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JP7578939B2 - 抗ｈｌａ－ａ２抗体及びその使用方法 - Google Patents

抗ｈｌａ－ａ２抗体及びその使用方法 Download PDF

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ザ・ユニバーシティ・オブ・ブリティッシュ・コロンビア
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関連出願への相互参照
本願は、２０１７年９月１９日に出願された米国仮特許出願第６２／５６０，５７４号と、２０１８年６月２９日に出願された米国仮特許出願第６２／６９２，３８６号の利益を主張し、該出願は参照により全体として本明細書に組み込まれる。
本発明は、一部の態様において、ＨＬＡ－Ａ２結合分子、特にヒト化抗ＨＬＡ－Ａ２抗体に関する。本発明は更に、該抗体を含むキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を含む、該抗体を含む組換え受容体に関する。本開示は更に、該受容体及び抗体を発現する遺伝子操作細胞と、細胞療法におけるその使用に関する。
クラスＩ ＨＬＡ抗原は、全ての有核細胞上で発現する多型のタンパク質であり、移植に関しては、免疫認識の重要な標的である。実際、ＨＬＡクラスＩ特異的Ｔ細胞及び／又は抗体の発生は、急性及び慢性の拒絶反応と同種移植片にとって主要な危険因子であり、予め形成された抗ドナーＨＬＡクラスＩ抗体の存在により、超急性拒絶反応が生じるおそれがある（Ｋｏｎｖａｌｉｎｋａ他、２０１５）。よって、ＨＬＡクラスＩタンパク質に対する免疫応答を調節する方法を見つけることは、移植における大きなブレークスルーとなるであろう。
古典的なＨＬＡクラスＩ分子は多型であり、感染からの進化的圧力に応じて進化した多くの異なる対立遺伝子によってコードされている。古典的ＨＬＡクラスＩタンパク質をコードする遺伝子座は３つあり、Ａ、Ｂ及びＣ遺伝子座と呼ばれる。ＨＬＡ－Ａ遺伝子座のうち、ＨＬＡ－Ａ２対立遺伝子ファミリーは最大かつ最も多様なファミリーであり、少なくとも３１の異なるＨＬＡ－Ａ２対立遺伝子がヒトに存在することが知られている。興味深いことに、他の多くのＨＬＡ対立遺伝子ファミリーとは異なり、ＨＬＡ－Ａ２は全ての民族で頻繁に存在し、コーカサス人の５０％、アフリカ系アメリカ人の３５％に見られる（Ｅｌｌｉｓ他、２０００）。多くのＨＬＡ－Ａ２対立遺伝子は、１～９個のアミノ酸しか違いがなく、多型の大部分はペプチド結合溝の周りに集中している（Ｈｉｌｔｏｎ他、２０１３）。ＨＬＡ－Ａ２対立遺伝子は、Ａ＊０２０１又はＡ＊０２０５の対立遺伝子間遺伝子変換イベントを介して派生した２つの主要なブランチにサブグループ化される（Ｅｌｌｉｓ他、２０００）。
ＨＬＡタンパク質及び移植拒絶を引き起こす他の抗原に対する望ましくない免疫を調節する方法としての制御性Ｔ（Ｔｒｅｇ）細胞による養子免疫療法は、同種移植片拒絶反応と移植片対宿主病（ＧＶＨＤ）にとって有望な治療法である。同種異系造血幹細胞移植（ＨＳＣＴ）後の移植片対宿主病（ＧＶＨＤ）の予防におけるポリクローナルＴｒｅｇ細胞導入の使用が報告されている（Ｂｒｕｎｓｔｅｉｎ他、２０１１；Ｄｉ Ｉａｎｎｉ他、２０１１；Ｔｒｚｏｎｋｏｗｓｋｉ他、２００９）。また、１型糖尿病のｃ－ペプチドレベルの維持におけるＴｒｅｇ細胞導入の使用も報告されている（Ｂｌｕｅｓｔｏｎｅ他、２０１５；Ｍａｒｅｋ－Ｔｒｚｏｎｋｏｗｓｋａ他、２０１２）。特に、そのような細胞療法のためのポリクローナルＴｒｅｇ細胞の使用に関連して、一時的に全身免疫抑制のリスクがあるかもしれないことが報告されている（Ｂｒｕｎｓｔｅｉｎ他、２０１３）。
動物研究のデータによれば、抗原特異的細胞を使用することにより、Ｔｒｅｇ細胞を用いた細胞療法の効力と特異性が著しく向上し得ることが示されている。例えば、自己免疫のモデルでは、抗原特異的Ｔｒｅｇ細胞は、疾患の軽減においてポリクローナルＴｒｅｇ細胞よりも優れている。膵臓リンパ節から単離された、又は膵島抗原によってパルスされたＴｒｅｇ細胞は、１型糖尿病の予防又は治癒においてポリクローナルＴｒｅｇ細胞よりも有意に優れており（Ｇｒｅｅｎ他、２００２；Ｍａｓｔｅｌｌｅｒ他、２００５；Ｔａｎｇ他、２００４；Ｔａｒｂｅｌｌ他、２００７；Ｔａｒｂｅｌｌ他、２００４）、自己抗原特異的トランスジェニックＴ細胞受容体（ＴＣＲ）を発現するＴｒｅｇ細胞は、実験的自己免疫性脳脊髄炎（ＥＡＥ）のモデルにおいて中枢神経系の炎症を抑制する点について、ポリクローナルＴｒｅｇ細胞よりも優れている（Ｓｔｅｐｈｅｎｓ他、２００９）。同様に、同種抗原特異的Ｔｒｅｇ細胞（インビトロでの同種抗原刺激による増殖によって濃縮されるか、又はＴＣＲ導入遺伝子を発現するように遺伝子操作されている）は、器官及び組織の移植片の拒絶反応を防ぐ上でポリクローナルＴｒｅｇ細胞よりも効果的である（Ｇｏｌｓｈａｙａｎ他、２００７；Ｊｏｆｆｒｅ他、２００８；Ｎｉｓｈｉｍｕｒａ他、２００４；Ｓａｎｃｈｅｚ－Ｆｕｅｙｏ他、２００６；Ｔｓａｎｇ他、２００８）。同種抗原によって増殖したＴｒｅｇ細胞がＧＶＨＤを効果的に予防するというある程度の証拠があり（Ｔｒｅｎａｄｏ他、２００６）、また、抗原特異的Ｔｒｅｇ細胞のインビボ誘導によってＧＶＨＤなしで造血同種移植片の受容が促進されるというある程度の証拠がある（Ｖｅｒｇｉｎｉｓ他、２００８）。ヒト化マウスモデルにより、同様の結果が示されている：同種抗原増殖されたヒトＴｒｅｇ細胞は、ポリクローナルＴｒｅｇ細胞よりも皮膚移植片拒絶反応の強力なサプレッサーである（Ｐｕｔｎａｍ他、２０１３；Ｓａｇｏｏ他、２０１１）。
トランスジェニックＴＣＲを過剰発現させること、又は抗原特異的Ｔ細胞を濃縮するための抗原刺激増殖への代替アプローチは、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）の使用である。細胞ベースの養子免疫療法では、患者から単離した免疫細胞を改変して、細胞がその後患者に戻された後に細胞が新しい治療機能を果たせるようにする合成タンパク質を発現させることができる。そのような合成タンパク質の例がＣＡＲである。現在使用されているＣＡＲの例は、細胞外認識ドメイン（例えば抗原結合ドメイン）と、膜貫通ドメインと、１つ以上の細胞内シグナル伝達ドメインとの融合である。抗原の会合により、ＣＡＲの細胞内シグナル伝達部分は、免疫細胞で活性化関連の応答を開始することができる。例えば、細胞内シグナル伝達ドメインに融合した細胞外単鎖抗体（ｓｃＦｖ）抗原結合ドメインを発現するように、Ｔ細胞を遺伝子操作することができる（Ｇｉｌｌ及びＪｕｎｅ、２０１５；Ｊｕｎｅ他、２０１５）。特に、モデル抗原に特異的なＣＡＲを発現するＴｒｅｇ細胞が報告されている（Ｂｌａｔ他、２０１４；Ｅｌｉｎａｖ他、２００９；Ｅｌｉｎａｖ他、２００８；Ｆｒａｎｓｓｏｎ他、２０１２；Ｈｏｍｂａｃｈ他、２００９；Ｂｏａｒｄｍａｎ他、２０１６；ＭａｃＤｏｎａｌｄ他、２０１６；Ｎｏｙａｎ他、２０１６）。
本開示の態様は、抗ＨＬＡ－Ａ２抗体を含む。また、本開示の抗ＨＬＡ－Ａ２抗体のいずれかを含む細胞外ドメインを含むキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）も提供される。また、本開示の抗ＨＬＡ－Ａ２抗体及びＣＡＲをコードする核酸と、それを含む発現ベクターと、該発現ベクターを含む宿主細胞も提供される。本開示の態様は、ヒト化抗ＨＬＡ－Ａ２抗体も含む。また、本開示のヒト化抗ＨＬＡ－Ａ２抗体のいずれかを含む細胞外ドメインを含むキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）も提供される。また、本開示のヒト化抗ＨＬＡ－Ａ２抗体及びＣＡＲをコードする核酸と、それを含む発現ベクターと、該発現ベクターを含む宿主細胞も提供される。また、本開示のＣＡＲ及び／又は発現ベクターを含む免疫細胞、例えば免疫制御細胞、該免疫細胞を含む組成物及び医薬組成物、該免疫細胞を作製するための該免疫細胞及び／又は試薬を含む部品のキット（例えば本開示の抗ＨＬＡ－Ａ抗体若しくはＣＡＲをコードする核酸又はベクター）、並びに該免疫細胞を作製する方法も提供される。また、本開示の抗ＨＬＡ－Ａ２抗体、ＣＡＲ、免疫細胞及び医薬組成物を使用する方法も提供される。例えば、主題の抗ＨＬＡ－Ａ２抗体、ＣＡＲ、免疫細胞（例えば免疫制御細胞）及び医薬組成物には、例えば対象における免疫寛容の促進、対象における移植片対宿主病（ＧＶＨＤ）の予防又は治療、対象における器官若しくは組織移植拒絶反応の予防又は治療等において用途がある。
一部の実施形態では、ヒト化抗ＨＬＡ－Ａ２抗体が提供され、本抗体は、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）の抗原結合ドメインを構成することが可能であり、ＣＡＲは、ＣＡＲがＨＬＡ－Ａ２に特異的に結合するように、ヒト細胞（例えば、ヒト免疫制御細胞等のヒト免疫細胞）において発現することが可能である。特定の態様において、該抗体は、ＨＬＡ－Ａ２への結合について、配列番号１８３のアミノ酸配列を有する重鎖相補性決定領域１（ＨＣＤＲ１）、配列番号１８５のアミノ酸配列を有する重鎖相補性決定領域２（ＨＣＤＲ２）、配列番号１８７のアミノ酸配列を有する重鎖相補性決定領域３（ＨＣＤＲ３）、配列番号１８８のアミノ酸配列を有する軽鎖相補性決定領域１（ＬＣＤＲ１）、配列番号１８９のアミノ酸配列を有する軽鎖相補性決定領域２（ＬＣＤＲ２）、及び配列番号１９０のアミノ酸配列を有する軽鎖相補性決定領域３（ＬＣＤＲ３）を含む抗体と競合する。
