CN116004476A - 提升细菌纤维素复合膜机械性能的方法 - Google Patents
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Abstract
一种提升细菌纤维素复合膜机械性能的方法，基于高分子量BC的诱变菌株发酵生产得到细菌纤维素，与淀粉、山梨醇、甘油、氯化钙和水混合后制成BC/淀粉复合膜。本发明通过生产菌株多轮诱变的方法，直接生产出高分子量的BC，并以此实现提高BC/淀粉复合膜的抗拉强度和杨氏模量的同时，通过添加氯化钙进一步改善复合膜的断裂伸长率。
Description
技术领域
本发明涉及的是一种生物工程领域技术，具体是一种基于诱变得到的木葡糖酸醋杆菌(CGMCC No.21569)筛选获得产量高又分子量高的细菌纳米纤维素生产菌株，采用其发酵生产的纳米纤维素、制备具备更高机械性能的可生物降解的复合材料薄膜，并通过加入氯化钙作为增塑剂对复合膜机械性能进一步优化的方法。
背景技术
细菌纳米纤维素(Bacterial(nano)cellulose，BC)是一种由微生物所产生的纳米材料。随着BC的用量增加，杨氏模量增加，抗拉强度先增加后减少，而断裂伸长率降低。但BC的生产成本较高，不利于商业化应用和实际使用。Y.Takeuchi等(Journal ofDrugDelivery Science and Technology 46(2018)93-100)在制作羟丙基纤维素的药物负载薄膜中，通过使用较高浓度和较高分子量的羟丙基纤维素，可获得较高抗拉强度的薄膜。此外，BC复合材料除了抗拉强度和杨氏模量、在断裂伸长率方面也存在一定不足，故限制了BC-淀粉复合材料的实际应用。
发明内容
本发明针对现有技术存在的上述不足，提出一种提升细菌纤维素复合膜机械性能的方法，基于诱变菌株发酵生产的BC用来改善BC/淀粉复合膜机械性能，并通过使用添加剂来提升复合膜的断裂伸长率的方法。
本发明是通过以下技术方案实现的：
本发明涉及一种提升细菌纤维素复合膜机械性能的方法，基于高分子量BC的诱变菌株发酵生产得到细菌纤维素，与淀粉、山梨醇、甘油、氯化钙和水混合后制成BC/淀粉复合膜。
所述的高分子量BC的诱变菌株，具体为木葡糖酸醋杆菌(Gluconacetobacterxylinus)158，已经于2021年12月29日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)保藏，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号，中国科学院微生物研究所，保藏编号为CGMCC No.21569。
所述的高分子量BC的诱变菌株，通过对木葡糖酸醋杆菌(Komagataeibacterxylinus，保藏于美国标准生物样品保藏中心ATCC，保藏编号53524)进行多轮诱变、筛选得到，具体包括：以木葡糖酸醋杆菌ATCC 53524为原始菌株，首先以1-甲基-3-硝基-1-亚硝基胍(NTG)诱变对菌株进行化学诱变后，再以静置培养4天BC产量为基准挑选诱变菌株继续进行紫外诱变。
所述的诱变的条件为：NTG浓度为0.05mg/mL，30℃、200rpm摇床反应30min。
所述的紫外诱变的条件为：紫外灯功率为30W，波长为254nm，间歇式照紫外：每次10s，一共三次。
所述的静置培养，按照发酵培养基的组分及含量为：蔗糖40g/L、(NH4)2SO43.3 g/L、KH2PO41.0 g/L、MgSO4·7H2O 0.25g/L、玉米浆(CSL)5％(v/v)，余量为水，30℃静态培养4天。
所述的细菌纤维素、淀粉、山梨醇、甘油、氯化钙与水的比例满足：细菌纤维素1％、淀粉10％、山梨醇1％、甘油2％、氯化钙0.5-10wt％(以细菌纤维素+淀粉的总质量为基准)、水50g进行称量。
所述的氯化钙的含量优选为0.5-2wt％。
技术效果
与现有技术相比，本发明通过生产菌株多轮诱变的方法，直接生产出高分子量的BC，并以此实现提高BC/淀粉复合膜的机械性能(特别是抗拉强度和杨氏模量)。同时氯化钙的添加可以改善复合膜的断裂伸长率，实现极大增强断裂伸长率的同时保持抗拉强度与杨氏模量。
