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CN115916823A - 人cd45rc特异的嵌合抗原受体及其用途 - Google Patents

人cd45rc特异的嵌合抗原受体及其用途 Download PDF

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CN115916823A
CN115916823A CN202180036571.9A CN202180036571A CN115916823A CN 115916823 A CN115916823 A CN 115916823A CN 202180036571 A CN202180036571 A CN 202180036571A CN 115916823 A CN115916823 A CN 115916823A
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CN
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C·吉永瑙
I·阿内贡
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Universite de Nantes
Institut National de la Sante et de la Recherche Medicale INSERM
Original Assignee
Universite de Nantes
Institut National de la Sante et de la Recherche Medicale INSERM
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Abstract

本发明涉及免疫治疗领域。具体而言，本发明涉及人CD45RC特异的嵌合抗原受体(CAR)、表达该CAR的免疫细胞以及其作为药物的用途，特别是用于预防或治疗CD45RC高相关的疾病(包括自身免疫病、不期望的免疫反应、单基因疾病、淋巴瘤或癌症)或移植物抗宿主病(GVHD)。

Description

人CD45RC特异的嵌合抗原受体及其用途
发明领域
本发明涉及免疫治疗领域。具体而言，本发明涉及人CD45RC特异的嵌合抗原受体(CAR)、表达该CAR的免疫细胞以及其作为药物的用途，特别是用于预防或治疗CD45RC高相关的疾病(包括自身免疫病、不期望的免疫反应、单基因疾病、淋巴瘤或癌症)或移植物抗宿主病(GVHD)。
发明背景
CD45(也称为白细胞共同抗原(LCA)、EC3.1.3.48、T200、Ly5和PTPRC)构成第一个且原型的受体样蛋白酪氨酸磷酸酶(RPTP)。CD45表达限于所有有核造血细胞，它是该细胞中最丰富的细胞表面糖蛋白之一，占几乎10％的细胞表面，且估计在质膜中以约25μM存在(Trowbridge&Thomas,1994.Annu Rev Immunol.12:85-116；Hermiston等,2003.Annu RevImmunol.21:107-37；Holmes,2006.Immunology.117(2):145-55)。
CD45包含胞外结构域、单个跨膜结构域和大的胞质结构域。跨膜和胞质结构域在物种间高度保守。具体来说，CD45的胞质结构域包含两个串联复制的磷酸酶结构域，其中仅膜近端结构域具有酶活性(Desai等,1994.EMBO J.13(17):4002-10)。CD45中更近C末端的第二磷酸酶结构域的功能尚未确定，尽管有人提出其可能通过稳定第一结构域而间接地促进CD45活性。通过这个胞质结构域，CD45通过调节酪氨酸蛋白激酶的Src家族(例如T细胞中的Lck，或B细胞中的Lyn、Fyn和Lck)的活性，以充当造血细胞中磷酸酪氨酸水平的核心调节因子(Palacios&Weiss,2004.Oncogene.23(48):7990-8000；Lowell,2004.Mol Immunol.41(6-7):631-43)。
与跨膜和胞质结构域相比，CD45的胞外结构域在不同的白细胞谱系中显示出更高的多态性。实际上，这个胞外结构域是高度糖基化的，并含有O-联糖基化和唾液酸化两者的三个选择性剪接外显子(4、5和6-分别编码A、B和C决定簇)(Hermiston等,2003.Annu RevImmunol.21:107-37；Holmes,2006.Immunology.117(2):145-55)。因此，可通过在白细胞分化和细胞活化中进行动态受控的选择性剪接，从而导致分子的胞外结构域中发生变化，来产生大小、形状和电荷不同的CD45同工型(Hall等,1988.J Immunol.141(8):2781-7；Lynch,2004.Nat Rev Immunol.4(12):931-40)。
含有全部三个选择性剪接外显子的最大CD45同工型CD45RABC为约235kDa，而缺乏全部三个外显子的最小同工型CD45RO为约180kDa。介于之间的可能还有包含三个外显子中的仅两个(例如CD45RAB、CD45RBC)或仅一个(CD45RB)的同工型。
虽然不同CD45同工型的功能尚不清楚，但这些同工型的差异表达与T细胞的激活水平关联，并可使初始T细胞与记忆T细胞分离(Birkeland等,1989.Proc Natl Acad Sci US A.86(17):6734-8)。例如，CD45RA存在于外周的初始成熟CD4+T细胞上，而CD45RO在激活的和记忆CD4+T细胞上表达。CD45RABC在B细胞及其前体上、在树突细胞的亚组和其他抗原呈递细胞上表达。效应记忆RA T细胞(TEMRA)作为终末分化记忆T细胞的亚型，也重新表达初始T细胞标志物CD45RA(Koch等,2008.Immun Ageing.5:6)。重要的是，这种同工型表达模式在物种间高度保守，突显了其功能性作用和重要性(Hermiston等,2003.Annu RevImmunol.21:107-37)。
CD4+和CD8+T细胞上CD45RC同工型的特定表达模式可以区分在增殖和细胞因子分泌方面表现不同的功能不同的同种异型反应性T细胞亚群。例如，在啮齿动物中，已显示CD4+和CD8+T细胞CD45RC高是能够促进移植排斥和器官炎症的强力的Th1效应细胞(Spickett等,1983.J Exp Med.158(3):795-810；Xystrakis等,2004.Eur J Immunol.34(2):408-17)，而表达不可检测或低水平的CD45RC的T细胞是Th2和调节性T细胞，并抑制同种异基因移植排斥、移植物抗宿主病(GVHD)和细胞介导的自身免疫疾病(Xystrakis等,2004.Blood.104(10):3294-30；Guillonneau等,2007.J Clin Invest.117(4):1096-106；Powrie&Mason,1990.J Exp Med.172(6):1701-8)。在人类中，移植前高比例的CD45RC+CD8+T细胞与肾移植患者中的移植物存活降低有关联(Ordonez等,2013.PLoS One.8(7):e69791)。
因此，消除CD45RC高T细胞群代表了一种在人体中诱导免疫耐受，从而预防、减少和/或治疗移植排斥(特别是GVHD)和自身免疫疾病的有前景的方法。
GVHD是干细胞移植患者发病和死亡的重要原因。这是T细胞介导的免疫反应性过程，在该过程中供体细胞对抗受体细胞发生反应。目前，用免疫调节药物如皮质类固醇进行免疫抑制是预防GVHD的主要手段。尽管随着时间在提高存活效果上已取得进展，但皮质类固醇在高比例的患者中无法预防GVHD(少于50％的患者具有急性GVHD，40-50％的患者具有慢性GVHD，这取决于初始疾病的严重程度-Garnett等,2013.Ther Adv Hematol.4(6):366-378)，与显著的毒性相关，并且许多当前可用的挽救疗法关联有免疫抑制增加和感染并发症。因此，开发用于GVHD的新型治疗策略以改善移植后的长期结果的需求仍未得到满足。
本发明人先前已经描述了耗减CD45RC高T细胞可代表一种通过减少攻击性效应T细胞，同时增加耐受性调节性T细胞来预防或减少移植排斥的潜在新型疗法。实际上，瞬时抗CD45RC mAb治疗触发了快速的CD45RC高T细胞凋亡，同时保留记忆免疫力。此外，本发明人证明，短期抗CD45RC抗体治疗会导致同种异基因移植物的永久存活而没有慢性排斥的迹象(国际专利WO2016016442；Picarda等,2017.JCI Insight.2(3):e90088)。
发明人在此开发了针对人CD45RC的包含抗原结合片段的嵌合抗原受体(CAR)。这个抗原结合片段与目前市场上可获得的抗人CD45RC抗体(例如MT2克隆)竞争，表现出相当的反应性谱图，但对T细胞具有显著更好的细胞毒活性且浓度最低。实际上，与目前可用的其他抗原结合片段相比，本发明的抗hCD45RC抗原结合片段显示出更好的亲和力，从而具有更好的治疗效果。
有趣的是，本发明的CAR还可用于预防或治疗其中在病理学上涉及免疫应答的某些单基因疾病。单基因疾病由单基因缺陷引起。超过4000种人类疾病由这些与单个特定基因相关的缺陷导致。迄今为止，大多数治疗选择都围绕病症症状的治疗，以期改善患者的生活质量。基因疗法是对这种类型疾病的持久治疗的主要希望。然而，所遇到的主要障碍在于在将基因递送至受病症影响的合适细胞的技术的开发中，以及针对转基因产物或载体的免疫应答限制了治疗功效这一事实。
在单基因疾病中，有些与免疫系统相关基因有关(例如，T和/或B细胞原发性免疫缺陷和多内分泌腺病念珠菌病外胚层营养不良症(polyendocrinopathy candidiasis-ectodermal dystrophy，[APECED])，或与免疫功能无关但其缺陷与炎症和/或免疫反应相关的基因有关[例如杜氏肌营养不良症(Duchenne muscular dystrophy，DMD)]。
APECED，也称为I型自身免疫多腺综合征(auto-immune polyglandular syndrometype I，APS 1)，是一种罕见的由AIRE基因突变引起的多器官常染色体隐性自身免疫疾病，所述AIRE基因是允许组织限制性抗原(TRA)在髓质上皮胸腺细胞(medullary epithelialthymic cell，mTEC)中表达和自身反应性T细胞缺失的转录调节因子。在人类中，已经描述了AIRE基因中导致患病率1-9:1000000的APECED的超过100种突变(Orphanet,http://www.orpha.net)。APECED的临床表型通常由存在以下3种主要症状中的2种来定义：甲状旁腺功能减退(hypoparathyroidism)、肾上腺功能不全(阿狄森氏病(Addison’s disease))和慢性黏膜皮肤念珠菌病(CMC)。这种疾病还与多种自身免疫和外胚层特征相关，例如1型糖尿病、牙釉质发育不全(enamel hypoplasia)、白癜风、卵巢早衰、角膜炎、恶性贫血、脱发、外分泌性胰腺炎、间质性肺病、肾炎和其他病症。
DMD是一种单基因疾病，其中编码肌营养不良蛋白的DMD基因的突变会导致严重的X连锁肌营养不良症，它在后期会影响所有随意肌(voluntary muscle)以及心肌和呼吸肌。在DMD患者和mdx小鼠中，疾病的病理生理学均涉及免疫应答(综述参见Rosenberg等,2015.Sci Transl Med.7(299):299rv4)。DMD的标准疗法是皮质类固醇，例如泼尼松龙(prednisolone)。在mdx小鼠中，还采用了降低效应免疫应答或炎症的治疗，例如静脉内免疫球蛋白、曲尼司特(tranilast)、血红素加氧酶-1诱导剂、IL-1受体拮抗剂和IL-2，以扩增调节性T细胞(Treg)(Villalta等,2014.Sci Transl Med.6(258):258ra142；Rosenberg等,2015.Sci Transl Med.7(299):299rv4)。然而，即便当前有前景的新型治疗，DMD患者的平均预期寿命仍大大降低。
令人惊讶地，本发明人已经证明，用特异性耗减CD45RC高细胞的抗CD45RC抗体治疗Dmd-/-大鼠(Dmdmdx)改善了肌肉强度(Ouisse等,2019.Front Immunol.9；10:2131)。他们还证明，向Aire-/-大鼠施用抗CD45RC单克隆抗体会导致CD45RC高T细胞的强烈耗减，并消除APECED的特征性症状(国际专利申请WO2019115791)。
因此，本发明的CAR代表了一种用于预防和/或治疗单基因疾病例如DMD和APECED的有前景的方法。
发明人还证明，可以对免疫细胞进行工程设计，以在其细胞表面表达转导的CD45RC-CAR。发明人还证明，用CD45RC-CAR转导的细胞诱导人T细胞凋亡，并且在与人T细胞接触后可被激活。
发明概述
本发明涉及人CD45RC特异的嵌合抗原受体(CAR)，其中所述CAR包含：
(a)至少一个胞外结合结构域，其中所述结合结构域与所述人CD45RC结合，
(b)任选地，至少一个胞外铰链结构域，
(c)至少一个跨膜结构域，以及
(d)至少一个胞内信号转导结构域，其中胞内结构域包含至少一个T细胞初级信号转导结构域和任选地至少一个T细胞共刺激信号转导结构域。
在一个实施方案中，所述胞外结合结构域包含至少一个与人CD45RC结合的抗原结合片段，所述抗原结合片段包含：
(a)包含以下三个CDR的HCVR：
(i)序列SEQ ID NO:1的VH-CDR1；
(ii)VH-CDR2，其序列选自包含序列SEQ ID NO:4、5、6、8、100、116、117、118和119的组；和
(iii)序列SEQ ID NO:3的VH-CDR3；和
(b)包含以下三个CDR的LCVR：
(i)VL-CDR1，其序列选自包含序列SEQ ID NO:15(SASSSVS-X12-YMH)和18(RASSSVS-X12-YMH)的组，其中X12不存在或选自Asn(N)、Ser(S)和Gly(G)；
(ii)VL-CDR2，其序列选自包含序列SEQ ID NO:16、111和120的组；和
(iii)序列SEQ ID NO:17的VL-CDR3。
在一个实施方案中，所述胞外结合结构域包含至少一个与人CD45RC结合的抗原结合片段，所述抗原结合片段包含：
(a)包含以下三个CDR的HCVR：
(i)序列SEQ ID NO:1的VH-CDR1；
(ii)VH-CDR2，其序列选自包含序列SEQ ID NO:4和5的组；和
(iii)序列SEQ ID NO:3的VH-CDR3；和
(b)包含以下三个CDR的LCVR：
(i)序列SEQ ID NO:15的VL-CDR1，其中X12不存在；
(ii)序列SEQ ID NO:16的VL-CDR2；和
(iii)序列SEQ ID NO:17的VL-CDR3。
在一个实施方案中，所述胞外结合结构域包含至少一个与人CD45RC结合的抗原结合片段，所述抗原结合片段包含：
(a)包含以下三个CDR的HCVR：
(i)序列SEQ ID NO:1的VH-CDR1；
(ii)序列SEQ ID NO:4的VH-CDR2；和
(iii)序列SEQ ID NO:3的VH-CDR3；和
(b)包含以下三个CDR的LCVR：
(i)序列SEQ ID NO:15的VL-CDR1，其中X12不存在；
(ii)序列SEQ ID NO:16的VL-CDR2；和
(iii)序列SEQ ID NO:17的VL-CDR3。
在一个实施方案中，所述胞外结合结构域包含至少一个与人CD45RC结合的抗原结合片段，所述抗原结合片段包含：
(a)包含以下三个CDR的HCVR：
(i)序列SEQ ID NO:1的VH-CDR1；
(ii)VH-CDR2，其序列选自包含序列SEQ ID NO:4、6和100的组；和
(iii)序列SEQ ID NO:3的VH-CDR3；和
(b)包含以下三个CDR的LCVR：
(i)VL-CDR1，其序列选自包含序列SEQ ID NO:15和18的组，其中X12不存在；
(ii)VL-CDR2，其序列选自包含序列SEQ ID NO:16、111和120的组；和
(iii)序列SEQ ID NO:17的VL-CDR3。
在一个实施方案中，所述胞外结合结构域包含至少一个与人CD45RC结合的抗原结合片段，所述抗原结合片段包含：
1)序列SEQ ID NO:61的HCVR和序列SEQ ID NO:81的LCVR；
2)序列SEQ ID NO:62的HCVR和序列SEQ ID NO:82的LCVR；
3)序列SEQ ID NO:62的HCVR和序列SEQ ID NO:83的LCVR；
4)序列SEQ ID NO:62的HCVR和序列SEQ ID NO:84的LCVR；
5)序列SEQ ID NO:63的HCVR和序列SEQ ID NO:82的LCVR；
6)序列SEQ ID NO:63的HCVR和序列SEQ ID NO:83的LCVR；
7)序列SEQ ID NO:63的HCVR和序列SEQ ID NO:84的LCVR；
8)序列SEQ ID NO:64的HCVR和序列SEQ ID NO:82的LCVR；
9)序列SEQ ID NO:64的HCVR和序列SEQ ID NO:83的LCVR；
10)序列SEQ ID NO:64的HCVR和序列SEQ ID NO:84的LCVR；
11)序列SEQ ID NO:101的HCVR和序列SEQ ID NO:85的LCVR；
12)序列SEQ ID NO:101的HCVR和序列SEQ ID NO:103的LCVR；
13)序列SEQ ID NO:65的HCVR和序列SEQ ID NO:85的LCVR；
14)序列SEQ ID NO:65的HCVR和序列SEQ ID NO:103的LCVR；
15)序列SEQ ID NO:62的HCVR和序列SEQ ID NO:85的LCVR；
16)序列SEQ ID NO:101的HCVR和序列SEQ ID NO:82的LCVR；
17)序列SEQ ID NO:121的HCVR和序列SEQ ID NO:85的LCVR；
18)序列SEQ ID NO:122的HCVR和序列SEQ ID NO:85的LCVR；
19)序列SEQ ID NO:123的HCVR和序列SEQ ID NO:85的LCVR；
20)序列SEQ ID NO:124的HCVR和序列SEQ ID NO:85的LCVR；
21)序列SEQ ID NO:63的HCVR和序列SEQ ID NO:85的LCVR；
22)序列SEQ ID NO:67的HCVR和序列SEQ ID NO:85的LCVR；
23)序列SEQ ID NO:67的HCVR和序列SEQ ID NO:103的LCVR；
24)序列SEQ ID NO:61的HCVR和序列SEQ ID NO:113的LCVR；
25)序列SEQ ID NO:61的HCVR和序列SEQ ID NO:126的LCVR；或
26)包含与1)至23)的HCVR和LCVR的非CDR区的序列具有至少70％同一性的非CDR区的序列的HCVR和LCVR。
在一个实施方案中，所述胞外结合结构域包含至少一个与人CD45RC结合的抗原结合片段，所述抗原结合片段包含：
(a)包含以下三个CDR的HCVR：
(i)序列SEQ ID NO:1的VH-CDR1；
(ii)VH-CDR2，其序列选自包含序列SEQ ID NO:4、5、6、8、100、116、117、118和119的组；和
(iii)序列SEQ ID NO:3的VH-CDR3；和
(b)包含以下三个CDR的LCVR：
(i)VL-CDR1，其序列选自包含序列SEQ ID NO:15和18的组，其中SEQ ID NO:15和18中的X12选自Asn(N)、Ser(S)和Gly(G)；
(ii)序列SEQ ID NO:16的VL-CDR2；和
(iii)序列SEQ ID NO:17的VL-CDR3；
优选地，其中LCVR的Kabat位置L71的氨基酸残基是Phe(F)。
在一个实施方案中，胞外结合结构域包含针对人CD45RC的scFv片段。
在一个实施方案中，铰链结构域是人CD8α的铰链区，优选具有SEQ IDNO:145的序列或与SEQ ID NO:145具有至少70％同一性的序列。
在一个实施方案中，跨膜结构域是来源于人CD8α的跨膜结构域，优选具有SEQ IDNO:153的序列或与SEQ ID NO:153具有至少70％同一性的序列。
在一个实施方案中，初级胞内信号转导结构域包含人CD3ζ的T细胞初级胞内信号转导结构域，优选具有SEQ ID NO:157的序列或与SEQ ID NO:157具有至少70％同一性的序列。
在一个实施方案中，共刺激信号转导结构域选自由CD28胞质信号转导结构域、4-1BB胞质信号转导结构域、OX40胞质信号转导结构域、ICOS胞质信号转导结构域、CD27胞质信号转导结构域和DAP10胞质信号转导结构域组成的组。
在一个实施方案中，本发明的CAR包含：
(i)抗人CD45RC scFv，优选包含具有SEQ ID NO:61的序列的HCVR和具有SEQ IDNO:81的序列的LCVR，优选地通过具有SEQ ID NO:134的序列的接头连接，
(ii)来源于CD8α的铰链结构域，优选具有SEQ ID NO:145的序列，
(iii)人CD8α跨膜结构域，优选具有SEQ ID NO:153的序列，以及
(iv)包含人CD28信号转导结构域的胞内信号转导结构域(优选具有SEQ ID NO:167的序列)和人CD3ζ信号转导结构域(优选具有SEQ ID NO:157的序列)。
本发明还涉及编码本发明的CAR的核酸。
本发明还涉及包含本发明的核酸的表达载体。
本发明还涉及免疫细胞群，其经工程化以在细胞表面表达本发明的CAR。
在一个实施方案中，所述免疫细胞群是CD45RCneg细胞群。
在一个实施方案中，所述免疫细胞群是调节性T细胞群、效应T细胞群、记忆T细胞群、NKT细胞群或MAIT细胞群。
在一个实施方案中，所述免疫细胞群是调节性T细胞群，优选地，其中所述调节性T淋巴细胞群选自由CD4+CD25+Foxp3+Treg、Tr1细胞、TGF-β分泌性Th3细胞、调节性NKT细胞、调节性γδT细胞、调控性CD8+T细胞和双阴性调节性T细胞组成的组。
本发明还涉及包含经工程化在细胞表面上表达本发明的CAR的至少一种免疫细胞群的组合物，其中，所述组合物优选为进一步包含至少一种药学上可接受的赋形剂或载体的药物组合物。
本发明还涉及本发明的免疫细胞群或本发明的药物组合物，其用作药物。
本发明还涉及本发明的免疫细胞群或本发明的组合物，其用于在有需要的受试者中诱导免疫耐受、预防或减少移植排斥，或预防或治疗移植物抗宿主病(GVHD)。
本发明还涉及本发明的免疫细胞群或本发明的组合物，其用于预防、减少和/或治疗CD45R高相关疾病，所述CD45R高相关疾病选自由自身免疫疾病、不期望的免疫反应、单基因疾病、淋巴瘤和癌症组成的组。
定义
“抗体”或“免疫球蛋白”
如本文所用，术语“免疫球蛋白”是指具有两条重链和两条轻链的组合的蛋白，而无论其是否具有任何相关的特异性免疫反应性。“抗体”是指对目标抗原(例如人CD45RC)具有显著已知的特异性免疫反应活性的组装体。本文所用的术语“抗hCD45RC抗体”是指对人CD45RC蛋白显示免疫特异性的抗体。如本文别处所述，对人CD45RC的“特异性”不排除与hCD45RC的物种同源物的交叉反应。
抗体和免疫球蛋白包含轻链和重链，它们之间具有或不具有链间共价连接。对脊椎动物系统中的基本免疫球蛋白结构具有相对深入的理解。上位术语“免疫球蛋白”包括五种不同的抗体类别，它们在生化上并不相同。尽管以下讨论整体上针对IgG类免疫球蛋白分子，但是所有五类抗体都在本发明的范围内。对于IgG，免疫球蛋白包含两条相同的分子量为约23kDa的多肽轻链，和两条相同的分子量为约53-70kDa的重链。这四条链以“Y”构型通过二硫键连接，其中轻链从“Y”的开口处开始并持续整个可变区与重链归在一起。抗体的轻链分类为kappa(κ)或lambda(λ)。每个重链类别可以与κ或λ轻链结合。通常，当免疫球蛋白由杂交瘤、B细胞或基因工程宿主细胞产生时，轻链和重链彼此共价结合，并且两条重链的“尾”区通过共价二硫键或非共价键彼此结合。在重链中，氨基酸序列从Y构型的叉头末端的N-端延伸至每条链末端的C-端。本领域技术人员理解，重链被分类为gamma(γ)、mu(μ)、alpha(α)、delta(δ)或epsilon(ε)，其中有一些亚类(例如γ1-γ4)。这条链的性质决定了抗体的“类别”，分别为IgG、IgM、IgA、IgD或IgE。免疫球蛋白亚类或“同种型”(例如IgGl、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1等)已被充分表征，并已知赋予功能特化。鉴于本公开的内容，这些类别和同种型中每一种的修饰形式对于本领域技术人员都是容易辨别的，并且因此在本发明的范围内。如上所述，抗体的可变区允许抗体选择性地识别并特异性地结合抗原上的表位。即，抗体的轻链可变区(VL结构域)和重链可变区(VH结构域)组合形成了限定三维抗原结合位点的可变区。这种四元抗体结构形成了存在于“Y”的每个臂的末端的抗原结合位点。更具体地说，抗原结合位点由VH和VL链中的每一个上的三个互补决定区(CDR)限定。
“抗体片段”
如本文所用，术语“抗体片段”是指完整抗体的至少一部分，优选完整抗体的抗原结合区或可变区，其保留了与抗原表位特异性相互作用(例如，通过结合、空间位阻、稳定/去稳定、空间分布)的能力。抗体片段的实例包括但不限于Fab、Fab'、F(ab')2、Fv片段、scFv抗体片段、二硫键连接的Fv(sdFv)、由VH和CHI结构域组成的Fd片段、线性抗体、单结构域抗体例如sdAb(VL或VH)、骆驼VHH结构域、由抗体片段形成的多特异性抗体例如包含由铰链区域的二硫键桥连接的两个Fab片段的二价片段以及抗体的分离的CDR或其他表位结合片段。抗原结合片段也可并入单域抗体、大抗体(maxibody)、微抗体(minibody)、纳米抗体(nanobody)、内抗体(intrabody)、二抗体(diabody)、三抗体(triabody)、四抗体(tetrabody)、v-NAR和bis-scFv(参见例如Hollinger and Hudson，Nature Biotechnology23:1126-1136,2005)。抗原结合片段也可以接植到基于多肽的支架中，例如纤连蛋白III型(参见美国专利号6,703,199，其描述了纤连蛋白多肽的微抗体)。抗体的木瓜蛋白酶消化产生两个相同的抗原结合片段(称为“Fab”片段)和一个残余的“Fc”片段(该名称反映了易于结晶的能力)。Fab片段由沿H链的可变区结构域(VH)的整个L链和一条重链的第一个恒定区(CH1)组成。每个Fab片段对于抗原结合来说都是单价的，即它有单一的抗原结合位点。胃蛋白酶处理抗体产生了单个大的F(ab’)2片段，该片段大致对应于具有二价抗原结合活性两个二硫键连接的Fab片段，并且仍然能够交联抗原。Fab’片段与Fab片段的不同之处在于，其在CH1结构域的羧基末端有额外的几个残基，包括来自抗体铰链区的一个或多个半胱氨酸。Fab'-SH是本文中Fab'的名称，其中恒定结构域的半胱氨酸残基含有游离巯基。F(ab')2抗体片段最初是作为之间有铰链半胱氨酸的Fab'片段对产生的。抗体片段的其他化学偶联也是已知的。
“结合片段”或“抗原结合片段”
如本文所用，术语“结合片段”是指本发明抗体的部分或区域，其包含的氨基酸残基少于完整抗体。“结合片段”结合抗原和/或与由之衍生的完整抗体竞争抗原结合(例如，与人CD45RC的特异性结合)。抗体结合片段包括但不限于单链抗体、Fv、Fab、Fab'、Fab'-SH、F(ab)'2、Fd、去岩藻糖基化抗体、二抗体、三抗体和四抗体。
“表征为具有[……]氨基酸由不同的氨基酸取代”
如本文所用，短语“表征为具有[……]氨基酸由不同的氨基酸取代”对于给定序列是指在所述序列中存在“保守性氨基酸修饰”。
“保守性氨基酸修饰”
“保守性氨基酸修饰”是指不显著影响或改变含有氨基酸序列的抗体或其结合片段的结合特征的修饰。这样的保守性修饰包括氨基酸取代、添加和缺失。可以通过本领域已知的标准技术例如定点诱变和PCR介导的诱变，将修饰引入抗体或其结合片段中。
保守性氨基酸取代通常是其中的氨基酸残基由具有理化性质相似的侧链的氨基酸残基取代的那些氨基酸取代。特定的可变区和CDR序列可包含1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、11个、12个、13个、14个、15个、16个、17个、18个、19个、20个、21个、22个、23个、24个、25个、26个、27个、28个、29个、30个、31个、32个、33个、34个或更多个氨基酸插入、缺失和/或取代。在进行取代时，优选的取代将是保守性修饰。具有相似侧链的氨基酸残基家族已在本领域中有定义。这些家族包括具有碱性侧链的氨基酸(例如赖氨酸、精氨酸、组氨酸)、具有酸性侧链的氨基酸(例如天冬氨酸、谷氨酸)、具有不带电荷的极性侧链的氨基酸(例如甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、半胱氨酸、色氨酸)、具有非极性侧链的氨基酸(例如丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸)、具有β支链侧链的氨基酸(例如苏氨酸、缬氨酸、异亮氨酸)和具有芳香族侧链的氨基酸(例如酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、组氨酸)。因此，本发明的抗体或其结合片段的CDR和/或可变区中的一个或多个氨基酸残基可以被来自相同侧链家族的其他氨基酸残基替代，并且可以使用本文所述的测定法检测改变的抗体所保留的功能(即本文所述的性质，例如与hCD45RC的结合)。在另一个实施方案中，可以将本发明的抗体或其结合片段的CDR和/或可变区中的氨基酸片段替换为侧链家族成员顺序和/或组成不同的结构相似的片段。
“CDR”或“互补决定区”
如本文所用，术语“CDR”或“互补决定区”是指在重链和轻链多肽的可变区内发现的非邻接的抗原结合位点。根据表1的规则鉴定CDR，其由以下推断：Kabat等,1991.Sequences of proteins of immunological interest(第5版).Bethesda,MD:U.S.Dep.of Health and Human Services；和Chothia和Lesk,1987.J Mol Biol.196(4):901-17：
Figure BDA0003952383070000131
Figure BDA0003952383070000141
Figure BDA0003952383070000151
*Saul&Poljak,1992.Proteins.14(3):363-71
“工程化的”
如本文所用，术语“工程化的”或者“修饰的”是指已经转染、转化或转导的细胞。
“表位”
如本文所用，术语“表位”是指一种或多种蛋白上抗体或其结合片段与之结合的氨基酸的特定排列。表位通常由分子的化学活性表面基团如氨基酸或糖侧链组成，并且具有特定的三维结构特征以及特定的电荷特征。表位可以是线性(或连续的)表位或构象表位，即，涉及抗原的不同区域中可以不必是连续的两个或更多个氨基酸序列。
“片段”
如本文所用，术语抗原的“片段”是指作为短肽的抗原的任何子集。在一些实施方案中，抗原片段是长度至少为6个氨基酸的肽。在一些实施方案中，抗原片段是长度为6到50个氨基酸、6到30个氨基酸或6到20个氨基酸的肽。
“框架区”或“FR”或“非CDR区”
本文所用的术语“框架区”、“FR”或“非CDR区”包括作为可变区的一部分但不是CDR的一部分的氨基酸残基(例如，使用Kabat/Chothia的CDR定义)。因此，可变区框架的长度在约100-120个氨基酸之间，但仅包括CDR以外的那些氨基酸。
对于HCVR的具体实例和Kabat/Chothia定义的CDR：
-根据Chothia/AbM的定义，FR1可对应于可变区的涵盖氨基酸1-25的结构域，或根据Kabat的定义在5个残基之后；
-FR2可对应于可变区的涵盖氨基酸36-49的结构域；
-FR3可对应于可变区的涵盖氨基酸67-98的结构域；以及
-FR4可对应于可变区的从氨基酸104-110至可变区末端的结构域。
轻链的框架区类似地被各LCVR的CDR分开。在天然存在的抗体中，每个单体抗体上存在的六个CDR是短的非连续的氨基酸序列，当抗体在水性环境中呈现三维构型时，所述氨基酸序列特异性定位以形成抗原结合位点。重链和轻链可变结构域的其余部分显示氨基酸序列的较小分子间变异性，并且称为框架区。框架区大部分采用β-折叠构象，并且CDR形成环，这些环连接β-折叠结构，并且在一些情况下形成β-折叠结构的一部分。因此，这些框架区作用形成支架，所述支架通过链间非共价相互作用将六个CDR定位在正确的方向。由定位的CDR形成的抗原结合位点限定了与免疫反应性抗原上的表位互补的表面。这个互补表面促进抗体与免疫反应性抗原表位的非共价结合。CDR的位置可由本领域普通技术人员容易地确定。
“重链区”
如本文所用，术语“重链区”包括来源于免疫球蛋白重链的恒定结构域的氨基酸序列。包含重链区的蛋白包含CH1结构域、铰链(例如上、中和/或下铰链区)结构域、CH2结构域、CH3结构域或其变体或片段中的至少一个。在一个实施方案中，本发明的抗体或其结合片段可以包含免疫球蛋白重链的Fc区(例如，铰链部分、CH2结构域和CH3结构域)。在另一个实施方案中，本发明的抗体或其结合片段缺少恒定结构域的至少一个区域(例如，CH2结构域的全部或部分)。在某些实施方案中，至少一个且优选所有的恒定区均来源于人免疫球蛋白重链。例如，在一个优选的实施方案中，重链区包含完全的人铰链结构域。在其它优选的实施方案中，重链区包含完全的人Fc区(例如，来自人免疫球蛋白的铰链、CH2和CH3结构域序列)。在某些实施方案中，重链区的组成性恒定结构域来自不同的免疫球蛋白分子。例如，蛋白的重链区可包含来源于IgG1分子的CH2结构域和来源于IgG3或IgG4分子的铰链区。在其它实施方案中，恒定结构域是包含不同免疫球蛋白分子的区域的嵌合结构域。例如，铰链可包含来自IgG1分子的第一区域和来自IgG3或IgG4分子的第二区域。如上所述，本领域普通技术人员理解，可以修饰重链区的恒定结构域，使得它们在氨基酸序列上与天然存在的(野生型)免疫球蛋白分子不同。即，本发明的抗体或其结合片段可以包含对一个或多个重链恒定结构域(CH1、铰链、CH2或CH3)和/或对轻链恒定结构域(CL)的改变或修饰。示例性修饰包括在一个或多个结构域中添加、缺失或取代一个或多个氨基酸。
“铰链区”
在抗体中，术语“铰链区”包括连接CH1结构域与CH2结构域的重链分子区域。这个铰链区包含约25个残基并且是柔性的，因此允许两个N-末端抗原结合区独立移动。铰链区可细分为三个不同的结构域：上、中和下铰链结构域(Roux等,1998.J Immunol.161(8):4083-90)。在CAR分子中，术语“铰链区”是指连接胞外结合结构域与跨膜结构域的区域。
“高变环”
术语“高变环”与互补决定区(CDR)不是严格的同义词，因为高变环(HV)是基于结构定义的，而CDR是基于序列变异性定义的(Kabat等,1991.Sequences of proteins ofimmunological interest(5th ed.).Bethesda,MD:U.S.Dep.of Health and HumanServices)，并且在一些VH和VL结构域中，HV和CDR的限制可能不同。VL和VH结构域的CDR通常可由上文已经解释的Kabat/Chothia定义来定义。
“同一性”或“同一的”
如本文所用，术语“同一性”或“同一的”当用于两个或更多个氨基酸序列的序列之间、或两个或更多个核酸序列的序列之间的关系时，是指氨基酸序列或核酸序列之间的序列相关性程度，这通过两个或更多个氨基酸残基或核酸残基的片段之间的匹配数目确定。“同一性”测量由特定数学模型或计算机程序(即“算法”)处理的具有缺口比对(如果有的话)的两条或更多条序列中较小的序列之间的相同匹配的百分比。
相关氨基酸序列或核酸序列的同一性可以通过已知方法容易地计算。这样的方法包括但不限于描述于以下的那些：Lesk A.M.(1988).Computational molecular biology:Sources and methods for sequence analysis.New York,NY:Oxford UniversityPress；Smith D.W.(1993).Biocomputing:Informatics and genome projects.SanDiego,CA:Academic Press；Griffin A.M.&Griffin H.G.(1994).Computer analysis ofsequence data,Part 1.Totowa,NJ:Humana Press；von Heijne G.(1987).Sequenceanalysis in molecular biology:treasure trove or trivial pursuit.San Diego,CA:Academic press；Gribskov M.R.&Devereux J.(1991).Sequence analysis primer.NewYork,NY:Stockton Press；Carillo等,1988.SIAM J Appl Math.48(5):1073-82。
设计用于测定同一性的优选方法以在所检测的序列之间给出最大匹配。测定同一性的方法描述在公众可获得的计算机程序中。用于测定两条序列之间同一性的优选的计算机程序方法包括GCG程序包，包括GAP(Genetics Computer Group,University ofWisconsin,Madison,WI；Devereux等,1984.Nucleic Acids Res.12(1Pt 1):387-95)、BLASTP、BLASTN和FASTA(Altschul等,1990.J Mol Biol.215(3):403-10)。BLASTX程序可从美国国家生物技术信息中心(NCBI)和其它来源由公众获得(BLAST Manual,Altschul等NCB/NLM/NIH Bethesda,Md.20894)。也可使用公知的Smith Waterman算法来测定同一性。
“免疫细胞”
如本文所用，术语“免疫细胞”通常包括来源于骨髓中产生的造血干细胞(HSC)的白血细胞(白细胞)。免疫细胞的实例包括但不限于淋巴细胞(T细胞、B细胞和自然杀伤(NK)细胞)和髓源性细胞(中性粒细胞、嗜酸性粒细胞、碱性粒细胞、单核细胞、巨噬细胞、树突状细胞)。
“免疫特异性的”、“特异于”或“特异结合”
如本文所用，如果抗体或其结合片段以可检测水平与抗原(例如hCD45RC)反应，优选以大于或等于约106M-1，优选大于或等于约107M-1、108M-1、5×108M-1、109M-1、5×109M-1或更高的亲和常数(KA)，则称其为对所述抗原是“免疫特异性的”、“特异于”所述抗原或“特异结合”所述抗原。
抗体或其结合片段对其同源抗原的亲和力通常也表示为平衡解离常数(KD)。如果抗体或其结合片段以可检测水平与抗原(例如hCD45RC)反应，优选以小于或等于10-6M，优选小于或等于10-7M、5x10-8M、10-8M、5x10-9M、10-9M或更小的KD反应，则其被称为对所述抗原是“免疫特异性的”、“特异于”所述抗原或“特异结合”所述抗原。
抗体或其结合片段的亲和力可以使用常规技术容易地确定，例如Scatchard,1949.Ann NY Acad Sci.51:660-672所述。抗体或其结合片段与抗原、细胞或组织的结合性质通常可以使用免疫检测方法来测定和评估，所述免疫检测方法包括例如ELISA、基于免疫荧光的测定例如免疫组织化学(IHC)和/或荧光激活细胞分选(FACS)或通过表面等离子体共振(SPR，例如使用
Figure BDA0003952383070000191
)。
“分离的抗体”
如本文所用，术语“分离的抗体”旨在指基本上不含具有不同抗原特异性的其他抗体的抗体(例如，特异性结合hCD45RC的分离的抗体基本上不含特异性结合hCD45RC以外的抗原的抗体)。然而，特异性结合hCD45RC的分离抗体可能与其他抗原(例如来自其他物种的CD45RC分子)具有交叉反应性。此外，分离的抗体可以基本上不含其他细胞物质和/或化学物质，尤其是会干扰抗体的诊断或治疗用途的那些，包括但不限于酶、激素和其他蛋白或非蛋白组分。
“分离的核酸”
如本文所用，术语“分离的核酸”旨在指基本上与天然伴随天然序列的其他基因组DNA序列以及蛋白或复合物(例如核糖体和聚合酶)分离的核酸。此术语包括已经从其天然存在的环境中移出的核酸序列，并且包括重组或克隆的DNA分离物和化学合成的类似物或由异源系统生物合成的类似物。基本上纯的核酸包括核酸的分离形式。当然，这是指最初分离的核酸，并且不排除随后人为添加到分离的核酸中的基因或序列。
“配体”
如本文所用，术语“配体”是指配体/受体对的成员，并且与该对中的另一个成员结合。
“单克隆抗体”
如本文所用，术语“单克隆抗体”是指从一群基本上同质的抗体获得的抗体，即，群体中包含的各个抗体是相同的，除了可能以少量存在的可能的天然存在的突变。单克隆抗体是高度特异性的，针对单一抗原位点。此外，与包括针对不同决定簇(表位)的不同抗体的多克隆抗体制剂相比，每种单克隆抗体针对抗原上的单个决定簇。除了它们的特异性之外，单克隆抗体的优点还在于它们可以在不被其它抗体污染的情况下合成。修饰语“单克隆”不应被解释为需要通过任意特定方法产生抗体。例如，本发明的单克隆抗体或其结合片段可以通过首先由Kohler等,1975.Nature.256(5517):495-7描述的杂交瘤方法制备，或者可以使用重组DNA方法在细菌、真核动物或植物细胞中制备(专利US4,816,567)。“单克隆抗体”也可以使用例如Clackson等,1991.Nature.352(6336):624-8和Marks等,1991.J MolBiol.222(3):581-97中描述的技术从噬菌体抗体文库中分离。
“MAIT细胞”
如本文所用，术语“MAIT细胞”是指粘膜相关的不变T(mucosal-associatedinvariant T)细胞。MAIT细胞可通过其TCR和独立于TCR的信号(例如细胞因子)被激活。MAIT细胞能够感知细菌或病毒感染，并响应这些信号产生效应细胞因子和/或脱颗粒。
“NK细胞”
如本文所用，“NK细胞”或“自然杀伤细胞”是指在先天免疫中发挥重要作用的细胞毒性淋巴细胞。NK细胞经常与其他细胞接触。NK细胞在其细胞表面表达活化和抑制受体。这种机制允许NK细胞识别一个细胞是“正常”的(因此不能被消除)或者一个细胞是“异常”的(因而被杀死)，如肿瘤细胞或感染细胞。
“NKT细胞”
如本文所用，“NKT细胞”或“自然杀伤T细胞”是指显示T淋巴细胞标志物和NK淋巴细胞标志物的细胞毒性淋巴细胞。自然杀伤(NK)细胞和自然杀伤T(NKT)细胞是先天免疫中的两种重要细胞。NK和NKT细胞都是细胞毒性细胞，可诱导致病细胞和肿瘤细胞的细胞死亡。NK细胞和NKT细胞的主要区别在于NK细胞是大颗粒淋巴细胞，而NKT是一种T细胞。
“核酸”或“多核苷酸”
如本文所用，术语“核酸”或“多核苷酸”是指通过磷酸二酯键共价连接的核苷酸的聚合物，例如单链或双链形式的脱氧核糖核酸(DNA)或核糖核酸(RNA)。除非特别限定，该术语包括含有天然核苷酸的已知类似物的核酸，其具有与参考核酸相似的结合性质并且以与天然存在的核苷酸类似的方式代谢。除非另有说明，否则特定核酸序列还隐含地包括其保守修饰的变体(例如，简并密码子取代)、等位基因、直系同源物、SNP和互补序列以及明确所示的序列。具体而言，简并密码子取代可以通过生成其中的一个或多个选定(或全部)密码子的第三位被混合碱基和/或脱氧肌苷残基取代的序列来实现(Batzer等,Nucleic AcidRes.19:5081(1991)；Ohtsuka等,J.Biol.Chem.260:2605-2608(1985)；和Rossolini等,Mol.Cell.Probes 8:91-98(1994))。
“预防”或“防止”或“阻止”
如本文所用，术语“预防”、“防止”和“阻止”是指预防性和防止性措施，其中目的是减少受试者在给定时间段内将要发展病理状况或病症的机会。这样的减少可以反映在例如受试者中病理状况或病症的至少一种症状的延迟发作中。
“启动子”
如本文所用，术语“启动子”是指启动多核苷酸序列的特定转录所需的由细胞的合成机制或引入的合成机制识别的DNA序列。
“受试者”
如本文所用，术语“受试者”是指哺乳动物，优选人。在一个实施方案中，受试者可以是“患者”，即温血动物，更优选人，其正在等待接受或正在接受医疗护理或曾经/正/将成为医疗程序的对象，或被监测疾病的发展。术语“哺乳动物”在这里是指任意哺乳动物，包括人、家畜和农场动物以及动物园动物、运动型动物或宠物动物，例如狗、猫、牛、马、绵羊、猪、山羊、兔等。优选地，哺乳动物是灵长类，更优选是人。
“转染”或“转化”或“转导”
如本文所用，术语“转染”或“转化”或“转导”是指将外源核酸转移或引入宿主细胞的方法。“转染”或“转化”或“转导”的细胞是指已经用外源核酸转染、转化或转导的细胞。细胞包括原代受试细胞及其后代。
“治疗”或“改善”
如本文所用，术语“治疗”或“改善”是指治疗性治疗，不包括预防性或防止性措施；其中目的是减缓(减轻)目标病理状况或病症。需要治疗的那些包括已经患有病症的那些以及怀疑患有病症的那些。如果在接受治疗有效量的本发明的分离的抗体或其结合片段、核酸、表达载体、组合物、药物组合物或药物后，受试者显示可观察和/或可测量的以下一种或多种降低或不存在，则认为所述受试者的目标病理状况或病症得到成功“治疗”：CD45RC高细胞数量减少；CD45RC高的总细胞的百分比降低；在一定程度上缓解与特定疾病或病况相关的一种或多种症状；发病率和死亡率降低；和/或生活质量问题得到改善。用于评估疾病的成功治疗和改善的上述参数可通过医师熟悉的常规方法容易地测量。
“Treg细胞”
如本文所用，术语“Treg细胞”是指能够抑制、阻止或预防过度或不期望的炎症反应(例如，自身免疫或过敏反应)的细胞。在一个实施方案中，本发明的Treg细胞群能够具有抑制活性。在一个实施例中，所述抑制活性不依赖于接触。在另一个实施方案中，所述抑制活性依赖于接触。在一个实施方案中，本发明的Treg细胞群对效应T细胞具有抑制作用，优选所述抑制作用依赖于TCR表达和/或活化。
“Teff细胞”
如本文所用，术语“Teff细胞”是指T效应细胞。Teff细胞包括CD4+T辅助细胞和CD8+细胞毒性T细胞。Teff细胞在抗原攻击后的细胞介导的免疫中发挥核心作用。Treg细胞是Teff细胞的关键调节者。
“记忆T细胞”
如本文所用，术语“记忆T细胞”是指先前遇到其同源抗原并对其作出反应的T细胞的子集。与初始T细胞(即尚未暴露于抗原的T细胞)相比，记忆T细胞可以安排更快、更强的免疫反应。
“可变区”或“可变结构域”
如本文所用，术语“可变”是指可变结构域VH和VL的某些区域的序列在抗体之间差异非常大，并且用于每个特定抗体对其靶抗原的结合和特异性的事实。然而，变异性并非均匀分布于抗体的整个可变区。它集中在每个VL结构域和VH结构域中称为“高变环”的三个区段中，所述区段形成抗原结合位点的部分。
Vλ轻链结构域的第一、第二和第三高变环在本文中称为L1(λ)、L2(λ)和L3(λ)，并且可定义为包含VL结构域中的残基24-33(L1(λ)，由9、10或11个氨基酸残基组成)、49-53(L2(λ)，由3个残基组成)和90-96(L3(λ)，由6个残基组成)(Morea等,2000.Methods.20(3):267-79)。
Vκ轻链结构域的第一、第二和第三高变环在本文中称为L1(κ)、L2(κ)和L3(κ)，并且可定义为包含VL结构域中的残基25-33(L1(κ)，由6、7、8、11、12或13个残基组成)、49-53(L2(κ)，由3个残基组成)和90-97(L3(κ)，由6个残基组成)(Morea等,2000.Methods.20(3):267-79)。
VH结构域的第一、第二和第三高变环在本文中称为H1、H2和H3，并且可定义为包含VH结构域中的残基25-33(H1，由7、8或9个残基组成)、52-56(H2，由3或4个残基组成)和91-105(H3，长度高度可变)(Morea等,2000.Methods.20(3):267-79)。
除非另有说明，否则术语L1、L2和L3分别指VL结构域的第一、第二和第三高变环，并涵盖从Vκ和Vλ同种型获得的高变环。术语H1、H2和H3分别指VH结构域的第一、第二和第三高变环，并涵盖从任意已知重链同种型，包括gamma(γ)、mu(μ)、alpha(α)、delta(δ)或epsilon(ε)获得的高变环。高变环L1、L2、L3、H1、H2和H3可以各自包含如上文定义的“互补决定区”或“CDR”的一部分。
“变体”
术语抗原的“变体”在本文中指与天然抗原几乎相同且具有相同生物活性的抗原。天然抗原与其变体之间的最小差异可在于例如氨基酸取代、缺失和/或添加。此类变体可以包含例如保守氨基酸取代。
在一些实施方案中，抗原的变体与天然抗原的序列呈现至少或约70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98或99％的序列同一性。
发明详述
本发明的第一方面涉及对人CD45RC特异的嵌合抗原受体(CAR)，其中所述CAR包含至少一个与所述人CD45RC结合的胞外结合结构域。在一个实施方案中，胞外结合结构域是抗原结合结构域，例如下文所述的抗体或其结合片段。
本文公开了与人CD45RC(hCD45RC)结合的分离抗体或其结合片段。所述分离的抗体或其结合片段可以是纯化的。
优选地，所述分离的抗体或其结合片段纯化至：
(1)通过Lowry法测定，以重量计大于80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％或以上的抗体或其结合片段，最优选大于96％、97％、98％或99％；
(2)通过使用旋转杯测序仪足以获得N-末端或内部氨基酸序列的至少15个残基的程度；或
(3)在还原或非还原条件下并使用考马斯蓝或优选银染色通过SDS-PAGE所示的均一性。
本文描述的抗体或其结合片段结合人CD45RC(hCD45RC)。
如本文所用，术语“CD45”(也称为CD45R或PTPRC)是指以不同同工型存在的跨膜糖蛋白。CD45的这些独特同工型的胞外结构域结构并不相同，这源于分别编码CD45胞外区的A、B和C决定簇的3个可变外显子(外显子4、5和6)的选择性剪接。与限制性表位反应的抗体聚类为“CD45R”。因此，抗CD45RA、抗CD45RB和抗CD45RC抗体分别识别包括A、B和C决定簇的表达的CD45同工型。CD45的各种同工型具有不同的胞外结构域，但在膜的近端具有相同的胞外序列，以及跨膜结构域和大的胞质尾区段(含有两个串联的同源且高度保守的约300个残基的磷酸酶结构域)。CD45及其同工型与T和B淋巴细胞上的淋巴细胞磷酸酶相关磷蛋白(LPAP)非共价结合。据报道，CD45与几种其它细胞表面抗原，包括CD1、CD2、CD3和CD4相关。CD45参与信号转导淋巴细胞激活。以字母“h”开头(例如hCD45)时，意指CD45是人起源的。
如本文所用，术语“CD45RC”是指本领域技术人员公知的200-220kDa单链I型膜糖蛋白。CD45RC是CD45的选择性剪接同工型，包含编码C决定簇的外显子6(因此称为术语CD45RC，即限于C决定簇的CD45)，但缺少分别编码A和B决定簇的外显子4和5。人CD45RC的氨基酸序列在SEQ ID NO:104中给出，对应于UniProt登录号P08575-10(版本10，于2018年3月28日修改—校验和(Checksum)：F92C874C9A114890)。这个CD45RC同工型在B细胞以及CD8+T细胞和CD4+T细胞的亚组上表达，但不在CD8+或CD4+Treg、CD14+单核细胞或PMN上表达(Picarda等,2017.JCI Insight.2(3):e90088)。尽管一些单克隆抗体能识别所有不同同工型所共有的CD45部分中的表位(这些称为抗CD45抗体)，但其它单克隆抗体对给定同工型具有受限的特异性，这取决于它们识别哪个决定簇(A、B或C)。以字母“h”开头(例如hCD45RC)时，意指CD45RC是人起源的。
在一个实施方案中，所述抗体或其结合片段与hCD45RC的胞外结构域结合。在一个实施方案中，所述抗体或其结合片段与存在于hCD45RC的胞外结构域上的至少一个表位结合。
在一个实施方案中，所述抗体或其结合片段与hCD45的外显子6编码的C决定簇结合。在一个实施方案中，所述抗体或其结合片段与hCD45的外显子6编码的C决定簇上的至少一个表位结合。
在一个实施方案中，hCD45的外显子6编码的C决定簇的氨基酸序列包含SEQ IDNO:23或由其组成。在一个实施方案中，编码hCD45的C决定簇的外显子6的核酸序列包含SEQID NO:24或由其组成。
Figure BDA0003952383070000251
在一个实施方案中，所述抗体或其结合片段与至少一个表位结合，所述表位包含SEQ ID NO:23或其片段，或由其组成。
在一个实施方案中，所述抗体或其结合片段与至少一个表位结合，所述表位包含与SEQ ID NO:23或其片段具有至少约70％，优选至少75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高同一性的序列，或由其组成。
在一个实施方案中，所述抗体或其结合片段与至少一个表位结合，编码所述表位的核酸序列包含SEQ ID NO:24或其片段，或由其组成。
在一个实施方案中，所述抗体或其结合片段与至少一个表位结合，编码所述表位的核酸序列包含与SEQ ID NO:24或其片段具有至少约70％，优选至少75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高同一性的序列，或由其组成。
在一个实施方案中，所述抗体或其结合片段与至少一个表位结合，所述至少一个表位包含SEQ ID NO:23或其片段的至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46或47个氨基酸，或由其组成；或包含与SEQ ID NO:23或其片段具有至少约70％，优选至少75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高同一性的序列的至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46或47个氨基酸，或由其组成。
在一个实施方案中，所述抗体或其结合片段与至少一个表位结合，所述至少一个表位包含SEQ ID NO:23或其片段的至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46或47个连续氨基酸，或由其组成；或包含与SEQ ID NO:23或其片段具有至少约70％，优选至少75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高同一性的序列的至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46或47个连续氨基酸，或由其组成。
在一个实施方案中，包含SEQ ID NO:23或由其组成的所述至少一个表位的片段包含1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46或47个氨基酸残基，或由其组成。
在一个实施方案中，包含SEQ ID NO:23或由其组成的所述至少一个表位的片段包含1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46或47个氨基酸残基或由其组成，所述氨基酸残基分布于包含SEQ ID NO:23或由其组成的序列的10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190、200、210、220、230、240、250、260、270、280、290、300、310、320、330、340、350、360、370、380、390、400、410、420、430、440、450、460、470、480、490、500、510、520、530、540、550、560、570、580、590、600、610、620、630、640、650、660、670、680、690、700、710、720、73、740、750、760、770、780、790、800、810、820、830、840、850、860、870、880、890、900、910、920、930、940、950、960、970、980、990、1000、1010、1020、1030、1040、1050、1060、1070、1080、1090、1100或更多个连续氨基酸残基中。
在一个实施方案中，包含SEQ ID NO:23的序列是SEQ ID NO:99所示的hCD45的序列，对应于UniProt登录号P08575-3(版本3，于2018年3月28日修改-校验和：6E942E2BF6B17AC5)。
Figure BDA0003952383070000271
Figure BDA0003952383070000281
在一个实施方案中，包含SEQ ID NO:23的序列是SEQ ID NO:104所示的hCD45RC的序列，对应于UniProt登录号P08575-10(版本10，于2018年3月28日修改-校验和：F92C874C9A114890)。
Figure BDA0003952383070000282
Figure BDA0003952383070000291
在一个实施方案中，所述抗体或其结合片段不结合由hCD45的外显子4编码的A决定簇。在一个实施方案中，所述抗体或其结合片段不结合由hCD45的外显子4编码的A决定簇上的至少一个表位。
在一个实施方案中，由hCD45的外显子4编码的A决定簇的氨基酸序列包含SEQ IDNO:105或由其组成。
Figure BDA0003952383070000292
在一个实施方案中，所述抗体或其结合片段不结合由hCD45的外显子5编码的B决定簇。在一个实施方案中，所述抗体或其结合片段不结合由hCD45的外显子5编码的B决定簇上的至少一个表位。
在一个实施方案中，由hCD45的外显子5编码的B决定簇的氨基酸序列包含SEQ IDNO:106或由其组成。
Figure BDA0003952383070000293
在一个实施方案中，所述抗体或其结合片段不结合hCD45RA。在一个实施方案中，所述抗体或其结合片段不结合hCD45RA的至少一个表位。
在一个实施方案中，hCD45RA的氨基酸序列包含SEQ ID NO:107或由其组成，对应于UniProt登录号P08575-8(版本8，于2018年3月28日修改-校验和：F42C1FEC9EDE4BC0)。
Figure BDA0003952383070000301
在一个实施方案中，所述抗体或其结合片段不结合hCD45RB。在一个实施方案中，所述抗体或其结合片段不结合hCD45RB的至少一个表位。
在一个实施方案中，hCD45RB的氨基酸序列包含SEQ ID NO:108或由其组成，对应于UniProt登录号P08575-9(版本9，于2018年3月28日修改-校验和：745870037910C575)。
Figure BDA0003952383070000311
在一个实施方案中，所述抗体或其结合片段不结合hCD45RAB。在一个实施方案中，所述抗体或其结合片段不结合hCD45RAB的至少一个表位。
在一个实施方案中，hCD45RAB的氨基酸序列包含SEQ ID NO:109或由其组成，对应于UniProt登录号P08575-5(版本5，于2018年3月28日修改-校验和：EA40BE995CD98F7C)。
Figure BDA0003952383070000321
在一个实施方案中，所述抗体或其结合片段不结合hCD45R0。在一个实施方案中，所述抗体或其结合片段不结合hCD45R0的至少一个表位。
在一个实施方案中，hCD45R0的氨基酸序列包含SEQ ID NO:110或由其组成，对应于UniProt登录号P08575-4(版本4，于2018年3月28日修改-校验和：D3CB364EF4243384)。
Figure BDA0003952383070000331
在一个实施方案中，至少一个表位是构象表位。在另一个实施方案中，至少一个表位是连续表位。
在一个实施方案中，所述抗体或其结合片段结合hCD45RC，其平衡解离常数(Kd)为约5x10-7 M或更低，优选约2.5x10-7 M或更低，约1x10-7 M或更低，约7.5x10-8 M或更低，约5x10-8 M或更低，约1x10-8 M或更低。
在一个实施方案中，所述抗体或其结合片段结合hCD45RC，其结合速率(Kon)为约1×104M-1sec-1或更高，优选约5×104M-1sec-1或更高，约1×105M-1sec-1或更高，约2.5×105M- 1sec-1或更高，约5×105M-1sec-1或更高。
在一个实施方案中，所述抗体或其结合片段结合hCD45RC，其解离速率(koff)为约5x10-2 sec-1或更低，优选约4x10-2 sec-1或更低，约3x10-2 sec-1或更低，约2x10-2 sec-1或更低，约1.5x10-2 sec-1或更低。
在一个实施方案中，所述抗体或其结合片段以以下的至少一项、优选以以下的至少两项、更优选以以下的三项与hCD45RC结合：
-平衡解离常数(Kd)为约5×10-7M或更低，优选约2.5×10-7M或更低，约1×10-7M或更低，约7.5×10-8M或更低，约5×10-8M或更低，约1×10-8M或更低；
-结合速率(Kon)为约1×104M-1sec-1或更高，优选约5×104M-1sec-1或更高，约1×105M-1sec-1或更高，约2.5×105M-1sec-1或更高，约5×105M-1sec-1或更高；以及
-解离速率(koff)为约5×10-2sec-1或更低，优选约4×10-2sec-1或更低、约3×10- 2sec-1或更低、约2×10-2sec-1或更低、约1.5×10-2sec-1或更低。
用于测定抗体或其结合片段对其配体的亲和力(包括例如测定Kd、Koff和Kon)的方法是本领域公知的，并且包括但不限于表面等离子体共振(SPR)、荧光激活细胞分选(FACS)、酶联免疫吸附测定(ELISA)、AlphaLISA和KinExA。
优选的方法是
Figure BDA0003952383070000341
其依赖于SPR，使用固定化CD45RC来测定抗体或其结合片段的亲和力。实施这个方法的方式将在实施例部分中进一步阐述。
在一个实施方案中，所述抗体或其结合片段是多克隆抗体或其结合片段。
在一个优选的实施方案中，所述抗体或其结合片段是单克隆抗体或其结合片段。
在一个实施方案中，所述抗体或其结合片段是选自由包含以下或由以下组成的组的分子：完整抗体、单链抗体、二聚体单链抗体、单结构域抗体、Fv、Fab、Fab'、Fab'-SH、F(ab)'2、Fd、脱岩藻糖基化抗体、双特异性抗体、双抗体(diabody)、三抗体(triabody)和四抗体(tetrabody)。
抗体结合片段可以使用标准方法获得。例如，可以根据常规技术通过蛋白酶消化分离的抗体来产生Fab或F(ab')2片段。还应当理解，可以使用已知方法修饰所述抗体或其结合片段。例如，为了减缓体内清除并获得更理想的药代动力学特征，可以用聚乙二醇(PEG)修饰抗体或其结合片段。用于将PEG与抗体或其结合片段偶联和位点特异性结合的方法描述于例如Leong等,2001.Cytokine.16(3):106-19；Delgado等,1996.Br J Cancer.73(2):175-82。
在一个实施方案中，所述抗体或其结合片段是选自包含单特异性体(unibody)、结构域抗体(domain antibody)和纳米抗体(nanobody)或由其组成的组的分子。
在一些实施方案中，所述抗体或其结合片段是选自包含以下或由以下组成的组的模拟物：affibody、affilin、affitin、adnectin、atrimer、evasin、DARPin、anticalin、avimer、fynomer、versabody和duocalin。
在一个实施方案中，所述抗体或其结合片段还涵盖多特异性抗体或其结合片段，即对多于一种(例如至少两种)的不同抗原具有免疫特异性，所述抗原的其中一种是本发明的hCD45RC。
在一个实施方案中，所述抗体或其结合片段还涵盖抗体或其结合片段的聚合物，即多于一种(例如至少两种)相同或不同的抗体或其结合片段直接或间接地共价连接在一起。
在下文中，除非另有明确说明，否则CDR编号和定义根据Kabat/Chothia定义。
在一个实施方案中，所述抗体或其结合片段包含重链可变区(本文中缩写为HCVR或VH)，其包含至少一个，优选至少两个，更优选以下三个互补决定区(CDR)：
VH-CDR1：NYYIG(SEQ ID NO:1)；
VH-CDR2：X1-IF-X2-GG-X3-Y-X4-N-X5-X6-X7-X8-X9-X10-G(SEQ ID NO:2)；和
VH-CDR3：RNFDY(SEQ ID NO:3)，
并且：
X1选自Asp(D)、Ile(I)和Arg(R)；
X2选自Pro(P)和Ser(S)；
X3选自Asp(D)、Ser(S)和Gly(G)；
X4选自Ala(A)和Thr(T)；
X5选自Ser(S)和Tyr(Y)；
X6选自Asn(N)、Ala(A)和Ser(S)；
X7选自Glu(E)、Asp(D)、Pro(P)和Gln(Q)；
X8选自Lys(K)和Ser(S)；
X9选自Phe(F)和Val(V)；和
X10选自Lys(K)和Gln(Q)。
在一个实施方案中，所述抗体或其结合片段包含HCVR，其包含以下三个CDR：
VH-CDR1：NYYIG(SEQ ID NO:1)；
VH-CDR2：X1-IF-X2-GG-X3-Y-X4-N-X5-X6-X7-X8-X9-X10-G(SEQ ID NO:2)；和
VH-CDR3：RNFDY(SEQ ID NO:3)，
和：DIFPGGDYANSNEKFKG
X1选自Asp(D)、Ile(I)和Arg(R)；
X2选自Pro(P)和Ser(S)；
X3选自Asp(D)、Ser(S)和Gly(G)；
X4选自Ala(A)和Thr(T)；
X5选自Ser(S)和Tyr(Y)；
X6选自Asn(N)、Ala(A)和Ser(S)；
X7选自Glu(E)、Asp(D)、Pro(P)和Gln(Q)；
X8选自Lys(K)和Ser(S)；
X9选自Phe(F)和Val(V)；和
X10选自Lys(K)和Gln(Q)。
在一个实施方案中，所述抗体或其结合片段包含HCVR，其包含至少一个，优选至少两个，更优选以下三个CDR：
VH-CDR1：NYYIG(SEQ ID NO:1)；
VH-CDR2：DIFPGGDYANSNEKFKG(SEQ ID NO:4)；和
VH-CDR3：RNFDY(SEQ ID NO:3)。
在一个实施方案中，所述抗体或其结合片段包含HCVR，其包含以下三个CDR：
VH-CDR1：NYYIG(SEQ ID NO:1)；
VH-CDR2：DIFPGGDYANSNEKFKG(SEQ ID NO:4)；和
VH-CDR3：RNFDY(SEQ ID NO:3)。
在一个实施方案中，所述抗体或其结合片段包含HCVR，其包含至少一个，优选至少两个，更优选以下三个CDR：
VH-CDR1：NYYIG(SEQ ID NO:1)；
VH-CDR2：DIFPGGDYANSNEKVKG(SEQ ID NO:5)；和
VH-CDR3：RNFDY(SEQ ID NO:3)。
在一个实施方案中，所述抗体或其结合片段包含HCVR，其包含以下三个CDR：
VH-CDR1：NYYIG(SEQ ID NO:1)；
VH-CDR2：DIFPGGDYANSNEKVKG(SEQ ID NO:5)；和
VH-CDR3：RNFDY(SEQ ID NO:3)。
在一个实施方案中，所述抗体或其结合片段包含HCVR，其包含至少一个，优选至少两个，更优选以下三个CDR：
VH-CDR1：NYYIG(SEQ ID NO:1)；
VH-CDR2：DIFPGGGYTNYAEKFQG(SEQ ID NO:6)；和
VH-CDR3：RNFDY(SEQ ID NO:3)。
在一个实施方案中，所述抗体或其结合片段包含HCVR，其包含以下三个CDR：
VH-CDR1：NYYIG(SEQ ID NO:1)；
VH-CDR2：DIFPGGGYTNYAEKFQG(SEQ ID NO:6)；和
VH-CDR3：RNFDY(SEQ ID NO:3)。
在一个实施方案中，所述抗体或其结合片段包含HCVR，其包含至少一个，优选至少两个，更优选以下三个CDR：
VH-CDR1：NYYIG(SEQ ID NO:1)；
VH-CDR2：DIFPGGSYTNYSESFQG(SEQ ID NO:7)；和
VH-CDR3：RNFDY(SEQ ID NO:3)。
在一个实施方案中，所述抗体或其结合片段包含HCVR，其包含以下三个CDR：
VH-CDR1：NYYIG(SEQ ID NO:1)；
VH-CDR2：DIFPGGSYTNYSESFQG(SEQ ID NO:7)；和
VH-CDR3：RNFDY(SEQ ID NO:3)。
在一个实施方案中，所述抗体或其结合片段包含HCVR，其包含至少一个，优选至少两个，更优选以下三个CDR：
VH-CDR1：NYYIG(SEQ ID NO:1)；
VH-CDR2：DIFPGGSYTNYADSVKG(SEQ ID NO:8)；和
VH-CDR3：RNFDY(SEQ ID NO:3)。
在一个实施方案中，所述抗体或其结合片段包含HCVR，其包含以下三个CDR：
VH-CDR1：NYYIG(SEQ ID NO:1)；
VH-CDR2：DIFPGGSYTNYADSVKG(SEQ ID NO:8)；和
VH-CDR3：RNFDY(SEQ ID NO:3)。
在一个实施方案中，所述抗体或其结合片段包含HCVR，其包含至少一个，优选至少两个，更优选以下三个CDR：
VH-CDR1：NYYIG(SEQ ID NO:1)；
VH-CDR2：RIFPGGGYTNYAQKFQG(SEQ ID NO:9)；和
VH-CDR3：RNFDY(SEQ ID NO:3)。
在一个实施方案中，所述抗体或其结合片段包含HCVR，其包含以下三个CDR：
VH-CDR1：NYYIG(SEQ ID NO:1)；
VH-CDR2：RIFPGGGYTNYAQKFQG(SEQ ID NO:9)；和
VH-CDR3：RNFDY(SEQ ID NO:3)。
在一个实施方案中，所述抗体或其结合片段包含HCVR，其包含至少一个，优选至少两个，更优选以下三个CDR：
VH-CDR1：NYYIG(SEQ ID NO:1)；
VH-CDR2：IIFPGGSYTNYSPSFQG(SEQ ID NO:10)；和
VH-CDR3：RNFDY(SEQ ID NO:3)。
在一个实施方案中，所述抗体或其结合片段包含HCVR，其包含以下三个CDR：
VH-CDR1：NYYIG(SEQ ID NO:1)；
VH-CDR2：IIFPGGSYTNYSPSFQG(SEQ ID NO:10)；和
VH-CDR3：RNFDY(SEQ ID NO:3)。
在一个实施方案中，所述抗体或其结合片段包含HCVR，其包含至少一个，优选至少两个，更优选以下三个CDR：
VH-CDR1：NYYIG(SEQ ID NO:1)；
VH-CDR2：DIFSGGSYTNYADSVKG(SEQ ID NO:11)；和
VH-CDR3：RNFDY(SEQ ID NO:3)。
在一个实施方案中，所述抗体或其结合片段包含HCVR，其包含以下三个CDR：
VH-CDR1：NYYIG(SEQ ID NO:1)；
VH-CDR2：DIFSGGSYTNYADSVKG(SEQ ID NO:11)；和
VH-CDR3：RNFDY(SEQ ID NO:3)。
在一个实施方案中，所述抗体或其结合片段包含HCVR，其包含至少一个，优选至少两个，更优选以下三个CDR：
VH-CDR1：NYYIG(SEQ ID NO:1)；
VH-CDR2：DIFPGGDYTNYAEKFQG(SEQ ID NO:100)；和
VH-CDR3：RNFDY(SEQ ID NO:3)。
在一个实施方案中，所述抗体或其结合片段包含HCVR，其包含以下三个CDR：
VH-CDR1：NYYIG(SEQ ID NO:1)；
VH-CDR2：DIFPGGDYTNYAEKFQG(SEQ ID NO:100)；和
VH-CDR3：RNFDY(SEQ ID NO:3)。
在一个实施方案中，所述抗体或其结合片段包含HCVR，其包含至少一个，优选至少两个，更优选以下三个CDR：
VH-CDR1：NYYIG(SEQ ID NO:1)；
VH-CDR2：DIFPGGGYANYAEKFQG(SEQ ID NO:116)；和
VH-CDR3：RNFDY(SEQ ID NO:3)。
在一个实施方案中，所述抗体或其结合片段包含HCVR，其包含以下三个CDR：
VH-CDR1：NYYIG(SEQ ID NO:1)；
VH-CDR2：DIFPGGGYANYAEKFQG(SEQ ID NO:116)；和
VH-CDR3：RNFDY(SEQ ID NO:3)。
在一个实施方案中，所述抗体或其结合片段包含HCVR，其包含至少一个，优选至少两个，更优选以下三个CDR：
VH-CDR1：NYYIG(SEQ ID NO:1)；
VH-CDR2：DIFPGGGYTNYAEKFKG(SEQ ID NO:117)；和
VH-CDR3：RNFDY(SEQ ID NO:3)。
在一个实施方案中，所述抗体或其结合片段包含HCVR，其包含以下三个CDR：
VH-CDR1：NYYIG(SEQ ID NO:1)；
VH-CDR2：DIFPGGGYTNYAEKFKG(SEQ ID NO:117)；和
VH-CDR3：RNFDY(SEQ ID NO:3)。
在一个实施方案中，所述抗体或其结合片段包含HCVR，其包含至少一个，优选至少两个，更优选以下三个CDR：
VH-CDR1：NYYIG(SEQ ID NO:1)；
VH-CDR2：DIFPGGGYTNYNEKFQG(SEQ ID NO:118)；和
VH-CDR3：RNFDY(SEQ ID NO:3)。
在一个实施方案中，所述抗体或其结合片段包含HCVR，其包含以下三个CDR：
VH-CDR1：NYYIG(SEQ ID NO:1)；
VH-CDR2：DIFPGGGYTNYNEKFQG(SEQ ID NO:118)；和
VH-CDR3：RNFDY(SEQ ID NO:3)。
在一个实施方案中，所述抗体或其结合片段包含HCVR，其包含至少一个，优选至少两个，更优选以下三个CDR：
VH-CDR1：NYYIG(SEQ ID NO:1)；
VH-CDR2：DIFPGGGYTNSAEKFQG(SEQ ID NO:119)；和
VH-CDR3：RNFDY(SEQ ID NO:3)。
在一个实施方案中，所述抗体或其结合片段包含HCVR，其包含以下三个CDR：
VH-CDR1：NYYIG(SEQ ID NO:1)；
VH-CDR2：DIFPGGGYTNSAEKFQG(SEQ ID NO:119)；和
VH-CDR3：RNFDY(SEQ ID NO:3)。
在一个实施方案中，所述抗体或其结合片段包含轻链可变区(本文简称为LCVR或者VL)，其包含至少一个，优选至少两个，更优选以下三个互补决定区(CDR)：
VL-CDR1：X11-ASSSVS-X12-YMH(SEQ ID NO:12)；
VL-CDR2：X13-TSN-X14-X15-X16(SEQ ID NO:13)；和
VL-CDR3：X17-QRSSYPLTF(SEQ ID NO:14),
其中：
X11选自Ser(S)和Arg(R)；
X12不存在或选自Asn(N)、Ser(S)和Gly(G)；
X13选自Asn(N)和Ala(A)；或者X13是除Ala(A)或Asn(N)以外的任意氨基酸；
X14选自Leu(L)、Ser(S)和Arg(R)；
X15选自Pro(P)、Ala(A)和Gln(Q)；
X16选自Ser(S)和Thr(T)；和
X17选自Gln(Q)和His(H)。
在一个实施方案中，所述抗体或其结合片段包含LCVR，其包含以下三个CDR：
VL-CDR1：X11-ASSSVS-X12-YMH(SEQ ID NO:12)；
VL-CDR2：X13-TSN-X14-X15-X16(SEQ ID NO:13)；和
VL-CDR3：X17-QRSSYPLTF(SEQ ID NO:14),
其中：
X11选自Ser(S)和Arg(R)；
X12不存在或选自Asn(N)、Ser(S)和Gly(G)；
X13选自Asn(N)和Ala(A)；或者X13是除Ala(A)或Asn(N)以外的任意氨基酸；
X14选自Leu(L)、Ser(S)和Arg(R)；
X15选自Pro(P)、Ala(A)和Gln(Q)；
X16选自Ser(S)和Thr(T)；和
X17选自Gln(Q)和His(H)。
在一个实施方案中，所述抗体或其结合片段包含LCVR，其包含至少一个，优选至少两个，更优选以下三个互补决定区(CDR)：
VL-CDR1：X11-ASSSVS-X12-YMH(SEQ ID NO:12)；
VL-CDR2：X13-TSN-X14-X15-X16(SEQ ID NO:13)；和
VL-CDR3：X17-QRSSYPLTF(SEQ ID NO:14)，
其中：
X11是Ser(S)；
X12不存在或选自Asn(N)、Ser(S)和Gly(G)；
X13是Asn(N)；或者X13是除Ala(A)或Asn(N)以外的任意氨基酸；
X14是Leu(L)；
X15是Pro(P)；
X16是Ser(S)；和
X17是Gln(Q)。
在一个实施方案中，所述抗体或其结合片段包含LCVR，其包含以下三个CDR：
VL-CDR1：X11-ASSSVS-X12-YMH(SEQ ID NO:12)；
VL-CDR2：X13-TSN-X14-X15-X16(SEQ ID NO:13)；和
VL-CDR3：X17-QRSSYPLTF(SEQ ID NO:14)，
其中：
X11是Ser(S)；
X12不存在或选自Asn(N)、Ser(S)和Gly(G)；
X13是Asn(N)；或者X13是除Ala(A)或Asn(N)以外的任意氨基酸；
X14是Leu(L)；
X15是Pro(P)；
