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CN113980138B - EphA2嵌合抗原受体以及其用途 - Google Patents

EphA2嵌合抗原受体以及其用途 Download PDF

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CN113980138B CN202110919075.XA CN202110919075A CN113980138B CN 113980138 B CN113980138 B CN 113980138B CN 202110919075 A CN202110919075 A CN 202110919075A CN 113980138 B CN113980138 B CN 113980138B
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Abstract

本发明涉及特异性结合EPHA2的新型嵌合抗原受体以及其用途。

Description

EphA2嵌合抗原受体以及其用途
本发明一般地涉及被工程化以表达EphA2嵌合抗原受体(CAR)的T细胞用于治疗与EphA2的表达相关的疾病的用途。
发明背景
胶质母细胞瘤(Glioblastoma，GBM)是人类最常见、最具侵袭性的原发性恶性脑肿瘤，大多数病例恶性程度比较高。由于高发病率、高死亡率和低治愈率，GBM在世界范围内造成了巨大的社会和医疗负担，而且几乎无法用传统的治疗方法治愈，因此患者总体生存期很不理想。具体而言，目前现有的标准化治疗策略，是最大安全限度的手术切除肿瘤，术后同步放疗和化疗，以及随后六个月的替莫唑胺辅助化疗的标准治疗方案。然而，患者平均生存期仅为14.6个月。
因此，有必要开发治疗GBM的新方法，以改善GBM患者的预后。
嵌合抗原受体(CAR)修饰的T细胞为治疗GBM提供了一种新的途径，它突破了抗原需要被MHC分子呈递的限制，克服了血脑屏障的障碍。CAR是一种人工合成的分子，通过特异性识别肿瘤细胞表面表达的抗原来引导T细胞清除肿瘤。CAR的结构包括细胞外肿瘤抗原结合区、铰链区、跨膜区和细胞内信号域。表达CAR的T细胞可以通过胞外区的单链可变区(ScFv)直接识别肿瘤相关抗原，然后激活细胞内信号转导，释放穿孔素、颗粒酶、干扰素-γ和肿瘤坏死因子等多种细胞因子，诱导肿瘤细胞凋亡。因此，CAR-T细胞以非MHC依赖的方式发挥作用，巧妙地结合了抗体特异性识别抗原的能力和T淋巴细胞的细胞毒作用。CAR T细胞治疗首次应用于血液系统B细胞恶性肿瘤的治疗，取得了良好的效果。美国和欧洲已有两种治疗血液系统恶性肿瘤的新药(Kymrial和Yescata)。然而，CAR T细胞治疗实体瘤的效果并不确切，大多仍处于研究和实验阶段。
其中，一些治疗GBM的CAR T候选靶点已被用于评估安全性和可行性，如IL-13受体亚单位α2(IL13Rα2)、人表皮生长因子受体2(HER2)和表皮生长因子受体变异体III(EGFRvIII)，它们已初步显示出令人鼓舞的抗肿瘤效果。生促红素人肝细胞受体2(EphA2)是Eph酪氨酸激酶受体之一，在多种发育、生理、免疫以及疾病过程中发挥重要作用。最近的研究表明，EphA2的过表达与多种肿瘤的预后不良有关，如食管癌、卵巢癌和肺癌。EphA2在GBM中高表达，但在正常脑中低表达，这使得EphA2成为开发新的治疗策略的一个有吸引力的靶点。
同时，由于CAR-T疗法在实体瘤治疗研究中表现出的疗效的不确定性，本领域也需要在一定程度上预测CAR-T抗肿瘤活性的方法或工具。
发明概述
本发明针对不同的EphA2表位产生了两种第三代CAR,不同的CAR转导的T细胞表现出不同的GBM抑制效应。利用高通量RNA测序揭示其分子机制，并获得用于预测CAR T细胞抗肿瘤效果的基因表达模式列表。
因此，在一些方面，本发明涉及结合EphA2的嵌合抗原受体，以及包含其的T细胞。
在一些方面本发明还涉及编码所述嵌合抗原受体的核酸、包含其的表达载体、病毒和T细胞。
本发明还涉及包含嵌合抗原受体的T细胞的用途，用于治疗肿瘤。
本发明还涉及预测CAR T细胞抗肿瘤效果的基因标志物，以及相应的预测方法和试剂盒。
在一个实施方案中，提供了一种分离的的嵌合抗原受体，所述的嵌合抗原受体包含顺序连接的：胞外结合区，跨膜区和包含共刺激结构域的胞内信号区，其中所述胞外结合区结合EPHA2，并且胞外结合区包含HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2和LCDR3。在一个具体的实施方案中，所述HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2和LCDR3分别具有SEQ ID NO:1、2、3、9、10和11的序列；在另一个具体的实施方案中，所述HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2和LCDR3分别具有SEQ ID NO:4、5、6、12、13和14的序列。
在另一个实施方案中，所述胞外结合区包含VH，所述VH包含以下氨基酸序列或由以下氨基酸序列组成：SEQ ID NO:7或SEQ ID NO:8。
在另一个实施方案中，所述胞外结合区包含VL，所述VL包含以下氨基酸序列或由以下氨基酸序列组成：SEQ ID NO:15；或SEQ ID NO:16。
在另一个实施方案中，所述胞外结合区包含VH和VL，所述VH和VL分别包含以下氨基酸序列或由以下氨基酸序列组成：SEQ ID NO:7和15；或SEQ ID NO:8和16。
在另一个实施方案中，所述结合EPHA2的胞外结合区是抗体或其抗原结合片段，例如scFv。
在另一个实施方案中，所述scFv包含VH和VL，优选地，所述VH和VL分别包含以下氨基酸序列或由以下氨基酸序列组成：SEQ ID NO:7和15，或SEQ ID NO:8和16；更优选地，所述VH和VL之间通过接头连接。
在另一个实施方案中，所述scFv包含选自SEQ ID NO:17-20任一项所示的氨基酸序列或与所述序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列或由所述氨基酸序列组成。
在另一个实施方案中，所述的跨膜区是包含CD28的跨膜区，优选的，跨膜区包含SEQ ID NO:23的氨基酸序列或由其组成。
在一些实施方案中，任选地，所述跨膜区经由铰链区连接至胞外结合区，优选地，铰链区包含SEQ ID NO:21的氨基酸序列或由其组成。
在另一个实施方案中，所述的胞内信号区包含CD3ζ的信号传导结构域(例如包含SEQ ID NO:26所示的序列或与之具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的同一性的氨基酸序列或由其组成)和共刺激结构域，优选地，所述共刺激结构域是从4-1BB(CD137)蛋白得到的功能性信号传导结构域；或优选地，所述共刺激结构域是从CD28蛋白得到的功能性信号传导结构域；或优选地，所述共刺激结构域包含源自CD28和4-1BB的两者。
在另一个实施方案中，所述共刺激结构域在CD3ζ的信号传导结构域之前。
在一个实施方案中，本发明提供了任一前述嵌合抗原受体的编码核酸。
在一个实施方案中，本发明提供了一种表达载体，其包含前述编码核酸。
在另一个实施方案中，所述的表达载体来源于逆转录病毒质粒；优选地，所述逆转录病毒质粒是SFG。
在一个实施方案中，本发明提供了一种病毒，其包含任一前述载体。
在一个实施方案中，本发明提供了一种T细胞，其转导有任意前述的编码核酸，或任意前述的表达载体或任意前述的病毒，优选地，所述T细胞是T淋巴细胞。
在一个实施方案中，本发明提供了一种T细胞，其表面表达任意前述的嵌合抗原受体，优选地，所述T细胞是T淋巴细胞。
在一个实施方案中，本发明提供了在受试者中预防或治疗肿瘤(例如癌症)或提供抗肿瘤免疫的方法，其包括给所述的受试者施用有效量的表达任意前述的嵌合抗原受体的细胞,或任意前述的T细胞。
在另一个实施方案中，所述的肿瘤(例如癌症)患者中具有(例如升高水平的，例如核酸或蛋白质水平的)EPHA2，优选地，所述肿瘤为胶质瘤，更优选地，所述肿瘤为胶质母细胞瘤。
在另一个实施方案中，所述细胞与一种或多种其它疗法例如治疗方式和/或其它治疗剂组合施用。在一个具体的实施方案中，所述其它治疗剂是化疗剂、细胞因子、细胞毒性剂、治疗性单克隆抗体、小分子药物、免疫调节剂(例如免疫抑制剂)或其任意组合。在一个优选的实施方案中，所述其他治疗剂是治疗性单克隆抗体，更优选地是PD-1抗体。
在另一些实施方案中，本发明提供了前述任一实施方案所述的嵌合抗原受体、核酸、载体、病毒或细胞的用途，用于制备药物。所述药物用于预防或治疗肿瘤。优选地，所述肿瘤具有(例如升高水平的，例如核酸或蛋白质水平的)EPHA2，优选地，所述肿瘤为胶质瘤，更优选地，所述肿瘤为胶质母细胞瘤。
在一些进一步的实施方案中，所述药物是单独使用，或与一种或多种其它疗法例如治疗方式和/或其它治疗剂组合施用。在一个具体的实施方案中，所述其它治疗剂是化疗剂、细胞因子、细胞毒性剂、治疗性单克隆抗体、小分子药物、免疫调节剂(例如免疫抑制剂)或其任意组合。在一个优选的实施方案中，所述其他治疗剂是治疗性单克隆抗体，更优选地是PD-1抗体。
在一个实施方案中，本发明提供了预测CAR-T细胞治疗肿瘤的疗效的方法，包括在样本中检测IFN-γ的存在水平。优选地，所述样本来源于CAR-T细胞体外培养上清；或者，所述样本来源于CAR-T细胞治疗后受试者的血清。
在一个实施方案中，本发明提供了检测样本中IFN-γ存在水平的试剂在制备试剂盒中的用途，其中，所述试剂盒用于：
i)预测CAR-T细胞治疗肿瘤的疗效；或
ii)预测肿瘤的治疗或预防方法的效果，其中所述方法涉及将CAR-T施用于受试者。
优选地，所述样本来源于CAR-T细胞体外培养上清；或者，所述样本来源于CAR-T细胞治疗后受试者的血清。
优选地，所述试剂是特异性针对IFN-γ的抗体；更优选地，检测样本中IFN-γ存在水平是通过ELISA方法。
在另一个实施方案中，所述试剂包含至少两种特异性针对IFN-γ的抗体。
在另一个实施方案中，所述制备试剂盒的用途中的CAR-T细胞是任意前述的细胞。
在另一个实施方案中，所述肿瘤的治疗或预防方法是任意前述的方法。
附图说明：
