CN101629146B - 一株高生物量富锌酵母及其选育方法和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种高生物量富锌酵母及其选育方法和应用。本发明提供的高生物量富锌酵母菌株是(Saccharomyces cerevisiae)F-090428X。该菌株于2009年07月02日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC)，保藏号为CGMCC No.3156。本发明的高生物量富锌酵母选育方法采用了微波辐照。本发明的高生物量富锌酵母可用于制备人类高含锌食品或高含锌食品添加剂或高含锌药物，也可用于制备动物高含锌饲料或高含锌饲料添加剂。
Description
技术领域
本发明涉及一种微生物的品种，这种微生物的选育方法及其应用，确切讲本发明涉及的微生物是一种高生物量富锌酵母。
背景技术
近年来，已有一些称为“富锌酵母”的产品问世，如李文珍等以啤酒酵母(Sacchsromyces cerevisiae)为出发菌种，利用玉米糖化渡加入适当的营养元素及锌离子，经发酵试验获得产品，微生物学杂志 1994年 第14卷 1期；胡振英等将啤酒酵母菌株在高锌条件下进行50代的适应性培养，获得了富锌酵母菌株，中兽医医药杂志 1997年第6期；陈佩林：以酵母菌IFO2346菌株为菌种，培养基中加入适量的锌离子，经发酵试验获得高锌酵母产品，动物医学进展2003，24(3)62-64；郭雪娜等对不同种属的酵母菌株运用了杂交育种技术，出筛、复筛、单倍体分离、亚硝基胍(NTG)诱变，选育到一株富锌酵母菌株(编号为ZGH.374，微生物学报 2004年4月 44卷2期。
中国发明专利申请93119253.6公开了一种药用富锌酵母、生产工艺及其制品，它采用在菌株培养过程选用含锌量高的啤酒酵母菌株，在种子罐或者商品罐接种培养过程，分别在培养基中添加硫酸锌，经相应的工艺过程，获得富锌酵母；富锌酵母和配料，经过药用颗粒剂或药用片剂的生产工艺制成药用富锌酵母制品。
中国发明专利03119428.1公开了一株富锌酵母及其选育方法与应用，本发明提供的菌株为高生物量富锌酵母(Saccharomyces cerevisiae)ZGFH-94 CGMCC№0896。其选育方法包括：1)分别筛选生物量高的酵母菌种和抗锌能力强及细胞含锌量高的酵母菌种；2)筛选生物量高的酵母菌种和抗锌能力强及细胞含锌量高的酵母菌种的单倍体突变菌株；3)生物量高的酵母菌单倍体突变菌株与抗锌能力强及细胞含锌量高的酵母菌单倍体突变菌株进行原生质体融合；4)在选择培养基上筛选高生物量和高含锌量的融合二倍体优良菌株，即富锌酵母菌种。
但这些产品存在明显的缺陷和不足：国内外有关富锌酵母的研究主要侧重于酵母细胞对锌离子的传递和调控或对菌种进行亚硝基胍(NTG)、钴60、紫外等方法诱变，其主要缺陷在于：不同酵母菌种对锌的抗性能力有较大差异，从而对锌离子的吸收转化能力差异较大；而且其酵母细胞内的锌含量较低，产品缺乏稳定性，不利于工业化生产，参见孔林等，食品与生物技术学报 2006年11月 第25卷 第6期。
发明内容
本发明提供一株高生物量的含锌量高的酵母菌株，同时本发明提供这种酵母的选育方法、培养方法及其用途。
本发明提供的高生物量富锌酵母菌株(Saccharomyces cerevisiae)F-090428X。该菌株于2009年07月02日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC)，保藏号为CGMCC No.3156。
本发明的高生物量的富锌酵母菌株的选育方法是以在2000μg/l～10000μg/l锌离子浓度的的麦芽汁固体培养基中驯化的啤酒酵母菌中筛选出生物量高、耐锌能力强及细胞含锌量高的酵母菌种作为诱变出发菌株，取一接种环的发菌株接入盛有30ml液体培养基制备成菌悬液，在29℃，摇床振摇24h，再取2ml菌液转入盛有18ml带玻珠的无菌生理盐水中，再将菌悬液用不高于900W的微波辐照，照射时间不大于65分钟，将经微波辐照的酵母锌菌悬液涂在硫酸锌浓度不高于15000μg/ml的麦芽汁固体培养基平板，经过多次复筛和传代试验，得到所要的高生物量的富锌酵母菌株，以上所用的麦芽汁固体培养基为8Bx麦芽汁、容积重量比为0.3％的尿素和1.2％琼脂、pH5.0，所用的液体培养基为8Bx麦芽汁、容积重量比为0.3％的尿素、pH5.0。