X16是Ser(S)；和
X17是Gln(Q)。
在一个实施方案中，所述抗体或其结合片段包含LCVR，其包含至少一个，优选至少两个，更优选以下三个CDR：
VL-CDR1：SASSSVS-X12-YMH(SEQ ID NO:15)；
VL-CDR2：NTSNLPS(SEQ ID NO:16)；和
VL-CDR3：QQRSSYPLTF(SEQ ID NO:17)，
其中：
X12不存在或选自Asn(N)、Ser(S)和Gly(G)。
在一个实施方案中，所述抗体或其结合片段包含LCVR，其包含以下三个CDR：
VL-CDR1：SASSSVS-X12-YMH(SEQ ID NO:15)；
VL-CDR2：NTSNLPS(SEQ ID NO:16)；和
VL-CDR3：QQRSSYPLTF(SEQ ID NO:17)，
其中：
X12不存在或选自Asn(N)、Ser(S)和Gly(G)。
在一个实施方案中，所述抗体或其结合片段包含LCVR，其包含至少一个，优选至少两个，更优选以下三个CDR：
VL-CDR1：SASSSVSYMH(SEQ ID NO:15)；
VL-CDR2：NTSNLPS(SEQ ID NO:16)；和
VL-CDR3：QQRSSYPLTF(SEQ ID NO:17)。
在一个实施方案中，所述抗体或其结合片段包含LCVR，其包含以下三个CDR：
VL-CDR1：SASSSVSYMH(SEQ ID NO:15)；
VL-CDR2：NTSNLPS(SEQ ID NO:16)；和
VL-CDR3：QQRSSYPLTF(SEQ ID NO:17)。
在一个实施方案中，所述抗体或其结合片段包含LCVR，其包含至少一个，优选至少两个，更优选以下三个CDR：
VL-CDR1：SASSSVS-X12-YMH(SEQ ID NO:15)；
VL-CDR2：NTSNLPS(SEQ ID NO:16)；和
VL-CDR3：QQRSSYPLTF(SEQ ID NO:17)，
其中：
X12选自Asn(N)、Ser(S)和Gly(G)。
在一个实施方案中，所述抗体或其结合片段包含LCVR，其包含以下三个CDR：
VL-CDR1：SASSSVS-X12-YMH(SEQ ID NO:15)；
VL-CDR2：NTSNLPS(SEQ ID NO:16)；和
VL-CDR3：QQRSSYPLTF(SEQ ID NO:17)，
其中：
X12选自Asn(N)、Ser(S)和Gly(G)。
在一个实施方案中，所述抗体或其结合片段包含LCVR，其包含至少一个，优选至少两个，更优选以下三个CDR：
VL-CDR1：RASSSVS-X12-YMH(SEQ ID NO:18)；
VL-CDR2：NTSNLPS(SEQ ID NO:16)；和
VL-CDR3：QQRSSYPLTF(SEQ ID NO:17)，
其中：
X12不存在或选自Asn(N)、Ser(S)和Gly(G)。
在一个实施方案中，所述抗体或其结合片段包含LCVR，其包含以下三个CDR：
VL-CDR1：RASSSVS-X12-YMH(SEQ ID NO:18)；
VL-CDR2：NTSNLPS(SEQ ID NO:16)；和
VL-CDR3：QQRSSYPLTF(SEQ ID NO:17)，
其中：
X12不存在或选自Asn(N)、Ser(S)和Gly(G)。
在一个实施方案中，所述抗体或其结合片段包含LCVR，其包含至少一个，优选至少两个，更优选以下三个CDR：
VL-CDR1：RASSSVSYMH(SEQ ID NO:18)；
VL-CDR2：NTSNLPS(SEQ ID NO:16)；和
VL-CDR3：QQRSSYPLTF(SEQ ID NO:17)。
在一个实施方案中，所述抗体或其结合片段包含LCVR，其包含以下三个CDR：
VL-CDR1：RASSSVSYMH(SEQ ID NO:18)；
VL-CDR2：NTSNLPS(SEQ ID NO:16)；和
VL-CDR3：QQRSSYPLTF(SEQ ID NO:17)。
在一个实施方案中，所述抗体或其结合片段包含LCVR，其包含至少一个，优选至少两个，更优选以下三个CDR：
VL-CDR1：RASSSVS-X12-YMH(SEQ ID NO:18)；
VL-CDR2：NTSNLPS(SEQ ID NO:16)；和
VL-CDR3：QQRSSYPLTF(SEQ ID NO:17)，
其中：
X12选自Asn(N)、Ser(S)和Gly(G)。
在一个实施方案中，所述抗体或其结合片段包含LCVR，其包含以下三个CDR：
VL-CDR1：RASSSVS-X12-YMH(SEQ ID NO:18)；
VL-CDR2：NTSNLPS(SEQ ID NO:16)；和
VL-CDR3：QQRSSYPLTF(SEQ ID NO:17)，
其中：
X12选自Asn(N)、Ser(S)和Gly(G)。
在一个实施方案中，所述抗体或其结合片段包含LCVR，其包含至少一个，优选至少两个，更优选以下三个CDR：
VL-CDR1：RASSSVS-X12-YMH(SEQ ID NO:18)；
VL-CDR2：NTSNSPS(SEQ ID NO:19)；和
VL-CDR3：QQRSSYPLTF(SEQ ID NO:17)，
其中：
X12不存在或选自Asn(N)、Ser(S)和Gly(G)。
在一个实施方案中，所述抗体或其结合片段包含LCVR，其包含以下三个CDR：
VL-CDR1：RASSSVS-X12-YMH(SEQ ID NO:18)；
VL-CDR2：NTSNSPS(SEQ ID NO:19)；和
VL-CDR3：QQRSSYPLTF(SEQ ID NO:17)，
其中：
X12不存在或选自Asn(N)、Ser(S)和Gly(G)。
在一个实施方案中，所述抗体或其结合片段包含LCVR，其包含至少一个，优选至少两个，更优选以下三个CDR：
VL-CDR1：RASSSVSYMH(SEQ ID NO:18)；
VL-CDR2：NTSNSPS(SEQ ID NO:19)；和
VL-CDR3：QQRSSYPLTF(SEQ ID NO:17)。
在一个实施方案中，所述抗体或其结合片段包含LCVR，其包含以下三个CDR：
VL-CDR1：RASSSVSYMH(SEQ ID NO:18)；
VL-CDR2：NTSNSPS(SEQ ID NO:19)；和
VL-CDR3：QQRSSYPLTF(SEQ ID NO:17)。
在一个实施方案中，所述抗体或其结合片段包含LCVR，其包含至少一个，优选至少两个，更优选以下三个CDR：
VL-CDR1：RASSSVS-X12-YMH(SEQ ID NO:18)；
VL-CDR2：NTSNSPS(SEQ ID NO:19)；和
VL-CDR3：QQRSSYPLTF(SEQ ID NO:17)，
其中：
X12选自Asn(N)、Ser(S)和Gly(G)。
在一个实施方案中，所述抗体或其结合片段包含LCVR，其包含以下三个CDR：
VL-CDR1：RASSSVS-X12-YMH(SEQ ID NO:18)；
VL-CDR2：NTSNSPS(SEQ ID NO:19)；和
VL-CDR3：QQRSSYPLTF(SEQ ID NO:17)，
其中：
X12选自Asn(N)、Ser(S)和Gly(G)。
在一个实施方案中，所述抗体或其结合片段包含LCVR，其包含至少一个，优选至少两个，更优选以下三个CDR：
VL-CDR1：RASSSVS-X12-YMH(SEQ ID NO:18)；
VL-CDR2：ATSNLQS(SEQ ID NO:20)；和
VL-CDR3：QQRSSYPLTF(SEQ ID NO:17)，
其中：
X12不存在或选自Asn(N)、Ser(S)和Gly(G)。
在一个实施方案中，所述抗体或其结合片段包含LCVR，其包含以下三个CDR：
VL-CDR1：RASSSVS-X12-YMH(SEQ ID NO:18)；
VL-CDR2：ATSNLQS(SEQ ID NO:20)；和
VL-CDR3：QQRSSYPLTF(SEQ ID NO:17)，
其中：
X12不存在或选自Asn(N)、Ser(S)和Gly(G)。
在一个实施方案中，所述抗体或其结合片段包含LCVR，其包含至少一个，优选至少两个，更优选以下三个CDR：
VL-CDR1：RASSSVSYMH(SEQ ID NO:18)；
VL-CDR2：ATSNLQS(SEQ ID NO:20)；和
VL-CDR3：QQRSSYPLTF(SEQ ID NO:17)。
在一个实施方案中，所述抗体或其结合片段包含LCVR，其包含以下三个CDR：
VL-CDR1：RASSSVSYMH(SEQ ID NO:18)；
VL-CDR2：ATSNLQS(SEQ ID NO:20)；和
VL-CDR3：QQRSSYPLTF(SEQ ID NO:17)。
在一个实施方案中，所述抗体或其结合片段包含LCVR，其包含至少一个，优选至少两个，更优选以下三个CDR：
VL-CDR1：RASSSVS-X12-YMH(SEQ ID NO:18)；
VL-CDR2：ATSNLQS(SEQ ID NO:20)；和
VL-CDR3：QQRSSYPLTF(SEQ ID NO:17)，
其中：
X12选自Asn(N)、Ser(S)和Gly(G)。
在一个实施方案中，所述抗体或其结合片段包含LCVR，其包含以下三个CDR：
VL-CDR1：RASSSVS-X12-YMH(SEQ ID NO:18)；
VL-CDR2：ATSNLQS(SEQ ID NO:20)；和
VL-CDR3：QQRSSYPLTF(SEQ ID NO:17)，
其中：
X12选自Asn(N)、Ser(S)和Gly(G)。
在一个实施方案中，所述抗体或其结合片段包含LCVR，其包含至少一个，优选至少两个，更优选以下三个CDR：
VL-CDR1：RASSSVS-X12-YMH(SEQ ID NO:18)；
VL-CDR2：NTSNSPS(SEQ ID NO:19)；和
VL-CDR3：HQRSSYPLTF(SEQ ID NO:21),
其中：
X12不存在或选自Asn(N)、Ser(S)和Gly(G)。
在一个实施方案中，所述抗体或其结合片段包含LCVR，其包含以下三个CDR：
VL-CDR1：RASSSVS-X12-YMH(SEQ ID NO:18)；
VL-CDR2：NTSNSPS(SEQ ID NO:19)；和
VL-CDR3：HQRSSYPLTF(SEQ ID NO:21)，
其中：
X12不存在或选自Asn(N)、Ser(S)和Gly(G)。
在一个实施方案中，所述抗体或其结合片段包含LCVR，其包含至少一个，优选至少两个，更优选以下三个CDR：
VL-CDR1：RASSSVSYMH(SEQ ID NO:18)；
VL-CDR2：NTSNSPS(SEQ ID NO:19)；和
VL-CDR3：HQRSSYPLTF(SEQ ID NO:21)。
在一个实施方案中，所述抗体或其结合片段包含LCVR，其包含以下三个CDR：
VL-CDR1：RASSSVSYMH(SEQ ID NO:18)；
VL-CDR2：NTSNSPS(SEQ ID NO:19)；和
VL-CDR3：HQRSSYPLTF(SEQ ID NO:21)。
在一个实施方案中，所述抗体或其结合片段包含LCVR，其包含至少一个，优选至少两个，更优选以下三个CDR：
VL-CDR1：RASSSVS-X12-YMH(SEQ ID NO:18)；
VL-CDR2：NTSNSPS(SEQ ID NO:19)；和
VL-CDR3：HQRSSYPLTF(SEQ ID NO:21)，
其中：
X12选自Asn(N)、Ser(S)和Gly(G)。
在一个实施方案中，所述抗体或其结合片段包含LCVR，其包含以下三个CDR：
VL-CDR1：RASSSVS-X12-YMH(SEQ ID NO:18)；
VL-CDR2：NTSNSPS(SEQ ID NO:19)；和
VL-CDR3：HQRSSYPLTF(SEQ ID NO:21)，
其中：
X12选自Asn(N)、Ser(S)和Gly(G)。
在一个实施方案中，所述抗体或其结合片段包含LCVR，其包含至少一个，优选至少两个，更优选以下三个CDR：
VL-CDR1：RASSSVS-X12-YMH(SEQ ID NO:18)；
VL-CDR2：NTSNRAT(SEQ ID NO:22)；和
VL-CDR3：QQRSSYPLTF(SEQ ID NO:17)，
其中：
X12不存在或选自Asn(N)、Ser(S)和Gly(G)。
在一个实施方案中，所述抗体或其结合片段包含LCVR，其包含以下三个CDR：
VL-CDR1：RASSSVS-X12-YMH(SEQ ID NO:18)；
VL-CDR2：NTSNRAT(SEQ ID NO:22)；和
VL-CDR3：QQRSSYPLTF(SEQ ID NO:17)，
其中：
X12不存在或选自Asn(N)、Ser(S)和Gly(G)。
在一个实施方案中，所述抗体或其结合片段包含LCVR，其包含至少一个，优选至少两个，更优选以下三个CDR：
VL-CDR1：RASSSVSYMH(SEQ ID NO:18)；
VL-CDR2：NTSNRAT(SEQ ID NO:22)；和
VL-CDR3：QQRSSYPLTF(SEQ ID NO:17)。
在一个实施方案中，所述抗体或其结合片段包含LCVR，其包含以下三个CDR：
VL-CDR1：RASSSVSYMH(SEQ ID NO:18)；
VL-CDR2：NTSNRAT(SEQ ID NO:22)；和
VL-CDR3：QQRSSYPLTF(SEQ ID NO:17)。
在一个实施方案中，所述抗体或其结合片段包含LCVR，其包含至少一个，优选至少两个，更优选以下三个CDR：
VL-CDR1：RASSSVS-X12-YMH(SEQ ID NO:18)；
VL-CDR2：NTSNRAT(SEQ ID NO:22)；和
VL-CDR3：QQRSSYPLTF(SEQ ID NO:17)，
其中：
X12选自Asn(N)、Ser(S)和Gly(G)。
在一个实施方案中，所述抗体或其结合片段包含LCVR，其包含以下三个CDR：
VL-CDR1：RASSSVS-X12-YMH(SEQ ID NO:18)；
VL-CDR2：NTSNRAT(SEQ ID NO:22)；和
VL-CDR3：QQRSSYPLTF(SEQ ID NO:17)，
其中：
X12选自Asn(N)、Ser(S)和Gly(G)。
在一个实施方案中，所述抗体或其结合片段包含LCVR，其包含至少一个，优选至少两个，更优选以下三个CDR：
VL-CDR1：RASSSVS-X12-YMH(SEQ ID NO:18)；
VL-CDR2：ATSNLPS(SEQ ID NO:111)；和
VL-CDR3：QQRSSYPLTF(SEQ ID NO:17)，
其中：
X12不存在或选自Asn(N)、Ser(S)和Gly(G)。
在一个实施方案中，所述抗体或其结合片段包含LCVR，其包含以下三个CDR：
VL-CDR1：RASSSVS-X12-YMH(SEQ ID NO:18)；
VL-CDR2：ATSNLPS(SEQ ID NO:111)；和
VL-CDR3：QQRSSYPLTF(SEQ ID NO:17)，
其中：
X12不存在或选自Asn(N)、Ser(S)和Gly(G)。
在一个实施方案中，所述抗体或其结合片段包含LCVR，其包含至少一个，优选至少两个，更优选以下三个CDR：
VL-CDR1：RASSSVSYMH(SEQ ID NO:18)；
VL-CDR2：ATSNLPS(SEQ ID NO:111)；和
VL-CDR3：QQRSSYPLTF(SEQ ID NO:17)。
在一个实施方案中，所述抗体或其结合片段包含LCVR，其包含以下三个CDR：
VL-CDR1：RASSSVSYMH(SEQ ID NO:18)；
VL-CDR2：ATSNLPS(SEQ ID NO:111)；和
VL-CDR3：QQRSSYPLTF(SEQ ID NO:17)。
在一个实施方案中，所述抗体或其结合片段包含LCVR，其包含至少一个，优选至少两个，更优选以下三个CDR：
VL-CDR1：RASSSVS-X12-YMH(SEQ ID NO:18)；
VL-CDR2：ATSNLPS(SEQ ID NO:111)；和
VL-CDR3：QQRSSYPLTF(SEQ ID NO:17)，
其中：
X12选自Asn(N)、Ser(S)和Gly(G)。
在一个实施方案中，所述抗体或其结合片段包含LCVR，其包含以下三个CDR：
VL-CDR1：RASSSVS-X12-YMH(SEQ ID NO:18)；
VL-CDR2：ATSNLPS(SEQ ID NO:111)；和
VL-CDR3：QQRSSYPLTF(SEQ ID NO:17)，
其中：
X12选自Asn(N)、Ser(S)和Gly(G)。
在一个实施方案中，所述抗体或其结合片段包含LCVR，其包含至少一个，优选至少两个，更优选以下三个CDR：
VL-CDR1：SASSSVS-X12-YMH(SEQ ID NO:15)；
VL-CDR2：NTANLPS(SEQ ID NO:120)；和
VL-CDR3：QQRSSYPLTF(SEQ ID NO:17)，
其中：
X12不存在或选自Asn(N)、Ser(S)和Gly(G)。
在一个实施方案中，所述抗体或其结合片段包含LCVR，其包含以下三个CDR：
VL-CDR1：SASSSVS-X12-YMH(SEQ ID NO:15)；
VL-CDR2：NTANLPS(SEQ ID NO:120)；和
VL-CDR3：QQRSSYPLTF(SEQ ID NO:17)，
其中：
X12不存在或选自Asn(N)、Ser(S)和Gly(G)。
在一个实施方案中，所述抗体或其结合片段包含LCVR，其包含至少一个，优选至少两个，更优选以下三个CDR：
VL-CDR1：SASSSVS-X12-YMH(SEQ ID NO:15)；
VL-CDR2：NTANLPS(SEQ ID NO:120)；和
VL-CDR3：QQRSSYPLTF(SEQ ID NO:17)。
在一个实施方案中，所述抗体或其结合片段包含LCVR，其包含以下三个CDR：
VL-CDR1：SASSSVS-X12-YMH(SEQ ID NO:15)；
VL-CDR2：NTANLPS(SEQ ID NO:120)；和
VL-CDR3：QQRSSYPLTF(SEQ ID NO:17)。
在一个实施方案中，所述抗体或其结合片段包含LCVR，其包含至少一个，优选至少两个，更优选以下三个CDR：
VL-CDR1：SASSSVS-X12-YMH(SEQ ID NO:15)；
VL-CDR2：NTANLPS(SEQ ID NO:120)；和
VL-CDR3：QQRSSYPLTF(SEQ ID NO:17)，
其中：
X12选自Asn(N)、Ser(S)和Gly(G)。
在一个实施方案中，所述抗体或其结合片段包含LCVR，其包含以下三个CDR：
VL-CDR1：SASSSVS-X12-YMH(SEQ ID NO:15)；
VL-CDR2：NTANLPS(SEQ ID NO:120)；和
VL-CDR3：QQRSSYPLTF(SEQ ID NO:17)，
其中：
X12选自Asn(N)、Ser(S)和Gly(G)。
在一个实施方案中，所述抗体或其结合片段包含LCVR，其包含至少一个，优选至少两个，更优选以下三个CDR：
VL-CDR1：RASSSVS-X12-YMH(SEQ ID NO:18)；
VL-CDR2：X13-TSNLPS(SEQ ID NO:127)；和
VL-CDR3：QQRSSYPLTF(SEQ ID NO:17)，
其中：
X12不存在或选自Asn(N)、Ser(S)和Gly(G)，和
X13是除Ala(A)或Asn(N)以外的任意氨基酸。
在一个实施方案中，所述抗体或其结合片段包含LCVR，其包含以下三个CDR：
VL-CDR1：RASSSVS-X12-YMH(SEQ ID NO:18)；
VL-CDR2：X13-TSNLPS(SEQ ID NO:127)；和
VL-CDR3：QQRSSYPLTF(SEQ ID NO:17)，
其中：
X12不存在或选自Asn(N)、Ser(S)和Gly(G)，和
X13是除Ala(A)或Asn(N)以外的任意氨基酸。
在一个实施方案中，所述抗体或其结合片段包含LCVR，其包含至少一个，优选至少两个，更优选以下三个CDR：
VL-CDR1：RASSSVSYMH(SEQ ID NO:18)；
VL-CDR2：X13-TSNLPS(SEQ ID NO:127)；和
VL-CDR3：QQRSSYPLTF(SEQ ID NO:17)，
其中：
X13是除Ala(A)或Asn(N)以外的任意氨基酸。
在一个实施方案中，所述抗体或其结合片段包含LCVR，其包含以下三个CDR：
VL-CDR1：RASSSVSYMH(SEQ ID NO:18)；
VL-CDR2：X13-TSNLPS(SEQ ID NO:127)；和
VL-CDR3：QQRSSYPLTF(SEQ ID NO:17)，
其中：
X13是除Ala(A)或Asn(N)以外的任意氨基酸。
在一个实施方案中，所述抗体或其结合片段包含LCVR，其包含至少一个，优选至少两个，更优选以下三个CDR：
VL-CDR1：RASSSVS-X12-YMH(SEQ ID NO:18)；
VL-CDR2：X13-TSNLPS(SEQ ID NO:127)；和
VL-CDR3：QQRSSYPLTF(SEQ ID NO:17),
其中：
X12不存在或选自Asn(N)、Ser(S)和Gly(G)，和
X13是除Ala(A)或Asn(N)以外的任意氨基酸。
在一个实施方案中，所述抗体或其结合片段包含LCVR，其包含以下三个CDR：
VL-CDR1：RASSSVS-X12-YMH(SEQ ID NO:18)；
VL-CDR2：X13-TSNLPS(SEQ ID NO:127)；和
VL-CDR3：QQRSSYPLTF(SEQ ID NO:17),
其中：
X12不存在或选自Asn(N)、Ser(S)和Gly(G)，和
X13是除Ala(A)或Asn(N)以外的任意氨基酸。
在一个实施方案中，所述抗体或其结合片段包含：
-HCVR，其包含至少一个，优选至少两个，更优选以下三个CDR：
VH-CDR1：NYYIG(SEQ ID NO:1)；
VH-CDR2：X1-IF-X2-GG-X3-Y-X4-N-X5-X6-X7-X8-X9-X10-G(SEQ IDNO:2)；和
VH-CDR3：RNFDY(SEQ ID NO:3)；和
-LCVR，其包含至少一个，优选至少两个，更优选以下三个CDR：
VL-CDR1：X11-ASSSVS-X12-YMH(SEQ ID NO:12)；
VL-CDR2：X13-TSN-X14-X15-X16(SEQ ID NO:13)；和
VL-CDR3：X17-QRSSYPLTF(SEQ ID NO:14)，
其中：
X1选自Asp(D)、Ile(I)和Arg(R)；
X2选自Pro(P)和Ser(S)；
X3选自Asp(D)、Ser(S)和Gly(G)；
X4选自Ala(A)和Thr(T)；
X5选自Ser(S)和Tyr(Y)；
X6选自Asn(N)、Ala(A)和Ser(S)；
X7选自Glu(E)、Asp(D)、Pro(P)和Gln(Q)；
X8选自Lys(K)和Ser(S)；
X9选自Phe(F)和Val(V)；
X10选自Lys(K)和Gln(Q)；
X11选自Ser(S)和Arg(R)；
X12不存在或选自Asn(N)、Ser(S)和Gly(G)；
X13选自Asn(N)和Ala(A)；或者X13是除Ala(A)或Asn(N)以外的任意氨基酸；
X14选自Leu(L)、Ser(S)和Arg(R)；
X15选自Pro(P)、Ala(A)和Gln(Q)；
X16选自Ser(S)和Thr(T)；和
X17选自Gln(Q)和His(H)。
在一个实施方案中，所述抗体或其结合片段包含：
-HCVR，其包含以下三个CDR：
VH-CDR1：NYYIG(SEQ ID NO:1)；
VH-CDR2：X1-IF-X2-GG-X3-Y-X4-N-X5-X6-X7-X8-X9-X10-G(SEQ ID NO:2)；和
VH-CDR3：RNFDY(SEQ ID NO:3)；以及
-LCVR，其包含以下三个CDR：
VL-CDR1：X11-ASSSVS-X12-YMH(SEQ ID NO:12)；
VL-CDR2：X13-TSN-X14-X15-X16(SEQ ID NO:13)；和
VL-CDR3：X17-QRSSYPLTF(SEQ ID NO:14)，
其中：
X1选自Asp(D)、Ile(I)和Arg(R)；
X2选自Pro(P)和Ser(S)；
X3选自Asp(D)、Ser(S)和Gly(G)；
X4选自Ala(A)和Thr(T)；
X5选自Ser(S)和Tyr(Y)；
X6选自Asn(N)、Ala(A)和Ser(S)；
X7选自Glu(E)、Asp(D)、Pro(P)和Gln(Q)；
X8选自Lys(K)和Ser(S)；
X9选自Phe(F)和Val(V)；
X10选自Lys(K)和Gln(Q)；
X11选自Ser(S)和Arg(R)；
X12不存在或选自Asn(N)、Ser(S)和Gly(G)；
X13选自Asn(N)和Ala(A)；或者X13是除Ala(A)或Asn(N)以外的任意氨基酸；
X14选自Leu(L)、Ser(S)和Arg(R)；
X15选自Pro(P)、Ala(A)和Gln(Q)；
X16选自Ser(S)和Thr(T)；和
X17选自Gln(Q)和His(H)。
在一个实施方案中，本发明的抗体或其结合片段包含以下的组合：(i)至少一个，优选至少两个，更优选三个HCVR的CDR和(ii)至少一个，优选至少两个，更优选三个LCVR的CDR，所述组合如表2中定义。
在一个实施方案中，本发明的抗体或其结合片段包含(i)三个HCVR的CDR和(ii)三个LCVR的CDR的组合，所述组合如表2中定义。
表2：HCVR的CDR和LCVR的CDR的优选组合。CDR由其SEQ ID NO定义(其中，在适用的情况下，X12不存在或选自Asn(N)、Ser(S)和Gly(G)；且X13是除Ala(A)或Asn(N)以外的任意氨基酸。
Figure BDA0003952383070000571
Figure BDA0003952383070000581
Figure BDA0003952383070000591
Figure BDA0003952383070000601
Figure BDA0003952383070000611
在一个实施方案中，上文所定义的VH-CDR1、VH-CDR2、VH-CDR3、VL-CDR1、VL-CDR2和/或VL-CDR3中的任意一个均可以表征为具有1个、2个、3个、4个、5个或更多个氨基酸被不同的氨基酸取代。
在一个实施方案中，如上文所定义的VH-CDR1、VH-CDR2、VH-CDR3、VL-CDR1、VL-CDR2和/或VL-CDR3中的任意一个均可以表征为具有与上文所定义的特定CDR或CDR组有至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或更高同一性的氨基酸序列。
在一个实施方案中，所述抗体或其结合片段包含以下的组合：(i)至少一个，优选至少两个，更优选三个HCVR的CDR和(ii)至少一个，优选至少两个，更优选三个LCVR的CDR，所述组合选自表2中定义的组合#1、#2、#7、#14、#20、#26、#49、#50、#63、#65、#72、#79、#86和#92。
在一个实施方案中，所述抗体或其结合片段包含(i)三个HCVR的CDR和(ii)三个LCVR的CDR的组合，所述组合选自表2中定义的组合#1、#2、#7、#14、#20、#26、#49、#50、#63、#65、#72、#79、#86和#92。
在一个实施方案中，所述抗体或其结合片段包含：
-HCVR，其包含以下三个CDR：
序列SEQ ID NO:1的VH-CDR1；
选自包含以下序列或由以下序列组成的组的VH-CDR2：SEQ ID NO:4、5、6、7、8、100、116、117、118和119；和
序列SEQ ID NO:3的VH-CDR3；和
-LCVR，其包含以下三个CDR：
选自包含序列SEQ ID NO:15和18或由其组成的组的VL-CDR1，其中X12不存在或选自Asn(N)、Ser(S)和Gly(G)，优选X12不存在；
选自包含序列SEQ ID NO:16、111和120或由其组成的组的VL-CDR2；和
序列SEQ ID NO:17的VL-CDR3。
在一个实施方案中，所述抗体或其结合片段包含：
-HCVR，其包含以下三个CDR：
序列SEQ ID NO:1的VH-CDR1；
选自包含序列SEQ ID NO:4和5或由其组成的组的VH-CDR2；和
序列SEQ ID NO:3的VH-CDR3；和
-LCVR，其包含以下三个CDR：
序列SEQ ID NO:15的VL-CDR1，其中X12不存在或选自Asn(N)、Ser(S)和Gly(G)，优选X12不存在；
序列SEQ ID NO:16的VL-CDR2；和
序列SEQ ID NO:17的VL-CDR3。
在一个实施方案中，所述抗体或其结合片段包含：
-HCVR，其包含以下三个CDR：
序列SEQ ID NO:1的VH-CDR1；
选自包含序列SEQ ID NO:4、5、6和100或由其组成的组的VH-CDR2；和
序列SEQ ID NO:3的VH-CDR3；和
-LCVR，其包含以下三个CDR：
选自包含序列SEQ ID NO:15和18或由其组成的组的VL-CDR1，其中X12不存在或选自Asn(N)、Ser(S)和Gly(G)，优选X12不存在；
序列SEQ ID NO:16的VL-CDR2；和
序列SEQ ID NO:17的VL-CDR3。
在一个实施方案中，所述抗体或其结合片段包含：
-HCVR，其包含以下三个CDR：
序列SEQ ID NO:1的VH-CDR1；
选自包含序列SEQ ID NO:4、6和100或由其组成的组的VH-CDR2；和
序列SEQ ID NO:3的VH-CDR3；和
-LCVR，其包含以下三个CDR：
选自包含序列SEQ ID NO:15和18或由其组成的组的VL-CDR1，其中X12不存在或选自Asn(N)、Ser(S)和Gly(G)，优选X12不存在；
序列SEQ ID NO:16的VL-CDR2；和
序列SEQ ID NO:17的VL-CDR3。
在一个实施方案中，所述抗体或其结合片段包含以下的组合：(i)至少一个，优选至少两个，更优选三个HCVR的CDR和(ii)至少一个，优选至少两个，更优选三个LCVR的CDR，所述组合是表2中定义的组合#1。
在一个实施方案中，所述抗体或其结合片段包含(i)三个HCVR的CDR和(ii)三个LCVR的CDR的组合，所述组合是表2中定义的组合#1。
在一个实施方案中，所述抗体或其结合片段包含以下的组合：(i)如SEQ ID NO:1、4和3所示的三个HCVR的CDR；(ii)如SEQ ID NO:15、16和17所示的三个LCVR的CDR；其中SEQID NO:15中的X12不存在或选自Asn(N)、Ser(S)和Gly(G)，优选X12不存在。
在一个实施方案中，所述抗体或其结合片段包含以下的组合：(i)至少一个，优选至少两个，更优选三个HCVR的CDR和(ii)至少一个，优选至少两个，更优选三个LCVR的CDR，所述组合是表2中定义的组合#2。
在一个实施方案中，所述抗体或其结合片段包含(i)三个HCVR的CDR和(ii)三个LCVR的CDR的组合，所述组合是表2中定义的组合#2。
在一个实施方案中，所述抗体或其结合片段包含以下的组合：(i)如SEQ ID NO:1、4和3所示的三个HCVR的CDR；(ii)如SEQ ID NO:18、16和17所示的三个LCVR的CDR；其中SEQID NO:18中的X12不存在或选自Asn(N)、Ser(S)和Gly(G)，优选X12不存在。
在一个实施方案中，所述抗体或其结合片段包含以下的组合：(i)至少一个，优选至少两个，更优选三个HCVR的CDR和(ii)至少一个，优选至少两个，更优选三个LCVR的CDR，所述组合是表2中定义的组合#7。
在一个实施方案中，所述抗体或其结合片段包含(i)三个HCVR的CDR和(ii)三个LCVR的CDR的组合，所述组合是表2中定义的组合#7。
在一个实施方案中，所述抗体或其结合片段包含以下的组合：(i)如SEQ ID NO:1、5和3所示的三个HCVR的CDR；(ii)如SEQ ID NO:15、16和17所示的三个LCVR的CDR；其中SEQID NO:15中的X12不存在或选自Asn(N)、Ser(S)和Gly(G)，优选X12不存在。
在一个实施方案中，所述抗体或其结合片段包含以下的组合：(i)至少一个，优选至少两个，更优选三个HCVR的CDR和(ii)至少一个，优选至少两个，更优选三个LCVR的CDR，所述组合是表2中定义的组合#14。
在一个实施方案中，所述抗体或其结合片段包含(i)三个HCVR的CDR和(ii)三个LCVR的CDR的组合，所述组合是表2中定义的组合#14。
在一个实施方案中，所述抗体或其结合片段包含以下的组合：(i)如SEQ ID NO:1、6和3所示的三个HCVR的CDR；(ii)如SEQ ID NO:18、16和17所示的三个LCVR的CDR；其中SEQID NO:18中的X12不存在或选自Asn(N)、Ser(S)和Gly(G)，优选X12不存在。
在一个实施方案中，所述抗体或其结合片段包含以下的组合：(i)至少一个，优选至少两个，更优选三个HCVR的CDR和(ii)至少一个，优选至少两个，更优选三个LCVR的CDR，所述组合是表2中定义的组合#20。
在一个实施方案中，所述抗体或其结合片段包含(i)三个HCVR的CDR和(ii)三个LCVR的CDR的组合，所述组合是表2中定义的组合#20。
在一个实施方案中，所述抗体或其结合片段包含以下的组合：(i)如SEQ ID NO:1、7和3所示的三个HCVR的CDR；(ii)如SEQ ID NO:18、16和17所示的三个LCVR的CDR；其中SEQID NO:18中的X12不存在或选自Asn(N)、Ser(S)和Gly(G)，优选X12不存在。
在一个实施方案中，所述抗体或其结合片段包含以下的组合：(i)至少一个，优选至少两个，更优选三个HCVR的CDR和(ii)至少一个，优选至少两个，更优选三个LCVR的CDR，所述组合是表2中定义的组合#26。
在一个实施方案中，所述抗体或其结合片段包含(i)三个HCVR的CDR和(ii)三个LCVR的CDR的组合，所述组合是表2中定义的组合#26。
在一个实施方案中，所述抗体或其结合片段包含以下的组合：(i)如SEQ ID NO:1、8和3所示的三个HCVR的CDR；(ii)如SEQ ID NO:18、16和17所示的三个LCVR的CDR；其中SEQID NO:18中的X12不存在或选自Asn(N)、Ser(S)和Gly(G)，优选X12不存在。
在一个实施方案中，所述抗体或其结合片段包含以下的组合：(i)至少一个，优选至少两个，更优选三个HCVR的CDR和(ii)至少一个，优选至少两个，更优选三个LCVR的CDR，所述组合是表2中定义的组合#49。
在一个实施方案中，所述抗体或其结合片段包含(i)三个HCVR的CDR和(ii)三个LCVR的CDR的组合，所述组合是表2中定义的组合#49。
在一个实施方案中，所述抗体或其结合片段包含以下的组合：(i)如SEQ ID NO:1、100和3所示的三个HCVR的CDR；(ii)如SEQ ID NO:15、16和17所示的三个LCVR的CDR；其中SEQ ID NO:15中的X12不存在或选自Asn(N)、Ser(S)和Gly(G)，优选X12不存在。
在一个实施方案中，所述抗体或其结合片段包含以下的组合：(i)至少一个，优选至少两个，更优选三个HCVR的CDR和(ii)至少一个，优选至少两个，更优选三个LCVR的CDR，所述组合是表2中定义的组合#50。
在一个实施方案中，所述抗体或其结合片段包含(i)三个HCVR的CDR和(ii)三个LCVR的CDR的组合，所述组合是表2中定义的组合#50。
在一个实施方案中，所述抗体或其结合片段包含以下的组合：(i)如SEQ ID NO:1、100和3所示的三个HCVR的CDR；(ii)如SEQ ID NO:18、16和17所示的三个LCVR的CDR；其中SEQ ID NO:18中的X12不存在或选自Asn(N)、Ser(S)和Gly(G)，优选X12不存在。
在一个实施方案中，所述抗体或其结合片段包含以下的组合：(i)至少一个，优选至少两个，更优选三个HCVR的CDR和(ii)至少一个，优选至少两个，更优选三个LCVR的CDR，所述组合是表2中定义的组合#63。
在一个实施方案中，所述抗体或其结合片段包含(i)三个HCVR的CDR和(ii)三个LCVR的CDR的组合，所述组合是表2中定义的组合#63。
在一个实施方案中，所述抗体或其结合片段包含以下的组合：(i)如SEQ ID NO:1、100和3所示的三个HCVR的CDR；(ii)如SEQ ID NO:18、111和17所示的三个LCVR的CDR；其中SEQ ID NO:18中的X12不存在或选自Asn(N)、Ser(S)和Gly(G)，优选X12不存在。
在一个实施方案中，所述抗体或其结合片段包含以下的组合：(i)至少一个，优选至少两个，更优选三个HCVR的CDR和(ii)至少一个，优选至少两个，更优选三个LCVR的CDR，所述组合是表2中定义的组合#65。
在一个实施方案中，所述抗体或其结合片段包含(i)三个HCVR的CDR和(ii)三个LCVR的CDR的组合，所述组合是表2中定义的组合#65。
在一个实施方案中，所述抗体或其结合片段包含以下的组合：(i)如SEQ ID NO:1、116和3所示的三个HCVR的CDR；(ii)如SEQ ID NO:18、16和17所示的三个LCVR的CDR；其中SEQ ID NO:18中的X12不存在或选自Asn(N)、Ser(S)和Gly(G)，优选X12不存在。
在一个实施方案中，所述抗体或其结合片段包含以下的组合：(i)至少一个，优选至少两个，更优选三个HCVR的CDR和(ii)至少一个，优选至少两个，更优选三个LCVR的CDR，所述组合是表2中定义的组合#72。
在一个实施方案中，所述抗体或其结合片段包含(i)三个HCVR的CDR和(ii)三个LCVR的CDR的组合，所述组合是表2中定义的组合#72。
在一个实施方案中，所述抗体或其结合片段包含以下的组合：(i)如SEQ ID NO:1、117和3所示的三个HCVR的CDR；(ii)如SEQ ID NO:18、16和17所示的三个LCVR的CDR；其中SEQ ID NO:18中的X12不存在或选自Asn(N)、Ser(S)和Gly(G)，优选X12不存在。
在一个实施方案中，所述抗体或其结合片段包含以下的组合：(i)至少一个，优选至少两个，更优选三个HCVR的CDR和(ii)至少一个，优选至少两个，更优选三个LCVR的CDR，所述组合是表2中定义的组合#79。
在一个实施方案中，所述抗体或其结合片段包含(i)三个HCVR的CDR和(ii)三个LCVR的CDR的组合，所述组合是表2中定义的组合#79。
在一个实施方案中，所述抗体或其结合片段包含以下的组合：(i)如SEQ ID NO:1、118和3所示的三个HCVR的CDR；(ii)如SEQ ID NO:18、16和17所示的三个LCVR的CDR；其中SEQ ID NO:18中的X12不存在或选自Asn(N)、Ser(S)和Gly(G)，优选X12不存在。
在一个实施方案中，所述抗体或其结合片段包含以下的组合：(i)至少一个，优选至少两个，更优选三个HCVR的CDR和(ii)至少一个，优选至少两个，更优选三个LCVR的CDR，所述组合是表2中定义的组合#86。
在一个实施方案中，所述抗体或其结合片段包含(i)三个HCVR的CDR和(ii)三个LCVR的CDR的组合，所述组合是表2中定义的组合#86。
在一个实施方案中，所述抗体或其结合片段包含以下的组合：(i)如SEQ ID NO:1、119和3所示的三个HCVR的CDR；(ii)如SEQ ID NO:18、16和17所示的三个LCVR的CDR；其中SEQ ID NO:18中的X12不存在或选自Asn(N)、Ser(S)和Gly(G)，优选X12不存在。
在一个实施方案中，所述抗体或其结合片段包含以下的组合：(i)至少一个，优选至少两个，更优选三个HCVR的CDR和(ii)至少一个，优选至少两个，更优选三个LCVR的CDR，所述组合是表2中定义的组合#92。
在一个实施方案中，所述抗体或其结合片段包含(i)三个HCVR的CDR和(ii)三个LCVR的CDR的组合，所述组合是表2中定义的组合#92。
在一个实施方案中，所述抗体或其结合片段包含以下的组合：(i)如SEQ ID NO:1、4和3所示的三个HCVR的CDR；(ii)如SEQ ID NO:15、120和17所示的三个LCVR的CDR；其中SEQID NO:15中的X12不存在或选自Asn(N)、Ser(S)和Gly(G)，优选X12不存在。
在一个实施方案中，所述抗体或其结合片段包含HCVR，其包含至少一个，优选至少两个，更优选至少三个，甚至更优选四个以下框架区(FR)：
VH-FR1:QVQLQQSGAELVRPGTSVKMSCKAAGYTFT(SEQ ID NO:25)；
VH-FR2:WVKQRPGHGLEWIG(SEQ ID NO:26)；
VH-FR3:KATLTADTSSSTAYMQLSSLTSEDSAIYYCVR(SEQ ID NO:27)；
VH-FR4:WGQGTTLTVSS(SEQ ID NO:28)。
在一个实施方案中，所述抗体或其结合片段包含HCVR，其包含四个以下FR：
VH-FR1:QVQLQQSGAELVRPGTSVKMSCKAAGYTFT(SEQ ID NO:25)；
VH-FR2:WVKQRPGHGLEWIG(SEQ ID NO:26)；
VH-FR3:KATLTADTSSSTAYMQLSSLTSEDSAIYYCVR(SEQ ID NO:27)；
VH-FR4:WGQGTTLTVSS(SEQ ID NO:28)。
在一个实施方案中，所述抗体或其结合片段包含HCVR，其包含至少一个，优选至少两个，更优选至少三个，甚至更优选四个以下FR：
VH-FR1:QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFT(SEQ ID NO:29)；
VH-FR2:WVRQAPGQGLEWIG(SEQ ID NO:30)；
VH-FR3:RVTLTADTSISTAYMELSRLRSDDTVVYYCVR(SEQ ID NO:31)；
VH-FR4:WGQGTLVTVSS(SEQ ID NO:32)。
在一个实施方案中，所述抗体或其结合片段包含HCVR，其包含四个以下FR：
VH-FR1:QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFT(SEQ ID NO:29)；
VH-FR2:WVRQAPGQGLEWIG(SEQ ID NO:30)；
VH-FR3:RVTLTADTSISTAYMELSRLRSDDTVVYYCVR(SEQ ID NO:31)；
VH-FR4:WGQGTLVTVSS(SEQ ID NO:32)。
在一个实施方案中，所述抗体或其结合片段包含HCVR，其包含至少一个，优选至少两个，更优选至少三个，甚至更优选四个以下FR：
VH-FR1:EVQLVQSGAEVKKPGESLKISCKASGYTFT(SEQ ID NO:33)；
VH-FR2:WVRQMPGKGLEWIG(SEQ ID NO:34)；
VH-FR3:QVTLSADKSISTAYLQLSSLKASDTAMYYCVR(SEQ ID NO:35)；
VH-FR4:WGQGTLVTVSS(SEQ ID NO:32)。
在一个实施方案中，所述抗体或其结合片段包含HCVR，其包含四个以下FR：
VH-FR1:EVQLVQSGAEVKKPGESLKISCKASGYTFT(SEQ ID NO:33)；
VH-FR2:WVRQMPGKGLEWIG(SEQ ID NO:34)；
VH-FR3:QVTLSADKSISTAYLQLSSLKASDTAMYYCVR(SEQ ID NO:35)；
VH-FR4:WGQGTLVTVSS(SEQ ID NO:32)。
在一个实施方案中，所述抗体或其结合片段包含HCVR，其包含至少一个，优选至少两个，更优选至少三个，甚至更优选四个以下FR：
VH-FR1:QVQLVESGGGLVKPGGSLRLSCAASGYTFT(SEQ ID NO:36)；
VH-FR2:WIRQAPGKGLEWIG(SEQ ID NO:37)；
VH-FR3:RFTLSADTAKNSAYLQMNSLRAEDTAVYYCVR(SEQ ID NO:38)；
VH-FR4:WGQGTLVTVSS(SEQ ID NO:32)。
在一个实施方案中，所述抗体或其结合片段包含HCVR，其包含四个以下FR：
VH-FR1:QVQLVESGGGLVKPGGSLRLSCAASGYTFT(SEQ ID NO:36)；
VH-FR2:WIRQAPGKGLEWIG(SEQ ID NO:37)；
VH-FR3:RFTLSADTAKNSAYLQMNSLRAEDTAVYYCVR(SEQ ID NO:38)；
VH-FR4:WGQGTLVTVSS(SEQ ID NO:32)。
在一个实施方案中，所述抗体或其结合片段包含HCVR，其包含至少一个，优选至少两个，更优选至少三个，甚至更优选四个以下FR：
VH-FR1:EVQLVQSGAEVKKPGESLKISCKGSGYTFT(SEQ ID NO:39)；
VH-FR2:WVRQMPGKGLEWIG(SEQ ID NO:34)；
VH-FR3:QVTLSADKSISTAYLQLSSLKASDTAMYYCVR(SEQ ID NO:35)；
VH-FR4:WGQGTLVTVSS(SEQ ID NO:32)。
在一个实施方案中，所述抗体或其结合片段包含HCVR，其包含四个以下FR：
VH-FR1:EVQLVQSGAEVKKPGESLKISCKGSGYTFT(SEQ ID NO:39)；
VH-FR2:WVRQMPGKGLEWIG(SEQ ID NO:34)；
VH-FR3:QVTLSADKSISTAYLQLSSLKASDTAMYYCVR(SEQ ID NO:35)；
VH-FR4:WGQGTLVTVSS(SEQ ID NO:32)。
在一个实施方案中，所述抗体或其结合片段包含HCVR，其包含至少一个，优选至少两个，更优选至少三个，甚至更优选四个以下FR：
VH-FR1:QVQLVESGGGLVKPGGSLRLSCAASGFTFS(SEQ ID NO:40)；
VH-FR2:WIRQAPGKGLEWIG(SEQ ID NO:37)；
VH-FR3:RFTLSADTAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCVR(SEQ ID NO:41)；
VH-FR4:WGQGTLVTVSS(SEQ ID NO:32)。
在一个实施方案中，所述抗体或其结合片段包含HCVR，其包含以下四个FR：
VH-FR1:QVQLVESGGGLVKPGGSLRLSCAASGFTFS(SEQ ID NO:40)；
VH-FR2:WIRQAPGKGLEWIG(SEQ ID NO:37)；
VH-FR3:RFTLSADTAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCVR(SEQ ID NO:41)；
VH-FR4:WGQGTLVTVSS(SEQ ID NO:32)。
在一个实施方案中，所述抗体或其结合片段包含HCVR，其包含至少一个，优选至少两个，更优选至少三个，甚至更优选四个以下FR：
VH-FR1:EVQLVQSGAEVKKPGESLKISCKGSGYSFT(SEQ ID NO:42)；
VH-FR2:WVRQMPGKGLEWIG(SEQ ID NO:34)；
VH-FR3:QVTLSADKSISTAYLQLSSLKASDTAMYYCVR(SEQ ID NO:35)；
VH-FR4:WGQGTLVTVSS(SEQ ID NO:32)。
在一个实施方案中，所述抗体或其结合片段包含HCVR，其包含以下四个FR：
VH-FR1:EVQLVQSGAEVKKPGESLKISCKGSGYSFT(SEQ ID NO:42)；
VH-FR2:WVRQMPGKGLEWIG(SEQ ID NO:34)；
VH-FR3:QVTLSADKSISTAYLQLSSLKASDTAMYYCVR(SEQ ID NO:35)；
VH-FR4:WGQGTLVTVSS(SEQ ID NO:32)。
在一个实施方案中，所述抗体或其结合片段包含HCVR，其包含至少一个，优选至少两个，更优选至少三个，甚至更优选四个以下FR：
VH-FR1:QVQLVESGGGLVKPGGSLRLSCAASGFTFS(SEQ ID NO:40)；
VH-FR2:WIRQAPGKGLEWVG(SEQ ID NO:43)；
VH-FR3:RFTLSADTAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCVR(SEQ ID NO:41)；
VH-FR4:WGQGTLVTVSS(SEQ ID NO:32)。
在一个实施方案中，所述抗体或其结合片段包含HCVR，其包含四个以下FR：
VH-FR1:QVQLVESGGGLVKPGGSLRLSCAASGFTFS(SEQ ID NO:40)；
VH-FR2:WIRQAPGKGLEWVG(SEQ ID NO:43)；
VH-FR3:RFTLSADTAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCVR(SEQ ID NO:41)；
VH-FR4:WGQGTLVTVSS(SEQ ID NO:32)。
在一个实施方案中，所述抗体或其结合片段包含LCVR，其包含至少一个，优选至少两个，更优选至少三个，甚至更优选四个以下FR：
VL-FR1:QIVLTQSPTIMSASPGEKVTITC(SEQ ID NO:44)；
VL-FR2:WFQQKTGTSPRLWIY(SEQ ID NO:45)；
VL-FR3:GVPARFSGSGSGTS-X18-SLTISRMEAEDAATYYC(SEQ IDNO:46)；
VL-FR4:GAGTKLELK(SEQ ID NO:47)，
其中：
X18选自Tyr(Y)和Phe(F)，优选X18是Tyr(Y)。
在一个实施方案中，所述抗体或其结合片段包含LCVR，其包含四个以下FR：
VL-FR1:QIVLTQSPTIMSASPGEKVTITC(SEQ ID NO:44)；
VL-FR2:WFQQKTGTSPRLWIY(SEQ ID NO:45)；
VL-FR3:GVPARFSGSGSGTS-X18-SLTISRMEAEDAATYYC(SEQ ID NO:46)；
VL-FR4:GAGTKLELK(SEQ ID NO:47)
其中：
X18选自Tyr(Y)和Phe(F)，优选X18是Tyr(Y)。
在一个实施方案中，所述抗体或其结合片段包含LCVR，其包含至少一个，优选至少两个，更优选至少三个，甚至更优选四个以下FR：
VL-FR1:DIQLTQSPSFLSASVGDRVTITC(SEQ ID NO:48)；
VL-FR2:WFQQKPGKAPKLWIY(SEQ ID NO:49)；
VL-FR3:GVPSRFSGSGSGTE-X18-TLTISSLQPEDFATYYC(SEQ ID NO:50)；
VL-FR4:GGGTKVEIK(SEQ ID NO:51)，
其中：
X18选自Tyr(Y)和Phe(F)，优选X18是Tyr(Y)。
在一个实施方案中，所述抗体或其结合片段包含LCVR，其包含四个以下FR：
VL-FR1:DIQLTQSPSFLSASVGDRVTITC(SEQ ID NO:48)；
VL-FR2:WFQQKPGKAPKLWIY(SEQ ID NO:49)；
VL-FR3:GVPSRFSGSGSGTE-X18-TLTISSLQPEDFATYYC(SEQ ID NO:50)；
VL-FR4:GGGTKVEIK(SEQ ID NO:51)，
其中：
X18选自Tyr(Y)和Phe(F)，优选X18是Tyr(Y)。
在一个实施方案中，所述抗体或其结合片段包含LCVR，其包含至少一个，优选至少两个，更优选至少三个，甚至更优选四个以下FR：
VL-FR1:EIVLTQSPDFQSVTPKEKVTITC(SEQ ID NO:52)；
VL-FR2:WFQQKPDQSPKLWIY(SEQ ID NO:53)；
VL-FR3:GVPSRFSGSGSGTD-X18-TLTINSLEAEDAATYYC(SEQ ID NO:54)；
VL-FR4:GGGTKVEIK(SEQ ID NO:51)，
其中：
X18选自Tyr(Y)和Phe(F)，优选X18是Tyr(Y)。
在一个实施方案中，所述抗体或其结合片段包含LCVR，其包含四个以下FR：
VL-FR1:EIVLTQSPDFQSVTPKEKVTITC(SEQ ID NO:52)；
VL-FR2:WFQQKPDQSPKLWIY(SEQ ID NO:53)；
VL-FR3:GVPSRFSGSGSGTD-X18-TLTINSLEAEDAATYYC(SEQ ID NO:54)；
VL-FR4:GGGTKVEIK(SEQ ID NO:51)，
其中：
X18选自Tyr(Y)和Phe(F)，优选X18是Tyr(Y)。
在一个实施方案中，所述抗体或其结合片段包含LCVR，其包含至少一个，优选至少两个，更优选至少三个，甚至更优选四个以下FR：
VL-FR1:EIVLTQSPATLSLSPGERATLSC(SEQ ID NO:55)；
VL-FR2:WFQQKPGQAPRLWIY(SEQ ID NO:56)；
VL-FR3:GIPARFSGSGSGTD-X18-TLTISSLEPEDFAVYYC(SEQ ID NO:57)；
VL-FR4:GGGTKVEIK(SEQ ID NO:51)，
其中：
X18选自Tyr(Y)和Phe(F)，优选X18是Tyr(Y)。
在一个实施方案中，所述抗体或其结合片段包含LCVR，其包含四个以下FR：
VL-FR1：EIVLTQSPATLSLSPGERATLSC(SEQ ID NO:55)；
VL-FR2：WFQQKPGQAPRLWIY(SEQ ID NO:56)；
VL-FR3：GIPARFSGSGSGTD-X18-TLTISSLEPEDFAVYYC(SEQ ID NO:57)；
VL-FR4:GGGTKVEIK(SEQ ID NO:51)，
其中：
X18选自Tyr(Y)和Phe(F)，优选X18是Tyr(Y)。
在一个实施方案中，所述抗体或其结合片段包含LCVR，其包含至少一个，优选至少两个，更优选至少三个，甚至更优选四个以下FR：
VL-FR1:DIQLTQSPSFLSASVGDRVTITC(SEQ ID NO:48)；
VL-FR2:WYQQKPGKAPKLWIY(SEQ ID NO:58)；
VL-FR3:GVPSRFSGSGSGTE-X18-TLTISSLQPEDFATYYC(SEQ ID NO:50)；
VL-FR4:GGGTKVEIK(SEQ ID NO:51)，
其中：
X18选自Tyr(Y)和Phe(F)，优选X18是Tyr(Y)。
在一个实施方案中，所述抗体或其结合片段包含LCVR，其包含四个以下FR：
VL-FR1:DIQLTQSPSFLSASVGDRVTITC(SEQ ID NO:48)；
VL-FR2:WYQQKPGKAPKLWIY(SEQ ID NO:58)；
VL-FR3:GVPSRFSGSGSGTE-X18-TLTISSLQPEDFATYYC(SEQ ID NO:50)；
VL-FR4:GGGTKVEIK(SEQ ID NO:51)，
其中：
X18选自Tyr(Y)和Phe(F)，优选X18是Tyr(Y)。
在一个实施方案中，所述抗体或其结合片段包含LCVR，其包含至少一个，优选至少两个，更优选至少三个，甚至更优选四个以下FR：
VL-FR1:DIQLTQSPSFLSASVGDRVTITC(SEQ ID NO:48)；
VL-FR2:WYQQKPGKAPKLWIY(SEQ ID NO:58)；
VL-FR3:GVPSRFSGSGSGTE-X18-TLTISSLQPEDFATYYC(SEQ ID NO:50)；
VL-FR4:GGGTKVEIK(SEQ ID NO:51)，
其中：
X18选自Tyr(Y)和Phe(F)，优选X18是Phe(F)。
在一个实施方案中，所述抗体或其结合片段包含LCVR，其包含四个以下FR：
VL-FR1:DIQLTQSPSFLSASVGDRVTITC(SEQ ID NO:48)；
VL-FR2:WYQQKPGKAPKLWIY(SEQ ID NO:58)；
VL-FR3:GVPSRFSGSGSGTE-X18-TLTISSLQPEDFATYYC(SEQ ID NO:50)；
VL-FR4:GGGTKVEIK(SEQ ID NO:51)，
其中：
X18选自Tyr(Y)和Phe(F)，优选X18是Phe(F)。
在一个实施方案中，所述抗体或其结合片段包含LCVR，其包含至少一个，优选至少两个，更优选至少三个，甚至更优选四个以下FR：
VL-FR1:EIVLTQSPDFQSVTPKEKVTITC(SEQ ID NO:52)；
VL-FR2:WYQQKPDQSPKLWIY(SEQ ID NO:59)；
VL-FR3:GVPSRFSGSGSGTD-X18-TLTINSLEAEDAATYYC(SEQ ID NO:54)；
VL-FR4:GGGTKVEIK(SEQ ID NO:51)，
其中：
X18选自Tyr(Y)和Phe(F)，优选X18是Phe(F)。
在一个实施方案中，所述抗体或其结合片段包含LCVR，其包含四个以下FR：
VL-FR1:EIVLTQSPDFQSVTPKEKVTITC(SEQ ID NO:52)；
VL-FR2:WYQQKPDQSPKLWIY(SEQ ID NO:59)；
VL-FR3:GVPSRFSGSGSGTD-X18-TLTINSLEAEDAATYYC(SEQ ID NO:54)；
VL-FR4:GGGTKVEIK(SEQ ID NO:51)，
其中：
X18选自Tyr(Y)和Phe(F)，优选X18是Phe(F)。
在一个实施方案中，所述抗体或其结合片段包含LCVR，其包含至少一个，优选至少两个，更优选至少三个，甚至更优选四个以下FR：
VL-FR1:EIVLTQSPATLSLSPGERATLSC(SEQ ID NO:55)；
VL-FR2:WYQQKPGQAPRLWIY(SEQ ID NO:60)；
VL-FR3:GIPARFSGSGSGTD-X18-TLTISSLEPEDFAVYYC(SEQ ID NO:57)；
VL-FR4:GGGTKVEIK(SEQ ID NO:51)，
其中：
X18选自Tyr(Y)和Phe(F)，优选X18是Phe(F)。
在一个实施方案中，所述抗体或其结合片段包含LCVR，其包含四个以下FR：
VL-FR1:EIVLTQSPATLSLSPGERATLSC(SEQ ID NO:55)；
VL-FR2:WYQQKPGQAPRLWIY(SEQ ID NO:60)；
VL-FR3:GIPARFSGSGSGTD-X18-TLTISSLEPEDFAVYYC(SEQ ID NO:57)；
VL-FR4:GGGTKVEIK(SEQ ID NO:51)，
其中：
X18选自Tyr(Y)和Phe(F)，优选X18是Phe(F)。
在一个实施方案中，所述抗体或其结合片段包含LCVR，其包含至少一个，优选至少两个，更优选至少三个，甚至更优选四个以下FR：
VL-FR1:DIQLTQSPSFLSASVGDRVTITC(SEQ ID NO:48)；
VL-FR2:WFQQKPGKAPKLWIY(SEQ ID NO:49)；
VL-FR3:GVPSRFSGSGSGTE-X18-TLTISSLQPEDFATYYC(SEQ ID NO:50)；
VL-FR4:GGGTKVEIK(SEQ ID NO:51)，
其中：
X18选自Tyr(Y)和Phe(F)，优选X18是Phe(F)。
在一个实施方案中，所述抗体或其结合片段包含LCVR，其包含四个以下FR：
VL-FR1:DIQLTQSPSFLSASVGDRVTITC(SEQ ID NO:48)；
VL-FR2:WFQQKPGKAPKLWIY(SEQ ID NO:49)；
VL-FR3:GVPSRFSGSGSGTE-X18-TLTISSLQPEDFATYYC(SEQ ID NO:50)；
VL-FR4:GGGTKVEIK(SEQ ID NO:51)，
其中：
X18选自Tyr(Y)和Phe(F)，优选X18是Phe(F)。
在一个实施方案中，所述抗体或其结合片段包含以下的组合：(i)至少一个，优选至少两个，更优选至少三个，甚至更优选四个HCVR的FR和(ii)至少一个，优选至少两个，更优选至少三个，甚至更优选四个LCVR的FR，所述组合如表3中定义。
在一个实施方案中，所述抗体或其结合片段包含(i)四个HCVR的FR和(ii)四个LCVR的FR的组合，所述组合如表3中定义。
表3：HCVR的FR和LCVR的FR的优选组合。FR由其SEQ ID NO定义(其中，在适用的情况下，X18选自Tyr(Y)和Phe(F))。
Figure BDA0003952383070000771
Figure BDA0003952383070000781
在一个实施方案中，上文所定义的VH-FR1、VH-FR2、VH-FR3、VH-FR4、VL-FR1、VL-FR2、VL-FR3和/或VL-FR4中的任意一个均可以表征为具有1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个或更多个氨基酸被不同的氨基酸取代。
在一个实施方案中，上文所定义的VH-FR1、VH-FR2、VH-FR3、VH-FR4、VL-FR1、VL-FR2、VL-FR3和/或VL-FR4中的任意一个均可以表征为具有与上文所定义的特定FR或FR组有至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或更高同一性的氨基酸序列。
在一个实施方案中，所述抗体或其结合片段包含HCVR，其包含以下或由其组成：
-如上文所述的VH-FR1，
-如上文所述的VH-CDR1，
-如上文所述的VH-FR2，
-如上文所述的VH-CDR2，
-如上文所述的VH-FR3，
-如上文所述的VH-CDR3，和
-如上文所述的VH-FR4。
在一个实施方案中，所述抗体或其结合片段包含HCVR，其包含以下或由以下组成：
-选自SEQ ID NO:25、29、33、36、39、40和42的VH-FR1；
-选自SEQ ID NO:1的VH-CDR1；
-选自SEQ ID NO:26、30、34、37和43的VH-FR2；
-选自SEQ ID NO:2的VH-CDR2；
-选自SEQ ID NO:27、31、35、38和41的VH-FR3；
-选自SEQ ID NO:3的VH-CDR3；和
-选自SEQ ID NO:28和32的VH-FR4。
在一个实施方案中，所述抗体或其结合片段包含HCVR，其包含以下或由其组成：
-选自SEQ ID NO:25、29、33、36、39、40和42的VH-FR1；
-选自SEQ ID NO:1的VH-CDR1；
-选自SEQ ID NO:26、30、34、37和43的VH-FR2；
-选自SEQ ID NO:4、5、6、7、8、9、10、11、100、116、117、118和119的VH-CDR2；
-选自SEQ ID NO:27、31、35、38和41的VH-FR3；
-选自SEQ ID NO:3的VH-CDR3；和
-选自SEQ ID NO:28和32的VH-FR4。
在优选的实施方案中，所述抗体或其结合片段包含HCVR，其包含VH-FR1、VH-CDR1、VH-FR2、VH-CDR2、VH-FR3、VH-CDR3和VH-FR4的组合或由其组成，所述组合如表4中定义。
表4：优选的HCVR。CDR和FR由其SEQ ID NO定义。倒数第二列是指完整HCVR的SEQID NO。
Figure BDA0003952383070000801
Figure BDA0003952383070000811
在优选的实施方案中，所述抗体或其结合片段包含HCVR，其包含序列SEQ ID NO:61或由其组成；或其包含与SEQ ID NO:61的非CDR区的序列具有至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或更高同一性的非CDR区的序列，或由其组成。
Figure BDA0003952383070000812
在优选的实施方案中，所述抗体或其结合片段包含HCVR，其包含序列SEQ ID NO:62或由其组成；或其包含与SEQ ID NO:62的非CDR区的序列具有至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或更高同一性的非CDR区的序列，或由其组成。
Figure BDA0003952383070000813
在优选的实施方案中，所述抗体或其结合片段包含HCVR，其包含序列SEQ ID NO:63或由其组成；或其包含与SEQ ID NO:63的非CDR区的序列具有至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或更高同一性的非CDR区的序列，或由其组成。
Figure BDA0003952383070000814
在优选的实施方案中，所述抗体或其结合片段包含HCVR，其包含序列SEQ ID NO:64或由其组成；或其包含与SEQ ID NO:64的非CDR区的序列具有至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或更高同一性的非CDR区的序列，或由其组成。
Figure BDA0003952383070000821
在优选的实施方案中，所述抗体或其结合片段包含HCVR，其包含序列SEQ ID NO:65或由其组成；或其包含与SEQ ID NO:65的非CDR区的序列具有至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或更高同一性的非CDR区的序列，或由其组成。
Figure BDA0003952383070000822
在优选的实施方案中，所述抗体或其结合片段包含HCVR，其包含序列SEQ ID NO:66或由其组成；或其包含与SEQ ID NO:66的非CDR区的序列具有至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或更高同一性的非CDR区的序列，或由其组成。
Figure BDA0003952383070000823
在优选的实施方案中，所述抗体或其结合片段包含HCVR，其包含序列SEQ ID NO:67或由其组成；或其包含与SEQ ID NO:67的非CDR区的序列具有至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或更高同一性的非CDR区的序列，或由其组成。
Figure BDA0003952383070000831
在优选的实施方案中，所述抗体或其结合片段包含HCVR，其包含序列SEQ ID NO:68或由其组成；或其包含与SEQ ID NO:68的非CDR区的序列具有至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或更高同一性的非CDR区的序列，或由其组成。
Figure BDA0003952383070000832
在优选的实施方案中，所述抗体或其结合片段包含HCVR，其包含序列SEQ ID NO:69或由其组成；或其包含与SEQ ID NO:69的非CDR区的序列具有至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或更高同一性的非CDR区的序列，或由其组成。
Figure BDA0003952383070000833
在优选的实施方案中，所述抗体或其结合片段包含HCVR，其包含序列SEQ ID NO:70或由其组成；或其包含与SEQ ID NO:70的非CDR区的序列具有至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或更高同一性的非CDR区的序列，或由其组成。
Figure BDA0003952383070000841
在优选的实施方案中，所述抗体或其结合片段包含HCVR，其包含序列SEQ ID NO:101或由其组成；或其包含与SEQ ID NO:101的非CDR区的序列具有至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或更高同一性的非CDR区的序列，或由其组成。
Figure BDA0003952383070000842
在优选的实施方案中，所述抗体或其结合片段包含HCVR，其包含序列SEQ ID NO:121或由其组成；或其包含与SEQ ID NO:121的非CDR区的序列具有至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或更高同一性的非CDR区的序列，或由其组成。
Figure BDA0003952383070000843
在优选的实施方案中，所述抗体或其结合片段包含HCVR，其包含序列SEQ ID NO:122或由其组成；或其包含与SEQ ID NO:122的非CDR区的序列具有至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或更高同一性的非CDR区的序列，或由其组成。
Figure BDA0003952383070000844
Figure BDA0003952383070000851
在优选的实施方案中，所述抗体或其结合片段包含HCVR，其包含序列SEQ ID NO:123或由其组成；或其包含与SEQ ID NO:123的非CDR区的序列具有至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或更高同一性的非CDR区的序列，或由其组成。
Figure BDA0003952383070000852
在优选的实施方案中，所述抗体或其结合片段包含HCVR，其包含序列SEQ ID NO:124或由其组成；或其包含与SEQ ID NO:124的非CDR区的序列具有至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或更高同一性的非CDR区的序列，或由其组成。
Figure BDA0003952383070000853
在一个实施方案中，所述抗体或其结合片段包含LCVR，其包含以下或由以下组成：
-如上文所述的VL-FR1，
-如上文所述的VL-CDR1，
-如上文所述的VL-FR2，
-如上文所述的VL-CDR2，
-如上文所述的VL-FR3，
-如上文所述的VL-CDR3，和
-如上文所述的VL-FR4。
在一个实施方案中，根据所述抗体或其结合片段包含HCVR，其包含以下组成或由以下组成：
-选自SEQ ID NO:44、48、52和55的VL-FR1；
-选自SEQ ID NO 12的VL-CDR1；
-选自SEQ ID NO:45、49、53、56、58、59和60的VL-FR2；
-选自SEQ ID NO 13的VL-CDR2；
-选自SEQ ID NO:46、50、54和57的VL-FR3；
-选自SEQ ID NO 14的VL-CDR3；和
-选自SEQ ID NO:47和51的VL-FR4。
在一个实施方案中，所述抗体或其结合片段包含HCVR，其包含以下或由其组成：
-选自SEQ ID NO:44、48、52和55的VL-FR1；
-选自SEQ ID NO:15和18的VL-CDR1；
-选自SEQ ID NO:45、49、53、56、58、59和60的VL-FR2；
-选自SEQ ID NO:16、19、20、22、111和120的VL-CDR2；
-选自SEQ ID NO:46、50、54和57的VL-FR3；
-选自SEQ ID NO:17和21的VL-CDR3；和
-选自SEQ ID NO:47和51的VL-FR4。
在优选的实施方案中，所述抗体或其结合片段包含LCVR，其包含VL-FR1、VL-CDR1、VL-FR2、VL-CDR2、VL-FR3、VL-CDR3和VL-FR4的组合或由其组成，所述组合如表5中定义。
表5：优选的LCVR。CDR和FR由其SEQ ID NO定义。倒数第二列是指完整LCVR的SEQID NO(其中第一序列编号的X12不存在或选自Asn(N)、Ser(S)和Gly(G)；且X18选自Tyr(Y)和Phe(F)；第二序列编号中定义了优选的X12和X18)。
Figure BDA0003952383070000871
在一个实施方案中，所述抗体或其结合片段包含LCVR，其包含如上文定义的VL-FR1、VL-CDR1、VL-FR2、VL-CDR2、VL-FR3、VL-CDR3和VL-FR4的组合或由其组成，其中如果X12并非不存在(即，如果X12是Asn(N)、Ser(S)或Gly(G)中任一)，则X18是Phe(F)。在一个实施方案中，所述抗体或其结合片段包含LCVR，其包含如上文定义的VL-FR1、VL-CDR1、VL-FR2、VL-CDR2、VL-FR3、VL-CDR3和VL-FR4的组合或由其组成，其中如果X12不存在，则X18选自Tyr(Y)和Phe(F)。
在优选的实施方案中，所述抗体或其结合片段包含LCVR，其包含序列SEQ ID NO:71或由其组成，其中X12选自Asn(N)、Ser(S)和Gly(G)；或其包含与SEQ ID NO:71的非CDR区的序列具有至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或更高同一性的非CDR区的序列，或由其组成。
Figure BDA0003952383070000881
在优选的实施方案中，所述抗体或其结合片段包含LCVR，其包含序列SEQ ID NO:72或由其组成，其中X12选自Asn(N)、Ser(S)和Gly(G)；或其包含与SEQ ID NO:72的非CDR区的序列具有至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或更高同一性的非CDR区的序列，或由其组成。
Figure BDA0003952383070000882
在优选的实施方案中，所述抗体或其结合片段包含LCVR，其包含序列SEQ ID NO:73或由其组成，其中X12选自Asn(N)、Ser(S)和Gly(G)；或其包含与SEQ ID NO:73的非CDR区的序列具有至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或更高同一性的非CDR区的序列，或由其组成。
Figure BDA0003952383070000883
Figure BDA0003952383070000891
在优选的实施方案中，所述抗体或其结合片段包含LCVR，其包含序列SEQ ID NO:74或由其组成，其中X12选自Asn(N)、Ser(S)和Gly(G)；或其包含与SEQ ID NO:74的非CDR区的序列具有至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或更高同一性的非CDR区的序列，或由其组成。
Figure BDA0003952383070000892
在优选的实施方案中，所述抗体或其结合片段包含LCVR，其包含序列SEQ ID NO:75或由其组成，其中X12选自Asn(N)、Ser(S)和Gly(G)；或其包含与SEQ ID NO:75的非CDR区的序列具有至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或更高同一性的非CDR区的序列，或由其组成。
Figure BDA0003952383070000893
在优选的实施方案中，所述抗体或其结合片段包含LCVR，其包含序列SEQ ID NO:76或由其组成，其中X12选自Asn(N)、Ser(S)和Gly(G)；或其包含与SEQ ID NO:76的非CDR区的序列具有至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或更高同一性的非CDR区的序列，或由其组成。
Figure BDA0003952383070000894
Figure BDA0003952383070000901
在优选的实施方案中，所述抗体或其结合片段包含LCVR，其包含序列SEQ ID NO:77或由其组成，其中X12选自Asn(N)、Ser(S)和Gly(G)；或其包含与SEQ ID NO:77的非CDR区的序列具有至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或更高同一性的非CDR区的序列，或由其组成。
Figure BDA0003952383070000902
在优选的实施方案中，所述抗体或其结合片段包含LCVR，其包含序列SEQ ID NO:78或由其组成，其中X12选自Asn(N)、Ser(S)和Gly(G)；或其包含与SEQ ID NO:78的非CDR区的序列具有至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或更高同一性的非CDR区的序列，或由其组成。
Figure BDA0003952383070000903
在优选的实施方案中，所述抗体或其结合片段包含LCVR，其包含序列SEQ ID NO:79或由其组成，其中X12选自Asn(N)、Ser(S)和Gly(G)；或其包含与SEQ ID NO:79的非CDR区的序列具有至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或更高同一性的非CDR区的序列，或由其组成。
Figure BDA0003952383070000904
Figure BDA0003952383070000911
在优选的实施方案中，所述抗体或其结合片段包含LCVR，其包含序列SEQ ID NO:80或由其组成，其中X12选自Asn(N)、Ser(S)和Gly(G)；或其包含与SEQ ID NO:80的非CDR区的序列具有至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或更高同一性的非CDR区的序列，或由其组成。
