CN115925985B

CN115925985B - Car-t细胞及其在非小细胞肺癌治疗中的应用

Info

Publication number: CN115925985B
Application number: CN202211031559.1A
Authority: CN
Inventors: 钟晓松; 仝帅
Original assignee: Carrizi Beijing Life Technology Co ltd
Current assignee: Beijing Yiguantang Biotechnology Co ltd
Priority date: 2022-08-26
Filing date: 2022-08-26
Publication date: 2023-10-31
Anticipated expiration: 2042-08-26
Also published as: CN115925985A; WO2024040681A1

Abstract

本发明涉及靶向uPAR的三代嵌合抗原受体、经工程化以表达本发明的嵌合抗原受体的免疫效应细胞(例如，T细胞、NK细胞)、以及所述经工程化的免疫效应细胞在治疗uPAR阳性非小细胞肺癌(NSCLC)中的用途。

Description

CAR-T细胞及其在非小细胞肺癌治疗中的应用

技术领域

本发明总体上涉及靶向uPAR的三代嵌合抗原受体、经工程化以表达本发明的嵌合抗原受体的免疫效应细胞(例如，T细胞、NK细胞)、以及所述经工程化的免疫效应细胞在治疗uPAR阳性非小细胞肺癌(NSCLC)中的用途。

背景技术

尿激酶型纤溶酶原激活物受体(uPAR，又称尿激酶受体或CD-87)，于1985年被发现，是一种富含半胱氨酸的糖基化单链蛋白，相对分子量为50kD-60kD[Casey,J.R.,etal.,The structure of the urokinase-type plasminogen activator receptorgene.Blood,1994.84(4):p.1151-6]。uPAR的编码基因PLAUR，编码由335个氨基酸组成的蛋白质，其N端包含22个氨基酸的分泌信号肽，而C端的30个氨基酸通过糖基磷脂酰肌醇(GPI)锚与细胞膜结合[Lv,T.,et al.,uPAR:An Essential Factor for Tumor Development.JCancer,2021.12(23):p.7026-7040；和Blasi,F.and N.Sidenius,The urokinasereceptor:focused cell surface proteolysis,cell adhesion and signaling.FEBSLett,2010.584(9):p.1923-30]。uPAR由三个长度为81至87个氨基酸的结构域，即D1、D2和D3结构域，通过短接头连接而成[De Lorenzi,V.,et al.,Urokinase links plasminogenactivation and cell adhesion by cleavage of the RGD motif in vitronectin.EMBORep,2016.17(7):p.982-98]。D1区与尿激酶型纤溶酶原激活物(uPA)结合。与D1和D2区连接的D3区，通过GPI，将uPAR锚定在细胞膜表面。

作为一种多功能蛋白，uPAR被认为在调节多种生理和病理状况方面具有关键作用，例如伤口愈合、炎症过程中的中性粒细胞募集、肿瘤侵袭和肿瘤转移[Ploug,M.,Structure-function relationships in the interaction between the urokinase-type plasminogen activator and its receptor.Curr Pharm Des,2003.9(19):p.1499-528]。大多数正常组织几乎没有或没有可检测到的uPAR表达。但已经发现，uPAR在多种肿瘤细胞系和组织(包括结肠、乳腺、卵巢等)中表达，并且已经在从结肠癌和乳腺癌患者获得的肿瘤样本中证实，uPAR水平与肿瘤转移潜能和疾病晚期潜在相关。uPAR在肿瘤组织中的表达水平增加以及其在正常、静息组织中的相对表达缺失，和uPAR在血管生成调节和肿瘤进展中的作用，提示uPAR是癌症治疗的一个潜在靶点[Pillay,V.,C.R.Dass,andP.F.Choong,The urokinase plasminogen activator receptor as a gene therapytarget for cancer.Trends Biotechnol,2007.25(1):p.33-9]。

嵌合抗原受体(Chimeric antigen receptor，CAR)是一种人工合成的分子，其通过特异性识别肿瘤细胞表面表达的抗原，来引导经基因工程化以表达CAR的免疫效应细胞(例如，T细胞、NK细胞)清除肿瘤(Sampson JH,Choi BD,Sanchez-Perez L等人,EGFRvIIImCAR-modified T-cell therapy cures mice with establishedintracerebralglioma and generates host immunity against tumor-antigenloss.Clinical cancer research:an official journal of the American Associationfor Cancer Research.2014；20(4):972-984)。

最近，Amor等[Amor,C.,et al.,Senolytic CAR T cells reverse senescence-associated pathologies.Nature,2020.583(7814):p.127-132]在对衰老模型的研究中提出，将靶向uPAR的二代CAR分子用作抗衰老药物，以清除体内因多种因素引起的衰老细胞。研究显示，在施用衰老诱导剂后，二代uPAR CAR T细胞表现出了对经诱导而出现老化标志物的肺癌肿瘤细胞的一定清除作用。然而，Amor等的研究也显示，该衰老诱导剂与二代CAR分子的组合在荷瘤小鼠模型中的体内应用，对动物总体生存期的延长作用十分有限，相对于对照小鼠30天死亡，接受uPAR CAR T细胞的小鼠在40天以内也均死亡。此外，衰老诱导剂的应用剂量，及其可能对正常人体细胞的生理过程的干扰，也为该组合策略在临床癌症治疗上的应用，提出了安全性和有效性方面的诸多问题。

据目前最新的研究，肺癌仍是全世界癌症相关死亡的最常见原因。超过200万人被诊断患有肺癌，每年有176万人死于这种疾病[Thai,A.A.,et al.,Lung cancer.Lancet,2021.398(10299):p.535-554]。肺癌的5年生存率因分期和地区差异而从4％到17％不等，而且这种疾病仍然不能通过手术等常规治疗得到很好的治疗[Hirsch,F.R.,et al.,Lungcancer:current therapies and new targeted treatments.Lancet,2017.389(10066):p.299-311]。因此，本领域持续需要开发新的肺癌治疗方法以改善患者的结局和预后。

发明概述

在深入的研究中，本发明人发现，uPAR在部分的非小细胞肺癌(NSCLC)患者的癌组织中呈现为显著的阳性表达，并且发现uPAR的高表达水平与NSCLC患者的存活率低相关。在此基础上，本发明人构建了uPAR靶向性三代CAR分子；通过检测转导了该CAR分子的T细胞单独在体外对uPAR阳性NSCLC癌细胞的选择性细胞毒性、以及在皮下、转移性、浸润前NSCLC肺癌动物模型和PDX模型中的抗肿瘤作用，确认了本发明三代CAR分子的治疗效用。进一步，本发明人应用高通量RNA测序，揭示了本发明uPAR CAR-T细胞在NSCLC肺癌治疗中的分子机制，并获得了可用于预测CAR-T细胞治疗效率的一系列基因表达模式；进而提出了该三代CAR-T细胞与PD-1阻断剂的联合疗法，并在NSCLC的PDX模型中确认了疗效的提升。基于这些研究，本发明人由此建立本发明。

因此，在第一方面，本发明提供了靶向uPAR的第三代嵌合抗原受体(CAR)多肽,所述嵌合抗原受体多肽，从N端到C端，包含：

(i)特异性结合uPAR的胞外抗原结合结构域；

(ii)任选地，铰链区/间隔区；

(iii)跨膜结构域；

(iv)CD28共刺激结构域和4-1BB共刺激结构域的组合；和

(v)CD3ζ信号传导结构域,

优选地，所述uPAR胞外抗原结合结构域由SEQ ID NO:1的优化核苷酸序列或与其具有至少95％、96％、97％、98％、99％或99.5％同一性的核苷酸序列编码。

在一些实施方案中，所述特异性结合uPAR的胞外抗原结合结构域为抗体或抗体片段，尤其是scFv，

优选地，所述抗原结合结构域包含：SEQ ID NO:3的VL氨基酸序列中的LCDR1-3和SEQ ID NO:4的VH氨基酸序列中的HCDR1-3(尤其是Kabat定义的CDR序列，或SEQ ID NOs:13-18中所示的LCDR1-3和HCDR1-3序列)，再优选地，包含SEQ ID NO:3或其具有至少90％、92％、95％、96％、97％、98％、99％或以上的同一性的氨基酸序列的VL和/或包含SEQ IDNO:4或其具有至少90％、92％、95％、96％、97％、98％、99％或以上的同一性的氨基酸序列的VH，更优选地，包含SEQ ID NO:3的VL和SEQ ID NO:4的VH，再优选地，所述抗原结合结构域为包含SEQ ID NO:2或与其具有至少90％、92％、95％、96％、97％、98％、99％或以上的同一性的氨基酸序列的抗uPAR scFv。

在一些实施方案中，所述嵌合抗原受体多肽还包含位于胞外抗原结合结构域和跨膜结构域之间的铰链区或间隔区。在一些实施方案中，所述铰链区/间隔区选自：来自IgG的铰链区或来自CD8α或CD28胞外区的间隔区，且优选是人CD8α间隔区或CD28间隔区。在另一些实施方案中，所述铰链区/间隔区包含SEQ ID NO:6的氨基酸序列、或与其具有至少90％、92％、95％、96％、97％、98％、99％或以上的同一性的氨基酸序列、或与其相差不超过1-5个氨基酸残基修饰(例如，取代、插入和/或缺失)的氨基酸序列。

在一些实施方案中，所述跨膜结构域选自：CD4,CD8，CD28和CD3ζ的跨膜结构域，且优选是人CD8跨膜结构域或CD28跨膜结构域。在另一些实施方案中，所述跨膜结构域包含SEQ ID NO:7或22的氨基酸序列、或与其具有至少90％、92％、95％、96％、97％、98％、99％或以上的同一性的氨基酸序列，或与其相差不超过1-5个氨基酸残基修饰(例如，取代、插入和/或缺失)的氨基酸序列。

在一些实施方案中，所述CD28共刺激结构域包含SEQ ID NO:11所示氨基酸序列、或与其具有至少90％、92％、95％、96％、97％、98％、99％或以上的同一性的氨基酸序列，或与其相差不超过1-5个氨基酸残基修饰(例如，取代、插入和/或缺失)的氨基酸序列。

在一些实施方案中，所述4-1BB共刺激结构域包含SEQ ID NO:10所示氨基酸序列、或与其具有至少90％、92％、95％、96％、97％、98％、99％或以上的同一性的氨基酸序列，或与其相差不超过1-5个氨基酸残基修饰(例如，取代、插入和/或缺失)的氨基酸序列。

在一些实施方案中，所述CD3ζ信号传导结构域包含SEQ ID NO:12所示氨基酸序列、或与其具有至少90％、92％、95％、96％、97％、98％、99％或以上的同一性的氨基酸序列，或与其相差不超过1-5个氨基酸残基修饰(例如，取代、插入和/或缺失)的氨基酸序列。

在一些实施方案中，所述CAR多肽，从N端到C端，包含：

(a)SEQ ID NO:2所示的抗uPAR scFv；

(b)SEQ ID NO:6所示的CD28间隔区和SEQ ID NO:7的CD28跨膜结构域；

(c)SEQ ID NO:11所示的CD28共刺激结构域和SEQ ID NO:10所示的4-1BB共刺激结构域的组合；和

(iv)SEQ ID NO:12所示的CD3ζ信号传导结构域，

优选地，所述CAR多肽包含SEQ ID NO:21或与其具有至少90％、92％、95％、96％、97％、98％、99％或以上的同一性的氨基酸序列。

在第二方面，本发明提供了编码本文所述嵌合抗原受体多肽的核酸分子、包含编码本文所述CAR多肽的核酸的载体、和包含本文所述CAR核酸分子或载体的细胞、或表达本文所述CAR多肽的细胞，优选地，所述细胞是自体T细胞或同种异体T细胞。

在一个实施方案中，本发明采用人PBMC制备了原代CAR-T细胞。用本发明的CAR分子转导的CAR-T细胞具有体外效应功能，在体外具有持续杀伤靶细胞的活性。在再一实施方案中，用本发明的CAR分子转导的CAR-T细胞还具有体内杀伤肿瘤细胞的功能，在具有皮下、浸润前、和/或转移性NSCLC肺癌的动物个体中，表现出显著的抗肿瘤活性。

在第三方面，本发明提供了一种产生细胞、例如免疫效应细胞的方法，所述方法包括将编码本文所述CAR多肽的核酸分子(例如，RNA分子，例如mRNA分子)，或包含编码本文所述CAR多肽的核酸分子的载体引入(例如转导)免疫效应细胞。

在一些实施方案中，所述免疫效应细胞是T细胞、NK细胞，例如，所述T细胞是自体T细胞或同种异体T细胞，例如，所述免疫效应细胞是自人PBMC分离T细胞、NK细胞后制备的。

在一些实施方案中，用逆转录病毒将编码本发明CAR分子的核酸导入原代T细胞中，获得了本发明的CAR-T细胞。

在一些实施方案中，本发明的CAR-T细胞在接触靶肿瘤细胞后，表现出与抗肿瘤活性相关的差异表达基因。在一些实施方案中，与如下BP,MF和CC相关的基因在所述CAR-T细胞接触靶肿瘤后表达上调：细胞对干扰素-γ的反应、免疫反应、炎症反应、以及肿瘤坏死因子激活受体活性。在另一些实施方案中，与以下BP,MF和CC相关的基因在所述CAR-T细胞接触靶肿瘤后表达下调：基因表达调控、DNA复制、有丝分裂细胞周期G1/S转换、蛋白结合和纺锤体极(spindle pole)。在一些实施方案中，可以通过监测所述的基因表达上调和/或所述的基因表达下调，预测接受CAR-T细胞治疗的患者的治疗反应。在一些实施方案中，监测选自以下的基因的表达上调：IL2、IL9、IFN-γ、TNFRSF9和IL17A基因以及趋化因子基因如CXCL1、CXCL5和CXCL8，以指示患者的治疗反应。在另一些实施方案中，监测选择以下的基因的表达上调：PD-1,PD-L2和/或Lag-3，以指示患者的复发可能性。