特定の態様において、ヒト化抗ＨＬＡ－Ａ２抗体が提供され、本抗体は、ＨＬＡ－Ａ２への結合について、配列番号１８３のアミノ酸配列を有する重鎖相補性決定領域１（ＨＣＤＲ１）、配列番号１８５のアミノ酸配列を有する重鎖相補性決定領域２（ＨＣＤＲ２）、配列番号１８７のアミノ酸配列を有する重鎖相補性決定領域３（ＨＣＤＲ３）、配列番号１８８のアミノ酸配列を有する軽鎖相補性決定領域１（ＬＣＤＲ１）、配列番号１８９のアミノ酸配列を有する軽鎖相補性決定領域２（ＬＣＤＲ２）、及び配列番号１９０のアミノ酸配列を有する軽鎖相補性決定領域３（ＬＣＤＲ３）を含む抗体と競合する。
特定の実施形態によれば、上記のヒト化抗ＨＬＡ－Ａ２抗体は、配列番号１８３のアミノ酸配列を有する重鎖相補性決定領域１（ＨＣＤＲ１）、配列番号１８５のアミノ酸配列を有する重鎖相補性決定領域２（ＨＣＤＲ２）、配列番号１８７のアミノ酸配列を有する重鎖相補性決定領域３（ＨＣＤＲ３）、配列番号１８８のアミノ酸配列を有する軽鎖相補性決定領域１（ＬＣＤＲ１）、配列番号１８９のアミノ酸配列を有する軽鎖相補性決定領域２（ＬＣＤＲ２）、及び配列番号１９０のアミノ酸配列を有する軽鎖相補性決定領域３（ＬＣＤＲ３）を含む抗体と同じＨＬＡ－Ａ２エピトープに結合する。
一部の実施形態では、本開示のヒト化抗ＨＬＡ－Ａ２抗体は、ＢＢ７．２抗体と比較して、ＨＬＡ－Ａ＊０３、ＨＬＡ－Ａ＊２５、ＨＬＡ－Ａ＊２９、ＨＬＡ－Ａ＊３０、ＨＬＡ－Ａ＊３１、ＨＬＡ－Ａ＊３３、ＨＬＡ－Ａ＊３６、ＨＬＡ－Ａ＊６８及びそれらの任意の組合せのうちの１つ以上から選択される少なくとも１つのＨＬＡ－Ａサブタイプに対する反応性が低い。例えば、一部の実施形態では、本開示のヒト化抗ＨＬＡ－Ａ２抗体は、ＢＢ７．２抗体と比較して、ＨＬＡ－Ａ＊２５、ＨＬＡ－Ａ＊２９、ＨＬＡ－Ａ＊３０及びそれらの任意の組合せのうちの１つ以上から選択される少なくとも１つのＨＬＡ－Ａサブタイプに対する反応性が低い。
特定の態様において、本開示のヒト化抗ＨＬＡ－Ａ２抗体は、ＳＹＨＩＱ（配列番号１）及びＧＹＴＦＴＳＹ（配列番号２）から成る群から選択されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域を含む。
特定の実施形態によれば、本開示のヒト化抗ＨＬＡ－Ａ２抗体は、ＹＰＧＤＧＳ（配列番号４）及びＷＩＹＰＧＤＧＳＴＸ１０ＹＸ１２Ｘ１３ＫＦＸ１６Ｇ（配列番号１０）から成る群から選択されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域を含み、Ｘ１０はＱ又はＫであり、Ｘ１２はＮ又はＳであり、Ｘ１３はＥ又はＱであり、Ｘ１６はＫ又はＱである。該抗体は、例えば、ＷＩＹＰＧＤＧＳＴＱＹＮＥＫＦＫＧ（配列番号３）及びＹＰＧＤＧＳ（配列番号４）から成る群から選択されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域を含んでよい。また、例として、該抗体は、例えば、アミノ酸配列ＷＩＹＰＧＤＧＳＴＫＹＳＱＫＦＱＧ（配列番号５）を含む重鎖可変領域を含んでよい。特定の態様において、本開示のヒト化抗体は、アミノ酸配列ＥＧＴＹＹＡＭＤＹ（配列番号６）を含む重鎖可変領域を含む。
一部の実施形態では、本開示のヒト化抗ＨＬＡ－Ａ２抗体は、アミノ酸配列ＲＳＳＱＳＩＶＨＳＮＧＮＴＹＬＥ（配列番号７）を含む軽鎖可変領域を含む。特定の態様において、本開示のヒト化抗体は、アミノ酸配列ＫＶＳＮＲＦＳ（配列番号８）を含む軽鎖可変領域を含む。一部の実施形態によれば、本開示のヒト化抗体は、アミノ酸配列ＦＱＧＳＨＶＰＲＴ（配列番号９）を含む軽鎖可変領域を含む。
特定の態様において、本開示のヒト化抗ＨＬＡ－Ａ２抗体は、
ＱＶＱＬＶＱＳＧＡＥＶＫＫＰＧＡＳＶＫＶＳＣＫＡＳ（配列番号１１）及び
ＱＶＱＬＶＱＳＧＡＥＶＫＫＰＧＡＳＶＫＶＳＣＫＡＳＧＹＴＦＴ（配列番号１２）
から成る群から選択されるアミノ酸配列を含むフレームワーク領域１（ＶＨ ＦＲ１）を含む重鎖可変領域を含む。
特定の実施形態によれば、本開示のヒト化抗ＨＬＡ－Ａ２抗体は、フレームワーク領域２（ＶＨ ＦＲ２）を含む重鎖可変領域を含み、フレームワーク領域２は、
ＷＶＲＱＡＰＧＱＸ９ＬＥＷＭＧＸ１５（配列番号１３）、
ＷＶＲＱＡＰＧＱＸ９ＬＥＷＭＧＸ１５ＷＩ（配列番号１７）、
ＨＩＱＷＶＲＱＡＰＧＱＸ１２ＬＥＷＭＧＸ１８ＷＩ（配列番号２１）、及び
ＨＩＱＷＶＲＱＡＰＧＱＸ１２ＬＥＷＭＧＸ１８（配列番号２５）
から成る群から選択されるアミノ酸配列を含み、
配列番号１３において、Ｘ９はＲ又はＧであり、Ｘ１５はＩ又は非存在であり、
配列番号１７において、Ｘ９はＲ又はＧであり、Ｘ１５はＩ又は非存在であり、
配列番号２１において、Ｘ１２はＲ又はＧであり、Ｘ１８はＩ又は非存在であり、
配列番号２５において、Ｘ１２はＲ又はＧであり、Ｘ１８はＩ又は非存在である。
一部の実施形態では、本開示のヒト化抗ＨＬＡ－Ａ２抗体は、フレームワーク領域３（ＶＨ ＦＲ３）を含む重鎖可変領域を含み、フレームワーク領域３は、
Ｘ１ＶＴＸ４ＴＸ６ＤＴＳＸ１０ＳＴＡＹＭＸ１６ＬＳＸ１９ＬＲＳＸ２３ＤＸ２５ＡＶＹＹＣＡＲ（配列番号２９）、
ＴＸ２ＹＸ４Ｘ５ＫＦＸ８ＧＸ１０ＶＴＸ１３ＴＸ１５ＤＴＳＸ１９ＳＴＡＹＭＸ２５ＬＳＸ２８ＬＲＳＸ３２ＤＸ３４ＡＶＹＹＣＡＲ（配列番号３５）、
ＴＱＹＮＥＫＦＫＧＸ１０ＶＴＸ１３ＴＸ１５ＤＴＳＸ１９ＳＴＡＹＭＸ２５ＬＳＸ２８ＬＲＳＸ３２ＤＸ３４ＡＶＹＹＣＡＲ（配列番号３６）、及び
ＴＫＹＳＱＫＦＱＧＸ１０ＶＴＸ１３ＴＸ１５ＤＴＳＸ１９ＳＴＡＹＭＸ２５ＬＳＸ２８ＬＲＳＸ３２ＤＸ３４ＡＶＹＹＣＡＲ（配列番号３７）
から成る群から選択されるアミノ酸配列を含み、
配列番号２９において、Ｘ１はＲ又は非存在であり、Ｘ４はＩ又はＭであり、Ｘ６はＲ又はＡであり、Ｘ１０はＡ、Ｔ又はＩであり、Ｘ１６はＥ又はＬであり、Ｘ１９はＳ又はＲであり、Ｘ２３はＥ又はＤであり、Ｘ２５はＴ又はＭであり、
配列番号３５において、Ｘ２はＱ又はＫであり、Ｘ４はＮ又はＳであり、Ｘ５はＥ又はＱであり、Ｘ８はＫ又はＱであり、Ｘ１０はＲ又は非存在であり、Ｘ１３はＩ又はＭであり、Ｘ１５はＲ又はＡであり、Ｘ１９はＡ、Ｔ又はＩであり、Ｘ２５はＥ又はＬであり、Ｘ２８はＳ又はＲであり、Ｘ３２はＥ又はＤであり、Ｘ３４はＴ又はＭであり、
配列番号３６において、Ｘ１０はＲ又は非存在であり、Ｘ１３はＩ又はＭであり、Ｘ１５はＲ又はＡであり、Ｘ１９はＡ、Ｔ又はＩであり、Ｘ２５はＥ又はＬであり、Ｘ２８はＳ又はＲであり、Ｘ３２はＥ又はＤであり、Ｘ３４はＴ又はＭであり、
配列番号３７において、Ｘ１０はＲ又は非存在であり、Ｘ１３はＩ又はＭであり、Ｘ１５はＲ又はＡであり、Ｘ１９はＡ、Ｔ又はＩであり、Ｘ２５はＥ又はＬであり、Ｘ２８はＳ又はＲであり、Ｘ３２はＥ又はＤであり、Ｘ３４はＴ又はＭである。
特定の態様において、本開示のヒト化抗ＨＬＡ－Ａ２抗体は、アミノ酸配列ＷＧＱＧＴＴＶＴＶＳＳ（配列番号４４）を含むフレームワーク領域４（ＶＨ ＦＲ４）を含む重鎖可変領域を含む。特定の実施形態によれば、本開示のヒト化抗ＨＬＡ－Ａ２抗体は、配列番号６１～６６から成る群から選択されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域を含む。
特定の実施形態によれば、本開示のヒト化抗ＨＬＡ－Ａ２抗体は、アミノ酸配列ＤＸ２ＶＭＴＱＸ７ＰＬＳＸ１１Ｘ１２ＶＴＸ１５ＧＱＰＡＳＩＳＸ２３（配列番号４６）を含むフレームワーク領域１（ＶＬ ＦＲ１）を含む軽鎖可変領域を含み、Ｘ２はＶ又はＩであり、Ｘ７はＳ又はＴであり、Ｘ１１はＬ又はＳであり、Ｘ１２はＰ又はＳであり、Ｘ１５はＬ又はＰであり、Ｘ２３はＣ又はＦである。
一部の実施形態では、本開示のヒト化抗ＨＬＡ－Ａ２抗体は、アミノ酸配列ＷＸ２Ｘ３ＱＸ５ＰＧＱＸ９ＰＸ１１Ｘ１２ＬＩＹ（配列番号５１）を含むフレームワーク領域２（ＶＬ ＦＲ２）を含む軽鎖可変領域を含み、Ｘ２はＦ又はＹであり、Ｘ３はＱ又はＬであり、Ｘ５はＲ又はＫであり、Ｘ９はＳ又はＰであり、Ｘ１１はＲ又はＱであり、Ｘ１２はＲ又はＬである。
特定の態様において、本開示のヒト化抗ＨＬＡ－Ａ２抗体は、アミノ酸配列ＧＶＰＤＲＦＳＧＳＧＸ１１ＧＴＤＦＴＬＫＩＳＲＶＥＡＥＤＶＧＶＹＹＣ（配列番号５６）を含むフレームワーク領域３（ＶＬ ＦＲ３）を含む軽鎖可変領域を含み、Ｘ１１はＳ又はＡである。特定の実施形態によれば、本開示のヒト化抗ＨＬＡ－Ａ２抗体は、アミノ酸配列ＦＧＧＧＴＫＶＥＩＫ（配列番号５９）を含むフレームワーク領域４（ＶＬ ＦＲ４）を含む軽鎖可変領域を含む。一部の実施形態では、本開示のヒト化抗ＨＬＡ－Ａ２抗体は、配列番号６７～７１から成る群から選択されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含む。一部の実施形態では、本開示のヒト化抗ＨＬＡ－Ａ２抗体は、全抗体か、単鎖抗体か、二量体単鎖抗体か、Ｆｖか、ｓｃＦｖか、Ｆａｂか、Ｆ（ａｂ）’２か、脱フコシル化抗体か、二重特異性抗体か、ダイアボディか、トリアボディか、テトラボディか、ユニボディ、ドメイン抗体及びナノボディから成る群から選択される抗体断片か、又は、アフィボディ、アルファボディ、アルマジロリピートタンパク質ベースの足場、ノッティン、クニッツドメインペプチド、アフィリン、アフィチン、アドネクチン、アトリマー、エバシン、ＤＡＲＰｉｎ、アンチカリン、アビマー、フィノマー、バーサボディ若しくはデュオカリンから成る群から選択される抗体ミメティックである。