Figure BDA0003952383070000912
在优选的实施方案中，所述抗体或其结合片段包含LCVR，其包含序列SEQ ID NO:102或由其组成，其中X12选自Asn(N)、Ser(S)和Gly(G)；或其包含与SEQ ID NO:102的非CDR区的序列具有至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或更高同一性的非CDR区的序列，或由其组成。
Figure BDA0003952383070000913
在优选的实施方案中，所述抗体或其结合片段包含LCVR，其包含序列SEQ ID NO:112或由其组成，其中X12选自Asn(N)、Ser(S)和Gly(G)；或其包含与SEQ ID NO:112的非CDR区的序列具有至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或更高同一性的非CDR区的序列，或由其组成。
Figure BDA0003952383070000921
在优选的实施方案中，所述抗体或其结合片段包含LCVR，其包含序列SEQ ID NO:125或由其组成，其中X12选自Asn(N)、Ser(S)和Gly(G)；或其包含与SEQ ID NO:125的非CDR区的序列具有至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或更高同一性的非CDR区的序列，或由其组成。
Figure BDA0003952383070000922
在优选的实施方案中，所述抗体或其结合片段包含LCVR，其包含序列SEQ ID NO:128或由其组成，其中X12选自Asn(N)、Ser(S)和Gly(G)；且X13是除Ala(A)或Asn(N)以外的任意氨基酸；或所述LCVR包含与SEQ ID NO:128的非CDR区的序列具有至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或更高同一性的非CDR区的序列，或由其组成。
Figure BDA0003952383070000923
在一个实施方案中，所述抗体或其结合片段包含LCVR，其包含序列SEQ ID NO:71-80、102、112、125或128，或由其组成，其中X12不存在。
在优选的实施方案中，所述抗体或其结合片段包含LCVR，其包含序列SEQ ID NO:81或由其组成；或其包含与SEQ ID NO:81的非CDR区的序列具有至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或更高同一性的非CDR区的序列，或由其组成。
Figure BDA0003952383070000931
在优选的实施方案中，所述抗体或其结合片段包含LCVR，其包含序列SEQ ID NO:82或由其组成；或其包含与SEQ ID NO:82的非CDR区的序列具有至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或更高同一性的非CDR区的序列，或由其组成。
Figure BDA0003952383070000932
在优选的实施方案中，所述抗体或其结合片段包含LCVR，其包含序列SEQ ID NO:83或由其组成；或其包含与SEQ ID NO:83的非CDR区的序列具有至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或更高同一性的非CDR区的序列，或由其组成。
Figure BDA0003952383070000933
在优选的实施方案中，所述抗体或其结合片段包含LCVR，其包含序列SEQ ID NO:84或由其组成；或其包含与SEQ ID NO:84的非CDR区的序列具有至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或更高同一性的非CDR区的序列，或由其组成。
Figure BDA0003952383070000941
在优选的实施方案中，所述抗体或其结合片段包含LCVR，其包含序列SEQ ID NO:85或由其组成；或其包含与SEQ ID NO:85的非CDR区的序列具有至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或更高同一性的非CDR区的序列，或由其组成。
Figure BDA0003952383070000942
在优选的实施方案中，所述抗体或其结合片段包含LCVR，其包含序列SEQ ID NO:86或由其组成；或其包含与SEQ ID NO:86的非CDR区的序列具有至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或更高同一性的非CDR区的序列，或由其组成。
Figure BDA0003952383070000943
在优选的实施方案中，所述抗体或其结合片段包含LCVR，其包含序列SEQ ID NO:87或由其组成；或其包含与SEQ ID NO:87的非CDR区的序列具有至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或更高同一性的非CDR区的序列，或由其组成。
Figure BDA0003952383070000951
在优选的实施方案中，所述抗体或其结合片段包含LCVR，其包含序列SEQ ID NO:88或由其组成；或其包含与SEQ ID NO:88的非CDR区的序列具有至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或更高同一性的非CDR区的序列，或由其组成。
Figure BDA0003952383070000952
在优选的实施方案中，所述抗体或其结合片段包含LCVR，其包含序列SEQ ID NO:89或由其组成；或其包含与SEQ ID NO:89的非CDR区的序列具有至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或更高同一性的非CDR区的序列，或由其组成。
Figure BDA0003952383070000953
在优选的实施方案中，所述抗体或其结合片段包含LCVR，其包含序列SEQ ID NO:90或由其组成；或其包含与SEQ ID NO:90的非CDR区的序列具有至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或更高同一性的非CDR区的序列，或由其组成。
Figure BDA0003952383070000954
Figure BDA0003952383070000961
在优选的实施方案中，所述抗体或其结合片段包含LCVR，其包含序列SEQ ID NO:103或由其组成；或其包含与SEQ ID NO:103的非CDR区的序列具有至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或更高同一性的非CDR区的序列，或由其组成。
Figure BDA0003952383070000962
在优选的实施方案中，所述抗体或其结合片段包含LCVR，其包含序列SEQ ID NO:113或由其组成；或其包含与SEQ ID NO:113的非CDR区的序列具有至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或更高同一性的非CDR区的序列，或由其组成。
Figure BDA0003952383070000963
在优选的实施方案中，所述抗体或其结合片段包含LCVR，其包含序列SEQ ID NO:126或由其组成；或其包含与SEQ ID NO:126的非CDR区的序列具有至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或更高同一性的非CDR区的序列，或由其组成。
Figure BDA0003952383070000964
在优选的实施方案中，所述抗体或其结合片段包含LCVR，其包含序列SEQ ID NO:129或由其组成，其中X13是除Ala(A)或Asn(N)以外的任意氨基酸；或其包含与SEQ ID NO:129的非CDR区的序列具有至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或更高同一性的非CDR区的序列，或由其组成。
Figure BDA0003952383070000971
在一个实施方案中，所述抗体或其结合片段包含：
-如上文定义的HCVR；和
-如上文定义的LCVR。
在一个实施方案中，所述抗体或其结合片段包含：
-HCVR，其选自SEQ ID NO:61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、101、121、122、123和124；或其包含与SEQ ID NO:61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、101、121、122、123或124的非CDR区的序列具有至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或更高同一性的非CDR区的序列，或由其组成；和
-LCVR，其选自SEQ ID NO:71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、102、112、125和128，其中X12选自Asn(N)、Ser(S)和Gly(G)，且X13是除Ala(A)或Asn(N)以外的任意氨基酸；或其包含与SEQ ID NO:71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、102、112、125或128的非CDR区的序列具有至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或更高同一性的非CDR区的序列，或由其组成。
在一个实施方案中，所述抗体或其结合片段包含：
-HCVR，其选自SEQ ID NO:61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、101、121、122、123和124；或其包含与SEQ ID NO:61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、101、121、122、123或124的非CDR区的序列具有至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或更高同一性的非CDR区的序列，或由其组成；和
-LCVR，其选自SEQ ID NO:81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、103、113、126和129，其中X13是除Ala(A)或Asn(N)以外的任意氨基酸；或其包含与SEQ ID NO:81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、103、113、126或129的非CDR区的序列具有至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或更高同一性的非CDR区的序列，或由其组成。
在一个实施方案中，所述抗体或其结合片段包含SEQ ID NO:61的HCVR和SEQ IDNO:71的LCVR，其中X12选自Asn(N)、Ser(S)和Gly(G)。
在一个实施方案中，所述抗体或其结合片段包含SEQ ID NO:61的HCVR和SEQ IDNO:72的LCVR，其中X12选自Asn(N)、Ser(S)和Gly(G)。
在一个实施方案中，所述抗体或其结合片段包含SEQ ID NO:61的HCVR和SEQ IDNO:73的LCVR，其中X12选自Asn(N)、Ser(S)和Gly(G)。
在一个实施方案中，所述抗体或其结合片段包含SEQ ID NO:61的HCVR和SEQ IDNO:74的LCVR，其中X12选自Asn(N)、Ser(S)和Gly(G)。
在一个实施方案中，所述抗体或其结合片段包含SEQ ID NO:61的HCVR和SEQ IDNO:75的LCVR，其中X12选自Asn(N)、Ser(S)和Gly(G)。
在一个实施方案中，所述抗体或其结合片段包含SEQ ID NO:61的HCVR和SEQ IDNO:76的LCVR，其中X12选自Asn(N)、Ser(S)和Gly(G)。
在一个实施方案中，所述抗体或其结合片段包含SEQ ID NO:61的HCVR和SEQ IDNO:77的LCVR，其中X12选自Asn(N)、Ser(S)和Gly(G)。
在一个实施方案中，所述抗体或其结合片段包含SEQ ID NO:61的HCVR和SEQ IDNO:78的LCVR，其中X12选自Asn(N)、Ser(S)和Gly(G)。
在一个实施方案中，所述抗体或其结合片段包含SEQ ID NO:61的HCVR和SEQ IDNO:79的LCVR，其中X12选自Asn(N)、Ser(S)和Gly(G)。
在一个实施方案中，所述抗体或其结合片段包含SEQ ID NO:61的HCVR和SEQ IDNO:80的LCVR，其中X12选自Asn(N)、Ser(S)和Gly(G)。
在一个实施方案中，所述抗体或其结合片段包含SEQ ID NO:61的HCVR和SEQ IDNO:102的LCVR，其中X12选自Asn(N)、Ser(S)和Gly(G)。
在一个实施方案中，所述抗体或其结合片段包含SEQ ID NO:61的HCVR和SEQ IDNO:112的LCVR，其中X12选自Asn(N)、Ser(S)和Gly(G)。
在一个实施方案中，所述抗体或其结合片段包含SEQ ID NO:61的HCVR和SEQ IDNO:125的LCVR，其中X12选自Asn(N)、Ser(S)和Gly(G)。
在一个实施方案中，所述抗体或其结合片段包含SEQ ID NO:62的HCVR和SEQ IDNO:71的LCVR，其中X12选自Asn(N)、Ser(S)和Gly(G)。
在一个实施方案中，所述抗体或其结合片段包含SEQ ID NO:62的HCVR和SEQ IDNO:72的LCVR，其中X12选自Asn(N)、Ser(S)和Gly(G)。
在一个实施方案中，所述抗体或其结合片段包含SEQ ID NO:62的HCVR和SEQ IDNO:73的LCVR，其中X12选自Asn(N)、Ser(S)和Gly(G)。
在一个实施方案中，所述抗体或其结合片段包含SEQ ID NO:62的HCVR和SEQ IDNO:74的LCVR，其中X12选自Asn(N)、Ser(S)和Gly(G)。
在一个实施方案中，所述抗体或其结合片段包含SEQ ID NO:62的HCVR和SEQ IDNO:75的LCVR，其中X12选自Asn(N)、Ser(S)和Gly(G)。
在一个实施方案中，所述抗体或其结合片段包含SEQ ID NO:62的HCVR和SEQ IDNO:76的LCVR，其中X12选自Asn(N)、Ser(S)和Gly(G)。
在一个实施方案中，所述抗体或其结合片段包含SEQ ID NO:62的HCVR和SEQ IDNO:77的LCVR，其中X12选自Asn(N)、Ser(S)和Gly(G)。
在一个实施方案中，所述抗体或其结合片段包含SEQ ID NO:62的HCVR和SEQ IDNO:78的LCVR，其中X12选自Asn(N)、Ser(S)和Gly(G)。
在一个实施方案中，所述抗体或其结合片段包含SEQ ID NO:62的HCVR和SEQ IDNO:79的LCVR，其中X12选自Asn(N)、Ser(S)和Gly(G)。
在一个实施方案中，所述抗体或其结合片段包含SEQ ID NO:62的HCVR和SEQ IDNO:80的LCVR，其中X12选自Asn(N)、Ser(S)和Gly(G)。
在一个实施方案中，所述抗体或其结合片段包含SEQ ID NO:62的HCVR和SEQ IDNO:102的LCVR，其中X12选自Asn(N)、Ser(S)和Gly(G)。
在一个实施方案中，所述抗体或其结合片段包含SEQ ID NO:62的HCVR和SEQ IDNO:112的LCVR，其中X12选自Asn(N)、Ser(S)和Gly(G)。
在一个实施方案中，所述抗体或其结合片段包含SEQ ID NO:62的HCVR和SEQ IDNO:125的LCVR，其中X12选自Asn(N)、Ser(S)和Gly(G)。
在一个实施方案中，所述抗体或其结合片段包含SEQ ID NO:63的HCVR和SEQ IDNO:71的LCVR，其中X12选自Asn(N)、Ser(S)和Gly(G)。
在一个实施方案中，所述抗体或其结合片段包含SEQ ID NO:63的HCVR和SEQ IDNO:72的LCVR，其中X12选自Asn(N)、Ser(S)和Gly(G)。
在一个实施方案中，所述抗体或其结合片段包含SEQ ID NO:63的HCVR和SEQ IDNO:73的LCVR，其中X12选自Asn(N)、Ser(S)和Gly(G)。
在一个实施方案中，所述抗体或其结合片段包含SEQ ID NO:63的HCVR和SEQ IDNO:74的LCVR，其中X12选自Asn(N)、Ser(S)和Gly(G)。
在一个实施方案中，所述抗体或其结合片段包含SEQ ID NO:63的HCVR和SEQ IDNO:75的LCVR，其中X12选自Asn(N)、Ser(S)和Gly(G)。
在一个实施方案中，所述抗体或其结合片段包含SEQ ID NO:63的HCVR和SEQ IDNO:76的LCVR，其中X12选自Asn(N)、Ser(S)和Gly(G)。
在一个实施方案中，所述抗体或其结合片段包含SEQ ID NO:63的HCVR和SEQ IDNO:77的LCVR，其中X12选自Asn(N)、Ser(S)和Gly(G)。
在一个实施方案中，所述抗体或其结合片段包含SEQ ID NO:63的HCVR和SEQ IDNO:78的LCVR，其中X12选自Asn(N)、Ser(S)和Gly(G)。
在一个实施方案中，所述抗体或其结合片段包含SEQ ID NO:63的HCVR和SEQ IDNO:79的LCVR，其中X12选自Asn(N)、Ser(S)和Gly(G)。
在一个实施方案中，所述抗体或其结合片段包含SEQ ID NO:63的HCVR和SEQ IDNO:80的LCVR，其中X12选自Asn(N)、Ser(S)和Gly(G)。
在一个实施方案中，所述抗体或其结合片段包含SEQ ID NO:63的HCVR和SEQ IDNO:102的LCVR，其中X12选自Asn(N)、Ser(S)和Gly(G)。
在一个实施方案中，所述抗体或其结合片段包含SEQ ID NO:63的HCVR和SEQ IDNO:112的LCVR，其中X12选自Asn(N)、Ser(S)和Gly(G)。
在一个实施方案中，所述抗体或其结合片段包含SEQ ID NO:63的HCVR和SEQ IDNO:125的LCVR，其中X12选自Asn(N)、Ser(S)和Gly(G)。
在一个实施方案中，所述抗体或其结合片段包含SEQ ID NO:64的HCVR和SEQ IDNO:71的LCVR，其中X12选自Asn(N)、Ser(S)和Gly(G)。
在一个实施方案中，所述抗体或其结合片段包含SEQ ID NO:64的HCVR和SEQ IDNO:72的LCVR，其中X12选自Asn(N)、Ser(S)和Gly(G)。
在一个实施方案中，所述抗体或其结合片段包含SEQ ID NO:64的HCVR和SEQ IDNO:73的LCVR，其中X12选自Asn(N)、Ser(S)和Gly(G)。
在一个实施方案中，所述抗体或其结合片段包含SEQ ID NO:64的HCVR和SEQ IDNO:74的LCVR，其中X12选自Asn(N)、Ser(S)和Gly(G)。
在一个实施方案中，所述抗体或其结合片段包含SEQ ID NO:64的HCVR和SEQ IDNO:75的LCVR，其中X12选自Asn(N)、Ser(S)和Gly(G)。
在一个实施方案中，所述抗体或其结合片段包含SEQ ID NO:64的HCVR和SEQ IDNO:76的LCVR，其中X12选自Asn(N)、Ser(S)和Gly(G)。
在一个实施方案中，所述抗体或其结合片段包含SEQ ID NO:64的HCVR和SEQ IDNO:77的LCVR，其中X12选自Asn(N)、Ser(S)和Gly(G)。
在一个实施方案中，所述抗体或其结合片段包含SEQ ID NO:64的HCVR和SEQ IDNO:78的LCVR，其中X12选自Asn(N)、Ser(S)和Gly(G)。
在一个实施方案中，所述抗体或其结合片段包含SEQ ID NO:64的HCVR和SEQ IDNO:79的LCVR，其中X12选自Asn(N)、Ser(S)和Gly(G)。
在一个实施方案中，所述抗体或其结合片段包含SEQ ID NO:64的HCVR和SEQ IDNO:80的LCVR，其中X12选自Asn(N)、Ser(S)和Gly(G)。
在一个实施方案中，所述抗体或其结合片段包含SEQ ID NO:64的HCVR和SEQ IDNO:102的LCVR，其中X12选自Asn(N)、Ser(S)和Gly(G)。
在一个实施方案中，所述抗体或其结合片段包含SEQ ID NO:64的HCVR和SEQ IDNO:112的LCVR，其中X12选自Asn(N)、Ser(S)和Gly(G)。
在一个实施方案中，所述抗体或其结合片段包含SEQ ID NO:64的HCVR和SEQ IDNO:125的LCVR，其中X12选自Asn(N)、Ser(S)和Gly(G)。
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在一个实施方案中，所述抗体或其结合片段包含SEQ ID NO:66的HCVR和SEQ IDNO:73的LCVR，其中X12选自Asn(N)、Ser(S)和Gly(G)。
在一个实施方案中，所述抗体或其结合片段包含SEQ ID NO:66的HCVR和SEQ IDNO:74的LCVR，其中X12选自Asn(N)、Ser(S)和Gly(G)。
在一个实施方案中，所述抗体或其结合片段包含SEQ ID NO:66的HCVR和SEQ IDNO:75的LCVR，其中X12选自Asn(N)、Ser(S)和Gly(G)。
在一个实施方案中，所述抗体或其结合片段包含SEQ ID NO:66的HCVR和SEQ IDNO:76的LCVR，其中X12选自Asn(N)、Ser(S)和Gly(G)。
在一个实施方案中，所述抗体或其结合片段包含SEQ ID NO:66的HCVR和SEQ IDNO:77的LCVR，其中X12选自Asn(N)、Ser(S)和Gly(G)。
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在一个实施方案中，所述抗体或其结合片段包含SEQ ID NO:68的HCVR和SEQ IDNO:77的LCVR，其中X12选自Asn(N)、Ser(S)和Gly(G)。
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在一个实施方案中，所述抗体或其结合片段包含SEQ ID NO:68的HCVR和SEQ IDNO:79的LCVR，其中X12选自Asn(N)、Ser(S)和Gly(G)。
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在一个实施方案中，所述抗体或其结合片段包含SEQ ID NO:69的HCVR和SEQ IDNO:73的LCVR，其中X12选自Asn(N)、Ser(S)和Gly(G)。
在一个实施方案中，所述抗体或其结合片段包含SEQ ID NO:69的HCVR和SEQ IDNO:74的LCVR，其中X12选自Asn(N)、Ser(S)和Gly(G)。
在一个实施方案中，所述抗体或其结合片段包含SEQ ID NO:69的HCVR和SEQ IDNO:75的LCVR，其中X12选自Asn(N)、Ser(S)和Gly(G)。
在一个实施方案中，所述抗体或其结合片段包含SEQ ID NO:69的HCVR和SEQ IDNO:76的LCVR，其中X12选自Asn(N)、Ser(S)和Gly(G)。
在一个实施方案中，所述抗体或其结合片段包含SEQ ID NO:69的HCVR和SEQ IDNO:77的LCVR，其中X12选自Asn(N)、Ser(S)和Gly(G)。
在一个实施方案中，所述抗体或其结合片段包含SEQ ID NO:69的HCVR和SEQ IDNO:78的LCVR，其中X12选自Asn(N)、Ser(S)和Gly(G)。
在一个实施方案中，所述抗体或其结合片段包含SEQ ID NO:69的HCVR和SEQ IDNO:79的LCVR，其中X12选自Asn(N)、Ser(S)和Gly(G)。
在一个实施方案中，所述抗体或其结合片段包含SEQ ID NO:69的HCVR和SEQ IDNO:80的LCVR，其中X12选自Asn(N)、Ser(S)和Gly(G)。
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在一个实施方案中，所述抗体或其结合片段包含SEQ ID NO:70的HCVR和SEQ IDNO:76的LCVR，其中X12选自Asn(N)、Ser(S)和Gly(G)。
在一个实施方案中，所述抗体或其结合片段包含SEQ ID NO:70的HCVR和SEQ IDNO:77的LCVR，其中X12选自Asn(N)、Ser(S)和Gly(G)。
在一个实施方案中，所述抗体或其结合片段包含SEQ ID NO:70的HCVR和SEQ IDNO:78的LCVR，其中X12选自Asn(N)、Ser(S)和Gly(G)。
在一个实施方案中，所述抗体或其结合片段包含SEQ ID NO:70的HCVR和SEQ IDNO:79的LCVR，其中X12选自Asn(N)、Ser(S)和Gly(G)。
在一个实施方案中，所述抗体或其结合片段包含SEQ ID NO:70的HCVR和SEQ IDNO:80的LCVR，其中X12选自Asn(N)、Ser(S)和Gly(G)。
在一个实施方案中，所述抗体或其结合片段包含SEQ ID NO:70的HCVR和SEQ IDNO:102的LCVR，其中X12选自Asn(N)、Ser(S)和Gly(G)。
在一个实施方案中，所述抗体或其结合片段包含SEQ ID NO:70的HCVR和SEQ IDNO:112的LCVR，其中X12选自Asn(N)、Ser(S)和Gly(G)。
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在一个实施方案中，所述抗体或其结合片段包含SEQ ID NO:101的HCVR和SEQ IDNO:71的LCVR，其中X12选自Asn(N)、Ser(S)和Gly(G)。
在一个实施方案中，所述抗体或其结合片段包含SEQ ID NO:101的HCVR和SEQ IDNO:72的LCVR，其中X12选自Asn(N)、Ser(S)和Gly(G)。
在一个实施方案中，所述抗体或其结合片段包含SEQ ID NO:101的HCVR和SEQ IDNO:73的LCVR，其中X12选自Asn(N)、Ser(S)和Gly(G)。
在一个实施方案中，所述抗体或其结合片段包含SEQ ID NO:101的HCVR和SEQ IDNO:74的LCVR，其中X12选自Asn(N)、Ser(S)和Gly(G)。
在一个实施方案中，所述抗体或其结合片段包含SEQ ID NO:101的HCVR和SEQ IDNO:75的LCVR，其中X12选自Asn(N)、Ser(S)和Gly(G)。
在一个实施方案中，所述抗体或其结合片段包含SEQ ID NO:101的HCVR和SEQ IDNO:76的LCVR，其中X12选自Asn(N)、Ser(S)和Gly(G)。
在一个实施方案中，所述抗体或其结合片段包含SEQ ID NO:101的HCVR和SEQ IDNO:77的LCVR，其中X12选自Asn(N)、Ser(S)和Gly(G)。
在一个实施方案中，所述抗体或其结合片段包含SEQ ID NO:101的HCVR和SEQ IDNO:78的LCVR，其中X12选自Asn(N)、Ser(S)和Gly(G)。
在一个实施方案中，所述抗体或其结合片段包含SEQ ID NO:101的HCVR和SEQ IDNO:79的LCVR，其中X12选自Asn(N)、Ser(S)和Gly(G)。
在一个实施方案中，所述抗体或其结合片段包含SEQ ID NO:101的HCVR和SEQ IDNO:80的LCVR，其中X12选自Asn(N)、Ser(S)和Gly(G)。
在一个实施方案中，所述抗体或其结合片段包含SEQ ID NO:101的HCVR和SEQ IDNO:102的LCVR，其中X12选自Asn(N)、Ser(S)和Gly(G)。
在一个实施方案中，所述抗体或其结合片段包含SEQ ID NO:101的HCVR和SEQ IDNO:112的LCVR，其中X12选自Asn(N)、Ser(S)和Gly(G)。
在一个实施方案中，所述抗体或其结合片段包含SEQ ID NO:101的HCVR和SEQ IDNO:125的LCVR，其中X12选自Asn(N)、Ser(S)和Gly(G)。
在一个实施方案中，所述抗体或其结合片段包含SEQ ID NO:121的HCVR和SEQ IDNO:71的LCVR，其中X12选自Asn(N)、Ser(S)和Gly(G)。
在一个实施方案中，所述抗体或其结合片段包含SEQ ID NO:121的HCVR和SEQ IDNO:72的LCVR，其中X12选自Asn(N)、Ser(S)和Gly(G)。
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在一个实施方案中，所述抗体或其结合片段包含SEQ ID NO:121的HCVR和SEQ IDNO:76的LCVR，其中X12选自Asn(N)、Ser(S)和Gly(G)。
在一个实施方案中，所述抗体或其结合片段包含SEQ ID NO:121的HCVR和SEQ IDNO:77的LCVR，其中X12选自Asn(N)、Ser(S)和Gly(G)。
在一个实施方案中，所述抗体或其结合片段包含SEQ ID NO:121的HCVR和SEQ IDNO:78的LCVR，其中X12选自Asn(N)、Ser(S)和Gly(G)。
在一个实施方案中，所述抗体或其结合片段包含SEQ ID NO:121的HCVR和SEQ IDNO:79的LCVR，其中X12选自Asn(N)、Ser(S)和Gly(G)。
在一个实施方案中，所述抗体或其结合片段包含SEQ ID NO:121的HCVR和SEQ IDNO:80的LCVR，其中X12选自Asn(N)、Ser(S)和Gly(G)。
在一个实施方案中，所述抗体或其结合片段包含SEQ ID NO:121的HCVR和SEQ IDNO:102的LCVR，其中X12选自Asn(N)、Ser(S)和Gly(G)。
在一个实施方案中，所述抗体或其结合片段包含SEQ ID NO:121的HCVR和SEQ IDNO:112的LCVR，其中X12选自Asn(N)、Ser(S)和Gly(G)。
在一个实施方案中，所述抗体或其结合片段包含SEQ ID NO:121的HCVR和SEQ IDNO:125的LCVR，其中X12选自Asn(N)、Ser(S)和Gly(G)。
在一个实施方案中，所述抗体或其结合片段包含SEQ ID NO:122的HCVR和SEQ IDNO:71的LCVR，其中X12选自Asn(N)、Ser(S)和Gly(G)。
在一个实施方案中，所述抗体或其结合片段包含SEQ ID NO:122的HCVR和SEQ IDNO:72的LCVR，其中X12选自Asn(N)、Ser(S)和Gly(G)。
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在一个实施方案中，所述抗体或其结合片段包含SEQ ID NO:122的HCVR和SEQ IDNO:76的LCVR，其中X12选自Asn(N)、Ser(S)和Gly(G)。
在一个实施方案中，所述抗体或其结合片段包含SEQ ID NO:122的HCVR和SEQ IDNO:77的LCVR，其中X12选自Asn(N)、Ser(S)和Gly(G)。
在一个实施方案中，所述抗体或其结合片段包含SEQ ID NO:122的HCVR和SEQ IDNO:78的LCVR，其中X12选自Asn(N)、Ser(S)和Gly(G)。
在一个实施方案中，所述抗体或其结合片段包含SEQ ID NO:122的HCVR和SEQ IDNO:79的LCVR，其中X12选自Asn(N)、Ser(S)和Gly(G)。
在一个实施方案中，所述抗体或其结合片段包含SEQ ID NO:122的HCVR和SEQ IDNO:80的LCVR，其中X12选自Asn(N)、Ser(S)和Gly(G)。
在一个实施方案中，所述抗体或其结合片段包含SEQ ID NO:122的HCVR和SEQ IDNO:102的LCVR，其中X12选自Asn(N)、Ser(S)和Gly(G)。
在一个实施方案中，所述抗体或其结合片段包含SEQ ID NO:122的HCVR和SEQ IDNO:112的LCVR，其中X12选自Asn(N)、Ser(S)和Gly(G)。
在一个实施方案中，所述抗体或其结合片段包含SEQ ID NO:122的HCVR和SEQ IDNO:125的LCVR，其中X12选自Asn(N)、Ser(S)和Gly(G)。
在一个实施方案中，所述抗体或其结合片段包含SEQ ID NO:123的HCVR和SEQ IDNO:71的LCVR，其中X12选自Asn(N)、Ser(S)和Gly(G)。
在一个实施方案中，所述抗体或其结合片段包含SEQ ID NO:123的HCVR和SEQ IDNO:72的LCVR，其中X12选自Asn(N)、Ser(S)和Gly(G)。
在一个实施方案中，所述抗体或其结合片段包含SEQ ID NO:123的HCVR和SEQ IDNO:73的LCVR，其中X12选自Asn(N)、Ser(S)和Gly(G)。
在一个实施方案中，所述抗体或其结合片段包含SEQ ID NO:123的HCVR和SEQ IDNO:74的LCVR，其中X12选自Asn(N)、Ser(S)和Gly(G)。
在一个实施方案中，所述抗体或其结合片段包含SEQ ID NO:123的HCVR和SEQ IDNO:75的LCVR，其中X12选自Asn(N)、Ser(S)和Gly(G)。
在一个实施方案中，所述抗体或其结合片段包含SEQ ID NO:123的HCVR和SEQ IDNO:76的LCVR，其中X12选自Asn(N)、Ser(S)和Gly(G)。
在一个实施方案中，所述抗体或其结合片段包含SEQ ID NO:123的HCVR和SEQ IDNO:77的LCVR，其中X12选自Asn(N)、Ser(S)和Gly(G)。
在一个实施方案中，所述抗体或其结合片段包含SEQ ID NO:123的HCVR和SEQ IDNO:78的LCVR，其中X12选自Asn(N)、Ser(S)和Gly(G)。
在一个实施方案中，所述抗体或其结合片段包含SEQ ID NO:123的HCVR和SEQ IDNO:79的LCVR，其中X12选自Asn(N)、Ser(S)和Gly(G)。
在一个实施方案中，所述抗体或其结合片段包含SEQ ID NO:123的HCVR和SEQ IDNO:80的LCVR，其中X12选自Asn(N)、Ser(S)和Gly(G)。
在一个实施方案中，所述抗体或其结合片段包含SEQ ID NO:123的HCVR和SEQ IDNO:102的LCVR，其中X12选自Asn(N)、Ser(S)和Gly(G)。
在一个实施方案中，所述抗体或其结合片段包含SEQ ID NO:123的HCVR和SEQ IDNO:112的LCVR，其中X12选自Asn(N)、Ser(S)和Gly(G)。
在一个实施方案中，所述抗体或其结合片段包含SEQ ID NO:123的HCVR和SEQ IDNO:125的LCVR，其中X12选自Asn(N)、Ser(S)和Gly(G)。
在一个实施方案中，所述抗体或其结合片段包含SEQ ID NO:124的HCVR和SEQ IDNO:71的LCVR，其中X12选自Asn(N)、Ser(S)和Gly(G)。
在一个实施方案中，所述抗体或其结合片段包含SEQ ID NO:124的HCVR和SEQ IDNO:72的LCVR，其中X12选自Asn(N)、Ser(S)和Gly(G)。
在一个实施方案中，所述抗体或其结合片段包含SEQ ID NO:124的HCVR和SEQ IDNO:73的LCVR，其中X12选自Asn(N)、Ser(S)和Gly(G)。
在一个实施方案中，所述抗体或其结合片段包含SEQ ID NO:124的HCVR和SEQ IDNO:74的LCVR，其中X12选自Asn(N)、Ser(S)和Gly(G)。
在一个实施方案中，所述抗体或其结合片段包含SEQ ID NO:124的HCVR和SEQ IDNO:75的LCVR，其中X12选自Asn(N)、Ser(S)和Gly(G)。
在一个实施方案中，所述抗体或其结合片段包含SEQ ID NO:124的HCVR和SEQ IDNO:76的LCVR，其中X12选自Asn(N)、Ser(S)和Gly(G)。
在一个实施方案中，所述抗体或其结合片段包含SEQ ID NO:124的HCVR和SEQ IDNO:77的LCVR，其中X12选自Asn(N)、Ser(S)和Gly(G)。
在一个实施方案中，所述抗体或其结合片段包含SEQ ID NO:124的HCVR和SEQ IDNO:78的LCVR，其中X12选自Asn(N)、Ser(S)和Gly(G)。
在一个实施方案中，所述抗体或其结合片段包含SEQ ID NO:124的HCVR和SEQ IDNO:79的LCVR，其中X12选自Asn(N)、Ser(S)和Gly(G)。
在一个实施方案中，所述抗体或其结合片段包含SEQ ID NO:124的HCVR和SEQ IDNO:80的LCVR，其中X12选自Asn(N)、Ser(S)和Gly(G)。
在一个实施方案中，所述抗体或其结合片段包含SEQ ID NO:124的HCVR和SEQ IDNO:102的LCVR，其中X12选自Asn(N)、Ser(S)和Gly(G)。
在一个实施方案中，所述抗体或其结合片段包含SEQ ID NO:124的HCVR和SEQ IDNO:112的LCVR，其中X12选自Asn(N)、Ser(S)和Gly(G)。
在一个实施方案中，所述抗体或其结合片段包含SEQ ID NO:124的HCVR和SEQ IDNO:125的LCVR，其中X12选自Asn(N)、Ser(S)和Gly(G)。
在一个实施方案中，所述抗体或其结合片段包含SEQ ID NO:61的HCVR和SEQ IDNO:81的LCVR。
在一个实施方案中，所述抗体或其结合片段包含SEQ ID NO:61的HCVR和SEQ IDNO:82的LCVR。
在一个实施方案中，所述抗体或其结合片段包含SEQ ID NO:61的HCVR和SEQ IDNO:83的LCVR。
在一个实施方案中，所述抗体或其结合片段包含SEQ ID NO:61的HCVR和SEQ IDNO:84的LCVR。
在一个实施方案中，所述抗体或其结合片段包含SEQ ID NO:61的HCVR和SEQ IDNO:85的LCVR。
在一个实施方案中，所述抗体或其结合片段包含SEQ ID NO:61的HCVR和SEQ IDNO:86的LCVR。
在一个实施方案中，所述抗体或其结合片段包含SEQ ID NO:61的HCVR和SEQ IDNO:87的LCVR。
在一个实施方案中，所述抗体或其结合片段包含SEQ ID NO:61的HCVR和SEQ IDNO:88的LCVR。
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在一个实施方案中，所述抗体或其结合片段包含SEQ ID NO:61的HCVR和SEQ IDNO:90的LCVR。
在一个实施方案中，所述抗体或其结合片段包含SEQ ID NO:61的HCVR和SEQ IDNO:103的LCVR。
在一个实施方案中，所述抗体或其结合片段包含SEQ ID NO:61的HCVR和SEQ IDNO:113的LCVR。
在一个实施方案中，所述抗体或其结合片段包含SEQ ID NO:61的HCVR和SEQ IDNO:126的LCVR。
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在一个实施方案中，所述抗体或其结合片段包含SEQ ID NO:62的HCVR和SEQ IDNO:82的LCVR。
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在一个实施方案中，所述抗体或其结合片段包含SEQ ID NO:62的HCVR和SEQ IDNO:86的LCVR。
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在一个实施方案中，所述抗体或其结合片段包含SEQ ID NO:62的HCVR和SEQ IDNO:88的LCVR。
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在一个实施方案中，所述抗体或其结合片段包含SEQ ID NO:62的HCVR和SEQ IDNO:90的LCVR。
在一个实施方案中，所述抗体或其结合片段包含SEQ ID NO:62的HCVR和SEQ IDNO:103的LCVR。
在一个实施方案中，所述抗体或其结合片段包含SEQ ID NO:62的HCVR和SEQ IDNO:113的LCVR。
在一个实施方案中，所述抗体或其结合片段包含SEQ ID NO:62的HCVR和SEQ IDNO:126的LCVR。
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在一个实施方案中，所述抗体或其结合片段包含SEQ ID NO:65的HCVR和SEQ IDNO:90的LCVR。
在一个实施方案中，所述抗体或其结合片段包含SEQ ID NO:65的HCVR和SEQ IDNO:103的LCVR。
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在一个实施方案中，所述抗体或其结合片段包含SEQ ID NO:66的HCVR和SEQ IDNO:87的LCVR。
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在一个实施方案中，所述抗体或其结合片段包含SEQ ID NO:66的HCVR和SEQ IDNO:89的LCVR。
在一个实施方案中，所述抗体或其结合片段包含SEQ ID NO:66的HCVR和SEQ IDNO:90的LCVR。
在一个实施方案中，所述抗体或其结合片段包含SEQ ID NO:66的HCVR和SEQ IDNO:103的LCVR。
在一个实施方案中，所述抗体或其结合片段包含SEQ ID NO:66的HCVR和SEQ IDNO:113的LCVR。
在一个实施方案中，所述抗体或其结合片段包含SEQ ID NO:66的HCVR和SEQ IDNO:126的LCVR。
在一个实施方案中，所述抗体或其结合片段包含SEQ ID NO:67的HCVR和SEQ IDNO:81的LCVR。
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在一个实施方案中，所述抗体或其结合片段包含SEQ ID NO:67的HCVR和SEQ IDNO:84的LCVR。
在一个实施方案中，所述抗体或其结合片段包含SEQ ID NO:67的HCVR和SEQ IDNO:85的LCVR。
在一个实施方案中，所述抗体或其结合片段包含SEQ ID NO:67的HCVR和SEQ IDNO:86的LCVR。
在一个实施方案中，所述抗体或其结合片段包含SEQ ID NO:67的HCVR和SEQ IDNO:87的LCVR。
在一个实施方案中，所述抗体或其结合片段包含SEQ ID NO:67的HCVR和SEQ IDNO:88的LCVR。
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在一个实施方案中，所述抗体或其结合片段包含SEQ ID NO:67的HCVR和SEQ IDNO:90的LCVR。
在一个实施方案中，所述抗体或其结合片段包含SEQ ID NO:67的HCVR和SEQ IDNO:103的LCVR。
在一个实施方案中，所述抗体或其结合片段包含SEQ ID NO:67的HCVR和SEQ IDNO:113的LCVR。
在一个实施方案中，所述抗体或其结合片段包含SEQ ID NO:67的HCVR和SEQ IDNO:126的LCVR。
在一个实施方案中，所述抗体或其结合片段包含SEQ ID NO:68的HCVR和SEQ IDNO:81的LCVR。
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在一个实施方案中，所述抗体或其结合片段包含SEQ ID NO:68的HCVR和SEQ IDNO:86的LCVR。
在一个实施方案中，所述抗体或其结合片段包含SEQ ID NO:68的HCVR和SEQ IDNO:87的LCVR。
在一个实施方案中，所述抗体或其结合片段包含SEQ ID NO:68的HCVR和SEQ IDNO:88的LCVR。
在一个实施方案中，所述抗体或其结合片段包含SEQ ID NO:68的HCVR和SEQ IDNO:89的LCVR。
在一个实施方案中，所述抗体或其结合片段包含SEQ ID NO:68的HCVR和SEQ IDNO:90的LCVR。
在一个实施方案中，所述抗体或其结合片段包含SEQ ID NO:68的HCVR和SEQ IDNO:103的LCVR。
在一个实施方案中，所述抗体或其结合片段包含SEQ ID NO:68的HCVR和SEQ IDNO:113的LCVR。
在一个实施方案中，所述抗体或其结合片段包含SEQ ID NO:68的HCVR和SEQ IDNO:126的LCVR。
在一个实施方案中，所述抗体或其结合片段包含SEQ ID NO:69的HCVR和SEQ IDNO:81的LCVR。
在一个实施方案中，所述抗体或其结合片段包含SEQ ID NO:69的HCVR和SEQ IDNO:82的LCVR。
在一个实施方案中，所述抗体或其结合片段包含SEQ ID NO:69的HCVR和SEQ IDNO:83的LCVR。
在一个实施方案中，所述抗体或其结合片段包含SEQ ID NO:69的HCVR和SEQ IDNO:84的LCVR。
在一个实施方案中，所述抗体或其结合片段包含SEQ ID NO:69的HCVR和SEQ IDNO:85的LCVR。
在一个实施方案中，所述抗体或其结合片段包含SEQ ID NO:69的HCVR和SEQ IDNO:86的LCVR。
在一个实施方案中，所述抗体或其结合片段包含SEQ ID NO:69的HCVR和SEQ IDNO:87的LCVR。
在一个实施方案中，所述抗体或其结合片段包含SEQ ID NO:69的HCVR和SEQ IDNO:88的LCVR。
在一个实施方案中，所述抗体或其结合片段包含SEQ ID NO:69的HCVR和SEQ IDNO:89的LCVR。
在一个实施方案中，所述抗体或其结合片段包含SEQ ID NO:69的HCVR和SEQ IDNO:90的LCVR。
在一个实施方案中，所述抗体或其结合片段包含SEQ ID NO:69的HCVR和SEQ IDNO:103的LCVR。
在一个实施方案中，所述抗体或其结合片段包含SEQ ID NO:69的HCVR和SEQ IDNO:113的LCVR。
在一个实施方案中，所述抗体或其结合片段包含SEQ ID NO:69的HCVR和SEQ IDNO:126的LCVR。
在一个实施方案中，所述抗体或其结合片段包含SEQ ID NO:70的HCVR和SEQ IDNO:81的LCVR。
在一个实施方案中，所述抗体或其结合片段包含SEQ ID NO:70的HCVR和SEQ IDNO:82的LCVR。
在一个实施方案中，所述抗体或其结合片段包含SEQ ID NO:70的HCVR和SEQ IDNO:83的LCVR。
在一个实施方案中，所述抗体或其结合片段包含SEQ ID NO:70的HCVR和SEQ IDNO:84的LCVR。
在一个实施方案中，所述抗体或其结合片段包含SEQ ID NO:70的HCVR和SEQ IDNO:85的LCVR。
在一个实施方案中，所述抗体或其结合片段包含SEQ ID NO:70的HCVR和SEQ IDNO:86的LCVR。
在一个实施方案中，所述抗体或其结合片段包含SEQ ID NO:70的HCVR和SEQ IDNO:87的LCVR。
在一个实施方案中，所述抗体或其结合片段包含SEQ ID NO:70的HCVR和SEQ IDNO:88的LCVR。
在一个实施方案中，所述抗体或其结合片段包含SEQ ID NO:70的HCVR和SEQ IDNO:89的LCVR。
在一个实施方案中，所述抗体或其结合片段包含SEQ ID NO:70的HCVR和SEQ IDNO:90的LCVR。
在一个实施方案中，所述抗体或其结合片段包含SEQ ID NO:70的HCVR和SEQ IDNO:103的LCVR。
在一个实施方案中，所述抗体或其结合片段包含SEQ ID NO:70的HCVR和SEQ IDNO:113的LCVR。
在一个实施方案中，所述抗体或其结合片段包含SEQ ID NO:70的HCVR和SEQ IDNO:126的LCVR。
在一个实施方案中，所述抗体或其结合片段包含SEQ ID NO:101的HCVR和SEQ IDNO:81的LCVR。
在一个实施方案中，所述抗体或其结合片段包含SEQ ID NO:101的HCVR和SEQ IDNO:82的LCVR。
在一个实施方案中，所述抗体或其结合片段包含SEQ ID NO:101的HCVR和SEQ IDNO:83的LCVR。
在一个实施方案中，所述抗体或其结合片段包含SEQ ID NO:101的HCVR和SEQ IDNO:84的LCVR。
在一个实施方案中，所述抗体或其结合片段包含SEQ ID NO:101的HCVR和SEQ IDNO:85的LCVR。
在一个实施方案中，所述抗体或其结合片段包含SEQ ID NO:101的HCVR和SEQ IDNO:86的LCVR。
在一个实施方案中，所述抗体或其结合片段包含SEQ ID NO:101的HCVR和SEQ IDNO:87的LCVR。
在一个实施方案中，所述抗体或其结合片段包含SEQ ID NO:101的HCVR和SEQ IDNO:88的LCVR。
在一个实施方案中，所述抗体或其结合片段包含SEQ ID NO:101的HCVR和SEQ IDNO:89的LCVR。
在一个实施方案中，所述抗体或其结合片段包含SEQ ID NO:101的HCVR和SEQ IDNO:90的LCVR。
在一个实施方案中，所述抗体或其结合片段包含SEQ ID NO:101的HCVR和SEQ IDNO:103的LCVR。
在一个实施方案中，所述抗体或其结合片段包含SEQ ID NO:101的HCVR和SEQ IDNO:113的LCVR。
在一个实施方案中，所述抗体或其结合片段包含SEQ ID NO:101的HCVR和SEQ IDNO:126的LCVR。
在一个实施方案中，所述抗体或其结合片段包含SEQ ID NO:121的HCVR和SEQ IDNO:81的LCVR。
在一个实施方案中，所述抗体或其结合片段包含SEQ ID NO:121的HCVR和SEQ IDNO:82的LCVR。
在一个实施方案中，所述抗体或其结合片段包含SEQ ID NO:121的HCVR和SEQ IDNO:83的LCVR。
在一个实施方案中，所述抗体或其结合片段包含SEQ ID NO:121的HCVR和SEQ IDNO:84的LCVR。
在一个实施方案中，所述抗体或其结合片段包含SEQ ID NO:121的HCVR和SEQ IDNO:85的LCVR。
在一个实施方案中，所述抗体或其结合片段包含SEQ ID NO:121的HCVR和SEQ IDNO:86的LCVR。
在一个实施方案中，所述抗体或其结合片段包含SEQ ID NO:121的HCVR和SEQ IDNO:87的LCVR。
在一个实施方案中，所述抗体或其结合片段包含SEQ ID NO:121的HCVR和SEQ IDNO:88的LCVR。
在一个实施方案中，所述抗体或其结合片段包含SEQ ID NO:121的HCVR和SEQ IDNO:89的LCVR。
在一个实施方案中，所述抗体或其结合片段包含SEQ ID NO:121的HCVR和SEQ IDNO:90的LCVR。
在一个实施方案中，所述抗体或其结合片段包含SEQ ID NO:121的HCVR和SEQ IDNO:103的LCVR。
在一个实施方案中，所述抗体或其结合片段包含SEQ ID NO:121的HCVR和SEQ IDNO:113的LCVR。
在一个实施方案中，所述抗体或其结合片段包含SEQ ID NO:121的HCVR和SEQ IDNO:126的LCVR。
在一个实施方案中，所述抗体或其结合片段包含SEQ ID NO:122的HCVR和SEQ IDNO:81的LCVR。
在一个实施方案中，所述抗体或其结合片段包含SEQ ID NO:122的HCVR和SEQ IDNO:82的LCVR。
在一个实施方案中，所述抗体或其结合片段包含SEQ ID NO:122的HCVR和SEQ IDNO:83的LCVR。
在一个实施方案中，所述抗体或其结合片段包含SEQ ID NO:122的HCVR和SEQ IDNO:84的LCVR。
在一个实施方案中，所述抗体或其结合片段包含SEQ ID NO:122的HCVR和SEQ IDNO:85的LCVR。
在一个实施方案中，所述抗体或其结合片段包含SEQ ID NO:122的HCVR和SEQ IDNO:86的LCVR。
在一个实施方案中，所述抗体或其结合片段包含SEQ ID NO:122的HCVR和SEQ IDNO:87的LCVR。
在一个实施方案中，所述抗体或其结合片段包含SEQ ID NO:122的HCVR和SEQ IDNO:88的LCVR。
在一个实施方案中，所述抗体或其结合片段包含SEQ ID NO:122的HCVR和SEQ IDNO:89的LCVR。
在一个实施方案中，所述抗体或其结合片段包含SEQ ID NO:122的HCVR和SEQ IDNO:90的LCVR。
在一个实施方案中，所述抗体或其结合片段包含SEQ ID NO:122的HCVR和SEQ IDNO:103的LCVR。
在一个实施方案中，所述抗体或其结合片段包含SEQ ID NO:122的HCVR和SEQ IDNO:113的LCVR。
在一个实施方案中，所述抗体或其结合片段包含SEQ ID NO:122的HCVR和SEQ IDNO:126的LCVR。
在一个实施方案中，所述抗体或其结合片段包含SEQ ID NO:123的HCVR和SEQ IDNO:81的LCVR。
在一个实施方案中，所述抗体或其结合片段包含SEQ ID NO:123的HCVR和SEQ IDNO:82的LCVR。
在一个实施方案中，所述抗体或其结合片段包含SEQ ID NO:123的HCVR和SEQ IDNO:83的LCVR。
在一个实施方案中，所述抗体或其结合片段包含SEQ ID NO:123的HCVR和SEQ IDNO:84的LCVR。
在一个实施方案中，所述抗体或其结合片段包含SEQ ID NO:123的HCVR和SEQ IDNO:85的LCVR。
在一个实施方案中，所述抗体或其结合片段包含SEQ ID NO:123的HCVR和SEQ IDNO:86的LCVR。
在一个实施方案中，所述抗体或其结合片段包含SEQ ID NO:123的HCVR和SEQ IDNO:87的LCVR。
在一个实施方案中，所述抗体或其结合片段包含SEQ ID NO:123的HCVR和SEQ IDNO:88的LCVR。
在一个实施方案中，所述抗体或其结合片段包含SEQ ID NO:123的HCVR和SEQ IDNO:89的LCVR。
在一个实施方案中，所述抗体或其结合片段包含SEQ ID NO:123的HCVR和SEQ IDNO:90的LCVR。
在一个实施方案中，所述抗体或其结合片段包含SEQ ID NO:123的HCVR和SEQ IDNO:103的LCVR。
在一个实施方案中，所述抗体或其结合片段包含SEQ ID NO:123的HCVR和SEQ IDNO:113的LCVR。
在一个实施方案中，所述抗体或其结合片段包含SEQ ID NO:123的HCVR和SEQ IDNO:126的LCVR。
在一个实施方案中，所述抗体或其结合片段包含SEQ ID NO:124的HCVR和SEQ IDNO:81的LCVR。
在一个实施方案中，所述抗体或其结合片段包含SEQ ID NO:124的HCVR和SEQ IDNO:82的LCVR。
在一个实施方案中，所述抗体或其结合片段包含SEQ ID NO:124的HCVR和SEQ IDNO:83的LCVR。
在一个实施方案中，所述抗体或其结合片段包含SEQ ID NO:124的HCVR和SEQ IDNO:84的LCVR。
在一个实施方案中，所述抗体或其结合片段包含SEQ ID NO:124的HCVR和SEQ IDNO:85的LCVR。
在一个实施方案中，所述抗体或其结合片段包含SEQ ID NO:124的HCVR和SEQ IDNO:86的LCVR。
在一个实施方案中，所述抗体或其结合片段包含SEQ ID NO:124的HCVR和SEQ IDNO:87的LCVR。
在一个实施方案中，所述抗体或其结合片段包含SEQ ID NO:124的HCVR和SEQ IDNO:88的LCVR。
在一个实施方案中，所述抗体或其结合片段包含SEQ ID NO:124的HCVR和SEQ IDNO:89的LCVR。
在一个实施方案中，所述抗体或其结合片段包含SEQ ID NO:124的HCVR和SEQ IDNO:90的LCVR。
在一个实施方案中，所述抗体或其结合片段包含SEQ ID NO:124的HCVR和SEQ IDNO:103的LCVR。
在一个实施方案中，所述抗体或其结合片段包含SEQ ID NO:124的HCVR和SEQ IDNO:113的LCVR。
在一个实施方案中，所述抗体或其结合片段包含SEQ ID NO:124的HCVR和SEQ IDNO:126的LCVR。
在一个实施方案中，上文所定义的任意HCVR和/或LCVR均可以表征为具有1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、11个、12个、13个、14个、15个、16个、17个、18个、19个、20个、21个、22个、23个、24个、25个、26个、27个、28个、29个、30个、31个、32个、33个、34个、35个或更多个氨基酸被不同的氨基酸取代。
在一个实施方案中，上文所定义的任意HCVR和/或LCVR的非CDR区的序列均可以表征为具有1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、11个、12个、13个、14个、15个、16个、17个、18个、19个、20个、21个、22个、23个、24个、25个、26个、27个、28个、29个、30个、31个、32个、33个、34个、35个或更多个氨基酸被不同的氨基酸取代。
在一个实施方案中，上文所定义的任意HCVR和/或LCVR均可以表征为具有与上文所定义的特定HCVR和/或LCVR有至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或更高同一性的氨基酸序列。
在一个实施方案中，上文所定义的任意HCVR和/或LCVR的非CDR区的序列均可以表征为具有与上文所定义的特定HCVR和/或LCVR有至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或更高同一性的氨基酸序列。
本说明书还描述了一种分离的核酸，其编码上文“抗体或抗原结合片段”部分中公开的与hCD45RC结合的抗体或其结合片段。
在一个实施方案中，分离的核酸是纯化的。
在一个实施方案中，分离的核酸被纯化为：
(1)如通过吸光度法或荧光法测定(例如，通过测量260nm和280nm处的吸光度比(A260/280))，以核酸重量计大于80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％或更高，且最优选大于96％、97％、98％或99％；或
(2)如使用插入剂如溴化乙锭、SYBR Green、GelGreen等通过琼脂糖凝胶电泳并显示的均一性。
在一个实施方案中，编码抗原结合片段的核酸包含编码“抗体或抗原结合片段”部分中公开的抗体或其结合片段的HCVR的序列，或由其组成。
在一个实施方案中，编码抗原结合片段的核酸包含SEQ ID NO:95或与SEQ ID NO:95具有至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或更高同一性的任何序列，或由SEQ ID NO:95或与SEQ ID NO:95具有至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或更高同一性的任何序列组成，其编码具有SEQ ID NO:61的鼠或嵌合抗体或其结合片段的HCVR。
Figure BDA0003952383070001271
在一个实施方案中，编码抗原结合片段的核酸包含编码“抗体或抗原结合片段”部分中公开的抗体或其结合片段的LCVR的序列，或由其组成。
在一个实施方案中，编码抗原结合片段的核酸包含SEQ ID NO:96或与SEQ ID NO:96具有至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或更高同一性的任何序列，或由SEQ ID NO:96或与SEQ ID NO:96具有至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或更高同一性的任何序列组成，其编码具有SEQ ID NO:81的鼠或嵌合抗体或其结合片段的LCVR。
Figure BDA0003952383070001281
在一个实施方案中，编码抗原结合片段的核酸包含以下或由以下组成：
-编码“抗体或抗原结合片段”部分公开的所述抗体或其结合片段的HCVR的序列，以及
-编码“抗体或抗原结合片段”部分公开的所述抗体或其结合片段的LCVR的序列。
在一个实施方案中，编码抗原结合片段的核酸包含以下或由以下组成：
-序列SEQ ID NO:95或与SEQ ID NO:95具有至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或更多同一性的任何序列，以及
-序列SEQ ID NO:96或与SEQ ID NO:96具有至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或更多同一性的任何序列。
很容易理解，本领域技术人员可以设计编码本文公开的所有其他HCVR和LCVR的核酸序列，特别是“抗体或抗原结合片段”部分中公开的人源化抗体或其结合片段。
进一步理解到，本领域技术人员熟悉旨在修饰核酸序列以便例如通过密码子优化来提高例如重组生产率的分子生物学方法。最终，本申请涵盖了编码本文公开的任何HCVR和/或LCVR的任何核酸。
本发明提供了对人CD45RC特异的嵌合受体，其中所述CAR包含：
(a)至少一个胞外结合结构域，其中所述结合结构域与所述人CD45RC结合，
(b)任选地，至少一个胞外铰链结构域，
(c)至少一个跨膜结构域，和
(d)至少一个胞内信号转导结构域，其中胞内结构域包含至少一个T细胞初级信号转导结构域和任选地至少一个T细胞共刺激信号转导结构域。
如本文所用，术语“嵌合受体”(CR)或“嵌合抗原受体”(CAR)是指一种多肽或一组多肽，在最简单的实施方案中通常为两种多肽，当在免疫细胞中时，其为所述细胞提供对靶配体的特异性和细胞内信号产生。在一些实施方案中，该组多肽彼此邻接。在一些实施方案中，嵌合受体是包含该组多肽的嵌合融合蛋白。在一些实施方案中，该组多肽包括二聚化开关，其在二聚化分子存在时可将多肽彼此偶联，例如可将配体结合结构域偶联至胞内信号转导结构域。在一个实施方案中，嵌合受体在嵌合受体融合蛋白的氨基末端(N-ter)包含任选的前导序列。在一个实施方案中，嵌合受体还包含位于胞外配体结合结构域N末端的前导序列，其中在细胞加工和将嵌合受体定位于细胞膜期间，所述前导序列任选地被从配体结合结构域切割。
在一些实施方案中，嵌合受体包括一个或多个多肽。
在一些实施方案中，胞外结合结构域是抗原结合结构域，因此嵌合受体也可以称为嵌合抗原受体(或CAR)。
本发明的嵌合受体或嵌合抗原受体包含至少一个胞外结合结构域，其中所述结合结构域结合人CD45RC。
在一些实施方案中，本发明嵌合受体的胞外结构域包含至少一个配体结合结构域或抗原结合结构域。在一些实施方案中，抗原结合结构域是抗体或抗原结合片段。
在一些实施方案中，本发明的嵌合受体包含针对人CD45RC的抗体或其抗原结合片段，例如上文“抗体或抗原结合片段”部分所述的任何抗体或其抗体结合片段。
在一些实施方案中，本发明的CAR的胞外结合结构域包含上文“抗体或抗原结合片段”部分中描述的针对人CD45RC的抗体。
在一些实施方案中，本发明的CAR的胞外结合结构域包含上文“抗体或抗原结合片段”部分中描述的针对人CD45RC的抗原结合片段。
在一个实施方案中，胞外结合结构域包含至少一个抗原结合片段，其包含：
(a)HCVR，其包含以下三个CDR：
(i)序列SEQ ID NO:1的VH-CDR1；
(ii)VH-CDR2，其序列选自包含序列SEQ ID NO:4、5、6、8、100、116、117、118和119的组；和
(iii)序列SEQ ID NO:3的VH-CDR3；和
(b)LCVR，其包含以下三个CDR：
(i)VL-CDR1，其序列选自包含序列SEQ ID NO:15(SASSSVS-X12-YMH)和18(RASSSVS-X12-YMH)的组，其中X12不存在或者选自Asn(N)、Ser(S)和Gly(G)；
(ii)序列SEQ ID NO:16的VL-CDR2；和
(iii)序列SEQ ID NO:17的VL-CDR3。
在一个实施方案中，胞外结合结构域包含至少一个抗原结合片段，其包含：
(a)HCVR，其包含以下三个CDR：
(i)序列SEQ ID NO:1的VH-CDR1；
(ii)VH-CDR2，其序列选自包含序列SEQ ID NO:4和5的组；和
(iii)序列SEQ ID NO:3的VH-CDR3；和
(b)LCVR，其包含以下三个CDR：
(i)序列SEQ ID NO:15的VL-CDR1，其中X12不存在；
(ii)序列SEQ ID NO:16的VL-CDR2；和
(iii)序列SEQ ID NO:17的VL-CDR3。
在一个实施方案中，胞外结合结构域包含至少一个抗原结合片段，其包含：
(a)HCVR，其包含以下三个CDR：
(i)序列SEQ ID NO:1的VH-CDR1；
(ii)序列4的VH-CDR2；和
(iii)序列SEQ ID NO:3的VH-CDR3；和
(b)LCVR，其包含以下三个CDR：
(i)序列SEQ ID NO:15的VL-CDR1，其中X12不存在；
(ii)序列SEQ ID NO:16的VL-CDR2；和
(iii)序列SEQ ID NO:17的VL-CDR3。
在一个实施方案中，胞外结合结构域包含至少一个抗原结合片段，其包含：
(a)HCVR，其包含以下三个CDR：
(i)序列SEQ ID NO:1的VH-CDR1；
(ii)VH-CDR2，其序列选自包含序列SEQ ID NO:4、6和100的组；和
(iii)序列SEQ ID NO:3的VH-CDR3；和
(b)LCVR，其包含以下三个CDR：
(i)VL-CDR1，其序列选自包含序列SEQ ID NO:15和18的组，其中X12不存在；
(ii)序列SEQ ID NO:16的VL-CDR2；和
(iii)序列SEQ ID NO:17的VL-CDR3。
在一个实施方案中，胞外结合结构域包含至少一个抗原结合片段，其包含：
1)序列SEQ ID NO:61的HCVR和序列SEQ ID NO:81的LCVR；
2)序列SEQ ID NO:62的HCVR和序列SEQ ID NO:82的LCVR；
3)序列SEQ ID NO:62的HCVR和序列SEQ ID NO:83的LCVR；
4)序列SEQ ID NO:62的HCVR和序列SEQ ID NO:84的LCVR；
5)序列SEQ ID NO:63的HCVR和序列SEQ ID NO:82的LCVR；
6)序列SEQ ID NO:63的HCVR和序列SEQ ID NO:83的LCVR；
7)序列SEQ ID NO:63的HCVR和序列SEQ ID NO:84的LCVR；
8)序列SEQ ID NO:64的HCVR和序列SEQ ID NO:82的LCVR；
9)序列SEQ ID NO:64的HCVR和序列SEQ ID NO:83的LCVR；
10)序列SEQ ID NO:64的HCVR和序列SEQ ID NO:84的LCVR；
11)序列SEQ ID NO:101的HCVR和序列SEQ ID NO:85的LCVR；
12)序列SEQ ID NO:101的HCVR和序列SEQ ID NO:103的LCVR；
13)序列SEQ ID NO:65的HCVR和序列SEQ ID NO:85的LCVR；
14)序列SEQ ID NO:65的HCVR和序列SEQ ID NO:103的LCVR；
15)序列SEQ ID NO:62的HCVR和序列SEQ ID NO:85的LCVR；
16)序列SEQ ID NO:101的HCVR和序列SEQ ID NO:82的LCVR；
17)序列SEQ ID NO:121的HCVR和序列SEQ ID NO:85的LCVR；
18)序列SEQ ID NO:122的HCVR和序列SEQ ID NO:85的LCVR；
19)序列SEQ ID NO:123的HCVR和序列SEQ ID NO:85的LCVR；
20)序列SEQ ID NO:124的HCVR和序列SEQ ID NO:85的LCVR；
21)序列SEQ ID NO:63的HCVR和序列SEQ ID NO:85的LCVR；
22)序列SEQ ID NO:67的HCVR和序列SEQ ID NO:85的LCVR；
23)序列SEQ ID NO:67的HCVR和序列SEQ ID NO:103的LCVR；或
24)HCVR和LCVR，其包含与根据1)至23)的HCVR和LCVR的非CDR区的序列具有至少70％同一性的非CDR区的序列。
在一个实施方案中，胞外结合结构域包含至少一个抗原结合片段，其包含：
(a)HCVR，其包含以下三个CDR：
(i)序列SEQ ID NO:1的VH-CDR1；
(ii)VH-CDR2，其序列选自包含序列SEQ ID NO:4、5、6、8、100、116、117、118和119的组；和
(iii)序列SEQ ID NO:3的VH-CDR3；和
(b)LCVR，其包含以下三个CDR：
(i)VL-CDR1，其序列选自包含序列SEQ ID NO:15和18的组，其中SEQ ID NO:15和18中的X12选自Asn(N)、Ser(S)和Gly(G)；
(ii)序列SEQ ID NO:16的VL-CDR2；和
(iii)序列SEQ ID NO:17的VH-CDR3；
优选地，其中在LCVR的Kabat第L71位的氨基酸残基是Phe(F)。
包含在本发明CAR中的抗体或其抗原结合片段可以以多种形式存在，其中配体结合结构域被表达为连续多肽链的一部分，包括例如单结构域抗体片段(sdAb)、单链抗体(scFv)、人源化抗体或双特异性抗体(Harlow等,1999,In:Using Antibodies:ALaboratory Manual,Cold Spring Harbor Laboratory Press,NY；Harlow等,1989,In:Antibodies:A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor,New York；Houston等,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85:5879-5883(1988)；Bird等,Science 242:423-426(1988))。在一些方面，本发明嵌合受体的抗原结合结构域包含抗体片段或抗原结合片段。在一些方面，嵌合受体包含抗原结合片段，其包含scFv。
在一些实施方案中，所述抗体或抗原结合片段是选自以下的抗体分子：人源化抗体、单链抗体、二聚体单链抗体、Fv、scFv、Fab、F(ab)'2、脱岩藻糖基化抗体、双特异性抗体、二抗体、三抗体和四抗体。
“单链抗体”是指一级结构包含一个连续氨基酸残基的不间断序列或由其组成的蛋白的任意抗体或其片段，包括但不限于(1)单链Fv分子(scFv)；(2)仅含有一个轻链可变结构域的单链多肽，或其含有轻链可变结构域的三个CDR的片段，而不含有相关的重链部分和(3)仅含有一个重链可变区的单链多肽，或其含有重链可变区的三个CDR的片段，而不含有相关的轻链部分。
“单链Fv”，也缩写为“sFv”或“scFv”，是指包含连接成单个氨基酸链的VH和VL抗体结构域的抗体片段。优选地，scFv氨基酸序列进一步包含VH和VL结构域之间的肽接头，其使得scFv能够形成用于抗原结合所需的结构(Plückthun,1994.Antibodies fromEscherichia coli.In Rosenberg&Moore(Eds.),The pharmacology of monoclonalantibodies.Handbook of Experimental Pharmacology,113:269-315.Springer:Berlin,Heidelberg)。
“Fv”是指含有完整抗原识别和结合位点的最小抗体片段。这个片段由紧密的非共价结合的一个HCVR和一个LCVR的二聚体组成。从这两个结构域的折叠发出六个高变环(来自重链和轻链各三个环)，其有助于抗原结合并赋予抗体抗原结合特异性。然而，即使是单个可变结构域(或仅包含对抗原特异的三个CDR的Fv的一半)也具有识别和结合抗原的能力，尽管亲和力低于整个结合位点。
“双抗体(diabody)”是指通过以下而制备的小抗体片段，即在HCVR和LCVR之间用短接头(约5-10个残基)构建scFv片段，从而实现可变结构域的链间配对而不是链内配对，产生二价片段，即具有两个抗原结合位点的片段。双特异性双抗体是两个“交叉”scFv片段的异二聚体，其中两个抗体的HCVR和LCVR存在于不同的多肽链上。双抗体更充分地描述于专利EP0404097、专利申请WO1993011161；和Holliger等,1993.Proc Natl Acad SciUSA.90(14):6444-8。
在一些实施方案中，所述抗体是选自单特异性体(unibody)、单结构域抗体和纳米抗体(nanobody)的抗体片段。
“单特异性体(unibody)”是本领域公知的，且是指缺少IgG4抗体的铰链区的抗体片段。铰链区的缺失产生基本上是传统IgG4抗体大小的一半，并具有IgG4抗体的单价结合区而不是二价结合区的分子。
“结构域抗体”是本领域公知的，且是指抗体的最小功能结合单位，对应于抗体的重链或轻链的可变区。
“单结构域抗体(single-domain antibody)”在本领域中是公知的，且是指包含天然存在的重链抗体的独特结构和功能特性的抗体衍生的蛋白(Muyldermans,2013.AnnuRev Biochem.82:775-97)。这些重链抗体可包含单个可变结构域(VHH)–一个这样的示例是
Figure BDA0003952383070001341
或单个可变结构域(VHH)和两个恒定结构域(CH2和CH3)–例如骆驼抗体(camelid antibody)–，或单个可变结构域(VHH)和五个恒定结构域(CH1、CH2、CH3、CH4和CH5)–例如鲨鱼抗体(shark antibody)。
在一些实施方案中，所述抗体是选自以下的模拟物：affibody、affilin、affitin、adnectin、atrimer、evasin、DARPin、anticalin、avimer、fynomer、versabody和duocalin。
“affibody”是本领域公知的，且是指基于来源于葡萄球菌蛋白A的IgG结合结构域之一的58个氨基酸残基的蛋白结构域的亲和蛋白(Frejd&Kim,2017.Exp Mol Med.49(3):e306；Patent US5,831,012)。
“DARPin”(Designed Ankyrin Repeat Protein，经设计的锚蛋白重复蛋白)是本领域公知的，且是指为利用非抗体蛋白的结合能力而开发的抗体模拟物DRP(designedrepeat protein，经设计的重复蛋白)技术(Binz等,2003.J Mol Biol.332(2):489-503；Plüchthun,2015.Annu Rev Pharmacol Toxicol.55:489-511)。
“Anticalin”是本领域公知的，且是指另一种抗体模拟物技术，其中结合特异性来源于脂质运载蛋白(lipocalin)(Skerra,2008.FEBS J.275(11):2677-83)。Anticalin也可被设计为双靶向蛋白的形式，称为“Duocalin”(Schlehuber&Skerra,2001.Biol Chem.382(9):1335-42)。
“avimer”是本领域公知的，且是指另一种抗体模拟物技术(Silverman等,2005.Nat Biotechnol.23(12):1556-61)。
“versabody”是本领域公知的，且是指另一种抗体模拟物技术(专利申请US20070191272)。它们是具有＞15％的半胱氨酸的3-5kDa的小蛋白，其形成高二硫键密度的骨架，取代了典型蛋白具有的疏水核心。用少量的二硫化物替换大量的疏水氨基酸(包括疏水核心)，会导致蛋白更小、更亲水(较少的聚集和非特异性结合)、对蛋白酶和热的抗性更强并且具有较低密度的T细胞表位，因为最有助于MHC呈递的残基是疏水的。众所周知，所有这四个特性都会影响免疫原性，并且预计它们一起会导致免疫原性大大降低。