在第四方面，本发明提供了包含药学上可接受的载体以及本文所述的嵌合抗原受体多肽、本文所述的CAR编码核酸分子、本文所述的免疫效应细胞、或本文所述的CAR-T细胞的药物组合物。在一些优选的实施方案中，所述药物组合物还包括PD-1抑制剂或PD-L1抑制剂，优选抗PD-1抗体，优选地，所述药物组合物以药物组合的形式提供，其中，本文所述CAR-T细胞和PD-L1抑制剂以利于分开、相继和/或同时给药的方式，包含在分开的制剂中。

在第五方面，本发明提供了工程化免疫效应细胞在制备用于在有需要的个体中治疗uPAR阳性非小细胞肺癌(NSCLC)的药物中的用途以及利用所述工程化免疫效应细胞治疗uPAR阳性非小细胞肺癌(NSCLC)的方法，其中所述工程化免疫效应细胞包含本文所述的靶向uPAR的嵌合抗原受体多肽。

在一些实施方案中，所述免疫效应细胞是T细胞，例如，自体T细胞或同种异体T细胞。

在一些实施方案中，所述NSCLC是大细胞肺癌、腺癌或鳞状细胞癌。

在一些实施方案中，所述个体具有浸润前NSCLC肺癌或者原位NSCLC肺癌。在另一些实施方案中，所述个体具有转移性NSCLC癌，例如NSCLC的脑转移。

在一些实施方案中，所述非小细胞肺癌为I期、II期、III期、或IV期肺癌。

在一些实施方案中，所述个体是亚洲人，例如中国人。

在一些实施方案中，所述个体为30岁以上的成年个体，或者60岁以上的老年个体。

在一些实施方案中，所述方法和用途还包括，在施用所述CAR-T细胞前，通过诸如免疫组织化学染色，在来自个体的肿瘤样品(例如肿瘤活检物)上，确定其中的uPAR阳性表达细胞的百分比(即，肿瘤的uPAR阳性率)。在一个实施方案中，优选地，通过免疫组织化学染色确定，肿瘤样本中大约25-80％或以上的细胞在细胞表面呈现uPAR阳性表达。

在一些实施方案中，所述方法和用途包括，向所述个体施用一剂或多剂本文所述的CAR-T细胞，例如，所述剂量可以连续给药或间隔给药。在一些优选的实施方案中，本文所述的治疗方法和用途还包括，向所述个体施用免疫检测点抑制剂，例如PD-1或PD-L1抑制剂或LAG-3抑制剂，例如，在所述CAR-T细胞施用之前、期间和/或之后，施用一剂或多剂所述抑制剂，尤其是PD-1抑制剂，例如抗PD-1抗体。

附图简述

结合以下附图一起阅读时，将更好地理解以下详细描述的本发明的优选实施方案。出于说明本发明的目的，图中显示了目前优选的实施方案。然而，应当理解本发明不限于图中所示实施方案的精确安排和手段。

图1显示：肿瘤中uPAR表达相对较高的肺癌患者存活率显著较低(p<0.001，Log-Rank检验)。

图2显示：免疫组化检测肺癌肿瘤中的uPAR水平，其中：(a)4例阳性，(b)8例阴性。显示了代表性免疫组化染色切片的100倍放大图及其局部区域的200倍放大图。

图3显示：靶向uPAR的嵌合抗原受体(CAR)示意图，其由uPAR scFv、来自CD28的铰链区和跨膜(TM)区、来自CD28和4-1BB的共刺激结构域、以及来自CD3ζ的信号传导结构域组成。其中，SD表示剪接供体位点；SA表示剪接受体位点；LTR表示长末端重复序列。

图4显示：在用编码CAR的逆转录病毒载体转导T细胞后，通过流式细胞术，对阳性CAR T细胞进行定量。其中，GAM表示山羊抗小鼠IgG(Fab特异性)F(ab')2片段-FITC抗体(GAM，Sigma)染色。

图5显示：uPAR CAR-T对uPAR阳性肿瘤细胞的体外活性。(a)用APC标记的单克隆抗体对癌细胞表面表达的uPAR进行染色。人肺癌细胞系H460具有95.4％的uPAR阳性率；在转基因过表达uPAR的人肺癌细胞系A549中，uPAR阳性率为83.5％。(b)将CFSE标记的CAR-T细胞与uPAR阳性肿瘤细胞以2:1的E:T比共培养12天。每三天用新鲜的肿瘤细胞刺激T细胞一次，并且每次在加入肿瘤细胞之前对T细胞进行计数，以确定T细胞扩增倍数。(c)在CAR-T细胞与uPAR阳性肿瘤细胞共培养6小时(E：T＝10：1)后，通过流式细胞术测定，检测CAR-T细胞上的CD107a水平。(d)在CAR-T细胞与uPAR阳性肿瘤细胞共培养24小时(E:T＝10:1)后，收集上清液，通过ELISA评估IFN-γ水平。图5(b)和(d)的结果通过student t检验进行分析，p<0.05视为显著。*表示p<0.05，**表示p<0.01，***表示p<0.001。

图6显示：uPAR CAR-T对uPAR阳性肿瘤细胞的体外活性。(a)在体外杀伤试验中，将NGFR CAR-T细胞或uPAR CAR-T细胞，与表达荧光素酶的不同靶细胞(H460和uPAR⁺A549)，在不同的E:T比(1:1、2.5:1、5:1和10:1)下共培养24小时，使用IVIS成像系统，检测肿瘤细胞的裂解率。(b)在基于阻抗的肿瘤细胞杀伤试验中，共培养肿瘤细胞与T细胞，使用xCELLigence阻抗系统，自该共培养开始时间起，监测直至12小时时间点的细胞指数值的连续图形输出。

图7显示：体内肿瘤模型。(a)将2x 10⁶个eGFP-Luc-H460细胞(荧光素酶和eGFP标记的H460肿瘤细胞)皮下注射到6-8周龄的雌性NOD-SCID小鼠的左腋下。三天后，连续三天将2x 10⁷uPAR CAR-T细胞直接注射到肿瘤中来处理荷瘤小鼠，并用未转导的T细胞(NT)作为对照。(b)小鼠肿瘤负荷荧光图。使用uPAR CAR-T治疗的小鼠，相对于对照小鼠，表现出明显的生存期延长，部分小鼠存活超过84天。(c)应用IVIS成像系统获取所有小鼠的定量生物发光成像数据(即，单位时间、单位面积、单位弧度从动物体表发出的绝对光子数(photons/sec/cm²/sr))。该数值越高指示肿瘤负荷越大。(d)使用Kaplan-Meier方法，测量肺癌异种移植物荷瘤小鼠的总体存活率，并使用Cox比例风险回归分析进行组间比较。p值小于0.05视为显著。

图8显示：自uPAR CAR T细胞治疗后肿瘤复发的肺异种移植物小鼠模型，分离肿瘤细胞，并在体外与uPAR CAR-T细胞共培养，以确认CAR-T细胞的抗肿瘤活性。“对照小鼠细胞”表示：肿瘤细胞分离于未经CAR-T治疗组小鼠；“复发小鼠细胞”表示：肿瘤细胞分离于经CAR-T治疗组小鼠。NT表示未转导的T细胞。(a)以E:T＝10:1共培养24小时后,通过ELISA检测培养物上清液中IFN-γ水平。**表示p<0.01。(b)以E:T＝10:1共培养6小时后,流式检测uPAR CAR T细胞上CD107a表达水平。(c)在体外杀伤试验中，uPAR CAR-T细胞与不同靶肿瘤细胞共培养24小时(E:T＝1:1、2.5:1、5:1和10:1)后，检测肿瘤细胞的裂解率。

图9显示：体内肿瘤模型。(a)将2x 10⁶个eGFP-Luc-H460细胞(荧光素酶和eGFP标记的H460肿瘤细胞)经胸膜注射原位植入6-8周龄的雌性NOD-SCID小鼠肺实质中。三天后，连续三天将2x 10⁷uPAR CAR-T细胞腹膜内(i.p.)注射到肿瘤中来处理荷瘤小鼠，并用未转导的T细胞(NT)作为对照。(b)小鼠肿瘤负荷荧光图。使用uPAR CAR-T治疗的小鼠，相对于对照小鼠，表现出明显的生存期延长。(c)应用IVIS成像系统获取所有小鼠的定量生物发光成像数据(即，单位时间、单位面积、单位弧度从动物体表发出的绝对光子数(p/sec/cm²/sr))。该数值越高指示肿瘤负荷越大。(d)使用Kaplan-Meier方法，测量肺癌原位异种移植物荷瘤小鼠的总体存活率，并使用Cox比例风险回归分析进行组间比较。p值小于0.05视为显著。

图10显示：自uPAR CAR T细胞治疗后肿瘤复发的原位异种移植物小鼠模型，分离肿瘤细胞，并在体外与uPAR CAR-T细胞共培养，以确认CAR-T细胞的抗肿瘤活性。“对照小鼠细胞”表示：肿瘤细胞分离于未经CAR-T治疗组小鼠；“复发小鼠细胞”表示：肿瘤细胞分离于经CAR-T治疗组小鼠。NT表示未转导的T细胞。(a)以E:T＝10:1共培养24小时后,通过ELISA检测培养物上清液中IFN-γ水平。***表示p<0.001。(b)以E:T＝10:1共培养6小时后,流式检测uPAR CAR T细胞上CD107a表达水平。(c)在体外杀伤试验中，uPAR CAR-T细胞与不同靶肿瘤细胞共培养24小时(E:T＝1:1、2.5:1、5:1和10:1)后，检测肿瘤细胞的裂解率。

图11显示：体内肿瘤模型。(a)将2x 10⁵个eGFP-Luc-H460细胞(荧光素酶和eGFP标记的H460肿瘤细胞)植入6-8周龄的雌性NOD-SCID小鼠颅内。三天后，连续三天向荷瘤小鼠静脉(i.v.)注射2x 10⁷uPAR CAR-T细胞，并用未转导的T细胞(NT)作为对照。(b)小鼠肿瘤负荷荧光图。使用uPAR CAR-T治疗的小鼠，相对于对照小鼠，表现出明显的生存期延长。(c)应用IVIS成像系统获取所有小鼠的定量生物发光成像数据(即，单位时间、单位面积、单位弧度从动物体表发出的绝对光子数(p/sec/cm²/sr))。该数值越高指示肿瘤负荷越大。(d)使用Kaplan-Meier方法，测量肺癌颅内异种移植物荷瘤小鼠的总体存活率，并使用Cox比例风险回归分析进行组间比较。p值小于0.05视为显著。

图12显示：自uPAR CAR T细胞治疗后肿瘤复发的颅内异种移植物小鼠模型，分离肿瘤细胞，并在体外与uPAR CAR-T细胞共培养，以确认CAR-T细胞的抗肿瘤活性。“对照小鼠细胞”表示：肿瘤细胞分离于未经CAR-T治疗组小鼠；“复发小鼠细胞”表示：肿瘤细胞分离于经CAR-T治疗组小鼠。NT表示未转导的T细胞。(a)以E:T＝10:1共培养24小时后,通过ELISA检测培养物上清液中IFN-γ水平。**表示p<0.01。(b)以E:T＝10:1共培养6小时后,流式检测uPAR CAR T细胞上CD107a表达水平。(c)在体外杀伤试验中，uPAR CAR-T细胞与不同靶细胞共培养24小时(E:T＝1:1、2.5:1、5:1和10:1)后，检测肿瘤细胞的裂解率。

图13显示：uPAR CAR-T细胞与肿瘤细胞共培养后差异表达基因的基因本体富集分析(Gene Ontology Enrichment Analysis)。差异表达基因(DEG)(即，共培养前后表达水平的倍数变化(FC)>2且调整后的p值<0.05的基因)的火山图。横轴表示倍数变化，纵轴表示调整后的p值。

图14显示：使用在线生物信息学工具：DAVID Bioinformatics Resources 6.8，对共培养前的CAR-T细胞和共培养后的CAR-T细胞之间的差异表达基因，进行GO分析。Fisher精确检验用于该基因富集分析。BP表示：生物学过程；CC表示：细胞成分；MF表示：分子功能。

图15显示：(a)对共培养前后的CAR-T细胞之间的差异表达基因，进行PPI分析。相对于共培养前的CAR-T细胞，在共培养后的CAR-T细胞中上调的基因的蛋白-蛋白相互作用图。(b)相对于未经共培养的CAR-T细胞，共培养30分钟的CAR-T细胞的差异表达基因的火山图。(c)共培养30分钟的CAR-T细胞和共培养4小时的CAR-T细胞比较，在两者中均上调的基因有133个，在两者中均下调的基因有22个。

图16显示：与肿瘤细胞共培养后，CAR-T细胞中上调的基因表达。(a)H460细胞与CAR-T细胞以2:1的E:T比共培养30分钟和4小时。然后对CAR-T细胞进行RT-qPCR以确定IL2、IL9、IFN-γ、TNFRSF9和IL17A水平。(b)H460细胞与CAR-T细胞以2:1的E:T比共培养30分钟和4小时。然后对CAR-T细胞进行RT-qPCR以确定CXCL1、CXCL5和CXCL8水平。

图17显示：与肿瘤细胞共培养后，CAR-T细胞中上调的基因表达。(a)H460细胞与CAR-T细胞以2:1的E:T比共培养30分钟和4小时。NT表示未转导的T细胞。然后对CAR-T细胞进行RT-qPCR以确定PD-1和PDCD1LG2水平；并对H460细胞进行PD-L1水平测定。(b)uPARCAR-T细胞与H460细胞和uPAR+A549细胞以E:T＝10:1共培养48小时后，流式检测CAR-T细胞的PD-1、Lag-3和Tim-3表达水平。