特定の実施形態によれば、本開示のヒト化抗ＨＬＡ－Ａ２抗体はｓｃＦｖである。例えば、本開示のヒト化抗ＨＬＡ－Ａ２抗体は、配列番号７２～９１から成る群から選択されるアミノ酸配列を含むｓｃＦｖであってよい。
一部の実施形態では、上記のヒト化抗ＨＬＡ－Ａ２抗体が提供され、本抗体は、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）の抗原結合ドメインを構成することが可能であり、ＣＡＲは、ＣＡＲがＨＬＡ－Ａ２に特異的に結合するように、免疫細胞（例えば制御性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ））において発現することが可能である。特定の態様において、上記のヒト化抗ＨＬＡ－Ａ２抗体が提供され、本抗体は、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）の抗原結合ドメインを構成することが可能であり、ＣＡＲは、免疫細胞（例えば制御性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ））がＨＬＡ－Ａ２によって活性化されるように、免疫細胞において発現することが可能である。
特定の態様において、上記のヒト化抗ＨＬＡ－Ａ２抗体のいずれかをコードする核酸が提供される。該核酸を含む発現ベクター及び遺伝子治療ベクターも提供される。該発現ベクター又は遺伝子治療ベクターを含む宿主細胞も提供される。
本開示の態様は、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を更に含む。例えば、（ｉ）上記のヒト化抗ＨＬＡ－Ａ２抗体のいずれかを含む細胞外ドメインと、（ｉｉ）膜貫通ドメインと、（ｉｉｉ）細胞内シグナル伝達ドメインを含む細胞質ドメインとを含むＣＡＲが提供され、ＣＡＲは、ＣＡＲがＨＬＡ－Ａ２に特異的に結合するように免疫細胞において発現することが可能である。該ＣＡＲは、ＢＢ７．２抗体を含むＣＡＲと比較して、ＨＬＡ－Ａ＊０３、ＨＬＡ－Ａ＊２５、ＨＬＡ－Ａ＊２９、ＨＬＡ－Ａ＊３０、ＨＬＡ－Ａ＊３１、ＨＬＡ－Ａ＊３３、ＨＬＡ－Ａ＊３６、ＨＬＡ－Ａ＊６８及びそれらの任意の組合せのうちの１つ以上から選択される少なくとも１つのＨＬＡ－Ａサブタイプに対する反応性が低くてよい。例えば、一部の実施形態では、該ＣＡＲは、ＢＢ７．２抗体を含むＣＡＲと比較して、ＨＬＡ－Ａ＊２５、ＨＬＡ－Ａ＊２９、ＨＬＡ－Ａ＊３０及びそれらの任意の組合せのうちの１つ以上から選択される少なくとも１つのＨＬＡ－Ａサブタイプに対する反応性が低い。本開示のＣＡＲは、免疫細胞がＨＬＡ－Ａ２によって活性化されるように、免疫細胞（例えば制御性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ））において発現することが可能であってよい。本開示のＣＡＲは、ヒンジ領域を含んでよい。特定の態様において、ヒンジ領域は、ＣＤ８ａのストーク領域を含む。
本開示のＣＡＲは、ＣＤ３ガンマ、ＣＤ３デルタ、ＣＤ３イプシロン、ＣＤ３ゼータ、Ｔ細胞受容体のアルファ鎖、Ｔ細胞受容体のベータ鎖、Ｔ細胞受容体のガンマ鎖、Ｔ細胞受容体のデルタ鎖、ＣＤ２８、ＣＤ４５、ＣＤ４、ＣＤ５、ＣＤ８、ＣＤ９、ＣＤ１６、ＣＤ２２、ＣＤ３３、ＣＤ３７、ＣＤ６４、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ１３４、ＣＤ１３７、及びＣＤ１５４並びにそれらの任意の組合せから成る群から選択されるタンパク質の膜貫通ドメインを含む膜貫通ドメインを含んでよい。一部の実施形態では、膜貫通ドメインは、ＣＤ２８の膜貫通ドメインを含む。
特定の実施形態によれば、本開示のＣＡＲは、ＣＤ３ガンマ、ＣＤ３デルタ、ＣＤ３イプシロン、ＣＤ３ゼータ、ＦｃＲガンマ、ＦｃＲアルファ、ＦｃＲイプシロン、ＣＤ５、ＣＤ２２、ＣＤ７９ａ、ＣＤ７９ｂ、及びＣＤ６６ｄ、並びにそれらの任意の組合せから成る群から選択されるタンパク質の機能的シグナル伝達ドメインを含む細胞内シグナル伝達ドメインを含む。一部の実施形態では、細胞内シグナル伝達ドメインは、ＣＤ３ゼータの機能的シグナル伝達ドメインを含む。特定の態様において、細胞内シグナル伝達ドメインは、共刺激ドメインを更に含む。該共刺激ドメインは、ＯＸ４０、ＣＤ２７、ＣＤ２８、リンパ球機能関連抗原－１（ＬＦＡ－１）（ＣＤ１１ａ／ＣＤ１８）、ＴＮＦＲ１（ＣＤ１２０ａ／ＴＮＦＲＳＦ１Ａ）、ＴＮＦＲ２（ＣＤ１２０ｂ／ＴＮＦＲＳＦ１Ｂ）、ＣＴＬＡ－４（ＣＤ１５２）、ＣＤ９５、ＩＣＯＳ（ＣＤ２７８）、４－１ＢＢ（ＣＤ１３７）、ＣＤ２、ＣＤ３０、ＣＤ４０、ＰＤ－１、ＣＤ７、ＬＩＧＨＴ、ＮＫＧ２Ｃ、Ｂ７－Ｈ３、ＩＣＡＭ－１、ＣＤ８３と特異的に結合するリガンド、ＩＬ２ｒａ（ＣＤ２５）、ＩＬ６Ｒａ（ＣＤ１２６）、ＩＬ－７Ｒａ（ＣＤ１２７）、ＩＬ－１３ＲＡ１、ＩＬ－１３ＲＡ２、ＩＬ－３３Ｒ（ＩＬ１ＲＬ１）、ＩＬ－１０ＲＡ、ＩＬ－１０ＲＢ、ＩＬ－４Ｒ、ＩＬ－５Ｒ（ＣＳＦ２ＲＢ）、ＡＲＨＲ、ＢＡＦＦ受容体、ＩＬ－２１Ｒ、ＴＧＦｂＲ１、ＴＧＦｂＲ２、ＴＧＦｂＲ３、共通ガンマ鎖及びそれらの任意の組合せから成る群から選択されるタンパク質の機能的シグナル伝達ドメインを含んでよい。特定の実施形態によれば、該共刺激ドメインは、ＣＤ２８及び４－１ＢＢから選択されるタンパク質の機能的シグナル伝達ドメインを含む。例えば、共刺激ドメインは、ＣＤ２８の機能的シグナル伝達ドメインを含んでよい。
また、本開示のＣＡＲのいずれかを含む改変免疫細胞も提供される。一部の実施形態では、改変免疫細胞は制御性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）である。
本開示は、本開示のＣＡＲのいずれかをコードする核酸を提供する。該核酸を含む発現ベクターも提供され、該発現ベクターを含む免疫細胞（例えば制御性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ））も同様である。
組成物（例えば医薬組成物）も提供される。特定の態様において、本開示の複数の改変免疫細胞又は免疫細胞を含む医薬組成物が提供される。部品のキットも提供される。一部の実施形態では、前記部品のキットは、第１の部品に本開示の免疫細胞を含み、第２の部品に、例えば免疫抑制剤等の別の治療薬を含む。一部の実施形態では、前記部品のキットは、本開示の細胞を作製するための１つ以上の試薬（例えば、本開示の抗ＨＬＡ－Ａ抗体若しくはＣＡＲをコードする核酸又は発現ベクター）を含む。本開示の改変免疫細胞を作製する方法も提供される。一部の実施形態では、該方法は、免疫細胞に本開示の発現ベクターを形質導入し、それにより改変免疫細胞を生成することを含む。
本開示の抗体、ＣＡＲ、免疫細胞、改変免疫細胞及び医薬組成物を使用する方法も提供される。特定の態様において、対象における免疫寛容を促進する方法が提供され、本方法は、本開示の医薬組成物、例えば本開示の改変免疫細胞又は免疫細胞を複数含む医薬組成物を、対象に投与することを含む。一部の実施形態では、免疫寛容は、移植された器官又は組織に対する寛容である。特定の実施形態によれば、対象における移植片対宿主病（ＧＶＨＤ）を予防又は治療する方法が提供され、本方法は、本開示の医薬組成物、例えば本開示の改変免疫細胞又は免疫細胞を複数含む医薬組成物を、対象に投与することを含む。特定の態様において、対象は造血幹細胞移植を受けているか、又は受けたことがある。対象における器官若しくは組織の移植拒絶反応を予防又は治療する方法も提供され、本方法は、本開示の医薬組成物、例えば本開示の改変免疫細胞又は免疫細胞を複数含む医薬組成物を、対象に投与することを含む。一部の実施形態では、対象は更に免疫抑制剤を投与されている。特定の実施形態によれば、対象における器官若しくは組織の移植拒絶反応又は移植片対宿主病（ＧＶＨＤ）を予防又は治療する方法が提供され、本方法は、本開示の免疫細胞と、免疫寛容を誘導するための少なくとも１つの免疫抑制剤との組合せを、対象に投与することを含む。本開示の抗体、ＣＡＲ、免疫細胞、改変免疫細胞及び医薬組成物を使用する方法のいずれにおいても、対象はヒトであってよい。