图1.EphA2特异性CAR T细胞。(A)两种不同的针对EphA2的嵌合抗原受体(CARs)示意图(已经构建在病毒载体中)。所述CAR由EphA2 scFv、铰链、CD28的跨膜(TM)区、CD28和4-1BB信号域以及人类CD3ζ链组成。(B)用western blot对CAR-T细胞总蛋白进行检测，用CD3ζ抗体检测全长EphA2-CARs的表达。(C)用CFSE标记不同的EphA2-CAR T细胞，然后与U251细胞共培养72小时，T细胞的增殖程度由结合的CFSE的减少来反映。(D)CAR-T细胞与U251细胞共培养15天，E：T比例为2：1。每三天用新鲜的U251细胞刺激T细胞，并在加入U251细胞之前对T细胞进行计数。结果用student’s t检验进行分析，P<0.05被认为具有统计学差异显著性。*p<0.05，***p<0.001。SD，剪接供体；SA，剪接受体。
图2.不同EphA2-CAR T细胞的抗肿瘤效果比较在体外。将未转导的T细胞(NT)或EphA2-CAR T细胞与不同的目标细胞以不同的效靶比例(1:1,2.5:1,5:1和10:1)共同培养24小时。(A)通过检查荧光素酶的活性来量化细胞裂解率。(B)收集上清液，通过ELISA(E：T＝10：1)评估IFN-γ水平。(C)通过xCELLigence阻抗系统监测细胞指数值的连续图形输出，直到50小时的时间点。结果通过单因素方差分析，P<0.05被认为具有统计学差异显著性。*P<0.05,**P<0.01,***P<0.001。
图3.不同EphA2 CAR T细胞在异种移植小鼠模型中的抗肿瘤效果比较。A.将5×106个eGFP-Luc-U251细胞皮下注射到6-8周龄的雌性NOD-SCID小鼠的左腹。注射10天后，用3×107个EphA2 CAR T细胞直接注射到肿瘤中，用未转染的T细胞(NT)作为对照，对肿瘤小鼠进行治疗。用IVIS系统监测肿瘤的生长，以肿瘤直径2厘米为终点。所有小鼠的定量生物发光(辐射度＝光子/cm2/sr)成像数据显示。使用Kaplan-Meier方法测量GBM异种移植小鼠的总生存率，用Cox比例危险回归分析进行分组比较。小于0.05的P值被认为具有统计学差异显著性。(B)麻醉6至8周大的NOD-SCID小鼠，然后通过颅骨上的钻孔将2×105个细胞注射到左纹状体。肿瘤细胞注射两周后，通过尾静脉注射3×107个CAR-T细胞，然后用体内成像系统IVIS监测肿瘤的生长。所有小鼠的定量生物发光(辐射度＝光子
/cm2/sr)成像数据显示。使用Kaplan-Meier方法测量GBM异种移植小鼠的总生存率，用Cox比例危险回归分析进行分组比较。小于0.05的P值被认为具有统计学差异显著性。
图4.共同培养后差异表达基因的Gene Ontology富集分析。使用在线生物信息学工具DAVID Bioinformatics Resources 6.8对两个CAR-T细胞之间差异表达的基因进行GO分析。基因富集分析采用了Fisher's精确检验。BP，生物过程；CC，细胞成分；MF，分子功能。
图5.低IFN-γ和CXCL8水平与EphA2-CAR-T细胞中更高的抗肿瘤活性有关。在与GBM细胞共培养之前或之后，对EphA2 CAR-T细胞进行RT-qPCR检测IFN-γ、CXCL8、IL-21、CXCR1和CXCR2的表达。结果用单因素方差分析，P<0.05为显著。*P<0.05，**P<0.01。
图6.EphA2-b CAR T细胞诱导了GBM细胞中PD-L1的上调表达。(A)GBM细胞与CAR-T细胞以2:1的E:T比例共同培养30分钟和4小时，然后对GBM细胞进行RT-qPCR检测PD-L1水平。(B)通过免疫组织化学检测CAR-T细胞治疗的小鼠肿瘤中的PD-L1和Ki-67水平。结果进行单因素方差分析，P<0.05被认为是显著的。*P<0.05,**P<0.01,***P<0.001。
图7.EphA2-b CAR-T治疗与PD1阻断相结合，表现出更强的抗肿瘤活性。U251和U373用IFNGR1、IFNGR2或PG-L1之中一个的siRNAs瞬时转染，单独敲除其表达(A和B)，然后以E:T＝1:1的方式对细胞进行体外杀伤试验。通过检测荧光素酶的活性来确定细胞的裂解率(C)。
NOD-SCID小鼠皮下注射1×107个U251.eGFP.Luc细胞，构建异种移植小鼠模型。肿瘤异种移植后5天，用总共3×107个CAR T细胞或非转录的对照T细胞对小鼠进行瘤周治疗，然后在瘤周(p.t.)给予200μg PD1抗体。在第13天，给小鼠注射第二剂量的PD1抗体，然后用IVIS监测肿瘤的生长(D、E和F)。
图8.实验工作流程和预设的EphA2-a-CAR T细胞处理后更好的抗肿瘤疗效模型。
图9.GBM细胞为EphA2阳性。三种GBM细胞系(U251,U87和U373)和K562用EphA2抗体染色，然后用流式细胞仪检查细胞表面EphA2的表达。
图10.EphA2-a和EphA2-b-CAR T细胞具有相似的CAR转染效率和CD4/CD8比例。用IgG F(ab′)2片段或CD4和CD8抗体对EphA2CAR-T细胞进行染色，然后用流式细胞仪测定CAR阳性细胞的百分比和细胞表面CD4和CD8水平。结果用student’s t检验进行分析，P<0.05被认为是显著的。n.s，不显著。
图11.EphA2 CAR-T细胞与U251细胞共培养前后的差异表达基因。
图12.EphA2-a CAR-T细胞中200个上调最多的基因的蛋白质-蛋白质相互作用分析。
图13.EphA2-a CAR-T细胞中200个下调最多的基因的蛋白质-蛋白质相互作用分析。
图14.细胞结合试验。用无菌PBS清洗CAR-T细胞两次，然后用0.5μM CSFE溶液染色。阻断和清洗后，将CAR-T细胞与预置的GBM细胞在37℃下孵化5分钟。然后用预热的PBS清洗细胞三次，再用4％多聚甲醛固定。捕获洗涤前和洗涤后的图像。重复实验3次，并在至少3个独立的区域计算细胞数。结果用单因素方差分析，P<0.05被认为是显著的。
发明详述
I.定义
在下文详细描述本发明前，应理解本发明不限于本文中描述的特定方法学、方案和试剂，因为这些可以变化。还应理解本文中使用的术语仅为了描述具体实施方案，而并不意图限制本发明的范围，其仅会由所附权利要求书限制。除非另外定义，本文中使用的所有技术和科学术语与本发明所属领域中普通技术人员通常的理解具有相同的含义。
为了解释本说明书，将使用以下定义，并且只要适当，以单数形式使用的术语也可以包括复数，并且反之亦然。要理解，本文所用的术语仅是为了描述具体的实施方案，并且不意欲是限制性的。
术语“约”在与数字数值联合使用时意为涵盖具有比指定数字数值小5％的下限和比指定数字数值大5％的上限的范围内的数字数值。
如本文所用，术语“和/或”意指可选项中的任一项或可选项的两项或多项。
如本文所用，术语“包含”或“包括”意指包括所述的要素、整数或步骤，但是不排除任意其他要素、整数或步骤。在本文中，当使用术语“包含”或“包括”时，除非另有指明，否则也涵盖由所述及的要素、整数或步骤组合的情形。例如，当提及“包含”某个具体序列的抗体可变区时，也旨在涵盖由该具体序列组成的抗体可变区。
本文所用的术语“EphA2”是指EphA2基因，或由该基因所表达的蛋白。EphA2基因名EphA2，全称EPH受体A2，属于蛋白酪氨酸激酶家族的ephrin受体亚家族。Epha2编码基因位于1号染色体短臂。蛋白为976个氨基酸，分子量108kDa,可形成同源二聚体。相互作用蛋白包括SLA,VAV2，VAV3，p85,PTPN11等。其下游所在信号通路由与配体ephrin-A1/EFNA1结合而激活，调节细胞的迁移、整合素介导的粘附、增殖和分化。在正常神经系统中表达较低，在多种肿瘤组织中表达上调。
本文所用的术语“抗EphA2抗体”、“抗EphA2”、“EphA2抗体”或“结合EphA2的抗体”是指这样的抗体，所述抗体能够以足够的亲和力结合(人)EphA2以致所述抗体可以用作靶向(人)EphA2的治疗剂。在一个实施方案中，所述(人)EphA2抗体在体外或体内以高亲和力结合(人)EPHA2。在一些实施方案中，所述结合是例如通过放射性免疫测定(RIA)、生物膜薄层干涉测定法(BLI)、MSD测定法或表面等离子体共振法(SPR)、流式细胞术或细胞结合实验来测量的。
术语“嵌合抗原受体”或备选地“CAR”是指一组多肽，在最简单的实施方案中通常是两组，当其在免疫效应细胞中时，给所述的细胞提供针对靶细胞(通常是癌细胞)的特异性，并且具有细胞内信号产生。在某些实施方案中，CAR包括至少一个胞外结合区、跨膜区和胞内信号区。在某些方面，多肽组彼此邻接。
术语“胞内信号区”是指通过在细胞内传递信息而起作用的蛋白质的功能性部分，用来通过产生第二信使或通过响应这样的信使起效应物作用经由确定的信号传导途径调节细胞的活性。
术语“胞外结合区”是指嵌合抗原受体识别抗原的部分，在一些实施方案中，胞外结合区是来自单克隆抗体的scFv，或dAb(domain antibody)或VHH。
术语“跨膜区”嵌合抗原受体跨越膜的部分。跨膜区可以是在膜中热力学稳定的任何蛋白质结构。这通常是包含几个疏水残基的alpha螺旋。任何跨膜蛋白的跨膜区可以用于提供嵌合受体的跨膜部分，例如跨膜区可以是来自CD8α或CD28的跨膜区，优选的包含SEQID NO:23的氨基酸序列或与其具有至少90％、95％、96％、97％、98％或99％或以上的同一性的序列。
术语“CD3-ζ”，又称为CD247，定义为如GenBan Acc.No.BAG36664.1提供的蛋白质或来自非人类种类(例如小鼠、啮齿类动物、猴子、猿等)的等同残基；“CD3-ζ信号传导结构域”定义为来自CD3-ζ的细胞质结构域的氨基酸残基或其功能性衍生物，其足以在功能上传递T细胞活化所需的起始信号。在一个实施例中，“CD3-ζ信号传导结构域”包含如SEQ IDNO:26提供的序列或与其具有至少90％、95％、96％、97％、98％或99％或以上的同一性的序列。
术语“4-1BB”是指具有如GenBank Acc.No.AAA62478.2提供的氨基酸序列的TNFR超家族的成员，或来自非人类物种例如小鼠、啮齿类动物、猴子、猿等的等同残基。在一个方面，“4-1BB共刺激结构域”被定义为GenBank Acc.No..AAA62478.2的氨基酸残基第214-255位，或来自非人类物种例如小鼠、啮齿类动物、猴子、猿等的等同残基。在一个方面，“4-1BB共刺激结构域”为如SEQ ID NO:25提供的序列或来自非人类物种例如小鼠、啮齿类动物、猴子、猿等的等同残基。