本发明的高生物量的富锌酵母菌株的选育中所用的微波频率为2450MHz。
本发明的高生物量的富锌酵母菌株的培养条件是在麦芽汁培养基上接种高生物量富锌酵母(Saccharomyces cerevisiae)F-090428X，接种量为体积比10％-30％，在28℃～30℃搅拌培养16～48小时，所用的培养基为8Bx麦芽汁、容积重量比为0.3％的尿素的麦芽汁-尿素培养基，总糖含量为5％～20％，培养基中锌盐浓度为10000～15000μg/ml，培养基的pH为4.5～5.5。
本发明的高生物量的富锌酵母菌株在制备人类高含锌食品或高含锌食品添加剂或高含锌药物中的应用。
本发明的高生物量的富锌酵母菌株在制备动物高含锌饲料或高含锌饲料添加剂中的应用。
本发明使用的高生物量富锌酵母(Sacchsromyces cerevisiae)F-090428X不仅生物量高，而且细胞的有机锌含量较高，检测表明，其每克干细胞含有机锌量高达50mg，生物量12g/L，而现有的高生物量富锌酵母ZGH-374菌株每克干细胞含有机锌量仅为14.3mg，生物量9.2g/L，参见2004年微生物学报《富锌酵母的选育及培养条件研究》一文。
本发明生产富锌酵母产品的方法以普通的麦芽汁、0.3％尿素培养基为发酵底物，只需调节其总糖含量，添加锌盐量(如硫酸锌)等即可进行生产，方法简单，成本低廉。其选育中所使用的最佳微波辐射频率为2450MHz，可采用普通的家用微波炉实现对被选育菌种的辐照诱变；本发明给出的高生物量的富锌酵母菌株的优选培养条件可以使其有最大的产率；因此本发明的方法实用性强，操作简便，对发酵设备及生产条件没有特殊要求，利用一般发酵厂的设备和生产条件即可生产，投资少、见效快、效益高，不但适合于大规模的生产还适合于小批量的生产，具有广阔的实际应用前景。
附图说明
图1为富锌酵母产品的生产工艺流程示意图。
具体实施方式
实施例1、高生物量富锌酵母(Saccharomyces cerevisiae)F-090428X的选育
高生物量富锌酵母(Saccharomyces cerevisiae)(F-090428X)的选育分为以下几个步骤：
1)根据酵母菌对硫酸锌的耐性测定进行初筛，测定了啤酒酵母菌在含有5000μg/ml、6000μg/ml、8000μg/ml、10000μg/ml的梯度锌离子浓度的麦芽汁固体培养基上的生长情况，从中选出2株在含有10000μg/ml锌离子的麦芽汁固体培养基上生长好的菌株。
2)测定初筛得到的1株菌株在含有10000μg/ml锌离子的麦芽汁液体培养基中培养的细胞生物量和细胞含锌量。通过驯化、筛选，获得1株(F-090415)干细胞锌含量35.5mg/g，细胞干重9.2g/L的菌株。
3)诱变剂量的考察 以筛选得到的高产菌株F-090415(锌10000μg/ml)作为出发菌株，取制备好的菌悬液于一三角瓶内，将装有菌悬液的的三角瓶放入2450MHz 900W家用微波炉进行不同时间的照射。照射时间分别累计为0、10、20、30、40、60和80s，在照射80s时，致死率已达100％。
4)诱变菌种筛选 根据微波照射剂量与死亡率的关系，从0s、10s、20s、30s、40s、60s的酵母锌菌悬液涂在硫酸锌浓度为10000μg/ml、12000μg/ml、15000μg/ml的培养基平板。待菌落长出后，将各剂量组分别挑出单菌落转接斜面培养。用长好的菌斜面，以出发菌株F-090415为对照进行发酵筛选试验，测定各菌株锌含量和细胞干重。结果相对于出发菌株，40s剂量组中生产能力超出20％以上的菌株百分率显著提高。说明微波诱变照射40s对酵母锌产生菌的菌种具有正效应。从各组挑出超过出发菌株生产能力20％的菌株进行复筛。经过多次复筛和传代试验，得到40s剂量组F-090428X菌株，在摇瓶中的酵母锌生产能力(细胞干重12g/L)较出发菌株F-090415提高30％，含锌量50.0mg/g，较出发菌株提高40.8％。
实施例2、高生物量富锌酵母(Saccharomyces cerevisiae)F-090428X的优化培养条件