ヒト化抗ＨＬＡ－Ａ２ ＣＡＲの構築。レンチウイルスコンストラクトの概略図。上：切断型ＮＧＦＲ対照コンストラクト（ＣＡＲなし）；下：ヒト化抗ＨＬＡ－Ａ２ ＣＡＲコンストラクト。“ＳＰ”：シグナルペプチド；“ＧＳ”：グリシン－セリンリンカー；“ＴＭ”：膜貫通領域；“ｈｓ”：ヒト化。 ヒト化抗ＨＬＡ－Ａ２ ＣＡＲの細胞表面発現と特異性。２９３Ｔ細胞に指定のコンストラクトを一時的にトランスフェクトし、４８時間後、発現及び抗原特異性を、抗ΔＮＧＦＲ ｍＡｂ及びＨＬＡ－Ａ２四量体によるフローサイトメトリー染色によって測定した。ＡとＢは、それぞれＨＬＡ－Ａ２に結合する能力を保持しているコンストラクト又は保持していないコンストラクトのドットプロットを示す。データは２つの独立した実験を代表する。 同上。 ヒト化抗ＨＬＡ－Ａ２ ＣＡＲ結合強度の比較。２９３Ｔ細胞に指定のヒト化抗ＨＬＡ－Ａ２ ＣＡＲコンストラクトをトランスフェクトし、指定の希釈のＨＬＡ－Ａ２四量体で染色した。Ａ、Ｂ及びＣは、軽鎖の使用に従ってグループ化されたコンストラクトによる、ゲーティングされたΔＮＧＦＲ＋細胞内のＨＬＡ－Ａ２四量体結合の幾何平均蛍光強度を示すグラフを示す。 同上。 Ｔｒｅｇ上のヒト化抗ＨＬＡ－Ａ２ ＣＡＲの発現と特異性。ＣＤ４＋ＣＤ２５ｈｉＣＤ１２７ｌｏＴｒｅｇを活性化し、１日後に指定のレンチウイルスを形質導入し、その後増殖させた。活性化の７日後、ΔＮＧＦＲ発現細胞を磁気ビーズベースの分離によって選択した。ΔＮＧＦＲ細胞（Ａ、Ｂ、Ｃ及びＤ）の分離前後に、フローサイトメトリーによって形質導入効率及びＨＬＡ－Ａ２結合を測定した。数字は、ΔＮＧＦＲ＋四量体＋細胞の割合を表す。データは独立した実験を代表する。（Ｅ）Ａ＊０２：０１－四量体結合のパーセント又は平均蛍光強度の要約データ。 同上。 同上。 同上。 同上。 ＨＬＡ－Ａ２ ＣＡＲを介したＴｒｅｇの活性化。ＣＤ４＋ＣＤ２５ｈｉＣＤ１２７ｌｏＴｒｅｇを活性化し、指定のレンチウイルスを形質導入し、その後増殖させた。７日後、Ｔｒｅｇを１００Ｕ／ｍＬ ＩＬ－２と共に一晩休ませた後、抗ＣＤ３／２８ロードＣＤ６４－Ｋ５６２細胞（ＴＣＲ）又はＨＬＡ－Ａ２－Ｋ５６２細胞（ＣＡＲ）の２：１（Ｔｒｅｇｓ：Ｋ５６２細胞）の比率の共培養により、刺激あり又は刺激なしで放置した。２４時間後、ＣＤ６９、ＣＤ１５４、ＣＴＬＡ－４及びＬＡＰの発現を、生きているＣＤ４＋細胞でのフローサイトメトリーによって測定した。２つの独立した実験からの（Ａ＆Ｂ）代表的なヒストグラムと（Ｃ＆Ｄ）平均データを示す。（Ｅ）ΔＮＧＦＲ対照／ＣＡＲ Ｔｒｅｇｓを、ＨＬＡ－Ａ２発現Ｋ５６２細胞の２：１（Ｔｒｅｇｓ：Ｋ５６２）の比率で共培養した。１６時間後、ＣＤ６９、ＣＤ７１、ＣＴＬＡ－４及びＬＡＰの発現をフローサイトメトリーで測定した。ＣＤ６９及びＣＤ７１のベースライン（Ｋ５６２なし）発現に対する陽性率及び倍増。（Ｆ）ＣＴＬＡ－４及びＬＡＰのベースライン（Ｋ５６２なし）発現に対する陽性率及び倍増。データは、少なくとも２つの独立した実験からの各コンストラクトについてｎ＝２～４である。全てのコンストラクトをｍＡ２－ＣＡＲ Ｔｒｅｇと比較する一元配置分散分析とＨｏｌｍ－Ｓｉｄａｋのポストテスト。平均値±標準誤差。＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００１、＊＊＊＊ｐ＜０．０００１。 同上。 同上。 同上。 同上。 同上。 一般的なＨＬＡ－Ａ及びＨＬＡ－Ｂの対立遺伝子変異体とヒト化抗ＨＬＡ－Ａ２ ＣＡＲの交差反応性の測定。（Ａ）ＦｌｏｗＰＲＴ細胞アッセイの実験設定とゲーティング戦略の概略図を示す。指定のヒト化ＣＡＲを発現するΔＮＧＦＲＴｒｅｇを、Ｆｌｏｗ Ｐａｎｅｌ Ｒｅａｃｔｉｖｅ Ｓｉｎｇｌｅ Ａｎｔｉｇｅｎビーズ及び固定可能な生死判別色素（ｆｉｘａｂｌｅ ｖｉａｂｉｌｉｔｙ ｄｙｅ）とともに室温で３０分間インキュベートした。次に、サンプルを洗浄し、固定し、フローサイトメトリーで分析した。（Ｂ）ΔＮＧＦＲ Ｔｒｅｇ対照の結合と比較した、各ｍ／ｈＡ２－ＣＡＲ ＴｒｅｇのＨＬＡ－Ａ＊０２：０１コーティングビーズへの結合。（Ｃ＆Ｄ）ＦｌｏｗＰＲＴ細胞アッセイによって測定したＨＬＡ－Ａ＊０２：０１結合の平均と、（Ｃ）フローサイトメトリーによって評価したＨＬＡ－Ａ＊０２：０１－四量体ＭＦＩ又は（Ｄ）陰性対照ＨＬＡ－Ａ＊２４：０１ Ｋ５６２細胞に対する、ＨＬＡ－Ａ＊０２：０１との共培養から１６時間後のＣＤ６９＋細胞の割合の増加のいずれかとの間の相関。Ｅ、Ｆ、Ｇ及びＨのデータは、サイトメーターによって収集されたＨＬＡ陰性ビーズの数に対して正規化された、切断型ＮＧＦＲのみを発現する対照Ｔｒｅｇに対する結合率を示す。灰色の斜線部分（Ｅ、Ｆ＆Ｇ）又は横点線（Ｈ）の上のデータポイントは、ビーズのみの対照の平均から２標準偏差よりも大きく、よって、統計的に有意であること（ｐ＜０．０５）を表す。データは、３つの独立した実験の平均である。（Ｉ）選択されたＨＬＡ－Ａ対立遺伝子を発現するように形質導入された指定のＫ５６２細胞とともに、ΔＮＧＦＲ又はｍ／ｈＡ２－ＣＡＲ Ｔｒｅｇを共培養した。１６時間後、ＣＤ６９、ＣＤ７１、ＬＡＰ及びＣＴＬＡ－４の発現を、生きているＣＤ４＋Ｔ生細胞上で測定した。少なくとも２つの独立した実験からのｎ＝２～６。ｍＡ２－ＣＡＲと比較した一元配置分散分析及びＨｏｌｍ－Ｓｉｄａｋポストテストによって決定された統計的有意性。平均値±標準誤差、＊＊ｐ＜０．０１。 同上。 同上。 同上。 同上。 同上。 同上。 ヒト化ＨＬＡ－Ａ２ ＣＡＲを発現するＴｒｅｇは、ＨＬＡ－Ａ２＋樹状細胞によって刺激されるＴ細胞増殖を強力に抑制する。（Ａ）実験設定の概略図。成熟したＨＬＡ－Ａ２＋樹状細胞を用いて、Ｃｅｌｌ Ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ Ｄｙｅ（ＣＰＤ）－ｅ４５０標識ＨＬＡ－Ａ２ｎｅｇＣＤ４＋「レスポンダー」Ｔ細胞を刺激した。形質導入していない、又はΔＮＧＦＲをコードする対照レンチウイルスで形質導入したＣＰＤ－ｅ６６０標識Ｔｒｅｇ、又はヒト化Ａ２ ＣＡＲ発現Ｔｒｅｇ。（Ｂ、Ｃ、Ｄ＆Ｅ）指定の比率の細胞を６日間共培養し、その後、レスポンダーＣＰＤ－ｅ４５０標識レスポンダーＣＤ４＋Ｔ細胞の増殖量をフローサイトメトリーで測定した。Ｂは代表的なドットプロットを表し、Ｃ、Ｄ及びＥは複数の細胞比のグラフデータを示す。Ｃ、Ｄ及びＥは、少なくとも３つの独立した実験からのｎ＝３～７の平均データを示す。ΔＮＧＦＲ Ｔｒｅｇ対照に対して、Ｈｏｌｍ－Ｓｉｄａｋポストテストと二元配置分散分析を使用して統計を行った。＊ｐ＜０．０５、平均値±標準誤差。 同上。 同上。 ヒト化ＨＬＡ－Ａ２ ＣＡＲを発現するＴｒｅｇは、異種移植片対宿主病を強力に抑制する。照射したＮＳＧマウスに、ＰＢＳ（ｎ＝３）、８×１０６個のＨＬＡ－Ａ２＋ＰＢＭＣのみ（ｎ＝５）、又は４×１０６個のＨ１ｋ２ ＣＡＲ発現Ｔｒｅｇ（ｎ＝６）を注射した。血中のヒト細胞の生着を、７日ごとに監視した。（Ａ）生存曲線と、（Ｂ）実験開始時に対する体重変化の割合。（Ｃ）血中のヒトＣＤ４５を発現する単核細胞（生きているシングレット）の総数の割合。（Ｄ）全体のヒトＣＤ４５＋とＣＡＲ Ｔｒｅｇ（ｈＣＤ４５＋ｈＣＤ４＋ＨＬＡ－Ａ２－）の細胞生着を識別するゲーティング戦略。（Ｅ）血液μＬあたりのＰＢＭＣとＣＡＲ Ｔｒｅｇの生着の絶対数で示した、異種ＧＶＨＤマウスモデルでの養子導入後のインビボ細胞生着。ＰＢＭＣの数は、ｈＣＤ４５＋からＤでゲーティングされた総ＣＡＲ Ｔｒｅｇ数を引いたものとして計算した。 同上。 ｍ／ｈＡ２ ＣＡＲの発現により、ＨＬＡ－Ａ２：０１＋皮膚同種移植片への迅速かつ持続的なホーミングがＴｒｅｇに与えられる。Ｔｒｅｇに、ルシフェラーゼをコードするレンチウイルスと、対照ＨＥＲ２－ＣＡＲ、ｍＡ２－ＣＡＲ又はｈＡ２－ＣＡＲ（Ｈ１ｋ２）のいずれかと、を同時形質導入した。二重形質導入細胞をＦＡＣＳで選別し、５日間増殖させた後、ＮＳＧトランスジェニックマウスとＮＳＧ－ＨＬＡ－Ａ＊０２：０１トランスジェニックマウスの両方からの並置皮膚移植片を以前に移植したＮＳＧマウスに注射した。（Ａ）実験設定の概略図。Ｔｒｅｇ注射から（左）７２時間後又は（右）２１日後の（Ｂ）皮膚移植片の代表的なルシフェラーゼイメージング。ルシフェラーゼの発光量を、光子／秒／ｃｍ２／ステラジアンの平均量を用いて定量化し、（Ｃ）Ｔｒｅｇ注射の７２時間後又は（Ｄ）経時的に、ＨＬＡ－Ａ＊０２：０１－ＮＳＧ皮膚移植片とＮＳＧ皮膚移植片の比率としてプロットした。３つの独立した実験からの群あたりｎ＝２～３、平均±標準誤差。ボンフェローニ補正を使用した反復測定分散分析。 同上。 ＨＬＡ－Ａ２：０１＋皮膚同種移植片への迅速かつ持続的なホーミングを伴うｍ／ｈＡ２ ＣＡＲ Ｔｒｅｇのフローサイトメトリートラッキング。図９に示すように、ルシフェラーゼとＨＥＲ２－ＣＡＲ、ｍＡ２－ＣＡＲ又はｈＡ２－ＣＡＲのいずれかのコンストラクトとを含むレンチウイルスをＴｒｅｇに同時形質導入し、増殖させ、移植ＮＳＧマウスに注射した。（Ａ）フローサイトメトリープロットのプレゲーティングは、対照ＨＥＲ２－ＣＡＲの脾臓からの細胞に基づいた。（Ｂ）指定コンストラクトのｈＣＤ４／ｈＣＤ８フローサイトメトリープロファイル。（Ａ）のように、プロットをＦｖＤ－ｈＣＤ４５＋上でプレゲーティングした。（Ｃ）１つの独立した実験からの群ごとの実験エンドポイントｎ＝１での、脾臓及び流入領域リンパ節におけるｍ／ｈＡ２－ＣＡＲ Ｔｒｅｇの染色を示すフローサイトメトリープロット。＊ｐ＜０．０５。 同上。 ｈＡ２－ＣＡＲ－Ｔｒｅｇｓは、ヒト皮膚同種移植片拒絶反応を減少させる。ＮＳＧマウスにＨＬＡ－Ａ＊０２：０１＋ヒト皮膚を移植し、３週間後に以下のいずれかを注射した：ＰＢＳ（ｎ＝３）；ＨＬＡ－Ａ＊０２：０１ｎｅｇＰＢＭＣ単独（ｎ＝４）又は２：１の比の自己Ｈ１ｋ２ ＣＡＲ Ｔｒｅｇ（ｎ＝６）。ＰＢＭＣ／ｈＡ２－ＣＡＲ Ｔｒｅｇｓは、１つの実験で試験された２人の個別のドナー由来であった。（Ａ）体重を毎週３回監視し、（Ｂ）血液（左）と脾臓（右）におけるヒトＣＤ４５＋細胞の割合を実験エンドポイントで測定した。（Ｃ）Ｈ＆Ｅ染色により決定された移植皮膚切片の累積組織学的スコア。