附图说明
图1为本发明细菌纤维素扫描电镜图；
图2为本发明细菌纤维素X-射线衍射图；
图3为NTG诱变初筛实验结果示意图；
图4为紫外诱变初筛实验结果示意图；
图5为诱变菌株全基因组序列图；
图6为不同氯化钙浓度下复合膜机械性能示意图。
具体实施方式
本实施例通过以下步骤实现提升细菌纤维素复合膜机械性能：
步骤1、NTG诱变，具体包括：
1.1)将ATCC 53524接种于含纤维素酶(0.0066g)的HS液体种子培养基(50mL/250mL三角瓶)，160rpm、30℃振荡培养18h左右。
1.2)取培养液10000rpm离心2min，去上清，沉淀中加入与上清等体积的无菌水，振荡重悬制成菌悬液。
1.3)取1mL菌液与棕色EP管中，12000rpm离心5min，去上清，用1mL缓冲液将离心后的沉淀重悬。
1.4)取500μL菌液加入不同量的缓冲液和1-甲基-3-硝基-1-亚硝基胍(NTG)，使NTG最终浓度为0.05mg/mL，放置30℃、200rpm摇床反应30min。
1.5)终止反应：反应结束后，取出菌液，立即向其中各加500μL硫代硫酸钠终止反应，迅速混匀后，12000rpm离心5min，取出后用枪头小心吸取上清弃掉。
1.6)涂布：无菌生理盐水重悬梯度稀释，溴平板上进行涂布筛选，于30℃条件下倒置培养。
1.7)摇瓶初筛：用接种环刮取半环菌体接种于发酵发酵基中(50mL/250mL挡板瓶)，30℃，100rpm动态培养。产物发酵4天后取出，水洗离心2次(10000rpm，6min)以去除培养基，置于已称量的一次性培养皿中，于60℃烘箱内烘干至恒重，称重计算。结果如附图3。
1.8)复筛：除培养方式为静态外，接种条件培养基与步骤1.7相同。产物发酵4天后取出，水洗离心2次(10000rpm，6min)以去除培养基。然后使用0.1mol NaOH水浴80-100℃碱煮20-30min，水洗至中性。收集纯化产物置于已称量的一次性培养皿中，于60℃烘箱内烘干至恒重，称重计算。
表1 NTG诱变复筛获得的若干株高产菌株的发酵结果
| 菌编号 | 静态发酵4d产量g/L |
| ATCC53524 | 11.91 |
| 143 | 12.73 |
| 187 | 10.03 |
| 167 | 10.29 |
| 157 | 13.58 |
| 207 | 12.35 |
本实施例复筛得到数株产量较好的BC生产菌株，并以产量最好的157进行第二轮紫外诱变。
步骤2、紫外诱变，具体包括：
2.1)根据步骤1的复筛结果，以BC产量标准进行诱变菌株筛选，选择最高产量菌株进行紫外诱变。按照实施例1的方式制备菌悬液。
2.2)取1mL菌悬液，将菌液稀释1000倍，吸1mL于60mm细胞板中，进行紫外照射，照射时间为10s。紫外灯功率为30W，波长为254nm，待处理菌悬液于紫外灯距离为22cm。诱变结束后，往细胞板内加入14mL无菌水(相当于稀释了15倍)。吸取50μL涂布于HS平板，放置于30℃培养箱中培养至长出单菌落，并对单菌落进行平板划线培养。
2.3)初筛：将紫外诱变得到的菌株接种于发酵培养基(50mL/250mL、pH5.0)，摇晃混匀，30℃静置培养4d。将发酵产物收集水洗离心(10000rpm、20min)，再打碎磨浆后在80℃碱煮20min。然后用漏斗过滤，并冲洗至中性，于60℃烘箱内烘干至恒重，称重计算。结果如附图4。
2.4)复筛：培养方式与步骤实施例2步骤3)相同。产物发酵4天后取出，水洗离心2次(10000rpm，6min)以去除培养基。然后使用0.1mol NaOH水浴80-100℃碱煮20-30min，水洗至中性。收集纯化产物置于已称量的一次性培养皿中，于60℃烘箱内烘干至恒重，称重计算。
表2紫外诱变复筛的若干株高产菌株的实验结果
| 编号 | 产量g/L | 增幅 |
| 157-CK | 5.67 | — |
| 158 | 11.5 | 50.72％ |
| 437 | 8.39 | 32.44％ |
| 120 | 8.17 | 30.64％ |
| 262 | 8.16 | 30.49％ |
