CN115927381B - 一种油菜rna加工因子ncbp基因及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种油菜RNA加工因子NCBP基因及其应用，涉及基因工程技术领域，该基因位于油菜的A10染色体上，具有如SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列，或具有与SEQ IDNO.1所示序列互补的核苷酸序列。本发明首次公开NCBP基因在调控植物花期中的用途，通过CRISPR‑Cas9技术遗传转化甘蓝型油菜品种Westar对油菜NCBP基因家族进行基因编辑，进一步筛选获得含有目的基因突变的纯合突变体材料，突变体材料表现出晚花，NCBP.A10在拟南芥中的过表达表现出早花，证实了NCBP基因在油菜花期调控中的用途。本发明为培养生育期适当的甘蓝型油菜提供了新的基因资源和新思路。

Description

一种油菜RNA加工因子NCBP基因及其应用

技术领域

本发明涉及基因工程技术领域，具体涉及一种油菜RNA加工因子NCBP基因及其应用。

背景技术

甘蓝型油菜(Brassica napusL.，2n＝38,AACC)是世界上最重要的食用植物油资源之一，油菜粕也是饲料蛋白的重要来源，与畜牧业的发展息息相关。因此，大力发展油菜产业，对于保障我国优质食用植物油和饲料蛋白的有效供应，促进相关产业发展具有重要意义。

开花是植物从营养阶段向生殖阶段转变的过程，这个过程受内部因素(年龄和赤霉素)和外部环境条件(光周期、春化和环境温度)的综合调控。油菜生育期对产量有显着影响，开花时间是影响生育期的重要因素。不同生态区域对油菜品种的开花期要求不同，油菜花期的长短也决定了其种植面积，植物适时开花可以避免不适宜的生存环境，对提高植物产量具有重要意义。挖掘油菜花期调控基因，对于维护国家食用油供应、保障国家粮油安全具有重要的战略意义和实际应用价值。

鉴于此，本发明利用GWAS技术，分离了一个位于甘蓝型油菜10号染色体上，同时控制初花期、终花期和成熟期的QTL，S10_12378911，进一步在该区间内发现候选基因NCBP.A10，其编码一种RNA加工因子。通过对候选基因进行CRISPR/Cas9基因编辑验证，并将其过表达载体在拟南芥中异源表达，证实了该基因在控制开花时间上的生物学功能，可为利用该基因进行花期的遗传改良提供理论依据。。

发明内容

本发明的目的在于提供了一种通过CRISPR-Cas9技术对油菜NCBP基因家族进行基因编辑的方法，以提供一种可调节植物开花时间的基因，为培育生育期适当的油菜品种提供依据。

本发明通过以下技术方案来实现上述目的：

本发明提供了一种油菜RNA加工因子NCBP基因，该基因位于油菜的A10染色体上，具有如SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列，或具有与SEQ ID NO.1所示序列互补的核苷酸序列。

本发明还提供了一种上述油菜RNA加工因子NCBP基因在改良油菜花期性状中的应用。

进一步改进在于，所述油菜为甘蓝型油菜。

进一步改进在于，敲除甘蓝型油菜中NCBP基因的纯合突变体植株表现出晚花。

进一步改进在于，过表达甘蓝型油菜中NCBP基因的纯合植株表现出早花。

本发明还提供了一种改良油菜花期性状的方法，包括以下步骤：

(1)在油菜BnaNCBP基因家族编码区的保守区域设计靶标序列；

(2)根据靶标序列合成接头引物，构建用于BnaNCBP基因打靶的CRISPR/Cas9重组载体；

(3)将所述重组载体转入根癌农杆菌GV3101,利用农杆菌介导法转化甘蓝型油菜春性品种Westar,获得转基因油菜植株；

(4)提取转基因阳性植株基因组DNA，利用覆盖靶标位点的基因特异性引物进行PCR扩增和序列测序，对T0代转基因植株进行基因型鉴定；

(5)对发生基因编辑的突变体在T1代进行种植，利用引物对T1代植株中的HPT和Cas9转基因进行PCR扩增检测，获得纯合的BnaNCBP基因编辑突变体植株。

进一步改进在于，所述靶标序列包括以下三种：

sgRNA1：5‘-TGCAGTACAAGTTTGCGATTTGG-3’；

sgRNA2：5‘-TCGCAATGCTTCTGATCATCAGG-3’；

sgRNA3：5‘-TACTCTCGCGACCTCAAAGCTGG-3’。

进一步改进在于，所述步骤(5)中，用于HPT和Cas9转基因扩增的引物序列分别为：

HPT-F：5'-ACACTACATGGCGTGATTTCAT-3'；

HPT-R：5'-TCCACTATCGGCGAGTACTTCT-3'；

Cas9-F：5'-GGCCTCGATATTGGGACTAACT-3'；

Cas9-R：5'-GTCCGCCTTATCTGTGGAGT-3'。

本发明还提供了一种油菜RNA加工因子NCBP基因的获得方法，以NCBP基因的核苷酸序列为模板设计特异性扩增引物，以野生型Westar油菜品种为材料，提取RNA并反转录成cDNA，通过PCR扩增技术获得油菜NCBP基因。

