CN116008237B - 一种检测Hg2+的生物传感器及检测方法和应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及生物检测技术领域，具体涉及一种检测Hg²⁺的生物传感器及检测方法和应用。检测Hg²⁺的生物传感器，包括以下组分：发卡探针，所述发卡探针含有切刻内切酶Nb.BbvCI的半识别位点序列和G‑四链体序列；引物探针，所述引物探针与所述发卡探针的一部分互补。本发明中的检测Hg²⁺的生物传感器能够基于引物‑模板转换的级联信号放大策略用于西洋参水浸出液中Hg²⁺的超灵敏检测，所述生物传感器将滚环扩增(RCA)、多重链置换扩增(MRSDA)和基于G‑四链体的turn‑on荧光开关相结合，检测灵敏度高，能有效控制背景信号，具有良好的抗干扰能力，可以用于西洋参水浸出液样品的直接检测，表现出良好的选择性，在复杂基质样品检测中具有应用前景。

Description

一种检测Hg2+的生物传感器及检测方法和应用

技术领域

本发明涉及生物检测技术领域，具体涉及一种检测Hg²⁺的生物传感器及检测方法和应用。

背景技术

公开该背景技术部分的信息仅仅旨在增加对本发明的总体背景的理解，而不必然被视为承认或以任何形式暗示该信息构成已经成为本领域一般技术人员所公知的现有技术。

中药西洋参是五加科植物panacis quinquefolii radix的干燥根茎，在中医药理论体系中具有补气养阴、清热生津的功效，作为常用药材广泛应用于临床治疗和日常保健。西洋参在培育过程中会因环境污染而吸收和积累一定程度的有毒物质。考虑到在病人和虚弱者等特殊人群中有较高的使用频率和使用量，西洋参中毒性物质的监测已经成为用药安全不可忽视的部分。其中重金属污染，特别是汞(Hg)污染，因其毒性剧烈和生物富集明显而受到越来越到的关注。每年有近万吨Hg被排放进入环境中，这些Hg难以被生物降解而不断通过食物链富集，在进入人体后几乎不能被排泄且表现出强烈的毒性，对神经系统、免疫系统和消化系统造成永久性损伤。因此，西洋参中Hg的检测对监管食品、药品安全和维护生命健康有重要意义。

为满足上述检测需求，一些仪器分析方法被开发，包括原子吸收光谱法(AAS)、原子荧光光谱法(AFS)和电感耦合等离子体发射质谱法(ICP-MS)。然而，这些方法依赖昂贵、精密的仪器，而且通常不能直接检测复杂基质样品，这一定程度上限制了在现场检测中的应用。近年来，基于T-Hg-T的分析方法因灵敏、操作简单和抗干扰能力强的特点而受到越来越多的关注。特别是一些T-Hg-T分析-核酸扩增联用方法通过循环的核酸复制、组装或水解，将Hg信号被转化为显著放大的核酸信号，进一步提升了检测的灵敏度。这些方法通常通过基于DNA模板的聚合或切刻反应获得放大的信号。然而，这些方法中外加的DNA模板通常与目标物不相关，这种非目标物依赖性的模板与其他探针或酶的非特异性相互作用会导致假阳性或假阴性信号，导致检测准确性降低。因此，仍有必要开发新的检测方法，以满足灵敏、准确检测Hg的需求。

发明内容

针对现有技术中存在的问题，本发明的目的是提供一种检测Hg²⁺的生物传感器及检测方法和应用，本发明中的检测Hg²⁺的生物传感器能够基于引物-模板转换的级联信号放大策略用于西洋参水浸出液中Hg²⁺的超灵敏检测，所述生物传感器将滚环扩增(RCA)、多重链置换扩增(MRSDA)和基于G-四链体的turn-on荧光开关相结合，检测灵敏度高，能有效控制背景信号，具有良好的抗干扰能力，可以用于西洋参水浸出液样品的直接检测，表现出良好的选择性，在复杂基质样品检测中具有应用前景。