图18显示：PD-1/PD-L1抑制uPAR CAR-T细胞的抗肿瘤活性。(a)和(b)用siRNA瞬时转染H460细胞以降低PD-L1的表达。H460-si-PD-L1-NC表示：用对照siRNA处理PD-L1的H460细胞；H460-si-PD-L1-#1和#2分别表示：用两种针对PD-L1的不同序列的siRNA处理的H460细胞。(a)通过PCR检测，在siRNA敲低处理后，细胞具有显著降低的PD-L1 mRNA表达水平。(b)通过流式检测，在siRNA敲低处理后，肿瘤细胞的细胞表面PD-L1表达下降。(c)以E:T＝10:1,共培养uPAR CAR-T细胞与敲低和未敲低PD-L1的肿瘤细胞，并检测分泌的IFN-γ水平。(d)以E:T＝2.5:1，共培养uPAR CAR-T细胞与敲低和未敲低PD-L1的肿瘤细胞，进行体外杀伤试验。通过检测荧光素酶活性来确定肿瘤细胞的裂解率。结果进行了单因素方差分析，统计显著性设定为p<0.05。*p<0.05，**P<0.01，***p<0.001。(e)以E:T＝10:1,共培养uPARCAR-T细胞与敲低和未敲低PD-L1的肿瘤细胞24小时后，检测CAR-T细胞的CD107a表达水平。

图19显示：PD-1抗体联合CAR-T细胞治疗显著抑制了肺癌PDX模型中的肿瘤生长。结果显示，经CAR-T治疗后的小鼠皮下肿瘤组织相对于未经治疗组明显减小，并且CAR-T细胞结合PD-1抗体治疗组小鼠皮下肿瘤组织相对于单纯CAR-T治疗组明显减小。(a)体内肺癌PDX模型生成示意图。(b)和(c)测量肿瘤体积：断颈猝死小鼠后取瘤组织于游标卡尺进行测量，体积计算公式为：长度x宽度x宽度/2。(d)测量肿瘤重量：断颈猝死小鼠后取瘤组织于万分之一分析天平进行肿瘤重量测量。*表示：p<0.05；**表示：p<0.01；***表示：p<0.005。

发明详述

除非另外限定，否则本文中所用的全部技术与科学术语具有如本发明所属领域的普通技术人员通常理解的相同含义。本文所提及的全部出版物、专利申请、专利和其他参考文献通过引用的方式完整地并入。此外，本文中所述的材料、方法和例子仅是说明性的并且不意在是限制性的。本发明的其他特征、目的和优点将从本说明书及附图并且从后附的权利要求书中显而易见。

定义

为了解释本说明书，将使用以下定义，并且只要适当，以单数形式使用的术语也可以包括复数，并且反之亦然。要理解，本文所用的术语仅是为了描述具体的实施方案，并且不意欲是限制性的。

术语“约”在与数字数值联合使用时意为涵盖具有比指定数字数值小5％的下限和比指定数字数值大5％的上限的范围内的数字数值。

如本文所用，术语“和/或”意指可选项中的任一项或可选项的两项或多项。

在本文中，当使用术语“包含”或“包括”时，除非另有指明，否则也涵盖由所述及的要素、整数或步骤组成的情形。例如，当提及“包含”某个具体序列的抗体可变区时，也旨在涵盖由该具体序列组成的抗体可变区。

术语“嵌合受体”、“嵌合抗原受体”或“CAR”在本文中可互换使用，是指至少包含胞外抗原结合结构域、跨膜结构域及胞内信号结构域的重组多肽。

术语“刺激分子”指由T细胞表达的提供初级胞质信号传导序列的分子，所述的初级胞质信号传导序列在T细胞信号传导途径的至少某个方面以刺激性方式调节TCR复合体的初级活化。在一个实施方案中，初级信号例如通过TCR/CD3复合体与载有肽的MHC分子的结合引发并且导致介导T细胞反应，包括但不限于增殖、活化、分化等。在本发明的具体CAR中，本发明的任一种或多种CAR中的胞内信号结构域包含胞内信号传导序列，例如，CD3ζ的初级信号传导序列。

术语“CD3ζ”定义为GenBan登录号BAG36664.1提供的蛋白质或其等同物，并且“CD3ζ信号传导序列”定义为来自CD3ζ链胞质结构域的氨基酸残基，所述氨基酸残基足以在功能上传播T细胞活化必需的初级信号。在一个实施方案中，CD3ζ的胞质结构域包含GenBank登录号BAG36664.1的残基52至残基164或作为其功能直向同源物的来自非人类物种(例如，小鼠、啮齿类、猴、猿等)的等同残基。在一个实施方案中，“CD3ζ信号传导序列”是在SEQ IDNO:12中提供的序列或其变体。

术语“共刺激分子”是指，T细胞上特异性地与共刺激配体结合并由此介导T细胞的共刺激应答(例如，但不限于，T细胞增殖)的关连结合配偶体。共刺激分子是除了有效免疫应答需要的抗原受体或其配体以外的其他细胞表面分子。共刺激分子包括但不限于MHC I类分子、TNF受体蛋白、免疫球蛋白样蛋白、细胞因子受体、整联蛋白、信号传导淋巴细胞活化分子(SLAM蛋白)、激活NK细胞受体、OX40、CD40、GITR、4-1BB(即CD137)、CD27和CD28。在一些实施方案中，“共刺激分子”是CD28、4-1BB(即CD137)。在本文中，“共刺激结构域”是指共刺激分子的胞内部分。

术语“4-1BB”指TNFR超家族成员，所述成员具有作为GenBank登录号AAA62478.2提供的氨基酸序列或来自非人类物种(例如，小鼠、啮齿类、猴、猿等)的等同残基；并且“4-1BB共刺激信号结构域”定义为GenBank登录号AAA62478.2的氨基酸残基214-255或来自非人类物种(例如，小鼠、啮齿类、猴、猿等)的等同残基。在一个实施方案中，“4-1BB共刺激结构域”是作为SEQ ID NO:10提供的序列或来自非人类物种(例如，小鼠、啮齿类、猴、猿等)的等同残基。

术语“CD28”是指在UniProtKB-P10747登录号下提供的氨基酸序列或来自非人类物种(例如，小鼠、啮齿类、猴、猿等)的等同残基。在本文中，术语“CD28共刺激结构域”定义为来自CD28的胞质区，例如，UniProtKB-P10747的氨基酸残基180-220或来自非人类物种(例如，小鼠、啮齿类、猴、猿等)的等同残基。在一个实施方案中，“CD28共刺激结构域”是作为SEQ ID NO:11提供的序列或来自非人类物种(例如，小鼠、啮齿类、猴、猿等)的等同残基。在本文中，术语“CD28跨膜结构域”定义为来自CD28的跨膜区，例如，UniProtKB-P10747的氨基酸残基153-179或来自非人类物种(例如，小鼠、啮齿类、猴、猿等)的等同残基。在一个实施方案中，“CD28跨膜结构域”是作为SEQ ID NO:7提供的序列或来自非人类物种(例如，小鼠、啮齿类、猴、猿等)的等同残基。在本文中，术语“CD28铰链结构域”，与术语“CD28间隔区”可互换使用，定义为来自CD28胞外区的铰链结构域，例如UniProtKB–P10747的氨基酸残基114-152或来自非人类物种(例如，小鼠、啮齿类、猴、猿等)的等同残基。在一个实施方案中，“CD28间隔区”是作为SEQ ID NO:6提供的序列或来自非人类物种(例如，小鼠、啮齿类、猴、猿等)的等同残基。

术语“氨基酸变化”和“氨基酸修饰”可互换地使用，是指氨基酸的添加、缺失、取代和其他修饰。可以进行氨基酸的添加、缺失、取代和其他修饰的任意组合，条件是最终的多肽序列具有所需的特性。在一些实施方案中，氨基酸的取代是非保守氨基酸取代，即用具有不同结构和/或化学性质的另一种氨基酸取代一种氨基酸。氨基酸取代包括用非天然存在的氨基酸或二十种标准氨基酸的天然存在的氨基酸衍生物(例如、4-羟基脯氨酸、3-甲基组氨酸、鸟氨酸、高丝氨酸、5-羟基赖氨酸)的取代。

术语“保守序列修饰”、“保守序列变化”指未显著影响或改变含有氨基酸序列的亲本多肽或其组成元件的特征的氨基酸修饰或变化。这类保守修饰包括氨基酸取代、添加和缺失。可以通过本领域已知的标准技术，如位点定向诱变和PCR介导的诱变向本发明的CAR融合多肽或其组成元件(例如CAR或Survivin)中引入保守修饰，尤其是保守性取代。保守性取代是氨基酸残基由具有相似侧链的氨基酸残基替换的氨基酸取代。已经在本领域中定义了具有相似侧链的氨基酸残基的家族。这些家族包括具有碱性侧链(例如，赖氨酸、精氨酸、组氨酸)、酸性侧链(例如，天冬氨酸、谷氨酸)、不带电荷极性侧链(例如，甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、半胱氨酸、色氨酸)、非极性侧链(例如，丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、蛋氨酸)、β-侧链(例如，苏氨酸、缬氨酸、异亮氨酸)和芳族侧链(例如，酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、组氨酸)的氨基酸。

氨基酸序列/核苷酸序列的“同一性百分数(％)”是指，将候选序列与本说明书中所示的具体氨基酸/核苷酸序列进行比对并且如有必要的话为达到最大序列同一性百分数而引入空位后，且在氨基酸序列的情况下，不考虑任何保守置换作为序列同一性的一部分时，候选序列中与本说明书中所示的具体氨基酸/核苷酸序列的氨基酸残基/核苷酸残基相同的氨基酸/核苷酸残基百分数。在一些实施方案中，本发明考虑本发明融合多肽或核酸分子或其组成元件的变体，所述变体相对于在本文中具体公开的融合多肽或核酸分子或其组成元件(例如CAR多肽/编码核酸，或Survivin蛋白/编码核酸)的序列而言具有相当程度的同一性，例如同一性为至少80％,85％,90％,95％,97％,98％或99％或更高。所述变体可以包含保守性修饰。根据本发明的目的，同一性百分数应用https:// blast.ncbi.nlm.nih.gov上公众可得的BLAST工具，采用默认参数进行确定。

在本文中，表述“变体”或“功能性变体”多肽或蛋白是指，所述的多肽或蛋白，与参照多肽或蛋白相比，具有实质上相同的序列或显著的序列同一性、并保持参照多肽或蛋白的期望生物学活性。

在本文中当谈及核酸时使用的术语“载体(vector)”是指能够增殖与其相连的另一个核酸的核酸分子。该术语包括作为自我复制核酸结构的载体以及结合到已经引入其的宿主细胞的基因组中的载体。一些载体能够指导与其有效相连的核酸的表达。这样的载体在本文中被称为“表达载体”。

术语“慢病毒”指逆转录病毒科(Retroviridae)的一个属。慢病毒在逆转录病毒当中的独特之处在于能够感染非分裂性细胞；它们可以递送显著量的遗传信息至宿主细胞，从而它们是基因递送载体的最高效方法之一。HIV、SIV和FIV均是慢病毒的例子。

术语“慢病毒载体”指从慢病毒基因组的至少一部分衍生的载体，尤其包括如Milone等人,Mol.Ther.

17(8):1453–1464(2009)中提供的自我失活慢病毒载体。可以在临床使用的慢病毒载体的其他例子，例如，包括但不限于，来自Oxford BioMedica的基因递送技术、来自Lentigen的LENTIMAX^TM载体系统等。非临床类型的慢病毒载体也是可获得的并且是本领域技术人员已知的。

术语“免疫效应细胞”指参与免疫应答，例如参与促进免疫效应反应的细胞。免疫效应细胞的例子包括T细胞，例如，α/βT细胞和γ/δT细胞、B细胞、天然杀伤(NK)细胞、天然杀伤T(NKT)细胞、肥大细胞、和髓细胞衍生的吞噬细胞。

本发明的嵌合抗原受体(CAR)

本发明人在深入的研究中发现，在非小细胞肺癌的治疗中，采用工程化表达经优化靶向uPAR的三代CAR多肽的免疫细胞(例如，CAR-T细胞和CAR-NK细胞)，可以有效地在uPAR阳性的浸润前/原位NSCLC肺癌以及转移性NSCLC肺癌中实现抗肿瘤免疫作用。基于此，本发明提供了经优化靶向uPAR的三代CAR多肽,基于所述CAR多肽的免疫细胞，及其单独或联合其他抗癌药物(尤其是PD-1抑制剂)在治疗NSCLC患者中的用途。

以下就本发明的CAR及其组件进行详述描述。本领域技术人员可以理解，除非上下文有明确相反指示，否则，在对组件进行描述时提及的任何技术特征及其任何组合，均在本发明考虑范畴之中；并且，本领域技术人员可以理解，除非上下文有明确相反指示，否则本发明的基于CAR的任何实施方案(包括，但不限于，CAR编码核酸，基于CAR的免疫细胞及其用途)也均可以包含任何这样的组合特征。

在第一方面，本发明提供了靶向uPAR的第三代嵌合抗原受体(CAR)多肽,所述嵌合抗原受体多肽，从N端到C端，包含：

(i)特异性结合uPAR的胞外抗原结合结构域；

(ii)任选地，铰链区/间隔区；

(iii)跨膜结构域；

(iv)CD28共刺激结构域和4-1BB共刺激结构域的组合；和

(v)CD3ζ信号传导结构域。

根据所要靶向的uPAR抗原，本发明的CAR可被构建以包括对该抗原靶标特异的适当抗原结合结构域，以赋予CAR分子以及包含所述CAR分子的CAR-T细胞特异性识别并结合该靶抗原的能力。在一个实施方案中，根据本发明的CAR分子的胞外抗原结合结构域是，对uPAR靶抗原具有结合亲和力的多肽分子，例如特异性结合uPAR的抗体或抗体片段或来自该抗原受体之配体的片段。在一个实施方案中，根据本发明的CAR包含来源于抗体或抗体片段的抗原结合结构域。在再一实施方案中，所述抗原结合结构域包含重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)。在优选的实施方案中，所述抗原结合结构域包含由VL和VH经由接头连接而成的scFv。

scFv可以根据本领域已知的方法，通过使用柔性多肽接头将VH和VL区连接在一起而产生。在一些实施方案中，scFv分子包含具有优化的长度和/或氨基酸组成的柔性多肽接头。在一些实施方案中，scFv包含位于其VL和VH区之间的接头，其中所述接头包含至少5,6,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17,18,19,20,25,30,35,40,45,50个或更多个氨基酸残基。接头序列可以包含任何天然存在的氨基酸。在一个实施方案中，scFv的肽接头由单独或组合使用的氨基酸如甘氨酸和/或丝氨酸残基组成，以将可变重链和可变轻链区连接在一起。在一个实施方案中，柔性多肽接头是Gly/Ser接头，并且例如包含氨基酸序列(Gly-Gly-Gly-Ser)n，其中n是等于或大于1的正整数。例如，n＝1,n＝2,n＝3.n＝4,n＝5和n＝6,n＝7,n＝8,n＝9和n＝10。在一个实施方案中，柔性多肽接头包括但不限于(Gly4 Ser)4或(Gly4 Ser)3。在另一个实施方案中，接头包括(Gly2Ser),(GlySer)或(Gly3Ser)的多个重复。在再一实施方案中，接头包含GSTSGSGKPGSGEGSTKG氨基酸序列。在一个实施方案中，用于本发明的scFv从N端到C端包含：VL-接头-VH；或VH-接头-VL。

