0.22μm滤膜过滤。

(3)CD70抗原淘选

将带有Fc标签的CD70蛋白与proteinG磁珠共孵育，制备为CD70-proteinG偶联磁珠，将偶联磁珠抽入到制备得到的全人源单链抗体文库噬菌体淘选中，经历3-4轮的共孵育、清洗和洗脱的淘选过程，即可富集得到针对抗原的特异性单克隆抗体。

(4)阳性克隆的筛选

淘选结束后，挑取最终出库的单克隆菌斑进行ELISA检测筛选，检测结果如图1所示，得到与CD70抗原有结合的噬菌体克隆，淘选得到靶向CD70的ScFv，具备人CD70抗原的特异性结合能力。靶向CD70的ScFv的氨基酸序列如Sequence NO.1所示，陶选了多条，只是这一条能够成功的构建CAR

本发明实施例中，抗原淘选的具体实施过程如下：

(1)封闭：5％脱脂奶粉以PBS溶解，过滤后作为封闭液，以适量封闭液分别重悬噬菌体与CD70-proteinG偶联磁珠，滚转混匀；

(2)共孵育：将CD70-proteinG偶联磁珠置于磁力架，弃上清后以噬菌体将磁珠重悬，滚转共孵育；

(3)清洗：将磁珠噬菌体混合液置于磁力架，弃上清后加入清洗液对磁珠进行清洗，根据不同的淘选轮数进行清洗次数的确定，；

(4)洗脱：将清洗后的磁珠置于磁力架，吸干上清，加入Gly-HCl 4，混匀后室温孵育7min后加入约Tris-HCl调节pH接近中性，最终将混合物置于磁力架，将噬菌体上清转移至新的1.5mL EP管完成一轮淘选；

(5)富集：将噬菌体接入到TGI菌液中进行感染，静止后离心，重悬沉淀，涂布于2YTAG板，倒置过夜培养；

(6)洗板：将过夜培养的平板由培养基洗下菌斑，作为下一轮文库包装的种子菌液。

本发明实施例中，ELISA检测的具体实施过程如下：

(1)包被：用碳酸盐包被缓冲液稀释CD70抗原至1μg/mL，100μL/孔加入至96孔板，4℃封盖过夜；

(2)噬菌体样品的获得：将过夜培养的噬菌体单克隆重组菌液离心10min，取上清作为检测样品；

(3)封闭：抗原包被板在洗板机上以PBS洗板3次后每孔加入脱脂奶粉封闭液，37℃封闭；

(4)抗体孵育：洗板机洗板3次后每孔加入待检噬菌体单克隆重组菌液，37℃孵育；

(5)加二抗：洗板机洗板3次，每孔加入1：5000Anti-M13-HRP二抗100μL，37℃孵育；

(6)显色：洗板机洗板6次，每孔加入显色液，室温避光放置25min显色；

(7)终止：每孔加入H₂SO₄终止反应；

(8)检测：将检测板置于酶标仪中检测OD₄₅₀吸光度，高于阴性对照2.5倍的噬菌体克隆即为阳性克隆。

本发明实施例中，载体结构元件的序列如下表1所示；8H/7H/8hdc/G4H/G4HH2H3mt为不同的铰链结构；8TM/28TM为不同的跨膜结构；28z/BBz/28z(YMFM)为不同的胞内信号结构。

本发明实施例中，CD70(1)/CD70(2)/CD70(3)/CD70(4)是不同靶向CD70的ScFv，不同的ScFv为CD70 ScFv、CD70 ScFv2、CD70 ScFv3和CD70 ScFv4。

表1载体结构元件的序列

实施例1质粒构建

通过PCR扩增获得CD70抗体的ScFv序列，再通过限制性内酶酶切的方式，将序列连接于含不同启动子、不同铰链、不同跨膜、不同共刺激信号的慢病毒载体中，即获得不同结构的靶向CD70的CAR T质粒载体，通过测序比对验证后，结构建成功，具体简称及结构对应见表2。

表2CAR结构及简称

由于活化的T细胞会瞬时的表达CD70，为了验证T细胞内源CD70的表达与CAR-T功能的影响，也为了阻止这种CAR与身体自身的免疫细胞上的CD70结合，杀死身体自身的免疫细胞，本发明实施例还设计了包含CD70干扰RNA的CAR-T序列，如表2中，CAR-17和CAR-19的区别是CAR-19加了CD70干扰RNA序列。本发明实施例是在本底较低的情况下做的实验，CAR-17和CAR-19做出来的体内与体外结果相差不大，可以大胆猜测，如果本底较高，含有CD70干扰RNA序列的CAR的效果明显优于没有CD70干扰RNA序列的CAR的效果。除了本试验的设计外，在某些实施例中，还可以将携带CD70干扰RNA的载体与CAR载体共转染T细胞，已达到干扰内源性CD70的的目的；在某些实施例中还可以使用基因编辑的方式如：锌指技术、TELN、Cas9、Cas12等基因编辑方式导致内源性CD70表达降低或破坏从而失活，如敲除内源性CD70表达；在某些实施例中还可以使用专利CN111826352A和专利CN113088495A的技术导致内源性CD70表达降低或破坏从而失活。

实施例2慢病毒制备

本实施例包装慢病毒采用磷酸钙法，具体为：用含10％FBS(w/v)的DMEM培养基培养293T细胞至较佳状态，包装质粒(RRE:REV:2G)和表达质粒按一定比列加入到1.5的离心管中，加入CaCl2和2×HBS，混匀后室温静置后加入到处理好的293T细胞培养液中，3-5h后再次换液至10mL含10％FBS的DMEM培养基，48h或72h后收集细胞上清，纯化病毒。获得实施例1中15个病毒颗粒。

实施例3CAR-T细胞制备

利用梯度离心法进行淋巴细胞分离；离心后，取第二层白色淋巴细胞层，生理盐水洗涤，加入含有10％FBS的RPMI 1640完全培养基培养，获得人PBMC细胞。获得的PBMC细胞经抗CD3、CD28单克隆抗体活化24h后，按一定的感染复数(MOI)感染已活化的PBMC，在病毒感染的第8天检测CAR-T的阳性率，检测方法为流式检测，抗体为：Protein-L-PE，Protein-L可识别抗体轻链，CAR抗原识别区的ScFv序列的轻链可被Protein-L识别，因此利用Protein-L可检测CAR阳性率和CAR表达强度。

实施例4不同人源化ScFv体内外药效学评价

将实施例3制备包含CAR-2、CAR-3、CAR-4、CAR-5的CAR-T细胞制剂，4种CAR-T只有ScFv不同，其余均相同，验证不同ScFv制备CAR-T的可行性。通过Protein-L检测CAR阳性率，具体结果见表3。