（Ｄ）移植された皮膚移植片を実験エンドポイントで免疫染色して、表皮内のインボルクリン発現量とＫｉ－６７＋細胞の割合を定量化した。（Ｅ）移植された皮膚切片内の指定遺伝子のｍＲＮＡ発現を、ｑＲＴ－ＰＣＲによって測定した。（Ｆ）移植された皮膚移植片を実験エンドポイントで免疫染色して、ヒトＣＤ４５＋細胞内のＦＯＸＰ３＋細胞の割合を定量化した。（Ｇ）移植された皮膚移植片、腸、肺及び肝臓の切片を実験エンドポイントで免疫染色して、各組織におけるヒトＣＤ４５＋細胞内のＦＯＸＰ３＋細胞の割合を示した。各データポイントは１匹のマウスを表す。箱ひげ図は平均値±範囲を示す。ＰＢＭＣをＨ１ｋ２と比較する両側マンホイットニー検定によって決定された統計的有意性。＊ｐ＜０．０５。 同上。 同上。 ヒト皮膚移植モデルにおける血中のｈＡ２ ＣＡＲ Ｔｒｅｇのフローサイトメトリートラッキング。図１１に示すように、ＮＳＧマウスにヒトＨＬＡ－Ａ＊０２＋皮膚を移植し、細胞を注射した。（Ａ）全体的なヒトＣＤ４５＋（ＰＢＭＣ）及びＣＡＲ Ｔｒｅｇ（ｈＣＤ４５＋ｈＣＤ４＋ＮＧＦＲ＋）細胞の生着を識別するゲーティング戦略。（Ｂ）経時的な血液μＬあたりのＰＢＭＣの絶対数及びＣＡＲ Ｔｒｅｇ生着。ＰＢＭＣの数は、（Ａ）でゲーティングされた、ｈＣＤ４５＋からＣＡＲ Ｔｒｅｇ総数を引いて計算した。 人工抗原提示細胞を用いたｈＡ２ ＣＡＲ Ｔｒｅｇの活性化。ΔＮＧＦＲ対照／ＣＡＲ Ｔｒｅｇｓを、刺激なしで、又は抗ＣＤ３及び抗ＣＤ２８モノクローナル抗体と結合したＣＤ６４－発現Ｋ５６２細胞の２：１（Ｔｒｅｇ：Ｋ５６２）比（ＴＣＲ刺激）のいずれかで、１６時間共培養した。（Ａ）ゲーティング戦略の例。（Ｂ）ＣＤ６９、ＣＤ７１、ＣＴＬＡ－４及びＬＡＰの発現をフローサイトメトリーによって測定した（左）。ベースライン（刺激なし）に対する各活性化マーカーの倍増を計算した（右）。データは、少なくとも２つの独立した実験からの各コンストラクトについてｎ＝２－４である。平均値±標準誤差。全てのコンストラクトをｍＡ２－ＣＡＲのＴｒｅｇと比較する一元配置分散分析及びＨｏｌｍ－Ｓｉｄａｋの多重比較テスト。＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊＊ｐ＜０．０００１。 同上。
Ｉ．一般的な技術
本発明の実施は、別段の指定がない限り、分子生物学（組換え技術を含む）、微生物学、細胞生物学、生化学及び免疫学の従来の技術を採用し、これらは当技術分野の技能の範囲内である。そのような技術は、「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ」、第２版（Ｓａｍｂｒｏｏｋ他、１９８９）；「Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ」（Ｍ．Ｊ．Ｇａｉｔ，（編），１９８４）；「Ａｎｉｍａｌ Ｃｅｌｌ Ｃｕｌｔｕｒｅ」（Ｒ．Ｉ．Ｆｒｅｓｈｎｅｙ，（編），１９８７）；「Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ」（Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．）；「Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ」（Ｆ．Ｍ．Ａｕｓｕｂｅｌ他、（編），１９８７及び定期更新）；「ＰＣＲ：Ｔｈｅ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ Ｃｈａｉｎ Ｒｅａｃｔｉｏｎ」，（Ｍｕｌｌｉｓ他、（編），１９９４）；「Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ｇｕｉｄｅ ｔｏ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ」（Ｐｅｒｂａｌ Ｂｅｒｎａｒｄ Ｖ．，１９８８）；“Ｐｈａｇｅ Ｄｉｓｐｌａｙ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ”（Ｂａｒｂａｓ他、２００１）等の文献で完全に説明されている。
当然のことながら、本発明は、記載される特定の実施形態に限定されず、それ自体、言うまでも変化し得る。また、当然ながら、本発明の範囲は添付の特許請求の範囲によってのみ限定されるので、本明細書において用いられる用語は、特定の実施形態を説明することのみを目的とし、限定することを意図するものではない。
別段の定義がない限り、本明細書において用いられる全ての技術用語と科学用語は、本発明が関係する技術分野の当業者によって一般に理解されるのと同じ意味を有する。本明細書に記載のものと類似又は均等の任意の方法及び材料を本発明の実施又は試験に使用することもできるが、好ましい方法及び材料をここで説明する。当業者であれば、本明細書に記載されるものと類似又は均等の多くの方法及び材料を認識し、それらは本発明の実施において用いることができる。実際、本発明は、記載される方法及び材料に決して限定されない。本発明の目的のために、以下の用語を以下に定義する。本明細書において言及される全ての刊行物は、該刊行物が引用されることに関連する方法及び／又は材料を開示及び説明するために、参照により本明細書に組み込まれる。記載される定義が参照により本明細書に組み込まれる文書と矛盾する場合、以下に記載される定義が優先するものとする。
ＩＩ．定義
用語「１つ（ａ）」及び「１つ（ａｎ）」は、冠詞の文法上の目的語の１つ又は２つ以上を指す。例として、「要素（ａｎ ｅｌｅｍｅｎｔ）」とは、１つの要素又は２つ以上の要素を意味する。
量、時間的な期間等の測定可能な値に言及するときの用語「約」は、指定された値から±２０％、又は場合によっては±１０％、又は場合によっては±５％、又は場合によっては±１％、又は場合によっては±０．１％の変動を包含することを意味し、これは、開示された方法を実行するには、そのような変動が妥当であるからである。
値の範囲が提供される場合、当然ながら、その範囲の上限と下限の間の各々の介在値（文脈上別段の明確な指示がない限り、下限の単位の１０分の１まで）と、その記載された範囲内の任意の他の記載値又は介在値は、本発明に包含される。これらのより小さな範囲の上限及び下限は、そのより小さな範囲に独立して含まれてもよく、本発明にも包含され、記載された範囲における任意の具体的に除外される限定に従う。記載された範囲が限界の一方又は両方を含む場合、そのような含まれる限界の一方又は両方を除外する範囲も、本発明に含まれる。
本明細書で用いられる用語「ＨＬＡ－Ａ２」及び「Ａ２」は、それぞれ、ＨＬＡ遺伝子複合体のＨＬＡ－Ａ遺伝子座のＨＬＡ－Ａ＊０２対立遺伝子ファミリーによってコードされる、細胞表面タンパク質を含むヒト白血球抗原（ＨＬＡ）タンパク質を指す。用語「ＨＬＡ－Ａ２」及び「Ａ２」に包含されるＨＬＡタンパク質は、血清学的試験又は遺伝子型判定によってＨＬＡ－Ａ＊０２抗原タイプに属するとして特定されたＨＬＡタンパク質を含む。ＨＬＡ－Ａ＊０２抗原タイプの追加の名称は、「ＨＬＡ－Ａ２」、「ＨＬＡ－Ａ０２」及び「ＨＬＡ－Ａ＊２」を含む。２０１０年にＨＬＡシステムの因子に関するＷＨＯ委員会（ＷＨＯ Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ ｆｏｒ Ｆａｃｔｏｒｓ ｏｆ ｔｈｅ ＨＬＡ Ｓｙｓｔｅｍ）によって開発されたＨＬＡ命名システムを含む、この対立遺伝子ファミリーによってコードされるＨＬＡタンパク質を識別する異なる命名システムが開発されている。用語「ＨＬＡ－Ａ２」及び「Ａ２」は、「ＨＬＡ－Ａ＊０２：０１」、「ＨＬＡ－Ａ＊０２：０２」、「ＨＬＡ－Ａ＊０２：０３」、「ＨＬＡ－Ａ＊０２：０４」、「ＨＬＡ－Ａ＊０２：０５」、「ＨＬＡ－Ａ＊０２：０６」、「ＨＬＡ－Ａ＊０２：０７」、「ＨＬＡ－Ａ＊０２：０８」、「ＨＬＡ－Ａ＊０２：０９」、「ＨＬＡ－Ａ＊０２：１０」及び「ＨＬＡ－Ａ＊０２：１１」で始まる命名を含むが、これらに限定されない「ＨＬＡ－Ａ＊０２：」で始まるこの命名システムに従って命名された対立遺伝子によってコードされるＨＬＡタンパク質を指す。「ＨＬＡ－Ａ＊０２：」に続く数字に加えて、対立遺伝子の命名は、大文字の「Ｐ」及び「Ｇ」を含むが、これらに限定されない大文字を含む場合もある（例えばＨＬＡ－Ａ＊０２：０１ＰやＨＬＡ－Ａ＊０２：０１：０１Ｇ）。「ＨＬＡ－Ａ＊０２：」で始まり、その後に２、３又は４の追加の数字が続く対立遺伝子の命名は、完全な命名、又は命名の開始部分を構成する場合がある。対立遺伝子の命名は、イタリック体である場合がある。また、用語「ＨＬＡ－Ａ２」及び「Ａ２」は、命名「ＨＬＡ－Ａ＊０２：０１」、「ＨＬＡ－Ａ＊０２：０２」、「ＨＬＡ－Ａ＊０２：０３」、「ＨＬＡ－Ａ＊０２：０４」、「ＨＬＡ－Ａ＊０２：０５」、「ＨＬＡ－Ａ＊０２：０６」、「ＨＬＡ－Ａ＊０２：０７」、「ＨＬＡ－Ａ＊０２：０８」、「ＨＬＡ－Ａ＊０２：０９」、「ＨＬＡ－Ａ＊０２：１０」及び「ＨＬＡ－Ａ＊０２：１１」を含むが、これらに限定されないこの命名システムに従って、「ＨＬＡ－Ａ＊０２：」で始まる命名によって特定されるＨＬＡタンパク質も指す。
本明細書で用いられる「ＨＬＡ－Ａサブタイプ」は、ＨＬＡ－Ａ遺伝子の対立遺伝子によってコードされるタンパク質を指す。