本发明的CAR多肽包含至少一个跨膜结构域，其可以衍生自天然来源或合成来源。例如，跨膜结构域可以衍生自膜结合蛋白或跨膜蛋白，例如来自CD3ζ、CD4、CD28、CD8(例如，CD8α，CD8β)的跨膜结构域。在本发明的嵌合抗原受体(CAR)多肽中，跨膜结构域赋予本发明的CAR多肽的膜附着。在一些实施方案中，本发明的CAR中的跨膜结构域可以借助铰链区/间隔区与CAR的胞外区连接。关于可用于CAR多肽中的跨膜区和铰链区/间隔区，可以参见例如，Kento Fujiwara等，Cells 2020,9,1182；doi:10.3390/cells9051182。

本发明的CAR多肽中包含的胞质结构域包含胞内信号结构域。胞内信号结构域能够活化引入了本发明CAR的免疫细胞的至少一个免疫效应功能。所述的免疫效应功能包括但不限于，例如增强或促进免疫攻击靶细胞的功能或应答。T细胞的效应功能例如可以是溶细胞活性或辅助活性，包括分泌细胞因子。

用于本发明CAR多肽中的胞质结构域的例子包括，可以发挥作用以在胞外结构域结合靶抗原后启动信号转导的T细胞受体(TCR)和/或共受体的胞质序列，以及这些序列的任何衍生物或变体和具有相同功能性能力的任何重组序列。T细胞的活化由两类不同的胞质信号传导序列介导：通过TCR启动抗原依赖性初级活化的那些序列(即，初级胞内信号结构域)和以抗原非依赖性方式发挥作用以提供共刺激信号的那些序列(即，次级胞质结构域，例如，共刺激结构域)。在一个实施方案中，本发明的CAR多肽包含提供初级胞内信号结构域的胞质结构域，例如，CD3ζ的胞内信号结构域，且还包含次级信号结构域，例如，来自4-1BB(也称为CD137)和CD28的共刺激结构域的组合。在一个实施方案中，本发明CAR多肽的胞质区包含顺序串联的CD28和4-1BB共刺激结构域以及CD3ζ胞内信号传导结构域，以保证有效地在uPAR阳性的浸润前/原位NSCLC肺癌以及转移性NSCLC肺癌中实现抗肿瘤免疫作用。

在一些实施方案中，本发明的CAR多肽可以包含位于胞外抗原结合结构域N端的信号肽或前导序列。通过信号肽/前导序列，新生的CAR多肽可以被引导到细胞的内质网，并之后锚定在细胞膜上。可以使用任何真核来源的信号肽/前导序列，例如哺乳动物或人分泌蛋白来源的信号肽/前导序列。

在一些实施方案中，根据本发明的嵌合抗原受体(CAR)多肽包含细胞外抗原结合结构域，跨膜结构域，和胞质结构域。

在一个实施方案中，本发明CAR多肽的抗原结合结构域是特异性结合uPAR的抗体或其抗原结合片段。在一个实施方案中，所述抗体或其抗原结合片段是鼠、人或人源化的抗体或其抗原结合片段。在一个实施方案中，所述抗原结合结构域包含:SEQ ID NO:4的重链可变区(VH)氨基酸序列的重链互补决定区1(HC CDR1)，重链互补决定区2(HC CDR2)和重链互补决定区3(HC CDR3)，例如SEQ ID NO:16-18的HCDR1-3氨基酸序列；和/或SEQ ID NO:3的轻链可变区(VL)氨基酸序列的轻链互补决定区1(LC CDR1)，轻链互补决定区2(LC CDR2)和轻链互补决定区3(LC CDR3)，例如SEQ ID NO:13-15的LCDR1-3氨基酸序列。在一个实施方案中，所述抗原结合结构域包含重链可变区和轻链可变区，其中，

所述重链可变区包含：i)SEQ ID NO:4的氨基酸序列；ii)对SEQ ID NO:4的氨基酸序列具有至少一个，两个或三个修饰但不超过30,20或10个修饰的氨基酸序列；或iii)与SEQ ID NO:4的重链可变区氨基酸序列具有95-99％同一性的氨基酸序列；和/或

所述轻链可变区包含:i)SEQ ID NO:3的氨基酸序列；ii)对SEQ ID NO:3的氨基酸序列具有至少一个，两个或三个修饰但不超过30,20或10个修饰的氨基酸序列；或iii)与SEQ ID NO:3的重链可变区氨基酸序列具有95-99％同一性的氨基酸序列。

在一个实施方案中，所述抗原结合结构域包含:i)SEQ ID NO:2的氨基酸序列；ii)对SEQ ID NO:2具有至少一个，两个或三个修饰但不超过30,20或10个修饰的氨基酸序列；或iii)与SEQ ID NO：2具有95-99％同一性的氨基酸序列。

在一个实施方案中，跨膜结构域包含选自以下的蛋白质的跨膜结构域:CD4,CD8α，CD28，CD3ζ，TCRζ，FcRγ，FcRβ，CD3γ，CD3δ，CD3ε，CD5，CD9,CD16，CD22，CD79a，CD79b，CD278(也称为“ICOS”)，FcεRI，CD66d，T细胞受体的α，β或ζ链，MHC I类分子，TNF受体蛋白，免疫球蛋白样蛋白，细胞因子受体，整联蛋白，和激活NK细胞受体。在一个实施方案中，跨膜结构域包含选自以下的蛋白质的跨膜结构域:CD4,CD8α，CD28和CD3ζ。在一个实施方案中，跨膜结构域包含:i)SEQ ID NO:7的氨基酸序列；ii)包含SEQ ID NO:7的氨基酸序列的至少一个，两个或三个修饰但不超过5个修饰的氨基酸序列；或iii)与SEQ ID NO:7具有95-99％序列同一性的氨基酸序列。在一个实施方案中，跨膜结构域包含:i)SEQ ID NO:22的氨基酸序列；ii)包含SEQ ID NO:22的氨基酸序列的至少一个，两个或三个修饰但不超过5个修饰的氨基酸序列；或iii)与SEQ ID NO:22具有95-99％序列同一性的氨基酸序列。

在一个实施方案中，胞质结构域包含选自以下的蛋白质的功能性信号传导结构域:TCRζ,FcRγ，FcRβ,CD3γ,CD3δ,CD3ε,CD5，CD22,CD79a,CD79b或CD66d。在一个实施方案中，胞质结构域包含CD3ζ蛋白的功能信号传导结构域(在本文中也称作，CD3ζ信号传导结构域)。在一个实施方案中，胞质结构域包含:i)SEQ ID NO:12的氨基酸序列；ii)包含SEQ IDNO:12的氨基酸序列的至少一个，两个或三个修饰但不超过20个，10个或5个修饰的氨基酸序列；或iii)与SEQ ID NO:12具有95-99％序列同一性的氨基酸序列。

在一个实施方案中，胞质结构域进一步包含选自以下的两种蛋白质的共刺激结构域：MHC I类分子、TNF受体蛋白、免疫球蛋白样蛋白、细胞因子受体、整联蛋白、信号传导淋巴细胞活化分子(SLAM蛋白)、激活NK细胞受体、CD8、ICOS，DAP10,DAP12,OX40、CD40、GITR、4-1BB(即CD137)、CD27和CD28。在一个实施方案中，胞质结构域包含选自以下的两种蛋白质的共刺激结构域：CD28,CD27,4-1BB,ICOS和OX40的共刺激结构域。在一个实施方案中，胞质结构域包含CD28和4-1BB的共刺激结构域的组合。在一个实施方案中，胞质结构域包含CD28共刺激结构域和4-1BB共刺激结构域，其中CD28共刺激结构域包含:i)SEQ ID NO:11的氨基酸序列；ii)包含SEQ ID NO:11的氨基酸序列的至少一个，两个或三个修饰但不超过20个，10个或5个修饰的氨基酸序列；或iii)与SEQ ID NO:11的氨基酸序列具有95-99％同一性的氨基酸序列；且其中4-1BB共刺激结构域包含:i)SEQ ID NO:10的氨基酸序列；ii)包含SEQID NO:10的氨基酸序列的至少一个，两个或三个修饰但不超过20个，10个或5个修饰的氨基酸序列；或iii)与SEQ ID NO:10的氨基酸序列具有95-99％同一性的氨基酸序列。

在一个实施方案中，CAR多肽还包含置于所述跨膜结构域和所述细胞外抗原结合结构域之间的铰链区或间隔区。在一个实施方案中，铰链区/间隔区选自GS铰链，CD8铰链，IgG4铰链，IgD铰链，CD16铰链，和CD64铰链。在一个实施方案中，CAR多肽包含来自CD28胞外区的铰链区。在一个实施方案中，铰链区/间隔区包含:i)SEQ ID NO:6的氨基酸序列；ii)包含SEQ ID NO:6的氨基酸序列的至少一个，两个或三个修饰但不超过5个修饰的氨基酸序列；或iii)与SEQ ID NO:6的氨基酸序列具有95-99％同一性的氨基酸序列。在本文中，表述“铰链”、“铰链区”和“铰链结构域”可互换使用。

在一个实施方案中，CAR多肽还包含前导肽或信号肽，例如来自人粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子受体α链(GM-CSFRα)的信号肽。

在一个实施方案中，根据本发明的CAR多肽包含:i)SEQ ID NO:21的氨基酸序列；ii)对SEQ ID NO:21的氨基酸序列具有至少一个，两个或三个修饰但不超过30,20或10个修饰的氨基酸序列；或iii)与SEQ ID NO:21的氨基酸序列具有至少95-99％同一性的氨基酸序列。

编码本发明的CAR的核酸分子、载体和表达本发明CAR的细胞

本发明提供了编码本文所述的CAR构建体的核酸分子。在一个实施方案中，核酸分子作为DNA构建体提供。可以使用本领域公知的重组方法获得编码本发明CAR的构建体。备选地，可以合成地产生目的核酸，而非通过基因重组方法产生目的核酸。

本发明还提供了插入有(一个或多个)本发明核酸分子或本发明的核酸构建体的载体。可以通过将编码CAR多肽的核酸有效连接至启动子，并将构建体并入表达载体中，实现编码CAR的核酸的表达。载体可以适合在真核生物中复制和整合。常见的克隆载体含有用于调节所需核酸序列的表达的转录和翻译终止子、起始序列和启动子。已经开发了众多基于病毒的系统用于转移基因至哺乳动物细胞中。例如，逆转录病毒提供了用于基因递送系统的便利平台。可以使用本领域已知的技术，将本发明核酸构建体插入载体并且包装在逆转录病毒粒子中。随后可以分离重组病毒并将其在体内或离体递送至受试者的细胞。众多逆转录病毒系统是本领域已知的。在一些实施方案中，使用慢病毒载体。

衍生自逆转录病毒(如慢病毒)的载体是实现长期基因转移的合适工具，因为它们允许转基因的长期、稳定整合和其在子代细胞中增殖。慢病毒载体具有胜过衍生自癌-逆转录病毒(如鼠白血病病毒)的载体的额外优点，因为它们可以转导非增殖性细胞，如肝细胞。它们还具有额外的低免疫原性优点。逆转录病毒载体也可以例如是γ逆转录病毒载体。γ逆转录病毒载体可以例如包含启动子、包装信号(ψ)、引物结合位点(PBS)、一个或多个(例如，两个)长末端重复序列(LTR)和目的转基因，例如，编码CAR的基因。γ逆转录病毒载体可以缺少病毒结构性基因如gag、pol和env。

能够在哺乳动物T细胞中表达CAR转基因的启动子的例子是EF1a启动子。天然EF1a启动子驱动延伸因子-1复合体的α亚基表达，所述α亚基负责酶促递送氨酰基tRNA至核糖体。已经在哺乳动物表达质粒中广泛使用了EF1a启动子并且已经显示有效驱动从克隆至慢病毒载体中的转基因表达CAR。参见，例如，Milone等人,Mol.Ther.17(8):1453–1464(2009)。

启动子的另一个例子是立即早期巨细胞病毒(CMV)启动子序列。这个启动子序列是能够驱动与之有效连接的任何多核苷酸序列高水平表达的组成型强启动子序列。但是，也可以使用其他组成型启动子序列，所述其他组成型启动子序列包括但不限于猴病毒40(SV40)早期启动子、小鼠乳腺瘤病毒(MMTV)、人类免疫缺陷病毒(HIV)长末端重复序列(LTR)启动子、MoMuLV启动子、鸟类白血病病毒启动子、埃巴病毒立即早期启动子、劳斯肉瘤病毒启动子以及人基因启动子，如但不限于肌动蛋白启动子、肌球蛋白启动子、延伸因子-1α启动子、血红蛋白启动子和肌酸激酶启动子。另外，本发明不应当限于使用组成型启动子。还构思了诱导型启动子作为本发明的部分。

在一些实施方案中，本发明提供了在哺乳动物免疫效应细胞(例如哺乳动物T细胞或哺乳动物NK细胞)中表达本发明的CAR构建体的方法和由此产生的免疫效应细胞。

从受试者获得细胞来源(例如，免疫效应细胞，例如，T细胞或NK细胞)。术语“受试者”意在包括可以激发免疫应答的活生物(例如，哺乳动物)。可以从众多来源获得T细胞，包括外周血单个核细胞、骨髓、淋巴结组织、脐带血、胸腺组织、来自感染部位的组织、腹水、胸腔积液、脾组织和肿瘤。