术语“CD28”是指人白细胞分化抗原28，它在NCBI GeneBank的官方名称为CD28，ID号为940，有3个异构体(cDNA序列/蛋白序列)，分别为NM_006139.3/NP_006130.1，NM_001243077.1/NP_001230006.1，NM_001243078.1/NP_001230007.1。如本文使用的，术语“CD28共刺激结构域”包含如SEQ ID NO:24提供的序列或与其具有至少90％、95％、96％、97％、98％或99％或以上的同一性的序列。
本文所用术语“逆转录病毒”是指逆转录病毒即RNA病毒中，作为常用的基因工程/基因治疗载体所使用的那些病毒。在一个具体的实施方案中，本发明所使用的逆转录病毒载体是基于Moloney小鼠白血病病毒(SFG)质粒。常用的逆转录病毒载体是可获得的，并且是本领域技术人员已知的。
术语“抗体片段”包括完整抗体的一部分。在优选的实施方案中，抗体片段为抗原结合片段。
“抗原结合片段”指与完整抗体不同的分子，其包含完整抗体的一部分且结合完整抗体所结合的抗原。抗体片段的例子包括但不限于Fv，Fab，Fab’，Fab’-SH，F(ab’)2；dAb(domain antibody)；线性抗体；单链抗体(例如scFv)；单结构域抗体例如VHH；双价抗体或其片段；或骆驼科抗体。术语“scFv”是指包含至少一个包括轻链的可变区抗体片段和至少一个包括重链的可变区的抗体片段的融合蛋白，其中所述轻链和重链可变区是邻接的(例如经由合成接头例如短的柔性多肽接头)，并且能够以单链多肽形式表达，且其中所述scFv保留其所来源的完整抗体的特异性。除非指定，否则如正如本文中使用的那样，scFv可以以任何顺序(例如相对于多肽的N-末端和C末端)具有所述的VL和VH可变区，scFv可以包括VL-接头-VH或可以包括VH-接头-VL。
“互补决定区”或“CDR区”或“CDR”是抗体可变结构域中在序列上高变并且形成在结构上确定的环(“超变环”)和/或含有抗原接触残基(“抗原接触点”)的区域。CDR主要负责与抗原表位结合。重链和轻链的CDR通常被称作CDR1、CDR2和CDR3，从N-端开始顺序编号。位于抗体重链可变结构域内的CDR被称作HCDR1、HCDR2和HCDR3，而位于抗体轻链可变结构域内的CDR被称作LCDR1、LCDR2和LCDR3。在一个给定的轻链可变区或重链可变区氨基酸序列中，各CDR的精确氨基酸序列边界可以使用许多公知的抗体CDR指派系统的任一种或其组合确定，所述指派系统包括例如：基于抗体的三维结构和CDR环的拓扑学的Chothia(Chothia等人.(1989)Nature342:877-883，Al-Lazikani等人,“Standard conformations for thecanonical structures of immunoglobulins”,Journal of Molecular Biology,273,927-948(1997))，基于抗体序列可变性的Kabat(Kabat等人,Sequences of Proteins ofImmunological Interest,第4版,U.S.Department of Health and Human Services,National Institutes of Health(1987)),AbM(University of Bath)，Contact(University College London)，国际ImMunoGeneTics database(IMGT)(在万维网上imgt.cines.fr/上)，以及基于利用大量晶体结构的近邻传播聚类(affinity propagationclustering)的North CDR定义。
例如，根据不同的CDR确定方案，每一个CDR的残基如下所述。
CDR也可以基于与参考CDR序列(例如本发明示例性CDR之任一)具有相同的Kabat编号位置而确定。
除非另有说明，否则在本发明中，术语“CDR”或“CDR序列”涵盖以上述任一种方式确定的CDR序列。
除非另有说明，否则在本发明中，当提及抗体可变区中的残基位置(包括重链可变区残基和轻链可变区残基)时，是指根据Kabat编号系统(Kabat等人，Sequences ofProteins of Immunological Interest,5th Ed.Public Health Service,NationalInstitutes of Health,Bethesda,Md.(1991))的编号位置。
在一个实施方案中，本发明抗体的重链可变区CDR按照Kabat规则确定
在一个实施方案中，本发明抗体的轻链可变区CDR按照Kabat规则确定。
在一个实施方案中，本发明抗体的重链可变区CDR按照Kabat规则确定；且轻链可变区CDR按照Kabat规则确定。
在另一个可替代的实施方案中，本发明抗体的重链可变区CDR和/或轻链可变区CDR按照非Kabat规则确定，例如按照Chothia、AbM、Contact、IMGT和North等等本领域公知的规则。
应该注意，基于不同的指派系统获得的同一抗体的可变区的CDR的边界可能有所差异。即不同指派系统下定义的同一抗体可变区的CDR序列有所不同。因此，在涉及用本发明定义的具体CDR序列限定抗体时，所述抗体的范围还涵盖了这样的抗体，其可变区序列包含所述的具体CDR序列，但是由于应用了不同的方案(例如不同的指派系统规则或组合)而导致其所声称的CDR边界与本发明所定义的具体CDR边界不同。
具有不同特异性(即，针对不同抗原的不同结合位点)的抗体具有不同的CDR(在同一指派系统下)。然而，尽管CDR在抗体与抗体之间是不同的，但是CDR内只有有限数量的氨基酸位置直接参与抗原结合。使用Kabat,Chothia,AbM、Contact和North方法中的至少两种，可以确定最小重叠区域，从而提供用于抗原结合的“最小结合单位”。最小结合单位可以是CDR的一个子部分。正如本领域技术人员明了，通过抗体的结构和蛋白折叠，可以确定CDR序列其余部分的残基。因此，本发明也考虑本文所给出的任何CDR的变体。例如，在一个CDR的变体中，最小结合单位的氨基酸残基可以保持不变，而根据Kabat或Chothia定义的其余CDR残基可以被保守氨基酸残基替代。
“人源化”抗体是指包含来自非人CDR的氨基酸残基和来自人FR的氨基酸残基的抗体。在一些实施方案中，人源化抗体将包含基本上所有的至少一个、通常两个可变结构域，其中所有或基本上所有的CDR(例如，CDR)对应于非人抗体的那些，并且所有或基本上所有的FR对应于人抗体的那些。人源化抗体任选可以包含至少一部分的来源于人抗体的抗体恒定区。抗体(例如非人抗体)的“人源化形式”是指已经进行了人源化的抗体。
“人抗体”或“全人抗体”或“全人源抗体”可以互换使用，其指具有这样的氨基酸序列的抗体，所述氨基酸序列对应于下述抗体的氨基酸序列，所述抗体由人或人细胞生成或来源于非人来源，其利用人抗体库或其它人抗体编码序列。人抗体的这种定义明确排除包含非人抗原结合残基的人源化抗体。
如本文所用，术语“结合”或“特异性结合”意指结合作用对抗原是选择性的并且可以与不想要的或非特异的相互作用区别。抗原结合位点与特定抗原结合的能力可以通过酶联免疫吸附测定法(ELISA)或本领域已知的常规结合测定法如通过放射性免疫测定(RIA)或生物膜薄层干涉测定法或MSD测定法或表面等离子体共振法(SPR)或细胞结合实验测定。
本文所述的术语“治疗剂”涵盖在预防或治疗肿瘤，例如癌症中有效的任何物质，包括化疗剂、细胞因子、细胞毒性剂、治疗性单克隆抗体、小分子药物或免疫调节剂(例如免疫抑制剂)。
术语“细胞毒性剂”用在本发明中指抑制或防止细胞功能和/或引起细胞死亡或破坏的物质。
“化疗剂”包括在治疗癌症中有用的化学化合物。
术语“小分子药物”是指低分子量的能够调节生物过程的有机化合物。“小分子”被定义为分子量小于10kD、通常小于2kD和优选小于1kD的分子。小分子包括但不限于无机分子、有机分子、含无机组分的有机分子、含放射性原子的分子、合成分子、肽模拟物和抗体模拟物。作为治疗剂，小分子可以比大分子更能透过细胞、对降解更不易感和更不易于引发免疫应答。
本文使用的术语“免疫调节剂”指抑制或调节免疫应答的天然或合成活性剂或者药物。免疫应答可以是体液应答或细胞应答。免疫调节剂包含免疫抑制剂。
本文使用的“免疫抑制剂”、“免疫抑制药物”或“免疫抑制物”是在免疫抑制治疗中用于抑制或阻止免疫系统活性的治疗剂。
术语“有效量”指本发明的抗体或片段或缀合物或组合物或组合的这样的量或剂量，其以单一或多次剂量施用患者后，在需要治疗或预防的患者中产生预期效果。
“治疗有效量”指以需要的剂量并持续需要的时间段，有效实现所需治疗结果的量。治疗有效量也是这样的一个量，其中抗体或抗体片段或其缀合物或组合物或组合的任何有毒或有害作用不及治疗有益作用。相对于未治疗的对象，“治疗有效量”优选地抑制可度量参数(例如肿瘤体积)至少约20％、更优选地至少约40％、甚至更优选地至少约50％、60％或70％。
“预防有效量”指以需要的剂量并持续需要的时间段，有效实现所需预防结果的量。通常，由于预防性剂量在对象中在疾病较早阶段之前或在疾病较早阶段使用，故预防有效量将小于治疗有效量。
“个体”或“受试者”包括哺乳动物。哺乳动物包括但不限于，家养动物(例如，牛，羊，猫，狗和马)，灵长类动物(例如，人和非人灵长类动物如猴)，兔，以及啮齿类动物(例如，小鼠和大鼠)。在一些实施方案中，个体或受试者是人。
如下进行序列之间序列同一性的计算。
为确定两个氨基酸序列或两个核酸序列的同一性百分数，将所述序列出于最佳比较目的比对(例如，可以为了最佳比对而在第一和第二氨基酸序列或核酸序列之一或二者中引入空位或可以为比较目的而抛弃非同源序列)。在一个优选实施方案中，为比较目的，所比对的参考序列的长度是至少30％、优选地至少40％、更优选地至少50％、60％和甚至更优选地至少70％、80％、90％、100％的参考序列长度。随后比较在对应氨基酸位置或核苷酸位置处的氨基酸残基或核苷酸。当第一序列中的位置由第二序列中对应位置处的相同氨基酸残基或核苷酸占据时，则所述分子在这个位置处是相同的。