表3不同CAR-T细胞制剂的阳性率

以Control T为对照组，实验组设置CAR-2组、CAR-3组、CAR-4组，以786-O-Luc-GFP(CD70阳性)、A549-Luc-GFP(CD70阴性)为靶细胞，通过体外杀伤和体外因子分泌验证体外有效性。结果显示CAR-2、CAR-3、CAR-4体外相比对照组有一定杀伤及因子分泌，但效果不好，CAR-5组杀伤及因子分泌均较高，详细结果见图1、图2和图3。

选用NOG小鼠(雌性，6周龄)，以5×10⁶Cells/只剂量皮下注射(i.v.)786-O-Luc-GFP细胞建立体内荷瘤模型，荷瘤后42d以3×10⁶CAR-T Cells/只剂量尾静脉注射(i.v.)给予不同组别(Saline、Control、CAR-2、CAR-3、CAR-4、CAR-5)，结果显示CAR-5组体内抗肿瘤效果最好，具体结果见图4、图5和图6；仅有CD70(1)ScFv构建的CAR-T优异的体内体外疗效。

实施例5含CD70(1)ScFv的不同CAR-T制剂体外药效评价

为进一步确定CD70(1)ScFv不同CAR-T制剂的抗肿瘤效果，参考实施例3制备含CD70(1)ScFv的不同CAR-T制剂CAR-5、CAR-11、CAR-12、CAR-13、CAR-14、CAR-16，通过Protein-L检测CAR阳性率，具体结果见图7。以Control T为对照组，上述CAR-T制剂为实验组，以786-O-Luc-GFP(CD70阳性)、A549-Luc-GFP(CD70阴性)为靶细胞，通过体外杀伤和体外因子分泌验证体外有效性。结果显示实验组相比对照组均有明显的杀伤及因子分泌详细结果见图8、图9。

实施例6含CD70(1)ScFv的不同CAR-T制剂体内以及体外药效评价

为进一步评估CD70(1)ScFv不同CAR-T制剂的体内抗肿瘤效果，参考实施例3制备含CD70(1)ScFv的不同CAR-T制剂CAR-5、CAR-12、CAR-13、CAR-14、CAR-16、CAR-17、CAR-19，通过Protein-L检测CAR阳性率，具体结果见图10。选用NOG小鼠(雌性，6周龄)，以5×10⁶Cells/只剂量皮下注射(i.v.)786-O-Luc-GFP细胞建立体内荷瘤模型，荷瘤后30d以1.5×10⁶CAR-T Cells/只剂量尾静脉注射(i.v.)给予不同组别的CAR-T细胞制剂，通过活体成像和肿瘤测量观察肿瘤体内生长情况，以评估CD70(1)ScFv不同CAR-T制剂的体内抗肿瘤效果。结果显示，各组体内抗肿瘤效果明显，详细结果见图11、图12和图13。

实施例7

接着再次验证其他的CAR结构是否有效，只验证体外的药效评价，结果见图14-16所示，验证CAR-8和CAR-9也是可行的，以此类推出本专利中的SCFV可以适用于所有的CAR结构。

最后说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管参照较佳实施例对本发明进行了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的宗旨和范围，其均应涵盖在本发明的权利要求范围当中。

序列表

<110> 重庆精准生物技术有限公司、重庆精准生物产业技术研究院有限公司

<120> 一种靶向全人源化CD70的嵌合抗原受体及其应用

<130> 2021-10-12

<160> 42

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 244

<212> PRT

<213> 人工合成(Artificial Sequence)

<400> 1

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Ser Tyr

20 25 30

Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile

35 40 45

Phe Ala Ala Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro

65 70 75 80

Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Tyr Ser Thr Pro Trp

85 90 95

Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Asp Ile Lys Arg Gly Ser Thr Ser

100 105 110

Gly Ser Gly Lys Pro Gly Ser Gly Glu Gly Ser Thr Lys Gly Glu Val

115 120 125

Gln Leu Val Gln Ser Gly Pro Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala Ser Val

130 135 140

Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Tyr Tyr Met

145 150 155 160

Asn Trp Val Arg Gln Met His Gly Lys Gly Leu Glu Trp Met Gly Val

165 170 175

Ile Asn Pro Tyr Asn Gly Gly Thr Asp Tyr Asn Gln Lys Phe Lys Gly

180 185 190

Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Lys Ser Thr Ser Thr Ala Tyr Met Glu

195 200 205

Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg

210 215 220

Ser Val Tyr Asp Tyr Pro Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val

225 230 235 240

Thr Val Ser Ser

<210> 2

<211> 21

<212> PRT

<213> 人工合成(Artificial Sequence)

<400> 2

Met Ala Leu Pro Val Thr Ala Leu Leu Leu Pro Leu Ala Leu Leu Leu

1 5 10 15

His Ala Ala Arg Pro

20

<210> 3

<211> 45

<212> PRT

<213> 人工合成(Artificial Sequence)

<400> 3

Thr Thr Thr Pro Ala Pro Arg Pro Pro Thr Pro Ala Pro Thr Ile Ala

1 5 10 15

Ser Gln Pro Leu Ser Leu Arg Pro Glu Ala Cys Arg Pro Ala Ala Gly

20 25 30

Gly Ala Val His Thr Arg Gly Leu Asp Phe Ala Cys Asp

35 40 45

<210> 4

<211> 47

<212> PRT

<213> 人工合成(Artificial Sequence)

<400> 4

Lys Pro Thr Thr Thr Pro Ala Pro Arg Pro Pro Thr Pro Ala Pro Thr

1 5 10 15

Ile Ala Ser Gln Pro Leu Ser Leu Arg Pro Glu Ala Cys Arg Pro Ala

20 25 30

Ala Gly Gly Ala Val His Thr Arg Gly Leu Asp Phe Ala Cys Asp

35 40 45

<210> 5

<211> 36

<212> PRT

<213> 人工合成(Artificial Sequence)

<400> 5

Ala Pro Pro Arg Ala Ser Ala Leu Pro Ala Pro Pro Thr Gly Ser Ala

1 5 10 15

Leu Pro Asp Pro Gln Thr Ala Ser Ala Leu Pro Asp Pro Pro Ala Ala

20 25 30

Ser Ala Leu Pro

35

<210> 6

<211> 228

<212> PRT

<213> 人工合成(Artificial Sequence)

<400> 6

Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Pro Val

1 5 10 15

Ala Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu

20 25 30

Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser

35 40 45

Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu

50 55 60

Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Gln Ser Thr

65 70 75 80

Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn

85 90 95

Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser Ser

100 105 110

Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln

115 120 125

Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val

130 135 140

Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val

145 150 155 160

Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro

165 170 175

Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu Thr

180 185 190

Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val

195 200 205

Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu

210 215 220

Ser Leu Gly Lys

225

<210> 7

<211> 24

<212> PRT

<213> 人工合成(Artificial Sequence)

<400> 7

Ile Tyr Ile Trp Ala Pro Leu Ala Gly Thr Cys Gly Val Leu Leu Leu

1 5 10 15

Ser Leu Val Ile Thr Leu Tyr Cys

20

<210> 8

<211> 27

<212> PRT

<213> 人工合成(Artificial Sequence)