为了实现上述目的，本发明的技术方案如下所述：

在本发明的第一方面，提供一种检测Hg²⁺的生物传感器，包括以下组分：

发卡探针，所述发卡探针含有切刻内切酶Nb.BbvCI的半识别位点序列和G-四链体序列；

引物探针，所述引物探针与所述发卡探针的一部分互补。

在一种或多种实施方式中，所述生物传感器还包括硫黄素T、T4连接酶、Bst聚合酶和切刻内切酶Nb.BbvCI。

在一种或多种实施方式中，所述发卡探针的序列为：

序列中的粗体字母表示切刻内切酶Nb.BbvCI的识别位点，下划线字母表示G-四链体序列。

在一种或多种实施方式中，所述引物探针的序列为：

AGCCACCACACCAGCAAGACGAC。

在本发明的第二方面，提供一种第二方面所述检测Hg²⁺的生物传感器在检测Hg²⁺中的应用。

在本发明的第三方面，提供一种西洋参水浸出液中Hg²⁺的检测方法，其特征在于，所述方法包括采用上述检测Hg²⁺的生物传感器进行检测：

1)将西洋参饮片加水煮沸，取溶液部分得到西洋参水浸出液，将浸出液定容得到待检测样品；

2)在T4连接酶反应缓冲液中，将发卡探针和待检测样品培养一段时间后加入T4连接酶，室温下反应，然后加热使T4连接酶失活；

3)向步骤2)得到的混合物中加入引物探针、脱氧核糖核苷5’-三磷酸混合物和Bst聚合酶，并在反应缓冲液中反应一段时间；反应完成后加入切刻内切酶Nb.BbvCI继续反应一段时间；

4)向步骤3)得到的混合物中加入硫黄素T，并在一定温度下保持一段时间；

5)对步骤4)得到的溶液进行荧光光谱检测。

在一种或多种实施方式中，步骤2)中的T4连接酶反应缓冲液的组成为50mM Tris-HCl(pH 7.5@25℃)，10mM MgCl₂，10mM DTT，1mM ATP。

在一种或多种实施方式中，步骤3)中的反应缓冲液的组成为20mM Tris-HAc(pH7.9)、100μg mL^-1BSA、50mM KAc、10mM Mg(Ac)₂；

在一种或多种实施方式中，步骤4)中加入硫黄素T的同时还加入KCl和H₂O。

在一种或多种实施方式中，步骤5)的具体方法为采用荧光分光光度计在425nm激发波长下，记录450-550nm荧光光谱区域的信号；

本发明具有以下有益效果：

本发明提出的检测Hg²⁺的生物传感器能够基于引物-模板转换的级联信号放大策略用于西洋参水浸出液中Hg²⁺的超灵敏检测。本发明中的生物传感器将滚环扩增(RCA)、多重链置换扩增(MRSDA)和基于G-四链体的turn-on荧光开关相结合，两种扩增都基于依赖Hg²⁺而生成的模板，RCA与MRSDA级联扩增可提供较高的检测灵敏度，而级联信号放大中模板的目标物依赖性能有效控制背景信号。

本发明中西洋参水浸出液中Hg²⁺的检测方法具有良好的抗干扰能力，在复杂基质样品的检测中表现出良好的性能，能够成功用于西洋参水浸出液中Hg²⁺的检测；可以用于西洋参水浸出液样品的直接检测，表现出良好的选择性，在复杂基质样品检测中具有应用前景。

本发明提供了一种新的Hg²⁺超灵敏检测方法，在食品药品质量监测和健康风险评估中有可观的应用前景。

附图说明

图1为本发明实施例中基于引物-模板转换的级联放大方法检测Hg²⁺的原理图。

图2(A)为本发明实施例中不同体系下的荧光光谱图，其中，四条曲线从上至下分别为阳性体系、无Nb.BbvCI体系、阴性体系、无Hg²⁺和Nb.BbvCI的体系。

图2(B)为本发明实施例中的PAGE凝胶成像图，M：DNAmarker；1：引物；2：发卡探针；3：阴性体系；4：无Nb.BbvCI体系；5：阳性体系。

图3为本发明实施例中不同实验条件对Hg²⁺检测结果的影响，其中，(A)为T4 DNA连接酶浓度；(B)为Bst聚合酶浓度；(C)为Nb.BbvCI浓度；(D)为dNTPs浓度；(E)为RCA反应时间；(F)为MRSDA反应时间；(G)为ThT浓度。

图4(A)为本发明实施例中0-7.5×10^-9M范围内不同浓度Hg²⁺存在时体系的荧光光谱。

图4(B)为本发明实施例中荧光强度对Hg²⁺浓度的响应关系，误差线显示了三次独立测试结果的标准偏差。

图5为本发明实施例中的选择性实验结果图，误差棒为三次平行实验结果的标准偏差。

具体实施方式

应该指出，以下详细说明都是例示性的，旨在对本申请提供进一步的说明。除非另有指明，本申请使用的所有技术和科学术语具有与本申请所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同含义。