可以利用数学算法实现两个序列间的序列比较和同一性百分数的计算。在一个优选实施方案中，使用已经集成至GCG软件包的GAP程序中的Needlema和Wunsch((1970)J.Mol.Biol.48:444-453)算法(在http://www.gcg.com可获得)，使用Blossum 62矩阵或PAM250矩阵和空位权重16、14、12、10、8、6或4和长度权重1、2、3、4、5或6，确定两个氨基酸序列之间的同一性百分数。在又一个优选的实施方案中，使用GCG软件包中的GAP程序(在http://www.gcg.com可获得)，使用NWSgapdna.CMP矩阵和空位权重40、50、60、70或80和长度权重1、2、3、4、5或6，确定两个核苷酸序列之间的同一性百分数。特别优选的参数集合(和除非另外说明否则应当使用的一个参数集合)是采用空位罚分12、空位延伸罚分4和移码空位罚分5的Blossum 62评分矩阵。还可以使用PAM120加权余数表、空位长度罚分12，空位罚分4)，利用已经并入ALIGN程序(2.0版)的E.Meyers和W.Miller算法,((1989)CABIOS,4:11-17)确定两个氨基酸序列或核苷酸序列之间的同一性百分数。额外地或备选地，可以进一步使用本文所述的核酸序列和蛋白质序列作为“查询序列”以针对公共数据库执行检索，以例如鉴定其他家族成员序列或相关序列。
术语“抗肿瘤作用”指可以通过多种手段展示的生物学效果，包括但不限于例如，肿瘤体积减少、肿瘤细胞数目减少、肿瘤细胞增殖减少或肿瘤细胞存活减少。
术语“肿瘤”和“癌症”在本文中互换地使用，涵盖实体瘤和液体肿瘤。
术语“癌症”和“癌性”指向或描述哺乳动物中特征通常为细胞生长不受调节的生理疾患。在某些实施方案中，适合于通过本发明的抗体来治疗的癌症包括胃癌或胰腺癌，包括那些癌症的转移性形式。
术语“肿瘤”指所有赘生性(neoplastic)细胞生长和增殖，无论是恶性的还是良性的，及所有癌前(pre-cancerous)和癌性细胞和组织。术语“癌症”、“癌性”和“肿瘤”在本文中提到时并不互相排斥。
术语“胶质瘤”是神经胶质瘤的简称，也称为胶质细胞瘤。胶质瘤是一种中枢神经系统的肿瘤疾病，是指是发生于神经外胚层的肿瘤，其源自神经元细胞或间质细胞的癌变。胶质瘤是颅内最常见的原发性中枢神经系统肿瘤，约占所有颅内原发肿瘤的一半。胶质母细胞瘤是胶质瘤中比较常见的一种类型，又称多形性胶质母细胞瘤(GBM)。胶质母细胞瘤在世界卫生组织对胶质瘤的分级中分Ⅳ级，Ⅳ级胶质瘤是恶性程度最高的胶质瘤。胶质母细胞瘤的发病高峰年龄一般为50—60岁，。
术语“组合疗法”是指施用两种或更多种治疗剂或治疗方式(例如放射疗法或手术)以治疗本文所述疾病。这种施用包括以基本上同时的方式共同施用这些治疗剂，例如以具有固定比例的活性成分的单一胶囊。或者，这种施用包括对于各个活性成分在多种或在分开的容器(例如片剂、胶囊、粉末和液体)中的共同施用。粉末和/或液体可以在施用前重构或稀释至所需剂量。此外，这种施用还包括以大致相同的时间或在不同的时间以顺序的方式使用每种类型的治疗剂。在任一情况下，治疗方案将提供药物组合在治疗本文所述的病症或病状中的有益作用。
用于本文时，“治疗”指减缓、中断、阻滞、缓解、停止、降低、或逆转已存在的症状、病症、病况或疾病的进展或严重性。
用于本文时，“预防”包括对疾病或病症或特定疾病或病症的症状的发生或发展的抑制。在一些实施方案中，具有癌症家族病史的受试者是预防性方案的候选。通常，在癌症的背景中，术语“预防”是指在癌症的病征或症状发生前，特别是在具有癌症风险的受试者中发生前的药物施用。
术语“载体”当在本文中使用时是指能够增殖与其相连的另一个核酸的核酸分子。该术语包括作为自我复制核酸结构的载体以及结合到已经引入其的宿主细胞的基因组中的载体。一些载体能够指导与其可操作相连的核酸的表达。这样的载体在本文中被称为“表达载体”。
本文中的术语“标志物”是指这样的一类物质，其来自于在体或离体样本，并且相对而言容易利用本领域已有的或常规的实验方法和工具来检测其在样本中的存在水平，而这种存在水平(例如，高低或有无)与某种特定的生理或病理状态有关联，因此可以藉由获取该标志物的存在水平而推断或辅助推断这种特定的生理或病理状态。标志物可以是机体内存在的任何物质，例如但不限于，核酸、多糖、蛋白质、无机或有机小分子，或它们的聚合物或杂合物(例如，糖蛋白、磷酸化的蛋白、甲基化的核酸序列，等等)，或它们(例如，蛋白质)的编码基因。在本发明的一些实施方案中，标志物是IFN-γ。在本发明的一些实施方案中，需要被推断的特定的生理或病理状态是指本发明的CAR-T细胞进入受试者体内后所表现出或将要表现出的对靶肿瘤的杀伤或抑制能力。在一些进一步的实施方案中，所述样本是转染CAR分子后的T细胞的体外培养上清，或接受CAR-T细胞治疗后受试者的血清。在一些优选的实施方案中，细胞培养过程中所分泌出的IFN-γ，通过酶联免疫吸附试验(ELISA)测定。
本文中的术语“IFN-γ”是指细胞因子干扰素(interferon)的一种亚型，其由活化T细胞和自然杀伤细胞分泌，特别是I型辅助T细胞(Th1细胞)，以水溶性二聚体存在。IFN-γ的受体由两个亚基组成，与IFN-γ结合后被其激活，调节JAK-STAT通路。多项研究表明，IFN-γ具有抗病毒、免疫调节及抗肿瘤等活性。
II.嵌合抗原受体以及其编码核酸
在本发明的一个方面，本发明涉及分离的嵌合抗原受体(CAR)分子，其包含(例如顺序连接的)结合EPHA2的胞外结合区、跨膜区和胞内信号区(例如包含共刺激结构域)。
II-1胞外结合区
在一个实施方案中，本文所述的结合EPHA2的胞外结合区结合野生型EPHA2，例如人野生型EPHA2。
结合EPHA2的胞外结合区可以是结合EPHA2的任何抗原结合结构域：包括但不限于单克隆抗体、多克隆抗体、重组抗体、人抗体、人源化抗体及其功能性片段，包括但不限于单结构域抗体，比如重链可变结构域(VH)、轻链可变结构域(VL)和骆驼科来源的纳米抗体的可变结构域(VHH)，且结合本领域已知的备选的支架以抗原结合结构域形式起作用。在某些情况下，抗原结合结构域来源于与CAR的最终用处相同的物种是有利的。例如，为了用于人类，CAR的抗原结合结构域包含人类或人源化的用于抗体或抗体片段的抗原结合结构域的残基可能是有利的。因此，在一个方面，抗原结合结构域包含人抗体或抗体片段。在一个方面，抗原结合结构域是scFv。
在一种实施方案中，所述的结合EPHA2的胞外结合区包含本文中描述的一个或更多个(例如，所有3个)轻链互补决定区1(LCDR1)、轻链互补决定区2(LCDR2)和轻链互补决定区3(LCDR3)以及本文中描述的一个或更多个(例如，所有3个)重链互补决定区1(HCDR1)、重链互补决定区2(HCDR2)和重链互补决定区3(HC CDR3)。
在一些实施方案中，本发明的结合EPHA2的胞外结合区包含3个来自重链可变区的互补决定区(HCDR)，HCDR1、HCDR2和HCDR3。
在一些实施方案中，本发明的结合EPHA2的胞外结合区包含3个来自轻链可变区的互补决定区(LCDR)，LCDR1、LCDR2和LCDR3。
在一些实施方案中，本发明的结合EPHA2的胞外结合区包含3个来自重链可变区的互补决定区(HCDR)和3个来自轻链可变区的互补决定区(LCDR)。
在一些方面中，本发明的结合EPHA2的胞外结合区包含重链可变区(VH)。在一些方面中，本发明的结合EPHA2的胞外结合区包含轻链可变区(VH)。在一些方面中，本发明的结合EPHA2的胞外结合区包含重链可变区和轻链可变区(VH)。在一些实施方案中，所述重链可变区包含3个来自重链可变区的互补决定区(CDR)，HCDR1、HCDR2和HCDR3。在一些实施方案中，所述轻链可变区包含3个来自轻链可变区的互补决定区(CDR)，LCDR1、LCDR2和LCDR3。
在一些实施方案中，本发明的重链可变区
(i)包含与选自SEQ ID NO:7或8的氨基酸序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列或由所述氨基酸序列组成；或者
(ii)包含选自SEQ ID NO:7或8的氨基酸序列或由所述氨基酸序列组成；或者
(iii)包含与选自SEQ ID NO:7或8的氨基酸序列相比具有1个或多个(优选不超过10个，更优选不超过5、4、3、2、1个)的氨基酸改变(优选氨基酸置换，更优选氨基酸保守置换)的氨基酸序列由所述氨基酸序列组成，优选地，所述氨基酸改变不发生在CDR区中。
在一些实施方案中，本发明的轻链可变区
(i)包含与选自SEQ ID NO:15或16的氨基酸序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列或由所述氨基酸序列组成；或者
(ii)包含选自SEQ ID NO:15或16的氨基酸序列或由所述氨基酸序列组成；或者
(iii)包含与选自SEQ ID NO:15或16的氨基酸序列相比具有1个或多个(优选不超过10个，更优选不超过5、4、3、2、1个)的氨基酸改变(优选氨基酸置换，更优选氨基酸保守置换)的氨基酸序列由所述氨基酸序列组成，优选地，所述氨基酸改变不发生在CDR区中。
在一些实施方案中，本发明的3个来自重链可变区的互补决定区(HCDR)，HCDR1、HCDR2和HCDR3选自
(i)如SEQ ID NO:7或8所示的VH中所含的三个互补决定区域HCDR1、HCDR2和HCDR3,或
(ii)相对于(i)中任一序列，在所述三个HCDR区上共包含至少一个且不超过5、4、3、2或1个氨基酸改变(优选氨基酸置换，优选保守置换)的序列。
在一些实施方案中，本发明的3个来自轻链可变区的互补决定区(LCDR)，LCDR1、LCDR2和LCDR3选自
(i)如SEQ ID NO:15或16所示的VL中所含的三个互补决定区域LCDR1、LCDR2和LCDR3，或
(ii)相对于(i)中任一序列，在所述三个LCDR区上共包含至少一个且不超过5、4、3、2或1个氨基酸改变(优选氨基酸置换，优选保守置换)的序列。
在一些实施方案中，HCDR1包含SEQ ID NO:1或4的氨基酸序列，或由所述氨基酸序列组成，或者HCDR1包含与SEQ ID NO:1或4的氨基酸序列相比具有一个、两个或三个改变(优选氨基酸置换，优选保守置换)的氨基酸序列。
在一些实施方案中，HCDR2包含SEQ ID NO:2或5的氨基酸序列，或由所述氨基酸序列组成，或者HCDR2包含与SEQ ID NO:2或5的氨基酸序列相比具有一个、两个或三个改变(优选氨基酸置换，优选保守置换)的氨基酸序列。