1)采用单因子发酵实验和多因子正交实验进行高生物量富锌酵母(Saccharomyces cerevisiae)F-090428X的培养条件(包括培养基组分、锌盐浓度、培养基的pH值、通气量、接种量及发酵时间等)实验，通过培养条件实验，确定了优化培养条件：麦芽汁+0.3％尿素培养基，总糖含量为5％-20％，培养基中锌盐(如硫酸锌)浓度为10000-15000μg/ml，培养基的pH为4.5-5.5，接种量为10％-30％，28℃-30℃搅拌培养16-48h。
2)在优化的发酵培养条件下发酵培养高生物量和高含锌量的富锌酵母：在优化培养条件下，每升培养液的细胞干重达12g以上，每克干细胞的锌含量达50mg以上。
实施例3、高生物量富锌酵母的生产
高生物量和高锌含量的富锌酵母产品的生产工艺包括：
斜面菌种→一级摇瓶菌种培养→二级摇瓶种子培养→种子罐→二级液体种子罐→发酵罐→储罐→固液分离→冻干或喷雾干燥→(或采用板框压榨或离心收集富锌酵母细胞→粉碎)→高生物量、高富锌含量的富锌→分装→制剂(饲料添加剂、或胶囊、片剂等)→包装。
下面对生产工艺进一步说明如下：
(1)斜面菌种培养
高生物量富锌酵母(Saccharomyces cerevisiae)F-090428X接种于含有总糖含量为16％、锌盐(如硫酸锌)浓度为15000μg/ml的麦芽汁固体斜面上，在28-30℃培养三天后，放入4℃冰箱保存：
(2)一级摇瓶菌种培养
将保存的高生物量富锌酵母(Saccharomyces cerevisiae)F-090428X菌种活化后，接一环细胞于装有150毫升总糖含量为10％、锌盐(如硫酸锌)浓度为12000μg/ml的麦芽汁培养基的1-3×500ml锥形瓶中，于28-30℃搅拌培养18h即为液体菌种；
(3)二级摇瓶种子培养
按10％的接种量将液体菌种接入装有150毫升总糖含量为12％、锌盐(如硫酸锌)浓度为12000μg/ml的麦芽汁培养基的20-30×500ml锥形瓶个中，在28-30℃搅拌培养20h，即为一级液体种子培养物：
(4)种子罐培养
按15％的接种量将一级种子培养液接入装有100立升总糖含量为12％、锌盐(硫酸锌)浓度为12000μg/ml的麦芽汁培养基的发酵罐，在28-30℃搅拌培养18h，即为二级液体种子培养物；
(5)二级液体种子培养
按20％的接种量将二级种子培养液接入装有500立升总糖含量为16％、锌盐(硫酸锌)浓度为15000μg/ml的麦芽汁培养基的发酵罐，在28-30℃搅拌培养20h，即为三级液体种子培养物：
(6)发酵罐发酵培养
按30％的接种量将三级种子培养液接入装有30000立升总糖含量为14％、锌盐(硫酸锌)浓度为15000μg/ml的麦芽汁培养基的发酵罐，在28-30℃搅拌培养24h；
(7)收集酵母细胞及干燥
采用冷冻干燥或喷雾干燥(或板框压榨或离心收集富锌酵母细胞，在45-85℃风干使其含水量小于5％)；。
(8)制剂
饲料添加剂、或胶囊、片剂等。
(9)包装
用不透气的包装袋包装，即为高生物量、高富锌含量的富锌酵母，每克干富锌酵母细胞含有机锌高于50mg)。
本发明的高生物量的富锌酵母菌株可在制备人类高含锌食品或高含锌食品添加剂或高含锌药物中的应用；貤可在制备动物高含锌饲料或高含锌饲料添加剂中的应用。
Claims (4)
1.一株高生物量富锌酵母(Saccharomyces cerevisiae)F-090428X，菌株于2009年07月02日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCC No.3156。
2.权利要求1所述的高生物量的富锌酵母菌株的培养方法，其特征是在麦芽汁培养基上接种高生物量富锌酵母(Saccharomyces cerevisiae)F-090428X，接种量为体积比10％-30％，在28℃～30℃搅拌培养16～48小时，所用的培养基为8Bx麦芽汁、容积重量比为0.3％的尿素的麦芽汁-尿素培养基，总糖含量为5％～20％，培养基中锌盐浓度为10000～15000μg/ml，培养基的pH为4.5～5.5。
3.权利要求1所述的高生物量的富锌酵母菌株在制备人类高含锌食品或高含锌食品添加剂或高含锌药物中的应用。
4.权利要求1所述的高生物量的富锌酵母菌株在制备动物高含锌饲料或高含锌饲料添加剂中的应用。
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