需要注意的是，这里所使用的术语仅是为了描述具体实施方式，而非意图限制根据本申请的示例性实施方式。如在这里所使用的，除非上下文另外明确指出，否则单数形式也意图包括复数形式，此外，还应当理解的是，当在本说明书中使用术语“包含”和/或“包括”时，其指明存在特征、步骤、操作、器件、组件和/或它们的组合。

下面结合具体的实施例对本发明作进一步的解释和说明。

实施例

实验部分

试剂和仪器：西洋参饮片购自山东中医药大学附属医院。Hg(ClO₄)₂、BaCl₂、NiSO₄、MnSO₄、Pb(NO₃)₂、AlCl₃、硫黄素T(ThT)由Sigma-Aldric公司(St Louis，MO，U.S.A.)提供。SYBR Gold购自Invitrogen Corporation(CA)。T4连接酶、脱氧核糖核苷5’-三磷酸混合物(dNTPs)、Bst聚合酶和切刻内切酶Nb.BbvCI由New England Biolabs(中国北京)提供。所有HPLC纯化的DNA寡核苷酸(表1)均从Sangon Biotech(中国上海)获得。所有其他试剂均为分析级试剂，无需进一步纯化即可使用。所有溶液均由Milli-Q水净化系统(Millipore Co.,U.S.A.)提供的超纯水制备。

表1本发明用到的DNA序列

注：序列中的粗体字母表示切刻内切酶Nb.BbvCI的识别位点，下划线字母表示G-四链体序列。

样品荧光光谱测试使用荧光光谱仪(日本日立F-7000)。凝胶成像使用紫外成像系统(美国Bio-RAD Laboratories Inc.)。

基于引物-模板转换的级联信号放大反应：

在T4连接酶反应缓冲液[50mM Tris-HCl(pH 7.5@25℃)，10mM MgCl₂，10mM DTT，1mM ATP]中，将100nM发卡探针和Hg²⁺在37℃下培养2.0h。之后，向上述混合物中加入2.0UL^-1T4连接酶，在室温下反应3.0h，然后在65℃下加热20min，使T4连接酶失活。随后，向混合物中加入100nM引物、0.4mM dNTPs和0.08UμL^-1Bst聚合酶，并在反应缓冲液[20mM Tris-HAc(pH 7.9)、100μg mL^-1BSA、50mM KAc、10mM Mg(Ac)₂]中于37℃反应1.5h。最后，加入0.5UμL^{- 1}Nb.BbvCI与混合物在37℃下混合3.0h。

荧光光谱测量：

向上述制备的混合物中加入0.2M KCl、20μM ThT和H₂O，并在37℃下保持40min。使用日立F-7000荧光光谱仪测量样本的荧光光谱。在425nm激发波长下，记录了450-550nm荧光光谱区域的信号。激发和发射带宽均为5.0nm，光电倍增管电压为700V。

凝胶电泳分析：

采用12％非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)对反应产物进行分析。本发明实施例中染色材料为SYBR Gold，工作缓冲液为1×TBE缓冲液(89mM硼酸，2.0mM EDTA，89mM Tris，pH 8.3)。凝胶电泳在恒定电流30mA、恒温15℃、运行时间1.0h条件下进行，凝胶避光处染色40min后，用紫外成像系统拍照。

西洋参水浸出液中Hg²⁺的检测

称取西洋参饮片1.0g，加入蒸馏水20mL，加热并保持沸腾1h。放凉后将溶液部分转移至25mL容量瓶中，用水定容，制得西洋参水浸出液。向西洋参水浸出液中加入不同浓度Hg²⁺，根据上述实验部分的方法，检测供试液中的Hg²⁺。