<400> 8

Phe Trp Val Leu Val Val Val Gly Gly Val Leu Ala Cys Tyr Ser Leu

1 5 10 15

Leu Val Thr Val Ala Phe Ile Ile Phe Trp Val

20 25

<210> 9

<211> 112

<212> PRT

<213> 人工合成(Artificial Sequence)

<400> 9

Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Gln Gln Gly

1 5 10 15

Gln Ser Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr

20 25 30

Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys

35 40 45

Pro Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys

50 55 60

Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg

65 70 75 80

Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala

85 90 95

Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg

100 105 110

<210> 10

<211> 42

<212> PRT

<213> 人工合成(Artificial Sequence)

<400> 10

Lys Arg Gly Arg Lys Lys Leu Leu Tyr Ile Phe Lys Gln Pro Phe Met

1 5 10 15

Arg Pro Val Gln Thr Thr Gln Glu Glu Asp Gly Cys Ser Cys Arg Phe

20 25 30

Pro Glu Glu Glu Glu Gly Gly Cys Glu Leu

35 40

<210> 11

<211> 41

<212> PRT

<213> 人工合成(Artificial Sequence)

<400> 11

Arg Ser Lys Arg Ser Arg Leu Leu His Ser Asp Tyr Met Phe Met Thr

1 5 10 15

Pro Arg Arg Pro Gly Pro Thr Arg Lys His Tyr Gln Pro Tyr Ala Pro

20 25 30

Pro Arg Asp Phe Ala Ala Tyr Arg Ser

35 40

<210> 12

<211> 41

<212> PRT

<213> 人工合成(Artificial Sequence)

<400> 12

Arg Ser Lys Arg Ser Arg Gly Gly His Ser Asp Tyr Met Asn Met Thr

1 5 10 15

Pro Arg Arg Pro Gly Pro Thr Arg Lys His Tyr Gln Pro Tyr Ala Pro

20 25 30

Pro Arg Asp Phe Ala Ala Tyr Arg Ser

35 40

<210> 13

<211> 1401

<212> DNA

<213> 人工合成(Artificial Sequence)

<400> 13

gacatccaga tgacccagtc tccatcctcc ctgtctgcat ctgtaggaga cagagtcacc 60

atcacttgcc gggcaagtca gagcattagc agctatttaa attggtatca gcagaaacca 120

gggaaagccc ctaagctcct gatctttgct gcatccagtt tgcaaagtgg ggtcccatca 180

aggttcagtg gcagtggatc tgggacagat ttcactctca ccatcagcag tctgcaacct 240

gaagattttg caacttacta ctgtcaacag agttacagta ccccctggac gttcggccaa 300

gggaccaaac tggatatcaa acgtggcagc acaagcggaa gcggcaaacc aggaagcgga 360

gaaggaagca ccaagggaga ggtgcagctg gtgcagtccg gaccagaggt gaagaagcca 420

ggagccagcg tgaaggtgtc ctgtaaggcc tctggctaca ccttcacaga ttactatatg 480

aactgggtgc ggcagatgca cggcaaggga ctggagtgga tgggcgtgat caacccatac 540

aatggcggca ccgattataa tcagaagttt aagggcagag tgaccatcac agccgacaag 600

tccacctcta cagcctacat ggagctgagc tccctgagga gcgaggacac agccgtgtac 660

tattgtgccc gctccgtgta cgactatccc tttgattatt ggggccaggg caccctggtc 720

acagtctcct caaccacgac gccagcgccg cgaccaccaa caccggcgcc caccatcgcg 780

tcgcagcccc tgtccctgcg cccagaggcg tgccggccag cggcgggggg cgcagtgcac 840

acgagggggc tggacttcgc ctgtgatatc tacatctggg cgcccttggc cgggacttgt 900

ggggtccttc tcctgtcact ggttatcacc ctttactgca aacggggcag aaagaaactc 960

ctgtatatat tcaaacaacc atttatgaga ccagtacaaa ctactcaaga ggaagatggc 1020

tgtagctgcc gatttccaga agaagaagaa ggaggatgtg aactgagagt gaagttcagc 1080

aggagcgcag acgcccccgc gtacaagcag ggccagaacc agctctataa cgagctcaat 1140

ctaggacgaa gagaggagta cgatgttttg gacaagagac gtggccggga ccctgagatg 1200

gggggaaagc cgagaaggaa gaaccctcag gaaggcctgt acaatgaact gcagaaagat 1260

aagatggcgg aggcctacag tgagattggg atgaaaggcg agcgccggag gggcaagggg 1320

cacgatggcc tttaccaggg tctcagtaca gccaccaagg acacctacga cgcccttcac 1380

atgcaggccc tgccccctcg c 1401

<210> 14

<211> 1413

<212> DNA

<213> 人工合成(Artificial Sequence)

<400> 14

gacatccaga tgacccagtc tccatcctcc ctgtctgcat ctgtaggaga cagagtcacc 60

atcacttgcc gggcaagtca gagcattagc agctatttaa attggtatca gcagaaacca 120

gggaaagccc ctaagctcct gatctttgct gcatccagtt tgcaaagtgg ggtcccatca 180

aggttcagtg gcagtggatc tgggacagat ttcactctca ccatcagcag tctgcaacct 240

gaagattttg caacttacta ctgtcaacag agttacagta ccccctggac gttcggccaa 300

gggaccaaac tggatatcaa acgtggcagc acaagcggaa gcggcaaacc aggaagcgga 360

gaaggaagca ccaagggaga ggtgcagctg gtgcagtccg gaccagaggt gaagaagcca 420

ggagccagcg tgaaggtgtc ctgtaaggcc tctggctaca ccttcacaga ttactatatg 480

aactgggtgc ggcagatgca cggcaaggga ctggagtgga tgggcgtgat caacccatac 540

aatggcggca ccgattataa tcagaagttt aagggcagag tgaccatcac agccgacaag 600

tccacctcta cagcctacat ggagctgagc tccctgagga gcgaggacac agccgtgtac 660

tattgtgccc gctccgtgta cgactatccc tttgattatt ggggccaggg caccctggtc 720

acagtctcct caaagcccac cacgacgcca gcgccgcgac caccaacacc ggcgcccacc 780

atcgcgtcgc agcccctgtc cctgcgccca gaggcgtgcc ggccagcggc ggggggcgca 840

gtgcacacga gggggctgga cttcgcctgc gacttctggg tgctggtcgt ggtgggtggc 900

gtgctggcct gctacagcct gctggtgaca gtggccttca tcatcttttg ggtgaggagc 960

aagcggagca gactgctgca cagcgactat atgtttatga ctccccgccg ccccgggccc 1020

acccgcaagc attaccagcc ctatgcccca ccacgcgact tcgcagccta tcgctccaga 1080

gtgaagttca gcaggagcgc agacgccccc gcgtacaagc agggccagaa ccagctctat 1140

aacgagctca atctaggacg aagagaggag tacgatgttt tggacaagag acgtggccgg 1200

gaccctgaga tggggggaaa gccgagaagg aagaaccctc aggaaggcct gtacaatgaa 1260

ctgcagaaag ataagatggc ggaggcctac agtgagattg ggatgaaagg cgagcgccgg 1320

aggggcaagg ggcacgatgg cctttaccag ggtctcagta cagccaccaa ggacacctac 1380

gacgcccttc acatgcaggc cctgccccct cgc 1413

<210> 15

<211> 1956

<212> DNA

<213> 人工合成(Artificial Sequence)