在一些实施方案中，HCDR3包含SEQ ID NO:3或6的氨基酸序列，或由所述氨基酸序列组成，或者HCDR3包含与SEQ ID NO:3或6的氨基酸序列相比具有一个、两个或三个改变(优选氨基酸置换，优选保守置换)的氨基酸序列。
在一些实施方案中，LCDR1包含SEQ ID NO:9或12的氨基酸序列，或由所述氨基酸序列组成，或者LCDR1包含与SEQ ID NO::9或12的氨基酸序列相比具有一个、两个或三个改变(优选氨基酸置换，优选保守置换)的氨基酸序列。
在一些实施方案中，LCDR2包含SEQ ID NO:10或13的氨基酸序列，或由所述氨基酸序列组成，或者LCDR2包含与SEQ ID NO:10或13的氨基酸序列相比具有一个、两个或三个改变(优选氨基酸置换，优选保守置换)的氨基酸序列。
在一些实施方案中，LCDR3包含SEQ ID NO:11或14的氨基酸序列，或由所述氨基酸序列组成，或者LCDR3包含与SEQ ID NO:11或14的氨基酸序列相比具有一个、两个或三个改变(优选氨基酸置换，优选保守置换)的氨基酸序列。
在本发明的一些具体实施方案中，本发明的结合EPHA2的胞外结合区包含以下表中的HCDR1、HCDR2、HCDR3组合：
在本发明的一些具体实施方案中，本发明的结合EPHA2的胞外结合区包含以下表中的LCDR1、LCDR2、LCDR3组合：
在本发明的一些具体实施方案中，本发明的结合EPHA2的胞外结合区包含以下表的HCDR1、HCDR2、HCDR3和LCDR1、LCDR2和LCDR3的组合：
在本发明的一些具体实施方案中，本发明的抗EPHA2抗体或其抗原结合片段包含如以下所示的VH和VL，所述VH和VL分别包含以下氨基酸序列或由以下氨基酸序列组成：
SEQ ID NO:7和15；或
SEQ ID NO:8和16。
在本发明的一个实施方案中，本文所述的氨基酸改变包括氨基酸的置换、插入或缺失。优选的，本文所述的氨基酸改变为氨基酸置换，优选地保守置换。
在优选的实施方案中，本发明所述的氨基酸改变发生在CDR外的区域(例如在FR中)。更优选地，本发明所述的氨基酸改变发生在重链可变区外和/或轻链可变区外的区域。在一些实施方案中，本发明所述的氨基酸改变发生在抗体重链恒定区的Fc区上，在优选的实施方案中，所述Fc区上的氨基酸改变增加抗体的ADCC和/或CDC作用。
在一些实施方案中，置换为保守性置换。保守置换是指一个氨基酸经相同类别内的另一氨基酸置换，例如一个酸性氨基酸经另一酸性氨基酸置换，一个碱性氨基酸经另一碱性氨基酸置换，或一个中性氨基酸经另一中性氨基酸置换。示例性的置换如下表所示：
在某些实施方案中，置换发生在EPHA2的胞外结合区的CDR区。通常，获得的变体相对于亲本抗体在某些生物学特性方面(例如，增加的亲和力)具有修饰(例如，改善)和/或将具有亲本的基本上保留的某些生物学特性。示例性置换变体是亲和力成熟抗体。
在一些实施方案中，本发明的EPHA2的胞外结合区是抗EPHA2抗体的scFv片段。
在一些实施方案中，所述scFv片段包含接头。在一些实施方案中，所述接头是肽接头。肽接头可以主要包括或可以不主要包括以下氨基酸残基：Gly、Ser、Ala或Thr。有用的接头包括甘氨酸-丝氨酸聚合物，包括例如(GS)n、(GSGGS)n、(GGGGS)n、(GGGS)n和(GGGGS)nG，其中n是至少1(且优选2、3、4、5、6、7、8、9、10)的整数。在一些实施方案中，接头包含(GSGGS)3(SEQ ID NO:22)的氨基酸序列。
在一些实施方案中，所述scFv片段包含选自SEQ ID NO:17-20任一项所示的氨基酸序列或与所述序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列或由所述氨基酸序列组成。
II-2跨膜区
在多种实施方案中，关于跨膜区，CAR可以被设计成包括连接至CAR的胞外结构域的跨膜区。跨膜区可以包括一个或更多个邻接跨膜区域的另外氨基酸，例如一个或更多个与所述跨膜所源自的蛋白质的胞外区域相关联的氨基酸(例如，胞外区域的1、2、3、4、5、6、7、8、9、10直至15个氨基酸)和/或与所述跨膜蛋白所源自的蛋白质的胞外区域相关联的一个或更多个另外的氨基酸(例如，胞内区域的1、2、3、4、5、6、7、8、9、10直至15个氨基酸)。在一个方面，跨膜区是与使用的CAR的其它区中的一个有关的区，例如，在一种实施方案中，所述跨膜区可以来自信号传导结构域、共刺激结构域或铰链结构域所源自的相同蛋白质。在另一个方面，跨膜区不是来源于CAR的任何其它区来源的相同蛋白质。在某些情况下，跨膜区可以被选择或通过氨基酸取代修饰以避免这样的区与相同或不同表面膜蛋白的跨膜区结合，例如以使与受体复合体的其它成员的相互作用最小化。在一个方面，跨膜区能够与表达CAR的细胞的细胞表面上的另一个CAR同型二聚化。在一个不同的方面，跨膜区的氨基酸序列可以被修饰或取代，以便使与存在于表达相同CAR的细胞中的天然结合配偶体的结合结构域的相互作用最小化。
跨膜区可以来源于天然或重组来源。当所述来源是天然的时，所述结构域可以来源于任何膜结合的蛋白质或跨膜蛋白质。在一个方面，跨膜区能够向胞内区传导信号，无论何时所述CAR与靶结合。在本发明中特别使用的跨膜区可以包括至少以下的跨膜区：例如，CD28、CD8(例如，CD8α，CD8β)。在一种实施方案中，所述的跨膜结构域包含本文中描述的的跨膜结构域,例如，其具有SEQ ID NO:23的序列、具有SEQ ID NO:23的氨基酸序列的至少1、2或3个修饰(例如，取代)但不超过20、10或5个修饰(例如，取代，例如保守取代)的氨基酸序列,或与SEQ ID NO:23的氨基酸序列具有95-99％同一性的序列。
在某些情况下，跨膜区可以经由铰链(例如，来自人蛋白质的铰链)连接至CAR的胞外区域，例如CAR的抗原结合结构域。例如，在一种实施方案中，铰链可以是人Ig(免疫球蛋白)铰链(例如，IgG4铰链、IgD铰链)、GS接头(例如，本文所述的GS接头)、KIR2DS2铰链或CD8a铰链。在一种实施方案中，铰链区是人IgG4铰链；在一些实施方案中，铰链区序列与人IgG4铰链具有至少95％序列同一性；在一种实施方案中，铰链区包含(例如，由其组成)SEQID NO:21的氨基酸序列。
II-3胞内信号区
在一些实施方案中，所述CAR分子包含胞内信号区。在一些实施方案中，所述胞内信号区包含共刺激结构域。在一种实施方案中，所述的共刺激结构域是从选自由下列组成的组的蛋白质得到的功能性信号传导结构域:CD28和/或4-1BB(CD137)或其功能性变体。在一种实施方案中，所述的共刺激结构域包含下列或由其组成:SEQ ID NO:24的序列和/或SEQ ID NO:25的序列。在一种实施方案中，所述的共刺激结构域包含下列或由其组成:具有SEQ ID NO:24和/或SEQ ID NO:25的氨基酸序列的至少1、2或3个修饰(例如，取代)但不超过20、10或5个修饰(例如，取代，例如保守取代)的氨基酸序列,或与SEQ ID NO:24和/或SEQID NO:25的氨基酸序列具有95-99％同一性的序列。
胞内信号区通常负责其中已经引入CAR的免疫细胞的正常效应子功能中至少一个的活化。术语“效应子功能”是指细胞的特化功能。T细胞的效应子功能例如可以是细胞溶解活性或辅助活性，包括分泌细胞因子。因此，术语“胞内信号区”是指转导效应子功能信号且引导细胞执行特定功能的蛋白质的部分。虽然通常可以应用全部胞内信号区，但是在许多情况下不必使用整个链。就使用胞内信号区的截短部分来说，可以使用这样的截短部分代替完整的链，只要其转导效应子功能信号。因此，术语胞内信号区意味着包括足以转导效应子功能信号的胞内信号区的截短部分。
用于本发明的CAR的胞内信号区还包括共同作用以在抗原受体衔接之后引发信号转导的T细胞受体(TCR)和共同受体的细胞质序列，以及这些序列的任何衍生物或变体和具有相同功能性能力的任何重组序列。众所周知通过单独的TCR产生的信号不足以完全活化T细胞，并且也需要二级和/或共刺激信号。因此，T细胞活化可以被称为是由两个不同种类的细胞质信号传导序列介导的：通过TCR引发抗原依赖性一级活化的那些(一级胞内信号区)以及以抗原独立方式起作用以提供二级或共刺激信号的那些(二级细胞质结构域，例如共刺激结构域)。一级细胞质信号传导结构域以刺激方式或以抑制方式调节TCR复合体的一级活化。以刺激方式起作用的一级胞内信号区可以含有信号传导基序，其被称为基于免疫受体酪氨酸的活化基序或ITAM。特别地用于本发明中的含有ITAM的一级胞内信号区的实例包括如下那些：CD3ζ。在一种实施方案中，本发明的CAR包含胞内信号区，例如CD3-ζ的初级信号传导结构域。
CAR的胞内信号区可以包含CD3-ζ信号传导结构域本身，或者其可以与用于本发明的CAR的其它的胞内信号区例如共刺激信号传导结构域组合。例如，CAR的胞内信号区可以包括CD3ζ链部分和共刺激信号传导结构域，优选地，所述共刺激传导结构域在CD3ζ的信号传导结构域之前。
可以使本发明的CAR的细胞质部分之内的胞内信号区以随机或指定顺序彼此连接。任选地，例如长度在2和10个氨基酸(例如，2、3、4、5、6、7、8、9或10个氨基酸)之间的短的寡肽或多肽接头可以在胞内信号区之间形成连接。在一种实施方案中，甘氨酸-丝氨酸二联体可用作合适的接头。在一种实施方案中，单个氨基酸例如丙氨酸、甘氨酸可用作合适的接头。
在一个方面，胞内信号区被设计成包含两个或多个，例如2、3、4、5个或多个共刺激信号传导结构域。在一种实施方案中，两个或多个，例如2、3、4、5个或多个共刺激信号传导结构域被接头(例如本文所述的接头)分子分开。在一种实施方案中，胞内信号区包含两个共刺激信号传导结构域。在某些实施方案中，接头分子为甘氨酸残基。在某些实施方案中，接头为丙氨酸残基。
在一个方面，胞内信号区被设计成包含CD3-ζ的信号传导结构域和CD28的信号传导结构域。在一个方面，胞内信号区被设计成包含CD3-ζ的信号传导结构域和4-1BB的信号传导结构域。在一个方面，CD3-ζ的信号传导结构域包含SEQ ID NO:26所示的序列或与之具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的同一性的氨基酸序列或由其组成。
CAR分子还可以包含信号肽。