在一个实施方案中，所述抗体或其结合片段还涵盖多特异性抗体或其结合片段，即对多于一种(例如至少两种)不同抗原具有免疫特异性，所述抗原的其中一种是本发明的hCD45RC。
在一个实施方案中，所述抗体或其结合片段还涵盖抗体或其结合片段的聚合物，即多于一种(例如至少两种)相同或不同的抗体或其结合片段直接或间接地共价连接在一起。
抗体的片段和衍生物(其涵盖在本申请中使用的术语“抗体”中，除非另有说明或上下文明确矛盾)可以通过本领域已知的技术生产。“片段”包括完整抗体的一部分，通常是抗原结合位点或可变区。抗体片段的实例包括Fab、Fab’、Fab’-SH、F(ab’)2和Fv片段；二抗体；任何抗体片段，其是一级结构由一个连续氨基酸残基的不间断序列组成的多肽(本文中称为“单链抗体片段”或“单链多肽”)，包括但不限于(1)单链Fv分子，(2)仅含有一个轻链可变结构域的单链多肽，或其含有轻链可变结构域的三个CDR的片段，而不含有相关的重链部分和(3)仅含有一个重链可变区的单链多肽，或其含有重链可变区的三个CDR的片段，而不含有相关的轻链部分；以及由抗体片段形成的多特异性抗体。本发明抗体的片段可以使用标准方法获得。给定CDR的精确氨基酸序列边界可以使用许多已知方案中的任何一种来确定，包括Kabat等(1991),“Sequences of Proteins of Immunological Interest,”5thEd.Public Health Service,National Institutes of Health,Bethesda,MD(“Kabat”编号方案),Al-Lazikani等,JMB 273:927-948(1997)(“Chothia”编号方案)，或其组合。
在一些实施方案中，本发明的CAR的抗原结合结构域包括抗体片段，例如scFv，或由其组成。在特定实施方案中，抗原结合结构域是scFv。
在一些实施方案中，本发明的CAR包含针对第一抗原hCD45RC的胞外结合结构域和针对另一抗原的至少一个其他胞外结合结构域。这种CAR能够结合至少2种不同的抗原。
在一个实施方案中，所述至少一个其他胞外结合结构域是针对特定抗原的抗体或其抗原结合片段。
在一个实施方案中，所述至少一个其他胞外结合结构域包括抗体片段，例如scFv，或由其组成。
在一个实施方案中，scFv包含连接VH链和VL链的接头。
在一个实施方案中，接头是短寡肽或多肽，优选具有2至10个氨基酸的长度。
例如，甘氨酸-丝氨酸双联体提供了特别合适的接头(GS接头)。Gly/Ser接头的实例包括但不限于GS接头、G2S接头、G3S接头和G4S接头。
G2S接头的非限制性实例是GGS。
G3S接头包含氨基酸序列(Gly-Gly-Gly-Ser)n，其也称为(GGGS)n或(SEQ ID NO:130)n，其中n是等于或大于1的正整数(例如n＝l,n＝2,n＝3，n＝4,n＝5,n＝6,n＝7,n＝8,n＝9或n＝10)。G3S接头的实例包括但不限于GGGSGGGSGGGSGGGS(SEQ ID NO:131)。
G4S接头的实例包括但不限于(Gly4 Ser)，其对应于GGGGS(SEQ ID NO:132)；(Gly4Ser)2，其对应于GGGGSGGGGS(SEQ ID NO:133)；(Gly4Ser)3，其对应于GGGGSGGGGSGGGGS(SEQID NO:134)；和(Gly4Ser)4，其对应于GGGGSGGGGSGGGGSGGGGS(SEQ ID NO:135)。
在一个实施方案中，接头是(G4S)3接头(SEQ ID NO:134)，其可以由序列SEQ IDNO:136编码。
Figure BDA0003952383070001361
Figure BDA0003952383070001371
在一个实施方案中，接头是(G4S)3接头(SEQ ID NO:134)，其可以由序列SEQ IDNO:137编码。
Figure BDA0003952383070001372
在一个实施方案中，scFv包含编码氨基酸序列SEQ ID NO:173的核酸序列SEQ IDNO:138，或由其组成。
Figure BDA0003952383070001373
Figure BDA0003952383070001381
在一些实施方案中，包含在本发明CAR中的抗体是多特异性抗体分子，例如，它包含多个免疫球蛋白可变结构域序列，其中所述多个免疫球蛋白可变结构域序列中的第一免疫球蛋白可变结构域序列对第一表位具有结合特异性，并且所述多个免疫球蛋白可变结构域序列中的第二免疫球蛋白可变结构域序列具有对第二表位的结合特异性。在一些实施方案中，多特异性抗体分子是双特异性抗体。双特异性抗体对两种抗原具有特异性，其特征在于对第一表位具有结合特异性的第一免疫球蛋白可变结构域序列和对第二表位具有结合特异性的第二免疫球蛋白可变结构域序列。
在一些实施方案中，胞外结构域包含如本文“抗体或抗原结合片段”部分所述的抗原结合结构域(例如抗原结合片段)。
在一些实施方案中，胞外结合结构域通过铰链结构域连接到跨膜结构域。
在一个实施方案中，铰链结构域是短的寡肽接头或多肽接头，优选具有2至10个氨基酸的长度，如上所述。
在一些实施方案中，铰链结构域是如上所述的Gly/Ser接头。
在WO2012/138475中描述了可用于本发明的铰链结构域的另一个实例，其通过引用并入本文。
在一个实施方案中，铰链结构域包含选自包含以下的氨基酸序列：氨基酸序列AGSSSSGGSTTGGSTT(SEQ ID NO:139)、氨基酸序列GTTAASGSSGGSSSGA (SEQ ID NO:140)、氨基酸序列SSATATAGTGSSTGST(SEQ ID NO:141)和氨基酸序列TSGSTGTAASSTSTST(SEQ IDNO:142)。
在一个实施方案中，铰链结构域由GGTGGCGGAGGTTCTGGAGGTGGAGGTTCC(SEQ IDNO:143)的核苷酸序列编码。
在另一个实施方案中，铰链结构域是KIR2DS2铰链，对应于KIRRDSS(SEQ ID NO:144)。
在一个实施方案中，铰链结构域包含CD8铰链的氨基酸序列(SEQ ID NO:145)或与SEQ ID NO:145具有至少70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列，或由其组成。在一个实施方案中，铰链结构域是由核酸序列(SEQ ID NO:146)或与SEQ ID NO:146具有至少70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的核酸序列编码的CD8铰链。
Figure BDA0003952383070001391
在另一个实施方案中，铰链结构域包含IgG4铰链的氨基酸序列(SEQ ID NO:147)，或与SEQ ID NO:147具有至少70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列，或由其组成。
Figure BDA0003952383070001392
在一个实施方案中，铰链结构域是由核酸序列(SEQ ID NO:148)或与SEQ ID NO:148具有至少70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的核酸序列编码的IgG4铰链。
Figure BDA0003952383070001393
Figure BDA0003952383070001401
在另一个实施方案中，铰链结构域包含IgD铰链的氨基酸序列(SEQ ID NO:149)或与SEQ ID NO:149具有至少70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列，或由其组成。
Figure BDA0003952383070001402
在一个实施方案中，铰链结构域是由核酸序列SEQ ID NO:150或与SEQ ID NO:150具有至少70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的核酸序列编码的IgD铰链。
Figure BDA0003952383070001411
在另一个实施方案中，铰链结构域包含CD28铰链的氨基酸序列(SEQ ID NO:151)或与SEQ ID NO:151具有至少70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列，或由其组成。
Figure BDA0003952383070001412
在一个实施方案中，铰链结构域是由核酸SEQ ID NO:152或与SEQ ID NO:152具有至少70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的核酸序列编码的CD28铰链。
Figure BDA0003952383070001421
可用于本发明嵌合受体的跨膜结构域的实例包括但不限于以下的跨膜结构域：T细胞受体的α、β、ζ链，或者CD28，CD3γ，CD3δ，CD3ε，CD3ζ，CD45，CD4，CD5，CD8，CD9，CD16，CD22，CD33，CD37，CD64，CD80，CD86，CD134，CD137，CD154，KIRDS2，OX40，CD2，CD27，LFA-1(CD1 la、CD18)，ICOS(CD278)，4-1BB(CD137)，GITR，CD40，BAFFR，HVEM(LIGHTR)，SLAMF7，NKp80(KLRFl)，CD160，CD19，IL2Rβ，IL2R γ，IL7R a，ITGA1，VLA1，CD49a，ITGA4，IA4，CD49D，ITGA6，VLA-6，CD49f，ITGAD，CD11d，ITGAE，CD103，ITGAL，CD11a，LFA-1，ITGAM，CD11b，PD1，ITGAX，CDl1c，ITGB1，CD29，ITGB2，CD18，LFA-1，ITGB7，TNFR2，DNAM1(CD226)，SLAMF4(CD244，2B4)，CD84，CD96(Tactile)，CEACAM1，CRT AM，Ly9(CD229)，CD160(BY55)，PSGL1，CDIOO(SEMA4D)，SLAMF6(NTB-A、Lyl08)，SLAM(SLAMF1、CD150、IPO-3)，BLAME(SLAMF8)，SELPLG(CD162)，LTBR，PAG/Cbp，NKp44，NKp30，NKp46，NKG2D，和/或NKG2C。
在一些实施方案中，跨膜结构域可以包括其所衍生自的分子的整个跨膜结构，或者可以包括其功能性片段或变体。
在一个实施方案中，跨膜结构域包含CD8跨膜结构域的氨基酸序列(SEQ ID NO:153)，或与SEQ ID NO:153具有至少70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列，或由其组成。在另一个实施方案中，跨膜结构域包含具有SEQ ID NO:153的氨基酸序列的至少一个、两个或三个修饰但不超过20个、10个或5个修饰的氨基酸序列，或与SEQ ID NO:153具有至少70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列，或由其组成。
Figure BDA0003952383070001431
在另一个实施方案中，跨膜结构域由CD8跨膜结构域的核苷酸序列(SEQ ID NO:154)或与SEQ ID NO:154具有至少70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的核苷酸序列编码。
Figure BDA0003952383070001432
在另一个实施方案中，跨膜结构域包含CD28跨膜结构域的氨基酸序列(SEQ IDNO:155)或与SEQ ID NO:155具有至少70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列，或由其组成。
Figure BDA0003952383070001433
在一个实施方案中，跨膜结构域是由核酸序列SEQ ID NO:156或与SEQ ID NO:156具有至少70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的核酸序列编码的CD28跨膜结构域。
Figure BDA0003952383070001434
在一些实施方案中，跨膜结构域可以是重组的。在某些实施方案中，重组跨膜结构域主要包含疏水性氨基酸，例如缬氨酸或亮氨酸。
如本文所用，术语“胞内信号转导结构域”是指分子的细胞内部分。胞内信号转导结构域产生促进含嵌合受体细胞的免疫效应功能的信号。嵌合受体T细胞中免疫效应功能的实例可包括细胞溶解活性、抑制活性、调节活性和辅助活性，包括细胞因子的分泌。
在一些实施方案中，本发明的CAR的胞内结构域包含至少一个T细胞初级信号转导结构域(或由其衍生的序列)和任选的一个或多个T细胞共刺激分子的胞内结构域(或由其衍生的序列)。
如本文所用，术语“共刺激分子”或“共刺激胞内信号转导结构域”是指T细胞上的同源结合配偶体，其与共刺激配体特异性结合，从而介导T细胞的共刺激反应，例如但不限于增殖。共刺激分子是除抗原受体或其配体以外的促进有效的免疫反应的细胞表面分子。共刺激信号转导结构域可以是共刺激分子的细胞内部分。共刺激分子可以在以下蛋白家族中呈现：TNF受体蛋白、免疫球蛋白样蛋白、细胞因子受体、整合素、信号转导淋巴细胞激活分子(SLAM蛋白)和激活性NK细胞受体。
在一些实施方案中，胞内结构域可包含其衍生自的分子的整个胞内部分或整个天然胞内信号转导结构域，或其功能性片段或变体。
在一些实施方案中，胞内信号转导结构域由至少一个初级信号转导结构域(例如，T细胞初级信号转导结构域)或其片段或变体组成。
在一些实施方案中，胞内信号转导结构域由至少一个共刺激信号转导结构域(例如，T细胞共刺激分子胞内结构域)或其片段或变体组成。
在一些实施方案中，胞内信号转导结构域包含T细胞共刺激分子的一个或多个胞内结构域或其片段或变体。在一些实施方案中，胞内信号转导结构域由T细胞共刺激分子的一个或多个胞内结构域或其片段或变体组成。
在一个实施方案中，本发明的CAR的胞内信号转导结构域包含至少一个共刺激结构域或其片段或变体以及至少一个初级信号转导结构域或片段或变体。
在一个实施方案中，本发明CAR的胞内信号转导结构域由一个共刺激结构域或其片段或变体和一个初级信号转导结构域或片段或变体组成。
在一个实施方案中，本发明的CAR的胞内信号转导结构域包含至少一个共刺激结构域或其片段或变体以及一个初级信号转导结构域或片段或变体，并且还包含允许表达重组蛋白的表达系统。在一个实施方案中，重组蛋白是促炎细胞因子，例如IL-12。在一个实施方案中，所述促炎细胞因子由CAR-工程化细胞释放。
如本文所用，“表达系统”是指包含编码感兴趣的重组肽、多肽或蛋白的核酸序列的片段的线性或环状DNA分子，所述片段有效地连接到用于系统转录的额外片段。
在一些实施方案中，表达系统包含编码促炎细胞因子的核酸序列。在一个实施方案中，表达系统包含编码IL-12的核酸序列。
额外片段可包括启动子和终止密码子序列。表达系统可以进一步包含一个或多个复制起点、一个或多个选择标记和编码核糖体结合位点的序列。
“有效地连接”表示片段被安排为按其预期的方式发挥作用，例如，一旦转录开始于启动子，它就会通过编码片段至终止密码子。
本发明意义上的“启动子”是允许RNA聚合酶结合和启动转录的表达控制元件。
在本发明的一个实施方案中，核酸序列处于“强”启动子的控制下。强启动子的特征一方面在于启动子序列对RNA聚合酶(通常是天然存在的相应RNA聚合合酶)的高结合亲和力，另一方面在于该RNA聚合物形成mRNA的高速率。
在另一个实施方案中，核酸序列在“诱导型启动子”的控制下。“诱导型启动子”是一种可由外部因素调节的启动子，所述外部因素是例如诱导物(也称为“诱导剂”)分子的存在或阻遏分子的缺失，或物理因素，如温度、渗透压或pH值的升高或降低。
在本发明的一个实施方案中，启动子也可以是组成型的，即一方面控制表达而不需要诱导的启动子，或另一方面控制表达而不可能抑制的启动子。因此，在一定程度上有持续稳定的表达。
有利的是，感兴趣的重组肽、多肽或蛋白质的表达是在特定条件下，例如在选择下诱导的。
在一个实施方案中，表达系统是组成型表达系统。在另一个实施方案中，表达系统是诱导型表达系统。
在一个实施方案中，表达系统是表达盒。
在一些实施方案中，本发明的CAR的胞内信号转导结构域包含至少一个或两个共刺激结构域或其片段或变体以及至少一个初级信号转导结构域或其片段或变体。在某些实施方案中，一个或多个共刺激结构域是T细胞共刺激分子的胞内结构域。在某些实施方案中，所述至少一个初级信号转导结构域是T细胞初级信号转导结构域。
在一些实施方案中，本发明的CAR的胞内信号转导结构域包含至少一个或两个共刺激结构域或其片段或变体，和至少一个初级信号转导结构域或片段或变体，以及至少一个允许表达重组促炎细胞因子的表达系统。
因此，在一个实施方案中，CAR工程化细胞表达重组促炎细胞因子，如IL-12。
在本发明的一些实施方案中，初级信号转导结构域包含选自以下的蛋白的信号转导结构域：CD3ζ、CD3γ、CD3δ、CD3ε、共同FcRγ(FCER1G)、FcRβ(FcεRib)、CD79a、CD79b、FcγRIIa、DAP10和DAP12，以及由此衍生的序列。
在一些实施方案中，初级信号转导结构域是T细胞初级信号转导结构域，其包含CD3ζ的至少一个功能性信号转导结构域或其片段或变体，或由其组成。
在一些实施方案中，T细胞初级信号转导结构域包含SEQ ID NO:157的CD3ζ氨基酸序列或与SEQ ID NO:157具有至少约70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列，或由其组成。
Figure BDA0003952383070001461
在一些实施方案中，CD3ζ初级信号转导结构域包含与SEQ ID NO:157的氨基酸序列相比具有至少一个、两个或三个修饰但不超过20个、10个或5个修饰的氨基酸序列，或与SEQ ID NO:157具有至少约70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、96％、97％、98％或99％的同一性的氨基酸序列，或由其组成。
因此，在一些实施方案中，编码T细胞初级信号转导结构域的核酸序列包含SEQ IDNO:162的CD3ζ结构域核酸序列或与SEQ ID NO:162具有至少约70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的核苷酸序列，或由其组成。
在一些实施方案中，CD3ζ初级信号转导结构域包含来自SEQ ID NO:157序列或来自与SEQ ID NO:157具有至少约70％同一性的序列的至少2、10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、110或112个氨基酸，例如，来自SEQ ID NO:157的至少2、10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、110或112个连续氨基酸。
在一些实施方案中，CD3ζ初级信号转导结构域由来自SEQ ID NO:162序列或来自与SEQ ID NO:162具有至少约70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的序列的至少6、30、60、90、120、150、180、210、240、270、300、330或336个核苷酸的核苷酸序列编码，例如，来自SEQ ID NO:162的至少6、30、60、90、120、150、180、210、240、270、300、330或336个连续核苷酸的核苷酸序列编码。
Figure BDA0003952383070001471
在一些实施方案中，以刺激方式起作用的T细胞初级信号转导结构域可以包括被称为基于免疫受体酪氨酸的激活基序(immunoreceptor tyrosine-based activationmotifs，ITAMS)的信号转导基序。在本发明中特别有用的含ITAM的T细胞初级胞内信号转导结构域的实例包括但不限于以下(或来源于以下)的那些：CD3ζ、共同FcRγ(FCER1G)、FcγRIIa、FcRβ(FcεR1b)、CD3γ、CD3δ、CD3ε、CD5、CD22、CD66b、CD79a、CD79b、DAP10和DAP12。
在一些实施方案中，T细胞初级信号转导结构域包含修饰的ITAM结构域，例如，与天然的ITAM结构域相比，具有改变(例如，增加或减少)的活性的突变的ITAM结构域。在一些实施方案中，初级信号转导结构域包含含有修饰的ITAM的初级胞内信号转导结构域，例如优化的和/或截短的含ITAM的初级胞外信号转导结构域。在某些实施方案中，初级信号转导结构域可以包含一个、两个、三个、四个或更多个ITAM基序。
在一些实施方案中，本发明CAR的胞内信号转导结构域包含与一个或多个共刺激信号转导结构域组合的T细胞初级信号转导结构域(例如，CD3ζ信号转导结构域或其片段或变体)，其中所述共刺激信号转导结构域是完整的共刺激胞内信号转导结构域或其片段或变体。
在一些实施方案中，共刺激信号转导结构域是T细胞共刺激分子的胞内或胞质结构域。
在一些实施方案中，共刺激信号转导结构域是T细胞共刺激分子的信号转导结构域。
共刺激信号转导结构域的实例包括但不限于选自以下的蛋白的胞内或胞质信号转导结构域：4-1BB(CD137)、ICOS(CD278)、CD27、CD28、CTLA-4(CD152)、PD-1、MHC I类分子、BTLA、Toll配体受体、OX40、CD30、CD40、淋巴细胞功能相关抗原-1(LFA-1)、CD2、CD7、LIGHT、NKG2C、B7-H3、特异性结合CD83的配体、CDS、ICAM-1、GITR、ARHR、BAFFR、HVEM(LIGHTR)、SLAMF7、NKp80(KLRF1)、NKp44、NKp30、NKp46、CD160(BY55)、CD19、CD19a、CD4、CD8α、CD8β、IL2ra、IL6Ra、IL2Rβ、IL2Rγ、IL7Rα、IL-13RA1/RA2、IL-33R(IL1RL1)、IL-10RA/RB、IL-4R、IL-5R(CSF2RB)、IL-21R、ITGA4、VLA1、CD49a、ITGA4、IA4、CD49D、ITGA6、VLA-6、CD49f、ITGAD、CD11d、ITGAE、CD103、ITGAL、CD11a/CD18、ITGAM、CD11b、ITGAX、CD11c、ITGB1、CD29、ITGB2、CD18、ITGB7、NKG2D、NKG2C、CD95、TGFbR1/2/3、TRANCE/RANKL、DNAM1(CD226)、SLAMF4(CD244、2B4)、CD84、CD96(Tactile)、CEACAM1、CRTAM、Ly9(CD229)、PSGL1、CD100(SEMA4D)、CD69、SLAMF6(NTB-A、Lyl08)、SLAM(SLAMF1、CD150、IPO-3)、BLAME(SLAMF8)、SELPLG(CD162)、LTBR、LAT、GADS、SLP-76、PAG/Cbp、共用γ链、特异性结合CD83的配体、NKp44、NKp30、NKp46、NKG2D，及其任意组合。
在一些实施方式中，嵌合受体包含T细胞共刺激分子的至少一个胞内或胞质信号转导结构域，所述T细胞共刺激分子选自CD28、4-1BB、OX40、ICOS、CD27和DAP10。
在一些实施方案中，嵌合受体包含至少一个共刺激信号转导结构域，其中所述共刺激信号转导结构域是完整的共刺激信号转导结构域或其片段或变体。
在一些实施方案中，T细胞共刺激信号转导结构域包含4-1BB共刺激胞内信号转导结构域的氨基酸序列(例如，包含SEQ ID NO:163的氨基酸序列或由其组成)或与SEQ IDNO:163具有至少约70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列，或由其组成。在一些实施方案中，T细胞共刺激信号转导结构域包含与SEQ ID NO:163的氨基酸序列相比具有至少一个、两个或三个修饰但不超过20、10或5个修饰的氨基酸序列，或由其组成。
Figure BDA0003952383070001491
在一些实施方案中，T细胞共刺激信号转导结构域由4-1BB共刺激胞内信号转导结构域核苷酸序列(例如，包含SEQ ID NO:164的序列或由其组成)或与SEQ ID NO:164具有至少约70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的核苷酸序列编码。
Figure BDA0003952383070001492
在一些实施方案中，4-1BB共刺激胞内信号转导结构域包含来自SEQ ID NO:163序列或来自与SEQ ID NO:163具有至少约70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的序列的至少2、3、6、9、12、15、18、21、24、27、30、33、36、39或42个氨基酸，例如来自SEQ ID NO:163的至少2、3、6、9、12、15、18、21、24、27、30、33、36、39或42个连续氨基酸。
在一些实施方案中，4-1BB共刺激胞内信号转导结构域由来自SEQ ID NO:164序列或来自与SEQ ID NO:164具有至少约70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的序列的至少6、18、27、36、45、54、63、72、81、96、99、108、117或126个核苷酸的核苷酸序列编码，例如由来自SEQ ID NO:164的至少6、18、27、36、45、54、63、72、81、96、99、108、117或126个连续核苷酸的核苷酸序列编码。
在一些实施方案中，T细胞共刺激信号转导结构域包含CD28共刺激胞内信号转导结构域的氨基酸序列(例如包含SEQ ID NO:167的氨基酸序列或由其组成)或与SEQ ID NO:167具有至少约70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列，或由其组成。在一些实施方案中，T细胞共刺激信号转导结构域包含与SEQ ID NO:167的氨基酸序列相比具有至少一个、两个或三个修饰但不超过20、10或5个修饰的氨基酸序列，或由其组成。
Figure BDA0003952383070001501
在一些实施方案中，T细胞共刺激信号转导结构域由CD28共刺激胞内信号转导结构域核苷酸序列(例如包含SEQ ID NO:168的序列或由其组成)或与SEQ ID NO:168具有至少约70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的核苷酸序列编码。
Figure BDA0003952383070001502
在一些实施方案中，CD28共刺激胞内信号转导结构域包含来自SEQ ID NO:167序列或来自与SEQ ID NO:167具有至少约70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的序列的至少2、3、6、9、12、15、18、21、24、27、30、33、36、39或41个氨基酸，例如来自SEQ ID NO:167的至少2、3、6、9、12、15、18、21、24、27、30、33、36、39或41个连续氨基酸。
在一些实施方案中，CD28共刺激胞内信号转导结构域由来自SEQ ID NO:168序列或来自与SEQ ID NO:168具有至少约70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的序列的至少6、18、27、36、45、54、63、72、81、96、99、108、117或123个核苷酸的核苷酸序列编码，例如由来自SEQ ID NO:168的至少6、18、27、36、45、54、63、72、81、96、99、108、117或123个连续核苷酸的核苷酸序列编码。
在本发明的一些实施方案中，嵌合受体包含T细胞共刺激分子的至少一个胞内结构域。在某些实施方案中，所述至少一个胞内结构域可以选自4-1BB的胞内结构域和CD28的胞内结构域。在具体的实施方案中，所述共刺激胞内信号转导结构域是完整的共刺激胞内信号转导结构域或其片段或变体。
在本发明的一些实施方案中，嵌合受体包含T细胞共刺激分子的至少两个胞内结构域的组合。在具体的实施方案中，所述共刺激胞内信号转导结构域是完整的共刺激胞内信号转导结构域或其片段或变体。
在一些实施方案中，嵌合受体包含4-1BB共刺激胞内信号转导结构域的氨基酸序列(例如，包含SEQ ID NO:163的氨基酸序列或由其组成)或其片段或变体和CD28共刺激胞内信号转导结构域的氨基酸序列(例如，包含SEQ ID NO:167的氨基酸序列或由其组成)或其片段或变体。
在本发明的一些实施方案中，嵌合受体可包含至少三个共刺激胞内信号转导结构域，其中所述结构域是完整的共刺激胞内信号转导结构域或其片段或变体。
在一些实施方案中，本发明CAR的胞内信号转导结构域包含：
-具有SEQ ID NO:163的氨基酸序列的4-1BB共刺激胞内信号转导结构域或其片段或变体，和/或具有SEQ ID NO:167的氨基酸序列的CD28共刺激胞内信号转导结构域；和/或
-具有SEQ ID NO:157的氨基酸序列的CD3ζ初级胞内信号转导结构域或其片段或变体；
其中包含在胞内结构域中的序列在相同的框架中作为单一多肽链表达。
因此，在一些实施方案中，编码本发明CAR的胞内信号转导结构域的核酸序列包含：
-SEQ ID NO:164的4-1BB共刺激胞内信号转导结构域核酸序列或其片段或变体，和/或SEQ ID NO:168的CD28共刺激胞内信号转导结构域核酸序列或其片段或变体；和/或
-SEQ ID NO:162的CD3ζ初级胞内信号转导结构域或者其片段或变体；
其中包含在胞内结构域中的序列在相同的框架中作为单一多肽链表达。
在一些实施方案中，本发明CAR的胞内信号转导结构域包含可以以随机或以指定顺序彼此连接的至少两个不同结构域(例如，初级信号转导结构域或其片段或变体和T细胞共刺激分子的至少一个胞内结构域或其片段或变体)。
任选地，长度例如在2和10个氨基酸(例如，2、3、4、5、6、7、8、9或10个氨基酸)之间的短寡肽接头或多肽接头可以在不同信号转导结构域之间形成连接。在一些实施方案中，甘氨酸-丝氨酸双联体(GS)用作合适的接头。在一些实施方案中，单个氨基酸，例如丙氨酸(A)、甘氨酸(G)，被用作合适的接头。本文描述了接头的其它实例。
在一些实施方案中，本发明CAR的胞内信号转导结构域包含两个或更多个(例如，2、3、4、5或更多个)共刺激胞内信号转导结构域。在一些实施方案中，所述两个或更多个(例如，2、3、4、5或更多个)共刺激信号转导结构域中的任一个或全部都被接头分子(例如，如本文所述的接头分子)分开。
在一些实施方式中，本发明嵌合受体的胞内信号转导结构域包含CD3ζ的初级胞内信号转导结构域(例如，SEQ ID NO:157)和4-1BB的共刺激胞内信号转导结构域(例如，SEQID NO:163)。
在一些实施方式中，本发明嵌合受体的胞内信号转导结构域包含CD3ζ的初级胞内信号转导结构域(例如，SEQ ID NO:157)和CD28的共刺激胞内信号转导结构域(例如，SEQID NO:167)。
在一些实施方案中，本发明的CAR包含如本文所述的胞外结合结构域、如本文所述的跨膜结构域、如本文所述的胞内信号转导结构域和任选地如本文所述的间隔区或铰链结构域的任意组合。
在一些实施方案中，本发明的CAR进一步包含标签，例如，用于质量控制、富集、体内追踪等的标签。所述标签可以位于N末端、C末端和/或内部。可用于本发明CAR的标签的实例是本领域技术人员公知的。
根据第一个实施方案，本发明的CAR包含至少一个胞外CD45RC结合结构域，任选地胞外铰链结构域，至少一个跨膜结构域，和至少一个胞内信号转导结构域。
在一个实施方案中，本发明的CAR包含CD45RC结合结构域；CD8的跨膜结构域(优选SEQ ID NO:153)；和CD3-ζ初级信号转导结构域(优选SEQ ID NO:157)。
在一个实施方案中，本发明的CAR包含CD45RC结合结构域；CD28的跨膜结构域(优选SEQ ID NO:155)；和CD3-ζ初级信号转导结构域(优选SEQ ID NO:157)。
在另一个实施方案中，本发明的CAR包含CD45RC结合结构域；CD8的铰链结构域(优选SEQ ID NO:145)；CD8的跨膜结构域(优选SEQ ID NO:153)；和CD3-ζ初级信号转导结构域(优选SEQ ID NO:157)。
在一个实施方案中，本发明的CAR包含CD45RC结合结构域；CD8的铰链结构域(优选SEQ ID NO:145)；CD28的跨膜结构域(优选SEQ ID NO:155)；和CD3-ζ初级信号转导结构域(优选SEQ ID NO:157)。
在另一个实施方案中，本发明的CAR包含CD45RC结合结构域；IgG4的铰链结构域(优选SEQ ID NO:147)；CD8的跨膜结构域(优选SEQ ID NO:153)；和CD3-ζ初级信号转导结构域(优选SEQ ID NO:157)。
在一个实施方案中，本发明的CAR包含CD45RC结合结构域；IgG4的铰链结构域(优选SEQ ID NO:147)；CD28的跨膜结构域(优选SEQ ID NO:155)；和CD3-ζ初级信号转导结构域(优选SEQ ID NO:157)。
在另一个实施方案中，本发明的CAR包含CD45RC结合结构域；IgD的铰链结构域(优选SEQ ID NO:149)；CD8的跨膜结构域(优选SEQ ID NO:153)；和CD3-ζ初级信号转导结构域(优选SEQ ID NO:157)。
在一个实施方案中，本发明的CAR包含CD45RC结合结构域；IgD的铰链结构域(优选SEQ ID NO:149)；CD28的跨膜结构域(优选SEQ ID NO:155)；和CD3-ζ初级信号转导结构域(优选SEQ ID NO:157)。
在另一个实施方案中，本发明的CAR包含CD45RC结合结构域；CD28的铰链结构域(优选SEQ ID NO:151)；CD8的跨膜结构域(优选SEQ ID NO:153)；和CD3-ζ初级信号转导结构域(优选SEQ ID NO:157)。
在一个实施方案中，本发明的CAR包含CD45RC结合结构域；CD28的铰链结构域(优选SEQ ID NO:151)；CD28的跨膜结构域(优选SEQ ID NO:155)；和CD3-ζ初级信号转导结构域(优选SEQ ID NO:157)。
根据第二个实施方案，本发明的CAR包含CD45RC结合结构域，任选地胞外铰链结构域，跨膜结构域，T细胞共刺激分子的单个胞内结构域和T细胞初级信号转导结构域。
在一个实施方案中，本发明的CAR包含CD45RC结合结构域；CD8的跨膜结构域(优选SEQ ID NO:153)；4-1BB的胞内结构域(优选SEQ ID NO:163)；和CD3-ζ初级信号转导结构域(优选SEQ ID NO:157)。
在一个实施方案中，本发明的CAR包含CD45RC结合结构域；CD8的跨膜结构域(优选SEQ ID NO:153)；CD28的胞内结构域(优选SEQ ID NO:167)；和CD3-ζ初级信号转导结构域(优选SEQ ID NO:157)。
在一个实施方案中，本发明的CAR包含CD45RC结合结构域；CD28的跨膜结构域(优选SEQ ID NO:155)；4-1BB的胞内结构域(优选SEQ ID NO:163)；和CD3-ζ初级信号转导结构域(优选SEQ ID NO:157)。
在一个实施方案中，本发明的CAR包含CD45RC结合结构域；CD28的跨膜结构域(优选SEQ ID NO:155)；CD28的胞内结构域(优选SEQ ID NO:167)；和CD3-ζ初级信号转导结构域(优选SEQ ID NO:157)。
在另一个实施方案中，本发明的CAR包含CD45RC结合结构域；CD8的铰链结构域(优选SEQ ID NO:145)；CD8的跨膜结构域(优选SEQ ID NO:153)；4-1BB的胞内结构域(优选SEQID NO:163)；和CD3-ζ初级信号转导结构域(优选SEQ ID NO:157)。
在一个实施方案中，本发明的CAR包含CD45RC结合结构域；CD8的铰链结构域(优选SEQ ID NO:145)；CD8的跨膜结构域(优选SEQ ID NO:153)；CD28的胞内结构域(优选SEQ IDNO:155)；和CD3-ζ初级信号转导结构域(优选SEQ ID NO:157)。
在一个实施方案中，本发明的CAR包含CD45RC结合结构域；CD8的铰链结构域(优选SEQ ID NO:145)；CD28的跨膜结构域(优选SEQ ID NO:155)；4-1BB的胞内结构域(优选SEQID NO:163)；和CD3-ζ初级信号转导结构域(优选SEQ ID NO:157)。
在一个实施方案中，本发明的CAR包含CD45RC结合结构域；CD8的铰链结构域(优选SEQ ID NO:145)；CD28的跨膜结构域(优选SEQ ID NO:155)；CD28的胞内结构域(优选SEQID NO:167)；和CD3-ζ初级信号转导结构域(优选SEQ ID NO:157)。
在另一个实施方案中，本发明的CAR包含CD45RC结合结构域；IgG4的铰链结构域(优选SEQ ID NO:147)；CD8的跨膜结构域(优选SEQ ID NO:153)；4-1BB的胞内结构域(优选SEQ ID NO:163)；和CD3-ζ初级信号转导结构域(优选SEQ ID NO:157)。
在一个实施方案中，本发明的CAR包含CD45RC结合结构域；IgG4的铰链结构域(优选SEQ ID NO:147)；CD8的跨膜结构域(优选SEQ ID NO:153)；CD28的胞内结构域(优选SEQID NO:167)；和CD3-ζ初级信号转导结构域(优选SEQ ID NO:157)。
在一个实施方案中，本发明的CAR包含CD45RC结合结构域；IgG4的铰链结构域(优选SEQ ID NO:147)；CD28的跨膜结构域(优选SEQ ID NO:155)；4-1BB的胞内结构域(优选SEQ ID NO:163)；和CD3-ζ初级信号转导结构域(优选SEQ ID NO:157)。
在一个实施方案中，本发明的CAR包含CD45RC结合结构域；IgG4的铰链结构域(优选SEQ ID NO:147)；CD28的跨膜结构域(优选SEQ ID NO:155)；CD28的胞内结构域(优选SEQID NO:167)；和CD3-ζ初级信号转导结构域(优选SEQ ID NO:157)。
在另一个实施方案中，本发明的CAR包含CD45RC结合结构域；IgD的铰链结构域(优选SEQ ID NO:149)；CD8的跨膜结构域(优选SEQ ID NO:153)；4-1BB的胞内结构域(优选SEQID NO:163)；和CD3-ζ初级信号转导结构域(优选SEQ ID NO:157)。
在一个实施方案中，本发明的CAR包含CD45RC结合结构域；IgD的铰链结构域(优选SEQ ID NO:149)；CD8的跨膜结构域(优选SEQ ID NO:153)；CD28的胞内结构域(优选SEQ IDNO:167)；和CD3-ζ初级信号转导结构域(优选SEQ ID NO:157)。
在一个实施方案中，本发明的CAR包含CD45RC结合结构域；IgD的铰链结构域(优选SEQ ID NO:149)；CD28的跨膜结构域(优选SEQ ID NO:155)；4-1BB的胞内结构域(优选SEQID NO:163)；和CD3-ζ初级信号转导结构域(优选SEQ ID NO:157)。
在一个实施方案中，本发明的CAR包含CD45RC结合结构域；IgD的铰链结构域(优选SEQ ID NO:149)；CD28的跨膜结构域(优选SEQ ID NO:155)；CD28的胞内结构域(优选SEQID NO:167)；和CD3-ζ初级信号转导结构域(优选SEQ ID NO:157)。
在另一个实施方案中，本发明的CAR包含CD45RC结合结构域；CD28的铰链结构域(优选SEQ ID NO:151)；CD8的跨膜结构域(优选SEQ ID NO:153)；4-1BB的胞内结构域(优选SEQ ID NO:163)；和CD3-ζ初级信号转导结构域(优选SEQ ID NO:157)。
在一个实施方案中，本发明的CAR包含CD45RC结合结构域；CD28的铰链结构域(优选SEQ ID NO:151)；CD8的跨膜结构域(优选SEQ ID NO:153)；CD28的胞内结构域(优选SEQID NO:167)；和CD3-ζ初级信号转导结构域(优选SEQ ID NO:157)。
在一个实施方案中，本发明的CAR包含CD45RC结合结构域；CD28的铰链结构域(优选SEQ ID NO:151)；CD28的跨膜结构域(优选SEQ ID NO:155)；4-1BB的胞内结构域(优选SEQ ID NO:163)；和CD3-ζ初级信号转导结构域(优选SEQ ID NO:157)。
在一个实施方案中，本发明的CAR包含CD45RC结合结构域；CD28的铰链结构域(优选SEQ ID NO:151)；CD28的跨膜结构域(优选SEQ ID NO:155)；CD28的胞内结构域(优选SEQID NO:167)；和CD3-ζ初级信号转导结构域(优选SEQ ID NO:157)。
根据第三个实施方案，本发明的CAR包含CD45RC结合结构域，任选地胞外铰链结构域，跨膜结构域，T细胞共刺激分子的两个胞内结构域和T细胞初级信号转导结构域。
在一个实施方案中，本发明的CAR包含CD45RC结合结构域；CD8的跨膜结构域(优选SEQ ID NO:153)；4-1BB的胞内结构域(优选SEQ ID NO:163)；CD28的胞内结构域(优选SEQID NO:167)；和CD3-ζ初级信号转导结构域(优选SEQ ID NO:157)。
在一个实施方案中，本发明的CAR包含CD45RC结合结构域；CD28的跨膜结构域(优选SEQ ID NO:155)；4-1BB的胞内结构域(优选SEQ ID NO:163)；CD28的胞内结构域(优选SEQ ID NO:167)；和CD3-ζ初级信号转导结构域(优选SEQ ID NO:157)。
在一个实施方案中，本发明的CAR包含CD45RC结合结构域；CD8的铰链结构域(优选SEQ ID NO:145)；CD8的跨膜结构域(优选SEQ ID NO:153)；4-1BB的胞内结构域(优选SEQID NO:163)；CD28的胞内结构域(优选SEQ ID NO:167)；和CD3-ζ初级信号转导结构域(优选SEQ ID NO:157)。
在一个实施方案中，本发明的CAR包含CD45RC结合结构域；CD8的铰链结构域(优选SEQ ID NO:145)；CD28的跨膜结构域(优选SEQ ID NO:155)；4-1BB的胞内结构域(优选SEQID NO:163)；CD28的胞内结构域(优选SEQ ID NO:167)；和CD3-ζ初级信号转导结构域(优选SEQ ID NO:157)。
在一个实施方案中，本发明的CAR包含CD45RC结合结构域；IgG4的铰链结构域(优选SEQ ID NO:147)；CD8的跨膜结构域(优选SEQ ID NO:153)；4-1BB的胞内结构域(优选SEQID NO:163)；CD28的胞内结构域(优选SEQ ID NO:167)；和CD3-ζ初级信号转导结构域(优选SEQ ID NO:157)。
在一个实施方案中，本发明的CAR包含CD45RC结合结构域；IgG4的铰链结构域(优选SEQ ID NO:147)；CD28的跨膜结构域(优选SEQ ID NO:155)；4-1BB的胞内结构域(优选SEQ ID NO:163)；CD28的胞内结构域(优选SEQ ID NO:167)；和CD3-ζ初级信号转导结构域(优选SEQ ID NO:157)。
在一个实施方案中，本发明的CAR包含CD45RC结合结构域；IgD的铰链结构域(优选SEQ ID NO:149)；CD8的跨膜结构域(优选SEQ ID NO:153)；4-1BB的胞内结构域(优选SEQID NO:163)；CD28的胞内结构域(优选SEQ ID NO:167)；和CD3-ζ初级信号转导结构域(优选SEQ ID NO:157)。
在一个实施方案中，本发明的CAR包含CD45RC结合结构域；IgD的铰链结构域(优选SEQ ID NO:149)；CD28的跨膜结构域(优选SEQ ID NO:155)；4-1BB的胞内结构域(优选SEQID NO:163)；CD28的胞内结构域(优选SEQ ID NO:167)；和CD3-ζ初级信号转导结构域(优选SEQ ID NO:157)。
在一个实施方案中，本发明的CAR包含CD45RC结合结构域；CD28的铰链结构域(优选SEQ ID NO:151)；CD8的跨膜结构域(优选SEQ ID NO:153)；4-1BB的胞内结构域(优选SEQID NO:163)；CD28的胞内结构域(优选SEQ ID NO:167)；和CD3-ζ初级信号转导结构域(优选SEQ ID NO:157)。
在一个实施方案中，本发明的CAR包含CD45RC结合结构域；CD28的铰链结构域(优选SEQ ID NO:151)；CD28的跨膜结构域(优选SEQ ID NO:155)；4-1BB的胞内结构域(优选SEQ ID NO:163)；CD28的胞内结构域(优选SEQ ID NO:167)；和CD3-ζ初级信号转导结构域(优选SEQ ID NO:157)。
在一个实施方案中，本发明的CAR包含(i)CD45RC结合结构域，(ii)人CD8的铰链区，(iii)人CD8的跨膜结构域，(iv)人CD28的胞内结构域和(v)人CD3ζ链的胞内结构域。
在一个实施方案中，包含人CD8的铰链区、人CD8都跨膜结构域、人CD28到胞内结构域和人CD3ζ链的胞内结构域的CAR部分对应于SEQ ID NO:169的氨基酸序列或与SEQ IDNO:169有至少约95％，优选约96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列。
在一个实施方案中，本发明的CAR包含CD45RC结合结构域，其与SEQ ID NO:169的氨基酸序列或与SEQ ID NO:169具有至少约95％，优选约96％、97％、98％或99％同一性的序列或氨基酸序列连接。
Figure BDA0003952383070001591
在一个实施方案中，包含人CD8的铰链区、人CD8的跨膜结构域、人CD28的胞内结构域和人CD3ζ链的胞内结构域的CAR部分对应于SEQ ID NO:170的核苷酸序列或与SEQ IDNO:170具有至少约95％，优选约96％、97％、98％或99％同一性的核苷酸序列。
在另一个实施方案中，本发明的CAR包含(i)CD45RC结合结构域，(ii)人CD8的铰链区，(iii)人CD8的跨膜结构域，(iv)人CD28的胞内结构域和(v)人CD3ζ的胞内结构域。
在一个实施方案中，包含人CD8的铰链区、人CD8的跨膜结构域、人CD28的胞内结构域和人CD3ζ的胞内结构域的CAR部分包含氨基酸序列SEQ ID NO:169或与SEQ ID NO:169具有至少约95％，优选约96％、97％、98％或99％同一性的任何氨基酸序列，或由其组成。
在一个实施方案中，包含CD45RC结合结构域、人CD8的铰链区、人CD8的跨膜结构域、人CD28的胞内结构域和人CD3ζ的胞内结构域的CAR部分包含氨基酸序列SEQ ID NO:171或与SEQ ID NO:171具有至少约95％，优选约96％、97％、98％或99％同一性的任何氨基酸序列，或由其组成。
Figure BDA0003952383070001592
Figure BDA0003952383070001601
本发明还涉及编码本发明CAR的核酸。
因此，本发明还涉及编码如本文所述的CAR的核酸序列，其中所述核酸序列包含：
-胞外结合结构域的至少一条核酸序列，其中所述结合结构域结合所述人CD45RC，
-任选地，胞外铰链结构域的至少一条核酸序列
-跨膜结构域的至少一条核酸序列，和
-胞内结构域的至少一条核酸序列，其中所述胞内结构域的至少一条核酸序列包含主要胞内信号转导结构域的至少一条核酸序列和任选地共刺激胞内信号转导结构域的至少一条核酸序列。
在一些实施方案中，胞外结合结构域的至少一条核酸序列包含编码结合hCD45RC的抗体或其结合片段的核酸或由其组成，所述抗体或其结合片段在上文“抗体或抗原结合片段”部分中公开。
在一些实施方案中，编码本发明CAR的核酸序列具有SEQ ID NO:172的序列或与SEQ ID NO:172的序列具有至少70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的序列。
Figure BDA0003952383070001611
Figure BDA0003952383070001621
在一个实施方案中，本发明的核酸是分离的核酸。
在一个实施方案中，本发明的分离的核酸是纯化的。
在一个实施方案中，将分离的核酸纯化至：
(1)如通过吸光度法或荧光法测定(例如，通过测量260nm和280nm的吸光度比值(A260/280))，以核酸重量计大于80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％或更高，并且最优选以重量计大于96％、97％、98％或99％；或
(2)如使用插入剂如溴化乙锭、SYBR Green、GelGreen等通过琼脂糖凝胶电泳所示的均一性。
还应理解，本领域技术人员熟悉旨在修饰核酸序列以便例如通过密码子优化来提高例如重组生产率的分子生物学方法。
本发明还提供了包含如本文所述的CAR编码核酸序列的载体。
可用于本发明的载体的实例包括但不限于DNA载体、RNA载体、质粒、噬菌粒、噬菌体衍生物、病毒和粘粒。
病毒载体技术是本领域公知的，并且描述于例如Sambrook等(2001，MolecularCloning:A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor Laboratory,纽约)和其它病毒学和分子生物学手册中。可用作载体的病毒包括但不限于逆转录病毒、腺病毒、腺相关病毒、疱疹病毒和慢病毒。
如本文所用，术语“慢病毒”指逆转录病毒科的属。慢病毒在逆转录病毒中是独特的，因为能够感染非分裂细胞；它们可以将显著量的遗传信息传递到宿主细胞的DNA中，因此它们是基因传递载体的最有效方法之一。HIV、SIV和FIV都是慢病毒的例子。
通常，合适的载体含有在至少一个生物体中有功能的复制起点、启动子序列、方便的限制性核酸内切酶位点和一个或多个选择标记(参见例如PCT专利公开WO 01/96584和WO01/29058和美国专利6,326,193，通过引用并入本文)。
已经开发了许多基于病毒的系统用于将基因转移到哺乳动物细胞中。例如，逆转录病毒为基因递送系统提供了方便的平台。可以使用本领域已知的技术将选择的基因插入载体并包装在逆转录病毒颗粒中。然后可分离重组病毒并将其体内或离体递送到受试者的细胞中。许多逆转录病毒系统都是本领域已知的。在一些实施方案中，使用腺病毒载体。此外，许多腺病毒载体都是本领域已知的。在一些实施方案中，使用慢病毒载体。
额外的转录活性元件，例如启动子和增强子，调节转录起始的频率。通常，核心启动子位于起始位点上游30-110bp的区域，尽管最近已显示许多启动子也含有在起始位点下游的功能元件，且增强子元件通常位于起始位点上游500-2000bp。启动子元件之间的间隔通常是灵活的，以便当元件相对于彼此倒置或移动时，启动子功能得以保持。在胸苷激酶(tk)启动子中，启动子元件之间的间隔可以在活性开始下降前增加到50bp。根据启动子，似乎单个元件可以协同或独立地发挥作用以激活转录。
合适的启动子的一个实例是即早期巨细胞病毒(CMV)启动子序列。该启动子序列是强组成型启动子序列，能够驱动与其有效连接的任何多核苷酸序列的高水平表达。合适的启动子的另一个例子是延伸生长因子-la(EF-la)。合适启动子的另一个实例是磷酸甘油酸激酶(PGK)启动子。然而，也可以使用其它组成型启动子序列，包括但不限于猿猴病毒40(SV40)早期启动子、小鼠乳腺肿瘤病毒(MMTV)、人免疫缺陷病毒(HIV)长末端重复序列(LTR)启动子、MoMuLV启动子、禽白血病病毒启动子、EB病毒即早期启动子和劳斯肉瘤病毒启动子，以及人基因启动子例如但不限于肌动蛋白启动子、肌球蛋白启动子、血红蛋白启动子和肌酸激酶启动子。此外，本发明不应限于使用组成型启动子。诱导型启动子也被考虑作为本发明的一部分。诱导型启动子的使用提供了一种分子开关，其能够在需要此种表达时开启与其有效连接的多核苷酸序列的表达，或在不需要表达时关闭表达。诱导型启动子的实例包括但不限于金属硫蛋白启动子、糖皮质激素启动子、孕酮启动子和四环素启动子。此外，允许两个或更多个基因有效和协同表达的双向启动子也是本发明感兴趣的。双向启动子的实例包括但不限于Luigi Naldini在美国专利公开2006/200869中描述的启动子，该专利通过引用并入本文，并且公开了包含i)源自巨细胞病毒(CMV)或小鼠乳腺肿瘤病毒(MMTV)基因组的第一最小启动子序列和ii)源自动物基因的全效启动子序列的双向启动子。
为了评估CAR多肽或其部分的表达，待引入T细胞的表达载体还可以含有选择性标记基因(例如CD34、CD271)或报告基因或两者，以促进从意图通过病毒载体转染或感染的细胞群中鉴定和选择表达的细胞。在其它方面，选择性标记可以在单独的DNA片段上携带并用于共转染方法中。选择标记和报告基因两者的侧翼可以有合适的调节序列以能够在宿主细胞中表达。有用的选择标记包括例如抗生素抗性基因，如新霉素等。
在本发明的一些实施方案中，可以使用自杀基因技术。本领域根据其作用机制描述了不同的自杀基因技术(参见，例如，Jones等，Frontiers in Pharmacology 5:254(2014))。将无毒药物转化为有毒药物的基因定向酶前药疗法(gene-directed enzymeprodrug therapy，GDEPT)的实例包括单纯疱疹病毒胸苷激酶(HSV-TK)和胞嘧啶脱氨酶(CD)。其它实例是由与凋亡成分连接的药物结合结构域组成的嵌合蛋白，例如诱导型Fas(iFas)或诱导型Caspase9(iCasp9)系统。其他实例包括由治疗性抗体介导的系统，例如通过施用抗c-myc抗体诱导c-myc在工程化细胞表面的过表达以诱导其缺失。EGFR的使用被描述为与c-myc系统相比的类似系统。
报道基因用于鉴定潜在的转染细胞和用于评价调节序列的功能性。通常，报告基因是不存在于受体生物体或组织中或由受体生物体或组织表达并且编码多肽的表达通过一些容易检测的性质例如酶活性来显示的基因。在DNA导入受体细胞后的合适时间测定报道基因的表达。合适的报道基因可包括编码萤光素酶、β-半乳糖苷酶、氯霉素乙酰转移酶、分泌型碱性磷酸酶或绿色荧光蛋白的基因(参见，例如Ui-Tei等，FEBS Letters 479:79-82(2000))。合适的表达系统是公知的，并且可以使用已知技术制备或商业获得。通常，将具有最小5'侧翼区的显示报告基因表达最高水平的构建体鉴定为启动子。这种启动子区可与报道基因连接，并用于评价试剂调节启动子驱动的转录的能力。
将基因导入细胞并在细胞中表达的方法是本领域已知的。在表达载体的情况下，载体可通过本领域的任何方法容易地引入宿主细胞，例如哺乳动物、细菌、酵母或昆虫细胞。例如，可通过物理、化学或生物方法将表达载体转移到宿主细胞中。
将多核苷酸导入宿主细胞的物理方法包括磷酸钙沉淀、脂转染、粒子轰击、显微注射、电穿孔等。用于产生包含载体和/或外源核酸的细胞的方法是本领域众所周知的。参见，例如，Sambrook等(2001,Molecular Cloning:A Laboratory Manual,Cold Spring HarborLaboratory,New York)。在本发明的一些实施方案中，使用磷酸钙转染将多核苷酸引入宿主细胞。
将感兴趣的多核苷酸导入宿主细胞的生物学方法包括使用DNA和RNA载体。病毒载体，特别是逆转录病毒载体，已经成为将基因插入哺乳动物，例如人细胞的最广泛使用的方法。其它病毒载体可衍生自慢病毒、痘病毒、单纯疱疹病毒I、腺病毒和腺相关病毒等。参见例如美国专利5,350,674和5,585,362。
将多核苷酸引入宿主细胞的化学方法包括胶体分散系统，例如大分子复合物、纳米胶囊、微球、珠和基于脂质的系统，包括水包油乳剂、胶束、混合胶束和脂质体。用作体外和体内递送载体的示例性胶体体系是脂质体(例如人工膜囊)。
在使用非病毒递送系统的情况下，示例性递送载体是脂质体。脂质制剂的使用被考虑用于将核酸引入宿主细胞(体外、离体或体内)。在另一个方面，核酸可以与脂质结合。与脂质结合的核酸可以包封在脂质体的水性内部，散布在脂质体的脂质双层内，通过与脂质体和寡核苷酸都结合的连接分子附着于脂质体，包封在脂质体中，与脂质体复合，分散在含有脂质的溶液中，与脂质混合，与脂质组合，作为悬浮液包含在脂质中，包含或复合有胶束，或者以其它方式与脂质结合。与脂质、脂质/DNA或脂质/表达载体结合的组合物不限于溶液中的任何特定结构。例如，它们可以以双层结构作为胶束存在，或具有“坍塌”结构。它们也可以简单地分散在溶液中，可能形成尺寸或形状不均匀的聚集体。脂质是脂肪物质，其可以是天然存在的或合成的脂质。例如，脂质包括天然存在于细胞质中的脂肪滴以及含有长链脂肪烃及其衍生物的化合物类型，例如脂肪酸、醇、胺、氨基醇和醛。
适合使用的脂质可以从商业来源获得。例如，二肉豆蔻酰磷脂酰胆碱(“DMPC”)可以获自Sigma,St.Louis,MO；双十六烷基磷酸酯(“DCP”)可以获自K&K Laboratories(Plainview,NY)；胆固醇(“Choi”)可以获自Calbiochem-Behring；二肉豆蔻酰磷脂酰甘油(“DMPG”)和其它脂质可以获自Avanti Polar Lipids公司(Birmingham，AL)。脂质在氯仿或氯仿/甲醇中的储备溶液可以储存在约-20℃。氯仿用作唯一的溶剂，因为它比甲醇更容易蒸发。“脂质体”是包括通过产生封闭的脂质双层或聚集体而形成的各种单层和多层脂质载体的通称。脂质体的特征在于具有带有磷脂双层膜和内部水性介质的囊泡结构。多层脂质体具有被水性介质分开的多个脂质层。当磷脂悬浮于过量的水溶液中时，它们自发形成。脂质成分在形成闭合结构之前经历自我重排，并将水和溶解的溶质截留在脂质双层之间(Ghosh等,1991 Glycobiology 5:505-10)。然而，还包括在溶液中具有与正常囊泡结构不同的结构的组合物。例如，脂质可以呈现胶束结构或仅作为脂质分子的不均匀聚集体存在。还考虑了lipofectamine-核酸复合物。
不管用于将外源核酸导入宿主细胞的方法如何，为了证实重组DNA序列在宿主细胞中的存在，可以进行多种测定。这些测定包括，例如，本领域技术人员熟知的“分子生物学”测定，如Southern和Northern印迹、RT-PCR和PCR；“生物化学”测定，例如通过免疫学方法(ELISA和Western印迹)或通过本文所述的测定来检测特定肽的存在或不存在，以鉴定落入本发明范围内的物质。
在一些实施方案中，本发明的免疫细胞通过引入RNA来修饰。在一些实施方案中，体外转录的RNA CAR可以以瞬时转染的形式引入细胞。RNA是通过体外转录使用聚合酶链式反应(PCR)产生的模板产生的。使用合适的引物和RNA聚合酶，通过PCR可将来自任何来源的目的DNA直接转化为体外mRNA合成的模板。DNA的来源可以是，例如，基因组DNA、质粒DNA、噬菌体DNA、cDNA、合成DNA序列或任何其它合适的DNA来源。在某些实施方案中，体外转录的模板是本发明的CAR。
在一些实施方案中，用于PCR的DNA含有开放阅读框。DNA可以是，例如，来自生物体基因组的天然存在的DNA序列。在一些实施方案中，DNA是感兴趣的全长基因或基因的一部分。所述基因可以包含一些或全部的5'和/或3'非翻译区(UTR)。基因可以包括外显子和内含子。在一些实施方案中，用于PCR的DNA是人基因。在一些实施方案中，用于PCR的DNA是包含5'和3'UTR的人基因。或者，DNA可以是通常在天然存在的生物体中不表达的人工DNA序列。示例性的人工DNA序列是含有连接在一起形成编码融合蛋白的开放阅读框的多个基因部分的序列。连接在一起的DNA的多个部分可以来自单个生物体或来自多于一个生物体。
PCR可用于产生用于转染的mRNA体外转录的模板。进行PCR的方法是本领域公知的。用于PCR的引物被设计成具有与用作PCR模板的DNA区域基本互补的区域。如本文所用，“基本互补”是指其中引物序列中的大多数或所有碱基都互补，或一个或多个碱基不互补或错配的核苷酸序列。基本互补的序列能够在用于PCR的退火条件下与预期的DNA靶退火或杂交。引物可设计成与DNA模板的任何部分基本互补。例如，引物可设计成扩增在细胞中正常转录的基因部分(开放阅读框)，其可包括5'和3'UTR。引物也可设计成扩增编码感兴趣的特定结构域的基因的一部分。在一些实施方案中，设计引物以扩增人cDNA的编码区，包括5'和3'UTR的全部或部分。用于PCR的引物通过本领域熟知的合成方法产生。
“正向引物”是含有与待扩增DNA序列上游的DNA模板上的核苷酸基本互补的核苷酸区域的引物。“上游”在此用于指相对于编码链而言待扩增DNA序列的5'位置。“反向引物”是含有与待扩增DNA序列下游的双链DNA模板基本互补的核苷酸区域的引物。“下游”在此用于指相对于编码链而言待扩增DNA序列的3'位置。
任何用于PCR的DNA聚合酶都可以用于本文公开的方法中。
所述试剂和聚合酶可从许多来源商购获得。
也可使用能够促进稳定性和/或翻译效率的化学结构。在一些实施方案中，RNA可以具有5'和3'UTR。在一些实施方案中，5'UTR的长度在0与3000个核苷酸之间。待添加至编码区的5'和3'UTR序列的长度可以通过不同的方法改变，包括但不限于设计与UTR的不同区域退火的PCR引物。通过使用该方法，本领域普通技术人员可以修饰在转染所转录的RNA后实现最佳翻译效率所需的5'和3'UTR长度。5'和3'UTR可以是感兴趣基因的天然存在的内源5'和3'UTR。或者，可通过将UTR序列引入正向和反向引物或通过模板的任何其它修饰，来添加相对感兴趣的基因而言非内源的UTR序列。使用对于感兴趣的基因而言非内源的UTR序列可以用于改变RNA的稳定性和/或翻译效率。例如，已知3'UTR序列中富含AU的元件可以降低mRNA的稳定性。因此，可以基于本领域熟知的UTR的性质，选择或设计3'UTR以增加转录的RNA的稳定性。
在一些实施方案中，5'UTR可以含有内源基因的Kozak序列。或者，当如上所述通过PCR添加相对感兴趣基因而言非内源的5'UTR时，可以通过添加5'UTR序列来重新设计共有Kozak序列。Kozak序列可以提高一些RNA转录本的翻译效率，但似乎不是所有RNA能有效翻译所必需的。许多mRNA对Kozak序列的要求是本领域已知的。在其他实施方案中，5'UTR可源自其RNA基因组在细胞中稳定的RNA病毒。在其它实施方案中，可以在3'或5'UTR中使用各种核苷酸类似物，以阻止mRNA的外切核酸酶降解。
为了能够从DNA模板合成RNA而不需要基因克隆，转录启动子应该连接到待转录序列上游的DNA模板上。当起RNA聚合酶启动子作用的序列加到正向引物的5'末端时，RNA聚合酶启动子被引入到待转录的开放阅读框上游的PCR产物中。在一些实施方案中，启动子是T7聚合酶启动子，如本文其它地方所述。其它有用的启动子包括但不限于T3和SP6 RNA聚合酶启动子。T7、T3和SP6启动子的共有核苷酸序列是本领域已知的。
在一些实施方案中，mRNA具有5'端帽结构和3'聚腺苷酸尾，其决定核糖体结合、翻译起始和mRNA在细胞中的稳定性。在环状DNA模板上，例如质粒DNA，RNA聚合酶产生不适合在真核细胞中表达的长串联产物。在3'UTR末端线性化的质粒DNA的转录产生正常大小的mRNA，其在真核转染中无效，即使其在转录后被聚腺苷酸化。
在线性DNA模板上，噬菌体T7 RNA聚合酶可将转录物的3'末端延伸超过模板的最后一个碱基(Schenborn和Mierendorf,Nuc Acids Res.,13:6223-36(1985)；Nacheva和Berzal-Herranz,Eur.J.Biochem.,270:1485-65(2003)。
将polyA/T延伸片段整合到DNA模板中的常规方法是分子克隆。然而，整合到质粒DNA中的polyA/T序列可引起质粒不稳定，这就是为什么从细菌细胞获得的质粒DNA模板经常高度污染有缺失和其它畸变的原因。这使得克隆过程不仅费力费时，而且通常不可靠。这就是为什么非常需要一种不进行克隆就可以用polyA/T 3'延伸片段构建DNA模板的方法的原因。
转录DNA模板的polyA/T片段可通过使用含有polyT尾，如100T尾(大小可以为50-5000T)的反向引物在PCR过程中产生，或在PCR之后通过任何其它方法，包括但不限于DNA连接或体外重组而产生。poly(A)尾还提供RNA稳定性并减少其降解。通常，poly(A)尾的长度与转录的RNA的稳定性正相关。在一些实施方案中，poly(A)尾是100至5000个腺苷。
RNA的poly(A)尾可在体外转录后使用poly(A)聚合酶，如大肠杆菌polyA聚合酶(E-PAP)进一步延伸。在一些实施方案中，将poly(A)尾的长度从100个核苷酸增加到300至400个核苷酸导致RNA翻译效率增加约两倍。另外，不同化学基团与3'末端的连接也可以增加mRNA稳定性。这种连接可以包含修饰的/人工的核苷酸、适体和其它化合物。例如，可以使用poly(A)聚合酶将ATP类似物引入poly(A)尾。ATP类似物可以进一步增加RNA的稳定性。
RNA上的5'帽也可以提供RNA分子的稳定性。在一些实施方案中，通过本文公开的方法产生的RNA包含5'帽。5'帽使用本领域已知的和本文描述的技术(Cougot等,Trends inBiochem.Sci.29:436-444(2001)；Stepinski等,RNA 7:1468-95(2001)；Elango,等,Biochim.Biophys.Res.Commun.330:958-966(2005))提供。
通过本文公开的方法产生的RNA还可以含有内部核糖体进入位点(IRES)序列。IRES序列可以是任何病毒、染色体或人工设计的序列，其使核糖体与mRNA的非帽依赖性结合起始，并促进翻译起始。可以包括任何适于细胞电穿孔的溶质，其可以含有促进细胞渗透性和存活力的因子，例如糖、肽、脂质、蛋白质、抗氧化剂和表面活性剂。
可以使用许多不同方法中的任何一种将RNA导入靶细胞，例如，商业上可获得的方法，包括但不限于电穿孔(例如，Amaxa Nucleofector-II(Amaxa Biosystems,Cologne,Germany)，ECM 830(BTX)(Harvard Instruments,Boston,Mass.)，Gene Pulser II(BioRad,Denver,Colo.)或者Multiporator(Eppendort,Hamburg Germany))、使用脂质体转染的阳离子脂质体介导的转染、聚合物封装、肽介导的转染或生物射弹颗粒递送系统例如“基因枪”(参见，例如Nishikawa等Hum Gene Ther.12(8):861-70(2001))。
在一些实施方式中，通过使用逆转录病毒或慢病毒载体将本文所述的CAR序列递送到本发明的免疫细胞中。表达CAR的逆转录病毒和慢病毒载体可以被递送到不同类型的真核细胞中，以及使用转导的细胞作为载体或封装的、结合的或裸的载体的无细胞局部或全身递送而递送到组织和完整生物体中。所用方法可以用于需要稳定表达或稳定表达是足够的的任何目的。
如本文所用，术语“慢病毒载体”是指衍生自慢病毒基因组的至少一部分的载体，尤其包括Milone等,Mol.Ther.17(8):1453-1464(2009)提供的自失活慢病毒载体。可用于临床的慢病毒载体的其它实例包括但不限于来自Oxford BioMedica的
Figure BDA0003952383070001701
基因递送技术、来自Lentigen的LENTIMAXTM载体系统等。非临床类型的慢病毒载体也可获得，并且是本领域技术人员已知的。
在一些实施方案中，通过使用体外转录的mRNA将CAR序列递送到本发明的免疫细胞中。体外转录的mRNA CAR可以被递送到不同类型的真核细胞，以及使用转染的细胞作为载体或封装的、结合的或裸的载体的无细胞的局部或全身递送而递送至组织和完整生物体中。所用方法可以用于需要瞬时表达或瞬时表达是足够的的任何目的。
在一些实施方案中，所需CAR可通过转座子在细胞中表达。
在一些实施方案中，本发明的免疫细胞是例如T细胞。在如本文所述的T细胞(例如Treg、Teff、记忆T细胞、NKT或MAIT细胞)的扩增和遗传修饰之前，从受试者获得细胞。T细胞可以从许多来源获得，包括外周血单核细胞、骨髓、淋巴结组织、脐带血、胸腺组织、来自感染部位的组织、腹水、胸腔积液、脾组织和肿瘤。在本发明的某些实施方案中，可以使用本领域可获得的任何数量的T细胞系。在本发明的某些实施方案中，T细胞可以使用本领域技术人员已知的任何技术从受试者收集的血液单位中获得，所述技术例如FicollTM分离、红细胞裂解和单核细胞耗减后的PERCOLLTM梯度离心、逆流离心淘析、白细胞分离和随后的基于细胞表面标志物的磁性或流式细胞术分离。在一些实施方案中，来自个体循环血液的细胞通过单采血液成分术获得。单采血液成分术的产品通常含有淋巴细胞，包括T细胞、单核细胞、粒细胞、B细胞、其它具核白细胞、红细胞和血小板。在一些实施方案中，来自个体循环血的细胞通过白细胞分离术获得。
在一些实施方案中，通过白细胞分离术收集的细胞可以洗涤以除去血浆级分，并将细胞置于合适的缓冲液或介质中以用于随后的处理步骤。在本发明的一些实施方案中，用磷酸盐缓冲盐水(PBS)洗涤细胞。在一些实施方式中，洗涤溶液缺少钙，并且可以缺少镁，或者可以缺少许多(如果不是全部)二价阳离子。洗涤后，可将细胞重悬于多种生物相容性缓冲液中的任一种，例如无Ca2+无Mg2+的PBS、PlasmaLyte A或其它含有或不含缓冲剂的盐水溶液。或者，可以除去白细胞分离术样品中不需要的成分，并将细胞直接重悬于培养基中。
在另一个实施方案中，通过裂解红血细胞和耗减单核细胞，例如通过PERCOLLTM梯度离心或通过逆流离心淘析，从外周血淋巴细胞分离T细胞。特定的T细胞亚群可以通过正选择或负选择技术进一步分离。例如，在一些实施方案中，通过与缀合有抗CD3/抗CD28(即3x28)的珠，例如
Figure BDA0003952383070001711
M-450CD3/CD28T温育对正选择所需T细胞充足的时间，而分离T细胞。在一些实施方案中，所述时间为约30分钟。在进一步的实施方案中，所述时间为30分钟至36小时或更长，以及其间的所有整数值。在进一步的实施方案中，所述时间为至少1、2、3、4、5或6小时。在一些实施方案中，所述时间是10至24小时。在某些实施方案中，温育时间为24小时。在与其它细胞类型相比T细胞较少的任何情况下，可以使用较长的温育时间来分离T细胞。因此，通过简单地缩短或延长T细胞结合抗CD3/抗CD28珠的时间和/或通过提高或降低珠与T细胞的比例(如本文进一步所述)，可在培养开始时或在该过程中的其它时间点优先选择或淘汰T细胞亚群。另外，通过提高或降低珠或其它表面上的抗CD3和/或抗CD28抗体的比例，可在培养开始时或在其它所需时间点优先选择或淘汰T细胞亚群。本领域技术人员会认识到，在本发明的上下文中也可以使用多轮选择。
在一些实施方案中，可能期望执行选择程序并在激活和扩增过程中使用“未选择的”细胞。“未选择的”细胞也可进行更多轮的选择。可以用针对负选择细胞特有的表面标志物的抗体的组合，来完成T细胞群通过负选择的富集。一种方法是使用针对存在于负选择的细胞上的细胞表面标志物的单克隆抗体的混合物，通过负磁性免疫粘附或流式细胞术进行细胞分选和/或选择。例如，为了通过负选择富集CD4+细胞，单克隆抗体混合物通常包含针对CD14、CD20、CD11b、CD16、HLA-DR和CD8的抗体。在某些实施方案中，调节性T细胞通过缀合有抗CD25的珠或其它类似的选择方法耗减。
为了通过正选择或负选择分离所需的细胞群，可以改变细胞的浓度和表面(例如，颗粒，如珠)。在某些实施方案中，可能需要显著减小珠和细胞混合在一起的体积(即，增加细胞的浓度)，以确保细胞和珠的最大接触。例如，在一些实施方案中，使用20亿细胞/mL的浓度。在一些实施方案中，使用10亿细胞/mL的浓度。在另一个实施方案中，使用大于1亿细胞/mL。在另一个实施方案中，使用1、1.5、2、2.5、3、3.5、4、4.5或5千万细胞/mL的细胞浓度。在一些实施方案中，使用7.5、8、8.5、9、9.5千万或1亿细胞/mL的细胞浓度。在进一步的实施方案中，可以使用1.25或1.50亿细胞/mL的浓度。使用高浓度可以导致增加的细胞产量、细胞活化和细胞扩增。此外，使用高细胞浓度可更有效地捕获可能弱表达感兴趣靶抗原的细胞，如CD28阴性T细胞，或从存在许多肿瘤细胞的样品(即白血病血液、肿瘤组织等)中捕获细胞。这样的细胞群可以具有治疗价值并且可以是期望获得的。
用于刺激的T细胞也可以在洗涤步骤后冷冻。不希望受理论的束缚，冷冻和随后的解冻步骤通过除去细胞群中的粒细胞和某种程度的单核细胞而提供了更均一的产物。在除去血浆和血小板的洗涤步骤之后，可以将细胞悬浮在冷冻溶液中。虽然许多冷冻溶液和参数是本领域已知的并且在此背景下是有用的，但是一种方法涉及使用含有20％DMSO和8％人血清白蛋白的PBS，或含有10％葡聚糖40和5％葡萄糖、20％人血清白蛋白和7.5％DMSO的培养基，或31.25％Plasmalyte-A、31.25％葡萄糖5％、0.45％NaCl、10％葡聚糖40和5％右旋糖、20％人血清白蛋白和7.5％DMSO，或含有例如Hespan和PlasmaLyte A的其它合适细胞冷冻介质，然后以1℃/分钟的速率将细胞冷冻至-80℃并且储存在液氮储存罐的气相中。可以使用其它受控冷冻方法以及在-20℃或液氮中立即不受控冷冻。
在某些实施方案中，将低温保存的细胞解冻并如本文所述洗涤，并允许在活化之前在室温下静置一小时。
本发明还考虑在可能需要本文所述的扩增细胞之前的时间从受试者收集血样或白细胞分离术产物。因此，待扩增的细胞来源可以在任何必要的时间点收集，并且可以分离和冷冻所需的细胞，例如T细胞，以便随后在T细胞治疗中用于治疗可受益于T细胞治疗的任何数量的疾病或病症，例如本文所述的那些。在一些实施方案中，从一般健康的受试者采集血液样品或白细胞分离术产物。在某些实施方案中，从具有发展疾病的风险但尚未发展疾病的一般健康受试者中采集血液样品或白细胞分离术产物，并且分离感兴趣的细胞并冷冻以供后续使用。在某些实施方案中，T细胞可以被扩增、冷冻并在以后使用。
无论在遗传修饰T细胞以表达所需CAR之前或之后，T细胞都可以通常使用例如以下专利中所述的方法活化和扩增：美国专利6,352,694；6,534,055；6,905,680；6,692,964；5,858,358；6,887,466；6,905,681；7,144,575；7,067,318；7,172,869；7,232,566；7,175,843；5,883,223；6,905,874；6,797,514；6,867,041；以及美国专利公开2006/0121005，其通过引用并入本文。
通常，本发明的T细胞(例如Treg、Teff、记忆T细胞、NKT或MAIT细胞)通过与表面接触而扩增，所述表面具有附着于其上的刺激CD3/TCR复合物相关信号的试剂和刺激细胞表面上的共刺激分子的配体。特别地，T细胞(例如Treg、Teff、记忆T细胞、NKT或MAIT细胞)可如本文所述进行刺激，例如通过与固定化在表面上的抗CD3抗体或其抗原结合片段或抗CD2抗体接触，或通过与连有钙离子载体点的蛋白激酶C激活剂(例如苔藓抑素)接触。为了共刺激T细胞表面上的辅助分子，使用结合辅助分子的配体。例如，T细胞群可以在适于刺激T细胞增殖的条件下与抗CD3抗体和抗CD28抗体接触。为了刺激CD4+T细胞的增殖，可使用抗CD3抗体和抗CD28抗体。抗CD28抗体的实例包括但不限于9.3、B-T3、XR-CD28(Diaclone，Besancon，法国)。可以使用本领域公知的其它扩增方法(Berg等,Transplant Proc.30(8):3975-3977(1998)；Haanen等,J.Exp.Med.190(9):1319-1328(1999)；Garland等,J.ImmunolMeth.227(l-2):53-63(1999))。
在某些实施方式中，用于本发明T细胞(例如Tregs、Teff、记忆T、NKT或MAIT细胞)的初级刺激信号和共刺激信号可通过不同方案提供。例如，提供每个信号的试剂可以在溶液中和/或与表面偶联。当与表面偶联时，所述试剂可以偶联至同一表面(即，以“顺式”形式)或不同的表面(即，以“反式”形式)。或者，一种试剂可以偶联到表面上，而另一种试剂在溶液中。在一些实施方案中，提供共刺激信号的试剂结合至细胞表面，并且提供初级活化信号的试剂在溶液中或偶联至表面。在某些实施方案中，两种试剂都可以在溶液中。在一些实施方案中，所述试剂可以是可溶形式，然后交联到表面，例如表达Fc受体的细胞或结合所述试剂的抗体或其它结合剂。在这方面，参见例如美国专利公开2004/0101519和2006/0034810，其通过引用并入本文，其用于人工抗原呈递细胞(aAPC)，其被考虑用于在本发明中活化和扩增T细胞。
在一些实施方案中，所述两种试剂被固定在珠上，或者在同一珠上，即“顺式”，或者固定至不同的珠，即“反式”。例如，提供初级活化信号的试剂是抗CD3抗体或其抗原结合片段，提供共刺激信号的试剂是抗CD28抗体或其抗原结合片段；并且两种试剂以相等的分子数量共同固定到同一珠上。在一些实施方案中，使用1:1比例的与珠结合的各抗体，用于CD4+T细胞扩增和T细胞生长。在本发明的某些方面，使用与珠结合的抗CD3抗体与抗CD28抗体的比例使得与使用1:1比例观察到的扩增相比，观察到T细胞扩增的增加。在一些实施方案中，与使用1:1比例观察到的扩增相比，观察到约1至约3倍的增加。在一些实施方案中，与珠结合的抗CD3抗体与抗CD28抗体的比例范围为100:1至1:100以及其间的所有整数值。在一些实施方案中，与抗CD3抗体相比，更多的抗CD28抗体结合颗粒，即CD3与CD28的比例小于1。在本发明的某些实施方案中，与珠结合的抗CD28抗体与抗CD3抗体的比例大于2:1。在一个具体实施方案中，使用比例为1:100的与珠结合的CD3抗体与CD28抗体。在一些实施方案中，使用比例为1:75的与珠结合的CD3抗体与CD28抗体。在进一步的实施方案中，使用比例为1:50的与珠结合的CD3抗体与CD28的抗体。在一些实施方案中，使用比例为1:30的与珠结合的CD3抗体与CD28抗体。在某些实施方案中，使用比例为1:10的与珠结合的CD3抗体与CD28抗体。在一些实施方式中，使用比例为1:3的与珠结合的CD3抗体与CD28抗体。在一些实施方式中，使用比例为3:1的与珠结合的CD3抗体与CD28抗体。