可以使用本领域技术人员已知的任何技术(如Ficoll^TM分离法)，从采集自受试者的血液成分中获得T细胞。在一个优选的方面，通过单采血液成分术获得来自个体循环血液的细胞。单采产物一般含有淋巴细胞，包括T细胞、单核细胞、粒细胞、B细胞、其他有核的白细胞、红细胞和血小板。在一个实施方案中，可以洗涤通过单采血液成分术采集的细胞，以除去血浆级分并且以在用于后续加工步骤的适宜缓冲液或培养基中放置细胞。在本发明的一个方面，用磷酸盐缓冲盐水(PBS)洗涤细胞。

可以通过正向或负向选择技术进一步分离特定的T细胞亚群，如CD3+、CD28+、CD4+、CD8+、CD45RA+和CD45RO+T细胞。例如，在一个实施方案中，通过与抗CD3/抗CD28缀合的珠(如M-450CD3/CD28 T)温育一段足够正向选择所需T细胞的时间，分离T细胞。在一些实施方案中，该时间段是约30分钟至36小时之间或更长时间。较长的温育时间可以用来在存在少量T细胞的任何情况下分离T细胞，如用于从肿瘤组织或从免疫受损个体分离肿瘤浸润型淋巴细胞(TIL)。另外，使用较长的温育时间可以增加捕获CD8+T细胞的效率。因此，通过简单地缩短或延长该时间，允许T细胞与CD3/CD28珠结合和/或通过增加或减少珠对T细胞的比率，可以在培养伊始或在培养过程期间的其他时间点偏好地选择T细胞亚群。

可以用抗体的组合，通过负选择过程完成T细胞群体的富集，其中所述抗体针对负向选择的细胞独有的表面标志物。一种方法是借助负向磁力免疫粘附法或流式细胞术分选和/或选择细胞，所述负向磁力免疫粘附法或流式细胞术使用针对负向选择的细胞上存在的细胞表面标志物的单克隆抗体混合物。

在一些实施方案中，免疫效应细胞可以是同种异体免疫效应细胞，例如，T细胞或NK细胞。例如，细胞可以是同种异体T细胞，例如，缺少功能性T细胞受体(TCR)和/或人白细胞抗原(HLA)(例如，HLA I类和/或HLA II类)表达的同种异体T细胞。

在一些实施方案中，对编码本发明所述的CAR的核酸转导的细胞进行增殖，例如，将细胞在培养下增殖2小时至约12天。对经体外增殖后获得的表达CAR的免疫效应细胞可以如实施例中所述进行效应功能的检测。

针对uPAR具有CD28和4-1BB共刺激结构域组合的本发明CAR多肽，在免疫效应细胞中的表达，可显著地促进荷瘤动物个体的总体生存期。这可能得益于，两种共刺激结构域的组合使用延长了CAR-T细胞的存活时间，同时促进了CAR-T细胞的增殖和抗肿瘤活性。通过将本发明的CAR-T细胞与肿瘤细胞共培养后，进行高通量测序，检测本发明的CAR-T细胞的差异表达基因。RNA提取、cDNA文库构建和测序均严格按照转录组测序标准进行。使用在线生物信息学工具DAVID bioinformatics Resources 6.8对本发明的CAR-T细胞差异表达的基因进行基因本体(GO)分析。数据可视化和分析由定制的R studio脚本按照包(ggplot2和Tree map)进行处理。基因富集分析采用Fisher精确检验。GO分析结果表明，本发明uPAR-CD28.4-1BBζCAR-T细胞中的大多数差异表达基因定位于细胞外区域和细胞膜中，并且相比于接触靶肿瘤细胞前，与免疫反应、炎症反应和干扰素γ的细胞反应相关的基因显著上调，在此三个生物学过程上的基因富集程度分别达大约10倍、大约12倍和大约2.5倍。这提示，本发明的三代CAR-T细胞在与靶NSCLC癌细胞接触后被有效地激活，支持了本发明CAR-T细胞的体内强抗肿瘤功能。

表达本发明CAR多肽的免疫效应细胞的用途和使用表达本发明CAR多肽的免疫效应细胞的治疗方法

近几十年来，CAR-T细胞疗法已成为过继性细胞免疫疗法的一种新方法。然而，在NSCLC等实体瘤中，由于肿瘤本身的生物学异质性，使得构建CAR-T细胞更为复杂，并持续需要靶向不同的肿瘤抗原的分子以用于改善个体患者的治疗。

本发明人构建的靶向uPAR的三代优化CAR分子在体外和多种体内动物荷瘤模型中均展示了显著的抗肿瘤免疫效果。基于此，在再一方面，本发明提供了工程化免疫效应细胞在制备用于在有需要的个体中治疗uPAR阳性非小细胞肺癌(NSCLC)的药物中的用途以及利用所述工程化免疫效应细胞治疗uPAR阳性非小细胞肺癌(NSCLC)的方法，其中所述工程化免疫效应细胞包含本文所述的靶向uPAR的嵌合抗原受体多肽。

在本文中，术语“个体”或“受试者”或“患者”可互换地使用，包括哺乳动物。哺乳动物包括但不限于驯化动物(例如，牛、羊、猫、犬和马)、灵长类(例如，人和非人灵长类如猴)、兔和啮齿类(例如，小鼠和大鼠)。特别地，个体或受试者是人。

术语“肿瘤”和“癌症”在本文中互换地使用。术语“抗肿瘤免疫”是指，可以通过各种方式呈现的生物学效果，包括但不限于，例如，肿瘤体积的减小、癌细胞数量的减少、转移数量的减少、预期荷瘤个体寿命的延长、癌细胞增殖的降低、癌细胞存活的降低、或各种与癌性病症相关的生理症状的改善。“抗肿瘤免疫”还可以通过肽、多肽、细胞和抗体预防癌症在第一个位置出现的能力来呈现。在一些实施方案中，在uPAR阳性NSCLC患者治疗中施用本发明的CAR免疫效应细胞，以提供抗肿瘤免疫效果。

用于本文时，“治疗”指减缓、中断、阻滞、缓解、停止、降低、或逆转已存在的症状、病症、病况或疾病的进展或严重性。想要的治疗效果包括但不限于防止疾病出现或复发、减轻症状、减小疾病的任何直接或间接病理学后果、防止转移、降低病情进展速率、改善或缓和疾病状态，以及缓解或改善预后。在一些实施方案中，本发明的CAR免疫效应细胞用来延缓疾病发展或用来减慢疾病的进展。

术语“治疗有效量”指本发明的CAR免疫效应细胞的这样的量或剂量，其以单一或多次剂量施用患者后，在需要治疗或预防的患者中产生预期效果。有效量可以由作为本领域技术人员的主治医师通过考虑以下多种因素来容易地确定：诸如哺乳动物的物种；体重、年龄和一般健康状况；涉及的具体疾病；疾病的程度或严重性；个体患者的应答；施用的具体CAR免疫效应细胞；施用模式；施用制剂的生物利用率特征；选择的给药方案；和任何伴随疗法的使用。治疗有效量也可以是这样的一个量，其中CAR免疫效应细胞的任何有毒或有害作用不及治疗有益作用。相对于未治疗的对象，“治疗有效量”优选地抑制可度量参数(例如肿瘤生长率、肿瘤体积等)至少约20％、更优选地至少约40％、甚至更优选地至少约50％、60％或70％和仍更优选地至少约80％或90％。可以在预示人肿瘤中的功效的动物模型系统中评价CAR免疫效应细胞抑制可度量参数(例如，癌症)的能力。

在一个实施方案中，本发明提供了一种治疗患者uPAR阳性NSCLC癌症的方法，其中该方法包括向患者施用治疗有效量的本文所述的CAR-T细胞(和任选地与其他抗癌剂，例如抗PD-1或抗PD-L1抗体的组合)。

在一些实施方案中，非小细胞肺癌是早期非小细胞肺癌、非转移性非小细胞肺癌、原发性非小细胞肺癌、切除的非小细胞肺癌、晚期非小细胞肺癌、局部晚期非小细胞肺癌、转移性非小细胞肺癌、不可切除的非小细胞肺癌、好转期中的非小细胞肺癌、复发的非小细胞肺癌、辅助治疗情况(adjuvant setting)中的非小细胞肺癌、或非辅助治疗情况中的非小细胞肺癌中的任何一种。

在一个实施方案中，所述非小细胞肺癌是腺癌。另一个实施方案中，所述非小细胞肺癌是鳞状细胞癌。在一个实施方案中，所述非小细胞肺癌是大细胞癌。在一个实施方案中，所述患者接受了至少一种先前的治疗。在一个实施方案中，所述在先疗法为用于治疗癌症的手术治疗。在一个实施方案中，所述非小细胞肺癌是浸润期、或原位癌。在另一实施方案中，所述非小细胞肺癌是局部晚期肺癌。另一个实施方案中，所述非小细胞肺癌是转移性的，尤其是NSCLC的脑转移。在一些实施方案中，所述非小细胞肺癌为I期、II期、III期、或IV期肺癌。在一些实施方案中，所述患者是亚洲人，例如中国人。在一些实施方案中，所述患者为30岁-50岁、或30-55岁的成年个体，或者60岁以上或65岁以上的老年个体。

在一些实施方案中，本发明的方法还包括，在施用本文所述的CAR-T治疗之前，选择用于本发明治疗的患者。在一个实施方案中，所述选择包括在来自受试者/患者的样品中检测uPAR表达水平。

术语“受试者/患者样品”指从患者或受试者得到的细胞、组织或体液的集合。组织或细胞样品的来源可以是实体组织，像来自新鲜的、冷冻的和/或保存的器官或组织样品或活检样品或穿刺样品；血液或任何血液组分；体液，诸如脑脊液、羊膜液(羊水)、腹膜液(腹水)、或间隙液；来自受试者的妊娠或发育任何时间的细胞。组织样品可能包含在自然界中天然不与组织混杂的化合物，诸如防腐剂、抗凝剂、缓冲剂、固定剂、营养物、抗生素、等等。肿瘤样品的例子在本文中包括但不限于肿瘤活检、细针吸出物、支气管灌洗液、胸膜液(胸水)、痰液、尿液、手术标本、循环中的肿瘤细胞、血清、血浆、循环中的血浆蛋白质、腹水、衍生自肿瘤或展现出肿瘤样特性的原代细胞培养物或细胞系，以及保存的肿瘤样品，诸如福尔马林固定的、石蜡包埋的肿瘤样品或冷冻的肿瘤样品。

在一些实施方案中，可以通过来自受试者或患者的肿瘤样品(例如肿瘤活检物)，确定肿瘤细胞表面的uPAR表达水平。在一些具体的实施方案中，术语“uPAR高表达”是指，与正常组织，例如待测肿瘤组织的相邻正常组织(即，配对组织)相比，在疑似癌变的组织或癌组织的细胞表面可检测到更高(增加)的靶抗原(即，uPAR)表达水平。所述表达水平的评估可以是定性的或定量的。换言之，与已知的参照标准相比，未知样品可以被评估为具有阳性或阴性表达。或者，可以定量地表示阳性细胞的百分比，其中，例如，可以对细胞进行计数并针对uPAR表达水平评分。在一个具体的实施方案中，用于所述比较的参照组织或细胞是正常或非癌性组织或细胞，其可以获自或来源于健康个体(例如，来自该个体的肺组织或细胞)，或获自待诊断和/或治疗的癌症或疑似癌症个体的正常组织或细胞(例如，来自该个体的肺组织或细胞)。

在一个实施方案中，由此，本发明的治疗方法还包括，通过来自受试者或患者的肿瘤样品(例如肿瘤活检物)，确定具有uPRAR阳性肿瘤的受试者或患者，并任选地定性或定量确定所述肿瘤的uPAR阳性率(即，uPAR阳性肿瘤细胞的百分比)。

在一些实施方案中，本文所述的方法包括向NSCLC患者施用本文所述的CAR-T细胞(和任选地，其他抗癌剂，例如与抗PD-1或抗PD-L1抗体的联合)，其中所述患者在肿瘤组织样本(例如，鳞状或非鳞状肿瘤组织样本)中表达升高的uPAR水平(例如，相对于正常组织样本而言)。在一些实施方案中，本文所述的方法包括向NSCLC患者施用本文所述的CAR-T细胞(和任选地，其他抗癌剂，例如与抗PD-1或抗PD-L1抗体的联合)，其中所述患者的肿瘤组织样本(例如，鳞状或非鳞状肿瘤组织样本)具有1％至50％、或20％至50％、60％、70％或以上、或30％至50％、60％、70％或以上、或50％至60％、70％、80％或以上的uPAR阳性细胞百分比。在一些实施方案中，所述患者在肿瘤组织样本(例如，鳞状或非鳞状肿瘤组织样本)中具有50％或更高的uPAR阳性细胞百分比。

在另一些实施方案中，本发明还提供了一种通过施用本文所述的CAR-T细胞(和任选地，其他抗癌剂，例如与抗PD-1或抗PD-L1抗体的联合)来治疗患者的uPAR阳性NSCLC癌症的方法，其中该方法进一步包括，在治疗过程中在自患者获得的生物样本中评估生物标志物的步骤。在一些实施方案中，生物样品是血液样品。在一些实施方案中，生物标志物选自以下之一或多项：IL2、IL9、IFN-γ、TNFRSF9和IL17A基因，以及任选地趋化因子基因如CXCL1、CXCL5和CXCL8，其中所述生物标志物的水平相对于施用本发明治疗前或在治疗过程中的增加，可以用于例如指示患者的治疗反应性。在另一些实施方案中，生物标志物是分离自患者的肿瘤浸润淋巴细胞上的PD-1,PD-L2和/或Lag-3的表达水平，和/或分离自患者的肿瘤细胞上PD-L1的表达水平，其中所述生物标志物的水平相对于施用本发明治疗前或在治疗过程中的增加，可以用于例如指示患者的复发可能性。