结果与讨论

图1描述了本发明中检测Hg²⁺的生物传感器的工作原理，该工作原理基于引物-模板转换的级联放大策略。整个传感过程包括两个步骤：目标物依赖的RCA和后续的MRSDA。在目标物依赖的RCA过程中，设计了两种DNA探针，即发卡探针和引物探针。发卡探针含有切刻内切酶Nb.BbvCI的半识别位点序列和G-四链体序列。引物探针是与发卡探针的一部分互补的短DNA序列。Hg²⁺存在时介导发生T-Hg-T错配杂交，使发卡探针折叠成哑铃状探针。随后在T4连接酶的辅助下将哑铃探针环化。以环化哑铃探针为模板，在外加引物和Bst聚合酶作用下发生RCA，生成重复的多个拷贝。然后加入切刻内切酶Nb.BbvCI，将RCA模板切刻成为线性DNA链，其作为随后MRSDA的引物。在MRSDA步骤之前，在Bst聚合酶作用下，以切断的RCA模版为引物，以RCA产物为模版发生DNA聚合，形成dsDNA。之后，通过切刻内切酶Nb.BbvCI的切刻作用引发MRSDA循环反应。一旦产生切刻位点，Bst聚合酶就在切刻位点的3’端处开始聚合，随后置换并释放包含G-四链体结构的ssDNA重复报告子的多个拷贝，最后通过硫黄素T(ThT)插入G-四链体而产生增强荧光。反之，在没有Hg²⁺的情况下，不会发生探针折叠和环化。因此，不会发生随后的RCA和MRSDA。本发明通过串联运行两种扩增反应，在灵敏度方面具有显著优势。特别是MRSDA通过多位点的切割-延伸-链置换的重复循环，实现了G-四链体序列的显著扩增。另外，级联扩增中模板的目标依赖性使背景信号得到控制。

1、可行性研究

为了验证该方法的可行性，测量了不同实验条件下的荧光光谱。如图2(A)所示，当体系中没有Hg²⁺和Nb.BbvCI时，体系的荧光强度非常低，因为缺少Hg²⁺和Nb.BbvCI时无法生成RCA模板和进行链置换反应。Hg²⁺不存在时体系输出弱信号，这表明几乎没有扩增反应产生G-四链体。这是因为没有Hg²⁺的参与，就无法产生RCA模板。当Hg²⁺加入到体系中时，正如预期的那样，获得了显著增强的荧光信号。这一结果表明，当Hg²⁺存在时，RCA模板成功生成，随后按设计预期进行级联的信号放大。有Hg²⁺但无Nb.BbvCI的体系信号较弱，表明没有Nb.BbvCI时几乎不发生MRSDA，说明MRSDA对信号放大对信号输出有主要贡献。

为进一步验证可行性，本发明实施例对不同条件下体系中DNA进行了PAGE测试。如图2(B)所示，泳道1至5分别表示引物、发卡探针、阴性体系产物、不含Nb.BbvCI的体系产物和阳性体系产物。由于引物为一条短的单链DNA，而PAGE染料主要通过插入双链DNA而染色，因此引物在PAGE成像图中条带不明显(泳道1)。发卡探针含有双链DNA，因此能插入染料而产生明显的条带(泳道2)。对于阴性体系产物(泳道3)，发卡探针条带消失，出现迁移速率略慢于发卡探针的条带，而且条带亮度较发卡探针更深。这说明在Bst聚合酶的作用下发卡探针的茎部延长，此发卡结构无法被T4连接酶环化形成RCA模板，不会引发后续的RCA。在泳道4中，发卡探针带消失，出现多条迁移速度慢的条带。该结果表明发生了RCA过程，生成了不同迁移率的高分子量产物。与泳道4相比，泳道5的条带更多，分子量分布更宽，表明MRSDA产生了不同分子量的扩增产物。因此，荧光和PAGE分析结果证实了所建立的方法用于Hg²⁺检测的可行性。

2、优化条件

在本发明的基于引物-模板转换的级联放大策略中，连接反应、RCA和MRSDA是影响整体检测性能的三个关键过程。为了获得更好的分析性能，对一些关键实验条件进行了优化，包括T4连接酶浓度，Bst聚合酶浓度，切刻内切酶Nb.BbvCI浓度，dNTPs浓度和RCA反应时间。F/F₀(F和F₀分别代表有无Hg²⁺时的信号强度)作为评价不同参数性能的指标。本实施例对每项参数的五个水平进行考察，综合考察不同水平的参数下，体系阴性信号强度、阳性信号强度和F/F₀的变化，以选择最优参数。

T4连接酶是催化RCA环状模板形成的重要成分。T4连接酶不足会导致在指定时间内不能完成RCA模板的环化，造成假阴性结果，严重降低检测的准确性。T4连接酶的过量可能会与其他试剂发生非特异相互作用，影响检测性能。本实施例研究了0.2、0.4、1.0、2.0和4.0U/μL T4连接酶浓度对检测结果的影响。如图3(A)所示，随T4连接酶浓度的升高，阴性信号几乎不变，说明T4连接酶对阴性结果几乎没有影响；阳性信号线升高后降低，在2.0U/μL时F/F₀达到最高值。因此，选择浓度为2.0U/μL的T4连接酶用于后续检测。