进一步改进在于，所述PCR扩增的特异性扩增引物为：

BnaNCBP.A10-F：5'-GGATCCATGGAGATTACGGAGAGGAGGC-3’；

BnaNCBP.A10-R：5'-GTCGACTCCTCTCAGCCAAGTGTTCC-3’。

本发明提具有如下有益效果：

1.本发明利用甘蓝型油菜自然群体根据GWAS分析结果，在A10染色体上定位了一个同时控制多个生育期性状的稳定主效QTL—S10_12378911，对定位区间进行基因注释及候选基因分析筛选到一个候选基因NCBP，所述NCBP基因编码一个RNA加工因子。

2.本发明通过CRISPR-Cas9技术对BnaNCBP基因家族进行基因编辑，T2代共获得4种纯合突变基因型。盆栽实验表明，纯合突变体开花时间比野生型显著延迟。进一步将BnaNCBP.A10过表达载体转化拟南芥，转基因纯合植株表现出早花，证实了NCBP基因可以控制花期。因此，NCBP基因有利于甘蓝型油菜花期性状的遗传改良和分子育种。利用该方法可快速定向改良现有油菜品种，大大缩短育种周期，节约时间和成本。

附图说明

图1为本发明自然群体生育期性状GWAS定位结果；

图2为利用CRISPR/Cas9系统对NCBP基因进行基因编辑；

图3为野生型和基因编辑突变体测序比对结果；

图4为野生型Westar和T2代BnaNCBP基因敲除纯合突变体油菜花期表型。

图5野生型Col-0和T2代BnaNCBP.A10基因过表达纯合拟南芥花期表型。

具体实施方式

下面结合附图对本申请作进一步详细描述，有必要在此指出的是，以下具体实施方式只用于对本申请进行进一步的说明，不能理解为对本申请保护范围的限制，该领域的技术人员可以根据上述申请内容对本申请作出一些非本质的改进和调整。

1、材料

本实施例所用方法如无特别说明均为本领域技术人员所知晓的常规方法，所用试剂等，如无特别说明，均为市售购买产品。

本发明用到的甘蓝型油菜品种：GWAS定位材料为西南大学油菜工程研究中心收集的588份自然群体；基因编辑材料为常规春性品种Westar；过表达材料为拟南芥品种Col-0。

2、方法

2.1甘蓝型油菜花期候选基因的鉴定

采用TASSEL软件对国内外收集的588份甘蓝型油菜自然群体的5个生育期相关性状(初花期DIF、终花期DFF、花期持续时间FP、成熟期MT和全生育期GP)进行了连续3年的调查统计，结合重测序数据对其进行GWAS分析。

GWAS分析发现，位于A10染色体上的SNP标记S10_12378911同时与初花期，终花期和成熟期显著相关，如图1所示。以SNP标记两侧上下游各300kb的序列区间作为LD区间，在区间内检测到一个候选基因NCBP，该基因与拟南芥eIF4E基因同源，编码一种RNA加工因子，推测其为控制甘蓝型油菜花期性状的候选基因。

2.2含特异sgRNA的BnaNCBP基因编辑载体构建

如图2所示，利用CRISPR/Cas9系统对BnaNCBP基因家族进行基因编辑，步骤如下：

(1)sgRNA的设计

在BnTIR网站(http://yanglab.hzau.edu.cn/BnTIR)上找到BnaNCBP基因家族，NCB P基因在甘蓝型油菜中有5个成员，分别命名为BnaA10.NCBP、BnaA02.NCBP、BnaA03.NCBP、BnC02.NCBP和BnaC03.NCBP，其DNA全长序列如SEQ ID NO.1，SEQ ID NO.2，SEQ ID NO.3，SEQ ID NO.4，SEQ ID NO.5所示。

基于CRISPR-GE在线网站(http://skl.scau.edu.cn/primerdesign/)，针对NCBP基因家族编码区保守区域设计出基因编辑的靶位点序列构建sgRNA序列；