1:500至500:1的颗粒与细胞的比例以及其间的任何整数值都可用于刺激T细胞或其它靶细胞。如本领域普通技术人员可以容易理解的，颗粒与细胞的比例可取决于颗粒相对于靶细胞的尺寸。例如，小尺寸的珠仅可以结合少数细胞，而较大的珠可以结合许多细胞。在某些实施方案中，T细胞可以用比例为1:100至100:1和其间的任何整数值的细胞与颗粒来刺激。在特定的实施方案中，所述比例包括1:9至9:1以及其间的任何整数值。导致T细胞刺激的抗CD3偶联颗粒和抗CD28偶联颗粒与T细胞的比例可如上所述变化；然而某些实施方案的数值包括1:100、1:50、1:40、1:30、1:20、1:10、1:9、1:8、1:7、1:6、1:5、1:4、1:3、1:2、1:1、2:1、3:1、4:1、5:1、6:1、7:1、8:1、9:1、10:1和15:1，其中一个特定比例为至少1:1的颗粒/T细胞。在一些实施方案中，使用1:1或更小的颗粒与细胞的比例。在某些实施方案中，颗粒与细胞比例为1:5。在进一步的实施方案中，颗粒与细胞的比例可以根据刺激日而变化。例如，在一些实施方案中，在第一天颗粒与细胞的比例为1:1至10：1，并且此后每天或每隔一天将额外的颗粒加入细胞中，持续最多10天，最终比例为1:1至1:10(基于加入当天的细胞计数)。在一个特定的实施方案中，在刺激的第一天，颗粒与细胞的比例为1:1，在刺激的第三天和第五天，调整至1:5。在一些实施方案中，以每天或每隔一天的基础添加颗粒至在刺激的第一天最终比例为1:1，第三天和第五天最终比例为1:5。在一些实施方案中，颗粒与细胞的比例在刺激的第一天为2:1，在刺激的第三天和第五天调整至1:10。在一些实施方案中，以每天或每隔一天的基础添加颗粒至在刺激的在刺激的第一天最终比例为1:1，在第三天和第五天最终比例为1:10。本领域技术人员将理解，多种其它比例可适用于本发明。特别地，比例将根据颗粒尺寸以及细胞尺寸和类型而变化。
在本发明的进一步实施方案中，将免疫细胞与试剂包被的珠组合，随后将珠和细胞分离，然后培养细胞。在替代实施方案中，在培养之前，不分离试剂包被的珠和细胞，而是将它们一起培养。在一些实施方案中，首先通过施加力例如磁力而导致细胞表面标志物的连接增加，来浓缩珠和细胞，从而诱导细胞刺激。
例如，可以通过使连接有抗CD3和抗CD28抗体的顺磁珠(3×28磁珠)与本发明的免疫细胞接触，来连接细胞表面蛋白。在一些实施方案中，将细胞(例如，104至109T细胞)和珠(例如，比例为1:1的
Figure BDA0003952383070001751
M-450CD3/CD28 T顺磁珠)在缓冲液例如PBS(例如，不含二价阳离子，例如钙和镁)中组合。同样，本领域普通技术人员可以容易地理解，根据情况可以使用任何细胞浓度。例如，靶细胞在样品中可能非常稀少并且仅占样品的0.01％，或者整个样品(即100％)可包含感兴趣的靶细胞。因此，任何细胞数目都在本发明的范围内。在某些实施方案中，可能需要显著减小颗粒和细胞混合在一起的体积(即，增加细胞的浓度)，以确保细胞和颗粒的最大接触。例如，在一个实施方案中，使用约20亿个细胞/mL的浓度。在另一个实施方案中，使用大于1亿细胞/mL。在另一个实施方案中，使用1.0、1.5、2、2.5、3、3.5、4、4.5或5千万细胞/mL的细胞浓度。在另一个实施方案中，使用7.5、8、8.5、9、9.5千万或1亿细胞/mL细胞浓度。在进一步的实施方案中，可以使用1.25或1.50亿细胞/mL的浓度。使用高浓度可导致细胞产量、细胞活化和/或细胞扩增增加。此外，使用高细胞浓度允许更有效地捕获可能弱表达感兴趣靶抗原的细胞，例如CD28阴性T细胞。这样的细胞群可以具有治疗价值，并且在某些实施方案中可以是期望获得的。
在本发明的一些实施方案中，混合物可以培养数小时(例如，约3小时)至约14天或其间的任何小时整数值。在一些实施方案中，混合物可以培养21天。在本发明的一些实施方案中，将珠和T细胞一起培养大约八天。在一些实施方案中，将珠和T细胞一起培养2-3天。也可能需要几个循环的刺激，以便T细胞的培养时间可以是60天或更长。适于T细胞培养的条件包括适当的培养基(例如，最小必需培养基或RPMI培养基1640或X-Vivo 15(Lonza))，其可以含有增殖和生存必需的因子，包括血清(例如，胎牛或人血清)、白介素-2(IL-2)、胰岛素、IFN-γ、IL-4、IL-7、GM-CSF、IL-10、IL-12、IL-15、TGFβ和TNF-α或本领域技术人员已知的用于细胞生长的任何其它添加剂。用于细胞生长的其它添加剂包括但不限于表面活性剂、人血浆蛋白粉(plasmanate)和还原剂如N-乙酰-半胱氨酸和2-巯基乙醇。培养基可以包括RPMI 1640、AIM-V、DMEM、MEM、a-MEM、F-12、X-vivo 15和X-vivo 20、优化物(Optimizer)，具有添加的氨基酸、丙酮酸钠和维生素，并且无血清或补充有适量的血清(或血浆)或确定的激素组，和/或足以使T细胞生长和扩增的量的细胞因子。抗生素，例如青霉素和链霉素，仅包括在实验培养物中，而不包括在要输注到受试者中的细胞培养物中。靶细胞维持在支持生长所必需的条件下，例如，合适的温度(例如，37℃)和气氛(例如，空气加5％CO2)。
已经暴露于不同刺激时间的T细胞可以表现出不同的特征。例如，典型的血液或单采外周血单核细胞产物具有大于细胞毒性或抑制性T细胞群(Tc，CD8+)的辅助T细胞群(Th，CD4+)。通过刺激CD3和CD28受体进行T细胞的离体扩增产生了一个T细胞群，该群在约8-9天之前主要由Th细胞组成，而在约8-9天之后T细胞群包含越来越多的Tc细胞群。根据治疗目的，在一些实施方案中，给受试者输注主要包含Th细胞的T细胞群可能是有利的。在一些实施方案中，如果已经分离了抗原特异性Tc细胞亚组，则将该亚组扩增至更大程度可能是有益的。
此外，除了CD4和CD8标志物外，其它表型标志物也有显著变化，但在细胞扩增过程中大部分是可重复进行的。这种再现性使得能够针对特定目的定制活化的T细胞产物。
在本发明的一些实施方案中，T细胞可以在雷帕霉素存在下培养以获得调节性T细胞，如PCT专利公开WO 2007/110785中所述(通过引用并入本文)。产生调节性T细胞的另一种方法描述于美国专利公开2016/024470(通过引用并入本文)，其中T细胞与T细胞受体(TCR)/CD3激活剂如TCR/CD3抗体、TCR共刺激激活剂如CD28、CD137(4-1BB)、GITR、B7-1/2、CD5、ICOS、OX40、CD40或CD137抗体和雷帕霉素一起培养。
在本发明的一些实施方案中，通过表达本文所述的CAR进行遗传修饰的T细胞也可以通过表达至少一种细胞内因子，如ROR-C、FoxP3、Foxo1、T-bet或Gata 3、C-Maf或AhR进行遗传修饰。在一些实施方式中，本发明的遗传修饰的免疫细胞表达FoxP3。在一些实施方案中，本发明的遗传修饰的免疫细胞表达Foxo1。
在一个实施方案中，本发明的遗传修饰的免疫细胞可以是同种异基因Treg细胞、Teff细胞、记忆T细胞、或NKT细胞或MAIT细胞。例如，同种异基因T细胞可以是缺乏功能性人白细胞抗原(HLA)表达的T细胞，例如，I类HLA和/或II类HLA。
在一个实施方案中，如本文所述的T细胞可以被工程化，使得它们不在其表面上表达功能性HLA。例如，可以工程化改造本文所述的T细胞，使得HLA，例如I类HLA和/或II类HLA或非经典HLA分子的细胞表面表达下调。
缺乏功能性TCR和/或HLA表达的修饰的免疫细胞可通过任何合适的方法获得，包括TCR和/或HLA的一个或多个亚基的敲除或敲减。例如，T细胞可以包括使用siRNA、shRNA、成簇规律间隔的短回文重复序列(CRISPR)、转录激活因子样效应物核酸酶(TALEN)、锌指核酸内切酶(ZFN)、大范围核酸酶(mn，也称为归巢核酸内切酶)或大范围TAL(将TAL效应物与mn切割结构域组合)敲减的TCR和/或HLA。
在一些实施方案中，将编码如本文所述的CAR的核酸插入免疫细胞基因组中的特定基因座，例如，在待删除的基因座。在一些实施方案中，将编码如本文所述的CAR的核酸插入TCR和/或HLA基因座内，从而导致TCR和/或HLA表达的抑制。
在一些实施方式中，TCR和/或HLA表达可使用靶向T细胞中编码TCR和/或HLA的核酸的siRNA或shRNA进行抑制。siRNA和shRNA在T细胞中的表达可以使用任何常规表达系统，例如慢病毒表达系统来实现。下调I类HLA和/或II类HLA基因表达的示例性siRNA和shRNA描述于例如美国专利公开2007/0036773中。下调TCR组分表达的示例性shRNA描述于例如美国专利公开2012/0321667中。
如本文所用，“CRISPR”或“针对TCR和/或HLA的CRISPR”或“抑制TCR和/或HLA的CRISPR”是指一组成簇的规律间隔的短回文重复序列，或包含这组重复序列的系统。如本文所用，“Cas”是指CRISPR相关蛋白。“CRISPR/Cas”系统是指衍生自CRISPR和Cas的系统，其可以用于沉默或突变TCR和/或HLA基因。
在大约40％的测序的真细菌基因组和90％的测序的古细菌中发现天然存在的CRISPR/Cas系统。参见，例如，Grissa等(BMC Bioinformatics 8:172(2007))。该系统是一种原核免疫系统，其赋予对诸如质粒和噬菌体的外源遗传元件的抗性，并提供获得性免疫形式。参见，例如，Barrangou等，Science 315:1709-1712(2007)；Marragini等,Science322:1843-1845(2008)。CRISPR/Cas系统已经被修饰用于真核生物(例如小鼠或灵长类)中的基因编辑(沉默、增强或改变特定基因)。参见，例如Wiedenheft等，Nature 482:331-8(2012)。这通过将含有特别设计的CRISPR和一个或多个合适的Cas编码序列的质粒引入真核细胞中来实现。CRISPR序列，有时称为CRISPR基因座，包含交替的重复序列和间隔区。在天然存在的CRISPR中，间隔区通常包含对于细菌而言外源的序列，例如质粒或噬菌体序列；在TCR和/或HLA CRISPR/Cas系统中，间隔区源自TCR和/或HLA基因序列。来自CRISPR基因座的RNA被组成型地表达，并由Cas蛋白加工成小RNA。这些序列包含侧翼为重复序列的间隔区。RNA引导其它Cas蛋白在RNA或DNA水平上沉默外源遗传元件。参见，例如，Horvath等，Science 327:167-170(2010)；Makarova等,Biology Direct 1:7(2006)。因此，间隔区作为RNA分子的模板，类似于siRNA。参见例如Pennisi,Science 341:833-836(2013)。因此，CRISPR/Cas系统可以用于编辑TCR和/或HLA基因(添加或删除碱基对)，或引入降低TCR和/或HLA表达的早熟终止。替代地或另外，CRISPR/Cas系统可以像RNA干扰一样使用，以可逆的方式关闭TCR和/或HLA基因。例如，在哺乳动物细胞中，RNA可以将Cas蛋白引导至TCR和/或HLA启动子，在空间上阻断RNA聚合酶。
可以使用本领域已知的技术，例如描述于美国专利公开2014/0068797和Cong,Science 339:819-823(2013)中的技术，产生抑制TCR和/或HLA的人工CRISPR/Cas系统。也可产生本领域已知的其它人工CRISPR/Cas系统以抑制TCR和/或HLA，例如Tsai,NatureBiotechnol.32:6569-576(2014)和美国专利8,871,44、8,865,406、8,795,965、8,771,945和8,697,359中所述的那些。
“TALEN”或“针对TCR和/或HLA的TALEN”或“抑制TCR和/或HLA的TALEN”是指转录激活子样效应物核酸酶，一种可用于编辑TCR和/或HLA基因的人工核酸酶。TALEN通过将TAL效应子DNA结合结构域融合至DNA切割结构域而人工产生。转录激活子样效应物(TALE)可经工程改造以结合任何所需DNA序列，包括TCR和/或HLA基因的一部分。通过将工程化TALE与DNA切割结构域组合，可以产生对任何期望DNA序列(包括TCR和/或HLA序列)特异的限制酶。然后可将这些导入细胞，在此它们可用于基因组编辑。参见，例如，Boch,Nature Biotech.29:135-6(2011)；Boch等,Science 326:1509-12(2009)；和Moscou等,Science 326:3501(2009)。
TALE是由黄单胞菌分泌的蛋白。DNA结合结构域含有重复的33-34个氨基酸的序列，除了第12和第13个氨基酸之外，该序列是高度保守的。这两个位置是高度可变的，显示出与特异性核苷酸识别的强相关性。因此，它们可以被工程化以结合到所需的DNA序列。为了产生TALEN，将TALE蛋白与核酸酶(N)融合，所述核酸酶是野生型或突变的Fokl核酸内切酶。已经对Fokl进行了几种突变以用于TALEN；例如，这些突变提高了切割特异性或活性。参见，例如，Cermak等,Nucl.Acids Res.39:e82(2011)；Miller等,Nature Biotech.29:143-8(2011)；Hockemeyer等,Nature Biotech.29:731-734(2011)；Wood等,Science 333:307(2011)；Doyon等,Nature Methods 8:74-79(2010)；Szczepek等,Nature Biotech.25:786-793(2007)；和Guo等,J.Mol.Biol.200:96(2010)。Fokl结构域作为二聚体起作用，这需要两个构建体，所述构建体具有针对目标基因组中位点的具有适当方向和间隔的独特DNA结合结构域。TALE DNA结合结构域和Fokl切割结构域之间的氨基酸残基数目以及两个单独的TALEN结合位点之间的碱基数似乎都是实现高水平活性的重要参数(Miller等，NatureBiotech.29:143-8(2011))。TCR和/或HLA TALEN可以在细胞内用于产生双链断裂(DSB)。如果修复机制通过非同源末端连接不适当地修复断裂，则可以在断裂位点引入突变。例如，不适当的修复可能引入移码突变。或者，外源DNA可以与TALEN一起导入细胞；根据外源DNA的序列和染色体序列，该方法可用于纠正TCR和/或HLA基因中的缺陷或将这样的缺陷引入wtHLA基因中，从而降低TCR和/或HLA的表达。对TCR和/或HLA中序列特异的TALEN可使用本领域已知的任何方法构建，包括使用模块化组件的各种方案(Zhang等，Nature Biotech.29:149-53(2011)；Geibler等,PLoS ONE 6:el9509(2011))。
“ZFN”或“锌指核酸酶”或“针对TCR和/或HLA的ZFN”或“抑制TCR和/或HLA的ZFN”是指锌指核酸酶，一种可用于编辑TCR和/或HLA基因的人工核酸酶。与TALEN一样，ZFN包含融合到DNA结合结构域的Fokl核酸酶结构域(或其衍生物)。在ZFN的情况下，DNA结合结构域包含一个或多个锌指。参见，例如Carroll等，Genetics Society of America 188:773-782(2011)；和Kim等,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 93:1156-1160(1996)。锌指是由一个或多个锌离子稳定的小蛋白结构基序。锌指可包含例如Cys2His2，并可识别约3bp序列。可以组合已知特异性的各种锌指来产生识别约6、9、12、15或18bp序列的多指多肽。各种选择和模块组装技术可用于产生识别特定序列的锌指(及其组合)，包括噬菌体展示、酵母单杂交系统、细菌单杂交和双杂交系统以及哺乳动物细胞。
与TALEN一样，ZFN必须二聚化才能切割DNA。因此，需要一对ZFN靶向非回文DNA位点。两个单独的ZFN必须结合DNA的相对链，它们的核酸酶适当地间隔开(Bitinatite等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 95:10570-5(1998))。还像TALEN一样，ZFN可以在DNA中产生双链断裂，如果被不适当地修复，则其可以产生移码突变，导致细胞中TCR和/或HLA的表达和量的降低。ZFN也可以与同源重组一起使用，用于突变TCR和/或HLA基因。对TCR和/或HLA中序列特异的ZFN可以使用本领域已知的任何方法构建。参见，例如，Provasi,Nature Med.18:807-815(2011)；Torikai,Blood 122:1341-1349(2013)；Cathomen等,Mol.Ther.16:1200-7(2008)；Quo等,J.Mol.Biol.400:96(2010)；以及美国专利公开2011/0158957和2012/0060230。
“大范围核酸酶”或“针对TCR和/或HLA的大范围核酸酶”或“抑制TCR和/或HLA的大范围核酸酶”是指具有大(＞14个碱基对)识别位点的单体核酸内切酶，其可用于编辑TCR和/或HLA基因。大范围核酸酶(MN)是具有固有核酸酶活性的单体蛋白，其源自细菌归巢核酸内切酶并且针对独特的靶位点进行工程改造。归巢核酸内切酶是DNA切割酶，其可以在其宿主基因组中的各个基因座处产生双链断裂，从而驱动位点特异性基因转化事件(Stoddard,Structure 19(1):7-15(2011))。尽管归巢核酸内切酶的大小较小，但它们能识别长的DNA序列(通常为20-30个碱基对)。归巢核酸内切酶非常广泛，并且见于微生物以及噬菌体和病毒中。LAGLIDADG和His-Cys盒酶(它们是这些酶中最具序列特异性的)依赖于泊入它们的DNA靶位点的大沟中的反平行β-片(Flick等，Nature 394(6688):96-101(1998)；Jurica等,Mol.Cell.2(4):469-76(1998)。在那里它们建立了在多个连续碱基对上不均匀分布的序列特异性和非特异性接触的集合(Chevalier等，Nature 394(6688):96-101(1998)；Jurica等,Mol.Cell.2(4):469-76(1998)。
LAGLIDADG归巢核酸内切酶(LHE)家族是用于基因靶向应用的工程酶的主要来源。LHE家族主要在古细菌内以及在藻类和真菌的叶绿体和线粒体基因组中编码(Chevalier等，Homing Endonucleases and Inteins.Nucleic Acids and Molecular Biology,vol.16(2005)；Dalgaard等,Nucleic Acids Res.25(22):4626-38(1997)；Sethuraman等,Mol Biol Evol.26(10):2299-315(2009)。每蛋白链都具有单个保守LAGLIDADG基序(SEQID NO:174)的大范围核酸酶形成切割回文的和近乎回文的DNA靶序列的同型二聚体蛋白，而每蛋白链含有两个这样的基序的那些则形成可以靶向完全不对称DNA序列的较大的假对称的单体。
大范围核酸酶可以被工程化以靶向TCR和/或HLA，并因此在DNA中产生双链断裂，如果被不适当地修复，其可以产生移码突变，导致细胞中TCR和/或HLA的表达和量的降低。
“MegaTAL”或“针对TCR和/或HLA的MegaTAL”或“抑制TCR和/或HLA的MegaTAL”是指人工核酸酶，其可用于编辑TCR和/或HLA基因。MegaTAL是通过最小TAL(转录激活因子样)效应子结构域与衍生自LAGLIDADG归巢核酸内切酶家族的大范围核酸酶的N-末端融合而获得的杂合单体核酸酶(Boissel等，Nucleic Acids Res.42(4):2591-601(2014)；Takeuchi等,Methods Mol Biol.1239:105-32(2015))。因此，MegaTAL由位点特异性大范围核酸酶切割头部组成，所述切割头部具有TAL效应子DNA结合结构域提供的额外的亲和力和特异性。
可将MegaTAL工程化以靶向TCR和/或HLA，从而在DNA中产生双链断裂，如果不适当地修复，则其可产生移码突变，导致细胞中TCR和/或HLA的表达和量的降低。
在一些实施方案中，用端粒酶基因转染可以延长T细胞的端粒并改善T细胞在患者中的持久性。参见，例如，June,Journal of Clinical Investigation 117:1466-1476(2007。因此，在一些实施方案中，本发明的遗传修饰的免疫细胞异位表达端粒酶亚基，例如端粒酶的催化亚基，例如TERT，例如hTERT。在一些方面，本公开提供了产生本发明的嵌合受体表达细胞的方法，包括使细胞与编码端粒酶亚基，例如端粒酶的催化亚基，例如TERT，例如hTERT的核酸接触。可以在与编码嵌合受体(例如，如本文所述的CAR)的构建体接触之前、同时或之后，使细胞与所述核酸接触。
本发明还涉及用于获得本发明的免疫细胞的方法，其中所述方法包括用编码如本文所述的CAR的核酸转导至少一个免疫细胞，和任选地扩增转导的细胞。在一些实施方案中，所述方法是离体方法。
在一个实施方案中，用于获得本发明的免疫细胞的方法包括：
-从PBMC群(例如通过白细胞分离术回收的PBMC群)中分离免疫细胞的步骤，
-遗传修饰步骤，其中将编码如上文所述的CAR的核酸序列引入或转移到免疫细胞内，
-任选地扩增步骤，
-任选的洗涤步骤，和
-任选地冷冻步骤。
在一个实施方案中，遗传修饰步骤对应于基因破坏步骤、基因校正步骤或基因添加步骤，优选基因添加步骤。在一个实施方案中，通过选自包括但不限于转染、转导或基因编辑的组的方法进行遗传修饰步骤。
可用于本发明的基因编辑方法的实例包括但不限于基于工程改造的核酸酶的方法、基于重组腺相关病毒(或AAV)的方法、基于转座子的方法(例如睡美人转座子系统)、基于同源重组的方法、使用位点特异性重组酶的条件靶向(例如Cre-LoxP和Flp-FRT系统)和多重自动化基因组工程(MAGE)。
工程化核酸酶的非限制性实例包括但不限于成簇规律间隔的短回文重复序列(CRISPR)、转录激活因子样效应物核酸酶(TALEN)、锌指核酸内切酶(ZFN)、大范围核酸酶(mn，也称为归巢核酸内切酶)或大范围TAL(将TAL效应物与mn切割结构域组合)。
在一个实施方案中，用于获得本发明的免疫细胞的方法包括：
-从PBMC群(例如通过白细胞分离术回收的PBMC群)中分离免疫细胞的步骤，
-用包含编码如上文所述的CAR的核酸序列的载体转导或转染的步骤，
-任选地扩增步骤，
-任选的洗涤步骤，和
-任选地冷冻步骤。
本发明还涉及表达如本文所述的CAR的免疫细胞，和这样的免疫细胞群。
在一些实施方式中，将编码本发明的CAR的核酸引入免疫细胞，从而产生在细胞表面上表达CAR的工程化细胞。因此，本发明还涉及编码本发明CAR的核酸。
在一些实施方案中，本发明的免疫细胞是哺乳动物免疫细胞，例如人免疫细胞、来自农场动物(例如，牛、猪或马)的免疫细胞或来自宠物(例如，猫或狗)的免疫细胞。
在一些实施方案中，免疫细胞选自淋巴细胞、骨髓来源的细胞及其任何组合。在某些实施方案中，免疫细胞是淋巴细胞，例如选自T细胞、B细胞、自然杀伤(NK)细胞及其任何组合。在具体的实施方式中，免疫细胞是T细胞，在某些实施方式中，其选自CD4+T细胞、CD8+T细胞、γδT细胞、双阴性(DN)T细胞及其任意组合。在某些实施方案中，免疫细胞是CD4+T细胞，例如，T辅助细胞、调节性T细胞、效应T细胞及其任何组合。在一些实施方式中，免疫细胞是CD8+T细胞，例如细胞毒性CD8+T细胞或CD8+调节性T细胞。在一些实施方案中，免疫细胞是γδT细胞。在一些实施方式中，免疫细胞是工程化以表达确定的γδTCR(TEGγδ)细胞的T细胞。在一些实施方案中，免疫细胞是DN T细胞。在一些实施方案中，免疫细胞是NK细胞。
在一些实施方案中，免疫细胞是调节性免疫细胞，例如，适合用于细胞治疗的任何调节性免疫细胞。在某些实施方式中，调节性免疫细胞选自调节性T细胞、CD4+调节性T细胞、CD8+调节性T细胞、调节性γδT细胞、调节性DN T细胞、调节性B细胞、调节性NK细胞、调节性巨噬细胞、调节性树突细胞及其任意组合。
在一些实施方式中，调节性免疫细胞是调节性T细胞(Treg)，特别是胸腺来源的Treg或适应性或诱导的Treg。在某些实施方案中，免疫细胞是CD4+调节性T细胞(Treg)。在某些实施方案中，Treg是胸腺来源的Treg或适应性或诱导的Treg。在某些实施方案中，Treg是CD4+FoxP3+调节性T细胞或CD4+FoxP3-调节性T细胞(Tr1细胞)。在具体实施方案中，免疫细胞是CD4+FoxP3+调节性T细胞。
在一些实施方式中，免疫细胞是CD8+调节性T细胞。CD8+调节性T细胞的实例包括但不限于CD8+CD28-调节性T细胞、CD8+CD103+调节性T细胞、CD8+FoxP3+调节性T细胞、CD8+CD122+调节性T细胞及其任何组合。
在一些实施方案中，调节性免疫细胞是调节性γδT细胞。
在一些实施方案中，调节性免疫细胞是调节性DN T细胞。
在一些实施方案中，调节性免疫细胞是调节性NK细胞。
在一些实施方案中，免疫细胞是效应免疫细胞，例如，适合用于细胞治疗的任何效应免疫细胞。在某些实施方案中，效应免疫细胞选自效应T细胞、CD4+效应T细胞、CD8+效应T细胞、效应γδT细胞、效应DN T细胞、效应NK细胞及其任何组合。
在一些实施方案中，免疫细胞是效应T细胞。在某些实施方案中，效应免疫细胞是CD4+效应T细胞。CD4+效应T细胞的实例包括但不限于Th1细胞、Th2细胞、Th9细胞、Th17细胞、Th22细胞、CD4+T滤泡辅助(Tfh)细胞及其任何组合。在一些实施方案中，效应免疫细胞是CD8+效应T细胞。CD8+效应T细胞的实例包括但不限于CD8+CD45RO+CCR7-CD62L-效应T细胞、CD8+CD45RA+CCR7-CD62L-效应T细胞及其任何组合。
在一个实施方案中，免疫细胞是效应γδT细胞。
在一个实施方案中，免疫细胞是效应DN T细胞。
在一些实施方案中，免疫细胞是效应NK细胞。
在一些实施方式中，免疫细胞选自T细胞、自然杀伤(NK)细胞、γδT细胞、双阴性(DN)细胞、调节性免疫细胞、调节性T细胞、效应免疫细胞、效应T细胞及其任意组合。
在一些实施方案中，将编码本发明的CAR的核酸引入非Treg淋巴细胞，所述细胞在基因组编辑后分化成Treg细胞。如上所述，所编辑的非Treg细胞在移植到患者体内之前可分化成Treg细胞。或者，所编辑的非Treg细胞可在移植到患者体内之后诱导分化成Treg细胞。
在一些实施方案中，通过流式细胞术、免疫荧光或图像分析，例如高含量分析，测定分子的表达水平。在某些实施方案中，通过流式细胞术测定分子的表达水平。在具体的实施方案中，在进行流式细胞术分析之前，将细胞固定并透化，从而允许检测细胞内蛋白。
在一些实施方案中，细胞群中分子的表达水平的测定包括测定细胞群中表达分子的细胞(即，对于分子为“+”的细胞)的百分比。在某些实施方案中，通过FACS测量表达分子的细胞的所述百分比。
术语“表达”、“阳性”或“+”和“不表达”、“阴性”或“-”是本领域公知的，并且是指感兴趣的细胞标志物的表达水平在于，对应于“+”的细胞标志物的表达水平是高的或中等的(也称为“+/-”)，对应于“-”的细胞标志物的表达水平是无效的(null)。
术语“低”或“lo”或“lo/-”是本领域公知的，指感兴趣的细胞标志物的表达水平在于，与作为整体被分析的细胞群中细胞标志物的表达水平相比，该细胞标志物的表达水平较低。更特别地，术语“lo”是指与一种或多种其他不同细胞群相比以更低水平表达细胞标志物的不同细胞群。
术语“高”或“hi”或“亮”是本领域公知的，并且是指感兴趣细胞标志物的表达水平在于，与作为整体被分析的细胞群中的该细胞标志物的表达水平相比，该细胞标志物的表达水平是高的。
通常，染色强度在前2％、3％、4％或5％的细胞被指定为“hi”，其中落入群体的前半部分的那些被分类为“+”。将荧光强度低于50％的那些细胞指定为“lo”细胞，低于5％的细胞指定为“-”细胞。
通过比较用对感兴趣的细胞标志物特异的荧光标记抗体染色的细胞群的细胞的中值荧光强度或平均荧光强度(MFI)与用具有无关特异性但具有相同同种型、相同荧光探针且来源于相同物种的荧光标记抗体染色的相同细胞群的细胞的荧光强度(FI)(称为同种型对照)，来测定该感兴趣的细胞标志物的表达水平。对该标志物特异的荧光标记抗体染色的群体中的细胞，以及显示与用同种型对照染色的细胞相比具有相等MFI或更低MFI的细胞，被认为不表达该标志物，并被命名为(-)或阴性。对该标记物特异的荧光标记抗体染色的细胞群中的细胞，以及MFI值优于用同种型对照染色的细胞，被认为表达该标志物，并被命名为(+)或阳性。
本发明还涉及如本文所定义的分离的和/或基本上纯化的免疫细胞群。
因此，本发明提供了分离的和/或基本上纯化的免疫细胞群，其中所述群体的细胞包含如本文所述的CAR。
如本文所用，“分离的群体”是指从其天然环境(如外周血)中移出并分离、纯化或分开的细胞群，其不含至少约75％、80％、85％并且在某些实施方案中约90％、95％、96％、97％、98％、99％的与之天然共存在的但缺乏细胞表面标志物并基于此将该细胞分离的其它细胞。
本发明还涉及如本文定义的富集的免疫细胞群。
在一些实施方案中，本发明的分离的、纯化的和/或富集的免疫细胞群已经冷冻和解冻。
在一些实施方式中，本发明的调节性免疫细胞可以选自CD4+CD25+FoxP3+Treg、Tr1细胞、TGF-β分泌型Th3细胞、调节性NK T细胞、调节性γδT细胞、调节性CD8+T细胞和双阴性调节性T细胞。
在一些实施方案中，免疫细胞是自体细胞。
在一些实施方案中，免疫细胞是异源细胞。
在一些实施方案中，免疫细胞是同种异基因细胞。
在一些实施方案中，本发明的免疫细胞群在其细胞表面表达本发明的CAR(本文称为“第一受体”)，和结合除人CD45RC以外的另一不同配体的另一受体(本文称为“第二受体”)。在某些实施方案中，第二受体包含胞外配体结合结构域，任选地铰链结构域，至少一个跨膜结构域，和至少一个胞内信号转导结构域，例如，如本文所述。
在一些实施方式中，所述第二受体是内源性的(例如，内源性TCR)。在一些实施方案中，第二受体是外源的，并且其表达是通过转化或转导编码它的核酸在本发明的免疫细胞群中诱导的。所述外源受体可以是外源TCR或CAR。因此，在一些实施方案中，本发明的免疫细胞群表达两种CAR，其中第一种识别人CD45RC，第二种识别不同的配体。在一些实施方案中，本发明的免疫细胞群表达两种CAR，其中第一种识别人CD45RC上的第一表位，第二种识别人CD45RC上的第二种不同的表位。在一些实施方案中，本发明的免疫细胞群表达两种CAR，其中第一种识别人CD45RC，第二种识别第二种不同的抗原(例如，人CD45RC的抗原变体)。
在一些实施方式中，本发明的CAR和第二受体(例如，第二CAR)中的至少一个是可诱导的，即，其在细胞表面上的表达可以被诱导。
在一些实施方式中，本发明的CAR和第二受体(例如，第二CAR)中的至少一个的表达通过另一受体的激活来诱导。在某些实施方案中，本发明的CAR的表达通过第二受体的激活来诱导。在某些实施方案中，第二受体的表达由本发明的CAR的激活诱导。诱导型CAR在本领域中已有描述，例如Roybal等(Cell，2006)。
在一个实施方案中，本发明的CAR包含第一胞内信号转导结构域，且第二受体包含不同的第二胞内信号转导结构域。在第一个实施方案中，本发明的CAR包含T细胞初级信号转导结构域(例如，CD3ζ)，且第二受体包含共刺激信号转导结构域(例如，4-1BB、CD28或4-1BB和CD28的组合的共刺激信号转导结构域)。在第二个实施方案中，本发明的CAR包含共刺激信号转导结构域(例如，4-1BB、CD28或4-1BB和CD28的组合的共刺激信号转导结构域)，并且第二受体包含T细胞初级信号转导结构域(例如，CD3ζ)。
因此，根据这些实施方案，本发明免疫细胞群的完全活化需要本发明CAR与人CD45RC的结合以及第二受体与其所针对的配体的结合。
在一个实施方案中，由第二受体识别的配体在患病组织或器官或自身免疫反应的位点表达或存在。因此，当所述配体存在并被免疫细胞群细胞上的第二受体识别时，对表达人CD45RC的细胞的抑制活性将仅在患病组织或器官或自身免疫应答的位点被诱导。
在一个实施方案中，本发明的嵌合受体还包含胞外配体结合结构域，其识别与嵌合受体识别的人CD45RC不同的配体。在一个实施方案中，所述配体结合结构域是抗体或其抗原结合片段。
在一个实施方案中，本发明的嵌合受体包含胞外配体结合结构域，其包含人CD45RC结合结构域和识别与所述人CD45RC不同的配体的另一配体结合结构域。在一个实施方案中，所述配体结合结构域是识别人CD45RC和所述不同配体的双功能抗体。
本发明的另一个目的是包含表达本发明的结合hCD45RC的CAR的分离的T细胞群的组合物。
本发明的另一个目的是包含至少一种核酸的组合物，所述核酸编码分离的T细胞群表达的本发明的结合hCD45RC的CAR。
本发明的另一个目的是包含至少一种表达载体的组合物，所述表达载体包含至少一种编码分离的T细胞群表达的本发明的结合hCD45RC的CAR的核酸。
本发明的另一个目的是包含表达本发明的结合hCD45RC的CAR的分离的T细胞群以及至少一种药学上可接受的赋形剂的药物组合物。
本发明的另一个目的是包含至少一种编码分离的T细胞群表达的本发明的结合hCD45RC的CAR的核酸和至少一种药学上可接受的赋形剂的药物组合物。
本发明的另一个目的是包含至少一种表达载体和至少一种药学上可接受的赋形剂或媒介物的药物组合物，所述表达载体包含至少一种编码分离的T细胞群表达的本发明的结合hCD45RC的CAR的核酸。
术语“药学上可接受的赋形剂”包括任意和所有溶剂、分散介质、包衣、抗细菌和抗真菌剂、等渗剂和吸收延迟剂等。当施用于动物，优选人时，所述赋形剂不产生不利的、过敏的或其他不良反应。对于人体施用，制剂应符合监管局(例如FDA局或EMA)所要求的无菌性、热原性以及一般安全性和纯度标准。
可用于这些组合物中的药学上可接受的赋形剂包括但不限于离子交换剂、氧化铝、硬脂酸铝、卵磷脂、血清蛋白如人血清白蛋白、缓冲物质如磷酸盐、甘氨酸、山梨酸、山梨酸钾、饱和植物脂肪酸的部分甘油酯混合物、水、盐或电解质如硫酸鱼精蛋白、磷酸氢二钠、磷酸氢钾、氯化钠、锌盐、胶体二氧化硅、三硅酸镁、聚乙烯吡咯烷酮、基于纤维素的物质(例如羧甲基纤维素钠)、聚乙二醇、聚丙烯酸酯、蜡、聚乙烯-聚氧丙烯-嵌段聚合物、聚乙二醇和羊毛脂。
在一个实施方案中，本发明的药物组合物包含对于能够被注射至受试者的制剂而言是药学上可接受的媒介物。这些尤其可以是等渗的无菌盐溶液(磷酸一钠或磷酸二钠，氯化钠、氯化钾、氯化钙或氯化镁等，或此类盐的混合物)，或干燥的尤其是冻干的组合物，其根据情况添加无菌水或生理盐水后可配制可注射溶液。
本发明的另一个目的是包含表达本发明的结合hCD45RC的CAR的分离的T细胞群的药物。
本发明的另一个目的是包含至少一种编码分离的T细胞群表达的本发明的结合hCD45RC的CAR的核酸的药物。
本发明的另一个目的是包含至少一种表达载体的药物，所述表达载体包含至少一种编码分离的T细胞群表达的本发明的结合hCD45RC的CAR的核酸。
本发明进一步涉及通过施用本发明的表达CAR的分离的T细胞群、组合物、药物组合物或药物，在有此需要的受试者中诱导免疫耐受的方法。它还涉及本发明的表达CAR的分离的T细胞群、组合物或药物组合物，用于在有此需要的受试者中诱导免疫耐受。
如本文所用，术语“免疫耐受”涉及免疫系统对具有引发免疫应答的能力的特定物质或组织的无应答状态，而同时保持针对其它物质或组织的免疫应答。
如本文所用，术语“免疫应答”包括T细胞介导的和/或B细胞介导的免疫应答。示例性的免疫应答包括但不限于T细胞应答(例如细胞因子产生和细胞毒性)，以及由T细胞激活间接影响的免疫应答(例如，巨噬细胞)。参与免疫应答的免疫细胞包括淋巴细胞(例如B细胞和T细胞，包括CD4+、CD8+、Th1和Th2细胞)、抗原呈递细胞(例如专职抗原呈递细胞，如树突细胞)、自然杀伤细胞、骨髓细胞(例如巨噬细胞、嗜酸性粒细胞、肥大细胞、嗜碱性粒细胞和粒细胞)。
本发明进一步涉及通过施用本发明的表达CAR的分离的T细胞群、组合物或药物组合物，在有此需要的受试者中耗减CD45RC高细胞的方法。它还涉及本发明的表达CAR的分离的T细胞群、组合物或药物组合物，用于在有此需要的受试者中耗减CD45RC高细胞。
使用细胞计数法(cytometry)测量hCD45RC的相对表达水平。可以区分三种类型的细胞：呈现高、中间或阴性水平的hCD45RC表达的细胞。
在一个实施方案中，本发明的表达CAR的分离的T细胞群、组合物或药物组合物耗减了CD45RC高细胞。
“CD45RC高细胞抗原”或“CD45RC高细胞表面标志物”
如本文所用，术语“CD45RC高细胞抗原”或“CD45RC高细胞表面标志物”是指序列SEQID NO:23的抗原(或表位)，其在(包括T细胞、B细胞和自然杀伤(NK)细胞)的表面表达或展示，所述CD45RC高细胞可被与其结合的抗CD45RC剂(如抗体或适体)靶向。示例性CD45RC高T细胞表面标志物包括但不限于如前所述的CD45RC或表征所述T细胞群的其他抗原。与哺乳动物的其它非CD45RC高T细胞相比，特别感兴趣的CD45RC高T细胞表面标志物优先在CD45RC高T细胞上表达。
然后，在产生如上所述针对CD45RC细胞表面标志物的抗体后，本领域技术人员可容易地选择那些作用于CD45RC高细胞的，且可用于在抗体直接结合后通过抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)、补体依赖性细胞毒性(CDC)或诱导CD45RC高而非CD45RC低/-细胞死亡(例如，通过凋亡)来耗减CD45RC高细胞的抗体(Picarda等，2017.JCI Insight.2(3):e90088)。
如上文所定义，“CD45RC高T细胞”是高水平表达CD45RC标志物的T细胞。本领域技术人员容易理解，耗减CD45RC高T细胞的本发明的表达CAR的分离的T细胞群、组合物或药物组合物也可能能够耗减其他类型的CD45RC高细胞，例如CD45RC高NK细胞或CD45RC高B细胞。
如本文所用，对于表达CD45RC的细胞，术语“耗减”是指受试者中细胞数量的可测量的减少。所述减少可以是至少约10％，例如至少约20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或更多。在一些实施方案中，此术语是指受试者或样品中的CD45RC高细胞数量减少至低于可检测限的量。根据本发明，表达CAR的分离的T细胞群、组合物、药物组合物特异性地介导强烈表达CD45RC的效应细胞(尤其是设计为CD45RC高Teff的那些)的耗减。
特别地，本发明的所述表达CAR的分离的T细胞群、组合物、药物组合物通过结合hCD45RC并转导促凋亡信号和/或通过激活抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)、补体依赖性细胞毒性(CDC)和/或抗体依赖性吞噬作用来耗减CD45RC高T细胞。
在一些实施方案中，本发明的表达CAR的分离的T细胞群、组合物、药物组合物介导补体依赖性细胞毒性。
在一个具体的实施方案中，本发明的分离的CAR可以与细胞毒性剂或生长抑制剂结合。
本发明进一步涉及通过施用本发明的表达CAR的分离的T细胞群、组合物、药物组合物，在有此需要的受试者中扩增和/或增强调节性T细胞的方法。它还涉及本发明的表达CAR的分离的T细胞群、组合物、药物组合物，用于在有此需要的受试者中扩增和/或增强调节性T细胞。
如本文所用，术语“扩增”是指转变和/或扩大给定细胞群(例如免疫细胞如Treg)的过程。细胞群的扩增可以在体内、体外或离体发生。
如本文所用，术语“增强”是指提高给定细胞群的功能(例如提高Treg细胞的抑制能力)的过程。细胞群的增强可以在体内、体外或离体发生。
“调节性T细胞”或“Treg”是抑制异常或过度免疫应答并在免疫耐受中起作用的T细胞。Treg通常是“叉头盒P3(Foxp3+)调节性T细胞”和/或“CD45RC低/-细胞”。
如本文所用，术语“叉头盒P3(Foxp3+)调节性T细胞”和“CD45RC低/-细胞”是指在人和啮齿动物中表征性标志物为转录因子Foxp3的0.1-10％的CD4+和/或CD8+T细胞。
在一个实施方案中，所述方法和用途是用于扩增和/或增强Foxp3+和/或CD45RC低/-Treg。
在一个实施方案中，通过刺激扩增CD45RC低/-Treg。在一个实施方案中，在IL-2和IL-15的存在下通过刺激来扩增CD45RC低/-Treg。在一个实施方案中，通过用抗CD3/抗CD28抗体和/或同种异基因的抗原呈递细胞(APC)和/或特异性抗原进行刺激，来扩增CD45RC低/-Treg。
另外或可替换地，本发明涉及纯化CD45RC低/-Treg的体外或离体方法。
在一个实施方案中，CD45RC低/-Treg是CD8+/CD4+T细胞。在一个实施方案中，CD45RC低/-Treg是CD8+/CD4-T细胞。在一个实施方案中，CD45RC低/-Treg是CD8-/CD4+T细胞。
在一个实施方案中，可以在施用给有此需要的受试者之前、同时或之后进一步扩增和/或增强纯化的CD45RC低/-Treg。
本发明进一步涉及通过向有此需要的受试者施用本发明的表达CAR的分离的T细胞群、组合物、药物组合物来预防和/或减少移植排斥的方法。它还涉及本发明的表达CAR的分离的T细胞群、组合物、药物组合物，用于预防和/或减少有此需要的受试者中的移植排斥。
术语“预防移植排斥”和“减少移植排斥”意在涵盖预防或抑制免疫移植排斥，以及延迟免疫移植排斥的发作或进展。此术语还意在涵盖延长移植物在受试者中的存活或逆转受试者中移植物的失败。此外，此术语意在涵盖改善免疫移植排斥的症状，包括例如改善与免疫排斥相关的免疫并发症，例如间质纤维化、慢性移植性动脉硬化或血管炎。
术语“移植”及其变形是指将移植物(transplant或graft)插入接受者，无论移植是同基因的(syngeneic，供体和接受者在基因上相同)、同种异基因的(allogeneic，供体和接受者具有不同的遗传来源但属于同一物种)或异种的(xenogeneic，供体和接受者来自不同物种)。因此，在典型情况下，宿主是人，且移植物是来源于相同或不同遗传来源的人的同种移植物(isograft)。在另一种情况下，移植物来源于与其移植到的物种不同的物种，包括来自系统发育学上距离大的物种的动物，例如，将狒狒心脏移植到人类宿主中。
如本文所用，术语“移植排斥”涵盖急性和慢性移植排斥两者。
“急性排斥”是当移植的组织在免疫学上是外来的时，组织移植物接受者的免疫系统产生的排斥。急性排斥的特征在于接受者的免疫细胞对移植组织的浸润，其执行其效应子功能并破坏移植组织。急性排斥的发作迅速，且通常发生在人体移植手术后几周内。通常，可以用雷帕霉素、环孢菌素、抗CD40L单克隆抗体等免疫抑制药物抑制或压制急性排斥。
“慢性排斥”通常发生在人体植入后数月至数年之内，即使在成功免疫抑制了急性排斥的情况下。纤维化是所有类型器官移植物的慢性排斥中的常见因素。
在一个实施方案中，移植排斥是同种异基因移植排斥。因此，在一个实施方案中，移植物的供体是人。移植物的供体可以是活体供体或已故供体，即尸体供体。
在一个实施方案中，移植物是器官、组织或细胞。
如本文所用，术语“器官”是指在生物体内执行特定功能或功能组的实体血管化器官。术语器官包括但不限于心脏、肺、肾、肝、胰腺、皮肤、子宫、骨骼、软骨、小肠或大肠、膀胱、脑、乳腺、血管、食管、输卵管、胆囊、卵巢、胰腺、前列腺、胎盘、脊髓、包括上肢和下肢在内的肢体、脾脏、胃、睾丸、胸腺、甲状腺、气管、输尿管、尿道、子宫。
如本文所用，术语“组织”是指人或动物中任意类型的组织，且包括但不限于血管组织、皮肤组织、肝组织、胰腺组织、神经组织、泌尿生殖组织、胃肠道组织、包括骨骼和软骨在内的骨骼组织、脂肪组织、包括腱和韧带在内的结缔组织、羊膜组织、绒毛膜组织、硬脑膜、心包、肌肉组织、腺体组织、面部组织、眼组织。
如本文所用，术语“细胞”是指富集感兴趣的细胞的组合物，优选包含至少30％，优选至少50％，甚至更优选至少65％的所述细胞的组合物。
在一个实施方案中，“细胞”选自包含以下或由其组成的组：来源于骨髓、外周血或脐带血的专潜能(multipotent)造血干细胞；或多能(pluripotent)(即胚胎干细胞[ES]或诱导多能干细胞[iPS])或不同细胞谱系的专潜能干细胞衍生的分化细胞，包括但不限于心肌细胞、β-胰腺细胞、肝细胞、神经元等。
在一个实施方案中，其中移植是同种异基因造血干细胞移植(HSCT)，“细胞”选自包含以下或由以下组成的组：专潜能造血干细胞，通常来源于骨髓、外周血或脐带血。
“HSCT”或“造血干细胞移植”是可以治疗患有白血病和淋巴瘤(包括但不限于急性髓性白血病(AML)、急性淋巴性白血病(ALL)、慢性髓性白血病(CML)、骨髓增生异常综合征(MDS)、骨髓增生综合征、霍奇金淋巴瘤、非霍奇金淋巴瘤、慢性淋巴性白血病(CLL)和多发性骨髓瘤)的患者的移植疗法。然而，同种异基因HSCT的一个重要局限是移植物抗宿主病(GVHD)的发展，其以严重形式发生在约30-50％接受这种疗法的人中。
因此，在一个实施方案中，本发明的表达CAR的分离的T细胞群、组合物、药物组合物用于预防和/或降低GVHD。
在进一步的实施方案中，本发明的表达CAR的分离的T细胞群、组合物、药物组合物可以与专潜能造血干细胞组合使用，以预防和/或治疗白血病和/或淋巴瘤(包括但不限于急性髓性白血病(AML)、急性淋巴性白血病(ALL)、慢性髓性白血病(CML)、骨髓增生异常综合征(MDS)、骨髓增生综合征、霍奇金淋巴瘤、非霍奇金淋巴瘤、慢性淋巴性白血病(CLL)和多发性骨髓瘤)。
另外或可选择地，本发明的表达CAR的分离的T细胞群、组合物、药物组合物可以用于移植物工程化。
在一个实施方案中，在移植前用本发明的表达CAR的分离的T细胞群、组合物、药物组合物处理待移植的移植物，以耗减CD45RC高细胞。
在优选的实施方案中，移植物是骨髓，并且在移植前用本发明的表达CAR的分离的T细胞群、组合物、药物组合物对其进行处理，以耗减CD45RC高T细胞。在一个实施方案中，骨髓包含含有CD45RC高T细胞和CD45RC低/-细胞的CD34+细胞。
本发明进一步涉及通过向有此需要的受试者施用本发明的表达CAR的分离的T细胞群、组合物、药物组合物来预防、减少和/或治疗与hCD45RC高相关的疾病、病症或病况的方法。它还涉及本发明的表达CAR的分离的T细胞群、组合物、药物组合物，其用于预防和/或治疗与hCD45RC高相关的疾病、病症或病况。
如本文所用，术语“与hCD45RC高相关的疾病、病症或病况”是指由受试者中表达hCD45RC细胞的细胞比例增加和/或由受试者细胞中hCD45RC的表达水平增加而引起或潜在的疾病、病症或病况。
“受试者中CD45RC高细胞的比例增加”意指与参照(例如基本上健康的受试者中的hCD45RC高细胞的数量)相比，给定受试者中表达CD45RC的细胞(例如CD45RC高细胞)的数量增加约5％，优选约10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、60％、70％、80％、90％、100％或更多。
“受试者细胞中hCD45RC表达水平增加”意指与参照(例如基本上健康的受试者中的hCD45RC表达水平)相比，给定受试者的细胞中hCD45RC表达水平(无论mRNA水平或蛋白水平)增加约5％，优选约10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、60％、70％、80％、90％、100％或更多。
在一个实施方案中，与hCD45RC高相关的疾病、病症或病况选自包含以下或由其组成的组：自身免疫疾病、不希望的免疫应答、单基因疾病和淋巴瘤或癌症。
在一个实施方案中，与hCD45RC高相关的疾病、病症或病况选自包含以下或由其组成的组：自身免疫疾病、不希望的免疫应答和单基因疾病。
如本文所用，术语“自身免疫疾病”是指其中免疫系统针对作为正常宿主一部分的抗原(即自身抗原)产生免疫应答(例如，B细胞或T细胞应答)，随之对组织造成损害的疾病。在自身免疫疾病中，宿主的免疫系统无法将特定抗原识别为“自身”，并且针对表达该抗原的宿主组织发起免疫反应。
本发明中涉及的示例性自身免疫疾病包括但不限于类风湿性关节炎，青少年少关节炎(juvenile oligoarthritis)，胶原诱导性关节炎(collagen-induced arthritis)，佐剂诱导性关节炎(adjuvant-induced arthritis)，干燥综合征，多发性硬化，实验性自身免疫性脑脊髓炎，炎性肠疾病(包括克罗恩氏病和溃疡性结肠炎)，自身免疫性胃萎缩(autoimmune gastric atrophy)，寻常型天疱疮，银屑病，白癜风，1型糖尿病，非肥胖型糖尿病，重症肌无力，格雷夫斯病(Grave’s disease)，桥本甲状腺炎(Hashimoto’sthyroiditis)，硬化性胆管炎，硬化性涎腺炎(sclerosing sialadenitis)，系统性红斑狼疮，自身免疫性血小板减少性紫癜(autoimmune thrombocytopenia purpura)，肺出血肾炎综合征(Goodpasture’s syndrome)，艾迪生氏病(Addison’s disease)，全身性硬化，多发性肌炎，皮肌炎，获得性血友病，血栓性血小板减少性紫癜(thrombotic thrombocytopenicpurpura)，葡萄膜炎，IgG4相关自身免疫疾病(例如，Kleger等,2015.Dtsch ArzteblInt.112(8):128-135的表1中列出的疾病，该表通过引用并入本文)等。
在一个优选的实施方案中，自身免疫疾病是系统性红斑狼疮。
在一个优选的实施方案中，自身免疫疾病是炎性肠疾病，包括克罗恩氏病和溃疡性结肠炎。在一个优选的实施方案中，自身免疫疾病是克罗恩氏病。在一个优选的实施方案中，自身免疫疾病是溃疡性结肠炎。
如本文所用，术语“不希望的免疫应答”是指任意不想要的免疫反应，优选针对以下的任意不想要的免疫反应：(i)基因疗法过程中表达的蛋白，(ii)基因疗法过程中使用的载体(例如病毒载体)和/或(iii)治疗性蛋白。这样的蛋白包括例如因子VIII(血友病A)和其他凝血因子、酶替代疗法、单克隆抗体(例如那他珠单抗(natalizumab)、利妥昔单抗(rituximab)、英夫利昔单抗(infliximab))、多克隆抗体、酶和细胞因子(例如IFNβ)。术语“不希望的免疫应答”还指过敏和过敏反应。
在一个实施方案中，可将本发明的表达CAR的分离的T细胞群、组合物、药物组合物施用给受试者，以抑制免疫应答，尤其是防止针对特定蛋白的免疫反应(当其表达通过基因疗法在具有相应遗传缺陷的那些受试者中恢复时)。因此，本发明的表达CAR的分离的T细胞群、组合物、药物组合物可用于预防针对通常由于突变在受试者中不存在同时通过基因疗法实现其重新形成(reconstitution)的蛋白的免疫反应性。此外，蛋白疗法是一个正变得越来越广泛的医学创新领域，并且涉及将例如酶、抗体或细胞因子的蛋白作为治疗性产品直接应用于受试者。递送此类药物的主要障碍之一涉及针对治疗性蛋白本身的免疫应答。基于蛋白的治疗剂的施用通常伴随着施用免疫抑制剂，其用于促进蛋白的寿命增长，并因此增加生物体的细胞和组织对蛋白的摄取。然而，一般的免疫抑制剂由于其所实施的免疫抑制的非特异性性质而可能是不利的，从而导致患者中不想要的副作用。因此，这种方法可用于抑制针对治疗性蛋白和肽的免疫应答，所述治疗性蛋白和肽例如治疗性抗体、细胞因子、酶或施用给患者的任意其他蛋白。
在一个实施方案中，可以将本发明的表达CAR的分离的T细胞群、组合物、药物组合物施用给受试者，以抑制免疫应答，尤其是防止针对基因疗法中使用的载体的免疫反应，尤其是基因疗法中使用的病毒载体。这样的病毒载体包括例如腺相关病毒(AAV)载体、腺病毒(Ad)载体、慢病毒载体等。关于综述，参见Nayak&Herzog,2010.Gene Ther.17(3):295-304。
如本文所用，术语“过敏反应”或“过敏”是指免疫系统的不恰当反应。过敏反应针对称为过敏原的通常无害的环境物质而发生；这些反应是获得性的，可预测的和快速的。严格来说，过敏是四种超敏反应形式之一，并称为I型(或速发型(immediate))超敏反应。它的特征在于通过称为IgE的一种抗体类型过度激活称为肥大细胞的某些白细胞和嗜碱性粒细胞，从而导致极端炎症反应。常见的过敏反应包括湿疹、荨麻疹、花粉症、哮喘、食物过敏以及对刺针昆虫(stinging insect)如黄蜂和蜜蜂的毒液的反应。
如本文所用，术语“单基因疾病”是指由选自以下基因的单个基因中的突变引起的疾病：
(i)与免疫功能无关但其缺乏与炎症和/或免疫反应有关的基因，例如在以下疾病中缺乏的基因：杜氏肌营养不良症(DMD)、囊性纤维化、溶酶体疾病和α1-抗胰蛋白酶缺乏；和
(ii)与免疫系统有关且其缺乏会引起炎症和/或自身免疫反应的基因，例如在以下疾病中缺乏的基因：T细胞原发性免疫缺陷，例如IPEX(immunodysregulationpolyendocrinopathy enteropathy X-linked syndrome，免疫失调多内分泌病肠病X连锁综合征)，APECED(autoimmune polyendocrinopathy-candidiasis-ectodermaldystrophy，自身免疫性多内分泌病-念珠菌病-表皮营养不良)，B细胞原发性免疫缺陷，穆-韦综合征(Muckle-Wells syndrome)，自身炎症和自身免疫混合综合征(mixedautoinflammatory and autoimmune syndrome)，NLRP12相关的遗传性周期性发热综合征(NLRP12-associated hereditary periodic fever syndrome)以及与肿瘤坏死因子受体1相关的周期性综合征(tumor necrosis factor receptor 1associated periodicsyndrome)。
在一个优选的实施方案中，自身免疫疾病是APECED(自身免疫性多内分泌病-念珠菌病-表皮营养不良)。
在一个优选的实施方案中，自身免疫疾病是杜氏肌营养不良症(DMD)。
如本文所用，术语“淋巴瘤或癌症”涵盖与CD45RC高细胞相关的淋巴瘤或癌症。与CD45RC高细胞相关的示例性淋巴瘤或癌症包括但不限于急性髓性白血病(AML)、急性淋巴性白血病(ALL)、慢性髓性白血病(CML)、骨髓增生异常综合征(MDS)/骨髓增生综合征、淋巴瘤(例如，霍奇金淋巴瘤和非霍奇金淋巴瘤)、慢性淋巴性白血病(CLL)和多发性骨髓瘤。
因此，本发明涉及通过施用本发明的表达CAR的分离的T细胞群、组合物、药物组合物，在有此需要的受试者中耗减CD45RC高细胞，从而扩增和/或增强调节性T细胞，优选Foxp3+和/或CD45RC低Treg，从而预防和/或减少移植排斥；或预防、减少和/或治疗与hCD45RC高相关的疾病、病症或病况的方法。
在一个优选的实施方案中，与hCD45RC高相关的疾病、病症或病况是系统性红斑狼疮、炎性肠疾病(包括克罗恩氏病和溃疡性结肠炎)、APECED(自身免疫性多内分泌病-念珠菌病-表皮营养不良)或杜氏肌营养不良症(DMD)。
在一个优选的实施方案中，与hCD45RC高相关的疾病、病症或病况是系统性红斑狼疮、炎性肠疾病(包括克罗恩氏病和溃疡性结肠炎)或APECED(自身免疫性多内分泌病-念珠菌病-表皮营养不良)。
还涉及本发明的表达CAR的分离的T细胞群、组合物、药物组合物，其用于在有此需要的受试者中耗减CD45RC高细胞，从而扩增和/或增强调节性T细胞，优选Foxp3+和/或CD45RC低Treg，从而预防和/或减少移植排斥；或预防、减少和/或治疗与hCD45R高相关的疾病、病症或病况。
本发明的CAR工程化免疫细胞可单独施用或作为本文所述的药物组合物施用(例如，与稀释剂和/或与其他组分组合，包括但不限于IL-2或其他细胞因子或细胞群)。
本发明的药物组合物可以以任何合适的方式施用于受试者，包括通过气雾剂吸入、注射、摄取、输注、植入或移植。在一些实施方案中，本文所述的药物组合物可以通过肠胃外施用而施用于受试者。在某些实施方案中，本文所述的药物组合物可以皮下、皮内、肿瘤内、结节内、髓内、肌内、胸骨内、通过静脉(i.v.)、通过输注技术或腹膜内施用给受试者。在具体实施方式中，本发明的CAR修饰的免疫细胞组合物可以通过皮内或皮下注射施用给受试者。在一些实施方案中，本发明的CAR修饰的免疫细胞组合物可以通过静脉内注射施用。在一些实施方案中，CAR修饰的免疫细胞的组合物可以直接注射到淋巴结、感染部位、炎症部位或组织或器官排斥部位。在一些实施方案中，CAR修饰的免疫细胞的组合物可直接注射到自身免疫性和/或炎性疾病的部位。
在一些实施方案中，向受试者施用(或将要施用)自体细胞。
在一些实施方案中，受试者被施用(或将要施用)同种异基因细胞。
在一些实施方案中，受试者可以是哺乳动物。在特定的实施方案中，所述受试者可以是人。
本发明的药物组合物可以以适合于待预防或治疗的疾病的方式施用。施用的量和频率将由诸如受试者的状况和受试者疾病的类型和严重性的因素决定，尽管适当的剂量可以通过临床试验来确定。
当指示“有效量”或“治疗量”时，待施用的本发明组合物的精确量可考虑受试者的年龄、体重、抗体滴度和状况的个体差异来确定。一般可以说，包含本文所述的CAR工程化免疫细胞的药物组合物可以以至少1×102、1×103、1×104、1×105、1×106、1×107、1×108或1×109细胞/kg体重或1×105至100×105细胞/kg体重的剂量施用，包括那些范围内的所有整数值。CAR工程化免疫细胞组合物还可以以这些剂量中的任何剂量或其任何组合施用多次。CAR工程化免疫细胞可以通过使用免疫疗法中通常已知的输注技术施用。通过监测受试者的疾病症状并相应地调整治疗，可以容易地确定特定受试者的最佳剂量和治疗方案。
在一个实施方案中，本发明的表达CAR的分离的免疫细胞群、组合物或药物组合物在治疗药物之前、同时或之后施用。
在一些实施方案中，本发明的CAR工程化免疫细胞可与任何数量的相关治疗模式联合(例如，之前、同时或之后)施用给受试者，所述治疗模式包括但不限于用药剂例如免疫抑制剂、细胞毒素、化疗剂、细胞因子、免疫刺激物、裂解肽和放射性同位素治疗。
本领域技术人员将理解，本发明的表达CAR的分离的T细胞群、组合物、药物组合物与特定治疗药物(可选自本文中所述的那些但不限于此)的共同施用将取决于要预防和/或治疗的疾病或病况。
免疫抑制剂的实例包括但不限于mTOR抑制剂，例如西罗莫司(sirolimus)、依维莫司(everolimus)、雷达莫司(ridaforolimus)、替西罗莫司(temsirolimus)、尤米莫司(umirolimus)和佐他莫司(zotarolimus)；IL-1受体拮抗剂，例如阿那白滞素(anakinra)；抗代谢物，例如硫唑嘌呤(azathioprine)、来氟米特(leflunomide)、甲氨蝶呤、麦考酚酸(mycophenolic acid)和特立氟胺；IMiD，例如阿普斯特(apremilast)、来那度胺(lenalidomide)、泊马度胺(pomalidomide)和沙利度胺；和抗体，例如艾库珠单抗(eculizumab)、阿达木单抗(adalimumab)、阿非利木单抗(afelimomab)、培化赛托珠单抗(certolizumab pegol)、戈利木单抗(golimumab)、英夫利昔单抗(infliximab)、奈立莫单抗(nerelimomab)、美吡珠单抗(mepolizumab)、奥马珠单抗(omalizumab)、法拉莫单抗(faralimomab)、艾西莫单抗(elsilimomab)、利勃珠单抗(lebrikizumab)、奥斯克单抗(ustekinumab)、塞库单抗(secukinumab)、莫洛单抗-CD3(muromonab-CD3)、奥立昔单抗(otelixizumab)、替普珠单抗(teplizumab)、维西珠单抗(visilizumab)、克立昔单抗(clenoliximab)、克利昔单抗(keliximab)、扎那利木单抗(zanolimumab)、依法珠单抗(efalizumab)、埃立珠单抗(erlizumab)、奥奴珠单抗(obinutuzumab)、利妥昔单抗(rituximab)、奥瑞珠单抗(ocrelizumab)、帕卡珠单抗(pascolizumab)、戈米西单抗(gomiliximab)、鲁利西单抗(lumiliximab)、替利昔单抗(teneliximab)、托拉利珠单抗(toralizumab)、阿塞利珠单抗(aselizumab)、加利昔单抗(galiximab)、加维利莫单抗(gavilimomab)、卢利珠单抗(ruplizumab)、贝利珠单抗(belimumab)、布利莫德(blisibimod)、伊利木单抗(ipilimumab)、曲美木单抗(tremelimumab)、伯特利木单抗(bertilimumab)、来立木单抗(lerdelimumab)、美特木单抗(metelimumab)、那他珠单抗(natalizumab)、妥利珠单抗(tocilizumab,)、奥利木单抗(odulimomab)、巴利昔单抗(basiliximab)、达西珠单抗(daclizumab)、伊利莫单抗(inolimomab)、阿佐莫单抗(zolimomab aritox)、阿托利木单抗(atorolimumab)、赛地珠单抗(cedelizumab)、芬特妥珠单抗(fontolizumab)、马司莫单抗(maslimomab)、莫洛莫单抗(morolimumab)、培昔单抗(pexelizumab)、利昔单抗(reslizumab)、罗维珠单抗(rovelizumab)、西普利单抗(siplizumab)、塔利单抗(talizumab)、telimomab aritox、伐昔单抗(vapaliximab)、维帕莫单抗(vepalimomab)、阿巴西普(abatacept)、贝拉西普(belatacept)、依那西普(etanercept)、培那西普(pegsunercept)、阿柏西普(aflibercept)、阿法西普(alefacept)和利洛那西普(rilonacept)。
细胞毒素的实例包括但不限于放射性核素(例如35S、14C、32P、125I、131I、90Y、89Zr、201T1、186Re、188Re、57Cu、213Bi和211At)、缀合的放射性核素和化学治疗剂。细胞毒素的其他实例包括但不限于抗代谢物(例如5-氟尿嘧啶(5-FU)、甲氨蝶呤(MTX)、氟达拉滨等)，抗微管剂(anti-microtubule agent)(例如长春新碱、长春碱、秋水仙碱、紫杉烷类(例如紫杉醇和多西紫杉醇(docetaxel))等)，烷化剂(例如环磷酰胺、美法仑、双氯乙基硝基脲(bischloroethylnitrosurea，BCNU)等)，铂剂(例如顺铂(也称为cDDP)、卡铂、奥沙利铂(oxaliplatin)、JM-216、CI-973等)，蒽环类药物(例如多柔比星、柔红霉素等)，抗生素剂(例如丝裂霉素C)，拓扑异构酶抑制剂(例如依托泊苷(etoposide)、替诺泊苷和喜树碱)，或其他细胞毒性剂，例如蓖麻毒素、白喉毒素(DT)、假单胞菌外毒素(Pseudomonas exotoxin，PE)A、PE40、相思豆毒蛋白、皂草素(saporin)、美洲商陆病毒蛋白(pokeweed viralprotein)、溴化乙锭、糖皮质激素、炭疽毒素等。
化学治疗剂的实例包括但不限于铂配位化合物(例如顺铂、卡铂或奥沙利铂)；紫杉烷类化合物(例如紫杉醇或多西紫杉醇)；拓扑异构酶I抑制剂(例如伊立替康或拓扑替康(topotecan))；拓扑异构酶II抑制剂(例如依托泊苷或替尼泊苷(teniposide))；长春花生物碱(例如长春碱、长春新碱或长春瑞滨)；抗肿瘤核苷衍生物(例如5-氟尿嘧啶、吉西他滨或卡培他滨(capecitabine))；烷化剂(例如氮芥或亚硝基脲、环磷酰胺、苯丁酸氮芥、卡莫司汀或洛莫斯汀；抗肿瘤蒽环类衍生物(例如柔红霉素、多柔比星、伊达比星或米托蒽醌)；抗-HER2抗体(例如曲妥珠单抗(trastuzumab))；雌激素受体拮抗剂或选择性雌激素受体调节剂(例如他莫昔芬(tamoxifen)、托瑞米芬(toremifene)、屈洛昔芬(droloxifene)、氟维斯群(faslodex)或雷洛昔芬(raloxifene))；芳香酶抑制剂(例如依西美坦(exemestane)、阿那曲唑(anastrozole)、来曲唑(letrazole)或伏洛唑(vorozole))；分化剂(differentiating agent)(例如类维生素A、维生素D和视黄酸代谢阻断剂[RAMBA]如异维甲酸(accutane))；DNA甲基转移酶抑制剂(例如氮杂胞苷(azacytidine))；激酶抑制剂(例如flavoperidol、甲磺酸伊马替尼(imatinib mesylate)或吉非替尼(gefitinib))；法尼基转移酶(farnesyltransferase)抑制剂；和HDAC抑制剂。
细胞因子的实例包括但不限于趋化因子(例如CCL1、CCL2/MCP1、CCL3/MIP1α、CCL4/MIP1β、CCL5/RANTES、CCL6、CCL7、CCL8、CCL9、CCL11、CCL12、CCL13、CCL14、CCL15、CCL16、CCL17、CCL18/PARC/DCCK1/AMAC1/MIP4、CCL19、CCL20、CCL21、CCL22、CCL23、CCL24、CCL25、CCL26、CCL27、CCL28、CXCL1/KC、CXCL2、CXCL3、CXCL4、CXCL5、CXCL6、CXCL7、CXCL8/IL8、CXCL9、CXCL10、CXCL11、CXCL12、CXCL13、CXCL14、CXCL15、CXCL16、CXCL17、CX3CL1、XCL1和XCL2)，肿瘤坏死因子(例如TNFA、淋巴毒素(Lymphotoxin)、TNFSF4、TNFSF5/CD40LG、TNFSF6、TNFSF7、TNFSF8、TNFSF9、TNFSF10、TNFSF11、TNFSF13、TNFSF13B和EDA)和白介素(例如IL-1α、IL-1β、IL-1Ra、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-9、IL-10、IL-11、IL-12、IL-13、IL-14、IL-15、IL-16、IL-17、IL-18、IL-19、IL-20、IL-21、IL-22、IL-23、IL-24、IL-25、IL-26、IL-27、IL-28、IL-29、IL-30、IL-31、IL-32、IL-33、IL-34、IL-35、IL-36α、IL-36β、IL-36γ、IL-36Ra、IL-37、IL-38、IFNα、IFNβ、IFNκ、IFNω和GM-CSF)。
免疫刺激剂的实例包括但不限于非格司亭(filgrastim)、聚乙二醇非格司亭(pegfilgrastim)、来格司亭(lenograstim)、莫拉司亭(molgramostim)、沙格司亭(sargramostim)、安西司亭(ancestim)、albinterferon、干扰素α、聚乙二醇干扰素α(peginterferon alfa)、干扰素β、聚乙二醇干扰素β、干扰素γ、阿地白介素(aldesleukin)、奥普瑞白介素(oprelvekin)、生长激素、免疫花青(immunocyanin)、培加酶(pegademase)、催乳素(prolactin)、他索纳明(tasonermin)、组胺二盐酸盐、聚ICLC、维生素D、香菇多糖(lentinan)、普乐沙福(plerixafor)、罗喹美克(roquinimex)、米伐木肽(mifamurtide)、醋酸格拉替雷、胸腺五肽、胸腺素α1、胸腺九肽(thymulin)、聚肌苷酸:聚胞苷酸(polyinosinic:polycytidylic acid)、匹多莫德(pidotimod)、卡介苗(BacillusCalmette–Guérin vaccine)、黑色素瘤疫苗和西普鲁塞-T疫苗(sipuleucel-T vaccine)。
裂解肽的实例包括但不限于毒素(例如，白喉毒素或假单胞菌外毒素)。
放射性同位素的实例包括但不限于以下的放射性核素：锝(例如Tc-99和Tc-97)、钾(例如K-40)、铷(例如Rb-82)、碘(例如I-123、I-124、I-125、I-129、I-131)、铯(例如Cs-135、Cs-137)、钴(例如Co-60)、钯(例如Pd-103、Pd-107)、镉(例如Cd-113)、锶(例如Sr-89、Sr-90)、铕(例如Eu-55)、锡(例如Sn-121、Sn-126)、磷(例如P-32、P-33)、铊(例如Tl-201)、铟(例如In-111)、镓(例如Ga-67、Ga-68)、钇(例如Y-90)、铱(例如Ir-192)、铋(例如Bi-213)、镭(例如Ra-223、Ra-225)和钌(例如Ru-106)。
本发明的CAR工程化免疫细胞可在免疫抑制剂之前、之后或与免疫抑制剂同时施用给受试者。
本发明的CAR工程化免疫细胞和/或免疫抑制剂可以在移植后施用于受试者。可选地，或另外，本发明的CAR工程化免疫细胞和/或免疫抑制剂可以在移植之前施用于受试者。在一些实施方式中，本发明的CAR工程化免疫细胞和/或免疫抑制剂可以在移植手术期间施用于受试者。
在一些实施方案中，一旦免疫抑制疗法已经开始，就进行CAR工程化免疫细胞向受试者的施用。
在一些实施方案中，所述方法进行多于一次，例如，随时间监测移植接受者，并且如果适用，在不同的免疫抑制治疗方案中。
在一些实施方案中，如果预测移植接受者对移植耐受，则减少免疫抑制疗法。在一些实施方案中，如果预测移植接受者对移植耐受，则不开具免疫抑制疗法处方，例如停止免疫抑制疗法。
本发明的CAR工程化免疫细胞可以在诊断移植器官或组织排斥之后施用，随后施用本发明的CAR工程化免疫细胞和免疫抑制剂两者，直到器官或组织排斥的症状消退。
在另一个实施方案中，本发明的CAR工程化免疫细胞组合物可以与骨髓移植联合(例如，之前、同时或之后)施用于受试者。
在一些实施方式中，本发明的CAR工程化免疫细胞可在B细胞消融疗法(例如与CD20反应的试剂，例如利妥昔单抗)后施用。例如，在一些实施方案中，受试者可经历高剂量化疗的标准治疗，随后进行外周血干细胞移植。在某些实施方案中，在移植后，受试者可以接受本发明的扩增的CAR工程化免疫细胞的输注。在某些实施方案中，可以在手术之前或之后施用扩增的CAR工程化免疫细胞。
在一些实施方案中，受试者(例如人)接受本发明的免疫细胞或细胞群的初始施用，和一次或多次后续施用，其中所述一次或多次后续施用是在前次施用后少于15天，例如14、13、12、11、10、9、8、7、6、5、4、3或2天施用。
在一些实施方案中，将治疗有效量的本发明的免疫细胞施用或将要施用给受试者。
在一些实施方案中，向受试者施用的本发明的免疫细胞群的免疫细胞的数量是至少102、103、104、105、106、107、108或109个细胞。
在一些实施方案中，施用给受试者的本发明的免疫细胞群的免疫细胞的数量在约102至约109个、约103至约108个、约104至约107个或约105至约106个细胞的范围内。
在一些实施方案中，施用给受试者的本发明的免疫细胞群的免疫细胞的数量在约102至约109个、约102至108个、约102至107个、约102至106个、约102至105个、约102至104个或约102至103个细胞的范围内。在一些实施方案中，施用于受试者的本发明的免疫细胞群的免疫细胞的数量为约102、约103、约104、约105、约106、约107、约108或约109个细胞。
在一些实施方案中，向受试者施用的本发明的免疫细胞群的免疫细胞的数量是至少102、103、104、105、106、107、108或109细胞/kg体重。
在一些实施方式中，向受试者施用的本发明的免疫细胞群的免疫细胞的数量在约102至109个细胞/kg体重或103至108个细胞/kg体重的范围内，包括在所述范围内的所有整数值。
在一些实施方案中，受试者每周接受多于1次本发明的免疫细胞群的施用，例如每周向受试者施用2、3或4次本发明的免疫细胞群施用。
在一些实施方案中，免疫细胞群与活性剂组合施用至有需要的受试者。根据一些实施方案，免疫细胞群在施用活性剂之前、同时或之后施用。
在一些实施方案中，可能期望将本发明的活化的免疫细胞施用于受试者，然后重抽血液(或进行单采血液成分术)，根据本发明活化来自其的免疫细胞，并用这些活化和扩增的免疫细胞重输注受试者。该过程可以每几个星期进行多次。在某些实施方案中，免疫细胞可以从10cc至400cc的抽血中激活。在某些实施方案中、免疫细胞从20cc、30cc、40cc、50cc、60cc、70cc、80cc、90cc或100cc的抽血中激活。不受理论束缚，使用这种多次抽血/多次重输注方案可以用于选出某些免疫细胞群。
应理解，本文所述的CAR、细胞群和组合物可用于本文所述的治疗方法，可用作本文所述的药物，可用于本文所述的治疗，和/或可用于制备本文所述的治疗用药物。
从说明书中显而易见，本发明的CAR，或包含在所述CAR中的抗体或抗原结合片段，或工程化以表达所述CAR的免疫细胞群，呈现许多优点。
在一个实施方案中，本发明的CAR，或包含在所述CAR中的抗体或抗原结合片段，或工程化以表达所述CAR的免疫细胞群，以约5x10-7M或更低，优选约2.5x10-7M或更低，约1x10-7M或更低，约7.5x10-8M或更低，约5x10-8M或更低，约1x10-8M或更低的平衡解离常数(Kd)结合人CD45RC。
在一个实施方案中，本发明的CAR，或包含在所述CAR中的抗体或抗原结合片段，或工程化以表达所述CAR的免疫细胞群，具有针对CD45RC高细胞的细胞毒性活性。
在一个实施方案中，在结合至其靶抗原后，本发明的CAR诱导CAR转导的细胞活化。
在一个实施方案中，在结合至其靶抗原后，本发明的CAR诱导了转导CAR的T细胞的活化。在一个实施方案中，在结合至其靶抗原后，本发明的CAR诱导了转导CAR的Treg的活化。在一个实施方案中，在结合其靶抗原后，本发明的CAR诱导了转导CAR的CD4+Treg的活化。在另一个实施方案中，在结合其靶抗原后，本发明的CAR诱导了转导CAR的CD8+Treg的活化。
在一个实施方案中，工程化以表达本发明的所述CAR的免疫细胞群具有针对靶细胞(例如CD45RC+T细胞)的促凋亡活性。
在一个实施方案中，工程化以表达本发明的所述CAR的免疫细胞群是CD4+Treg群，并且所述转导CAR的CD4+Treg具有针对靶细胞(例如CD45RC+T细胞)的促凋亡活性。在一个实施方案中，工程化以表达本发明的所述CAR的免疫细胞群是CD8+Treg群，并且所述转导CAR的CD8+Treg具有针对靶细胞(例如CD45RC+T细胞)的促凋亡活性。
在一个实施方案中，本发明的CAR，或包含在所述CAR中的抗体或抗原结合片段，或工程化以表达所述CAR的免疫细胞群，降低或消除了移植排斥(例如，皮肤移植排斥)和GVHD。
附图简要说明
图1A1(1)-B(2)显示了人血中不同白细胞类型上的CD45RC表达水平(通过ABIS-45RC或市售MT2抗体检测)。用ABIS-45RC或MT2对来自健康志愿者的全血(EDTA)中的不同细胞类型进行染色。然后将红细胞裂解(Versalyse，Beckman Coulter)，其后进行细胞分析仪分析(Navios，Beckman Coulter)。首先在形态上(双细胞(doublet cell)和活细胞)对细胞进行门控。(A(1)到A(3))在不同白细胞类型上分析的来自三名健康志愿者的一名的通过ABIS-45RC或MT2检测的CD45RC表达的代表性点图分析。ABIS-45RC显示在左小图，而MT2在右小图。x轴显示了对所示的每种白细胞类型进行标记的细胞谱系标志物的荧光强度；y轴代表抗CD45RC抗体标记的荧光强度。水平线定义具有高、中/低和负水平的CD45RC表达的细胞，如左上点图所示，且数字代表每个类别中细胞的百分比。(B(1)和B(2))在标记有ABIS-45RC(B(1))或MT2(B(2))的三个供体的不同白细胞类型上的CD45RC高、CD45RC低和CD45RC-的平均表达+/-SEM。
图2显示，ABIS-45RC和市售的抗CD45RC MT2抗体两者竞争相同的表位。从健康志愿者的血液中分离出PBMC，并用抗CD3标记的Mab、用嵌合的ABIS-45RC(所示浓度)和抗CD45RC(小鼠克隆MT2)-FITC(以1.33mg/mL标记)来标记T细胞。使用生物素驴抗人IgG+Strepta PerCP-Cy 5.5二抗显示ABIS-45RC反应性。上排点图窗口中的数字代表被两种抗体共同标记的细胞的百分比。
图3A-F显示，与市售抗CD45RC MT2相比，ABIS-45RC诱导的细胞毒性更高。将来自健康志愿者(n＝3)的PBMC于37℃下与培养基、同种型阴性对照(2.5或10mg/mL)、ABIS-CD45RC(2.5或10mg/mL)或作为阳性对照的地塞米松(10mg/mL)一同温育所示时间点，然后用抗CD3-FITC小鼠抗体标记细胞，凋亡细胞用膜联蛋白-V-PE(Annexin-V-PE)标记。(A-E)图表明所示细胞群中膜联蛋白V+细胞的百分比。(F)膜联蛋白V+(早期凋亡)和DAPI+(晚期凋亡)细胞的代表性点图。数字表示每个类别中细胞的百分比。
图4A-C显示了ABIS-45RC在免疫人源化NSG免疫缺陷小鼠中治疗GVHD的用途。(A)实验程序显示，将来自健康供体志愿者的外周血单核细胞(PBMC)静脉内(iv)输入(第0天)到先前(第-1天)亚致死量(2Gy)辐射的NSG免疫缺陷小鼠中。将ABIS-45RC在第0天到第20天之间以所示方案腹膜内(ip)施用。同种型对照为人IgG(IVIg制剂)，并使用与ABIS-45RC相同的方案施用。(B-C)使用Kaplan-Meier分析法分析NSG小鼠的存活曲线和统计数据(*p<0.01，**p<0.001)。
图5A-J是流式细胞术点图的组合，显示了在两种浓度(左小图为2μg/mL，右小图为1μg/mL)下，人源化ABIS-45RC抗体变体和鼠ABIS-45RC抗体对人T细胞的反应性。(A)人源化ABIS-45RC变体A；(B)人源化ABIS-45RC变体B；(C)人源化ABIS-45RC变体C；(D)人源化ABIS-45RC变体D；(E)人源化ABIS-45RC变体E；(F)人源化ABIS-45RC变体F；(G)人源化ABIS-45RC变体G；(H)人源化ABIS-45RC变体H；(I)人源化ABIS-45RC变体I；(J)鼠ABIS-45RC。