在一个优选的实施方案中，本发明方法包括联合施用本文所述的CAR-T细胞与另一抗癌剂(例如，抗PD-1抗体)。如本文中使用的，“联合”施用或“组合”施用表示，两种(或更多种)不同的治疗在受试者罹患病症的过程中被递送给受试者，例如，在受试者已经被诊断为患病后并且在病症治愈或消除或出于其他原因停止治疗前，递送两种或更多种治疗。在一些实施方案中，一种治疗的递送在第二种开始递送时仍然进行，由此就施用而言存在重叠。这有时候在本文中被称为“同时”或“并行递送”。在其他实施方案中，一种治疗的递送在另一种治疗开始递送前结束。在任一种情况的一些实施方案中，由于联合施用，治疗更有效。在一些实施方案中，联合施用使得症状减轻，或与病症相关的其他参数优于在不存在另一种治疗的情况下使用一种治疗所观察到的参数。两种治疗的效果可以是部分相加、完全相加或高于相加。

在一些实施方案中，本文所述的治疗方法和用途还包括，向所述个体施用免疫检测点抑制剂，例如PD-1或PD-L1抑制剂或LAG-3抑制剂，例如，在所述CAR-T细胞施用之前、期间和/或之后，施用一剂或多剂所述抑制剂，尤其是PD-1抑制剂，例如抗PD-1抗体。在一些实施方案中，抗PD-1抗体治疗包括，但不限于：纳武单抗(nivolumab)、派立珠单抗(pembrolizumab)、伊匹单抗(ipilimumab)、JS001、TSR-042、匹立珠单抗(pidilizumab)、BGB-A317、SHR-1210、REGN2810、MDX-1106、PDR001、来自克隆株RMP1-14的抗PD-1；及美国专利第8,008,449号中公开的抗PD-1抗体、度伐单抗(durvalumab)、阿特珠单抗(atezolizumab)、阿维鲁单抗(avelumab)及其片段、衍生物、变体以及生物类似物。

在一些实施方案中，在根据本发明的治疗方法和用途中，在施用CAR-T细胞前，所述个体已接受过在先癌症治疗。在一个实施方案中，所述在先治疗为肺癌手术治疗。在另一些实施方案中，在先治疗是化疗和/或放疗。在再一些实施方案中，所述个体已经用化疗剂或放疗剂进行过治疗，但当前(例如，在所述CAR-T细胞施用前，例如，一周、两周、三周、一个月或两个月内)尚未接受化疗剂或放疗剂治疗。在又一些实施方案中，在所述CAR-T细胞施用前，例如，一周、两周、三周、一个月或两个月内，所述个体未曾接受过衰老诱导处理。在一些实施方案中，所述衰老诱导处理为接触癌细胞后可诱导细胞表面uPAR表达上升的化疗和/或放疗，例如，多柔比星、电离放射、MEK抑制剂和CDK4/6抑制剂的联合疗法、CDC7抑制剂和mTOR抑制剂的联合疗法。

在一个方面，本发明也提供了药物组合物和药物组合，其包含本文所述的CAR细胞，例如免疫效应细胞，以及任选地，PD-L1抑制剂；并提供所述药物组合物和药物组合在用于本发明上述NSCLC治疗方法中的用途，或在制备用于所述方法的药物中的用途。

本发明所述的各个实施方案/技术方案以及各个实施方案/技术方案中的特征应当被理解为可以任意进行相互组合，这些相互组合得到的各个方案均包括在本发明的范围内，就如同在本文中具体地且逐一地列出了这些相互组合而得到的方案一样，除非上下文清楚地显示并非如此。

描述以下实施例以辅助对本发明的理解。不意在且不应当以任何方式将实施例解释成对本发明的保护范围的限制。

实施例

材料和方法

细胞系

人癌细胞系H460、A549、和逆转录病毒包装细胞系PG13购自美国典型培养物保藏中心(ATCC)。通过逆转录病毒感染产生表达eGFP和萤火虫荧光素酶的H460、uPAR⁺A549细胞。所有这些细胞都保存在Dulbecco改良Eagle培养基(Lonza)中，该培养基含有10％胎牛血清(Biosera)和10,000IU/mL青霉素/10,000μg/mL链霉素(EallBio Life Sciences)。

免疫组织化学

将福尔马林固定、石蜡包埋(FFPE)的肿瘤标本切片脱蜡，然后与兔抗人uPAR抗体(Cell Signaling Technology)在4℃孵育过夜。在与HRP缀合的山羊抗兔二抗孵育后，按照制造商的说明，使用DAB底物试剂盒(Abcam)检测信号。使用显微镜(尼康)采集图像。以100倍放大倍率，并通过Image J v1.49量化uPAR信号的相对密度。相对密度大于5％，确认肺肿瘤组织为uPAR阳性。

产生编码uPAR特异性CAR的逆转录病毒载体

包含优化的uPAR-scFvs编码序列(SEQ ID NO:1)的CAR分子(SEQ ID NO：21)由GeneArt(Invitrogen)合成，然后亚克隆到SFG逆转录病毒载体(addgene)中。通过测序验证CAR的克隆。在瞬时转染48小时后，应用逆转录病毒包装细胞系PG13，产生逆转录病毒颗粒。

产生CAR T细胞

通过Lymphoprep(MP Biomedicals)梯度离心，自健康供体分离人外周血单个核细胞(PBMC)。为了产生uPAR-CAR T细胞，PBMC中的T细胞用抗CD3和抗CD28珠刺激，然后用逆转录病毒感染。7天后，通过流式细胞术，对T细胞进行CAR表达检测，然后在含有5％GemCell^TM人血清AB(Gemini Bio)和IL-2(SL PHARM)的X-VIVO^TM15无血清培养基(Lonza)中扩增。本研究经北京世纪坛医院机构审查委员会批准，并获得所有参与者的知情同意。

流式细胞术测定

流式细胞术在FACSCanto Plus仪器(BD Biosciences)上进行。FlowJo v.10(FlowJo,LLC)用于数据分析。用APC标记的小鼠抗人CD3抗体(BD Biosciences)、PE标记的小鼠抗人CD8抗体(BD Biosciences)、BV421标记的小鼠抗人CD4抗体(BD Biosciences)和山羊抗小鼠IgG(Fab特异性)F(ab')2片段-FITC抗体(GAM，Sigma)染色后，检测转基因T细胞。H460细胞及uPAR⁺A549细胞用APC标记的单克隆抗体小鼠抗人uPAR(R&D System)染色，然后进行流式细胞术以检查细胞表面uPAR表达。用APC标记的小鼠抗人CD3抗体(BDBiosciences)、APC标记小鼠抗人CD107a抗体(BD Biosciences)染色后，检测CAR-T细胞活化水平。用APC标记的小鼠抗人CD3抗体(BD Biosciences)、PE标记的小鼠抗人CD8抗体(BDBiosciences)、BV421标记的小鼠抗人CD4抗体(BD Biosciences)、BV480标记的小鼠抗人PD-1抗体、BV605标记的小鼠抗人TIM-3抗体、BV480标记的小鼠抗人LAG-3抗体染色，检测CAR-T细胞PD-1/TIM-3/LAG-3水平变化、用PE标记的小鼠抗人PD-L1抗体染色，检测细胞PD-L1水平变化。

T细胞增殖试验

1x10^6的H460细胞接种于6孔板，过夜培养以使H460细胞充分贴壁后，CAR-T细胞与H460细胞在E:T比例为2:1的条件下共培养12天。每3天用新鲜的H460细胞刺激T细胞，在添加H460细胞之前对T细胞进行计数。

IFN-γ细胞因子分泌水平检测

CAR-T细胞，与H460,uPAR⁺A549细胞以及从肿瘤组织块分离的细胞，以10:1的E:T比例，共培养24小时。收集上清液并进行IFN-γ检测。根据制造商的说明，使用人IFN-γDuoSet ELISA试剂盒(Development Systems)测量IFN-γ水平。

肿瘤细胞体外杀伤试验

NGFR CAR-T细胞或uPAR CAR-T细胞，与H460,uPAR⁺A549,和从肿瘤组织块中分离的细胞，以0:1、1:1、2.5:1、5:1或10:1的比例(效靶比，E:T)，在X–VIVO^TM15培养基中共培养24小时。使用IVIS成像系统(IVIS,Xenogen,Alameda,CA,USA)，监测荧光素酶活性，并相对于对照，确定由CAR-T细胞引起的靶肿瘤细胞裂解百分数。计算方式：裂解百分数＝1-(共培养后荧光强度/0:1比例共培养后荧光强度)。

基于阻抗的肿瘤细胞杀伤试验

使用xCELLigence阻抗系统，在24小时内评估持续的肿瘤细胞死亡。将肿瘤细胞以每孔10,000个细胞接种在底部整合了电阻器的96孔板(resistor-bottomed plate)中。一式三份进行实验。24小时后，加入100,000个T细胞(E:T＝10:1)。NT细胞(未转导的T细胞)作为对照。相对于NT对照，标化与肿瘤细胞粘附相关的细胞指数值。通过测量由肿瘤细胞粘附引起的电流阻抗，每15分钟收集一次基于阻抗测量的标化细胞指数值。

皮下注射肺癌细胞的异种移植小鼠模型

6至8周龄的NOD-SCID小鼠购自Charles River实验室。雌性NOD-SCID小鼠左侧肋腹，皮下注射2x10⁶个H460-eGFP-Luc细胞，构建异种移植小鼠模型。肿瘤细胞注射3天后，将2x10⁷个CAR T细胞连续3天直接注射到肿瘤中。使用IVIS成像系统(IVIS,Xenogen,Alameda,CA,USA)，监测肿瘤发展，当肿瘤直径达到20mm时处死小鼠。包括小鼠在内的所有实验均经北京世纪坛医院机构审查委员会批准。

生物发光成像

用100％氧气中3％异氟醚麻醉小鼠，注射在300μL盐水中的4.5mg/kg D-荧光素，并在10分钟后使用光学成像平台(Spectral Instruments Imaging)成像。每5分钟拍摄一次图像，直到光子计数达到峰值。

RNA高通量测序

使用Ultra^TM RNA文库制备试剂盒(#E7530L,NEB)，按照制造商说明，应用各含有2μg总RNA的样品作为输入材料，生成测序文库。简而言之，使用附有poly-T寡核苷酸的磁珠，从总RNA中纯化mRNA。在NEB Next第一链合成反应缓冲液(5X)中，在升高的温度下，使用二价阳离子进行片段化。使用随机六聚体引物和RNase H合成第一链cDNA。随后使用缓冲液、dNTP、DNA聚合酶I和RNase H合成cDNA第二链。文库片段用QiaQuick PCR试剂盒纯化，用EB缓冲液洗脱，然后进行末端修复、加A尾和添加衔接物。为了构建文库，回收产物并进行PCR。根据制造商的方案，使用TruSeq SR Cluster试剂盒v3-cBot-HS(Illumina Inc.)，在cBot Cluster Generation系统上，对具有index码的样品进行分类。随后，对文库进行Illumina NovaSeq 6000System平台(Illumina Inc.)测序。

实时逆转录聚合酶链反应

按照制造商的说明，使用TRIzol试剂(Invitrogen)从细胞中提取总RNA。使用Nanodrop One分光光度计(Thermo Fisher Scientific)测量RNA的量和纯度。只有具有适当吸光度测量值的样品(A260/A280约为2.0，且A260/A230为1.9-2.2)才被考虑纳入本研究。使用High-Capacity cDNA逆转录试剂盒(Thermo Fisher Scientific)合成cDNA，然后使用SYBR Green PCR Master Mix(Thermo Fisher Scientific)和基因特异性引物进行扩增。GAPDH用作内部对照。使用2-ΔΔCt方法，计算相对基因表达。

RNA干扰

使用Lipofectamine 3000(Thermo Fisher Scientific)，用小干扰RNA(siRNA)转染H460细胞48小时。然后收集细胞用于RNA和蛋白质提取。用于siRNA的序列:

Si-NC,ACGUGACACGUUCGGAGAA(作为对照)；si-PD-L1,UCUCUCUUGGAAUUGGUGG(靶向PD-L1)。

PDX建模和治疗

将来自uPAR阳性肺腺癌患者的肿瘤组织，接种到BALB/C-nu/nu小鼠中，进行PDXs(P0)建模。三周后，将肿瘤组织从PDXs(P0)中分离出来，并再次接种BALB/C-nu/nu小鼠中，用于建立PDXs(P1)模型。见图19a所示。在PDXs(P1)建模三天后，用NT(未转导的T细胞)对照、uPAR CAR-T细胞单独、或uPAR CAR-T细胞与PD-1抗体的联合，连续三天治疗荷瘤小鼠。如图19b-19d显示，与仅应用CAR-T细胞相比，PD-1抗体联合治疗显著更好地抑制了肿瘤生长。

原位异种移植物模型

经胸膜注射用于原位异种移植。用3％异氟醚麻醉小鼠并保持右侧卧位。在左肩胛骨的尾侧切开一个5mm的皮肤切口，解剖脂肪和肌肉组织，暴露出左肋腔。观察左肺运动，将含有30μL H460细胞悬液和50％Matrigel的PBS溶液的31号针头注射器，通过第六肋间隙插入肺实质，深度3mm；然后将细胞直接注入左肺。用3M^TMVetbond^TM组织粘合剂(3M,St.Paul,MN,USA)关闭皮肤切口，并使小鼠保持温暖直至完全恢复。

颅内植入肺癌细胞构建异种移植物小鼠模型

用氯胺酮/甲苯噻嗪混合溶液麻醉6至8周龄的NOD-SCID小鼠。将动物固定在立体定向头架中，在头皮中线切开1cm，在颅骨上钻孔，使用10μL BD注射器将5μl PBS中的2x10⁵H460-eGFP-luc细胞注射到左侧纹状体(坐标：前囟外侧2.5mm和前囟后侧0.5mm)，由此将肿瘤细胞递送到3.5mm深度的脑实质内。颅骨上的钻孔用骨蜡密封，切口用医用胶(COMPONT)封闭。肿瘤细胞注射三天后，通过尾静脉注射3x10⁷个CAR-T细胞，并使用IVIS体内成像系统(IVIS，Xenogen，Alameda，CA，USA)监测肿瘤生长。所有小鼠实验均获得北京世纪坛医院机构审查委员会的批准。