Bst聚合酶在RCA和MRSDA反应中发挥链延伸作用。Bst聚合酶浓度不足会导致信号放大效率降低，限制检测的灵敏度；而Bst浓度过高可能因与探针的非特异相互作用而导致的不可预期的影响。同样，本实施例研究了不同Bst聚合酶浓度(0.02、0.04、0.08、0.16和0.32U/μL)对结果的影响，实验结果如图3(B)所示。随着Bst酶浓度的升高，阴性信号几乎没有变化，阳性信号先升高后显著降低。Bst聚合酶浓度为0.08U/μL时F/F₀达到峰值，选择0.08U/μL作为最佳Bst聚合酶浓度。

Nb.BbvCI在引物-模板转化过程中发挥关键作用，Nb.BbvCI不足会减缓甚至中断引物-模板转化，会抑制MRSDA的放大效率，导致检测灵敏度降低。如图3(C)所示，考察了五个水平的Nb.BbvCI浓度：0.3、0.4、0.5、0.6和0.7U/μL。随着Nb.BbvCI浓度的升高，阴性信号几乎没有变化，阳性信号先升高后进入平台期。在0.5U/μL浓度下获得的F/F₀最高，说明Nb.BbvCI浓度为0.5U/μL时足以完成引物-模板转化，因此选0.5U/μL为最佳Nb.BbvCI浓度。

此外，还考察了dNTPs浓度、RCA反应时间、MRSDA反应时间以及ThT浓度对荧光信号的影响。图3(D)显示随dNTPs浓度的升高，阴性信号和阳性信号均先升高后降低。当dNTPs浓度为0.4mM时F/F₀达到最高值，选择0.4mM为最优的dNTPs浓度。需要关注的是，当dNTPs浓度超过1.0mM后，其浓度的继续增加会导致F/F₀急剧下降，这可能与过量的dNTPs对一些酶的抑制作用有关。

RCA过程为后续MRSDA提供模板，RCA反应时间过短会导致后续MRSDA的模板不足，降低放大效果，抑制检测灵敏度。充足的RCA反应时间是保证高效MRSDA放大的重要参数。本实施例对不同RCA时间对结果的影响做了考察，如图3(E)所示。F/F₀在0.5h-1.5h之间逐渐升高，1.5h后达到平稳状态，选择1.5h为最优的RCA反应时间。

MRSDA是产生G-四链体信号分子的关键过程，MRSDA反应时间是保证检测灵敏度的关键参数。本实施例对不同MRSDA反应时间对结果的影响进了考察，结果如图3(F)所示，随着MRSDA反应时间的延长，阴性信号几乎没有变化，阳性信号先升高后进入平台期。当MRSDA反应时间为3.0h时，F/F₀达到平稳状态，选择3.0h为最优MRSDA反应时间。另外，MRSDA反应时间的延长并没有导致阴性信号的升高，说明本实施例的方法的背景信号能被有效控制，这得益于扩增模板的目标物依赖性。

ThT作为荧光染料，其浓度的变化对结果有直接影响，是重要的待优化参数。本实施例选择五个水平的ThT浓度，考察其对结果的影响，如图3(G)所示，随着ThT浓度的升高，阴性信号缓慢升高，这与ThT自发荧光的累积有关；阳性信号先升高后显著降低，这可能是由染料的自淬灭作用引起的。ThT浓度为20μM时，F/F₀达到最大值，选择20μM为最佳ThT浓度。

3、灵敏度实验

通过测定不同浓度Hg²⁺存在时体系的荧光强度，考察本发明实施例中检测Hg²⁺的检测灵敏度和线性范围。当Hg²⁺浓度在0-7.5×10^-9M范围内时，荧光强度随Hg²⁺浓度升高而逐渐增强(图4A)。在3.0×10^-12-1.5×10^-9M范围内，荧光强度与Hg²⁺浓度呈良好的线性关系，线性方程为F＝5.0×10¹¹x+94.6，相关系数(R²)为0.996(图4B)。根据3σ法则计算检出限为0.8×10^-12M(0.8pM)。

表2汇总了本发明实施例与现有技术中的Hg²⁺检测方法的线性范围和检出限。相较于现有技术中的方法，本发明实施例的Hg²⁺检测方法表现出相近甚至更加优越的灵敏度。这得益于高效的信号放大和出色的背景控制：两种扩增技术(RCA和MRSDA)的协同作用提供了良好的检测灵敏度；该方法中级联放大反应的模板的产生均依赖目标物，这有效抑制了背景信号。