图6显示了流式细胞术的两个点图，其显示ABIS-45RC(左小图)和工程化Asn/PheABIS-45RC(右小图)对人T细胞的反应谱相同。
图7A-C显示了来自三名健康志愿者的人血中CD3+白细胞上的CD45RC表达水平。首先在形态上(双细胞(doublet cell)和活细胞)对细胞进行门控。(A)来自所分析的三名健康志愿者中的一名的通过鼠ABIS-45RC检测的CD45RC表达的代表性点图分析；(B)来自所分析的三名健康志愿者中的一名的通过人源化ABIS-45RC变体A1检测CD45RC表达的代表性点图分析；(C)来自所分析的三名健康志愿者中的一名的通过人源化ABIS-45RC变体A3检测的CD45RC表达的代表性点图分析。x轴显示FSC；y轴代表抗CD45RC抗体标记的荧光强度。正方形定义具有高、中/低和负水平的CD45RC表达的细胞，如所示，且数字代表每个类别中细胞的百分比。
图8A-B显示了由ABIS-45RC或人源化变体A1和A3诱导的凋亡是相当的。将来自健康志愿者的PBMC于37℃下与同种型阴性对照(10μg/mL)、鼠ABIS-CD45RC(10μg/mL)、人源化变体A1(10μg/mL)或人源化变体A3(10μg/mL)一同温育所示时间点，然后用抗CD3和抗CD45RA抗体标记细胞，凋亡细胞用膜联蛋白-V-PE(Annexin-V-PE)标记。图表明，与同种型对照条件相比的CD3+CD45RAhi细胞(A)和CD3-细胞(B)的凋亡倍数。
图9显示了用抗人CD45RC治疗的所治疗的人源化小鼠的皮肤移植物存活。用鼠ABIS-45RC或人源化变体A1以及雷帕霉素(Rapa)处理转移了全人PBMC以诱导人皮肤排斥的NSG小鼠。结果以皮肤移植物存活评分表示。
图10描述了CAR结构和CD45RC-CAR的示例性结构的示意图。CAR包含胞外结构域(例如scFv CD45RC)，任选地铰链结构域(例如来源于CD8a)，跨膜(TM)结构域(例如来源于CD8)、共刺激胞内结构域(例如来源于CD28)和初级信号转导结构域(例如来源于CD3ζ)。在同一质粒中，GFP编码序列可任选地紧接CD45RC-CAR序列的3'，两者之间通过T2A自剪接序列分隔(未画出)。因此，GFP可用作CAR-CD45RC表达的替代标志物。
图11显示转染3天后，用编码CD45RC-CAR和GFP的质粒转染的HEK(人胚肾293细胞)细胞表达GFP(左图)。作为转染的阳性对照，HEK细胞用仅编码GFP的质粒转染(右图)。
图12显示与未转导的Jurkat细胞相比，培养6天后，Jurkat细胞可用编码CD45RC-CAR和GFP的慢病毒载体转导。
图13显示Jurkat细胞在细胞表面表达转导的CD45RC-CAR如蛋白L染色所示)，并且CAR的表达与GFP的表达相关。
图14显示用CD45RC-CAR慢病毒载体转导的Jurkat细胞可在人T细胞中诱导凋亡。在不同细胞比例条件下，将人T细胞与用CD45RC-CAR或Ctrl-CAR(具有不同抗原特异性的对照CAR)转导的Jurkat细胞一起培养。培养18小时后通过流式细胞术评价细胞凋亡。用于产生CAR的抗CD45RC单克隆抗体(嵌合人IgG1)用作阳性对照，人非反应性IgG1用作同种型对照，表达识别在该测定中未表达的靶的CAR的Ctrl-CAR Jurkat和非转导的Jurkat细胞用作阴性对照。
图15显示用CD45RC-CAR慢病毒载体转导的Jurkat细胞在与人T细胞接触后可被激活。在不同细胞比例条件下，将人T细胞与用CD45RC-CAR(基于GFP的表达分选或不分选)或Ctrl-CAR转导的Jurkat细胞一起培养。培养18小时后，通过流式细胞术评估CD69(T细胞活化的标志物)的平均荧光强度(MFI)。将经分选或未分选的Ctrl-CAR Jurkat和未转导的Jurkat用作阴性对照。
图16描述了CD45RC-CAR与CD45RC靶的结合。HEK 293T未转导或用CD45RC-CAR慢病毒载体转导，并培养5天。然后将细胞与生物素化的CD45R-ABC蛋白一起温育，然后用链霉亲和素-APC-Cy7染色，并通过流式细胞术分析。
图17A-B显示用CD45RC-CAR慢病毒载体转导的CD4+Treg的扩增。在第0天和第1天之间激活CD4+Treg，然后在第1天和第2天用CD45RC-CAR转导两次。第7天分选GFP+细胞。在扩增7或14天后，分析CD45RC-CAR CD4+Treg的GFP表达：(A)在第7天和第14天CD45RC-CAR转导的CD4+Treg中GFP表达的代表性直方图和点图；(B)在第7天和第14天表达CD45RC-CAR的细胞的百分比。
图18显示CD45RC-CAR CD4+Treg通过CAR被特异性激活。将扩增14天的CD45RC-CARCD4+Treg和Ctrl-CAR CD4+Treg与包被的CD45R-ABC蛋白培养24小时，最后4小时存在布雷菲德菌素A，然后通过流式细胞术分析活化标志物。每种标志物的MFI都以与未刺激细胞的比率表示。
图19A-C显示CD45RC-CARCD4+Treg通过凋亡诱导CD45RC高T细胞的细胞死亡。对以不同比例与同种异基因CD4+Treg以及抗CD45RC mAb(ABIS-45RC，10mg/mL)一起温育4h然后用膜联蛋白V和DAPI染色的PBMC进行凋亡分析，所述同种异基因CD4+Treg用CD45RC-CAR(平均60％ GFP+转导细胞)或Ctrl-CAR(＞90％ LNGFR+转导细胞)转导或者是非转导的CD4+Treg。结果表示为(A)T细胞、(B)CD45RC低/negT细胞、(C)CD45RC高T细胞中膜联蛋白V+细胞的相对比例。灰色菱形分离点代表在抗CD45RC mAb存在下的凋亡。
实施例
通过以下实施例进一步说明本发明。
以下命名适用于整个实施例中：
“ABIS-45RC”：本发明的鼠抗hCD45RC抗体，其包含：
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“抗45RC变体A”：ABIS-45RC的人源化变体，其包含：
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“抗45RC变体B”：ABIS-45RC的人源化变体，其包含：
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“抗45RC变体C”：ABIS-45RC的人源化变体，其包含：
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“抗45RC变体A4”：ABIS-45RC的人源化变体，其包含：
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“抗45RC变体A5”：ABIS-45RC的人源化变体，其包含：
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“抗45RC变体A6”：ABIS-45RC的人源化变体，其包含：
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“抗45RC变体A7”：ABIS-45RC的人源化变体，其包含：
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“抗45RC变体A8”：ABIS-45RC的人源化变体，其包含：
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“抗45RC变体A9”：ABIS-45RC的人源化变体，其包含：
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“抗45RC变体A10”：ABIS-45RC的人源化变体，其包含：
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“抗45RC变体D1”：ABIS-45RC的人源化变体，其包含：
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“抗45RC变体I1”：ABIS-45RC的人源化变体，其包含：
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“抗45RC变体I2”：ABIS-45RC的人源化变体，其包含：
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“MT2”：鼠抗hCD45RC抗体，可商购自OriGene，Ref.AM39022PU-N。
“工程化Asn/Phe ABIS-45RC”：鼠ABIS-45RC，通过在CDR1中插入一个残基并在FR3中取代一个残基工程化其LCVR而将其嵌合化(如实施例8中所述)。工程化Asn/Phe ABIS-45RC包含：
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-SEQ ID NO:71的轻链可变区，其中X12为Asn(N)；和
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“工程化Ser/Phe ABIS-45RC”：鼠ABIS-45RC，通过在CDR1中插入一个残基并在FR3中取代一个残基工程化其LCVR而将其嵌合化(如实施例8中所述)。工程化Ser/Phe ABIS-45RC包含：
-SEQ ID NO:61的重链可变区；
-SEQ ID NO:93的重链恒定区；
-SEQ ID NO:71的轻链可变区，其中X12为Ser(S)；和
-SEQ ID NO:94的轻链恒定区。
“工程化Gly/Phe ABIS-45RC”：鼠ABIS-45RC，通过在CDR1中插入一个残基并在FR3中取代一个残基工程化其LCVR而将其嵌合化(如实施例8中所述)。工程化Gly/Phe ABIS-45RC包含：
-SEQ ID NO:61的重链可变区；
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-SEQ ID NO:71的轻链可变区，其中X12为Gly(G)；和
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“嵌合的N50A ABIS-45RC”：鼠ABIS-45RC的嵌合变体，其包含鼠ABIS-45RC重链和人源化轻链。嵌合的N50A ABIS-45RC包含：
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“嵌合的S52A ABIS-45RC”：鼠ABIS-45RC的嵌合变体，其包含鼠ABIS-45RC重链和人源化轻链。嵌合的S52A ABIS-45RC包含：
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“嵌合的N50X ABIS-45RC”：鼠ABIS-45RC的嵌合变体，其包含鼠ABIS-45RC重链和人源化轻链。嵌合的N50X ABIS-45RC包含：
-SEQ ID NO:61的重链可变区；
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-SEQ ID NO:129的轻链可变区，其中X13是除Ala(A)或Asn(N)以外的任意氨基酸；和
-SEQ ID NO:92的轻链恒定区。
实施例1：ABIS-45RC的反应性
材料与方法
PBMC染色和数据获取
用合适的单克隆抗体(Ab)的组合对50μL或100μL新鲜EDTA全血进行染色，然后进行红细胞裂解(versalyse，Beckman Coulter)。洗涤后，在Navios流式细胞分析仪上分析细胞，并使用Kaluza软件(Beckman Coulter，Marseille，法国)和FlowJo软件(Tree StarInc)分析数据。
抗体和流式细胞术
表6：用于流式细胞术分析的抗体。对于左栏中的每种抗体，所使用的克隆在右栏中给出。
Figure BDA0003952383070002151
Figure BDA0003952383070002161
结果
作为首次筛选，ABIS-45RC对使用市售抗CD45RC mAb MT2克隆分选的CD45RC-细胞无反应，这表明ABIS-45RC可识别CD45RC(数据未显示)。
为了进一步表征ABIS-45RC，发明人分析了其与人PBMC的反应性。
如图1A和B所示，T CD4+和T CD8+细胞的一部分是ABIS-45RC高，而其余的是ABIS-45RC低或ABIS-45RC-。大多数B细胞和NK细胞以及pDC是ABIS-45RC高。大多数NKT、iNKT MAIT、ILC2、ILC3和大多数CD14intCD16+单核细胞是ABIS-45RC高或ABIS-45RC低。CD14高CD16-单核细胞、mDC、嗜碱性粒细胞和嗜中性粒细胞主要是ABIS-45RC-。CD4+Treg和CD8+Foxp3+Treg主要是ABIS-45RC低/-。
对主要PBMC群的分析显示，ABIS-45RC具有与市售抗CD45RC小鼠MT2抗体相当的反应谱(图1和Picarda等,2017.JCI Insight.2(3):e90088)。
实施例2：ABIS-45RC与市售抗CD45RC抗体“MT2”的比较
材料与方法
PBMC的分离
收集健康志愿者的血液，并通过Ficoll梯度离心分离外周血单核细胞(PBMC)，所述Ficoll梯度离心能够去除血液产物中不想要的部分，例如粒细胞、血小板和剩余的红细胞污染物。
抗体和流式细胞术
使用ABIS-45RC抗体(以所示浓度)、抗CD3抗体和抗CD45RC(小鼠克隆MT2，Biolegend)-FITC(以1.33mg/mL标记)来标记人PBMC。使用生物素驴抗人IgG+链霉亲和素PerCP-Cy 5.5二抗显示ABIS-45RC反应性。
使用Canto II细胞分析仪(BD Biosciences)测量荧光强度，并使用FLOWJO软件(Tree Star Inc.)分析数据。首先在其形态上对细胞进行门控，并通过选择DAPI阴性细胞排除死细胞。
细胞毒性分析
将人PBMC与37℃培养基、同种型对照抗体(Ms IgG1，克隆107.3，10μg/ml)、2.5或10μg/ml的ABIS-45RC或抗CD45RC(小鼠克隆MT2)温育10分钟至18小时。然后，用抗CD3(克隆SK7，BD Biosciences)、膜联蛋白-V和DAPI染色细胞。通过流式细胞术对T细胞或非T细胞中的膜联蛋白V+和DAPI+细胞进行门控，来获得凋亡百分比。
结果
ABIS-45RC和市售抗CD45RC MT2抗体两者竞争相同的表位
如图2所示，与市售抗CD45RC MT2克隆的共同标记表明，两种抗体竞争并因此识别人CD45RC的相同或邻近表位。
与市售抗CD45RC相比，ABIS-45RC诱导的细胞毒性更高
如图3所示，ABIS-45RC对T细胞具有细胞毒性，但对非T细胞没有细胞毒性。此外，T细胞的细胞毒性与CD45RC表达水平直接相关，并且重要的是，与10μg/mL的MT2克隆相比，2.5μg/mL的ABIS-45RC表现更好。
实施例3：ABIS-45RC的亲和力
材料与方法
简而言之，使用Mem-PER膜分离试剂盒(Thermo-fisher)溶解在质粒转染后表达CD45RC的1x107个CD45RC高PBMC或CHO细胞。将ABIS-45RC固定在生物芯片CM5上，并在25℃下温育细胞膜，以使用单周期动力学和无标定浓度分析法在BIAcore 3000和BIAcore T200上测量亲和常数。
结果
通过表面等离子体共振(SPR，一种用于表征抗体-抗原相互作用的技术)对CD45RC抗体的亲和力进行测量，并显示亲和力(KD)为5x10-8 M，Kon为2.91x105 M-1.sec.-1，且Koff为1.44x10-2 sec-1。
实施例4：用ABIS-45RC治疗移植物抗宿主病(GVHD)
材料与方法
PBMC的分离
在法国血液中心(
Figure BDA0003952383070002182
Figure BDA0003952383070002181
du Sang，Nantes，法国)从健康个体采集血液。根据机构指南提供了书面知情同意书。通过Ficoll-Paque密度-梯度离心(Eurobio，Courtateauf，法国)分离PBMC。用低渗溶液和离心去除剩余的红细胞和血小板。
动物
将8至12周龄的NOD/SCID/IL2Rγ-/-(NSG)小鼠以SPF条件饲养在我们自己的动物设施中(认证号C44-278)。
GVHD模型
对成年NSG免疫缺陷小鼠进行全身亚致死辐射(第-1天的辐射剂量为2Gy)，以诱导组织中有利于GVHD发展的损伤。次日(第0天)，将来自健康志愿者的1.5x107个PBMC(包括CD45RC高和CD45RC低/-T细胞)静脉注射到这些小鼠中。人PBMC，且尤其是T细胞，对小鼠组织有反应并攻击这些小鼠组织，诱导损伤。这些T细胞以及在肝、肠、肺和皮肤中观察到的损伤模拟了以啮齿动物为供体和接受者的人体或其他GVHD实验系统中在骨髓移植后观察到的GVHD。特别地，这些组织损伤通常会引起体重减轻，取决于注射的PBMC数量以及在我们的实验系统中，所述体重减轻开始于注射PBMC后的约第13天。每天监测体重减轻，且当体重降至原始体重的20％时处死动物，以避免不必要的痛苦。
处理
从第0天开始并在20天内每2.5天，用纯化的ABIS-45RC、MT2抗CD45RC抗体或无关对照(临床上使用的IVIg制剂，包含人纯化的IgG并主要含有IgG1抗体)以0.8mg/kg腹膜内处理NSG小鼠。
从第0天到第10天，用ABIS-45RC或对照抗体处理的NSG小鼠还腹膜内接受次优剂量0.4mg/天的雷帕霉素。
实验过程概述在图4A中。
结果
用PBMC处理仅引起体重减轻，开始于约第14天，并且如图4所示，所有小鼠在第33天前死亡(中位存活期：11天(图4B)至15天(图4C))。
用对照抗体和雷帕霉素处理仅延长存活期，但没有达到统计学显著性(中位存活期：21天(图4C))。
用MT2处理可显著延长小鼠存活期(中位存活期：19天(图4B))，而用ABIS-45RC处理可显著提高小鼠存活期的这种延长至72天(中位存活期：35天(图4B))。
最后，ABIS-45RC与雷帕霉素的联合施用完全防止了因GVHD导致的死亡(100％存活，图4C)。
实施例5：ABIS-45RC的人源化
通过将CDR移植到人种系抗体序列中来进行ABIS-45RC的人源化设计。通过将来自LCVR的三个CDR(SEQ ID NO:15、16和17)移植到与ABIS-45RC的LCVR尽可能同源的人种系LCVR中，来对ABIS-45RC进行人源化。类似地，将来自HCVR的三个CDR(SEQ ID NO:1、4和3)移植到与ABIS-45RC的HCVR尽可能同源的人种系HCVR中。
另外，将所选人种系可变区的框架区(FR)中的一些氨基酸残基改变为存在于鼠可变区的氨基酸残基(所谓回复突变)。基于有关免疫球蛋白可变区结构的信息，并在ABIS-45RC的Fv的同源分子模型的指导下，将FR中的这些残基鉴定为或在维持CDR正确构象或在HCVR/LCVR包装中起关键作用，并因此将它们保留在第一个人源化版本(版本A)中，或者如果可能的话，在后续的人源化版本(版本B和C)中用其人种系对应物取代。在同源性分子模型的指导下，在版本B和C中，当判断为可能时，CDR残基也用其人类种系对应物取代。
同源性模型构建
根据已建立的方案(Ramos,2012.Methods Mol Biol.907:39-55)构建ABIS-45RC模型。
轻链
在本节中，除非另有说明，否则氨基酸编号基于SEQ ID NO:81。
使用LCVR的框架残基以通过蛋白BLAST搜索已解析的抗体结构的序列。命中最高的有Protein Data Bank(PDB)ID：4NCC(
Figure BDA0003952383070002201
分辨率)，其在89个FR残基中有83个与ABIS-45RC LCVR的那些相同，89个FR残基中有85个类似于ABIS-45RC LCVR的那些；以及PDB ID：1QOK(
Figure BDA0003952383070002202
分辨率)，其在87个框架残基中有83个与ABIS-45RC LCVR的那些相同，87个框架残基中有84个类似于ABIS-45RC LCVR的那些。
这两个结构的序列均不同于ABIS-45RC的LCVR的序列(SEQ ID NO:81)，具有T9A、T39P、R44K、N49S和P54A取代。此外，PDB ID：4NCC在序列上与ABIS-45RC的LCVR不同，具有L95F、A99G和L105I取代。
两种结构的比较显示出高度同源性。然而，碳链在区域A13-E17和E104-K106中采用略微不同的构象。
基于后续CDR搜索的结果以及两个N末端残基的存在，选择PDB ID：4NCC的结构的LCVR作为LCVR框架模板，并参考PDB ID：1QOK选择L105I的旋转异构构象(在PyMol中)。
随后，使用在每个末端添加有两个残基的ABIS-45RC LCVR的CDR1、CDR2和CDR3序列，以通过蛋白BLAST搜索已解析的抗体结构的序列。
对于CDR1，最高命中由具有9个残基中9个相同的一组序列组成。其中包括PDB ID：4NCC和PDB ID：1QOK。因此，采用PDB ID：4NCC结构作为CDR1的模板。
对于CDR2，最高命中由具有7个残基中6个相同的一组序列组成。其中仍包括PDBID：4NCC和PDB ID：1QOK。因此，仍采用PDB ID：4NCC结构作为CDR2的模板。
对于CDR3，最高命中(不含空位)是PDB ID：1QOK，具有13个残基中13个相同。然而，PDB ID：4NCC紧随其后，具有13个残基中12个相同。两种结构的比较显示出基本相同的构象，除了L95F取代之外。因此，采用PDB ID：4NCC结构作为CDR3的模板，并且参考PDB ID：1QOK选择L95F的旋转异构构象(PyMol中)。
因此，没有必要将任何CDR模板都拟合到LCVR框架模板，因为选择了PDB ID：4NCC作为所有LCVR的CDR的基础模板。
最后，为了匹配ABIS-45RC LCVR序列，手动对LCVR局部模型进行在8个位置处的诱变(PyMol中)，并选择最佳旋转异构体。
重链
在本节中，除非另有说明，否则氨基酸编号基于SEQ ID NO:61。
接下来，使用HCVR的框架残基以通过蛋白BLAST搜索已解析的抗体结构的序列。最高命中是PDB ID：3OPZ(
Figure BDA0003952383070002211
分辨率)，其在90个框架残基中有84个与ABIS-45RC HCVR的那些相同，在90个框架残基中有85个类似于ABIS-45RC HCVR的那些。
由于PDB ID：3OPZ缺少N末端残基，并且解析的分辨率相当差，因此还调查了具有最高同一性/相似性评分的其他命中。其中最高的有PDB ID：4CAD(
Figure BDA0003952383070002212
分辨率)，其在91个框架残基中有78个与ABIS-45RC HCVR的那些相同，在91个框架残基中有87个类似于ABIS-45RC HCVR的那些；以及PDB ID：1RUR(
Figure BDA0003952383070002213
分辨率)，其在91个框架残基中有75个与ABIS-45RC HCVR的那些相同，在91个框架残基中有87个类似于ABIS-45RC HCVR的那些相似。
PDB ID：3OPZ和PDB ID：4CAD结构的比较显示出高度的同源性，其中主要差异是可选的残基旋转异构体。
PDB ID：3OPZ和PDB ID：1RUR结构的比较同样显示出高度同源性；然而，VH-FR2环L45-G49相对于PDB ID：3OPZ和PDB ID：4CAD结构有显著的构象变化。
此外，基于序列，预测ABIS-45RC的HCVR和PDB ID：4CAD由于位置6上存在谷氨酰胺，会表现出N末端链5-12的Honegger III型(Honegger&Plückthun,2001.J Mol Biol.309(3):687-99)构象。但是，预测PDB ID：1RUR由于位置6上存在谷氨酸，会表现出Honegger I型构象。然而，三个结构表现出相同的5-12链构象。并且，预测ABIS-45RC的HCVR、PDB ID：4CAD和PDB ID：1RUR的序列会采用K-形式(K-form，纽结的碱基构象)，其由修订的对HCVR的CDR3的Shirai规则定义(Kuroda等,2008.Proteins.73(3):608-20)。
基于后续CDR搜索的结果、较高的整体序列相似性、与PDB ID：3OPZ的结构一致性以及较高的实验分辨率，选择结构PDB ID：1RUR的HCVR作为HCVR框架模板；但是，使用45-49末端上的两个残基的N和C末端悬突在HCVR模板中用PDB ID：4CAD(具有与PDB ID：3OPZ相同的构象)的45-49环取代PDB ID：1RUR中的，以将环模板片段锚定到框架模板上。
随后，使用在每个末端添加了两个残基的HCVR的CDR1、CDR2和CDR3序列，以通过蛋白BLAST搜索已解析的抗体结构的序列。
对于CDR1，存在具有12个残基中9个相同的一组序列命中。其中包括PDB ID：1RUR。因此，选择PDB ID：1RUR结构作为CDR1的模板。
对于CDR2，最高命中是PDB ID：3NTC(
Figure BDA0003952383070002221
分辨率)，其在12个残基中有8个与ABIS-45RC的HCVR的那些相同，在12个残基中有9个类似于ABIS-45RC的HCVR的那些。而PDBID：1RUR紧随其后，其在12个残基中有7个与ABIS-45RC的HCVR的那些相同，在12个残基中有9个类似于ABIS-45RC的HCVR的那些。两种结构的比较显示出基本相同的构象，且PDB ID：3NTC的同一性较高是由于为BLAST搜索目的而向CDR2序列添加的2个C末端残基。因此，优选PDB ID：1RUR结构优选作为CDR2的模板。
对于CDR3，两个最高命中(不含空位)是PDB ID：1NGY(
Figure BDA0003952383070002222
分辨率)和PDB ID：1NGZ(
Figure BDA0003952383070002231
分辨率)，两者均在11个残基中有8个与ABIS-45RC的HCVR的那些相同，在11个残基中有9个类似于ABIS-45RC的HCVR的那些相似。两种结构的比较显示出显著不同的主链构象。不受理论的束缚，发明人假设这种差异可能是由于位置101上的残基所致。在PDB ID：1NGY中，较大的甲硫氨酸不能采用PDB ID：1NGZ的较小丝氨酸的朝向(将其侧链导向蛋白核心)。由于匹配ABIS-45RC的HCVR序列的期望取代是F101，因此采用PDB ID：1NGY结构作为CDR3的模板。接下来，为了完成HCVR局部模型，使用其末端的两个残基悬突将CDR3模板移植到修饰的PDB ID：1RUR HCVR模板上，以将CDR模板片段锚定在框架模板上(在PyMol中)。
最后，为了匹配ABIS-45RC的HCVR序列，手动对HCVR局部模型在23个位置进行诱变(PyMol中)，并选择最佳旋转异构体。
最终模型组装
随后，选择HCVR和LCVR局部模型的最佳三级排列来组装最终模型。HCVR和LCVR模板序列已提交给堆叠角度预测服务器(Packing Angle Prediction Server，PAPS)(Abhinandan&Martin,2010.Protein Eng Des Sel.23(9):689-97)，以寻找所预测的最佳拟合三级结构。PAPS服务器预测，已解析的抗体结构PDB ID：1MNU，相对堆叠角度为-45.6°，将提供HCVR和LCVR的最佳三级排列。因此，通过将HCVR和LCVR局部模型的保守锚区段的骨架坐标拟合到PDB ID：1MNU来组装最终模型(PyMol中)。
最后，采用具有GROMOS96力场(Scott等,1999.J Phys Chem A.103(19):3596-3607)的GROMACS(Van der Spoel等,2005.J Comput Chem.26(16):1701-18)对这个最终模型的坐标进行一轮能量最小化。
人种系
为了设计ABIS-45RC的HCVR和LCVR的CDR移植版本，选择了三个人种系两次：
-用于HCVR的IGHV1-2*01、IGHV5-51*01和IGHV3-11*05；和
-用于LCVR的IGKV1-9*01、IGKV6-21*02和IGKV3-11*01。
人源化HCVR和LCVR的设计
HCVR和LCVR的人源化版本A都是明确地最小化和/或避免了CDR残基改变的保守版本。因此，预测这些版本作为融合到人恒定区[SEQ ID NO:91和92])的嵌合抗体(ABIS-45RC的HCVR[SEQ ID NO:61]和LCVR[SEQ ID NO:81]将提供相似或更好的结合和/或效力活性。
HCVR和LCVR两者的人源化版本B经设计而与最接近的人种系的序列同一性百分比达到至少85％。这可以通过种系化(即用相应的人种系残基取代小鼠残基)FR和/或CDR氨基酸残基来实现。需要85％的截断百分比同一性，以获得表示“人源化”的亚词干-zu-，命名根据2014年世界卫生组织(WHO)关于抗体国际非专有名称(INN)的指南。
HCVR和LCVR两者的人源化版本C经设计而达到最大程度的人化(即与相应人种系的序列同一性程度最高)。在检查同源分子模型后，已鉴定出许多残基作为种系化的候选者。因此，已经考虑了可以合理地进行种系化的所有残基。
HCVR，使用IGHV1-2*01
为了从IGHV1-2*01设计人源化HCVR版本A，将鼠CDR(SEQ ID NO:1、4和3)移植到IGHV1-2*01中，并将FR2和FR3中的4个残基回复突变为亲本鼠残基，以保持抗体的全部活性。这些残基是SEQ ID NO:61中的I48、L70、A72和V97。得到的HCVR如SEQ ID NO:62所示，并且与IGHV1-2*01人种系具有81.6％的序列同一性。
为了从IGHV1-2*01设计人源化HCVR版本B，除版本A之外，进一步对CDR2中的5个氨基酸残基进行种系化(即被相应的IGHV1-2*01人种系残基所取代)。这些残基是SEQ ID NO:61中的D56G、A58T、S60Y、N61A和K65Q。得到的HCVR如SEQ ID NO:65所示，并且与IGHV1-2*01人种系具有86.7％的序列同一性。
为了从IGHV1-2*01设计人源化HCVR版本C，除版本B之外，进一步对CDR2中的2个氨基酸残基进行种系化。这些残基是SEQ ID NO:61中的D50R和E62Q。得到的HCVR如SEQ IDNO:68所示，并且与IGHV1-2*01人种系具有88.8％的序列同一性。
从版本B开始，进一步从IGHV1-2*01设计了HCVR的多种其他人源化版本。实际上，要获得良好人源化的单克隆抗体，85％被认为是足够的(来自IGHV1-2*01的版本B与IGHV1-2*01人种系具有86.7％的序列同一性)。为了降低引入突变的风险，因此设计了版本D、E、F、G和H以达到85％而不再有其他。
从IGHV1-2*01得到的HCVR版本D、E、F、G和H分别如SEQ ID NO:101、121、122、123和124所示，并且均与IGHV1-2*01人种系具有85.7％的序列同一性。
HCVR，使用IGHV5-51*01
为了从IGHV5-51*01设计人源化HCVR版本A，将鼠CDR(SEQ ID NO:1、4和3)移植到IGHV5-51*01中，并将FR1、FR2和FR3中的6个残基回复突变为亲本鼠残基，以保持抗体的全部活性。这些残基是SEQ ID NO:61中的A24、T28、I48、L70、L83和V97。得到的HCVR如SEQ IDNO:63所示，并且与IGHV5-51*01人种系具有79.6％的序列同一性。
为了从IGHV5-51*01设计人源化HCVR版本B，除版本A之外，进一步对FR1中的1个氨基酸残基和CDR2中的6个氨基酸残基进行种系化。这些残基是SEQ ID NO:61中的A24G、D56S、A58T、S60Y、N61S、K63S和K65Q。得到的HCVR如SEQ ID NO:66所示，并且与IGHV5-51*01人种系具有86.7％的序列同一性。
为了从IGHV5-51*01设计人源化HCVR版本C，除版本B之外，进一步对FR1中的1个氨基酸残基和CDR2中的2个氨基酸残基进行种系化。这些残基是SEQ ID NO:61中的T28S、D50I和E62P。得到的HCVR如SEQ ID NO:69所示，并且与IGHV5-51*01人种系具有89.8％的序列同一性。
HCVR，使用IGHV3-11*05
为了从IGHV3-11*05设计人源化HCVR版本A，将鼠CDR(SEQ ID NO:1、4和3)移植到IGHV3-11*05中，并将FR1、FR2和FR3中的9个残基回复突变为亲本鼠残基，以保持抗体的全部活性。这些残基是SEQ ID NO:61中的Y27、T30、I48、G49、L70、A72、T74、A79和V97。得到的HCVR如SEQ ID NO:64所示，并且与IGHV3-11*05人种系具有76.5％的序列同一性。
为了从IGHV3-11*05设计人源化HCVR版本B，除版本A之外，进一步对FR1中的2个氨基酸残基、CDR2中的6个氨基酸残基和FR3中的1个氨基酸残基进行种系化。这些残基是SEQID NO:61中的Y27F、T30S、D56S、A58T、S60Y、N61A、E62D、K63S和A79L。得到的HCVR如SEQ IDNO:67所示，并且与IGHV3-11*05人种系具有89.8％的序列同一性。
为了从IGHV3-11*05设计人源化HCVR版本C，除版本B之外，进一步对FR2中的1个氨基酸残基和CDR2中的1个氨基酸残基进行种系化。这些残基是SEQ ID NO:61中的I48V和P53S。得到的HCVR如SEQ ID NO:70所示，并且与IGHV3-11*05人种系具有87.8％的序列同一性。
LCVR，使用IGKV1-9*01
为了从IGKV1-9*01设计人源化LCVR版本A，将鼠CDR(SEQ ID NO:15、16和17，其中X12不存在)移植到IGKV1-9*01中，并将FR2和FR3中的3个残基回复突变为亲本鼠残基，以保持抗体的全部活性。这些残基是SEQ ID NO:81中的F35、W46和Y70。得到的LCVR如SEQ IDNO:82所示，并且与IGKV1-9*01人种系具有83.2％的序列同一性。
为了从IGKV1-9*01设计人源化LCVR版本B，除版本A之外，进一步对CDR1中的1个氨基酸残基和FR2中的1个氨基酸残基进行种系化。这些残基是SEQ ID NO:81中的S24R和F35Y。得到的LCVR如SEQ ID NO:85所示，并且与IGKV1-9*01人种系具有85.3％的序列同一性。
为了从IGKV1-9*01设计人源化LCVR版本C，除版本B之外，进一步对CDR2中的2个氨基酸残基和FR3中的1个氨基酸残基进行种系化。这些残基是SEQ ID NO:81中的N49A、P54Q和Y70F。得到的LCVR如SEQ ID NO:88所示，并且与IGKV1-9*01人种系具有88.4％的序列同一性。
为了在CDR1中引入如在人种系IGKV1-9*01中发现的额外残基(Ser；S)，进一步从IGKV1-9*01设计了LCVR版本D。在CDR1环中引入额外的残基已显示保留了结合活性(数据未显示)。在版本B的CDR1中引入丝氨酸残基使序列同一性达到86.3％，因此为了降低引入突变的风险，设计了版本D，其中将Kabat残基L36恢复为原始的小鼠残基Phe(F)。得到的LCVR如SEQ ID NO:103所示。
LCVR，使用IGKV6-21*02
为了从IGKV6-21*02设计人源化LCVR版本A，将鼠CDR(SEQ ID NO:15、16和17，其中X12不存在)移植到IGKV6-21*02中，并将FR2和FR3中的4个残基回复突变为亲本鼠残基，以保持抗体的全部活性。这些残基是SEQ ID NO:81中的F35、W46、Y48和Y70。得到的LCVR如SEQID NO:83所示，并且与IGKV6-21*02人种系具有81.1％的序列同一性。
为了从IGKV6-21*02设计人源化LCVR版本B，除版本A之外，进一步对CDR1中的1个氨基酸残基、FR2中的1个氨基酸残基、CDR2中的1个氨基酸残基和FR3中的1个氨基酸残基进行种系化。这些残基是SEQ ID NO:81中的S24R、F35Y、L53S和Y70F。得到的LCVR如SEQ IDNO:86所示，并且与IGKV6-21*02人种系具有85.3％的序列同一性。
为了从IGKV6-21*02设计人源化LCVR版本C，除版本B之外，进一步对CDR3中的1个氨基酸残基进行种系化。这个残基是SEQ ID NO:81中的Q88H。得到的LCVR如SEQ ID NO:89所示，并且与IGKV6-21*02人种系具有86.3％的序列同一性。
LCVR，使用IGKV3-11*01
为了从IGKV3-11*01设计人源化LCVR版本A，将鼠CDR(SEQ ID NO:15、16和17，其中X12不存在)移植到IGKV3-11*01中，并将FR2和FR3中的3个残基回复突变为亲本鼠残基，以保持抗体的全部活性。这些残基是SEQ ID NO:81中的F35、W46和Y70。得到的LCVR如SEQ IDNO:84所示，并且与IGKV3-11*01人种系具有84.2％的序列同一性。
为了从IGKV3-11*01设计人源化LCVR版本B，除版本A之外，进一步对CDR1中的1个氨基酸残基进行种系化。这个残基是SEQ ID NO:81中的S24R。得到的LCVR如SEQ ID NO:87所示，并且与IGKV3-11*01人种系具有85.3％的序列同一性。
为了从IGKV3-11*01设计人源化LCVR版本C，除版本B之外，进一步对FR2中的1个氨基酸残基、CDR2中的3个氨基酸残基和FR3中的1个氨基酸残基进行种系化。这些残基是SEQID NO:81中的F35Y、L53R、P54A、S55和Y70F。得到的LCVR如SEQ ID NO:90所示，并且与IGKV3-11*01人种系具有90.5％的序列同一性。
实施例6：人源化抗45RC抗体的生产、纯化和表征
使用分析型尺寸排阻色谱法(SEC-HPLC)和差示扫描量热法(DSC)分别比较了9种人源化抗45RC变体A至I的概况和热稳定性。这些变体对应于包含实施例5中描述的“版本A”HCVR和LCVR的抗体。还使用分析型尺寸排阻色谱法(SEC-HPLC)和差示扫描量热法(DSC)分别比较了4种其他人源化抗45RC变体A1、A2、I1和I2的概况和热稳定性。
材料与方法
SEC-HPLC
使用配有Superdex 200增加型5/150GL色谱柱(GE Healthcare)的ShimadzuProminence HPLC系统。色谱柱先前已在与样品分析期间所用相同的缓冲液和条件下进行了校准(使用来自GE Healthcare的Molecular Weight SEC Calibration试剂盒，在PBS 1X中，0.25mL/min，柱温箱设置为30℃)。
在SEC分析之前，将所有样品离心(20,000g，5分钟，4℃)，并通过具有IgG分析程序的Nanodrop ND-1000分光光度计对其蛋白含量进行定量。
将等度程序设置为在18分钟内以0.25mL/min注射每个样品约15μg。在SEC分析之后，从原始数据中提取280nm色谱图，并通过峰积分进行分析。
DSC
使用MicrocalTM VP-Capillary DSC系统进行差示扫描量热实验。
在DSC分析之前，将在1x PBS缓冲液中的样品离心(20.000g，5分钟，4℃)，并通过具有IgG分析程序的Nanodrop ND-1000分光光度计对其蛋白含量进行定量。然后将样品在PBS中稀释至1mg/mL的终浓度。
预平衡时间为3分钟，并且在20至110℃之间以60℃/小时的扫描速率、25秒的过滤时间和媒介反馈(medium feedback)获得随后的热谱图。
在样品分析之前，测量5次缓冲液/缓冲液扫描以稳定仪器，并且在每次蛋白/缓冲液扫描之间进行缓冲液/缓冲液扫描。
将数据拟合到非2态解折叠模型(non-2-state unfolding model)，其中减去转换前和转换后调整的基线。以转换峰以下的面积确定量热焓(ΔH)，而从所使用的模型确定范特霍夫焓(ΔHv)。
结果
SEC-HPLC
SEC参数的概述在下表7中给出。
表7：人源化ABIS-45RC变体A-I、A1、A2，I1和I2的SEC参数。
Figure BDA0003952383070002281
Figure BDA0003952383070002291
Figure BDA0003952383070002301
RT：保留时间(分钟)
MW：分子量(kDa)
上表7以粗体显示了对应于抗CD45RC抗体的峰(峰3针对变体A至H、I1和I2的每一个；峰2针对变体I、A1和A2的每一个)，其中RT和计算的MW预期针对单体的非沉淀且非解离的抗体。
DSC
DSC参数的总结在下表8中给出。
表8：人源化ABIS-45RC变体A-I、A1、A2，I1和I2的DSC参数。抗体的变性发生在两个步骤中，因此给出两个熔解温度(melting temperature)，每个步骤一个。
Figure BDA0003952383070002302
Figure BDA0003952383070002311
Conc.：浓度，mM。
T1/2：半峰高处的转换宽度，℃。
ΔH：解折叠的量热焓，cal/M。
T起始：解折叠转换开始时的温度，℃。
Tm1：第一个步骤的变性/熔解温度，℃。
Tm2：第二个步骤的变性/熔解温度，℃。
实施例7：人源化ABIS-45RC变体A-I的反应性
材料与方法
PBMC的分离
收集健康志愿者的血液，并通过Ficoll梯度离心分离外周血单核细胞(PBMC)，所述Ficoll梯度离心能够去除血液产物中不想要的部分，例如粒细胞、血小板和剩余的红细胞污染物。
抗体和流式细胞术
用鼠ABIS-45RC抗体或人源化ABIS-45RC抗体变体A-I的每种(2μg/mL和1μg/mL)和抗CD3抗体标记人PBMC。使用生物素驴抗人IgG+链霉亲和素Per-CP-Cy 5.5二抗显示鼠和人源化ABIS-45RC抗体的反应性。
使用Canto II细胞分析仪(BD Biosciences)测量荧光强度，并使用FLOWJO软件(Tree Star Inc.)分析数据。首先通过细胞形态上对细胞进行门控，并通过选择DAPI阴性细胞来排除死细胞。
结果
ABIS-45RC和市售抗CD45RC MT2抗体两者竞争相同的表位
利用人源化ABIS-45RC抗体(变体A，图5A；变体B，图5B；变体C，图5C；变体D，图5D；变体E，图5E；变体F，图5F；变体G，图5G；变体H，图5H；变体I，图5I)或鼠ABIS-45RC(图5J)的标记显示，抗体以相似的方式识别人CD45RC。
实施例8：工程化抗体
ABIS-45RC的LCVR的CDR1具有鼠抗体特有的标准结构，其长度为10个氨基酸残基(SEQ ID NO:15，其中X12不存在，即SASSSVSYMH)。
对于实施例5中描述的LCVR的人源化版本A、B和C的设计，将这个10个氨基酸残基的CDR1移植到人种系中，其中有回复突变和/或种系化，但没有任意残基的添加或缺失。然而，在人种系中，LCVR的CDR1的最小长度为11个氨基酸残基。
因此，为了增加人源化抗体的人化，发明人已设法将ABIS-45RC VL-CDR1“SASSSVSYMH”工程化，以使其延伸一个额外残基。一个候选位置是SEQ ID NO:15中的位置8(命名为X12)，即SEQ ID NO:81中的S30和Y31之间。在用于人源化设计的所有候选种系中，这个位置被Asn(N)、Ser(S)或Gly(G)占据，而在鼠种系中，这个位置是空的。
为了研究此类插入的结构相关性和稳定性，通过插入天冬酰胺来延伸ABIS-45RCVL-CDR1，即SEQ ID NO:15，其中X12是Asn(N)，即SASSSVSNYMH。然后通过蛋白BLAST对已解析的抗体结构的序列进行搜索。最高命中是结构PDB ID：5CMA的LCVR CDR1。随后，使用其末端的两个残基的悬突将这个结构区段移植到ABIS-45RC模型上，从而将CDR模板片段锚定到模型上。观察到，为了容纳额外残基，存在构象变化，其使相邻残基移位，从而与Y70呈现轻微的空间冲突。然而，在所有人种系中，这个残基是更易容纳的苯丙氨酸。
工程化小鼠抗体
基于以上，发明人通过在VL-CDR1中插入天冬酰胺残基(Asn，N)，并将SEQ ID NO:81的Y70进一步突变为苯丙氨酸(Phe，F)，来对ABIS-RC45抗体进行工程化。得到的“工程化Asn/Phe ABIS-RC45”LCVR如SEQ ID NO:71所示，其中X12是Asn(N)。
通过在VL-CDR1中插入丝氨酸残基(Ser，S)或甘氨酸残基(Gly，G)，并将SEQ IDNO:81的Y70进一步突变为苯丙氨酸(Phe，F)，也已经在同样基础上生产了两种其他小鼠抗体。两个产生的“工程化Ser/Phe ABIS-RC45”和“工程化Gly/Phe ABIS-RC45”LCVR如SEQ IDNO:71所示，其中X12分别是Ser(S)或Gly(G)。
工程化人源化抗体
基于以上，可以进一步设计工程化人源化LCVR版本A、B和C(如实施例5中所述)，如SEQ ID NO:72-80所示，其中X12是Asn(N)、Ser(S)或Gly(G)，且位置70中的残基是Phe(F)。
实施例9：工程化Asn/Phe ABIS-45RC的反应性
材料与方法
收集健康志愿者的血液，并通过Ficoll梯度离心分离外周血单核细胞(PBMC)，所述Ficoll梯度离心能够去除血液产物中不想要的部分，例如粒细胞、血小板和剩余的红细胞污染物。
用ABIS-45RC或用工程化Asn/Phe ABIS-45RC和抗CD3抗体标记人PBMC。使用生物素驴抗人IgG+链霉亲和素PerCP-Cy 5.5二抗显示反应性。
使用Canto II细胞分析仪(BD Biosciences)测量荧光强度，并使用FLOWJO软件(Tree Star Inc.)分析数据。首先通过细胞形态对细胞进行门控，并通过选择DAPI阴性细胞来排除死细胞。
结果
如图6所示，用ABIS-45RC(左小图)或工程化Asn/Phe ABIS-45RC(右小图)进行的标记显示，两种抗体以相似的方式识别人CD45RC。
实施例10：人源化ABIS-45RC的反应性
材料与方法
收集健康志愿者的血液，并通过Ficoll梯度离心分离外周血单核细胞(PBMC)，所述Ficoll梯度离心能够去除血液产物中不想要的部分，例如粒细胞、血小板和剩余的红细胞污染物。
用ABIS-45RC或人源化ABIS-45RC(20、5、1.25或0.3μg/mL)和抗CD3抗体标记人PBMC。使用生物素驴抗人IgG+链霉亲和素PercpCy 5.5二抗显示反应性。
使用Canto II细胞分析仪(BD Biosciences)测量荧光强度，并使用FLOWJO软件(Tree Star Inc.)分析数据。首先通过细胞形态对细胞进行门控，并通过选择DAPI阴性细胞来排除死细胞。
结果
用不同浓度的鼠ABIS-45RC(图7A)或人源化ABIS-45RC变体A1(图7B)或变体A3(图7C)进行的标记显示，两种抗体以相似的方式识别人CD45RC。
实施例11：人源化ABIS-45RC变体诱导细胞死亡
材料与方法
将人PBMC与培养基、同种型对照Ab或抗CD45RC变体(10μg/mL)一同温育6小时。然后，将细胞用抗CD3和抗CD45RA、膜联蛋白V和DAPI染色。通过流式细胞术在T细胞或非T细胞中的DAPI+膜联蛋白V++DAPI-膜联蛋白V+细胞上进行门控，获得总凋亡百分比。
结果
ABIS-45RC或人源化变体A1或A3有效诱导CD3+细胞(图8A)而非CD3-细胞(图8B)的细胞死亡。
实施例12：用ABIS-45RC和人源化变体A1治疗人皮肤排斥
材料与方法
PBMC的分离
在法国血液中心(
Figure BDA0003952383070002342
Figure BDA0003952383070002341
du Sang，Nantes，法国)从健康个体采集血液。根据机构指南提供了书面知情同意书。通过Ficoll-Paque密度-梯度离心(Eurobio，Courtateauf，法国)分离PBMC。用低渗溶液和离心去除剩余的红细胞和血小板。
动物
将8至12周龄的NOD/SCID/IL2Rγ-/-(NSG)小鼠以SPF条件饲养在我们自己的动物设施中(认证号C44-278)。
人皮肤移植模型
从健康志愿者的腹部整形手术获得人皮肤，并如先前所述(Bézie等,2018.FrontImmunol.8:2014)进行移植。一个月后，将来自同种异基因健康志愿者的5x106个PBMC在有或没有抗体的情况下进行静脉注射。
通过肉眼观察，基于皮肤的干燥(得分1)、僵硬(得分2)、结疤(得分3)、部分缺失(得分4)和完全缺失(得分5)，对移植排斥从0至5评分。
通过流式细胞术在血液中监测人PBMC的植入。
处理
从第0天开始并在20天内每2.5天，用纯化的ABIS-45RC或人源化变体A1抗体以0.8mg/kg腹膜内处理NSG小鼠，同时从第0天到第10天以0.4mg/天的次优剂量腹膜内施用雷帕霉素。
结果
仅用PBMC治疗引起体重减轻，开始于约第14天，并且如图9所示，所有小鼠在第33天前死亡。
发明人先前证明了仅用雷帕霉素治疗不延长存活期(中位存活期：21天(Bézie等,2018.Front Immunol.8:2014))。此处，用ABIS-45RC或人源化变体A1的治疗则完全消除了皮肤移植排斥。
实施例13：用CD45RC-CAR进行细胞工程化
材料和方法
慢病毒载体
产生编码CAR-CD45R的第二代自失活慢病毒载体。在该载体中，EF1α启动子以所示顺序控制下列序列：信号肽，通过接头融合的抗CD45RC mAb(ABIS-45RC)重链和轻链可变区，CD8-CD28共刺激信号区的跨膜区，CD3ζ信号转导区，P2A自剪接序列，GFP。慢病毒载体用VSV-G假型化。Ctrl-CAR用作对照，编码在EF1α启动子控制下的具有除CD45RC以外的抗原特异性的单克隆抗体的可变重链和轻链(以及CD8-CD28共刺激信号区域的跨膜区，和CD3ζ转导信号)，和在CMV启动子控制下的LNGFR。该Ctrl-CAR慢病毒载体也是VSV-G假型化的。
细胞转导
在第1天收获HEK(293)或Jurkat细胞并计数，然后以每孔2mL DMEM(10％ FBS、10μg/mL青霉素-链霉素、2nM L-谷氨酰胺)中500000个细胞的量铺板于6孔板中。在第2天，通过移液除去培养基，并加入2mL新鲜培养基(在37℃预温)。平行地，每孔加入500μL以下制备物：
-在室温(RT)下5分钟内，将2.5μg DNA稀释在250μL Optimem(Gibco，LifeTechnology)中，
-在RT下5分钟内，将10μL lipofectamine TM 2000(Life Technology，Invitrogen)稀释在250μL Optimem中，
-将DNA和lipofectamine在RT下混合20分钟。
GFP检测
使用Canto II细胞仪(BD Biosciences)测量荧光强度，并使用FLOWJO软件(TreeStar Inc.)分析数据。通过细胞的形态学对细胞进行门控，然后通过选择DAPI阴性细胞排除死细胞。在用蛋白L(Genscript)染色细胞后，通过流式细胞术分析GFP。
结果
CAR被设计为具有至少一个胞外结构域，任选地铰链结构域，跨膜结构域，至少一个共刺激结构域和至少一个初级信号转导结构域(图10)。本发明的一种CAR构建体是携带scFv CD45RC、CD8a铰链结构域和跨膜结构域、CD28共刺激结构域和CD3ζ初级信号转导结构域的CAR。任选地，GFP编码序列可以紧接CD45RC-CAR序列的3'，两者之间通过T2A自剪接序列分隔(未画出)。在这种情况下，GFP可用作CAR-CD45RC表达的替代标记。
发明人证明，与GFP模拟质粒(mock plasmid)相比，HEK细胞能够用CD45RC-CAR转染，如GFP染色所示(图11)。此外，该CAR构建物还可以用慢病毒载体在人永生化T细胞细胞系(Jurkat)中转导。事实上，显示CAR的存在的GFP水平在用CD45RC CAR转导的Jurkat细胞中为58.7％，在未转导的Jurkat细胞中仅为1.25％(图12)。特别地，CAR在Jurkat细胞表面的表达通过蛋白L染色得到了证实，并证明与GFP染色具有良好相关性，这同时也证明了慢病毒是有功能的(图13)。
实施例14：CD45 RC-CAR诱导靶T细胞凋亡
材料和方法
使用磁性分选(Miltenyi Biotech)从人PBMC负分选全部T细胞。细胞用CPD 670标记并铺于96孔V底板(每孔20,000个，完全培养基RPMI(10％ SVF、氨基酸、青霉素/链霉素、谷氨酰胺、丙酮酸钠、HEPES))。将100,000个Jurkat细胞铺于96孔底板中的完全DMEM培养基中，并用10μL实施例13中所述的CD45RC-CAR或Ctrl-CAR对照慢病毒载体转导，然后在37℃温育2天。对Jurkat细胞计数，并以T细胞与Jurkat细胞的不同比例(比例1:0-1:1-1:5-1:10)将Jurkat细胞添加到完全RPMI培养基中的T细胞中。细胞在37℃温育18小时。温育后，细胞在膜联蛋白缓冲液中用膜联蛋白V标记20分钟。将DAPI加入膜联蛋白缓冲液中并在CantoII细胞仪(BD Biosciences)中直接分析细胞。
结果
在先前用CD45RC-CAR或Ctrl-CAR转导的Jurkat细胞存在下，培养人T细胞18小时，然后通过流式细胞术评价凋亡。在携带CD45RC-CAR的Jurkat细胞存在下，T细胞有15％凋亡，而在Ctrl-CAR或未转导的细胞中仅有7-8％凋亡(图14)。观察到的凋亡水平等于用抗CD45RC抗体获得的水平。因此，表达CD45RC-CAR的Jurkat细胞可在人T细胞中诱导凋亡。
实施例15：CD45 RC-CAR诱导T细胞活化
材料和方法
使用磁性分选(Miltenyi Biotech)从人PBMC负分选全部T细胞。细胞用CPD 670标记，并铺于96孔V底板(每孔20,000个细胞，完全培养基RPMI(10％ SVF、氨基酸、青霉素/链霉素、谷氨酰胺、丙酮酸钠、HEPES))。将100,000个Jurkat细胞铺于96孔底板中的完全DMEM培养基中，并用10μL实施例13中所述的CD45RC-CAR或Ctrl-CAR对照慢病毒载体转导，然后在37℃下温育2天。对Jurkat细胞计数，并以T细胞与Jurkat细胞的不同比例(比例1:0-1:1-1:5-1:10)添加到完全RPMI培养基中的T细胞中。将细胞在37℃下温育18小时。温育后，用抗CD69 mAb标记细胞20分钟。加入DAPI，并在Canto II细胞分析仪(BD Biosciences)中直接分析细胞。
结果
在用CD45RC-CAR或Ctrl-CAR转导的Jurkat细胞存在下培养人T细胞18小时，然后使用CD69活化标志物通过流式细胞术测量T细胞活化。
发明人观察到，与Ctrl-CAR和未转化的Jurkat细胞相比，CD45RC-CAR诱导T细胞活化(如通过CD69表达所显示的)。有趣的是，当细胞被分选时，则意味着CD45RC-CAR由所有细胞表达，与未分选的CD45RC-CAR Jurkat细胞相比，激活甚至更好(图15)。总之，这表明CAR是有功能的。
实施例16：CD45RC-CAR诱导CD4+Treg活化和靶T细胞凋亡
材料和方法
CD4+Treg慢病毒转导和扩增方案
在第0天，在FACSAriaTM上分选CD4+CD127低CD25+CD45RC-Treg，并将其以每孔100μL培养基含105个细胞接种在先前用1μg/mL抗CD3单克隆抗体(克隆OKT3)包被的96孔平底板中。第0天使用的培养基是RPMI1640，其中补充有青霉素、链霉素、丙酮酸钠、HEPES缓冲液、氨基酸、谷氨酰胺、5％ CTS血清、抗CD28 mAb(克隆CD28.2，1μg/mL)和1000U/mL IL-2。在第1天和第2天，用10μL实施例13中描述的慢病毒载体转导细胞，所述慢病毒载体编码抗CD45RC嵌合抗原受体(CD45RC-CAR)和GFP，或编码具有不同抗原特异性和LNGFR的对照CAR(Ctrl-CAR)。在第3天，加入培养基以达到10％ CTS血清终浓度。在第7天，收获细胞并基于GFP或LNGFR在CAR表达上分选，然后用抗CD3和抗CD28 mAb进行新刺激，用于第二轮的7天扩增。每2天在培养基中新鲜加入细胞因子，并在需要时加入新鲜培养基。
CD45 RC-CAR检测
在第1天还用编码CD45RC-CAR的慢病毒转导HEK 293T细胞一次。如上所述，用慢病毒转导CD4+Treg。在最后一次转导后5天分析HEK 293T和CD4+Treg。细胞用人Fc阻断剂(BDBiosciences)处理，然后使用2μg/mL在室内稀释于PBS BSA 1％中的生物素化CD45R-ABC蛋白(R&D)在4℃温育1小时。CD45R-ABC-生物素蛋白用4μg/mL链霉亲和素-APC-Cy7显示。加入DAPI以排除死细胞，并在FACSCantoTM中分析细胞。
CAR介导的活化测定
将总共105个CD45RC-CAR CD4+Treg或Ctrl-CAR CD4+Treg铺板于先前用CD45R-ABC蛋白(1μg/mL于PBS中，1h30，37℃)包被的96孔U-底板中的完全培养基RPMI(10％ CTS血清、氨基酸、青霉素/链霉素、谷氨酰胺、丙酮酸钠、HEPES)中。细胞在37℃培养24小时，在培养的最后4小时加入布雷菲德菌素A。温育后，用存活染料标记细胞，并用抗CD69、抗CD25、抗CD71mAb在细胞外染色30分钟。细胞固定并透化，并用抗CTLA-4mAb细胞内染色1小时。在FACSCantoTM中分析细胞。
凋亡测定
人PBMC用CPD 670标记，并铺在96孔V底板(每孔50,000个细胞)的完全培养基RPMI(10％人AB血清、氨基酸、青霉素/链霉素、谷氨酰胺、丙酮酸钠、HEPES)中。在扩增15天后，对未转导或转导有CD45RC-CAR或Ctrl-CAR的CD4+Treg进行计数，并以PBMC与Treg的不同比例(比例1:0-1:1-1:2-1:5)将其添加至完全RPMI培养基中同种异基因的PBMC中。细胞在37℃培养4小时。培养后，细胞用抗CD3、抗CD19、抗CD14、抗CD56和抗CD45RA mAb染色，然后细胞用膜联蛋白V在膜联蛋白缓冲液中标记20分钟。将DAPI加入膜联蛋白缓冲液中，并在FACSCantoTM中快速分析细胞。抗CD45RA mAb作为替代标记用于鉴定每个细胞亚组中的CD45RC高细胞。作为凋亡的对照，将ABIS-45RC以10μg/mL与PBMC一起温育。总凋亡细胞的百分比通过膜联蛋白+DAPI+细胞和膜联蛋白+DAPI-细胞的总和来计算。
结果
用编码CD45RC-CAR和GFP的慢病毒载体转导人HEK 293，并通过细胞荧光测定法分析(图16)。CD45RC-CAR的检测使用用生物素标记并用链霉亲和素-APC-Cy7显示的CD45R-ABC蛋白，结果显示与非转导细胞相比具有清晰的阳性信号以及与GFP的共表达，这证明CD45RC-CAR被表达并且以对CD45RC的特异性发挥作用。
通过用CD45RC-CAR转导CD4+Treg，在第7天使用GFP进行细胞分选选择，然后在体外扩增14天，可以获得74.38％+/-17.3％转导细胞的细胞群(图17)，这证明可以转导CD4+Treg并且可以扩增CD45RC-CAR CD4+Treg。
然后，发明人通过将其与CD45R-ABC蛋白一起温育并通过细胞荧光测定法分析活化标志物，分析了CD45RC-CAR转导和扩增的CD4+Treg的活化(图18)。他们在由CD45RC-CAR转导而不是由Ctrl-CAR转导的CD4+Treg中观察到，在与CD45R-ABC蛋白温育24小时后，CD69、CD25、CD71和CTLA-4的蛋白表达增加，这证明CAR正在转导信号并且直接激活Treg。
分析了同种异基因CAR转导的或未转导的CD4+Treg在扩增14天后对PBMC的不同细胞群的凋亡，并与用抗-CD45RC mAb获得的凋亡进行比较，所述抗-CD45RC mAb用于产生CD45RC-CAR(图19)。发明人观察到，与不诱导凋亡的Ctrl-CAR转导和未转导的CD4+Treg相反，CD45RC-CAR转导的CD4+Treg诱导了与抗-CD45RC mAb相等的CD45RC高T细胞凋亡。CD45RC-CAR CD4+Treg的这种凋亡效应是剂量依赖性的，随着PBMC与CD4+Treg比例的增高而增高。
总之，这些结果显示CD45RC-CAR是功能性的，因为其诱导CD45RC-CAR转导的CD4+Treg的激活。此外，CD45RC-CAR转导的CD4+Treg诱导了CD45RC高T细胞凋亡。
序列表
<110> 法国国家健康和医学研究院（INSERM（Institut National de la Santé et dela
Recherche Médicale））
南特大学（UNIVERSITé DE NANTES）
<120> 人CD45RC特异的嵌合抗原受体及其用途
<130> IBIO-1475/PCT
<150> EP20305298.0
<151> 2020-03-20
<160> 173
<170> BiSSAP 1.3.6
<210> 1
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> VH-CDR1
<400> 1
Asn Tyr Tyr Ile Gly
1 5
<210> 2
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<221> SITE
<222> 1
<223> Xaa选自Asp (D), Ile (I)和Arg (R)
<220>
<223> VH-CDR2
<220>
<221> SITE
<222> 4
<223> Xaa选自Pro (P)和Ser (S)
<220>
<221> SITE
<222> 7
<223> Xaa选自Asp (D), Ser (S)和Gly (G)
<220>
<221> SITE
<222> 9
<223> Xaa选自Ala (A)和Thr (T)
<220>
<221> SITE
<222> 11
<223> Xaa选自Ser (S)和Tyr (Y)
<220>
<221> SITE
<222> 12
<223> Xaa选自Asn (N), Ala (A)和Ser (S)
<220>
<221> SITE
<222> 13
<223> Xaa选自Glu (E), Asp (D), Pro (P)和Gln (Q)
<220>
<221> SITE
<222> 14
<223> Xaa选自Lys (K)和Ser (S)
<220>
<221> SITE
<222> 15
<223> Xaa选自Phe (F)和Val (V)
<220>
<221> SITE
<222> 16
<223> Xaa选自Lys (K)和Gln (Q)
<400> 2
Xaa Ile Phe Xaa Gly Gly Xaa Tyr Xaa Asn Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa
1 5 10 15
Gly
<210> 3
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> VH-CDR3
<400> 3
Arg Asn Phe Asp Tyr
1 5
<210> 4
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> VH-CDR2
<400> 4
Asp Ile Phe Pro Gly Gly Asp Tyr Ala Asn Ser Asn Glu Lys Phe Lys
1 5 10 15
Gly
<210> 5
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> VH-CDR2
<400> 5
Asp Ile Phe Pro Gly Gly Asp Tyr Ala Asn Ser Asn Glu Lys Val Lys
1 5 10 15
Gly
<210> 6
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> VH-CDR2
<400> 6
Asp Ile Phe Pro Gly Gly Gly Tyr Thr Asn Tyr Ala Glu Lys Phe Gln
1 5 10 15
Gly
<210> 7
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> VH-CDR2
<400> 7
Asp Ile Phe Pro Gly Gly Ser Tyr Thr Asn Tyr Ser Glu Ser Phe Gln
1 5 10 15
Gly
<210> 8
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> VH-CDR2
<400> 8
Asp Ile Phe Pro Gly Gly Ser Tyr Thr Asn Tyr Ala Asp Ser Val Lys
1 5 10 15
Gly
<210> 9
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> VH-CDR2
<400> 9
Arg Ile Phe Pro Gly Gly Gly Tyr Thr Asn Tyr Ala Gln Lys Phe Gln
1 5 10 15
Gly
<210> 10
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> VH-CDR2
<400> 10
Ile Ile Phe Pro Gly Gly Ser Tyr Thr Asn Tyr Ser Pro Ser Phe Gln
1 5 10 15
Gly
<210> 11
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> VH-CDR2
<400> 11
Asp Ile Phe Ser Gly Gly Ser Tyr Thr Asn Tyr Ala Asp Ser Val Lys
1 5 10 15
Gly
<210> 12
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<221> SITE
<222> 1
<223> Xaa选自Ser (S)和Arg (R)
<220>
<223> VL-CDR1
<220>
<221> SITE
<222> 8
<223> Xaa不存在或选自Asn (N), Ser (S)和Gly (G)
<400> 12
Xaa Ala Ser Ser Ser Val Ser Xaa Tyr Met His
1 5 10
<210> 13
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<221> SITE
<222> 1
<223> Xaa选自Asn (N)和Ala (A);或Xaa是除Ala（A）或Asn（N）外的任何氨基酸
<220>
<223> VL-CDR2
<220>
<221> SITE
<222> 5
<223> Xaa选自Leu (L), Ser (S)和Arg (R)
<220>
<221> SITE
<222> 6
<223> Xaa选自Pro (P), Ala (A)和Gln (Q)
<220>
<221> SITE
<222> 7
<223> Xaa选自Ser (S)和Thr (T)
<400> 13
Xaa Thr Ser Asn Xaa Xaa Xaa
1 5
<210> 14
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<221> SITE
<222> 1
<223> Xaa选自Gln (Q)和His (H)
<220>
<223> VL-CDR3
<400> 14
Xaa Gln Arg Ser Ser Tyr Pro Leu Thr Phe
1 5 10
<210> 15
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> VL-CDR1
<220>
<221> SITE
<222> 8
<223> Xaa不存在或选自Asn (N), Ser (S)和Gly (G)
<400> 15
Ser Ala Ser Ser Ser Val Ser Xaa Tyr Met His
1 5 10
<210> 16
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> VL-CDR2
<400> 16
Asn Thr Ser Asn Leu Pro Ser
1 5
<210> 17
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> VL-CDR3
<400> 17
Gln Gln Arg Ser Ser Tyr Pro Leu Thr Phe
1 5 10
<210> 18
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> VL-CDR1
<220>
<221> SITE
<222> 8
<223> Xaa不存在或选自Asn (N), Ser (S)和Gly (G)
<400> 18
Arg Ala Ser Ser Ser Val Ser Xaa Tyr Met His
1 5 10
<210> 19
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> VL-CDR2
<400> 19
Asn Thr Ser Asn Ser Pro Ser
1 5
<210> 20
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> VL-CDR2
<400> 20
Ala Thr Ser Asn Leu Gln Ser
1 5
<210> 21
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> VL-CDR3
<400> 21
His Gln Arg Ser Ser Tyr Pro Leu Thr Phe
1 5 10
<210> 22
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> VL-CDR2
<400> 22
Asn Thr Ser Asn Arg Ala Thr
1 5
<210> 23
<211> 48
<212> PRT
<213> 智人（Homo sapiens）
<220>
<223> hCD45RC的C决定簇
<400> 23
Asp Val Pro Gly Glu Arg Ser Thr Ala Ser Thr Phe Pro Thr Asp Pro
1 5 10 15
Val Ser Pro Leu Thr Thr Thr Leu Ser Leu Ala His His Ser Ser Ala
20 25 30
Ala Leu Pro Ala Arg Thr Ser Asn Thr Thr Ile Thr Ala Asn Thr Ser
35 40 45
<210> 24
<211> 144
<212> DNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<220>
<223> hCD45RC的外显子6
<400> 24
gatgtcccag gagagaggag tacagccagc acctttccta cagacccagt ttccccattg 60
acaaccaccc tcagccttgc acaccacagc tctgctgcct tacctgcacg cacctccaac 120
accaccatca cagcgaacac ctca 144
<210> 25
<211> 30
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> VH-FR1
<400> 25
Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Val Arg Pro Gly Thr
1 5 10 15
Ser Val Lys Met Ser Cys Lys Ala Ala Gly Tyr Thr Phe Thr
20 25 30
<210> 26
<211> 14
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> VH-FR2
<400> 26
Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly His Gly Leu Glu Trp Ile Gly
1 5 10
<210> 27
<211> 32
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> VH-FR3
<400> 27
Lys Ala Thr Leu Thr Ala Asp Thr Ser Ser Ser Thr Ala Tyr Met Gln
1 5 10 15
Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Ile Tyr Tyr Cys Val Arg
20 25 30
<210> 28
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> VH-FR4
<400> 28
Trp Gly Gln Gly Thr Thr Leu Thr Val Ser Ser
1 5 10
<210> 29
<211> 30
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> VH-FR1
<400> 29
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr
20 25 30
<210> 30
<211> 14
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> VH-FR2
<400> 30
Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile Gly
1 5 10
<210> 31
<211> 32
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> VH-FR3
<400> 31
Arg Val Thr Leu Thr Ala Asp Thr Ser Ile Ser Thr Ala Tyr Met Glu
1 5 10 15
Leu Ser Arg Leu Arg Ser Asp Asp Thr Val Val Tyr Tyr Cys Val Arg
20 25 30
<210> 32
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> VH-FR4
<400> 32
Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
1 5 10
<210> 33
<211> 30
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> VH-FR1
<400> 33
Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Glu
1 5 10 15
Ser Leu Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr
20 25 30
<210> 34
<211> 14
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> VH-FR2
<400> 34
Trp Val Arg Gln Met Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile Gly
1 5 10
<210> 35
<211> 32
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> VH-FR3
<400> 35
Gln Val Thr Leu Ser Ala Asp Lys Ser Ile Ser Thr Ala Tyr Leu Gln
1 5 10 15
Leu Ser Ser Leu Lys Ala Ser Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys Val Arg
20 25 30
<210> 36
<211> 30
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> VH-FR1
<400> 36
Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr
20 25 30
<210> 37
<211> 14
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> VH-FR2
<400> 37
Trp Ile Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile Gly
1 5 10
<210> 38
<211> 32
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> VH-FR3