统计分析

所有实验至少一式三份进行。统计分析应用GraphPad Prism 8.0.2版(GraphPad软件)进行。数据表示为平均值±标准差。采用合适的统计学检验方法，检验平均值之间的差异。使用Kaplan-Meier方法，测量带有肿瘤异种移植物的小鼠的总体生存率，并使用Cox比例风险回归分析进行组间比较。统计显著性设定为p<.05。

实施例1：uPAR与肺癌患者的低生存率相关

通过Human Protein Atlas数据库(http://www.proteinatlas.org/)，我们发现，uPAR高表达的肺癌患者的生存率明显低于uPAR低表达的患者(图1，来自一共994例肺癌患者病例信息)。

为了检测uPAR在不同肺癌患者中的具体表达情况及其与患者生存率的关系，我们进一步通过免疫组织化学检测了12名中国肺癌患者的肿瘤样本中的uPAR水平(如图2a和2b和表1所示)。入组患者的中位年龄为61.5岁(范围：49-73岁)。所有患者均接受过手术治疗。患者的人口统计学和临床特征显示在表1中。根据在肿瘤标本切片上量化的uPAR信号的相对密度，33.3％患者的肺肿瘤组织为uPAR阳性，其余为uPAR阴性。

表1.患者的人口统计学和临床特征。

患者编号

性别

年龄(岁)

肿瘤类型

肿瘤分期

uPAR

状态

#1

男

65

腺癌

IV

阴性

死亡

#2

女

73

鳞状细胞癌

I

阳性

死亡

#3

男

64

鳞状细胞癌

III

阴性

存活

#4

男

59

腺癌

II

阴性

存活

#5

男

49

鳞状细胞癌

IV

阴性

存活

#6

男

64

鳞状细胞癌

III

阴性

存活

#7

男

69

腺癌

II

阳性

存活

#8

男

51

小细胞癌

III

阴性

死亡

#9

男

41

小细胞癌

NA

阴性

死亡

#10

女

57

NA

阳性

死亡

#11

男

58

腺癌

I

阴性

存活

#12

男

68

鳞状细胞癌

II

阳性

死亡

实施例2：uPAR CAR-T细胞在体外表现出显著的抗肿瘤活性

为了产生uPAR特异性CAR-T细胞，开发了基于uPAR特异性mAb的三代(CD28.4-1BBζ)CAR(图3)，并构建编码该三代CAR分子的逆转录病毒载体。之后，从健康供体外周血单个核细胞中分离的T细胞，用抗CD3和抗CD28珠刺激；并用构建的逆转录病毒感染。在转导7天后，进行流式细胞术测定，以检查转导效率。如图4所示，大约60％的T细胞是CAR阳性的。

采用已知表达高水平uPAR的人肺癌细胞系H460，以及人工过表达uPAR的另一个肺癌细胞系A549(uPAR⁺A549)，作为uPAR高表达的肿瘤细胞系的代表。图5a显示了对这两种细胞系的细胞表面uPAR表达水平的流式检查结果。将构建的uPAR CAR-T细胞与高表达uPAR的这些肿瘤细胞(H460和uPAR⁺A549)以1:1到10:1的效靶比(E:T比率)共培养，以检查CAR T细胞的体外增殖和抗肿瘤活性。PBMC细胞和NGFR CAR-T细胞用作对照。靶向无关抗原NGFR的NGFR CAR-T细胞，采用与uPAR CAR-T细胞相同的方式构建。如图5b所示，在低E:T比(2:1)下共培养，构建的uPAR CAR-T细胞在接触靶肿瘤细胞后表现出良好的活力和增殖能力。如图5c至图5d所示，在高E:T比(10:1)下将uPAR CAR-T细胞与靶肿瘤细胞共培养6小时后，自共培养的uPAR CAR-T细胞检测到高水平的CD107a表达(图5c)以及IFN-γ分泌(图5d)。此外，如图6a所示，相比于对照NGFR CAR-T细胞，由uPAR CAR-T细胞引起了显著的肿瘤靶细胞裂解，在低E:T比(1:1)下肿瘤细胞裂解率大于60％，在高E:T比(10:1)下肿瘤细胞裂解率大于80％。实时细胞生长监测(RTCA)系统的结果也表明，与对照PBMC细胞和NGFR CAR-T细胞相比，uPAR CAR-T细胞抑制肿瘤细胞的生长(图6b)。

实施例3：uPAR CAR-T细胞在体内显示治疗功效

为检查uPAR CAR-T细胞在体内的抗肿瘤活性，将H460-Luc细胞,皮下注射到NOD-SCID小鼠中，以生成肺异种移植物小鼠模型。如图7a所示。第1/2/3天，将CAR-T细胞直接注射到肿瘤中，并以未转导的T细胞(NT)为对照，监测肿瘤生长84天。结果显示，与NT组小鼠相比，用uPAR CAR-T细胞治疗的小鼠的生存期显著延长(图7b,7c和7d)。

由于在uPAR CAR-T细胞治疗的部分小鼠中观察到肿瘤复发现象。为了确认构建的CAR-T细胞对复发的肿瘤是否仍然具有抗肿瘤作用，之后我们自复发肿瘤的小鼠分离了肿瘤细胞，并进行了体外细胞测试。如图8a-c所示，uPAR CAR-T仍然表现出优异的抗肿瘤能力。这说明，肿瘤的复发原因可能并非是CAR-T细胞脱靶效应，更可能是因为CAR-T细胞本身在小鼠体内的存活周期和肿瘤免疫抑制性微环境限制了CAR-T细胞的体内抗肿瘤活性，导致了肿瘤复发。

实施例4：uPAR CAR-T细胞在体内显示治疗功效

为更进一步模拟实际的肺癌临床情形，我们构建了原位异种移植物小鼠模型和颅内转移癌异种移植小鼠模型，以考察所构建的uPAR CAR-T细胞分别对未扩散的浸润前NSCLC肺癌以及转移性NSCLC肺癌的治疗功效。在这些小鼠模型中，均获得了类似良好治疗结果。构建的uPAR CAR-T细胞在体内抑制肿瘤生长，同时在体外表现出优异的抗肿瘤活性(图9-12)。Wilcoxon秩和检验的统计结果见表2。

表2

辐射率P值基于Wilcoxon秩和检验。EXCEL Kaplan-Meier和非参数Wilcoxon p值用于存活曲线比较。NT＝未转导的T细胞；CAR-T＝uPAR CAR-T细胞；皮下＝皮下接种模型；肺＝浸润前模型；脑＝转移模型。

实施例5：使用高通量RNA测序分析差异表达基因

为探究uPAR CAR-T细胞在体内和体外具有肿瘤抑制活性的原因，采用高通量RNA测序检测了与H460细胞共培养前后的CAR-T细胞之间的差异表达基因。与未进行共培养的CAR-T细胞相比，在与H460细胞共培养4小时的CAR-T细胞中，发现1280个上调基因和664个下调基因(图13)。对表达差异最大的前400个差异表达基因进行Gene Ontology分析。结果发现，在与靶肿瘤细胞共培养的CAR-T中，表达上调的基因与如下生物过程(BP),分子功能(MF)和细胞成分(CC)相关：细胞对干扰素-γ的反应、免疫反应、炎症反应、以及肿瘤坏死因子激活受体活性；而与以下方面相关的基因表达相对较低：基因表达调控、DNA复制、有丝分裂细胞周期G1/S转换、蛋白结合和纺锤体极体(spindle pole)(图14)。此外，与肿瘤细胞共培养的CAR-T细胞中，上调和下调的基因大多富集在细胞外区域和细胞膜中。在蛋白质-蛋白质相互作用(PPI)分析后，我们发现一个包含30个基因的簇位于上调的PPI网络的中心，包括CD274(即PD-L1)和PDCD1LG2(即PD-L2)、IL2、IL9、IFN-γ、TNFRSF9以及Th17A通路相关趋化因子基因CXCL1、CXCL5和CXCL8(图15a)。进一步，我们也发现，在共培养30分钟的CAR-T细胞和共培养4小时的CAR-T细胞中，有133个基因在两者中均上调，有22个基因在两者中均下调(图15b和15c)。

为了确认RNA-seq结果，我们在将CAR-T细胞与H460细胞共培养30分钟和4小时后收集CAR-T细胞，然后通过RT-qPCR检测了一些候选基因。结果发现，与H460细胞共培养前相比，CAR-T细胞与H460细胞共培养后，IL2、IL9、IFN-γ、TNFRSF9和IL17A基因以及Th17A相关趋化因子基因如CXCL1、CXCL5和CXCL8的表达显著升高(图16a和图16b)。

实施例6：CAR-T细胞的抗肿瘤活性受到PD-1/PD-L1轴的限制

据报道，T细胞在肿瘤部位受到多种机制的抑制，其中PD-1/PD-L1轴介导的功能抑制起关键作用[15-17]。为理解设计的三代uPAR CAR-T细胞是否会受到PD-1/PD-L1轴的限制，我们在两个不同的时间点检测了与H460细胞共培养的CAR-T细胞中PD-1的mRNA水平。如图17a所示，与未经共培养的CAR-T细胞相比，与H460细胞共培养30分钟和4小时后的CAR-T细胞表达显著增加的PD-1和PDCD1LG2；而且，与未经共培养的肿瘤细胞相比，共培养后的H460细胞也表达了显著增加的PD-L1。此外，在CAR-T细胞与H460细胞和uPAR+A549细胞共培养48小时后，也观察到了PD-1和Lag-3水平的明显上升(图17b)。

为了进一步证实PD-1/PD-L1轴对CAR-T细胞抗肿瘤活性的抑制，我们通过siRNA敲低了肿瘤细胞中的PD-L1(如图18a和18b所示)，然后进行了体外杀伤试验，并与未敲低PD-L1的肿瘤细胞比较。如图18d所示，在肿瘤细胞中的PD-L1被敲低后，观察到共培养的CAR-T细胞的肿瘤裂解活性增加(E:T＝2.5:1)，且如图18c和18e所示，IFN-γ分泌水平和细胞膜表面的CD107a水平也增加(E:T＝10:1)。

实施例7：PD-L1抗体联合uPAR CAR T细胞对肺癌患者来源的异种移植(PDX)模型具有治疗作用

患者来源的异种移植(PDX)模型，由注射来自肺癌患者的原发性肿瘤活检物而非人细胞系构建，用于评估CAR-T细胞体内疗效。将来自肺腺癌患者的肿瘤组织，接种到BALB/C-nu/nu小鼠中，进行PDXs(P0)建模。三周后，将肿瘤组织从PDXs(P0)中分离出来，并再次接种BALB/C-nu/nu小鼠中，用于建立PDXs(P1)模型。见图19a所示。在PDXs(P1)建模三天后，用NT(未转导的T细胞)对照、uPAR CAR-T细胞单独、或uPAR CAR-T细胞与PD-1抗体的联合，连续三天治疗荷瘤小鼠。如图19b-19d显示，与仅应用CAR-T细胞相比，PD-1抗体联合治疗显著更好地抑制了肿瘤生长。

讨论

肺癌是全球主要的公共健康问题，在过去几十年中一直是最常被诊出的癌症，并且多达40％的肺癌患者会出现脑转移[Schabath,M.B.and M.L.Cote,Cancer Progressand Priorities:Lung Cancer.Cancer Epidemiol Biomarkers Prev,2019.28(10):p.1563-1579]。肺癌在组织学上可分为两种主要亚型：小细胞肺癌(SCLC)和非小细胞肺癌(NSCLC)[Thai,A.A.,et al.,Lung cancer.Lancet,2021.398(10299):p.535-554]。NSCLC约占确诊肺癌病例的85％，可进一步分为腺癌、鳞状细胞癌和大细胞癌[Connolly,B.M.,etal.,Selective abrogation of the uPA-uPAR interaction in vivo reveals a novelrole in suppression of fibrin-associated inflammation.Blood,2010.116(9):p.1593-603；和Amor,C.,et al.,Senolytic CAR T cells reverse senescence-associated pathologies.Nature,2020.583(7814):p.127-132]。尽管在过去20年中手术治疗、化学疗法和放射疗法在NSCLC的治疗中取得了一定的进展，导致NSCLC患者的生存时间增加，但由于肿瘤突变负担和该疾病的异质性，NSCLC的预后并没有显著改善。因此，探索延长患者生存时间的新策略势在必行。

CAR-T细胞疗法在治疗血液癌症方面已在临床上取得成功，但在肺癌等实体瘤上的应用并不理想[Larson,R.C.and M.V.Maus,Recent advances and discoveries in themechanisms and functions of CAR T cells.Nat Rev Cancer,2021.21(3):p.145-161；Rosenberg,S.A.and N.P.Restifo,Adoptive cell transfer as personalizedimmunotherapy for human cancer.Science,2015.348(6230):p.62-8；和Leko,V.andS.A.Rosenberg,Identifying and Targeting Human Tumor Antigens for T Cell-BasedImmunotherapy of Solid Tumors.Cancer Cell,2020.38(4):p.454-472]。目前对于用于实体瘤的CAR分子的设计，已经提出，针对不同的具体肿瘤类型和靶抗原，从CAR-T的胞外抗原结构域的亲和力和特异性，到胞内信号传导结构域的性质、数量和排列方式，都可能潜在地对治疗功效产生影响。而另一方面，临床前研究中采用的基于细胞的体外和离体试验，尽管可以在一定程度上体现候选CAR-T细胞的活性，但仍然很难反映CAR-T细胞的体内治疗功效。因此，预测CAR-T细胞疗效常常需要建立在合适的动物模型基础上。而这众多的因素都导致了，在肺癌等实体瘤的治疗应用中，CAR-T分子的设计及其功效评估，仍是CAR-T治疗领域所需持续面对的一个挑战。