本实施例复筛得到数株产量较好的BC生产菌株。这里以产量最好的诱变菌株158进行分子量检测。158菌株的全基因组序列图如附图5所示，与出发菌株的基因差异分析结果如附表3所示。结果表明：基因bcsA_1、acsAB_1、epsJ_1和bglB_1有可能调控BC分子量，基因序列如序列表SEQ ID No.1，SEQ ID No.2，SEQ ID No.3和SEQ ID No.4所示。
表3
步骤3)细菌纤维素分子量测定
3.1)将细菌纤维素使用自动粉碎机进行粉碎，得到细菌纤维素粉末。
3.2)在上一步得到的细菌纤维素粉末中，按照每0.125g细菌纤维素干粉，加入三氟乙酸(TFA)5mL，三氟乙酸酐(TFAA)1.6mL加入到100mL圆底瓶中，室温(25℃)磁力搅拌2-3h，得到高粘度溶液，然后加入12mL氯仿稀释，室温放置16h，得到白色聚合物沉淀，用200mL乙醚洗涤。乙醚用真空旋转蒸发器在25℃、80Pa条件下蒸发，剩余液体用氮气吹干。在150℃干燥60min去除TFA或乙醚，得到三氟乙酸纤维素。
3.3)通过凝胶色谱进行分子量测定。使用色谱纯四氢呋喃溶解上一步所得到的三氟乙酸纤维素，过滤后进样。色谱柱为聚苯乙烯凝胶柱，标样为聚苯乙烯，柱温为45℃，流速为1mL/min，保留时间为15min
表4不同菌株产量及BC衍生物的重均分子量
| 重均分子量 | 转板10次后静态发酵5天产量 | |
| 158 | 3194555 | 18.8g/L |
| ATCC53524 | 1332610 | 10.6g/L |
诱变菌株158分子量比原始菌株ATCC 53524提高139％，产量也比原始菌株提高77％，具有实际应用价值。
性能比较
①将步骤3得到的ATCC 53524菌株生产的BC与诱变菌株158生产的BC分别使用搅拌器破碎，然后使用高压均质机进行均质，均质条件70-90MPa循环5次，均质完成后使用滤纸将多余水分过滤，取部分均质BC进行烘干测定BC含量。
②按照配方细菌纤维素1％，淀粉10％，山梨醇1％，甘油2％，水50g进行称量；
③材料称量好后，在磁力搅拌器上280℃加热6min进行成膜液制备；
④成膜液制备完成后，10000rpm离心10min去除气泡；
⑤去除气泡后使用涂膜器在亚克力板上进行制膜，厚度为1.5mm，在室温下自然干燥后揭膜。
细菌纤维素/淀粉复合膜机械性能测定
将膜裁剪成2mm*30mm的长条形，使用动态热机械分析仪(DMA)进行抗拉强度以及断裂伸长率的检测，测试速率为2.00％/min，环境湿度20％。
表5均质循环5次下不同菌株生产细菌纤维素的所制备复合膜机械性能
| 抗拉强度 | 杨氏模量 | 断裂伸长率 | |
| 诱变菌株158 | 24.76MPa | 1698.67MPa | 2.4％ |
| ATCC53524 | 19.57MPa | 1332.67MPa | 2.5％ |
测试环境湿度为20％，环境温度为25℃
如表5所示，在用量相同的情况下，使用更高分子量的BC所制备的复合膜具有更高的机械性能，抗拉强度由19.57MPa提高至24.76MPa，杨氏模量从1332.67MPa提升至1698.67MPa，分别提升了26.5％与27.5％。
将步骤2中得到的两种BC以另一种均质条件均质，步骤4中BC均质条件为70-90MPa循环3次，均质完成后使用滤纸将多余水分过滤，取部分均质BC进行烘干测定BC含量。其余制备条件同步骤2，实验条件为环境湿度60％
表6均质循环3次下不同菌株生产细菌纤维素的所制备复合膜机械性能
| 抗拉强度 | 杨氏模量 | 断裂伸长率 | |
| 诱变菌株158 | 5.07MPa | 248.08MPa | 15.3％ |
| ATCC53524 | 3.36MPa | 136.13MPa | 15.5％ |
测试环境湿度为60％，环境温度为25℃
如表6所示，在BC预处理条件改变的情况下，使用更高分子量的BC所制备的复合膜同样具有更高的机械性能，抗拉强度由3.36MPa提高至5.07MPa，杨氏模量从136.13MPa提升至248.08MPa，分别提升了50.1％与82.2％，显著提升了复合膜的机械性能