所述sgRNA作用位点的核苷酸序列为：

sgRNA1：5‘-TGCAGTACAAGTTTGCGATTTGG-3’；

sgRNA2：5‘-TCGCAATGCTTCTGATCATCAGG-3’；

sgRNA3：5‘-TACTCTCGCGACCTCAAAGCTGG-3’；

其中下划线部分为PAM序列。

(2)CRISPR编辑载体构建

根据靶位点设计靶位点PCR扩增引物。引物由天一辉远生物科技有限公司合成。以PGTR质粒为模板，PCR扩增目的片段。

所述引物序列如下：

PCR产物通过同源重组方式构建至含有Cas9表达盒的CRISPR表达载体PKSE401-TRNA，将重组表达载体转入大肠杆菌感受态DH5α，挑取单菌落采用菌液PCR方法筛选阳性克隆并进行测序，将测序正确的重组质粒转入农杆菌GV3101，通过农杆菌介导的油菜转化体系转入甘蓝型油菜品系Westar，农杆菌转化、阳性苗筛选实验委托武汉天问生物科技有限公司完成。

2.3BnaNCBP基因敲除油菜的获得及鉴定

(1)阳性苗筛选

转基因苗在培养基中经过潮霉素筛选后，转移到土中，一周后对单株幼嫩叶片进行取样，用CTAB法提取油菜叶片DNA，以引物HPT-F/R进行PCR鉴定阳性植株，扩增产物用1％琼脂糖凝胶电泳进行检测。

所述HPT引物序列如下：

HPT-F：5'-ACACTACATGGCGTGATTTCAT-3’

HPT-R：5'-TCCACTATCGGCGAGTACTTCT-3’

(2)编辑类型检测

分别在每个sgRNA靶位点附近设计基因特异性引物进行PCR扩增，将扩增产物条带大小正确的PCR产物寄送到中国农科院水稻所测序组进行Hi-TOM测序，获取变异位点。

所述基因特异性引物序列如下：

在转基因T0代植株中，有5株转基因植株带有目标突变，其中纯合突变体1株，杂合突变体4株，突变体类型见图3，选取发生基因编辑的植株进行自交繁种，获得T1代种子。

2.4NCBP基因编辑纯合植株表型观察

提取T1代转基因植株基因组DNA，利用上述方法检测T1代植株的编辑情况，自交获得稳定遗传的T2代基因编辑纯合突变体植株(图3)。T2代共获得5个纯合突变基因型，T2-4-9中BnC02.NCBP和BnaA03.NCBP均发生编辑，T2-12-7中BnaA10.NCBP发生编辑，在T2-12-9中BnaA03.NCBP发生编辑，T2-51-7中BnaA03.NCBP发生编辑。这5种突变基因型均导致移码突变，使密码子提前终止，致使蛋白质功能失活。

将T2代敲除的纯合突变体和野生型Westar一同种植于安徽农业大学温室。野生型开花时间为65.5±1.2天，与野生型相比，纯合编辑植株在T2代均表现出晚花，且差异显著。T2-4-9开花时间为69.4±2.2天，T2-12-7开花时间为68.6±1.6天，T2-12-9开花时间为68.4±2.5天，T2-51-7开花时间为68.6±1.8天，结果见图4。以上结果表明，BnaNCBP基因控制甘蓝型油菜开花时间。

2.5NCBP.A10过表达载体构建及转基因拟南芥表型观察

(1)BnaNCBP.A10过表达载体构建

以野生型Westar油菜品种为材料，提取RNA，并将提取的RNA进行反转录生成cDNA第一链，作为PCR扩增的模板。根据BnaNCBP.A10基因的编码区CDS序列，设计特异引物构建过表达载体(横线为酶切位点)：

BnaNCBP.A10-F：5'-GGATCCATGGAGATTACGGAGAGGAGGC-3’；

BnaNCBP.A10-R：5'-GTCGACTCCTCTCAGCCAAGTGTTCC-3’，

获得带有酶切位点的BnaNCBP.A10编码区片段。

将测序正确带有酶切位点的BnaNCBP.A10编码区片段和过表达载体pCambia1300modified(PCMM)分别经BamH I和Sal I双酶切，切胶回收目的片段与载体。利用T4连接酶，22℃过夜连接，使用热激法转入大肠杆菌感受态细胞DH5α，37℃过夜培养，挑取单菌落采用菌液PCR方法筛选阳性克隆并进行测序分析，最终得到植物过表达重组载体PCMM-NCBP.A10。将PCMM-NCBP.A10重组质粒转入农杆菌感受态GV3101，采用菌液PCR法鉴定阳性克隆。