<400> 38
Arg Phe Thr Leu Ser Ala Asp Thr Ala Lys Asn Ser Ala Tyr Leu Gln
1 5 10 15
Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Val Arg
20 25 30
<210> 39
<211> 30
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> VH-FR1
<400> 39
Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Glu
1 5 10 15
Ser Leu Lys Ile Ser Cys Lys Gly Ser Gly Tyr Thr Phe Thr
20 25 30
<210> 40
<211> 30
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> VH-FR1
<400> 40
Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser
20 25 30
<210> 41
<211> 32
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> VH-FR3
<400> 41
Arg Phe Thr Leu Ser Ala Asp Thr Ala Lys Asn Ser Leu Tyr Leu Gln
1 5 10 15
Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Val Arg
20 25 30
<210> 42
<211> 30
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> VH-FR1
<400> 42
Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Glu
1 5 10 15
Ser Leu Lys Ile Ser Cys Lys Gly Ser Gly Tyr Ser Phe Thr
20 25 30
<210> 43
<211> 14
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> VH-FR2
<400> 43
Trp Ile Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Gly
1 5 10
<210> 44
<211> 23
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> VL-FR1
<400> 44
Gln Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Thr Ile Met Ser Ala Ser Pro Gly
1 5 10 15
Glu Lys Val Thr Ile Thr Cys
20
<210> 45
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> VL-FR2
<400> 45
Trp Phe Gln Gln Lys Thr Gly Thr Ser Pro Arg Leu Trp Ile Tyr
1 5 10 15
<210> 46
<211> 32
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> VL-FR3
<220>
<221> SITE
<222> 15
<223> Xaa选自Tyr (Y)和Phe (F)
<400> 46
Gly Val Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Ser Xaa Ser
1 5 10 15
Leu Thr Ile Ser Arg Met Glu Ala Glu Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys
20 25 30
<210> 47
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> VL-FR4
<400> 47
Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys
1 5
<210> 48
<211> 23
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> VL-FR1
<400> 48
Asp Ile Gln Leu Thr Gln Ser Pro Ser Phe Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys
20
<210> 49
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> VL-FR2
<400> 49
Trp Phe Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Trp Ile Tyr
1 5 10 15
<210> 50
<211> 32
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> VL-FR3
<220>
<221> SITE
<222> 15
<223> Xaa选自Tyr (Y)和Phe (F)
<400> 50
Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Glu Xaa Thr
1 5 10 15
Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys
20 25 30
<210> 51
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> VL-FR4
<400> 51
Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
1 5
<210> 52
<211> 23
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> VL-FR1
<400> 52
Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Asp Phe Gln Ser Val Thr Pro Lys
1 5 10 15
Glu Lys Val Thr Ile Thr Cys
20
<210> 53
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> VL-FR2
<400> 53
Trp Phe Gln Gln Lys Pro Asp Gln Ser Pro Lys Leu Trp Ile Tyr
1 5 10 15
<210> 54
<211> 32
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> VL-FR3
<220>
<221> SITE
<222> 15
<223> Xaa选自Tyr (Y)和Phe (F)
<400> 54
Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Xaa Thr
1 5 10 15
Leu Thr Ile Asn Ser Leu Glu Ala Glu Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys
20 25 30
<210> 55
<211> 23
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> VL-FR1
<400> 55
Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys
20
<210> 56
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> VL-FR2
<400> 56
Trp Phe Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Trp Ile Tyr
1 5 10 15
<210> 57
<211> 32
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> VL-FR3
<220>
<221> SITE
<222> 15
<223> Xaa选自Tyr (Y)和Phe (F)
<400> 57
Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Xaa Thr
1 5 10 15
Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys
20 25 30
<210> 58
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> VL-FR2
<400> 58
Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Trp Ile Tyr
1 5 10 15
<210> 59
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> VL-FR2
<400> 59
Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Asp Gln Ser Pro Lys Leu Trp Ile Tyr
1 5 10 15
<210> 60
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> VL-FR2
<400> 60
Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Trp Ile Tyr
1 5 10 15
<210> 61
<211> 114
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 鼠HCVR
<400> 61
Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Val Arg Pro Gly Thr
1 5 10 15
Ser Val Lys Met Ser Cys Lys Ala Ala Gly Tyr Thr Phe Thr Asn Tyr
20 25 30
Tyr Ile Gly Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly His Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Asp Ile Phe Pro Gly Gly Asp Tyr Ala Asn Ser Asn Glu Lys Phe
50 55 60
Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Ala Asp Thr Ser Ser Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Ile Tyr Tyr Cys
85 90 95
Val Arg Arg Asn Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Leu Thr Val
100 105 110
Ser Ser
<210> 62
<211> 114
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 人源化的HCVR
<400> 62
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asn Tyr
20 25 30
Tyr Ile Gly Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Asp Ile Phe Pro Gly Gly Asp Tyr Ala Asn Ser Asn Glu Lys Phe
50 55 60
Lys Gly Arg Val Thr Leu Thr Ala Asp Thr Ser Ile Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Arg Leu Arg Ser Asp Asp Thr Val Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Val Arg Arg Asn Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val
100 105 110
Ser Ser
<210> 63
<211> 114
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 人源化的HCVR
<400> 63
Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Glu
1 5 10 15
Ser Leu Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asn Tyr
20 25 30
Tyr Ile Gly Trp Val Arg Gln Met Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Asp Ile Phe Pro Gly Gly Asp Tyr Ala Asn Ser Asn Glu Lys Phe
50 55 60
Lys Gly Gln Val Thr Leu Ser Ala Asp Lys Ser Ile Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Leu Ser Ser Leu Lys Ala Ser Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys
85 90 95
Val Arg Arg Asn Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val
100 105 110
Ser Ser
<210> 64
<211> 114
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 人源化的HCVR
<400> 64
Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asn Tyr
20 25 30
Tyr Ile Gly Trp Ile Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Asp Ile Phe Pro Gly Gly Asp Tyr Ala Asn Ser Asn Glu Lys Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Leu Ser Ala Asp Thr Ala Lys Asn Ser Ala Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Val Arg Arg Asn Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val
100 105 110
Ser Ser
<210> 65
<211> 114
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 人源化的HCVR
<400> 65
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asn Tyr
20 25 30
Tyr Ile Gly Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Asp Ile Phe Pro Gly Gly Gly Tyr Thr Asn Tyr Ala Glu Lys Phe
50 55 60
Gln Gly Arg Val Thr Leu Thr Ala Asp Thr Ser Ile Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Arg Leu Arg Ser Asp Asp Thr Val Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Val Arg Arg Asn Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val
100 105 110
Ser Ser
<210> 66
<211> 114
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 人源化的HCVR
<400> 66
Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Glu
1 5 10 15
Ser Leu Lys Ile Ser Cys Lys Gly Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asn Tyr
20 25 30
Tyr Ile Gly Trp Val Arg Gln Met Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Asp Ile Phe Pro Gly Gly Ser Tyr Thr Asn Tyr Ser Glu Ser Phe
50 55 60
Gln Gly Gln Val Thr Leu Ser Ala Asp Lys Ser Ile Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Leu Ser Ser Leu Lys Ala Ser Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys
85 90 95
Val Arg Arg Asn Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val
100 105 110
Ser Ser
<210> 67
<211> 114
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 人源化的HCVR
<400> 67
Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asn Tyr
20 25 30
Tyr Ile Gly Trp Ile Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Asp Ile Phe Pro Gly Gly Ser Tyr Thr Asn Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Leu Ser Ala Asp Thr Ala Lys Asn Ser Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Val Arg Arg Asn Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val
100 105 110
Ser Ser
<210> 68
<211> 114
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 人源化的HCVR
<400> 68
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asn Tyr
20 25 30
Tyr Ile Gly Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Arg Ile Phe Pro Gly Gly Gly Tyr Thr Asn Tyr Ala Gln Lys Phe
50 55 60
Gln Gly Arg Val Thr Leu Thr Ala Asp Thr Ser Ile Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Arg Leu Arg Ser Asp Asp Thr Val Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Val Arg Arg Asn Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val
100 105 110
Ser Ser
<210> 69
<211> 114
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 人源化的HCVR
<400> 69
Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Glu
1 5 10 15
Ser Leu Lys Ile Ser Cys Lys Gly Ser Gly Tyr Ser Phe Thr Asn Tyr
20 25 30
Tyr Ile Gly Trp Val Arg Gln Met Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Ile Ile Phe Pro Gly Gly Ser Tyr Thr Asn Tyr Ser Pro Ser Phe
50 55 60
Gln Gly Gln Val Thr Leu Ser Ala Asp Lys Ser Ile Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Leu Ser Ser Leu Lys Ala Ser Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys
85 90 95
Val Arg Arg Asn Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val
100 105 110
Ser Ser
<210> 70
<211> 114
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 人源化的HCVR
<400> 70
Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asn Tyr
20 25 30
Tyr Ile Gly Trp Ile Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Gly Asp Ile Phe Ser Gly Gly Ser Tyr Thr Asn Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Leu Ser Ala Asp Thr Ala Lys Asn Ser Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Val Arg Arg Asn Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val
100 105 110
Ser Ser
<210> 71
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 鼠LCVR
<220>
<221> SITE
<222> 31
<223> Xaa选自Asn (N), Ser (S)和Gly (G)
<400> 71
Gln Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Thr Ile Met Ser Ala Ser Pro Gly
1 5 10 15
Glu Lys Val Thr Ile Thr Cys Ser Ala Ser Ser Ser Val Ser Xaa Tyr
20 25 30
Met His Trp Phe Gln Gln Lys Thr Gly Thr Ser Pro Arg Leu Trp Ile
35 40 45
Tyr Asn Thr Ser Asn Leu Pro Ser Gly Val Pro Ala Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Ser Phe Ser Leu Thr Ile Ser Arg Met Glu Ala
65 70 75 80
Glu Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Arg Ser Ser Tyr Pro Leu
85 90 95
Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys
100 105
<210> 72
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 人源化的LCVR
<220>
<221> SITE
<222> 31
<223> Xaa选自Asn (N), Ser (S)和Gly (G)
<400> 72
Asp Ile Gln Leu Thr Gln Ser Pro Ser Phe Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Ser Ala Ser Ser Ser Val Ser Xaa Tyr
20 25 30
Met His Trp Phe Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Trp Ile
35 40 45
Tyr Asn Thr Ser Asn Leu Pro Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Arg Ser Ser Tyr Pro Leu
85 90 95
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105
<210> 73
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 人源化的LCVR
<220>
<221> SITE
<222> 31
<223> Xaa选自Asn (N), Ser (S)和Gly (G)
<400> 73
Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Asp Phe Gln Ser Val Thr Pro Lys
1 5 10 15
Glu Lys Val Thr Ile Thr Cys Ser Ala Ser Ser Ser Val Ser Xaa Tyr
20 25 30
Met His Trp Phe Gln Gln Lys Pro Asp Gln Ser Pro Lys Leu Trp Ile
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50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Asn Ser Leu Glu Ala
65 70 75 80
Glu Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Arg Ser Ser Tyr Pro Leu
85 90 95
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105
<210> 74
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 人源化的LCVR
<220>
<221> SITE
<222> 31
<223> Xaa选自Asn (N), Ser (S)和Gly (G)
<400> 74
Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Ser Ala Ser Ser Ser Val Ser Xaa Tyr
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Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105
<210> 75
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 人源化的LCVR
<220>
<221> SITE
<222> 31
<223> Xaa选自Asn (N), Ser (S)和Gly (G)
<400> 75
Asp Ile Gln Leu Thr Gln Ser Pro Ser Phe Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Ser Ser Val Ser Xaa Tyr
20 25 30
Met His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Trp Ile
35 40 45
Tyr Asn Thr Ser Asn Leu Pro Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Arg Ser Ser Tyr Pro Leu
85 90 95
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105
<210> 76
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 人源化的LCVR
<220>
<221> SITE
<222> 31
<223> Xaa选自Asn (N), Ser (S)和Gly (G)
<400> 76
Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Asp Phe Gln Ser Val Thr Pro Lys
1 5 10 15
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Met His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Asp Gln Ser Pro Lys Leu Trp Ile
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50 55 60
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65 70 75 80
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85 90 95
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105
<210> 77
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 人源化的LCVR
<220>
<221> SITE
<222> 31
<223> Xaa选自Asn (N), Ser (S)和Gly (G)
<400> 77
Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly
1 5 10 15
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85 90 95
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105
<210> 78
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 人源化的LCVR
<220>
<221> SITE
<222> 31
<223> Xaa选自Asn (N), Ser (S)和Gly (G)
<400> 78
Asp Ile Gln Leu Thr Gln Ser Pro Ser Phe Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Ser Ser Val Ser Xaa Tyr
20 25 30
Met His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Trp Ile
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Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105
<210> 79
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 人源化的LCVR
<220>
<221> SITE
<222> 31
<223> Xaa选自Asn (N), Ser (S)和Gly (G)
<400> 79
Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Asp Phe Gln Ser Val Thr Pro Lys
1 5 10 15
Glu Lys Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Ser Ser Val Ser Xaa Tyr
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85 90 95
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105
<210> 80
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 人源化的LCVR
<220>
<221> SITE
<222> 31
<223> Xaa选自Asn (N), Ser (S)和Gly (G)
<400> 80
Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Ser Ser Val Ser Xaa Tyr
20 25 30
Met His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Trp Ile
35 40 45
Tyr Asn Thr Ser Asn Arg Ala Thr Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Arg Ser Ser Tyr Pro Leu
85 90 95
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105
<210> 81
<211> 106
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 鼠LCVR
<400> 81
Gln Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Thr Ile Met Ser Ala Ser Pro Gly
1 5 10 15
Glu Lys Val Thr Ile Thr Cys Ser Ala Ser Ser Ser Val Ser Tyr Met
20 25 30
His Trp Phe Gln Gln Lys Thr Gly Thr Ser Pro Arg Leu Trp Ile Tyr
35 40 45
Asn Thr Ser Asn Leu Pro Ser Gly Val Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser
50 55 60
Gly Ser Gly Thr Ser Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Arg Met Glu Ala Glu
65 70 75 80
Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Arg Ser Ser Tyr Pro Leu Thr
85 90 95
Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys
100 105
<210> 82
<211> 106
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 人源化的LCVR
<400> 82
Asp Ile Gln Leu Thr Gln Ser Pro Ser Phe Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Ser Ala Ser Ser Ser Val Ser Tyr Met
20 25 30
His Trp Phe Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Trp Ile Tyr
35 40 45
Asn Thr Ser Asn Leu Pro Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser
50 55 60
Gly Ser Gly Thr Glu Tyr Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu
65 70 75 80
Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Arg Ser Ser Tyr Pro Leu Thr
85 90 95
Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105
<210> 83
<211> 106
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 人源化的LCVR
<400> 83
Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Asp Phe Gln Ser Val Thr Pro Lys
1 5 10 15
Glu Lys Val Thr Ile Thr Cys Ser Ala Ser Ser Ser Val Ser Tyr Met
20 25 30
His Trp Phe Gln Gln Lys Pro Asp Gln Ser Pro Lys Leu Trp Ile Tyr
35 40 45
Asn Thr Ser Asn Leu Pro Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser
50 55 60
Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Thr Leu Thr Ile Asn Ser Leu Glu Ala Glu
65 70 75 80
Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Arg Ser Ser Tyr Pro Leu Thr
85 90 95
Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105
<210> 84
<211> 106
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 人源化的LCVR
<400> 84
Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Ser Ala Ser Ser Ser Val Ser Tyr Met
20 25 30
His Trp Phe Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Trp Ile Tyr
35 40 45
Asn Thr Ser Asn Leu Pro Ser Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser
50 55 60
Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Pro Glu
65 70 75 80
Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Arg Ser Ser Tyr Pro Leu Thr
85 90 95
Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105
<210> 85
<211> 106
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 人源化的LCVR
<400> 85
Asp Ile Gln Leu Thr Gln Ser Pro Ser Phe Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Ser Ser Val Ser Tyr Met
20 25 30
His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Trp Ile Tyr
35 40 45
Asn Thr Ser Asn Leu Pro Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser
50 55 60
Gly Ser Gly Thr Glu Tyr Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu
65 70 75 80
Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Arg Ser Ser Tyr Pro Leu Thr
85 90 95
Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105
<210> 86
<211> 106
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 人源化的LCVR
<400> 86
Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Asp Phe Gln Ser Val Thr Pro Lys
1 5 10 15
Glu Lys Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Ser Ser Val Ser Tyr Met
20 25 30
His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Asp Gln Ser Pro Lys Leu Trp Ile Tyr
35 40 45
Asn Thr Ser Asn Ser Pro Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser
50 55 60
Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Asn Ser Leu Glu Ala Glu
65 70 75 80
Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Arg Ser Ser Tyr Pro Leu Thr
85 90 95
Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105
<210> 87
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<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 人源化的LCVR
<400> 87
Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Ser Ser Val Ser Tyr Met
20 25 30
His Trp Phe Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Trp Ile Tyr
35 40 45
Asn Thr Ser Asn Leu Pro Ser Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser
50 55 60
Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Pro Glu
65 70 75 80
Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Arg Ser Ser Tyr Pro Leu Thr
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Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105
<210> 88
<211> 106
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 人源化的LCVR
<400> 88
Asp Ile Gln Leu Thr Gln Ser Pro Ser Phe Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Ser Ser Val Ser Tyr Met
20 25 30
His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Trp Ile Tyr
35 40 45
Ala Thr Ser Asn Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser
50 55 60
Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu
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Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Arg Ser Ser Tyr Pro Leu Thr
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Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105
<210> 89
<211> 106
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 人源化的LCVR
<400> 89
Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Asp Phe Gln Ser Val Thr Pro Lys
1 5 10 15
Glu Lys Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Ser Ser Val Ser Tyr Met
20 25 30
His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Asp Gln Ser Pro Lys Leu Trp Ile Tyr
35 40 45
Asn Thr Ser Asn Ser Pro Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser
50 55 60
Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Asn Ser Leu Glu Ala Glu
65 70 75 80
Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys His Gln Arg Ser Ser Tyr Pro Leu Thr
85 90 95
Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105
<210> 90
<211> 106
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 人源化的LCVR
<400> 90
Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Ser Ser Val Ser Tyr Met
20 25 30
His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Trp Ile Tyr
35 40 45
Asn Thr Ser Asn Arg Ala Thr Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser
50 55 60
Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Pro Glu
65 70 75 80
Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Arg Ser Ser Tyr Pro Leu Thr
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Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105
<210> 91
<211> 330
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 人HCCR
<400> 91
Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys
1 5 10 15
Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr
20 25 30
Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser
35 40 45
Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser
50 55 60
Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr
65 70 75 80
Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys
85 90 95
Arg Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys
100 105 110
Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro
115 120 125
Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys
130 135 140
Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp
145 150 155 160
Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu
165 170 175
Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu
180 185 190
His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn
195 200 205
Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly
210 215 220
Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu
225 230 235 240
Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr
245 250 255
Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn
260 265 270
Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe
275 280 285
Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn
290 295 300
Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr
305 310 315 320
Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
325 330
<210> 92
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 人LCCR
<400> 92
Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu
1 5 10 15
Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe
20 25 30
Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln
35 40 45
Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser
50 55 60
Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu
65 70 75 80
Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser
85 90 95
Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
100 105
<210> 93
<211> 323
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 鼠HCCR
<400> 93
Ala Lys Thr Thr Pro Pro Ser Val Tyr Pro Leu Ala Pro Gly Ser Ala
1 5 10 15
Ala Gln Thr Asn Ser Met Val Thr Leu Gly Cys Leu Val Lys Gly Tyr
20 25 30
Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Thr Trp Asn Ser Gly Ser Leu Ser Ser
35 40 45
Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Asp Leu Tyr Thr Leu
50 55 60
Ser Ser Ser Val Thr Val Pro Ser Ser Thr Trp Pro Ser Glu Thr Val
65 70 75 80
Thr Cys Asn Val Ala His Pro Ala Ser Ser Thr Lys Val Asp Lys Lys
85 90 95
Ile Val Pro Arg Asp Cys Gly Cys Lys Pro Cys Ile Cys Thr Val Pro
100 105 110
Glu Val Ser Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Val Leu
115 120 125
Thr Ile Thr Leu Thr Pro Lys Val Thr Cys Val Val Val Asp Ile Ser
130 135 140
Lys Asp Asp Pro Glu Val Gln Phe Ser Trp Phe Val Asp Asp Val Glu
145 150 155 160
Val His Thr Ala Gln Thr Gln Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr
165 170 175
Phe Arg Ser Val Ser Glu Leu Pro Ile Met His Gln Asp Trp Leu Asn
180 185 190
Gly Lys Glu Phe Lys Cys Arg Val Asn Ser Ala Ala Phe Pro Ala Pro
195 200 205
Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Thr Lys Gly Arg Pro Lys Ala Pro Gln
210 215 220
Val Tyr Thr Ile Pro Pro Pro Lys Glu Gln Met Ala Lys Asp Lys Val
225 230 235 240
Ser Leu Thr Cys Met Ile Thr Asp Phe Phe Pro Glu Asp Ile Thr Val
245 250 255
Glu Trp Gln Trp Asn Gly Gln Pro Ala Glu Asn Tyr Lys Asn Thr Gln
260 265 270
Pro Ile Met Asp Thr Asp Gly Ser Tyr Phe Val Tyr Ser Lys Leu Asn
275 280 285
Val Gln Lys Ser Asn Trp Glu Ala Gly Asn Thr Phe Thr Cys Ser Val
290 295 300
Leu His Glu Gly Leu His Asn His His Thr Glu Lys Ser Leu Ser His
305 310 315 320
Ser Pro Gly
<210> 94
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 鼠LCCR
<400> 94
Arg Ala Asp Ala Ala Pro Thr Val Ser Ile Phe Pro Pro Ser Ser Glu
1 5 10 15
Gln Leu Thr Ser Gly Gly Ala Ser Val Val Cys Phe Leu Asn Asn Phe
20 25 30
Tyr Pro Lys Asp Ile Asn Val Lys Trp Lys Ile Asp Gly Ser Glu Arg
35 40 45
Gln Asn Gly Val Leu Asn Ser Trp Thr Asp Gln Asp Ser Lys Asp Ser
50 55 60
Thr Tyr Ser Met Ser Ser Thr Leu Thr Leu Thr Lys Asp Glu Tyr Glu
65 70 75 80
Arg His Asn Ser Tyr Thr Cys Glu Ala Thr His Lys Thr Ser Thr Ser
85 90 95
Pro Ile Val Lys Ser Phe Asn Arg Asn Glu Cys
100 105
<210> 95
<211> 342
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 鼠HCVR
<400> 95
caggtccagc tgcaacagtc tggcgctgag ctggttaggc ctgggacttc agtgaagatg 60
tcctgcaagg ccgctggata caccttcact aactactaca taggttgggt aaagcagagg 120
cctggacatg gccttgagtg gatcggagat attttccctg gaggtgacta tgccaacagc 180
aatgagaagt tcaagggcaa agccacactg actgcagaca catcctccag cacagcctac 240
atgcagctca gcagcctgac atctgaggac tctgccatct attactgtgt gagaaggaac 300
tttgactact ggggccaagg caccactctc acagtgtcct ca 342
<210> 96
<211> 318
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 鼠LCVR
<400> 96
caaattgttc tcacccagtc tccaacaatc atgtctgcat ctccagggga gaaggtgacc 60
ataacctgca gtgccagctc aagtgtaagt tacatgcact ggttccagca gaagacaggc 120
acttctccca gactctggat ttataacaca tccaacctgc cttctggagt ccccgctcgc 180
ttcagtggca gtggatctgg gacctcttac tctctcacaa tcagccgaat ggaggctgaa 240
gatgctgcca cttattactg ccagcaaagg agtagttacc cactcacgtt cggtgctggg 300
accaagctgg agctgaaa 318
<210> 97
<400> 97
000
<210> 98
<400> 98
000
<210> 99
<211> 1306
<212> PRT
<213> 智人（Homo sapiens）
<220>
<223> hCD45
<300>
<308> UniProt登录号P08575-3
<309> 2018 03 28
<400> 99
Met Thr Met Tyr Leu Trp Leu Lys Leu Leu Ala Phe Gly Phe Ala Phe
1 5 10 15
Leu Asp Thr Glu Val Phe Val Thr Gly Gln Ser Pro Thr Pro Ser Pro
20 25 30
Thr Gly Leu Thr Thr Ala Lys Met Pro Ser Val Pro Leu Ser Ser Asp
35 40 45
Pro Leu Pro Thr His Thr Thr Ala Phe Ser Pro Ala Ser Thr Phe Glu
50 55 60
Arg Glu Asn Asp Phe Ser Glu Thr Thr Thr Ser Leu Ser Pro Asp Asn
65 70 75 80
Thr Ser Thr Gln Val Ser Pro Asp Ser Leu Asp Asn Ala Ser Ala Phe
85 90 95
Asn Thr Thr Gly Val Ser Ser Val Gln Thr Pro His Leu Pro Thr His
100 105 110
Ala Asp Ser Gln Thr Pro Ser Ala Gly Thr Asp Thr Gln Thr Phe Ser
115 120 125
Gly Ser Ala Ala Asn Ala Lys Leu Asn Pro Thr Pro Gly Ser Asn Ala
130 135 140
Ile Ser Asp Val Pro Gly Glu Arg Ser Thr Ala Ser Thr Phe Pro Thr
145 150 155 160
Asp Pro Val Ser Pro Leu Thr Thr Thr Leu Ser Leu Ala His His Ser
165 170 175
Ser Ala Ala Leu Pro Ala Arg Thr Ser Asn Thr Thr Ile Thr Ala Asn
180 185 190
Thr Ser Asp Ala Tyr Leu Asn Ala Ser Glu Thr Thr Thr Leu Ser Pro
195 200 205
Ser Gly Ser Ala Val Ile Ser Thr Thr Thr Ile Ala Thr Thr Pro Ser
210 215 220
Lys Pro Thr Cys Asp Glu Lys Tyr Ala Asn Ile Thr Val Asp Tyr Leu
225 230 235 240
Tyr Asn Lys Glu Thr Lys Leu Phe Thr Ala Lys Leu Asn Val Asn Glu
245 250 255
Asn Val Glu Cys Gly Asn Asn Thr Cys Thr Asn Asn Glu Val His Asn
260 265 270
Leu Thr Glu Cys Lys Asn Ala Ser Val Ser Ile Ser His Asn Ser Cys
275 280 285
Thr Ala Pro Asp Lys Thr Leu Ile Leu Asp Val Pro Pro Gly Val Glu
290 295 300
Lys Phe Gln Leu His Asp Cys Thr Gln Val Glu Lys Ala Asp Thr Thr
305 310 315 320
Ile Cys Leu Lys Trp Lys Asn Ile Glu Thr Phe Thr Cys Asp Thr Gln
325 330 335
Asn Ile Thr Tyr Arg Phe Gln Cys Gly Asn Met Ile Phe Asp Asn Lys
340 345 350
Glu Ile Lys Leu Glu Asn Leu Glu Pro Glu His Glu Tyr Lys Cys Asp
355 360 365
Ser Glu Ile Leu Tyr Asn Asn His Lys Phe Thr Asn Ala Ser Lys Ile
370 375 380
Ile Lys Thr Asp Phe Gly Ser Pro Gly Glu Pro Gln Ile Ile Phe Cys
385 390 395 400
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405 410 415
Arg Ser Phe His Asn Phe Thr Leu Cys Tyr Ile Lys Glu Thr Glu Lys
420 425 430
Asp Cys Leu Asn Leu Asp Lys Asn Leu Ile Lys Tyr Asp Leu Gln Asn
435 440 445
Leu Lys Pro Tyr Thr Lys Tyr Val Leu Ser Leu His Ala Tyr Ile Ile
450 455 460
Ala Lys Val Gln Arg Asn Gly Ser Ala Ala Met Cys His Phe Thr Thr
465 470 475 480
Lys Ser Ala Pro Pro Ser Gln Val Trp Asn Met Thr Val Ser Met Thr
485 490 495
Ser Asp Asn Ser Met His Val Lys Cys Arg Pro Pro Arg Asp Arg Asn
500 505 510
Gly Pro His Glu Arg Tyr His Leu Glu Val Glu Ala Gly Asn Thr Leu
515 520 525
Val Arg Asn Glu Ser His Lys Asn Cys Asp Phe Arg Val Lys Asp Leu
530 535 540
Gln Tyr Ser Thr Asp Tyr Thr Phe Lys Ala Tyr Phe His Asn Gly Asp
545 550 555 560
Tyr Pro Gly Glu Pro Phe Ile Leu His His Ser Thr Ser Tyr Asn Ser
565 570 575
Lys Ala Leu Ile Ala Phe Leu Ala Phe Leu Ile Ile Val Thr Ser Ile
580 585 590
Ala Leu Leu Val Val Leu Tyr Lys Ile Tyr Asp Leu His Lys Lys Arg
595 600 605
Ser Cys Asn Leu Asp Glu Gln Gln Glu Leu Val Glu Arg Asp Asp Glu
610 615 620
Lys Gln Leu Met Asn Val Glu Pro Ile His Ala Asp Ile Leu Leu Glu
625 630 635 640
Thr Tyr Lys Arg Lys Ile Ala Asp Glu Gly Arg Leu Phe Leu Ala Glu
645 650 655
Phe Gln Ser Ile Pro Arg Val Phe Ser Lys Phe Pro Ile Lys Glu Ala
660 665 670
Arg Lys Pro Phe Asn Gln Asn Lys Asn Arg Tyr Val Asp Ile Leu Pro
675 680 685
Tyr Asp Tyr Asn Arg Val Glu Leu Ser Glu Ile Asn Gly Asp Ala Gly
690 695 700
Ser Asn Tyr Ile Asn Ala Ser Tyr Ile Asp Gly Phe Lys Glu Pro Arg
705 710 715 720
Lys Tyr Ile Ala Ala Gln Gly Pro Arg Asp Glu Thr Val Asp Asp Phe
725 730 735
Trp Arg Met Ile Trp Glu Gln Lys Ala Thr Val Ile Val Met Val Thr
740 745 750
Arg Cys Glu Glu Gly Asn Arg Asn Lys Cys Ala Glu Tyr Trp Pro Ser
755 760 765
Met Glu Glu Gly Thr Arg Ala Phe Gly Asp Val Val Val Lys Ile Asn
770 775 780
Gln His Lys Arg Cys Pro Asp Tyr Ile Ile Gln Lys Leu Asn Ile Val
785 790 795 800
Asn Lys Lys Glu Lys Ala Thr Gly Arg Glu Val Thr His Ile Gln Phe
805 810 815
Thr Ser Trp Pro Asp His Gly Val Pro Glu Asp Pro His Leu Leu Leu
820 825 830
Lys Leu Arg Arg Arg Val Asn Ala Phe Ser Asn Phe Phe Ser Gly Pro
835 840 845
Ile Val Val His Cys Ser Ala Gly Val Gly Arg Thr Gly Thr Tyr Ile
850 855 860
Gly Ile Asp Ala Met Leu Glu Gly Leu Glu Ala Glu Asn Lys Val Asp
865 870 875 880
Val Tyr Gly Tyr Val Val Lys Leu Arg Arg Gln Arg Cys Leu Met Val
885 890 895
Gln Val Glu Ala Gln Tyr Ile Leu Ile His Gln Ala Leu Val Glu Tyr
900 905 910
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Leu His Asn Met Lys Lys Arg Asp Pro Pro Ser Glu Pro Ser Pro Leu
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945 950 955 960
His Ile Gly Asn Gln Glu Glu Asn Lys Ser Lys Asn Arg Asn Ser Asn
965 970 975
Val Ile Pro Tyr Asp Tyr Asn Arg Val Pro Leu Lys His Glu Leu Glu
980 985 990
Met Ser Lys Glu Ser Glu His Asp Ser Asp Glu Ser Ser Asp Asp Asp
995 1000 1005
Ser Asp Ser Glu Glu Pro Ser Lys Tyr Ile Asn Ala Ser Phe Ile Met
1010 1015 1020
Ser Tyr Trp Lys Pro Glu Val Met Ile Ala Ala Gln Gly Pro Leu Lys
1025 1030 1035 1040
Glu Thr Ile Gly Asp Phe Trp Gln Met Ile Phe Gln Arg Lys Val Lys
1045 1050 1055
Val Ile Val Met Leu Thr Glu Leu Lys His Gly Asp Gln Glu Ile Cys
1060 1065 1070
Ala Gln Tyr Trp Gly Glu Gly Lys Gln Thr Tyr Gly Asp Ile Glu Val
1075 1080 1085
Asp Leu Lys Asp Thr Asp Lys Ser Ser Thr Tyr Thr Leu Arg Val Phe
1090 1095 1100
Glu Leu Arg His Ser Lys Arg Lys Asp Ser Arg Thr Val Tyr Gln Tyr
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Gln Tyr Thr Asn Trp Ser Val Glu Gln Leu Pro Ala Glu Pro Lys Glu
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Leu Ile Ser Met Ile Gln Val Val Lys Gln Lys Leu Pro Gln Lys Asn
1140 1145 1150
Ser Ser Glu Gly Asn Lys His His Lys Ser Thr Pro Leu Leu Ile His
1155 1160 1165
Cys Arg Asp Gly Ser Gln Gln Thr Gly Ile Phe Cys Ala Leu Leu Asn
1170 1175 1180
Leu Leu Glu Ser Ala Glu Thr Glu Glu Val Val Asp Ile Phe Gln Val
1185 1190 1195 1200
Val Lys Ala Leu Arg Lys Ala Arg Pro Gly Met Val Ser Thr Phe Glu
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Gly
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<220>
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<213> 人工序列（Artificial Sequence）
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<223> 人源化的LCVR
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Met His Trp Phe Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Trp Ile
35 40 45
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50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