本明細書で用いられる「ＨＬＡ－Ａ＊０３」という用語は、ＨＬＡ遺伝子複合体のＨＬＡ－Ａ遺伝子座のＨＬＡ－Ａ＊０３対立遺伝子ファミリーによってコードされる、細胞表面タンパク質を含むＨＬＡタンパク質を指す。用語「ＨＬＡ－Ａ＊０３」に包含されるＨＬＡタンパク質は、血清学的試験又は遺伝子型判定によってＨＬＡ－Ａ＊０３抗原タイプに属するとして特定されたＨＬＡタンパク質を含む。ＨＬＡ－Ａ＊０３抗原タイプの追加の名称は、「ＨＬＡ－Ａ０３」及び「ＨＬＡ－Ａ３」を含む。用語「ＨＬＡ－Ａ＊０３」は、「ＨＬＡ－Ａ＊０３：０１」、「ＨＬＡ－Ａ＊０３：０２」、「ＨＬＡ－Ａ＊０３：０４」、「ＨＬＡ－Ａ＊０３：０５」、「ＨＬＡ－Ａ＊０３：０６」、「ＨＬＡ－Ａ＊０３：０７」、「ＨＬＡ－Ａ＊０３：０８」、「ＨＬＡ－Ａ＊０３：０９」、「ＨＬＡ－Ａ＊０３：１０」及び「ＨＬＡ－Ａ＊０３：１２」で始まる命名を含むが、これらに限定されない「ＨＬＡ－Ａ＊０３：」で始まる、ＨＬＡシステムの因子に関するＷＨＯ委員会（ＷＨＯ Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ ｆｏｒ Ｆａｃｔｏｒｓ ｏｆ ｔｈｅ ＨＬＡ Ｓｙｓｔｅｍ）によって２０１０年に開発されたＨＬＡ命名システムに従って命名された対立遺伝子によってコードされるＨＬＡタンパク質を指す。「ＨＬＡ－Ａ＊０３：」に続く数字に加えて、対立遺伝子の命名は、大文字の「Ｐ」及び「Ｇ」を含むが、これらに限定されない大文字を含む場合もある（例えばＨＬＡ－Ａ＊０３：０１ＰやＨＬＡ－Ａ＊０３：０１：０１Ｇ）。「ＨＬＡ－Ａ＊０３：」で始まり、その後に２、３又は４の追加の数字が続く対立遺伝子の命名は、完全な命名、又は命名の開始部分を構成する場合がある。対立遺伝子の命名は、イタリック体である場合がある。また、用語「ＨＬＡ－Ａ＊０３」は、「ＨＬＡ－Ａ＊０３：０１」、「ＨＬＡ－Ａ＊０３：０２」、「ＨＬＡ－Ａ＊０３：０４」、「ＨＬＡ－Ａ＊０３：０５」、「ＨＬＡ－Ａ＊０３：０６」、「ＨＬＡ－Ａ＊０３：０７」、「ＨＬＡ－Ａ＊０３：０８」、「ＨＬＡ－Ａ＊０３：０９」、「ＨＬＡ－Ａ＊０３：１０」及び「ＨＬＡ－Ａ＊０３：１２」「Ｐ」及び「Ｇ」を含むが、これらに限定されないこの命名システムに従って「ＨＬＡ－Ａ＊０３：」で始まる命名によって特定されるＨＬＡタンパク質も指す。
本明細書で用いられる用語「ＨＬＡ－Ａ＊２５」、「ＨＬＡ－Ａ２５」及び「Ａ２５」は、それぞれ、ＨＬＡ遺伝子複合体のＨＬＡ－Ａ遺伝子座のＨＬＡ－Ａ＊２５対立遺伝子ファミリーによってコードされる、細胞表面タンパク質を含むＨＬＡタンパク質を指す。用語「ＨＬＡ－Ａ＊２５」、「ＨＬＡ－Ａ２５」及び「Ａ２５」に包含されるＨＬＡタンパク質は、血清学的試験又は遺伝子型判定によってＨＬＡ－Ａ＊２５抗原タイプに属するとして特定されたＨＬＡタンパク質を含む。ＨＬＡ－Ａ＊２５抗原タイプの追加の名称は、「ＨＬＡ－Ａ２５」を含む。用語「ＨＬＡ－Ａ＊２５」、「ＨＬＡ－Ａ２５」及び「Ａ２５」は、「ＨＬＡ－Ａ＊２５：０１」、「ＨＬＡ－Ａ＊２５：０２」、「ＨＬＡ－Ａ＊２５：０３」、「ＨＬＡ－Ａ＊２５：０４」、「ＨＬＡ－Ａ＊２５：０５」、「ＨＬＡ－Ａ＊２５：０６」、「ＨＬＡ－Ａ＊２５：０７」、「ＨＬＡ－Ａ＊２５：０８」、「ＨＬＡ－Ａ＊２５：０９」、「ＨＬＡ－Ａ＊２５：１０」及び「ＨＬＡ－Ａ＊２５：１１」を含むが、これらに限定されない「ＨＬＡ－Ａ＊２５：」で始まる、ＨＬＡシステムの因子に関するＷＨＯ委員会（ＷＨＯ Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ ｆｏｒ Ｆａｃｔｏｒｓ ｏｆ ｔｈｅ ＨＬＡ Ｓｙｓｔｅｍ）によって２０１０年に開発されたＨＬＡ命名システムに従って命名された対立遺伝子によってコードされるＨＬＡタンパク質を指す。「ＨＬＡ－Ａ＊２５：」に続く数字に加えて、対立遺伝子の命名は、大文字の「Ｐ」及び「Ｇ」を含むが、これらに限定されない大文字を含む場合もある（例えばＨＬＡ－Ａ＊２５：０１ＰやＨＬＡ－Ａ＊２５：０１：０１Ｇ）。「ＨＬＡ－Ａ＊２５：」で始まり、その後に２、３又は４の追加の数字が続く対立遺伝子の命名は、完全な命名、又は命名の開始部分を構成する場合がある。対立遺伝子の命名は、イタリック体である場合がある。また、用語「ＨＬＡ－Ａ＊２５」、「ＨＬＡ－Ａ２５」及び「Ａ２５」は、命名「ＨＬＡ－Ａ＊２５：０１」、「ＨＬＡ－Ａ＊２５：０２」、「ＨＬＡ－Ａ＊２５：０３」、「ＨＬＡ－Ａ＊２５：０４」、「ＨＬＡ－Ａ＊２５：０５」、「ＨＬＡ－Ａ＊２５：０６」、「ＨＬＡ－Ａ＊２５：０７」、「ＨＬＡ－Ａ＊２５：０８」、「ＨＬＡ－Ａ＊２５：０９」、「ＨＬＡ－Ａ＊２５：１０」及び「ＨＬＡ－Ａ＊２５：１１」を含むが、これらに限定されないこの命名システムに従って、「ＨＬＡ－Ａ＊２５：」で始まる命名によって特定されるＨＬＡタンパク質も指す。
本明細書で用いられる用語「ＨＬＡ－Ａ＊２９」、「ＨＬＡ－Ａ２９」及び「Ａ２９」は、それぞれ、ＨＬＡ遺伝子複合体のＨＬＡ－Ａ遺伝子座のＨＬＡ－Ａ＊２９対立遺伝子ファミリーによってコードされる、細胞表面タンパク質を含むＨＬＡタンパク質を指す。用語「ＨＬＡ－Ａ＊２９」、「ＨＬＡ－Ａ２９」及び「Ａ２９」に包含されるＨＬＡタンパク質は、血清学的試験又は遺伝子型判定によってＨＬＡ－Ａ＊２９抗原タイプに属するとして特定されたＨＬＡタンパク質を含む。ＨＬＡ－Ａ＊２９抗原タイプの追加の名称は、「ＨＬＡ－Ａ２９」を含む。用語「ＨＬＡ－Ａ＊２９」、「ＨＬＡ－Ａ２９」及び「Ａ２９」は、「ＨＬＡ－Ａ＊２９：０１」、「ＨＬＡ－Ａ＊２９：０２」、「ＨＬＡ－Ａ＊２９：０３」、「ＨＬＡ－Ａ＊２９：０４」、「ＨＬＡ－Ａ＊２９：０５」、「ＨＬＡ－Ａ＊２９：０６」、「ＨＬＡ－Ａ＊２９：０７」、ＨＬＡ－Ａ＊２９：０９」、「ＨＬＡ－Ａ＊２９：１０」及び「ＨＬＡ－Ａ＊２９：１１」を含むが、これらに限定されない「ＨＬＡ－Ａ＊２９：」で始まる、ＨＬＡシステムの因子に関するＷＨＯ委員会（ＷＨＯ Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ ｆｏｒ Ｆａｃｔｏｒｓ ｏｆ ｔｈｅ ＨＬＡ Ｓｙｓｔｅｍ）によって２０１０年に開発されたＨＬＡ命名システムに従って命名された対立遺伝子によってコードされるＨＬＡタンパク質を指す。「ＨＬＡ－Ａ＊２９：」に続く数字に加えて、対立遺伝子の命名は、大文字の「Ｐ」及び「Ｇ」を含むが、これらに限定されない大文字を含む場合もある（例えばＨＬＡ－Ａ＊２９：０２ＰやＨＬＡ－Ａ＊２９：０２：０１Ｇ）。「ＨＬＡ－Ａ＊２９：」で始まり、その後に２、３又は４の追加の数字が続く対立遺伝子の命名は、完全な命名、又は命名の開始部分を構成する場合がある。対立遺伝子の命名は、イタリック体である場合がある。また、用語「ＨＬＡ－Ａ＊２９」、「ＨＬＡ－Ａ２９」及び「Ａ２９」は、命名「ＨＬＡ－Ａ＊２９：０１」、「ＨＬＡ－Ａ＊２９：０２」、「ＨＬＡ－Ａ＊２９：０３」、「ＨＬＡ－Ａ＊２９：０４」、「ＨＬＡ－Ａ＊２９：０５」、「ＨＬＡ－Ａ＊２９：０６」、「ＨＬＡ－Ａ＊２９：０７」、「ＨＬＡ－Ａ＊２９：０９」、「ＨＬＡ－Ａ＊２９：１０」及び「ＨＬＡ－Ａ＊２９：１１」を含むが、これらに限定されないこの命名システムに従って「ＨＬＡ－Ａ＊２９：」で始まる命名によって特定されるＨＬＡタンパク質も指す。
本明細書で用いられる用語「ＨＬＡ－Ａ＊３０」、「ＨＬＡ－Ａ３０」及び「Ａ３０」は、それぞれ、ＨＬＡ遺伝子複合体のＨＬＡ－Ａ遺伝子座のＨＬＡ－Ａ＊３０対立遺伝子ファミリーによってコードされる、細胞表面タンパク質を含むＨＬＡタンパク質を指す。用語「ＨＬＡ－Ａ＊３０」、「ＨＬＡ－Ａ３０」及び「Ａ３０」に包含されるＨＬＡタンパク質は、血清学的試験又は遺伝子型判定によってＨＬＡ－Ａ＊３０抗原タイプに属するとして特定されたＨＬＡタンパク質を含む。ＨＬＡ－Ａ＊３０抗原タイプの追加の名称は、「ＨＬＡ－Ａ３０」を含む。用語「ＨＬＡ－Ａ＊３０」、「ＨＬＡ－Ａ３０」及び「Ａ３０」は、「ＨＬＡ－Ａ＊３０：０１」、「ＨＬＡ－Ａ＊３０：０２」、「ＨＬＡ－Ａ＊３０：０３」、「ＨＬＡ－Ａ＊３０：０４」、「ＨＬＡ－Ａ＊３０：０６」、「ＨＬＡ－Ａ＊３０：０７」、「ＨＬＡ－Ａ＊３０：０８」、「ＨＬＡ－Ａ＊３０：」で始まる、ＨＬＡシステムの因子に関するＷＨＯ委員会（ＷＨＯ Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ ｆｏｒ Ｆａｃｔｏｒｓ ｏｆ ｔｈｅ ＨＬＡ Ｓｙｓｔｅｍ）によって２０１０年に開発されたＨＬＡ命名システムに従って命名された対立遺伝子によってコードされるＨＬＡタンパク質を指す。「ＨＬＡ－Ａ＊３０：」に続く数字に加えて、対立遺伝子の命名は、大文字の「Ｐ」及び「Ｇ」を含むが、これらに限定されない大文字を含む場合もある（例えばＨＬＡ－Ａ＊３０：０１Ｐ、ＨＬＡ－Ａ＊３０：０２Ｐ、ＨＬＡ－Ａ＊３０：０４Ｐ、ＨＬＡ－Ａ＊３０：０１：０１Ｇ、ＨＬＡ－Ａ＊３０：０２：０１Ｇ又はＨＬＡ－Ａ＊３０：０４：０１Ｇ）。「ＨＬＡ－Ａ＊３０：」で始まり、その後に２、３又は４の追加の数字が続く対立遺伝子の命名は、完全な命名、又は命名の開始部分を構成する場合がある。対立遺伝子の命名は、イタリック体である場合がある。また、用語「ＨＬＡ－Ａ＊３０」、「ＨＬＡ－Ａ３０」及び「Ａ３０」は、命名「ＨＬＡ－Ａ＊３０：０１」、「ＨＬＡ－Ａ＊３０：０２」、「ＨＬＡ－Ａ＊３０：０３」、「ＨＬＡ－Ａ＊３０：０４」、「ＨＬＡ－Ａ＊３０：０６」、「ＨＬＡ－Ａ＊３０：０７」、「ＨＬＡ－Ａ＊３０：０８」、「ＨＬＡ－Ａ＊３０：０９」、「ＨＬＡ－Ａ＊３０：１０」及び「ＨＬＡ－Ａ＊３０：１１」を含むが、これらに限定されないこの命名システムに従って「ＨＬＡ－Ａ＊３０：」で始まる命名によって特定されるＨＬＡタンパク質も指す。