表2与现有技术中的相关Hg²⁺检测方法的比较

4、选择性实验

选择性是评价检测方法可靠性的重要指标。非目标离子和探针DNA之间的相互作用可能会导致假阳性/假阴性信号，降低检测的准确性。本实施例进行了选择性实验，考察了本发明中的生物传感器响应不同种类金属离子的信号输出情况。Ba²⁺、Ni²⁺、Pb²⁺、Mn²⁺、Al^{3 +}在自然环境中广泛分布，在西洋参中有一定程度的富集。本实施例考察上述五种干扰离子存在时的信号输出情况。如图5所示，5种干扰离子在检测中仅输出微弱的荧光信号，而Hg²⁺会输出强烈信号。这些结果表明，采用本发明中的检测Hg²⁺的生物传感器对于Hg²⁺的检测具有良好的选择性。

5、西洋参水浸出液中Hg²⁺的检测

水浸出液是西洋参的常用制剂形式，通常含有多种水溶性物质，包括金属离子、有机小分子、多糖、核酸和蛋白质。在仪器分析中，如AAS、AFS和ICP-MS，这些水溶性物质会影响原子化或离子化过程，有些会严重污染进样器，对Hg²⁺的检测产生明显干扰。为了验证本发明中Hg²⁺的检测方法在复杂基质样品检测中的可行性，将不同浓度的Hg²⁺加入到西洋参水浸出液中进行回收实验。对三个浓度水平的Hg²⁺做了回收率考察，即1.5×10^-11、1.5×10^-10和1.5×10^-9M，回收率分别为85.3％、87.4％和98.3％，各水平下测量值的相对标准偏差分别为6.2％、5.9％和3.5％(n＝3)(见表3)。结果表明本发明的检测方法在检测复杂基质样品时表现出可接受的稳定性和准确性。

表3不同浓度Hg²⁺收受率结果(n＝3)。

以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (7)

1.一种检测Hg²⁺的生物传感器，其特征在于，包括以下组分：

发卡探针，所述发卡探针含有切刻内切酶Nb.BbvCI的半识别位点序列和G-四链体序列；

引物探针，所述引物探针与所述发卡探针的一部分互补；

所述生物传感器还包括硫黄素T、T4连接酶、Bst聚合酶和切刻内切酶Nb.BbvCI；

所述发卡探针的序列为：

P-GTTGTTAGGGATAGGGATAGGGATAGGGATTCTTCGTCGTCTTGCTGGT

GTGGTGGCTGCTGAGGAAGACGAC，序列中的粗体字母表示切刻内切酶Nb.BbvCI的识别位点，下划线字母表示G-四链体序列；

所述引物探针的序列为：AGCCACCACACCAGCAAGACGAC；

所述传感器还包括脱氧核糖核苷5’-三磷酸混合物。

2.权利要求1所述检测Hg²⁺的生物传感器在检测Hg²⁺中的应用。

3.一种西洋参水浸出液中Hg²⁺的检测方法，其特征在于，所述方法包括采用权利要求1-2任一项所述检测Hg²⁺的生物传感器进行检测：

1）将西洋参饮片加水煮沸，取溶液部分得到西洋参水浸出液，将浸出液定容得到待检测样品；

2）在T4连接酶反应缓冲液中，将发卡探针和待检测样品培养2.0 h后加入T4连接酶，室温下反应，然后加热使T4连接酶失活；

3）向步骤2）得到的混合物中加入引物探针、脱氧核糖核苷5’-三磷酸混合物和Bst聚合酶，并在反应缓冲液中反应1.5 h；反应完成后加入切刻内切酶Nb.BbvCI继续反应3.0 h；

4）向步骤3）得到的混合物中加入硫黄素T，并在37°C温度下保持40 min；

5）对步骤4）得到的溶液进行荧光光谱检测。

4.如权利要求3所述的检测方法，其特征在于，步骤2）中的T4连接酶反应缓冲液的组成为50 mM Tris-HCl，pH为7.5，10 mM MgCl₂，10 mM DTT，1 mM ATP。

5.如权利要求3所述的检测方法，其特征在于，步骤3）中的反应缓冲液的组成为20 mMTris-HAc，pH值为7.9，100 μg mL^-1 BSA，50 mM KAc，10 mM Mg(Ac)₂。

6.如权利要求3所述的检测方法，其特征在于，步骤4）中加入硫黄素T的同时还加入KCl和H₂O。

7.如权利要求3所述的检测方法，其特征在于，步骤5）的具体方法为采用荧光分光光度计在425 nm激发波长下，记录450-550nm荧光光谱区域的信号。