<400> 15

gacatccaga tgacccagtc tccatcctcc ctgtctgcat ctgtaggaga cagagtcacc 60

atcacttgcc gggcaagtca gagcattagc agctatttaa attggtatca gcagaaacca 120

gggaaagccc ctaagctcct gatctttgct gcatccagtt tgcaaagtgg ggtcccatca 180

aggttcagtg gcagtggatc tgggacagat ttcactctca ccatcagcag tctgcaacct 240

gaagattttg caacttacta ctgtcaacag agttacagta ccccctggac gttcggccaa 300

gggaccaaac tggatatcaa acgtggcagc acaagcggaa gcggcaaacc aggaagcgga 360

gaaggaagca ccaagggaga ggtgcagctg gtgcagtccg gaccagaggt gaagaagcca 420

ggagccagcg tgaaggtgtc ctgtaaggcc tctggctaca ccttcacaga ttactatatg 480

aactgggtgc ggcagatgca cggcaaggga ctggagtgga tgggcgtgat caacccatac 540

aatggcggca ccgattataa tcagaagttt aagggcagag tgaccatcac agccgacaag 600

tccacctcta cagcctacat ggagctgagc tccctgagga gcgaggacac agccgtgtac 660

tattgtgccc gctccgtgta cgactatccc tttgattatt ggggccaggg caccctggtc 720

acagtctcct cagagtccaa gtacggacca ccttgcccac catgtccagc acctccagtg 780

gcaggaccaa gcgtgttcct gtttccacct aagcctaagg acaccctgat gatctctcgg 840

accccagagg tgacatgcgt ggtggtggac gtgagccagg aggatccaga ggtgcagttc 900

aactggtacg tggatggcgt ggaggtgcac aatgccaaga caaagcccag ggaggagcag 960

tttcagagca cctaccgcgt ggtgtccgtg ctgacagtgc tgcaccagga ctggctgaac 1020

ggcaaggagt ataagtgcaa ggtgtccaat aagggcctgc ctagctccat cgagaagacc 1080

atctctaagg caaagggaca gcccagggag cctcaggtgt acacactgcc acccagccag 1140

gaggagatga ccaagaacca ggtgtccctg acatgtctgg tgaagggctt ctatccctcc 1200

gacatcgccg tggagtggga gtctaatggc cagcctgaga acaattacaa gaccacacct 1260

ccagtgctgg actccgatgg ctctttcttt ctgtattctc ggctgaccgt ggataagagc 1320

agatggcagg agggcaacgt gttttcttgt agcgtgatgc acgaggccct gcacaatcac 1380

tacacacaga agtccctgtc tctgagcctg ggcaagttct gggtgctggt cgtggtgggt 1440

ggcgtgctgg cctgctacag cctgctggtg acagtggcct tcatcatctt ttgggtgagg 1500

agcaagcgga gcagaggcgg ccacagcgac tacatgaaca tgaccccccg gaggcctggc 1560

cccacccgga agcactacca gccctacgcc cctcccaggg acttcgccgc ctaccggagc 1620

cgggtgaagt tcagccggag cgccgacgcc cctgcctacc agcagggcca gagccagctg 1680

tacaacgagc tgaacctggg ccggagggag gagtacgacg tgctggacaa gcggagaggc 1740

cgggaccctg agatgggcgg caagccccgg agaaagaacc ctcaggaggg cctgtataac 1800

gaactgcaga aagacaagat ggccgaggcc tacagcgaga tcggcatgaa gggcgagcgg 1860

cggaggggca agggccacga cggcctgtac cagggcctga gcaccgccac caaggatacc 1920

tacgacgccc tgcacatgca ggccctgccc cctcgc 1956

<210> 16

<211> 1380

<212> DNA

<213> 人工合成(Artificial Sequence)

<400> 16

gacatccaga tgacccagtc tccatcctcc ctgtctgcat ctgtaggaga cagagtcacc 60

atcacttgcc gggcaagtca gagcattagc agctatttaa attggtatca gcagaaacca 120

gggaaagccc ctaagctcct gatctttgct gcatccagtt tgcaaagtgg ggtcccatca 180

aggttcagtg gcagtggatc tgggacagat ttcactctca ccatcagcag tctgcaacct 240

gaagattttg caacttacta ctgtcaacag agttacagta ccccctggac gttcggccaa 300

gggaccaaac tggatatcaa acgtggcagc acaagcggaa gcggcaaacc aggaagcgga 360

gaaggaagca ccaagggaga ggtgcagctg gtgcagtccg gaccagaggt gaagaagcca 420

ggagccagcg tgaaggtgtc ctgtaaggcc tctggctaca ccttcacaga ttactatatg 480

aactgggtgc ggcagatgca cggcaaggga ctggagtgga tgggcgtgat caacccatac 540

aatggcggca ccgattataa tcagaagttt aagggcagag tgaccatcac agccgacaag 600

tccacctcta cagcctacat ggagctgagc tccctgagga gcgaggacac agccgtgtac 660

tattgtgccc gctccgtgta cgactatccc tttgattatt ggggccaggg caccctggtc 720

acagtctcct cagcaccacc tcgggccagc gccctgcctg caccacccac cggctccgcc 780

ctgccagacc ctcagacagc atctgccctg ccagatcctc cagcagcaag cgccctgccc 840

ttctgggtgc tggtcgtggt gggtggcgtg ctggcctgct acagcctgct ggtgacagtg 900

gccttcatca tcttttgggt gaggagcaag cggagcagag gcggccacag cgactacatg 960

aacatgaccc cccggaggcc tggccccacc cggaagcact accagcccta cgcccctccc 1020

agggacttcg ccgcctaccg gagccgggtg aagttcagcc ggagcgccga cgcccctgcc 1080

taccagcagg gccagagcca gctgtacaac gagctgaacc tgggccggag ggaggagtac 1140

gacgtgctgg acaagcggag aggccgggac cctgagatgg gcggcaagcc ccggagaaag 1200

aaccctcagg agggcctgta taacgaactg cagaaagaca agatggccga ggcctacagc 1260

gagatcggca tgaagggcga gcggcggagg ggcaagggcc acgacggcct gtaccagggc 1320

ctgagcaccg ccaccaagga tacctacgac gccctgcaca tgcaggccct gccccctcgc 1380

<210> 17

<211> 63

<212> DNA

<213> 人工合成(Artificial Sequence)

<400> 17

atggctctgc cagtgacagc tctgctgctg cctctggctc tgctgctgca cgcagctaga 60

ccc 63

<210> 18

<211> 545

<212> DNA

<213> 人工合成(Artificial Sequence)