因此，本发明的CAR分子可以包含结合EPHA2的胞外结合区，例如结合EPHA2的scFv，例如包含选自SEQ ID NO:17-20任一项所示的氨基酸序列或与所述序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列或由所述氨基酸序列组成；铰链区，例如IgG4铰链区，其例如包含SEQ ID NO:21的氨基酸序列或由其组成；跨膜区，例如CD28跨膜区，例如包含SEQ ID NO:23的氨基酸序列或由其组成；胞内信号区，其包含CD28信号传导结构域，例如包含SEQ ID NO:24的氨基酸序列或由其组成，和/或4-1BB信号传导结构域，例如包含SEQ ID NO:25的氨基酸序列或由其组成，以及CD3ζ，例如包含SEQ ID NO:26所示的序列或与之具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的同一性的氨基酸序列；以及报告基因，例如GFP，例如添加了T2A的GFP，例如包含SEQ ID NO:28的氨基酸序列或由其组成。
III.编码核酸和载体
本发明提供CAR的编码核酸，其包括编码一个或更多个本发明的CAR的核酸序列。在一个方面，以DNA构建体形式提供CAR编码核酸。
CAR编码核酸可以在5’端包含Kozak序列，以促进稳定性和翻译效率。在一个实施方案中，Kozak序列包含GCCACCATGG(SEQ ID NO:27)的核酸序列或由其组成。
本发明进一步提供包含CAR转基因的载体。在一个方面，可以直接地把CAR载体转导到细胞中，例如T细胞，例如T淋巴细胞。在一个方面，载体为克隆载体或表达载体，例如包括，但不限于一个或更多个质粒(例如表达质粒、克隆载体、微环(minicircles)、微载体、双微染色体)、逆转录病毒和慢病毒载体构建体。在一个方面，载体能够在哺乳动物T细胞中表达CAR分子。在一个方面，哺乳动物T细胞为人T细胞，例如T淋巴细胞。
本发明还提供其中插入本发明的编码CAR的核酸的载体。在一些实施方案中，所述载体为DNA、RNA、质粒、腺病毒载体、慢病毒载体或逆转录病毒载体。在一个实施方案中，所述的载体是慢病毒载体。在另一个实施方案中，所述的载体是逆转录病毒。在一个优选的实施方案中，逆转录病毒是SFG。
在一些实施方案中，所述的载体进一步包含启动子。
简言之，编码CAR的天然或合成核酸的表达通常通过将编码CAR多肽或其部分的核酸与启动子有效连接，且将构建体掺入表达载体中来实现。载体可以适用于复制和整合真核生物。典型的克隆载体含有转录和翻译终止子、起始序列和用于调节期望的核酸序列表达的启动子。
本发明的表达构建体也可用于使用标准基因递送方案的核酸免疫和基因治疗。用于基因递送的方法是本领域已知的。可以把核酸克隆到大量类型的载体中。例如，可以把核酸克隆到包括，但不限于质粒、噬菌粒、噬菌体衍生物、动物病毒和粘粒的载体中。特别目的载体包括表达载体、复制载体、产生探针的载体和测序载体。
进一步，可以以病毒载体的形式把表达载体提供到细胞中。病毒载体技术是本领域熟知的，并且被描述在例如Sambrook等人,2012,MOLECULAR CLONING:ALABORATORYMANUAL,volumes 1-4,Cold Spring Harbor Press,NY)和其它病毒学和分子生物学手册中。用作载体的病毒包括，但不限于逆转录病毒、腺病毒、腺伴随病毒、疱疹病毒和慢病毒。通常，合适的载体含有在至少一种生物体中起作用的复制起点、启动子序列、方便的限制性核酸内切酶位点和一种或多种可选的标记物。
在一种实施方案中，使用逆转录病毒载体。
为了评价CAR多肽或其部分的表达，引入到细胞中的表达载体也可以含有可选的标记基因或报告基因或这两者，以促进从寻求通过病毒载体转染或感染的细胞群鉴定和选择表达细胞。在一些实施方案中，报告基因是GFP。在一些实施方案中，T2A与EGFP的氨基酸序列包含EGRGSLLTCGDVEENPGP(SEQ ID NO:28)的氨基酸序列或与之具有至少90％同一性的氨基酸序列。
向细胞中引入和表达基因的方法是本领域已知的。在表达载体的上下文中，载体可以通过本领域的任何方法容易地被引入宿主细胞中，例如哺乳动物、细菌、酵母菌或昆虫细胞。例如，表达载体可以通过物理、化学或生物学手段转移到宿主细胞中。
用于将多核苷酸引入到宿主细胞中的物理方法包括磷酸钙沉淀、脂转染、粒子轰击、显微注射、电穿孔等。用于产生包括载体和/或外源性核酸的细胞的方法是本领域熟知的，参见例如Sambrook等人,2012,MOLECULAR CLONING:ALABORATORY MANUAL,volumes 1-4,Cold Spring Harbor Press,NY)。一种用于将多核苷酸引入到宿主细胞中的优选的方法是脂质体转染。
IV.细胞
在另一个方面中，本发明涉及包含所述载体或核酸的细胞。在一种实施方案中，所述的细胞是人T细胞,例如，本文中描述的T细胞。在一种实施方案中，所述的T细胞是T淋巴细胞。在一种实施方案中，所述的细胞是自体的T细胞。在一种实施方案中，所述的细胞是同种异体的T细胞。
在扩增和基因修饰之前，细胞来源(例如，T细胞或NK细胞)是从受试者获得的。术语“受试者”意味着包括其中可以引发免疫应答的活生物体(例如哺乳动物)。受试者的实例包括人类、狗、猫、小鼠、大鼠及其转基因物种。T细胞可以从大量来源获得，包括外周血单核细胞、骨髓、淋巴结组织、脐带血、胸腺组织、来自感染部位的组织、腹水、胸膜积液、脾组织和肿瘤。在本发明的某些方面，可以使用本领域可获得的许多T细胞系。在本发明的某些方面，T细胞可以使用本领域技术人员已知的多种技术的任一种(比如FicollTM分离)从受试者收集的血液单位获得。在一个优选的方面，通过单采血液成分术，从个体的正在循环的血液获得细胞。
在一个方面，通过溶解红细胞和例如通过离心穿过PERCOLLTM梯度或逆流离心机淘析耗尽单核细胞，从外周血淋巴细胞中分离T细胞。T细胞的特异性亚群体，比如CD3+、CD28+、CD4+、CD8+、CD45RA+和CD45RO+T细胞可以通过正选择或负选择技术进一步分离。例如，在一个方面，通过用抗-CD3/抗-CD28(例如3×28)-缀合的珠(比如M-450 CD3/CD28 T)培养足以正选择期望的T细胞的时期分离T细胞。
在另一个方面中，本发明涉及生产细胞的方法，其包括给本文中描述的细胞(例如，T细胞)转导含有编码CAR分子(例如，本文中描述的CAR分子)的核酸的载体。在一种实施方案中，所述的载体是本文中描述的慢病毒载体。
V.用途和方法
本发明一方面提供了在受试者中预防或治疗肿瘤(例如癌症)或提供抗肿瘤免疫的方法，其包括给所述的受试者施用有效量的含有CAR分子的细胞,例如，本文中描述的表达CAR分子的细胞。在一种实施方案中，所述的细胞是自体的T细胞。在一种实施方案中，所述的细胞是同种异体的T细胞或NK细胞。在一种实施方案中，所述的受试者是人。在一种实施方案中，所述T细胞是T淋巴细胞。
在一些实施方案中，所述肿瘤(例如癌症)患者中具有(例如升高水平的，例如核酸或蛋白质水平的)EPHA2。
在一些实施方案中，所述肿瘤例如癌症包括实体肿瘤和血液肿瘤以及转移性病灶。在一个实施方案中，实体瘤的例子包括恶性肿瘤。癌症可以处于早期、中期或晚期或是转移性癌。
在一些实施方案中，所述肿瘤治疗将受益于抑制核酸或蛋白质水平的EPHA2。在一些实施方案中，所述肿瘤治疗将受益于本发明的CAR-T细胞对肿瘤细胞的直接杀伤。在一些实施方案中，所述肿瘤治疗将受益于本发明的CAR-T细胞所分泌的细胞因子对肿瘤细胞的生长抑制或杀伤。在另一些实施方案中，所述肿瘤治疗将受益于本发明的CAR-T细胞所分泌的细胞因子对体内免疫系统的整体或局部的调节，并由后者对肿瘤细胞造成生长抑制或杀伤。
在一个具体的实施方案中，本发明的抗EPHA2抗体能够抑制肿瘤细胞增殖，例如表达EPHA2的肿瘤细胞，例如胶质瘤细胞，例如GBM细胞。
在一些实施方案中，肿瘤是肿瘤免疫逃逸。
在一些实施方案中，所述肿瘤是癌症，例如胶质瘤，例如GBM。
受试者可以是哺乳动物，例如，灵长类，优选地，高级灵长类，例如，人类(例如，患有本文所述疾病或具有患有本文所述疾病的风险的个体)。在一个实施方案中，受试者患有本文所述疾病(例如，癌症)或具有患有本文所述疾病的风险。在某些实施方案中，受试者接受或已经接受过其它治疗，例如化疗治疗和/或放射疗法。在一些实施方案中，受试者之前已经接受过或正在接受免疫疗法。
在其他方面，本发明提供CAR分子或其编码核酸或包含其的载体或包含其的细胞在生产或制备药物中的用途，所述药物用于本文所述的用途，例如用于预防或治疗本文提及的相关疾病或病症。
在一些实施方案中，本发明的CAR分子或其编码核酸或包含其的载体或包含其的细胞会延迟病症和/或与病症相关的症状的发作。
在一些实施方案中，本发明的CAR分子或其编码核酸或包含其的载体或包含其的细胞还能与一种或多种其它疗法例如治疗方式和/或其它治疗剂组合施用，用于本文所述的用途，例如用于预防和/或治疗本文提及的相关疾病或病症。
在一些实施方案中，所述治疗方式或治疗剂增强表达CAR分子的细胞的活性或适应性，或减轻与施用表达CAR分子的细胞的副作用，或者治疗与EPHA2相关的疾病。
在一些实施方案中，治疗方式包括外科手术；放射疗法、局部照射或聚焦照射等。在一些实施方案中，治疗剂选自化疗剂、细胞因子、细胞毒性剂、疫苗、治疗性单克隆抗体、小分子药物或免疫调节剂。示例性的免疫调节剂包括免疫抑制剂或抗炎剂。
具体实施方式
本发明的全部实施例都是旨在说明性而非限制性的。本发明的全部实施例都在必要时经过了北京世纪坛医院机构评审委员会的批准，并征得所有参与者的知情同意。
本发明的示例性scFv的序列SEQ ID NO编号(全部CDR应用Kabat规则定义)
ScFv-a ScFv-b
HCDR1 1 4
HCDR2 2 5
HCDR3 3 6
VH 7 8
LCDR1 9 12
LCDR2 10 13
LCDR3 11 14
VL 15 16
scFv 17或18 19或20
实施例1.EphA2抗原在胶质母细胞瘤细胞系中高表达
为了评估使用EphA2特异性的CAR-T细胞治疗胶质母细胞瘤的临床潜力，使用流式细胞术检测了3株胶质瘤细胞系(U251、U87和U373)中EphA2的表达水平。
人GBM细胞系U87、U373、U251和逆转录病毒包装细胞系PG13购自美国类型培养物保藏中心(ATCC)。表达eGFP和萤火虫荧光素酶的U251和U373细胞是通过逆转录病毒感染产生的。所有这些细胞都在含有10％胎牛血清(Biosera)和10,000IU/mL青霉素/10,000μg/mL链霉素(EallBio Life Sciences)的Dulbecco's modified Eagle's培养基(Lonza)中培养维持。