(2)转化拟南芥及转基因纯合植株表型观察

挑选阳性菌液，加入5mL含有卡那霉素Kan、利福平Rif抗性的LB液体培养基，28℃200rpm培养两天，然后按体积比1：100接种于100mL的含有卡那霉素Kan、利福平Rif抗性的LB液体培养基，28℃200rpm培养至OD600值在0.6～0.8之间。

通过离心法收集清洗菌体，使用花粉管介导法转入野生型拟南芥Col-0中，待种子成熟后(T0)，对种子进行潮霉素抗性筛选，阳性苗(T1)于人工气候室培养至种子成熟。筛选T2代纯合转基因种子，播种后鉴定表型，结果如图5所示。图5可以看出，过表达转基因株系与野生型Col-0相比，开花时间显著提前。

综上实施例，本发明利用GWAS分析鉴定了油菜花期候选基因NCBP.A10，根据油菜的NCBP基因序列信息，通过生物信息学方法检索BnTIR数据库，在油菜中鉴定了NCBP的同源基因，分别命名为BnaA10.NCBP、BnaA02.NCBP、BnaA03.NCBP、BnC02.NCBP和BnaC03.NCBP。利用CRISPR-GE在线分析工具，设计出3个基因编辑的靶位点序列，并将其连接在带有Cas9表达盒的PKSE401-TRNA载体上。采用农杆菌介导法转入甘蓝型油菜Westar。经基因特异性引物PCR检测和测序进行转基因植株突变类型分析，筛选到4株纯合的BnaNCBP基因编辑突变体。将BnaNCBP.A10过表达载体转化拟南芥，转基因纯合植株表现出早花。本发明发现BnaNCBP基因对油菜开花期有重要的影响，可应用于油菜花期改良。

以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。

Claims (7)

1.一种油菜RNA加工因子NCBP基因，其特征在于，该基因位于油菜的A10染色体上，所述NCBP基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

2.一种如权利要求1所述的油菜RNA加工因子NCBP基因在改良油菜花期性状中的应用，其特征在于，所述油菜为甘蓝型油菜。

3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，敲除甘蓝型油菜中NCBP基因的纯合突变体植株表现出晚花。

4.一种改良油菜花期性状的方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)在油菜BnaNCBP基因家族编码区的保守区域设计靶标序列；所述靶标序列包括以下三种：

sgRNA1：5‘-TGCAGTACAAGTTTGCGATTTGG-3’；

sgRNA2：5‘-TCGCAATGCTTCTGATCATCAGG-3’；

sgRNA3：5‘-TACTCTCGCGACCTCAAAGCTGG-3’；

(2)根据靶标序列合成接头引物，构建用于BnaNCBP基因打靶的CRISPR/Cas9重组载体；

(3)将所述重组载体转入根癌农杆菌GV3101,利用农杆菌介导法转化甘蓝型油菜春性品种Westar,获得转基因油菜植株；

(4)提取转基因阳性植株基因组DNA，利用覆盖靶标位点的基因特异性引物进行PCR扩增和序列测序，对T0代转基因植株进行基因型鉴定；

(5)对发生基因编辑的突变体在T1代进行种植，利用引物对T1代植株中的HPT和Cas9转基因进行PCR扩增检测，获得纯合的BnaNCBP基因编辑突变体植株。

5.根据权利要求4所述的改良油菜花期性状的方法，其特征在于，所述步骤(5)中，用于HPT和Cas9转基因扩增的引物序列分别为：

HPT-F：5'-ACACTACATGGCGTGATTTCAT-3'；

HPT-R：5'-TCCACTATCGGCGAGTACTTCT-3'；

Cas9-F：5'-GGCCTCGATATTGGGACTAACT-3'；

Cas9-R：5'-GTCCGCCTTATCTGTGGAGT-3'。

6.一种如权利要求1所述的油菜RNA加工因子NCBP基因的获得方法，其特征在于，以NCBP基因的核苷酸序列为模板设计特异性扩增引物，以野生型Westar油菜品种为材料，提取RNA并反转录成cDNA，通过PCR扩增技术获得油菜NCBP基因。

7.根据权利要求6所述的一种油菜RNA加工因子NCBP基因的获得方法，其特征在于，所述PCR扩增的特异性扩增引物为：

BnaNCBP.A10-F：5'-GGATCCATGGAGATTACGGAGAGGAGGC-3’；

BnaNCBP.A10-R：5'-GTCGACTCCTCTCAGCCAAGTGTTCC-3’。