<400> 18

ggatctgcga tcgctccggt gcccgtcagt gggcagagcg cacatcgccc acagtccccg 60

agaagttggg gggaggggtc ggcaattgaa cgggtgccta gagaaggtgg cgcggggtaa 120

actgggaaag tgatgtcgtg tactggctcc gcctttttcc cgagggtggg ggagaaccgt 180

atataagtgc agtagtcgcc gtgaacgttc tttttcgcaa cgggtttgcc gccagaacac 240

agctgaagct tcgaggggct cgcatctctc cttcacgcgc ccgccgccct acctgaggcc 300

gccatccacg ccggttgagt cgcgttctgc cgcctcccgc ctgtggtgcc tcctgaactg 360

cgtccgccgt ctaggtaagt ttaaagctca ggtcgagacc gggcctttgt ccggcgctcc 420

cttggagcct acctagactc agccggctct ccacgctttg cctgaccctg cttgctcaac 480

tctacgtctt tgtttcgttt tctgttctgc gccgttacag atccaagctg tgaccggcgc 540

ctact 545

<210> 19

<211> 545

<212> DNA

<213> 人工合成(Artificial Sequence)

<400> 19

ggatctgcga tcgctccggt gcccgtcagt gggcagagcg cacatcgccc acagtccccg 60

agaagttggg gggaggggtc ggcaattgaa cgggtgccta gagaaggtgg cgcggggtaa 120

actgggaaag tgatgtcgtg tactggctcc gcctttttcc cgagggtggg ggagaaccgt 180

atataagtgc agtagtcgcc gtgaacgttc tttttcgcaa cgggtttgcc gccagaacac 240

agctgaagct tcgaggggct cgcatctctc cttcacgcgc ccgccgccct acctgaggcc 300

gccatccacg ccggttgagt cgcgttctgc cgcctcccgc ctgtggtgcc tcctgaactg 360

cgtccgccgt ctaggtaagt ttaaagctca ggtcgagacc gggcctttgt ccggcgctcc 420

cttggagcct acctagactc agccggctct ccacgctttg cctgaccctg cttgctcaac 480

tctacgtctt tgtttcgttt tctgttctgc gccgttacag atccaagctg tgaccggcgc 540

ctact 545

<210> 20

<211> 286

<212> DNA

<213> 人工合成(Artificial Sequence)

<400> 20

gagggcctat ttcccatgat tccttcatat ttgcatatac gatacaaggc tgttagagag 60

ataattggaa ttaatttgac tgtaaacaca aagatattag tacaaaatac gtgacgtaga 120

aagtaataat ttcttgggta gtttgcagtt ttaaaattat gttttaaaat ggactatcat 180

atgcttaccg taacttgaaa gtatttcgat ttcttggctt tatatatctt gtggaaagga 240

cgcgtctcag cttccaccaa tcaagagttg gtggaagctg agacgc 286

<210> 21

<211> 45

<212> PRT

<213> 人工合成(Artificial Sequence)

<400> 21

Lys Pro Thr Thr Thr Pro Ala Pro Arg Pro Pro Thr Pro Ala Pro Thr

1 5 10 15

Ile Ala Ser Gln Pro Leu Ser Leu Arg Pro Glu Ala Arg Pro Ala Ala

20 25 30

Gly Gly Ala Val His Thr Arg Gly Leu Asp Phe Ala Asp

35 40 45

<210> 22

<211> 732

<212> DNA

<213> 人工合成(Artificial Sequence)

<400> 22

gacatccaga tgacccagtc tccatcctcc ctgtctgcat ctgtaggaga cagagtcacc 60

atcacttgcc gggcaagtca gagcattagc agctatttaa attggtatca gcagaaacca 120

gggaaagccc ctaagctcct gatctttgct gcatccagtt tgcaaagtgg ggtcccatca 180

aggttcagtg gcagtggatc tgggacagat ttcactctca ccatcagcag tctgcaacct 240

gaagattttg caacttacta ctgtcaacag agttacagta ccccctggac gttcggccaa 300

gggaccaaac tggatatcaa acgtggcagc acaagcggaa gcggcaaacc aggaagcgga 360

gaaggaagca ccaagggaga ggtgcagctg gtgcagtccg gaccagaggt gaagaagcca 420

ggagccagcg tgaaggtgtc ctgtaaggcc tctggctaca ccttcacaga ttactatatg 480

aactgggtgc ggcagatgca cggcaaggga ctggagtgga tgggcgtgat caacccatac 540

aatggcggca ccgattataa tcagaagttt aagggcagag tgaccatcac agccgacaag 600

tccacctcta cagcctacat ggagctgagc tccctgagga gcgaggacac agccgtgtac 660

tattgtgccc gctccgtgta cgactatccc tttgattatt ggggccaggg caccctggtc 720

acagtctcct ca 732

<210> 23

<211> 135

<212> DNA

<213> 人工合成(Artificial Sequence)

<400> 23

accacgacgc cagcgccgcg accaccaaca ccggcgccca ccatcgcgtc gcagcccctg 60

tccctgcgcc cagaggcgtg ccggccagcg gcggggggcg cagtgcacac gagggggctg 120

gacttcgcct gtgat 135

<210> 24

<211> 141

<212> DNA

<213> 人工合成(Artificial Sequence)

<400> 24

aagcccacca cgacgccagc gccgcgacca ccaacaccgg cgcccaccat cgcgtcgcag 60

cccctgtccc tgcgcccaga ggcgtgccgg ccagcggcgg ggggcgcagt gcacacgagg 120

gggctggact tcgcctgcga c 141

<210> 25

<211> 108

<212> DNA

<213> 人工合成(Artificial Sequence)

<400> 25

gcaccacctc gggccagcgc cctgcctgca ccacccaccg gctccgccct gccagaccct 60

cagacagcat ctgccctgcc agatcctcca gcagcaagcg ccctgccc 108

<210> 26

<211> 135

<212> DNA

<213> 人工合成(Artificial Sequence)

<400> 26

aagccaacca caaccccagc accaaggcca cctacacctg caccaaccat cgcaagccag 60

ccactgtccc tgaggccaga ggcaagacct gcagcaggag gcgccgtgca cacacggggc 120

ctggacttcg ccgat 135

<210> 27

<211> 684

<212> DNA

<213> 人工合成(Artificial Sequence)