流式细胞术在FACS Canto Plus仪器(BD Biosciences)上进行，Flow Jo v.10(FlowJo，LLC)用于数据分析。用APC标记的鼠抗人CD3抗体(BD Biosciences)、PE标记的鼠抗人CD8抗体(BD Biosciences)、BV421标记的鼠抗人CD4抗体(BD Biosciences)和山羊抗鼠IgG(Fab特异性)F(ab‘)2片段-FITC抗体(Sigma)对转基因T细胞进行检测。用AlexaFluor 700标记的鼠抗人EphA2(R&D系统)对肿瘤细胞进行染色，流式细胞仪检测细胞表面EphA2的表达。
结果发现，在93.45％的U87细胞、97.75％的U251细胞和93.40％的U373细胞表面均有EphA2的表达，表明EphA2可以作为CAR的靶点。
实施例2.生成EphA2特异性CAR T细胞
设计了两种不同的第三代CAR(CD28.4-1BB.ζ)，它们分别基于两种不同的鼠源化的EphA2特异性单克隆抗体，分别称为EphA2scFv-a和EphA2 scFv-b,其序列分别如SEQ IDNO:18和20所示。除了所述不同的EphA2-scFv，两个不同的CARs包含相同的CD28跨膜结构域(SEQ ID NO:23)，以及来源于CD28.4-1BB的共刺激域和CD3ζ信号结构域(分别SEQ ID NO:24、25和26)。ScFv与跨膜结构域之间通过铰链区(SEQ ID NO:21)相连。(参见图1A)
由GeneArt(Invitrogen)合成上述两个不同的EphA2-scFvs的编码序列，设计引物，通过同源重组将其与CD28跨膜结构域，CD28，4-1BB共刺激域以及CD3ζ信号结构域连接形成一个完整的第三代EphA2特异性的CAR序列，最后再通过同源重组的方式将CAR亚克隆至逆转录病毒载体SFG上。
脂质体法瞬时转染PG13细胞(逆转录病毒包被的NIH3T3细胞)产生逆转率病毒颗粒。
采用淋巴细胞分离液(MP Biomedals)梯度离心法分离健康志愿者外周血单个核细胞(PBMC)。为了产生EphA2-CAR T细胞，用抗CD3/CD28 beads刺激PBMC中的T细胞,然后转导逆转录病毒两次。第7天，检测T细胞上CAR的表达，并在含5％人AB血清(Gemini Bio)和IL-2(SL Pharm)的X-VIVOTM15无血清培养基(Lonza)中扩增。
4-5天后用FACS分析检测基因修饰的T细胞，T细胞表面稳定表达CAR，转导效率大约为30％，且两种CAR之间无显著差异。用Western blot检测CD3ζ也证明了T细胞上CAR的表达。表型分析显示CD4+和CD8+T细胞的比值为1:3，各组间无显著差异。(图1B)其中WesternBlot按如下步骤：细胞用PBS清洗三次，然后用RIPA缓冲液提取蛋白质。使用Pierce BCA蛋白质检测试剂盒(Thermo Fisher Scientific)对蛋白质样品进行定量，然后在十二烷基硫酸钠(SDS)/β-巯基乙醇样品缓冲液中变性。样品(10μg)在15％的SDS-聚丙烯酰胺凝胶上分离，并通过电泳转移印迹在聚偏二氟乙烯膜(Millipore)上。将膜与小鼠抗人CD247(BDBiosciences)在4℃下孵育过夜，然后用HRP连接的山羊抗小鼠第二抗体(Santa CruzBiotechnology)检测特异性蛋白-抗体复合物。使用ECL试剂盒(Thermo FisherScientific)进行化学发光反应的检测。该实验至少重复三次。
CFSE染色3天后用流式细胞仪检测细胞增殖，CAR-T细胞表现出良好的生存能力和增殖能力(图1C)，且共培养后计数T细胞数量，两组CAR-T细胞增殖有显著差异(图1D)。这两组之间的CD4/CD8比率相似(图10B)。
实施例3.两种EphA2-CAR T细胞在EphA2+肿瘤细胞刺激下的增殖情况
为了比较不同的scFv对CAR T细胞增值的影响，首先我们根据试剂说明书用5μMCFSE(Thermo Fisher Science)标记两种EphA2-CAR T细胞，将1×106个CFSE标记的T细胞与5×105个靶细胞(U251细胞)共培养72小时。流式细胞仪分析T细胞增殖情况，结果显示两种EphA2-CAR T细胞都能进行正常的增殖。
接下来，我们对两种EphA2-CAR T细胞进行了体外扩增。通过15天共培养试验，将CAR T细胞每三天用EphA2+靶细胞(U251)刺激，并在每次刺激之前对T细胞进行计数。实时细胞生长监测(RTCA)系统的结果表明，与对照组T细胞相比，EphA2-a和EphA2-b-CAR T细胞都能抑制肿瘤细胞的生长(图2C)。EphA2-a-CAR T细胞在体外表现出最高的肿瘤抑制能力(图2C)。与EphA2-b-CAR T细胞相比，EphA2-a CAR T细胞在与U251细胞共培养时的扩增明显要快。
实施例4.CART细胞的体外抗肿瘤活性
通过细胞毒实验和检测EphA2-CAR T细胞分泌细胞因子IFN-γ水平来判断两种EphA2-CAR T细胞的抗肿瘤活性。
结果显示，两组CAR-T细胞相比对照组都能够抑制肿瘤细胞的增殖，且EphA2-a-CAR T细胞的抑制能力更强。(图2C)
我们将两种EphA2-CAR T细胞分别与胶质瘤细胞(U87,U251，和U373细胞)以1比1至10比1的效靶比(E:T比)共培养24小时之后检测两种CAR-T细胞的体外抗肿瘤活性。结果显示，共培养24h后，两组CAR-T细胞对肿瘤细胞的裂解能力均高于NT组，EphA2-a-CAR-T细胞在低E:T比(1:1)时裂解超过76.05％的肿瘤细胞，在高E:T比(10:1)时裂解超过85％的肿瘤细胞，且EphA2-a-CAR-T细胞对肿瘤细胞的杀伤率明显高于EphA2-b-CAR-T细胞(图2A)。
接下来，我们收集了24小时共培养后的细胞上清液，采用人干扰素-γ-酶联免疫吸附试验试剂盒Human IFN-gamma DuoSet ELISA(R&D system)，按生产厂家说明书进行干扰素-γ水平测定。结果显示，与EphA2-a-CAR T细胞相比，与肿瘤细胞共培养后EphA2-b-CAR T细胞上清液中的IFN-γ水平极高。(图2B)同时，使用实时细胞生长监测(real-timecell growth monitoring,RTCA)系统在24小时内评估连续的肿瘤细胞增殖情况。U373和U251肿瘤细胞以每孔10,000个细胞的数量被安置在96孔的电阻底板上。24小时后，一式三份加入100,000个T细胞(10:1的接种比例)，NT细胞作为对照，这时与U373或U251粘附相关的细胞指数值被归一化。每15分钟收集一次归一化细胞指数的阻抗测量，通过测量由肿瘤细胞粘附引起的跨晶体管板的电流阻抗来确定。结果显示，EphA2-a-CAR T细胞和EphA2-b-CAR T细胞与对照组NT细胞相比均能抑制肿瘤细胞的生长，但EphA2-a-CAR T细胞在体外表现出最高的肿瘤抑制能力。(图2C)
实施例5.细胞结合试验
用无菌PBS清洗CAR-T细胞两次，然后用0.5μM CSFE(Thermo Fisher Scientific)溶液进行染色。阻断和清洗后，将CAR-T细胞与预置的GBM细胞在37℃下孵化5分钟。然后用预热的PBS清洗细胞三次，再用4％多聚甲醛固定。洗涤前和洗涤后的图像被捕获。重复实验3次，并在至少3个独立的区域计算细胞数。(结果参见图14)
实施例6.两种EphA2-CAR T细胞在体内有不同的抗肿瘤效果
为了进一步检测EphA2-CAR T细胞在体内抗肿瘤活性，我们将U251-eGFP-Luc细胞注射到NOD-SCID小鼠皮下，建立了胶质瘤异种移植小鼠模型。6～8周龄雌性NOD-SCID小鼠购自Charles River实验室。小鼠左侧腋下皮下注射5×106个U251-GL细胞，建立异种移植小鼠模型。肿瘤细胞注射后10天，通过瘤内注射不同的EphA2-CAR T细胞3×107个治疗荷瘤小鼠，未转导的T细胞(NT)作为阴性对照，监测70d。使用IVIS系统(IVIS，Xenogen，Alameda，CA，USA)监测荷瘤小鼠肿瘤的进展，当肿瘤直径达到20mm时处死小鼠。与对照组相比，接受EphA2-a-CAR T细胞治疗的小鼠生存时间明显延长，EphA2-b-CAR T细胞治疗的小鼠生存时间相对对照组延长了，但差异不显著。(图3A)
在异种小鼠原位胶质瘤模型中也观察到了类似的结果。用10％水合氯醛麻醉6～8周龄NOD-SCID小鼠，剃去小鼠头部的毛，将小鼠固定在小动物立体定向仪上，进行1cm头皮正中线切口，左侧纹状体用颅骨钻钻孔，10μL BD注射器注入2×10 5个U373-GL细胞。颅骨钻孔用骨蜡封闭，切口用医用胶粘剂(COMPONT)封闭。肿瘤细胞注射2周后，尾静脉注射3×107个CAR T细胞。用IVIS活体成像系统(IVIS，Xenogen，Alameda，CA，USA)监测肿瘤生长情况。结果显示，EphA2-a-CAR T治疗组和EphA2-b-CAR T细胞治疗组的肿瘤发展均降低，而EphA2-a-CAR T细胞治疗组的肿瘤进展最慢。这些结果表明，EphA2-CAR-T细胞在体内可以抑制胶质瘤的的进展，并且EphA2-a CARS具有更好的抗肿瘤活性(图3B)。
实施例7.高通量RNA测序分析两种EphA2-CAR T的差异表达基因
为了探讨EphA2-a-CAR T细胞具有更好的抑制肿瘤活性的原因，我们采用RNA高通量测序技术检测了EphA2-a-CAR T细胞和EphA2-b-CAR T细胞之间的差异表达基因。