本明細書で用いられる用語「ＨＬＡ－Ａ＊３１」、「ＨＬＡ－Ａ３１」及び「Ａ３１」は、それぞれ、ＨＬＡ遺伝子複合体のＨＬＡ－Ａ遺伝子座のＨＬＡ－Ａ＊３１対立遺伝子ファミリーによってコードされる、細胞表面タンパク質を含むＨＬＡタンパク質を指す。用語「ＨＬＡ－Ａ＊３１」、「ＨＬＡ－Ａ３１」及び「Ａ３１」に包含されるＨＬＡタンパク質は、血清学的試験又は遺伝子型判定によってＨＬＡ－Ａ＊３１抗原タイプに属するとして特定されたＨＬＡタンパク質を含む。ＨＬＡ－Ａ＊３１抗原タイプの追加の名称は、「ＨＬＡ－Ａ３１」を含む。用語「ＨＬＡ－Ａ＊３１」、「ＨＬＡ－Ａ３１」及び「Ａ３１」は、「ＨＬＡ－Ａ＊３１：０１」、「ＨＬＡ－Ａ＊３１：０２」、「ＨＬＡ－Ａ＊３１：０３」、「ＨＬＡ－Ａ＊３１：０４」、「ＨＬＡ－Ａ＊３１：０５」、「ＨＬＡ－Ａ＊３１：０６」、「ＨＬＡ－Ａ＊３１：０７」、「ＨＬＡ－Ａ＊３１：０８」、「ＨＬＡ－Ａ＊３１：０９」、「ＨＬＡ－Ａ＊３１：１０」及び「ＨＬＡ－Ａ＊３１：１１」を含むが、これらに限定されない「ＨＬＡ－Ａ＊３１：」で始まる、ＨＬＡシステムの因子に関するＷＨＯ委員会（ＷＨＯ Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ ｆｏｒ Ｆａｃｔｏｒｓ ｏｆ ｔｈｅ ＨＬＡ Ｓｙｓｔｅｍ）によって２０１０年に開発されたＨＬＡ命名システムに従って命名された対立遺伝子によってコードされるＨＬＡタンパク質を指す。「ＨＬＡ－Ａ＊３１：」に続く数字に加えて、対立遺伝子の命名は、大文字の「Ｐ」及び「Ｇ」を含むが、これらに限定されない大文字を含む場合もある（例えばＨＬＡ－Ａ＊３１：０１ＰやＨＬＡ－Ａ＊３１：０１：０２Ｇ）。「ＨＬＡ－Ａ＊３１：」で始まり、その後に２、３又は４の追加の数字が続く対立遺伝子の命名は、完全な命名、又は命名の開始部分を構成する場合がある。対立遺伝子の命名は、イタリック体である場合がある。また、用語「ＨＬＡ－Ａ＊３１」、「ＨＬＡ－Ａ３１」及び「Ａ３１」は、命名「ＨＬＡ－Ａ＊３１：０１」、「ＨＬＡ－Ａ＊３１：０２」、「ＨＬＡ－Ａ＊３１：０３」、「ＨＬＡ－Ａ＊３１：０４」、「ＨＬＡ－Ａ＊３１：０５」、「ＨＬＡ－Ａ＊３１：０６」、「ＨＬＡ－Ａ＊３１：０７」、「ＨＬＡ－Ａ＊３１：０８」、「ＨＬＡ－Ａ＊３１：０９」、「ＨＬＡ－Ａ＊３１：１０」及び「ＨＬＡ－Ａ＊３１：１１」を含むが、これらに限定されないこの命名システムに従って「ＨＬＡ－Ａ＊３１：」で始まる命名によって特定されるＨＬＡタンパク質も指す。
本明細書で用いられる用語「ＨＬＡ－Ａ＊３３」、「ＨＬＡ－Ａ３３」及び「Ａ３３」は、それぞれ、ＨＬＡ遺伝子複合体のＨＬＡ－Ａ遺伝子座のＨＬＡ－Ａ＊３３対立遺伝子ファミリーによってコードされる、細胞表面タンパク質を含むＨＬＡタンパク質を指す。用語「ＨＬＡ－Ａ＊３３」、「ＨＬＡ－Ａ３３」及び「Ａ３３」に含まれるＨＬＡタンパク質は、血清学的試験又は遺伝子型判定によってＨＬＡ－Ａ＊３３抗原タイプに属するとして特定されたＨＬＡタンパク質を含む。ＨＬＡ－Ａ＊３３抗原タイプの追加の名称は、「ＨＬＡ－Ａ３３」を含む。用語「ＨＬＡ－Ａ＊３３」、「ＨＬＡ－Ａ３３」及び「Ａ３３」は、「ＨＬＡ－Ａ＊３３：０１」、「ＨＬＡ－Ａ＊３３：０３」、「ＨＬＡ－Ａ＊３３：０４」、「ＨＬＡ－Ａ＊３３：０５」、「ＨＬＡ－Ａ＊３３：０６」、「ＨＬＡ－Ａ＊３３：０７」、「ＨＬＡ－Ａ＊３３：０８」、「ＨＬＡ－Ａ＊３３：０９」、「ＨＬＡ－Ａ＊３３：１０」及び「ＨＬＡ－Ａ＊３３：１１」を含むが、これらに限定されない「ＨＬＡ－Ａ＊３３：」で始まる、ＨＬＡシステムの因子に関するＷＨＯ委員会（ＷＨＯ Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ ｆｏｒ Ｆａｃｔｏｒｓ ｏｆ ｔｈｅ ＨＬＡ Ｓｙｓｔｅｍ）によって２０１０年に開発されたＨＬＡ命名システムに従って命名された対立遺伝子によってコードされるＨＬＡタンパク質を指す。「ＨＬＡ－Ａ＊３３：」に続く数字に加えて、対立遺伝子の命名は、大文字の「Ｐ」及び「Ｇ」を含むが、これらに限定されない大文字を含む場合もある（例えばＨＬＡ－Ａ＊３３：０１ＰやＨＬＡ－Ａ＊３３：０１：０１Ｇ）。「ＨＬＡ－Ａ＊３３：」で始まり、その後に２、３又は４の追加の数字が続く対立遺伝子の命名は、完全な命名、又は命名の開始部分を構成する場合がある。対立遺伝子の命名は、イタリック体である場合がある。また、用語「ＨＬＡ－Ａ＊３３」、「ＨＬＡ－Ａ３３」及び「Ａ３３」は、命名「ＨＬＡ－Ａ＊３３：０１」、「ＨＬＡ－Ａ＊３３：０３」、「ＨＬＡ－Ａ＊３３：０４」、「ＨＬＡ－Ａ＊３３：０５」、「ＨＬＡ－Ａ＊３３：０６」、「ＨＬＡ－Ａ＊３３：０７」、「ＨＬＡ－Ａ＊３３：０８」、「ＨＬＡ－Ａ＊３３：０９」、「ＨＬＡ－Ａ＊３３：１０」及び「ＨＬＡ－Ａ＊３３：１１」を含むが、これらに限定されないこの命名システムに従って「ＨＬＡ－Ａ＊３３：」で始まる命名によって特定されるＨＬＡタンパク質も指す。
本明細書で用いられる用語「ＨＬＡ－Ａ＊３６」、「ＨＬＡ－Ａ３６」及び「Ａ３６」は、それぞれ、ＨＬＡ遺伝子複合体のＨＬＡ－Ａ遺伝子座のＨＬＡ－Ａ＊３６対立遺伝子ファミリーによってコードされる、細胞表面タンパク質を含むＨＬＡタンパク質を指す。用語「ＨＬＡ－Ａ＊３６」、「ＨＬＡ－Ａ３６」及び「Ａ３６」に包含されるＨＬＡタンパク質は、血清学的試験又は遺伝子型判定によってＨＬＡ－Ａ＊３６抗原タイプに属するとして特定されたＨＬＡタンパク質を含む。ＨＬＡ－Ａ＊３６抗原タイプの追加の名称は、「ＨＬＡ－Ａ３６」を含む。用語「ＨＬＡ－Ａ＊３６」、「ＨＬＡ－Ａ３６」及び「Ａ３６」は、「ＨＬＡ－Ａ＊３６：０１」、「ＨＬＡ－Ａ＊３６：０２」、「ＨＬＡ－Ａ＊３６：０３」、「ＨＬＡ－Ａ＊３６：０４」及び「ＨＬＡ－Ａ＊３６：０５」を含むが、これらに限定されない「ＨＬＡ－Ａ＊３６：」で始まる、ＨＬＡシステムの因子に関するＷＨＯ委員会（ＷＨＯ Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ ｆｏｒ Ｆａｃｔｏｒｓ ｏｆ ｔｈｅ ＨＬＡ Ｓｙｓｔｅｍ）によって２０１０年に開発されたＨＬＡ命名システムに従って命名された対立遺伝子によってコードされるＨＬＡタンパク質を指す。「ＨＬＡ－Ａ＊３６：」に続く数字に加えて、対立遺伝子の命名は、大文字の「Ｐ」及び「Ｇ」を含むが、これらに限定されない大文字を含む場合もある。「ＨＬＡ－Ａ＊３６：」で始まり、その後に２、３又は４個の追加の数字が続く対立遺伝子の命名は、完全な命名、又は命名の開始部分を構成する場合がある。対立遺伝子の命名は、イタリック体である場合がある。また、用語「ＨＬＡ－Ａ＊３６」、「ＨＬＡ－Ａ３６」及び「Ａ３６」は、命名「ＨＬＡ－Ａ＊３６：０１」、「ＨＬＡ－Ａ＊３６：０２」、「ＨＬＡ－Ａ＊３６：０３」、「ＨＬＡ－Ａ＊３６：０４」、「ＨＬＡ－Ａ＊３６：０５」及び「ＨＬＡ－Ａ＊３６：０６」等を含むが、これらに限定されないこの命名システムに従って「ＨＬＡ－Ａ＊３６：」で始まる命名によって特定されるＨＬＡタンパク質も指す。
本明細書で用いられる用語「ＨＬＡ－Ａ＊６８」、「ＨＬＡ－Ａ６８」及び「Ａ６８」は、それぞれ、ＨＬＡ遺伝子複合体のＨＬＡ－Ａ遺伝子座のＨＬＡ－Ａ＊６８対立遺伝子ファミリーによってコードされる、細胞表面タンパク質を含むＨＬＡタンパク質を指す。用語「ＨＬＡ－Ａ＊６８」、「ＨＬＡ－Ａ６８」及び「Ａ６８」に包含されるＨＬＡタンパク質は、血清学的試験又は遺伝子型判定によってＨＬＡ－Ａ＊６８抗原タイプに属するとして特定されたＨＬＡタンパク質を含む。ＨＬＡ－Ａ＊６８抗原タイプの追加の名称は、「ＨＬＡ－Ａ６８」を含む。用語「ＨＬＡ－Ａ＊６８」、「ＨＬＡ－Ａ６８」及び「Ａ６８」は、「ＨＬＡ－Ａ＊６８：０１」、「ＨＬＡ－Ａ＊６８：０２」、「ＨＬＡ－Ａ＊６８：０３」、「ＨＬＡ－Ａ＊６８：０４」、「ＨＬＡ－Ａ＊６８：０５」、「ＨＬＡ－Ａ＊６８：０６」、「ＨＬＡ－Ａ＊６８：０７」、「ＨＬＡ－Ａ＊６８：０８」、「ＨＬＡ－Ａ＊６８：０９」及び「ＨＬＡ－Ａ＊６８：１０」を含むが、これらに限定されない「ＨＬＡ－Ａ＊６８：」で始まる、ＨＬＡシステムの因子に関するＷＨＯ委員会（ＷＨＯ Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ ｆｏｒ Ｆａｃｔｏｒｓ ｏｆ ｔｈｅ ＨＬＡ Ｓｙｓｔｅｍ）によって２０１０年に開発されたＨＬＡ命名システムに従って命名された対立遺伝子によってコードされるＨＬＡタンパク質を指す。「ＨＬＡ－Ａ＊６８：」に続く数字に加えて、対立遺伝子の命名は、大文字の「Ｐ」及び「Ｇ」を含むが、これらに限定されない大文字を含む場合もある（例えばＨＬＡ－Ａ＊６８：０１Ｐ、ＨＬＡ－Ａ＊６８：０１：０１Ｇ又はＨＬＡ－Ａ＊６８：０１：０２Ｇ）。「ＨＬＡ－Ａ＊６８：」で始まり、その後に２、３又は４の追加の数字が続く対立遺伝子の命名は、完全な命名、又は命名の開始部分を構成する場合がある。対立遺伝子の命名は、イタリック体である場合がある。また、用語「ＨＬＡ－Ａ＊６８」、「ＨＬＡ－Ａ６８」及び「Ａ６８」は、命名「ＨＬＡ－Ａ＊６８：０１」、「ＨＬＡ－Ａ＊６８：０２」、「ＨＬＡ－Ａ＊６８：０３」、「ＨＬＡ－Ａ＊６８：０４」、「ＨＬＡ－Ａ＊６８：０５」、「ＨＬＡ－Ａ＊６８：０６」、「ＨＬＡ－Ａ＊６８：０７」、「ＨＬＡ－Ａ＊６８：０８」、「ＨＬＡ－Ａ＊６８：０９」及び「ＨＬＡ－Ａ＊６８：１０」を含むが、これらに限定されないこの命名システムに従って「ＨＬＡ－Ａ＊６８：」で始まる命名によって特定されるＨＬＡタンパク質も指す。