<400> 27

gagtccaagt acggaccacc ttgcccacca tgtccagcac ctccagtggc aggaccaagc 60

gtgttcctgt ttccacctaa gcctaaggac accctgatga tctctcggac cccagaggtg 120

acatgcgtgg tggtggacgt gagccaggag gatccagagg tgcagttcaa ctggtacgtg 180

gatggcgtgg aggtgcacaa tgccaagaca aagcccaggg aggagcagtt tcagagcacc 240

taccgcgtgg tgtccgtgct gacagtgctg caccaggact ggctgaacgg caaggagtat 300

aagtgcaagg tgtccaataa gggcctgcct agctccatcg agaagaccat ctctaaggca 360

aagggacagc ccagggagcc tcaggtgtac acactgccac ccagccagga ggagatgacc 420

aagaaccagg tgtccctgac atgtctggtg aagggcttct atccctccga catcgccgtg 480

gagtgggagt ctaatggcca gcctgagaac aattacaaga ccacacctcc agtgctggac 540

tccgatggct ctttctttct gtattctcgg ctgaccgtgg ataagagcag atggcaggag 600

ggcaacgtgt tttcttgtag cgtgatgcac gaggccctgc acaatcacta cacacagaag 660

tccctgtctc tgagcctggg caag 684

<210> 28

<211> 72

<212> DNA

<213> 人工合成(Artificial Sequence)

<400> 28

atctacatct gggcgccctt ggccgggact tgtggggtcc ttctcctgtc actggttatc 60

accctttact gc 72

<210> 29

<211> 81

<212> DNA

<213> 人工合成(Artificial Sequence)

<400> 29

ttctgggtgc tggtcgtggt gggtggcgtg ctggcctgct acagcctgct ggtgacagtg 60

gccttcatca tcttttgggt g 81

<210> 30

<211> 123

<212> DNA

<213> 人工合成(Artificial Sequence)

<400> 30

aggagcaagc ggagcagagg cggccacagc gactacatga acatgacccc ccggaggcct 60

ggccccaccc ggaagcacta ccagccctac gcccctccca gggacttcgc cgcctaccgg 120

agc 123

<210> 31

<211> 336

<212> DNA

<213> 人工合成(Artificial Sequence)

<400> 31

cgggtgaagt tcagccggag cgccgacgcc cctgcctacc agcagggcca gagccagctg 60

tacaacgagc tgaacctggg ccggagggag gagtacgacg tgctggacaa gcggagaggc 120

cgggaccctg agatgggcgg caagccccgg agaaagaacc ctcaggaggg cctgtataac 180

gaactgcaga aagacaagat ggccgaggcc tacagcgaga tcggcatgaa gggcgagcgg 240

cggaggggca agggccacga cggcctgtac cagggcctga gcaccgccac caaggatacc 300

tacgacgccc tgcacatgca ggccctgccc cctcgc 336

<210> 32

<211> 126

<212> DNA

<213> 人工合成(Artificial Sequence)

<400> 32

aaacggggca gaaagaaact cctgtatata ttcaaacaac catttatgag accagtacaa 60

actactcaag aggaagatgg ctgtagctgc cgatttccag aagaagaaga aggaggatgt 120

gaactg 126

<210> 33

<211> 123

<212> DNA

<213> 人工合成(Artificial Sequence)

<400> 33

aggagcaagc ggagcagact gctgcacagc gactatatgt ttatgactcc ccgccgcccc 60

gggcccaccc gcaagcatta ccagccctat gccccaccac gcgacttcgc agcctatcgc 120

tcc 123

<210> 34

<211> 112

<212> PRT

<213> 人工合成(Artificial Sequence)

<400> 34

Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Lys Gln Gly

1 5 10 15

Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr

20 25 30

Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys

35 40 45

Pro Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys

50 55 60

Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg

65 70 75 80

Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala

85 90 95

Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg

100 105 110

<210> 35

<211> 336

<212> DNA

<213> 人工合成(Artificial Sequence)

<400> 35

agagtgaagt tcagcaggag cgcagacgcc cccgcgtaca agcagggcca gaaccagctc 60

tataacgagc tcaatctagg acgaagagag gagtacgatg ttttggacaa gagacgtggc 120

cgggaccctg agatgggggg aaagccgaga aggaagaacc ctcaggaagg cctgtacaat 180

gaactgcaga aagataagat ggcggaggcc tacagtgaga ttgggatgaa aggcgagcgc 240

cggaggggca aggggcacga tggcctttac cagggtctca gtacagccac caaggacacc 300

tacgacgccc ttcacatgca ggccctgccc cctcgc 336

<210> 36

<211> 1950

<212> DNA

<213> 人工合成(Artificial Sequence)

<400> 36

gacatccaga tgacccagtc tccatcctcc ctgtctgcat ctgtaggaga cagagtcacc 60

atcacttgcc gggcaagtca gagcattagc agctatttaa attggtatca gcagaaacca 120

gggaaagccc ctaagctcct gatctttgct gcatccagtt tgcaaagtgg ggtcccatca 180

aggttcagtg gcagtggatc tgggacagat ttcactctca ccatcagcag tctgcaacct 240

gaagattttg caacttacta ctgtcaacag agttacagta ccccctggac gttcggccaa 300

gggaccaaac tggatatcaa acgtggcagc acaagcggaa gcggcaaacc aggaagcgga 360

gaaggaagca ccaagggaga ggtgcagctg gtgcagtccg gaccagaggt gaagaagcca 420

ggagccagcg tgaaggtgtc ctgtaaggcc tctggctaca ccttcacaga ttactatatg 480

aactgggtgc ggcagatgca cggcaaggga ctggagtgga tgggcgtgat caacccatac 540

aatggcggca ccgattataa tcagaagttt aagggcagag tgaccatcac agccgacaag 600

tccacctcta cagcctacat ggagctgagc tccctgagga gcgaggacac agccgtgtac 660

tattgtgccc gctccgtgta cgactatccc tttgattatt ggggccaggg caccctggtc 720

acagtctcct cagagtccaa gtacggacca ccttgcccac catgtccagc acctccagtg 780

gcaggaccaa gcgtgttcct gtttccacct aagcctaagg acaccctgat gatctctcgg 840

accccagagg tgacatgcgt ggtggtggac gtgagccagg aggatccaga ggtgcagttc 900

aactggtacg tggatggcgt ggaggtgcac aatgccaaga caaagcccag ggaggagcag 960

tttcagagca cctaccgcgt ggtgtccgtg ctgacagtgc tgcaccagga ctggctgaac 1020

ggcaaggagt ataagtgcaa ggtgtccaat aagggcctgc ctagctccat cgagaagacc 1080

atctctaagg caaagggaca gcccagggag cctcaggtgt acacactgcc acccagccag 1140

gaggagatga ccaagaacca ggtgtccctg acatgtctgg tgaagggctt ctatccctcc 1200

gacatcgccg tggagtggga gtctaatggc cagcctgaga acaattacaa gaccacacct 1260

ccagtgctgg actccgatgg ctctttcttt ctgtattctc ggctgaccgt ggataagagc 1320

agatggcagg agggcaacgt gttttcttgt agcgtgatgc acgaggccct gcacaatcac 1380

tacacacaga agtccctgtc tctgagcctg ggcaagatct acatctgggc gcccttggcc 1440

gggacttgtg gggtccttct cctgtcactg gttatcaccc tttactgcaa acggggcaga 1500

aagaaactcc tgtatatatt caaacaacca tttatgagac cagtacaaac tactcaagag 1560

gaagatggct gtagctgccg atttccagaa gaagaagaag gaggatgtga actgagagtg 1620

aagttcagca ggagcgcaga cgcccccgcg tacaagcagg gccagaacca gctctataac 1680

gagctcaatc taggacgaag agaggagtac gatgttttgg acaagagacg tggccgggac 1740

cctgagatgg ggggaaagcc gagaaggaag aaccctcagg aaggcctgta caatgaactg 1800

cagaaagata agatggcgga ggcctacagt gagattggga tgaaaggcga gcgccggagg 1860

ggcaaggggc acgatggcct ttaccagggt ctcagtacag ccaccaagga cacctacgac 1920

gcccttcaca tgcaggccct gccccctcgc 1950

<210> 37

<211> 244

<212> PRT

<213> 人工合成(Artificial Sequence)