实体瘤的生物学异质性是导致CAR-T治疗失败的一个重要因素。对此，已经提出了一些用于改善临床效应和安全性的方法。例如，一种方式是，在CAR-T治疗前，使用增加癌细胞上靶抗原表达的药物，处理患者，以提高CART功效。另一种是，对CAR分子进行工程化改造，以增强其对呈现较低靶抗原密度的癌细胞的T细胞活性。前者受此类药物的可得性及其相关功效/毒性的限制。后者则对CAR分子的设计提出了较高的要求。

在致力于肺癌治疗的一系列研究中，我们发现，在非小细胞肺癌患者群中存在uPAR阳性和阴性患者亚群之分，且uPAR的高表达与人NSCLC肺癌患者的存活率相关联。基于此，我们构建了靶向uPAR的第三代CAR分子，并在体外和体内评估了其对NSCLC肿瘤的抑制能力。转导所述CARs的T细胞在体外和多种异种移植小鼠模型中均表现出了优异的抗NSCLC肿瘤活性，由此为临床肺癌治疗提供了强有力的候选工具。

CAR-T细胞的抗肿瘤效率受多种因素影响，例如，靶向抗原的亲和力、CAR-T细胞的终末分化程度、以及体内脱靶毒性和寿命[Wang,E.,et al.,Improving the therapeuticindex in adoptive cell therapy:key factors that impact efficacy.J ImmunotherCancer,2020.8(2)]。在我们的研究中，CAR-T细胞受肿瘤细胞刺激后，IL2、IL9和IFN-γ表达上调。此外，我们也注意到，IL17A及与其相关的趋化因子如CXCL1、CXCL5和CXCL8的表达也增加。这些因子的表达增加，可部分地解释本发明CAR-T细胞的强抗肿瘤功能。

另一方面，在异种移植小鼠模型实验中，我们也注意到，尽管归结于设计的CAR-T细胞的强抗肿瘤能力，在CAR-T细胞治疗后一段时间内，大多数受试小鼠的肿瘤体积会减少到几乎不再能够检测到的程度，但在大约一个月后肿瘤在部分小鼠中仍出现了复发。而我们对分离自复发肿瘤的肿瘤细胞进行的体外试验显示，所用的CAR-T细胞仍保持了对这些分离的肿瘤细胞的裂解活性。这提示，CAR-T细胞在体内的疗效受到了某种限制，原因可能是多种的，例如，肿瘤免疫抑制性微环境、CAR-T细胞在体内的短生存期。

为了进一步改善该三代CAR-T细胞的NSCLC体内治疗功效，我们研究了，在肿瘤细胞刺激CAR-T细胞后，PD-1/PD-L1轴在CAR-T细胞和肿瘤细胞上的表达变化。结果显示，PD-1和PD-L1均显著上调，并且PDCD1LG2(细胞程序性死亡蛋白1配体2,PD-L2)也上调。PDCD1LG2是PD-1的第二配体并抑制T细胞活化，也有报道该分子是T细胞功能受到抑制的重要原因之一[Latchman,Y.,et al.,PD-L2 is a second ligand for PD-1and inhibits T cellactivation.Nat Immunol,2001.2(3):p.261-8]。因此，PD-1轴的上调可在一定程度上解释接受本发明CAR-T细胞治疗的荷瘤小鼠在1个月后的肿瘤复发。我们的PD-L1敲除研究和PDX模型研究进一步支持，将PD-1抗体联合本发明CAR-T疗法，作为克服PD-1/PD-L1免疫抑制作用的一种策略。在我们的研究中，也发现，在本发明CAR-T细胞治疗过程中免疫抑制性LAG-3的表达也增加，这提示可以将LAG-3抗体与CAR T细胞联合用于肺癌治疗中以增强疗效。

总之，我们产生了一种在体外和体内都具有治疗作用的三代uPAR CAR分子。本发明的工程化CAR分子，无需联合衰老诱导剂，即可对呈现uPAR抗原的NSCLC癌细胞引起增强的T细胞活性，并在多种NSCLC肺癌动物模型中获得了显著良好的疗法，实现了显著的荷瘤动物总体生存期改善，由此为uPAR阳性NSCLC肺癌患者提供了强有力的治疗选择。

以上所述的实施例仅是对本发明的优选方式进行描述，并非对本发明的范围进行限定，在不脱离本发明设计精神的前提下，本领域普通技术人员对本发明的技术方案做出的各种变形和改进，均应落入本发明权利要求书确定的保护范围内。

本发明的一些实施方案：

1.一种靶向uPAR的嵌合抗原受体(CAR)多肽，所述嵌合抗原受体多肽，从N端到C端，包含：

(i)特异性结合uPAR的胞外抗原结合结构域；

(ii)任选地，铰链区/间隔区；

(iii)跨膜结构域；

(iv)CD28共刺激结构域和4-1BB共刺激结构域的组合；和

(v)CD3ζ信号传导结构域。

2.实施方案1的CAR多肽，其中，所述特异性结合uPAR的胞外抗原结合结构域为抗体或抗体片段，尤其是scFv，

优选地，所述抗原结合结构域包含：SEQ ID NO:3的VL氨基酸序列中的LCDR1-3和SEQ ID NO:4的VH氨基酸序列中的HCDR1-3(尤其是Kabat定义的CDR序列，或SEQ ID NOs:13-18中所示的LCDR1-3和HCDR1-3序列)，再优选地，包含SEQ ID NO:3的VL和SEQ ID NO:4的VH，

再优选地，所述抗原结合结构域为包含SEQ ID NO:2或与其具有至少90％、92％、95％、96％、97％、98％、99％或以上的同一性的氨基酸序列的scFv。

3.实施方案1-2任一项的CAR多肽，其中，所述铰链区/间隔区选自：来自IgG的铰链区或来自CD8α或CD28胞外区的间隔区，且优选是人CD8α间隔区或CD28间隔区，例如，包含SEQ ID NO:6所示氨基酸序列的CD28间隔区。

4.实施方案1-3任一项的CAR多肽，其中，所述跨膜结构域选自：CD4,CD8，CD28和CD3ζ的跨膜结构域，且优选是人CD8跨膜结构域或CD28跨膜结构域，或者，其中所述跨膜结构域包含SEQ ID NO:7或22所示的氨基酸序列。

5.实施方案1-4任一项的CAR多肽，其中，所述CD28共刺激结构域包含SEQ ID NO:11所示氨基酸序列。

6.实施方案1-5任一项的CAR多肽，其中，所述4-1BB共刺激结构域包含SEQ ID NO:10所示氨基酸序列。

7.实施方案1-6任一项的CAR多肽，其中，所述CD3ζ信号传导结构域包含SEQ IDNO:12所示氨基酸序列。

8.实施方案1-6任一项的CAR多肽，其中，所述CAR多肽，从N端到C端，包含：

(a)SEQ ID NO:2所示的抗uPAR scFv；

(b)SEQ ID NO:6所示的CD28间隔区和SEQ ID NO:7所示的CD28跨膜结构域；

(iv)SEQ ID NO:12所示的CD3ζ信号传导结构域，

9.一种核酸分子，其特征在于，编码实施方案1-8中任一项所述的嵌合抗原受体多肽，优选地，其中所述嵌合抗原受体多肽的uPAR胞外抗原结合结构域由SEQ ID NO:1的核苷酸序列编码、或由与其具有至少95％、96％、97％、98％、99％或99.5％同一性的核苷酸序列编码。

10.一种重组载体，其特征在于，包含实施方案9所述的核酸分子，例如，所述载体选自DNA载体、RNA载体、慢病毒载体、腺病毒载体或逆转录病毒载体，优选地，逆转录病毒载体。

11.一种宿主细胞，其特征在于，包含实施方案1-8中任一项所述的嵌合抗原受体多肽、实施方案9所述的核酸分子、或实施方案10所述的载体，其中所述细胞优选是免疫效应细胞，例如T细胞或NK细胞，例如，所述T细胞是自体T细胞或同种异体T细胞。

12.一种CAR-T细胞，其中所述细胞包含实施方案1-8中任一项所述的嵌合抗原受体多肽或实施方案9所述的核酸分子。

13.一种药物组合物，其包含药学上可接受的载体以及实施方案1-8中任一项所述的嵌合抗原受体多肽、实施方案9所述的核酸分子、实施方案11所述的重组细胞、或实施方案12所述的CAR-T细胞。

14.实施方案13的药物组合物，所述药物组合物还包括PD-1抑制剂或PD-L1抑制剂，优选抗PD-1抗体。

15.一种工程化免疫效应细胞在制备用于在有需要的个体中治疗uPAR阳性非小细胞肺癌(NSCLC)的药物中的用途，其中所述工程化免疫效应细胞包含实施方案1-8中任一项所述的靶向uPAR的嵌合抗原受体多肽。

16.一种治疗非小细胞肺癌(NSCLC)的方法，包括向有需要的个体施用包含实施方案1-8中任一项所述的靶向uPAR的嵌合抗原受体多肽的工程化免疫效应细胞。

17.根据实施方案15的用途或根据实施方案16的方法，其中，所述免疫效应细胞是T细胞。

18.根据实施方案17的用途或方法，其中，所述NSCLC是大细胞肺癌、腺癌或鳞状细胞癌。

19.根据实施方案17的用途或方法，其中，所述个体具有浸润前癌或者原位癌，或转移性癌，例如脑转移。

20.根据实施方案17的用途或方法，其中，所述个体是亚种人，例如中国人。

21.根据实施方案17的用途或方法，其中，所述个体为30岁以上的成年个体，或者60岁以上的成年个体。

22.根据实施方案17-18的用途或方法，其中，还包括向所述个体施用免疫检测点抑制剂，例如PD-1或PD-L1抑制剂或LAG-3抑制剂，例如，在所述CAR-T细胞施用之前、期间和/或之后，施用一剂或多剂PD-1抑制剂，尤其是抗PD-1抗体。

23.根据实施方案17-19的用途或方法，其中，在施用所述CAR-T细胞前，通过免疫组织化学染色，在来自个体的肿瘤活检物上，确定肿瘤的uPAR阳性表达率，

优选地，所述个体具有uPAR阳性表达率为25％到80％或以上的NSCLC肿瘤，即，大约25-80％或以上的肿瘤细胞在细胞表面呈现uPAR阳性表达。

序列表

Claims

1.一种靶向uPAR的嵌合抗原受体(CAR)多肽，其由SEQ ID NO: 21的氨基酸23至氨基酸529的序列组成。

2.一种核酸分子，其特征在于，编码根据权利要求1所述的嵌合抗原受体多肽。

3.一种重组载体，其特征在于，包含根据权利要求2所述的核酸分子。

4.根据权利要求3所述的重组载体，其中，所述载体选自DNA载体和RNA载体。

5.根据权利要求3所述的重组载体，其中，所述载体选自慢病毒载体、腺病毒载体或逆转录病毒载体。

6.根据权利要求5所述的重组载体，其中，所述载体是逆转录病毒载体。

7.一种宿主细胞，其特征在于，包含根据权利要求1所述的嵌合抗原受体多肽、根据权利要求2所述的核酸分子、或根据权利要求3-6中任一项所述的重组载体。

8.根据权利要求7所述的宿主细胞，其中所述细胞是免疫效应细胞。

9.根据权利要求8所述的宿主细胞，其中所述细胞是T细胞或NK细胞。

10.根据权利要求9所述的宿主细胞，其中所述T细胞是自体T细胞或同种异体T细胞。

11.一种CAR-T细胞，其中所述细胞包含根据权利要求1所述的嵌合抗原受体多肽或根据权利要求2所述的核酸分子。

12.一种药物组合物，其包含药学上可接受的载体以及根据权利要求1所述的嵌合抗原受体多肽、根据权利要求2所述的核酸分子、根据权利要求7-10中任一项所述的宿主细胞、或根据权利要求11所述的CAR-T细胞。

13.根据权利要求12所述的药物组合物，其中所述药物组合物还包括PD-1抑制剂或PD-L1抑制剂。

14.根据权利要求13所述的药物组合物，其中所述药物组合物还包括抗PD-1抗体。

15.一种工程化免疫效应细胞在制备用于在有需要的个体中治疗uPAR阳性非小细胞肺癌(NSCLC)的药物中的用途，其中所述工程化免疫效应细胞包含根据权利要求1所述的靶向uPAR的嵌合抗原受体多肽。

16.根据权利要求15所述的用途，其中，所述免疫效应细胞是T细胞。

17.根据权利要求16所述的用途，其中，所述NSCLC是大细胞肺癌、腺癌或鳞状细胞癌。

18.根据权利要求16所述的用途，其中，所述个体具有浸润前癌或者原位癌，或转移性癌。

19.根据权利要求18所述的用途，其中，所述个体具有NSCLC的脑转移。

20.根据权利要求16所述的用途，其中，所述个体是亚州人。

21.根据权利要求20所述的用途，其中，所述个体是中国人。

22.根据权利要求16所述的用途，其中，所述个体为30岁以上的成年个体。

23.根据权利要求16所述的用途，其中，所述个体是60岁以上的成年个体。

24.根据权利要求16-23中任一项所述的用途，其中，所述药物还包括免疫检测点抑制剂。

25.根据权利要求24所述的用途，其中所述免疫检测点抑制剂为PD-1或PD-L1抑制剂或LAG-3抑制剂。

26.根据权利要求25所述的用途，其中，所述工程化免疫效应细胞为CAR-T细胞，且其中所述药物配制为在所述CAR-T细胞施用之前、期间和/或之后施用一剂或多剂PD-1抑制剂的形式。

27.根据权利要求26所述的用途，其中，所述PD-1抑制剂是抗PD-1抗体。

28.根据权利要求16所述的用途，其中，所述工程化免疫效应细胞为CAR-T细胞，且其中在施用所述CAR-T细胞前，通过免疫组织化学染色，在来自个体的肿瘤活检物上，确定肿瘤的uPAR阳性表达率。

29.根据权利要求28所述的用途，其中，所述个体具有uPAR阳性表达率为25%到80%或以上的NSCLC肿瘤，即，25-80%或以上的肿瘤细胞在细胞表面呈现uPAR阳性表达。