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740 745 750
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755 760 765
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770 775 780
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835 840 845
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Leu Asp Thr Glu Val Phe Val Thr Gly Gln Ser Pro Thr Pro Ser Pro
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Thr Gly Val Ser Ser Val Gln Thr Pro His Leu Pro Thr His Ala Asp
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180 185 190
Gln Leu His Asp Cys Thr Gln Val Glu Lys Ala Asp Thr Thr Ile Cys
195 200 205
Leu Lys Trp Lys Asn Ile Glu Thr Phe Thr Cys Asp Thr Gln Asn Ile
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Ile Ala Ala Gln Gly Pro Arg Asp Glu Thr Val Asp Asp Phe Trp Arg
610 615 620
Met Ile Trp Glu Gln Lys Ala Thr Val Ile Val Met Val Thr Arg Cys
625 630 635 640
Glu Glu Gly Asn Arg Asn Lys Cys Ala Glu Tyr Trp Pro Ser Met Glu
645 650 655
Glu Gly Thr Arg Ala Phe Gly Asp Val Val Val Lys Ile Asn Gln His
660 665 670
Lys Arg Cys Pro Asp Tyr Ile Ile Gln Lys Leu Asn Ile Val Asn Lys
675 680 685
Lys Glu Lys Ala Thr Gly Arg Glu Val Thr His Ile Gln Phe Thr Ser
690 695 700
Trp Pro Asp His Gly Val Pro Glu Asp Pro His Leu Leu Leu Lys Leu
705 710 715 720
Arg Arg Arg Val Asn Ala Phe Ser Asn Phe Phe Ser Gly Pro Ile Val
725 730 735
Val His Cys Ser Ala Gly Val Gly Arg Thr Gly Thr Tyr Ile Gly Ile
740 745 750
Asp Ala Met Leu Glu Gly Leu Glu Ala Glu Asn Lys Val Asp Val Tyr
755 760 765
Gly Tyr Val Val Lys Leu Arg Arg Gln Arg Cys Leu Met Val Gln Val
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Glu Ala Gln Tyr Ile Leu Ile His Gln Ala Leu Val Glu Tyr Asn Gln
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Phe Gly Glu Thr Glu Val Asn Leu Ser Glu Leu His Pro Tyr Leu His
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Asn Met Lys Lys Arg Asp Pro Pro Ser Glu Pro Ser Pro Leu Glu Ala
820 825 830
Glu Phe Gln Arg Leu Pro Ser Tyr Arg Ser Trp Arg Thr Gln His Ile
835 840 845
Gly Asn Gln Glu Glu Asn Lys Ser Lys Asn Arg Asn Ser Asn Val Ile
850 855 860
Pro Tyr Asp Tyr Asn Arg Val Pro Leu Lys His Glu Leu Glu Met Ser
865 870 875 880
Lys Glu Ser Glu His Asp Ser Asp Glu Ser Ser Asp Asp Asp Ser Asp
885 890 895
Ser Glu Glu Pro Ser Lys Tyr Ile Asn Ala Ser Phe Ile Met Ser Tyr
900 905 910
Trp Lys Pro Glu Val Met Ile Ala Ala Gln Gly Pro Leu Lys Glu Thr
915 920 925
Ile Gly Asp Phe Trp Gln Met Ile Phe Gln Arg Lys Val Lys Val Ile
930 935 940
Val Met Leu Thr Glu Leu Lys His Gly Asp Gln Glu Ile Cys Ala Gln
945 950 955 960
Tyr Trp Gly Glu Gly Lys Gln Thr Tyr Gly Asp Ile Glu Val Asp Leu
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Arg His Ser Lys Arg Lys Asp Ser Arg Thr Val Tyr Gln Tyr Gln Tyr
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Thr Asn Trp Ser Val Glu Gln Leu Pro Ala Glu Pro Lys Glu Leu Ile
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Asn Lys Lys Glu Lys Ala Thr Gly Arg Glu Val Thr His Ile Gln Phe
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965 970 975
Ser Tyr Trp Lys Pro Glu Val Met Ile Ala Ala Gln Gly Pro Leu Lys
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Glu Leu Arg His Ser Lys Arg Lys Asp Ser Arg Thr Val Tyr Gln Tyr
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145 150 155 160
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Ile Thr Tyr Arg Phe Gln Cys Gly Asn Met Ile Phe Asp Asn Lys Glu
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Ile Lys Leu Glu Asn Leu Glu Pro Glu His Glu Tyr Lys Cys Asp Ser
195 200 205
Glu Ile Leu Tyr Asn Asn His Lys Phe Thr Asn Ala Ser Lys Ile Ile
210 215 220
Lys Thr Asp Phe Gly Ser Pro Gly Glu Pro Gln Ile Ile Phe Cys Arg
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Ser Glu Ala Ala His Gln Gly Val Ile Thr Trp Asn Pro Pro Gln Arg
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Ser Phe His Asn Phe Thr Leu Cys Tyr Ile Lys Glu Thr Glu Lys Asp
260 265 270
Cys Leu Asn Leu Asp Lys Asn Leu Ile Lys Tyr Asp Leu Gln Asn Leu
275 280 285
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Lys Val Gln Arg Asn Gly Ser Ala Ala Met Cys His Phe Thr Thr Lys
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340 345 350
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Ala Ser Pro Ala Leu Asn Gln Gly Ser
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<210> 111
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> VL-CDR2
<400> 111
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1 5
<210> 112
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 人源化的LCVR
<220>
<221> SITE
<222> 31
<223> Xaa选自Asn (N), Ser (S)和Gly (G)
<400> 112
Asp Ile Gln Leu Thr Gln Ser Pro Ser Phe Leu Ser Ala Ser Val Gly
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100 105
<210> 113
<211> 106
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 人源化的LCVR
<400> 113
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Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105
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<400> 114
000
<210> 115
<400> 115
000
<210> 116
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> VH-CDR2
<400> 116
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1 5 10 15
Gly
<210> 117
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> VH-CDR2
<400> 117
Asp Ile Phe Pro Gly Gly Gly Tyr Thr Asn Tyr Ala Glu Lys Phe Lys
1 5 10 15
Gly
<210> 118
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> VH-CDR2
<400> 118
Asp Ile Phe Pro Gly Gly Gly Tyr Thr Asn Tyr Asn Glu Lys Phe Gln
1 5 10 15
Gly
<210> 119
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> VH-CDR2
<400> 119
Asp Ile Phe Pro Gly Gly Gly Tyr Thr Asn Ser Ala Glu Lys Phe Gln
1 5 10 15
Gly
<210> 120
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> VL-CDR2
<400> 120
Asn Thr Ala Asn Leu Pro Ser
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<210> 121
<211> 114
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 人源化的HCVR
<400> 121
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Gly Asp Ile Phe Pro Gly Gly Gly Tyr Ala Asn Tyr Ala Glu Lys Phe
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65 70 75 80
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<210> 122
<211> 114
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 人源化的HCVR
<400> 122
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Tyr Ile Gly Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Asp Ile Phe Pro Gly Gly Gly Tyr Thr Asn Tyr Ala Glu Lys Phe
50 55 60
Lys Gly Arg Val Thr Leu Thr Ala Asp Thr Ser Ile Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Arg Leu Arg Ser Asp Asp Thr Val Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Val Arg Arg Asn Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val
100 105 110
Ser Ser
<210> 123
<211> 114
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 人源化的HCVR
<400> 123
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asn Tyr
20 25 30
Tyr Ile Gly Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Asp Ile Phe Pro Gly Gly Gly Tyr Thr Asn Tyr Asn Glu Lys Phe
50 55 60
Gln Gly Arg Val Thr Leu Thr Ala Asp Thr Ser Ile Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Arg Leu Arg Ser Asp Asp Thr Val Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Val Arg Arg Asn Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val
100 105 110
Ser Ser
<210> 124
<211> 114
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 人源化的HCVR
<400> 124
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asn Tyr
20 25 30
Tyr Ile Gly Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Asp Ile Phe Pro Gly Gly Gly Tyr Thr Asn Ser Ala Glu Lys Phe
50 55 60
Gln Gly Arg Val Thr Leu Thr Ala Asp Thr Ser Ile Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Arg Leu Arg Ser Asp Asp Thr Val Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Val Arg Arg Asn Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val
100 105 110
Ser Ser
<210> 125
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 人源化的LCVR
<220>
<221> SITE
<222> 31
<223> Xaa选自Asn (N), Ser (S)和Gly (G)
<400> 125
Gln Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Thr Ile Met Ser Ala Ser Pro Gly
1 5 10 15
Glu Lys Val Thr Ile Thr Cys Ser Ala Ser Ser Ser Val Ser Xaa Tyr
20 25 30
Met His Trp Phe Gln Gln Lys Thr Gly Thr Ser Pro Arg Leu Trp Ile
35 40 45
Tyr Asn Thr Ala Asn Leu Pro Ser Gly Val Pro Ala Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Ser Phe Ser Leu Thr Ile Ser Arg Met Glu Ala
65 70 75 80
Glu Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Arg Ser Ser Tyr Pro Leu
85 90 95
Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys
100 105
<210> 126
<211> 106
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 人源化的LCVR
<400> 126
Gln Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Thr Ile Met Ser Ala Ser Pro Gly
1 5 10 15
Glu Lys Val Thr Ile Thr Cys Ser Ala Ser Ser Ser Val Ser Tyr Met
20 25 30
His Trp Phe Gln Gln Lys Thr Gly Thr Ser Pro Arg Leu Trp Ile Tyr
35 40 45
Asn Thr Ala Asn Leu Pro Ser Gly Val Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser
50 55 60
Gly Ser Gly Thr Ser Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Arg Met Glu Ala Glu
65 70 75 80
Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Arg Ser Ser Tyr Pro Leu Thr
85 90 95
Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys
100 105
<210> 127
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<221> SITE
<222> 1
<223> Xaa是除Ala（A）或Asn（N）外的任意氨基酸
<220>
<223> VL-CDR2
<400> 127
Xaa Thr Ser Asn Leu Pro Ser
1 5
<210> 128
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 人源化的LCVR
<220>
<221> SITE
<222> 31
<223> Xaa选自Asn (N), Ser (S)和Gly (G)
<220>
<221> SITE
<222> 50
<223> Xaa是除Ala（A）或Asn（N）外的任意氨基酸
<400> 128
Asp Ile Gln Leu Thr Gln Ser Pro Ser Phe Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Ser Ser Val Ser Xaa Tyr
20 25 30
Met His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Trp Ile
35 40 45
Tyr Xaa Thr Ser Asn Leu Pro Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Arg Ser Ser Tyr Pro Leu
85 90 95
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105
<210> 129
<211> 106
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 人源化的LCVR
<220>
<221> SITE
<222> 49
<223> Xaa是除Ala（A）或Asn（N）外的任意氨基酸
<400> 129
Asp Ile Gln Leu Thr Gln Ser Pro Ser Phe Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Ser Ser Val Ser Tyr Met
20 25 30
His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Trp Ile Tyr
35 40 45
Xaa Thr Ser Asn Leu Pro Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser
50 55 60
Gly Ser Gly Thr Glu Tyr Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu
65 70 75 80
Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Arg Ser Ser Tyr Pro Leu Thr
85 90 95
Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105
<210> 130
<211> 4
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 接头Gly3 Ser
<400> 130
Gly Gly Gly Ser
1
<210> 131
<211> 16
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 接头(Gly3 Ser)4
<400> 131
Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser
1 5 10 15
<210> 132
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 接头Gly4 Ser
<400> 132
Gly Gly Gly Gly Ser
1 5
<210> 133
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 接头(Gly4 Ser)2
<400> 133
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
1 5 10
<210> 134
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 接头(Gly4 Ser)3
<400> 134
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
1 5 10 15
<210> 135
<211> 20
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 接头(Gly4 Ser)4
<400> 135
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly
1 5 10 15
Gly Gly Gly Ser
20
<210> 136
<211> 45
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> (G4S)3接头
<400> 136
ggaggtggag gctctggcgg tggaggaagt ggtgggggag gctct 45
<210> 137
<211> 45
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> (G4S)3接头
<400> 137
ggtggcggtg gctcgggcgg tggtgggtcg ggtggcggcg gatct 45
<210> 138
<211> 705
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> scFv CD45RC-CAR
<400> 138
aaggtccagc tgcaacagtc tggcgctgag ctggttaggc ctgggacttc agtgaagatg 60
tcctgcaagg ccgctggata caccttcact aactactaca taggttgggt aaagcagagg 120
cctggacatg gccttgagtg gatcggagat attttccctg gaggtgacta tgccaacagc 180
aatgagaagt tcaagggcaa agccacactg actgcagaca catcctccag cacagcctac 240
atgcagctca gcagcctgac atctgaggac tctgccatct attactgtgt gagaaggaac 300
tttgactact ggggccaagg caccactctc acagtgtcct caggtggcgg tggctcgggc 360
ggtggtgggt cgggtggcgg cggatctcaa attgttctca cccagtctcc aacaatcatg 420
tctgcatctc caggggagaa ggtgaccata acctgcagtg ccagctcaag tgtaagttac 480
atgcactggt tccagcagaa gacaggcact tctcccagac tctggattta taacacatcc 540
aacctgcctt ctggagtccc cgctcgcttc agtggcagtg gatctgggac ctcttactct 600
ctcacaatca gccgaatgga ggctgaagat gctgccactt attactgcca gcaaaggagt 660
agttacccac tcacgttcgg tgctgggacc aagctggagc tgaaa 705
<210> 139
<211> 16
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 铰链
<400> 139
Ala Gly Ser Ser Ser Ser Gly Gly Ser Thr Thr Gly Gly Ser Thr Thr
1 5 10 15
<210> 140
<211> 16
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 铰链
<400> 140
Gly Thr Thr Ala Ala Ser Gly Ser Ser Gly Gly Ser Ser Ser Gly Ala
1 5 10 15
<210> 141
<211> 16
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 铰链
<400> 141
Ser Ser Ala Thr Ala Thr Ala Gly Thr Gly Ser Ser Thr Gly Ser Thr
1 5 10 15
<210> 142
<211> 16
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 铰链
<400> 142
Thr Ser Gly Ser Thr Gly Thr Ala Ala Ser Ser Thr Ser Thr Ser Thr
1 5 10 15
<210> 143
<211> 30
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 铰链
<400> 143
Gly Gly Thr Gly Gly Cys Gly Gly Ala Gly Gly Thr Thr Cys Thr Gly
1 5 10 15
Gly Ala Gly Gly Thr Gly Gly Ala Gly Gly Thr Thr Cys Cys
20 25 30
<210> 144
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 铰链 KIR2DS2
<400> 144
Lys Ile Arg Arg Asp Ser Ser
1 5
<210> 145
<211> 45
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> CD8 铰链
<400> 145
Thr Thr Thr Pro Ala Pro Arg Pro Pro Thr Pro Ala Pro Thr Ile Ala
1 5 10 15
Ser Gln Pro Leu Ser Leu Arg Pro Glu Ala Cys Arg Pro Ala Ala Gly
20 25 30
Gly Ala Val His Thr Arg Gly Leu Asp Phe Ala Cys Asp
35 40 45
<210> 146
<211> 135
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> CD8 铰链
<400> 146
accacgacgc cagcgccgcg accaccaaca ccggcgccca ccatcgcgtc gcagcccctg 60
tccctgcgcc cagaggcgtg ccggccagcg gcggggggcg cagtgcacac gagggggctg 120
gacttcgcct gtgat 135
<210> 147
<211> 230
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> IgG4 铰链
<400> 147
Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Phe
1 5 10 15
Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr
20 25 30
Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val
35 40 45
Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val
50 55 60
Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser
65 70 75 80
Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu
85 90 95
Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser
100 105 110
Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro
115 120 125
Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln
130 135 140
Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala
145 150 155 160
Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr
165 170 175
Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu
180 185 190
Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser
195 200 205
Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser
210 215 220
Leu Ser Leu Gly Lys Met
225 230
<210> 148
<211> 690
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> IgG4 铰链
<400> 148
gagagcaagt acggccctcc ctgcccccct tgccctgccc ccgagttcct gggcggaccc 60
agcgtgttcc tgttcccccc caagcccaag gacaccctga tgatcagccg gacccccgag 120
gtgacctgtg tggtggtgga cgtgtcccag gaggaccccg aggtccagtt caactggtac 180
gtggacggcg tggaggtgca caacgccaag accaagcccc gggaggagca gttcaatagc 240
acctaccggg tggtgtccgt gctgaccgtg ctgcaccagg actggctgaa cggcaaggaa 300
tacaagtgta aggtgtccaa caagggcctg cccagcagca tcgagaaaac catcagcaag 360
gccaagggcc agcctcggga gccccaggtg tacaccctgc cccctagcca agaggagatg 420
accaagaacc aggtgtccct gacctgcctg gtgaagggct tctaccccag cgacatcgcc 480
gtggagtggg agagcaacgg ccagcccgag aacaactaca agaccacccc ccctgtgctg 540
gacagcgacg gcagcttctt cctgtacagc cggctgaccg tggacaagag ccggtggcag 600
gagggcaacg tctttagctg ctccgtgatg cacgaggccc tgcacaacca ctacacccag 660
aagagcctga gcctgtccct gggcaagatg 690
<210> 149
<211> 282
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> IgD 铰链
<400> 149
Arg Trp Pro Glu Ser Pro Lys Ala Gln Ala Ser Ser Val Pro Thr Ala
1 5 10 15
Gln Pro Gln Ala Glu Gly Ser Leu Ala Lys Ala Thr Thr Ala Pro Ala
20 25 30
Thr Thr Arg Asn Thr Gly Arg Gly Gly Glu Glu Lys Lys Lys Glu Lys
35 40 45
Glu Lys Glu Glu Gln Glu Glu Arg Glu Thr Lys Thr Pro Glu Cys Pro
50 55 60
Ser His Thr Gln Pro Leu Gly Val Tyr Leu Leu Thr Pro Ala Val Gln
65 70 75 80
Asp Leu Trp Leu Arg Asp Lys Ala Thr Phe Thr Cys Phe Val Val Gly
85 90 95
Ser Asp Leu Lys Asp Ala His Leu Thr Trp Glu Val Ala Gly Lys Val
100 105 110
Pro Thr Gly Gly Val Glu Glu Gly Leu Leu Glu Arg His Ser Asn Gly
115 120 125
Ser Gln Ser Gln His Ser Arg Leu Thr Leu Pro Arg Ser Leu Trp Asn
130 135 140
Ala Gly Thr Ser Val Thr Cys Thr Leu Asn His Pro Ser Leu Pro Pro
145 150 155 160
Gln Arg Leu Met Ala Leu Arg Glu Pro Ala Ala Gln Ala Pro Val Lys
165 170 175
Leu Ser Leu Asn Leu Leu Ala Ser Ser Asp Pro Pro Glu Ala Ala Ser
180 185 190
Trp Leu Leu Cys Glu Val Ser Gly Phe Ser Pro Pro Asn Ile Leu Leu
195 200 205
Met Trp Leu Glu Asp Gln Arg Glu Val Asn Thr Ser Gly Phe Ala Pro
210 215 220
Ala Arg Pro Pro Pro Gln Pro Gly Ser Thr Thr Phe Trp Ala Trp Ser
225 230 235 240
Val Leu Arg Val Pro Ala Pro Pro Ser Pro Gln Pro Ala Thr Tyr Thr
245 250 255
Cys Val Val Ser His Glu Asp Ser Arg Thr Leu Leu Asn Ala Ser Arg
260 265 270
Ser Leu Glu Val Ser Tyr Val Thr Asp His
275 280
<210> 150
<211> 847
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> IgD 铰链
<400> 150
aggtggcccg aaagtcccaa ggcccaggca tctagtgttc ctactgcaca gccccaggca 60
gaaggcagcc tagccaaagc tactactgca cctgccacta cgcgcaatac tggccgtggc 120
ggggaggaga agaaaaagga gaaagagaaa gaagaacagg aagagaggga gaccaagacc 180
cctgaatgtc catcccatac ccagccgctg ggcgtctatc tcttgactcc cgcagtacag 240
gacttgtggc ttagagataa ggccaccttt acatgtttcg tcgtgggctc tgacctgaag 300
gatgcccatt tgacttggga ggttgccgga aaggtaccca cagggggggt tgaggaaggg 360
ttgctggagc gccattccaa tggctctcag agccagcact caagactcac ccttccgaga 420
tccctgtgga acgccgggac ctctgtcaca tgtactctaa atcatcctag cctgccccca 480
cagcgtctga tggcccttag agagccagcc gcccaggcac cagttaagct tagcctgaat 540
ctgctcgcca gtagtgatcc cccagaggcc gccagctggc tcttatgcga agtgtccggc 600
tttagcccgc ccaacatctt gctcatgtgg ctggaggacc agcgagaagt gaacaccagc 660
ggcttcgctc cagcccggcc cccaccccag ccgggttcta ccacattctg ggcctggagt 720
gtcttaaggg tcccagcacc acctagcccc cagccagcca catacacctg tgttgtgtcc 780
catgaagata gcaggaccct gctaaatgct tctaggagtc tggaggtttc ctacgtgact 840
gaccatt 847
<210> 151
<211> 39
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> CD28 铰链
<400> 151
Ile Glu Val Met Tyr Pro Pro Pro Tyr Leu Asp Asn Glu Lys Ser Asn
1 5 10 15
Gly Thr Ile Ile His Val Lys Gly Lys His Leu Cys Pro Ser Pro Leu
20 25 30
Phe Pro Gly Pro Ser Lys Pro
35
<210> 152
<211> 117
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> CD28 铰链
<400> 152
attgaagtta tgtatcctcc tccttaccta gacaatgaga agagcaatgg aaccattatc 60
catgtgaaag ggaaacacct ttgtccaagt cccctatttc ccggaccttc taagccc 117
<210> 153
<211> 24
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> CD8跨膜
<400> 153
Ile Tyr Ile Trp Ala Pro Leu Ala Gly Thr Cys Gly Val Leu Leu Leu
1 5 10 15
Ser Leu Val Ile Thr Leu Tyr Cys
20
<210> 154
<211> 72
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> CD8跨膜
<400> 154
atctacatct gggcgccctt ggccgggact tgtggggtcc ttctcctgtc actggttatc 60
accctttact gc 72
<210> 155
<211> 27
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> CD28跨膜
<400> 155
Phe Trp Val Leu Val Val Val Gly Gly Val Leu Ala Cys Tyr Ser Leu
1 5 10 15
Leu Val Thr Val Ala Phe Ile Ile Phe Trp Val
20 25
<210> 156
<211> 81
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> CD28跨膜
<400> 156
ttttgggtgc tggtggtggt tggtggagtc ctggcttgct atagcttgct agtaacagtg 60
gcctttatta ttttctgggt g 81
<210> 157
<211> 112
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> CD3ζ
<400> 157
Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Gln Gln Gly
1 5 10 15
Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr
20 25 30
Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys
35 40 45
Pro Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys
50 55 60
Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg
65 70 75 80
Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala
85 90 95
Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg
100 105 110
<210> 158
<400> 158
000
<210> 159
<400> 159
000
<210> 160
<400> 160
000
<210> 161
<400> 161
000
<210> 162
<211> 336
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> CD3ζ
<400> 162
agagtgaagt tcagcaggag cgcagacgcc cccgcgtacc agcagggcca gaaccagctc 60
tataacgagc tcaatctagg acgaagagag gagtacgatg ttttggacaa gagacgtggc 120
cgggaccctg agatgggggg aaagccgaga aggaagaacc ctcaggaagg cctgtacaat 180
gaactgcaga aagataagat ggcggaggcc tacagtgaga ttgggatgaa aggcgagcgc 240
cggaggggca aggggcacga tggcctttac cagggtctca gtacagccac caaggacacc 300
tacgacgccc ttcacatgca ggccctgccc cctcgc 336
<210> 163
<211> 42
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 4-1BB胞内
<400> 163
Lys Arg Gly Arg Lys Lys Leu Leu Tyr Ile Phe Lys Gln Pro Phe Met
1 5 10 15
Arg Pro Val Gln Thr Thr Gln Glu Glu Asp Gly Cys Ser Cys Arg Phe
20 25 30
Pro Glu Glu Glu Glu Gly Gly Cys Glu Leu
35 40
<210> 164
<211> 126
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 4-1BB胞内
<400> 164
aaacggggca gaaagaaact cctgtatata ttcaaacaac catttatgag accagtacaa 60
actactcaag aggaagatgg ctgtagctgc cgatttccag aagaagaaga aggaggatgt 120
gaactg 126
<210> 165
<400> 165
000
<210> 166
<400> 166
000
<210> 167
<211> 41
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> CD28胞内
<400> 167
Arg Ser Lys Arg Ser Arg Leu Leu His Ser Asp Tyr Met Asn Met Thr
1 5 10 15
Pro Arg Arg Pro Gly Pro Thr Arg Lys His Tyr Gln Pro Tyr Ala Pro
20 25 30
Pro Arg Asp Phe Ala Ala Tyr Arg Ser
35 40
<210> 168
<211> 123
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> CD28胞内
<400> 168
aggagtaaga ggagcaggct cctgcacagt gactacatga acatgactcc ccgccgcccc 60
gggcccaccc gcaagcatta ccagccctat gccccaccac gcgacttcgc agcctatcgc 120
tcc 123
<210> 169
<211> 222
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> CD8-CD28-CD3ζ
<400> 169
Thr Thr Thr Pro Ala Pro Arg Pro Pro Thr Pro Ala Pro Thr Ile Ala
1 5 10 15
Ser Gln Pro Leu Ser Leu Arg Pro Glu Ala Cys Arg Pro Ala Ala Gly
20 25 30
Gly Ala Val His Thr Arg Gly Leu Asp Phe Ala Cys Asp Ile Tyr Ile
35 40 45
Trp Ala Pro Leu Ala Gly Thr Cys Gly Val Leu Leu Leu Ser Leu Val
50 55 60
Ile Thr Leu Tyr Cys Arg Ser Lys Arg Ser Arg Leu Leu His Ser Asp
65 70 75 80
Tyr Met Asn Met Thr Pro Arg Arg Pro Gly Pro Thr Arg Lys His Tyr
85 90 95
Gln Pro Tyr Ala Pro Pro Arg Asp Phe Ala Ala Tyr Arg Ser Arg Val
100 105 110
Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Gln Gln Gly Gln Asn
115 120 125
Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr Asp Val
130 135 140
Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys Pro Arg
145 150 155 160
Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys Asp Lys
165 170 175
Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg Arg Arg
180 185 190
Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala Thr Lys
195 200 205
Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg
210 215 220
<210> 170
<211> 666
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> CD8-CD28-CD3ζ
<400> 170
accacgacgc cagcgccgcg accaccaaca ccggcgccca ccatcgcgtc gcagcccctg 60
tccctgcgcc cagaggcgtg ccggccagcg gcggggggcg cagtgcacac gagggggctg 120
gacttcgcct gtgatatcta catctgggcg cccttggccg ggacttgtgg ggtccttctc 180
ctgtcactgg ttatcaccct ttactgcagg agtaagagga gcaggctcct gcacagtgac 240
tacatgaaca tgactccccg ccgccccggg cccacccgca agcattacca gccctatgcc 300
ccaccacgcg acttcgcagc ctatcgctcc agagtgaagt tcagcaggag cgcagacgcc 360
cccgcgtacc agcagggcca gaaccagctc tataacgagc tcaatctagg acgaagagag 420
gagtacgatg ttttggacaa gagacgtggc cgggaccctg agatgggggg aaagccgaga 480
aggaagaacc ctcaggaagg cctgtacaat gaactgcaga aagataagat ggcggaggcc 540
tacagtgaga ttgggatgaa aggcgagcgc cggaggggca aggggcacga tggcctttac 600
cagggtctca gtacagccac caaggacacc tacgacgccc ttcacatgca ggccctgccc 660
cctcgc 666
<210> 171
<211> 457
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> CD45RC-CD8-CD28-CD3ζ
<400> 171
Lys Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Val Arg Pro Gly Thr
1 5 10 15
Ser Val Lys Met Ser Cys Lys Ala Ala Gly Tyr Thr Phe Thr Asn Tyr
20 25 30
Tyr Ile Gly Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly His Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Asp Ile Phe Pro Gly Gly Asp Tyr Ala Asn Ser Asn Glu Lys Phe
50 55 60
Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Ala Asp Thr Ser Ser Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Ile Tyr Tyr Cys
85 90 95
Val Arg Arg Asn Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Leu Thr Val
100 105 110
Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly
115 120 125
Ser Gln Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Thr Ile Met Ser Ala Ser Pro
130 135 140
Gly Glu Lys Val Thr Ile Thr Cys Ser Ala Ser Ser Ser Val Ser Tyr
145 150 155 160
Met His Trp Phe Gln Gln Lys Thr Gly Thr Ser Pro Arg Leu Trp Ile
165 170 175
Tyr Asn Thr Ser Asn Leu Pro Ser Gly Val Pro Ala Arg Phe Ser Gly
180 185 190
Ser Gly Ser Gly Thr Ser Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Arg Met Glu Ala
195 200 205
Glu Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Arg Ser Ser Tyr Pro Leu
210 215 220
Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys Thr Thr Thr Pro Ala
225 230 235 240
Pro Arg Pro Pro Thr Pro Ala Pro Thr Ile Ala Ser Gln Pro Leu Ser
245 250 255
Leu Arg Pro Glu Ala Cys Arg Pro Ala Ala Gly Gly Ala Val His Thr
260 265 270
Arg Gly Leu Asp Phe Ala Cys Asp Ile Tyr Ile Trp Ala Pro Leu Ala
275 280 285
Gly Thr Cys Gly Val Leu Leu Leu Ser Leu Val Ile Thr Leu Tyr Cys
290 295 300
Arg Ser Lys Arg Ser Arg Leu Leu His Ser Asp Tyr Met Asn Met Thr
305 310 315 320
Pro Arg Arg Pro Gly Pro Thr Arg Lys His Tyr Gln Pro Tyr Ala Pro
325 330 335
Pro Arg Asp Phe Ala Ala Tyr Arg Ser Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser
340 345 350
Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Gln Gln Gly Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu
355 360 365
Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg
370 375 380
Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys Pro Arg Arg Lys Asn Pro Gln
385 390 395 400
Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr
405 410 415
Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg Arg Arg Gly Lys Gly His Asp
420 425 430
Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala
435 440 445
Leu His Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg
450 455
<210> 172
<211> 1371
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> CD45RC-CD8-CD28-CD3ζ
<400> 172
aaggtccagc tgcaacagtc tggcgctgag ctggttaggc ctgggacttc agtgaagatg 60
tcctgcaagg ccgctggata caccttcact aactactaca taggttgggt aaagcagagg 120
cctggacatg gccttgagtg gatcggagat attttccctg gaggtgacta tgccaacagc 180
aatgagaagt tcaagggcaa agccacactg actgcagaca catcctccag cacagcctac 240
atgcagctca gcagcctgac atctgaggac tctgccatct attactgtgt gagaaggaac 300
tttgactact ggggccaagg caccactctc acagtgtcct caggtggcgg tggctcgggc 360
ggtggtgggt cgggtggcgg cggatctcaa attgttctca cccagtctcc aacaatcatg 420
tctgcatctc caggggagaa ggtgaccata acctgcagtg ccagctcaag tgtaagttac 480
atgcactggt tccagcagaa gacaggcact tctcccagac tctggattta taacacatcc 540
aacctgcctt ctggagtccc cgctcgcttc agtggcagtg gatctgggac ctcttactct 600
ctcacaatca gccgaatgga ggctgaagat gctgccactt attactgcca gcaaaggagt 660
agttacccac tcacgttcgg tgctgggacc aagctggagc tgaaaaccac gacgccagcg 720
ccgcgaccac caacaccggc gcccaccatc gcgtcgcagc ccctgtccct gcgcccagag 780
gcgtgccggc cagcggcggg gggcgcagtg cacacgaggg ggctggactt cgcctgtgat 840
atctacatct gggcgccctt ggccgggact tgtggggtcc ttctcctgtc actggttatc 900
accctttact gcaggagtaa gaggagcagg ctcctgcaca gtgactacat gaacatgact 960
ccccgccgcc ccgggcccac ccgcaagcat taccagccct atgccccacc acgcgacttc 1020
gcagcctatc gctccagagt gaagttcagc aggagcgcag acgcccccgc gtaccagcag 1080
ggccagaacc agctctataa cgagctcaat ctaggacgaa gagaggagta cgatgttttg 1140
gacaagagac gtggccggga ccctgagatg gggggaaagc cgagaaggaa gaaccctcag 1200
gaaggcctgt acaatgaact gcagaaagat aagatggcgg aggcctacag tgagattggg 1260
atgaaaggcg agcgccggag gggcaagggg cacgatggcc tttaccaggg tctcagtaca 1320
gccaccaagg acacctacga cgcccttcac atgcaggccc tgccccctcg c 1371
<210> 173
<211> 235
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> ScFv CD45RC-CAR
<400> 173
Lys Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Val Arg Pro Gly Thr
1 5 10 15
Ser Val Lys Met Ser Cys Lys Ala Ala Gly Tyr Thr Phe Thr Asn Tyr
20 25 30
Tyr Ile Gly Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly His Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Asp Ile Phe Pro Gly Gly Asp Tyr Ala Asn Ser Asn Glu Lys Phe
50 55 60
Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Ala Asp Thr Ser Ser Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Ile Tyr Tyr Cys
85 90 95
Val Arg Arg Asn Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Leu Thr Val
100 105 110
Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly
115 120 125
Ser Gln Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Thr Ile Met Ser Ala Ser Pro
130 135 140
Gly Glu Lys Val Thr Ile Thr Cys Ser Ala Ser Ser Ser Val Ser Tyr
145 150 155 160
Met His Trp Phe Gln Gln Lys Thr Gly Thr Ser Pro Arg Leu Trp Ile
165 170 175
Tyr Asn Thr Ser Asn Leu Pro Ser Gly Val Pro Ala Arg Phe Ser Gly
180 185 190
Ser Gly Ser Gly Thr Ser Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Arg Met Glu Ala
195 200 205
Glu Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Arg Ser Ser Tyr Pro Leu
210 215 220
Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys
225 230 235

Claims (15)

1.一种对人CD45RC特异的嵌合抗原受体(CAR)，其中所述CAR包含：
(a)至少一个胞外结合结构域，其中所述结合结构域结合所述人CD45RC，
(b)任选地，至少一个胞外铰链结构域，
(c)至少一个跨膜结构域，和
(d)至少一个胞内信号转导结构域，其中胞内结构域包含至少一个T细胞初级信号转导结构域和任选地至少一个T细胞共刺激信号转导结构域。
2.如权利要求1所述的CAR，其中所述胞外结合结构域包含至少一个结合人CD45RC的抗原结合片段，其中所述抗原结合片段包含：
(a)包含以下三个CDR的HCVR：
(i)序列SEQ ID NO:1的VH-CDR1；
(ii)VH-CDR2，其序列选自包含序列SEQ ID NO:4、5、6、8、100、116、117、118和119的组；和
(iii)序列SEQ ID NO:3的VH-CDR3；和
(b)包含以下三个CDR的LCVR：
(i)VL-CDR1，其序列选自包含序列SEQ ID NO:15(SASSSVS-X12-YMH)和18(RASSSVS-X12-YMH)的组，其中X12不存在或选自Asn(N)、Ser(S)和Gly(G)；
(ii)VL-CDR2，其序列选自包含序列SEQ ID NO:16、111和120的组；和
(iii)序列SEQ ID NO:17的VL-CDR3。
3.如权利要求1或2所述的CAR，其中所述胞外结合结构域包含至少一个结合人CD45RC的抗原结合片段，其中所述抗原结合片段包含：
(a)包含以下三个CDR的HCVR：
(i)序列SEQ ID NO:1的VH-CDR1；
(ii)VH-CDR2，其序列选自包含序列SEQ ID NO:4和5的组；和
(iii)序列SEQ ID NO:3的VH-CDR3；和
(b)包含以下三个CDR的LCVR：
(i)序列SEQ ID NO:15的VL-CDR1，其中X12不存在；
(ii)序列SEQ ID NO:16的VL-CDR2；和
(iii)序列SEQ ID NO:17的VL-CDR3。
4.如权利要求1至3中任一项所述的CAR，其中所述胞外结合结构域包含至少一个结合人CD45RC的抗原结合片段，其中所述抗原结合片段包含：
(a)包含以下三个CDR的HCVR：
(i)序列SEQ ID NO:1的VH-CDR1；
(ii)序列SEQ ID NO:4的VH-CDR2；和
(iii)序列SEQ ID NO:3的VH-CDR3；和
(b)包含以下三个CDR的LCVR：
(i)序列SEQ ID NO:15的VL-CDR1，其中X12不存在；
(ii)序列SEQ ID NO:16的VL-CDR2；和
(iii)序列SEQ ID NO:17的VL-CDR3。
5.如权利要求1至4中任一项所述的CAR，其中所述胞外结合结构域包含至少一个结合人CD45RC的抗原结合片段，其中所述抗原结合片段包含：
(a)包含以下三个CDR的HCVR：
(i)序列SEQ ID NO:1的VH-CDR1；
(ii)VH-CDR2，其序列选自包含序列SEQ ID NO:4、6和100的组；和
(iii)序列SEQ ID NO:3的VH-CDR3；和
(b)包含以下三个CDR的LCVR：
(i)VL-CDR1，其序列选自包含序列SEQ ID NO:15和18的组，其中X12不存在；
(ii)VL-CDR2，其序列选自包含序列SEQ ID NO:16、111和120的组；和
(iii)序列SEQ ID NO:17的VL-CDR3。
6.如权利要求1至5中任一项所述的CAR，其中所述胞外结合结构域包含至少一个结合人CD45RC的抗原结合片段，其中所述抗原结合片段包含：
1)序列SEQ ID NO:61的HCVR和序列SEQ ID NO:81的LCVR；
2)序列SEQ ID NO:62的HCVR和序列SEQ ID NO:82的LCVR；
3)序列SEQ ID NO:62的HCVR和序列SEQ ID NO:83的LCVR；
4)序列SEQ ID NO:62的HCVR和序列SEQ ID NO:84的LCVR；
5)序列SEQ ID NO:63的HCVR和序列SEQ ID NO:82的LCVR；
6)序列SEQ ID NO:63的HCVR和序列SEQ ID NO:83的LCVR；
7)序列SEQ ID NO:63的HCVR和序列SEQ ID NO:84的LCVR；
8)序列SEQ ID NO:64的HCVR和序列SEQ ID NO:82的LCVR；
9)序列SEQ ID NO:64的HCVR和序列SEQ ID NO:83的LCVR；
10)序列SEQ ID NO:64的HCVR和序列SEQ ID NO:84的LCVR；
11)序列SEQ ID NO:101的HCVR和序列SEQ ID NO:85的LCVR；
12)序列SEQ ID NO:101的HCVR和序列SEQ ID NO:103的LCVR；
13)序列SEQ ID NO:65的HCVR和序列SEQ ID NO:85的LCVR；
14)序列SEQ ID NO:65的HCVR和序列SEQ ID NO:103的LCVR；
15)序列SEQ ID NO:62的HCVR和序列SEQ ID NO:85的LCVR；
16)序列SEQ ID NO:101的HCVR和序列SEQ ID NO:82的LCVR；
17)序列SEQ ID NO:121的HCVR和序列SEQ ID NO:85的LCVR；
18)序列SEQ ID NO:122的HCVR和序列SEQ ID NO:85的LCVR；
19)序列SEQ ID NO:123的HCVR和序列SEQ ID NO:85的LCVR；
20)序列SEQ ID NO:124的HCVR和序列SEQ ID NO:85的LCVR；
21)序列SEQ ID NO:63的HCVR和序列SEQ ID NO:85的LCVR；
22)序列SEQ ID NO:67的HCVR和序列SEQ ID NO:85的LCVR；
23)序列SEQ ID NO:67的HCVR和序列SEQ ID NO:103的LCVR；
24)序列SEQ ID NO：61的HCVR和序列SEQ ID NO：113的LCVR；
25)序列SEQ ID NO：61的HCVR和序列SEQ ID NO：126的LCVR；或
26)包含与1)至23)所述的HCVR和LCVR的非CDR区的序列具有至少70％同一性的非CDR区的序列的HCVR和LCVR。
7.如权利要求1至6中任一项所述的CAR，其中所述胞外结合结构域包含至少一个结合人CD45RC的抗原结合片段，其中所述抗原结合片段包含：
(a)包含以下三个CDR的HCVR：
(i)序列SEQ ID NO:1的VH-CDR1；
(ii)VH-CDR2，其序列选自包含序列SEQ ID NO:4、5、6、8、100、116、117、118和119的组；和
(iii)序列SEQ ID NO:3的VH-CDR3；和
(b)包含以下三个CDR的LCVR：
(i)VL-CDR1，其序列选自包含序列SEQ ID NO:15和18的组，其中SEQ ID NO:15和18中的X12选自Asn(N)、Ser(S)和Gly(G)；
(ii)序列SEQ ID NO:16的VL-CDR2；和
(iii)序列SEQ ID NO:17的VL-CDR3；
优选地，其中LCVR的Kabat位置L71处的氨基酸残基是Phe(F)。
8.如权利要求1至7中任一项所述的CAR，其包含：
(i)抗人CD45RC scFv，优选地，其包含具有序列SEQ ID NO：61的HCVR和具有序列SEQID NO：81的LCVR，优选地，所述HCVR和LCVR通过具有序列SEQ ID NO：134的接头连接，
(ii)来源于CD8α的铰链结构域，优选地，其具有序列SEQ ID NO：145，
(iii)人CD8α跨膜结构域，优选地，其具有序列SEQ ID NO：153，和
(iv)胞内信号转导结构域，其包含人CD28信号转导结构域和人CD3ζ信号转导结构域，优选地，人CD28信号转导结构域具有序列SEQ ID NO：167，优选地，人CD3ζ信号转导结构域具有序列SEQ ID NO：157。
9.一种编码权利要求1至8中任一项所述的CAR的核酸。
10.一种包含权利要求9所述的核酸的表达载体。
11.一种免疫细胞群，其经工程化以在细胞表面表达权利要求1至8中任一项所述的CAR。
12.如权利要求11所述的免疫细胞群，其中所述免疫细胞群是调节性T细胞群，优选地，其中所述调节性T细胞群选自CD4+CD25+Foxp3+Treg、Tr1细胞、分泌TGF-β的Th3细胞、调节性NKT细胞、调节性γδT细胞、调节性CD8+T细胞和双阴性调节性T细胞。
13.一种包含至少一种免疫细胞群的组合物，所述免疫细胞群经工程化以在细胞表面表达权利要求1至8中任一项所述的CAR，其中所述组合物优选是药物组合物并且进一步包含至少一种药学上可接受的赋形剂或载体。
14.如权利要求11或权利要求12所述的免疫细胞群或如权利要求13所述的药物组合物，其用作药物。
15.如权利要求11或权利要求12所述的免疫细胞群或如权利要求13所述的组合物，其用于在有需要的受试者中诱导免疫耐受，预防或减少移植排斥，或预防或治疗移植物抗宿主病(GVHD)，或用于预防、减少和/或治疗选自自身免疫性疾病、不期望的免疫应答、单基因疾病、淋巴瘤和癌症的CD45RC高相关病症。
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