<400> 37

Glu Thr Thr Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Val Ser Pro Gly

1 5 10 15

Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Asn

20 25 30

Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile

35 40 45

Tyr Gly Ala Ser Thr Arg Ala Thr Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Ser

65 70 75 80

Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Asn Asn Trp Pro Leu

85 90 95

Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Gly Ser Thr Ser

100 105 110

Gly Ser Gly Lys Pro Gly Ser Gly Glu Gly Ser Thr Lys Gly Glu Val

115 120 125

Gln Leu Val Gln Ser Gly Pro Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala Ser Val

130 135 140

Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Tyr Tyr Met

145 150 155 160

Asn Trp Val Arg Gln Met His Gly Lys Gly Leu Glu Trp Met Gly Val

165 170 175

Ile Asn Pro Tyr Asn Gly Gly Thr Asp Tyr Asn Gln Lys Phe Lys Gly

180 185 190

Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Lys Ser Thr Ser Thr Ala Tyr Met Glu

195 200 205

Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg

210 215 220

Ser Val Tyr Asp Tyr Pro Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val

225 230 235 240

Thr Val Ser Ser

<210> 38

<211> 244

<212> PRT

<213> 人工合成(Artificial Sequence)

<400> 38

Ala Ile Arg Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Ser Ser

20 25 30

Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Val Ile

35 40 45

Tyr Ala Ala Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro

65 70 75 80

Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Tyr Asn Thr Pro Arg

85 90 95

Thr Phe Gly Pro Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Gly Ser Thr Ser

100 105 110

Gly Ser Gly Lys Pro Gly Ser Gly Glu Gly Ser Thr Lys Gly Glu Val

115 120 125

Gln Leu Val Gln Ser Gly Pro Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala Ser Val

130 135 140

Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Tyr Tyr Met

145 150 155 160

Asn Trp Val Arg Gln Met His Gly Lys Gly Leu Glu Trp Met Gly Val

165 170 175

Ile Asn Pro Tyr Asn Gly Gly Thr Asp Tyr Asn Gln Lys Phe Lys Gly

180 185 190

Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Lys Ser Thr Ser Thr Ala Tyr Met Glu

195 200 205

Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg

210 215 220

Ser Val Tyr Asp Tyr Pro Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val

225 230 235 240

Thr Val Ser Ser

<210> 39

<211> 249

<212> PRT

<213> 人工合成(Artificial Sequence)

<400> 39

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Asp Ser Leu Pro Val Ser Leu Gly

1 5 10 15

Glu Arg Ala Thr Ile Asn Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Ser Ser

20 25 30

Ala Asp Asp Leu Asn Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln

35 40 45

Pro Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Trp Ala Ser Thr Arg Gln Ser Gly Val

50 55 60

Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr

65 70 75 80

Ile Asn Ser Leu Gln Ala Glu Asp Val Ala Val Tyr Phe Cys Gln Gln

85 90 95

Tyr Tyr Gly Thr Pro Thr Phe Gly Gln Gly Thr Arg Leu Glu Ile Lys

100 105 110

Arg Gly Ser Thr Ser Gly Ser Gly Lys Pro Gly Ser Gly Glu Gly Ser

115 120 125

Thr Lys Gly Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Glu Val Lys Lys

130 135 140

Pro Gly Ala Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe

145 150 155 160

Thr Asp Tyr Tyr Met Asn Trp Val Arg Gln Met His Gly Lys Gly Leu

165 170 175

Glu Trp Met Gly Val Ile Asn Pro Tyr Asn Gly Gly Thr Asp Tyr Asn

180 185 190

Gln Lys Phe Lys Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Lys Ser Thr Ser

195 200 205

Thr Ala Tyr Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val

210 215 220

Tyr Tyr Cys Ala Arg Ser Val Tyr Asp Tyr Pro Phe Asp Tyr Trp Gly

225 230 235 240

Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser

245

<210> 40

<211> 732

<212> DNA

<213> 人工合成(Artificial Sequence)

<400> 40

gaaacgacac tcacgcagtc tccagccacc ctgtctgtgt ctccagggga aagagccacc 60

ctctcctgca gggccagtca gagtgttagc agcaacttag cctggtacca gcagaaacct 120

ggccaggctc ccaggctcct catctatggt gcatccacca gggccactgg tatcccagcc 180

aggttcagtg gcagtgggtc tgggacagag ttcactctca ccatcagcag cctgcagtct 240

gaagattttg cagtttatta ctgtcagcag tataataact ggcccctcac tttcggcgga 300

gggaccaagg tggagatcaa acgtggcagc acaagcggaa gcggcaaacc aggaagcgga 360

gaaggaagca ccaagggaga ggtgcagctg gtacagtccg gaccagaggt gaagaagcca 420

ggagccagcg tgaaggtgtc ctgtaaggcc tctggctaca ccttcacaga ttactatatg 480

aactgggtgc ggcagatgca cggcaaggga ctggagtgga tgggcgtgat caacccatac 540

aatggcggca ccgattataa tcagaagttt aagggcagag tgaccatcac agccgacaag 600

tccacctcta cagcctacat ggagctgagc tccctgagga gcgaggacac agccgtgtac 660

tattgtgccc gctccgtgta cgactatccc tttgattatt ggggccaggg aaccctggtc 720

acagtctcct ca 732

<210> 41

<211> 732

<212> DNA

<213> 人工合成(Artificial Sequence)

<400> 41

gccatccgga tgacccagtc tccatcctcc ctgtctgcat ctgtaggaga cagagtcacc 60

atcacttgcc gggcaagtca gagcattagc agctctttaa attggtatca gcagaaacca 120

gggaaagccc ctaagcttgt gatctatgct gcgtccagtt tacaaagtgg ggtcccatca 180

aggttcagtg gcagtggatc tgggacagat ttcactctca ccatcagcag cctgcagcct 240

gaagattttg caacttacta ctgtcaacag agttacaata ccccgagaac tttcggccct 300

gggaccaagg tggagatcaa acgtggcagc acaagcggaa gcggcaaacc aggaagcgga 360

gaaggaagca ccaagggaga ggttcagctg gtacagtccg gaccagaggt gaagaagcca 420

ggagccagcg tgaaggtgtc ctgtaaggcc tctggctaca ccttcacaga ttactatatg 480

aactgggtgc ggcagatgca cggcaaggga ctggagtgga tgggcgtgat caacccatac 540

aatggcggca ccgattataa tcagaagttt aagggcagag tgaccatcac agccgacaag 600

tccacctcta cagcctacat ggagctgagc tccctgagga gcgaggacac agccgtgtac 660

tattgtgccc gctccgtgta cgactatccc tttgattatt ggggccaggg caccctggtc 720

acagtctcct ca 732

<210> 42

<211> 747

<212> DNA

<213> 人工合成(Artificial Sequence)