综上，可以通过联合诱变育种的方式进行高分子量的BC生产，并可使用高分子量BC制备具有更高机械性能的BC/淀粉复合膜。
使用诱变菌株158所生产BC进行复合膜制备，配方中加入0wt％，0.5wt％，2.0wt％，5wt％，10wt％(基于淀粉+BC的质量：5.5g)的氯化钙。其余步骤按照实施例4步骤进行制备与测试。
实验结果见附图5，不加入氯化钙的BC/淀粉复合膜断裂伸长率、抗拉强度与杨氏模量分别为11.6％、4.32MPa与244.02MPa。加入0.5wt％氯化钙的BC/淀粉复合膜断裂伸长率、抗拉强度与杨氏模量分别为23.7％、4.90Mpa与234.92Mpa。实现了在增加1倍断裂伸长率的同时，保持了抗拉强度与杨氏模量。
与现有技术相比，本方法通过添加使用诱变菌株产的高分子量BC及低浓度的氯化钙，在保证抗拉强度与杨氏模量的前提下，极大地增强断裂伸长率。
上述具体实施可由本领域技术人员在不背离本发明原理和宗旨的前提下以不同的方式对其进行局部调整，本发明的保护范围以权利要求书为准且不由上述具体实施所限，在其范围内的各个实现方案均受本发明之约束。
Claims (9)
1.一种用于提升细菌纤维素复合膜机械性能的诱变菌株，其特征在于，具体为木葡糖酸醋杆菌(Gluconacetobacterxylinus)158，已经于2021年12月29日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)保藏，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号，中国科学院微生物研究所，保藏编号为CGMCCNo.21569。
2.一种基于权利要求1所述诱变菌株的应用，其特征在于，将其用于提升细菌纤维素复合膜机械性能的方法，具体为：将诱变菌株发酵生产得到细菌纤维素，与淀粉、山梨醇、甘油、氯化钙和水混合后制成BC/淀粉复合膜。
3.根据权利要求1或2所述的提升细菌纤维素复合膜机械性能的方法，其特征是，所述的诱变菌株，基于木葡糖酸醋杆菌(Komagataeibacterxylinus，保藏于美国标准生物样品保藏中心ATCC，保藏编号53524)进行多轮诱变、筛选得到。
4.根据权利要求1或2所述的提升细菌纤维素复合膜机械性能的方法，其特征是，所述的诱变菌株，具体通过以木葡糖酸醋杆菌ATCC53524为原始菌株，首先以1-甲基-3-硝基-1-亚硝基胍(NTG)诱变对菌株进行化学诱变后，再以静置培养4天BC产量为基准挑选诱变菌株继续进行紫外诱变。
5.根据权利要求1或2所述的提升细菌纤维素复合膜机械性能的方法，其特征是，所述的诱变的条件为：NTG浓度为0.05mg/mL，30℃、200rpm摇床反应30min。
6.根据权利要求1或2所述的提升细菌纤维素复合膜机械性能的方法，其特征是，所述的诱变，采用的紫外灯功率为30W，波长为254nm，间歇式照紫外：每次10s，一共三次。
7.根据权利要求4所述的提升细菌纤维素复合膜机械性能的方法，其特征是，所述的静置培养，按照发酵培养基的组分及含量为：蔗糖40g/L、(NH4)2SO43.3g/L、KH2PO41.0g/L、MgSO4·7H2O0.25g/L、玉米浆(CSL)5％(v/v)，余量为水，30℃静态培养4天。
8.根据权利要求2所述的提升细菌纤维素复合膜机械性能的方法，其特征是，所述的细菌纤维素、淀粉、山梨醇、甘油、氯化钙与水的比例，以细菌纤维素+淀粉的总质量为基准满足：细菌纤维素1％、淀粉10％、山梨醇1％、甘油2％、氯化钙0.5-10wt％、水50g。
9.根据权利要求8所述的提升细菌纤维素复合膜机械性能的方法，其特征是，所述的氯化钙的含量为0.5-2wt％。
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| CN111378209A (zh) * | 2020-04-20 | 2020-07-07 | 上海交通大学 | 可生物降解的包装膜的制备方法 |
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