收集细胞将样品送至安诺优达基因科技北京有限公司进行RNA高通量测序。具体地，使用UltraTM RNA Library Prep Kit(#E7530L，NEB)，将每个含有2μg总RNA的样本作为输入材料，按照制造商的要求生成测序文库。简而言之，使用poly-T oligo-attached磁珠从总RNA中纯化mRNA。在NEB Next First Strand Synthesis ReactionBuffer(5X)中，在高温下使用二价阳离子进行片段化。使用随机六聚体引物和RNase H合成第一链cDNA。随后使用缓冲液、dNTPs、DNA聚合酶I和RNase H进行第二链cDNA合成。用QiaQuick PCR试剂盒纯化文库片段，用EB缓冲液洗脱，然后进行末端修复、A-tailing和连接接头。对产物进行PCR扩增以完成文库。根据制造商的协议，使用TruSeq SR Clusterkit,v3-cBot-HS(Illumina Inc.)，在cBot Cluster Generation系统上对索引编码的样本进行聚类。随后，该文库在Illumina NovaSeq 6000系统平台(Illumina Inc.)上进行测序。原始数据首先使用定制的Perl脚本进行处理。清洁数据(清洁读数)是通过从原始数据中去除含有5′-接头污染物的poly-N，没有3′-接头或插入标签，或含有poly-A、-T、-G或-C的读数，以及低质量读数。得到原始数据使用在线生物信息学工具David BioInformationResources6.8对两个CAR-T细胞之间的差异表达基因进行基因本体论(GO)、KEGG途径和亚细胞定位分析。数据可视化和分析由软件包(ggplot2和Treemap)自定义RStudio脚本处理。基因富集分析采用Fisher‘s精确检验。
原始数据提交给基因表达总览数据库(登录号为GSE163833)。
两种CAR-T在与GMB细胞共培养后，EphA2-a CAR-T细胞相比EphA2-b CAR-T细胞，有1090个上调基因和1228个下调的基因。对前400个差异表达的基因进行了Gene Ontology分析，我们发现相比EphA2-b CAR-T细胞，EphA2-a-CAR T细胞中调节适应性免疫反应、钾离子运输和跨膜受体蛋白酪氨酸激酶信号通路的基因相对较高，而γ干扰素介导的信号通路、JAK-STAT级联、炎症反应和I型干扰素信号通路中的基因表达相对较低(图4)。同时，相比EphA2-bCAR-T细胞，EphA2-a CAR-T细胞中上调和下调的基因都主要富集在细胞外区域和细胞膜上。经过蛋白质-蛋白质相互作用(PPI)分析(图12和13)，我们发现有两个集群位于下调PPI网络的中心，一个群集包含12个节点和42条边，另一个包含10个节点和43条边(图13)。
为了验证RNA-seq结果，我们收集了与U87、U251和U373细胞共培养4h后的CAR-T细胞，然后用RT-qPCR检测了3个候选基因的表达情况。方法如下：使用TRIzol试剂(Invitrogen)按照制造商的说明从细胞中提取总RNA。使用Nanodrop One分光光度计(Thermo Fisher Scientific)测量RNA的数量和纯度。使用高容量cDNA反转录试剂盒(Thermo Fisher Scientific)合成cDNA，然后使用SYBR Green PCR Master Mix(ThermoFisher Scientific)和基因特异引物进行扩增。GAPDH被用来作为内部对照。使用2-ΔΔCt方法计算基因的相对表达。
结果显示，在与GBM细胞共培养前后，两个EphA2-CAR T细胞的IFN-γ基因表达均显著升高。与EphA2-a-CART细胞相比，EphA2-b-CAR T细胞在与GBM细胞共培养前以及与U251、U87细胞共培养4h后，其IFN-γ水平均高于EphA2-a-CAR T细胞。
实施例8.CAR T细胞GBM细胞的PD-L1表达的诱导
据报道，T细胞在肿瘤部位受到多种机制的抑制，其中PD-1/PD-L1轴介导的功能抑制起着关键作用。已知在肿瘤微环境中过表达的干扰素-γ可以与其受体结合，从而激活JAK/STAT信号通路，进而诱导肿瘤细胞中PD-L1的表达。
为了了解过高的干扰素-γ水平是否会通过在GBM细胞中诱导PD-L1升高而导致EphA2-b-CAR T细胞的抗肿瘤活性降低，我们检测了两个不同时间点与CAR T细胞共培养的GBM细胞的PD-L1在mRNA水平的表达。如图6A所示，共培养30min后,与EphA2-b-CAR T细胞共同培养的GBM细胞PD-L1的表达明显高于EphA2-a-CAR T细胞。当共培养时间增加到4h时，共培养后的GBM细胞PD-L1表达量是野生型GBM细胞的8倍以上。然而，与两种不同的EphA2-CART细胞共培养的GBM细胞之间的PD-L1水平是相似的。
验证EphA2-b-CAR T细胞是否在体内诱导GBM细胞表达PD-L1。我们用免疫组织化学的方法检测了CAR-T细胞处理的荷瘤小鼠肿瘤标本中PD-L1的表达。肿瘤标本石蜡包埋切片(FFPE)脱蜡后与PD-L1抗体或Ki67抗体在4℃孵育过夜。与辣根过氧化物酶(HRP)偶联的山羊抗兔二抗孵育后，按试剂说明书用DAB底物试剂盒(ABCAM)检测信号。图像是使用显微镜(尼康)获得的。以400倍的放大倍率对每个样本采集三种不同的随机图像，并用Image Jv1.49软件对PD-L1信号的相对密度进行量化。
结果显示，EphA2-b-CAR T细胞处理组有45.89％的肿瘤细胞PD-L1阳性，明显高于EphA2-a-CAR T细胞处理组，并且EphA2-bCAR T组Ki67阳性肿瘤细胞百分率为32.46％，也明显高于EphA2-a-CAR T组。(参见图6)
为了验证EphA2-b CAR-T细胞是否通过IFN-γ-IFN受体途径在GBM细胞中诱导更多的PD-L1，我们分别用siRNAs敲除IFNGR1、IFNGR2或PG-L1(图7A和B)。RNA干扰按如下进行：用Lipofectamine 3000(Thermo Fisher Scientific)将GBM细胞与小干扰RNAs(siRNAs)转染48小时，siRNA的序列为Si-Control，ACGUGACACGUUCGGAGAA；si-IFNGR1，UUAUACUGGAUCUCACUUC；si-IFNGR2，UUCGUAGCAAGAUGUUG；si-PD-L1，UCUCUUGGAAUUGGUGG。然后做体外杀伤试验。如图7C所示，EphA2-a和EphA2-b CAR-T细胞的抗GBM活性都有所提高，而且EphA2-b CAR-T细胞表现出与EphA2-a CAR-T细胞相似的肿瘤细胞杀伤力。
最后，我们用CAR-T细胞与PD1抗体联合治疗肿瘤小鼠(图7D-F)。在NT组中，PD1抗体联合处理并没有抑制肿瘤的生长。无论PD1抗体如何处理，EphA2-a CAR-T细胞治疗都能极大地抑制肿瘤的生长。而EphA2-b CAR-T细胞与PD1阻断的结合可以提高CAR-T的抗肿瘤活性，表明PD1-PD-L1的相互作用对抑制EphA2-b细胞的抗肿瘤活性起到了重要作用。
以上实施例的所有实验至少按一式三份进行，GraphPad Prism8.0.2版(GraphPad软件)被用于统计分析。数据以平均值±标准差表示。平均值之间的差异使用适当的测试进行检验。使用Kaplan-Meier方法测量GBM异种移植小鼠的总生存率，用Cox比例危险回归分析进行分组比较。P值小于0.05被认为是显著的。
本发明所涉及的序列如下：
scFv-a相关序列
scFv-b相关序列
其他序列

Claims (18)

1.分离的嵌合抗原受体，所述的嵌合抗原受体包含顺序连接的：胞外结合区，跨膜区和包含共刺激结构域的胞内信号区，其中所述胞外结合区特异性结合EPHA2，且包含HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2和LCDR3；并且所述HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2和LCDR3分别为SEQ ID NO: 1、2、3、9、10和11所示的序列，或分别为SEQ ID NO: 4、5、6、12、13和14所示的序列。
2.如权利要求1所述的嵌合抗原受体，其中所述胞外结合区：
a) 包含VH和VL，所述VH和VL分别包含以下氨基酸序列或由以下氨基酸序列组成：
SEQ ID NO:7和15;或
SEQ ID NO:8和16；
或者
b) 包含选自SEQ ID NO:17-20任一项所示的氨基酸序列或由所述氨基酸序列组成。
3.如权利要求1或2所述的嵌合抗原受体，其中所述的跨膜区是包含CD28的跨膜区，以及任选的所述跨膜区经由铰链区连接至胞外结合区。
4.如权利要求3所述的嵌合抗原受体，其中所述铰链区包含SEQ ID NO:21的氨基酸序列或由其组成。
5.如权利要求1或2所述的嵌合抗原受体，其中所述的胞内信号区包含CD3ζ的信号传导结构域和共刺激结构域，其中所述共刺激传导结构域在CD3ζ的信号传导结构域之前。
6.如权利要求5所述的嵌合抗原受体，其中所述CD3ζ的信号传导结构域包含SEQ IDNO:26所示的序列的氨基酸序列或由其组成，和/或所述共刺激结构域是从4-1BB蛋白得到的功能性信号传导结构域。
7.编码权利要求1-6任一项所述的嵌合抗原受体的核酸。
8.一种表达载体，其包含权利要求7所述的核酸。
9.如权利要求8所述的表达载体，其中，所述的表达载体来源于逆转录病毒质粒。
10.如权利要求9所述的表达载体，其中所述逆转录病毒质粒是SFG。
11.一种病毒，其中所述的病毒包含权利要求8-10任一项所述的载体。
12.一种T细胞，其转导有权利要求7所述的核酸，或权利要求8-10任一项所述的表达载体或权利要求11所述的病毒，或其表面表达权利要求1-6任一所述的嵌合抗原受体。
13.权利要求1-6任一项所述的嵌合抗原受体，权利要求7所述的核酸，权利要求8-10任一项所述的表达载体，权利要求11所述的病毒或权利要求12所述的T细胞在制备药物中的用途，所述药物用于预防或治疗肿瘤，其中所述肿瘤具有EPHA2。
14.如权利要求13所述的用途，其中所述肿瘤为胶质瘤。
15.如权利要求13所述的用途，其中所述肿瘤为胶质母细胞瘤。
16.检测样本中IFN-γ存在水平的试剂在制备试剂盒中的用途，其中，所述试剂盒用于：
i) 预测CAR-T细胞治疗肿瘤的疗效；或
ii) 预测肿瘤的治疗或预防方法的效果，其中所述方法涉及将CAR-T细胞施用于受试者，
其中所述CAR-T细胞是权利要求12的T细胞，其中所述样本是CAR-T细胞体外培养上清，或CAR-T细胞治疗后受试者的血清。
17.如权利要求16所述的用途，其中所述试剂是特异性针对IFN-γ的抗体。
18.如权利要求16所述的用途，其中检测样本中IFN-γ存在水平是通过ELISA方法。
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