<400> 42

gacatccaga tgacccagtc tccagactcc ctgcctgtgt ctctgggcga gagggccacc 60

atcaattgca agtccagcca gagtcttcta tccagcgccg acgatttgaa ctacttagct 120

tggtaccagc agaaaccagg gcagcctcct aagctgctca tttactgggc atctacccgg 180

caatccgggg tccctgaccg attcagtggc agcgggtctg ggacagattt cactctcacc 240

atcaacagcc tgcaggctga agatgtggca gtttatttct gtcagcaata ttatggtact 300

cccaccttcg gccaagggac acgactggag attaaacgtg gcagcacaag cggaagcggc 360

aaaccaggaa gcggagaagg aagcaccaag ggacaggtac agctgcagca gtccggacca 420

gaggtgaaga agccaggagc cagcgtgaag gtgtcctgta aggcctctgg ctacaccttc 480

acagattact atatgaactg ggtgcggcag atgcacggca agggactgga gtggatgggc 540

gtgatcaacc catacaatgg cggcaccgat tataatcaga agtttaaggg cagagtgacc 600

atcacagccg acaagtccac ctctacagcc tacatggagc tgagctccct gaggagcgag 660

gacacagccg tgtactattg tgcccgctcc gtgtacgact atccctttga ttattggggc 720

cagggaaccc tggtcaccgt ctcctca 747

Claims (16)

1.靶向全人源化CD70的嵌合抗原受体，其特征在于，所述嵌合抗原受体包括胞外结构域、铰链区和跨膜区及胞内信号域，所述胞外结构域的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。

2.根据权利要求1所述的嵌合抗原受体，其特征在于，所述铰链区的氨基酸序列如SEQID NO.3、SEQ ID NO.4、SEQ ID NO.5或SEQ ID NO.6所示。

3.根据权利要求2所述的嵌合抗原受体，其特征在于：所述跨膜区的氨基酸序列如SEQID NO.7或SEQ ID NO.8所示。

4.根据权利要求3所述的嵌合抗原受体，其特征在于，所述胞内信号域包含信号传导区和共刺激结构域，所述信号传导区的氨基酸序列如SEQ ID NO.9或SEQ ID NO.34所示；所述共刺激结构域的氨基酸序列如SEQ ID NO.10、SEQ ID NO.11或SEQ ID NO.12所示。

5.根据权利要求1所述的嵌合抗原受体，其特征在于，所述嵌合抗原受体包括以下组合中的一种：

组合1）：所述铰链区的氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示，所述跨膜区的氨基酸序列如SEQ ID NO.7所示，所述胞内信号域包含如SEQ ID NO.34所示的氨基酸序列和如SEQ IDNO.10所示的氨基酸序列；

组合2）：所述铰链区的氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示，所述跨膜区的氨基酸序列如SEQ ID NO.8所示，所述胞内信号域包含如SEQ ID NO.34所示的氨基酸序列和如SEQ IDNO.11所示的氨基酸序列；

组合3）：所述铰链区的氨基酸序列如SEQ ID NO.6所示，所述跨膜区的氨基酸序列如SEQ ID NO.8所示，所述胞内信号域包含如SEQ ID NO.9所示的氨基酸序列和如SEQ IDNO.12所示的氨基酸序列；

组合4）：所述铰链区的氨基酸序列如SEQ ID NO.5所示，所述跨膜区的氨基酸序列如SEQ ID NO.8所示，所述胞内信号域包含如SEQ ID NO.9所示的氨基酸序列和如SEQ IDNO.12所示的氨基酸序列；

组合5）：所述铰链区的氨基酸序列如SEQ ID NO.6、SEQ ID NO.5或SEQ ID NO.21所示，所述跨膜区的氨基酸序列如SEQ ID NO.7所示，所述胞内信号域包含如SEQ ID NO.34所示的氨基酸序列和如SEQ ID NO.10所示的氨基酸序列。

6.编码权利要求5所述的嵌合抗原受体的核酸分子，其特征在于，编码所述组合1）的核酸分子包含如SEQ ID NO.13所示的序列；或编码所述组合2）的核酸分子包含如SEQ IDNO.14所示的序列；或编码所述组合3）的核酸分子包含如SEQ ID NO.15所示的序列；或编码所述组合4）的核酸分子包含如SEQ ID NO.16所示的序列；或编码所述组合5）的核酸分子包含如SEQ ID NO.36所示的序列。

7.根据权利要求6所述的核酸分子，其特征在于，所述核酸分子还包括启动子的核酸序列，所述启动子的核酸序列如SEQ ID NO.18或SEQ ID NO.19所示。

8.根据权利要求1-5任一项所述的嵌合抗原受体，其特征在于，所述嵌合抗原受体还包括 CD70干扰RNA，所述CD70干扰RNA的序列如SEQ ID NO.20所示。

9.包含权利要求6-7任一所述的核酸分子的表达载体。

10.根据权利要求9所述的表达载体，其特征在于，所述表达载体选自慢病毒表达载体、腺病毒表达载体、腺相关病毒表达载体、质粒中的任一种。

11.一种工程化的细胞，其特征在于，所述细胞中转导有权利要求6-7任一所述的核酸分子或权利要求9-10任一所述的表达载体。

12.根据权利要求11所述的工程化的细胞，其特征在于，所述细胞为T细胞、T细胞前体或NK细胞。

13.一种细胞制品，其特征在于，所述细胞制品包括权利要求11-12任一项所述的工程化的细胞。

14.一种药物组合物，其特征在于，所述药物组合物中包括权利要求1-5任一所述的嵌合抗原受体或权利要求6-7任一所述的核酸分子或权利要求9-10任一所述的表达载体或权利要求11-12任一项所述的工程化的细胞。

15.权利要求1-5任一所述的嵌合抗原受体或权利要求6-7任一所述的核酸分子或权利要求9-10任一所述的表达载体或权利要求11-12任一项所述的工程化的细胞或权利要求14所述的药物组合物在制备抗高表达CD70分子的肿瘤的药物中的应用。

16.权利要求1-5任一所述的嵌合抗原受体或权利要求6-7任一所述的核酸分子或权利要求9-10任一所述的表达载体或权利要求11-12任一项所述的工程化的细胞或权利要求14所述的药物组合物在制备抗肾癌药物、抗血源性恶性肿瘤药物、抗胸腺肿瘤药物、抗卵巢癌药物、抗成神经胶质细胞瘤药物、抗鼻咽癌药物中的应用。

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