本明細書では、特定のＨＬＡタンパク質は、ＨＬＡシステムの因子に関するＷＨＯ委員会（ＷＨＯ Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ ｆｏｒ Ｆａｃｔｏｒｓ ｏｆ ｔｈｅ ＨＬＡ Ｓｙｓｔｅｍ）によって２０１０年に開発されたＨＬＡ命名システムに従うタンパク質の命名を用いて、具体的なＨＬＡタンパク質に言及する場合がある。例えば、本明細書で用いられる用語「ＨＬＡ－Ａ＊０２：０１」は、この命名システムに従って「ＨＬＡ－Ａ＊０２：０１」と命名されたＨＬＡタンパク質を指す。同様に、用語「ＨＬＡ－Ａ＊０３：０１」、「ＨＬＡ－Ａ＊２５：０１」、「ＨＬＡ－Ａ＊２９：０２」、「ＨＬＡ－Ａ＊３０：０１」、「ＨＬＡ－Ａ＊３１：０１」、「ＨＬＡ－Ａ＊３３：０１」、「ＨＬＡ－Ａ＊３６：０１」、「ＨＬＡ－Ａ＊６８：０１」は、それぞれ、「ＨＬＡ－Ａ＊０３：０１」、「ＨＬＡ－Ａ＊２５：０１」、「ＨＬＡ－Ａ＊２９：０２」、「ＨＬＡ－Ａ＊３０：０１」、「ＨＬＡ－Ａ＊３１：０１」、「ＨＬＡ－Ａ＊３３：０１」、「ＨＬＡ－Ａ＊３６：０１」、「ＨＬＡ－Ａ＊６８：０１」と命名されたＨＬＡタンパク質を指す。
本明細書で用いられる用語「抗ＨＬＡ－Ａ２抗体」は、ＨＬＡ－Ａ２に優先的又は特異的に結合する抗体を指す。
本明細書で用いられる用語「ＢＢ７．２」は、ＡＴＣＣ寄託番号ＨＢ－８２として識別されるマウスハイブリドーマを指す。ＢＢ７．２ハイブリドーマ細胞は、Ｐａｒｈａｍ、Ｐ．他とＨｉｌｔｏｎ他（Ｐａｒｈａｍ、Ｐ．他、１９８１；Ｈｉｌｔｏｎ他、２０１３）によって特徴付けられた、ＩｇＧ２ｂカッパアイソタイプのマウスモノクローナル抗体を分泌する。ＢＢ７．２によって分泌されるモノクローナル抗体の６つの相補性決定領域（ＣＤＲ）のアミノ酸配列は、次のとおりである：
重鎖ＣＤＲ１（ＨＣＤＲ１）：ＳＹＨＩＱ（配列番号１８３）；
重鎖ＣＤＲ２（ＨＣＤＲ２）：ＷＩＹＰＧＤＧＳＴＱＹＮＥＫＦＫＧ（配列番号１８５）；
重鎖ＣＤＲ３（ＨＣＤＲ３）：ＥＧＴＹＹＡＭＤＹ（配列番号１８７）；
軽鎖ＣＤＲ１（ＬＣＤＲ１）：ＲＳＳＱＳＩＶＨＳＮＧＮＴＹＬＥ（配列番号１８８）；
軽鎖ＣＤＲ２（ＬＣＤＲ２）：ＫＶＳＮＲＦＳ（配列番号１８９）；
軽鎖ＣＤＲ３（ＬＣＤＲ３）：ＦＱＧＳＨＶＰＲＴ（配列番号１９０）。
本明細書で用いられる場合、「ＢＢ７．２抗体」は、ＢＢ７．２によって分泌されるモノクローナル抗体のＶＨ（配列番号１９１）及びＶＬ（配列番号１９２）を有する抗体である。ＢＢ７．２抗体は、ＢＢ７．２によって分泌されるモノクローナル抗体のＶＨ及びＶＬを有するｓｃＦｖ等、ＢＢ７．２によって分泌されるモノクローナル抗体のＶＨ及びＶＬを有する抗体全体又はその断片であってよい。
用語「抗体」及び「免疫グロブリン」は、任意のアイソタイプの抗体又は免疫グロブリン、抗原への特異的結合を保持する抗体の断片（Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖ、ｓｃＦｖ、Ｆｄ、ダイアボディ、単一ドメイン抗体（ｓｄＡｂ）、線形抗体、単鎖抗体分子、及び抗体断片から形成される多重特異性抗体を含むが、これらに限定されない）、キメラ抗体、ヒト化抗体、単鎖抗体、及び抗体の抗原結合部と非抗体タンパク質とを含む融合タンパク質を含む。
抗体は、ポリクローナルであってもモノクローナルであってもよく、多鎖であっても単鎖であってもよく、又はインタクト免疫グロブリンであってもよく、天然源に由来しても組換え源に由来してもよい。抗体は、免疫グロブリン分子の四量体であってよい。基本的な４鎖抗体ユニットは、２つの同一の軽（Ｌ）鎖と２つの同一の重（Ｈ）鎖とから構成されるヘテロ四量体糖タンパク質である。ＩｇＧの場合、４鎖ユニットは一般に約１５０，０００ダルトンである。各Ｌ鎖は１つの共有ジスルフィド結合によってＨ鎖に結合され、２つのＨ鎖は、Ｈ鎖アイソタイプに応じて、１つ以上のジスルフィド結合によって互いに結合される。各Ｈ鎖及びＬ鎖には、一定の間隔で鎖内ジスルフィド架橋もある。各Ｈ鎖は、Ｎ末端に可変ドメイン（ＶＨ）をもち、α鎖及びγ鎖の各々については３つの定常ドメイン（ＣＨ）が続き、μアイソタイプ及びεアイソタイプについては４つのＣＨドメインが続く。各Ｌ鎖は、Ｎ末端に可変ドメイン（ＶＬ）をもち、もう一方の端に定常ドメイン（ＣＬ）が続く。ＶＬはＶＨと整列し、ＣＬは重鎖の第１の定常ドメイン（ＣＨ１）と整列する。特定のアミノ酸残基は、軽鎖と重鎖の可変ドメインの間に界面を形成すると考えられている。ＶＨとＶＬのペアリングにより、単一の抗原結合部位が形成される。異なるクラスの抗体の構造と特性については、例えばＢａｓｉｃ ａｎｄ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，第８版，Ｄａｎｉｅｌ Ｐ．Ｓｔｉｔｅｓ，Ａｂｂａ Ｉ．Ｔｅｒｒ及びＴｒｉｓｔｒａｍ Ｇ．Ｐａｒｓｌｏｗ（編），Ａｐｐｌｅｔｏｎ＆Ｌａｎｇｅ，コネチカット州ノーウォーク、１９９４年、７１頁及び第６章を参照されたい。脊椎動物種のＬ鎖は、その定常ドメインのアミノ酸配列に基づいて、カッパとラムダと呼ばれる２つの明らかに別々の種類のいずれかに割り当てることができる。その重鎖（ＣＨ）の定常ドメインのアミノ酸配列に応じて、免疫グロブリンは、異なるクラス又はアイソタイプに割り当てることができる。免疫グロブリンの５つのクラス：ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ、及びＩｇＭは、それぞれα、δ、ε、γ、μと呼ばれる重鎖を有する。γクラスとαクラスは、ＣＨ配列と機能における比較的小さな違いに基づいて、更にサブクラスに分類され、例えば、ヒトは、以下のサブクラス：ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１及びＩｇＡ２を発現する。
抗体の「可変領域」又は「可変ドメイン」とは、抗体の重鎖又は軽鎖のアミノ末端ドメインを指す。重鎖の可変ドメインは、「ＶＨ」、「ＶＨ」又は「Ｈ」と呼ばれることがある。軽鎖の可変ドメインは、「ＶＬ」、「ＶＬ」又は「Ｌ」と呼ばれることがある。これらのドメインは、一般に、抗体の最も可変性の高い部分であり、抗原結合部位を含む。
用語「可変」は、可変ドメインの特定のセグメントの配列が抗体間で大幅に異なるという事実を指す。Ｖドメインは抗原結合を媒介し、その特定の抗原に対する特定の抗体の特異性を定義する。しかしながら、可変性は、可変ドメインの１１０～１３０アミノ酸の範囲に均等に分布はしていない。代わりに、Ｖ領域は、１５～３０アミノ酸のフレームワーク領域（ＦＲ）と呼ばれる比較的不変のストレッチで構成され、それぞれ９～１２アミノ酸長である「超可変領域」と呼ばれる極端な可変性を有する短い領域によって区切られる。天然の重鎖及び軽鎖の可変ドメインは、それぞれ４つのＦＲを有し、主にβシート構成を採用し、３つの超可変領域によって接続され、βシート構造を接続する（場合によってはβシート構造の一部を形成する）ループを形成する。各鎖の超可変領域は、ＦＲによって近接して一緒に保持され、他の鎖の超可変領域とともに、抗体の抗原結合部位の形成に寄与する（Ｋａｂａｔ他、Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，第５版、Ｐｕｂｌｉｃ Ｈｅａｌｔｈ Ｓｅｒｖｉｃｅ，Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，ＭＤ．（１９９１）を参照）。
「インタクト」抗体とは、抗原結合部位とＣＬ及び少なくとも重鎖定常ドメインＣＨ１、ＣＨ２及びＣＨ３を含む抗体である。定常ドメインは、天然の配列定常ドメイン（例えばヒト天然配列定常ドメイン）又はそのアミノ酸配列変異体であってよい。一実施形態では、インタクト抗体は、１つ以上のエフェクター機能を有することがある。
用語「抗体断片」は、インタクト抗体又はその組換え変異体の少なくとも一部を指し、抗原等の標的に対する認識と抗体断片の特異的結合を付与するのに十分である、インタクト抗体の抗原結合ドメイン、例えば抗原決定可変領域を指す。抗体断片の例には、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖ断片、ｓｃＦｖ断片；ダイアボディ；単一ドメイン抗体（ｓｄＡｂ）；線状抗体（米国特許第５，６４１，８７０号、実施例２；Ｚａｐａｔａ他、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇ．８（１０）：１０５７－１０６２［１９９５］を参照）；単鎖抗体分子；及び抗体断片から形成された多重特異性抗体が含まれる。一実施形態では、抗体断片は、インタクト抗体の抗原結合部位を含み、よって、抗原に結合する能力を保持する。抗ＨＬＡ－Ａ２抗体の断片の中には、ＣＡＲ－改変免疫細胞のキメラ抗原受容体においてターゲティングアーム（ＨＬＡ－Ａ２に向けられる）として使用できる、抗ＨＬＡ－Ａ２抗体の一部（及び抗ＨＬＡ－Ａ２抗体の一部（例えばｓｃＦｖ）の組合せ）も含まれる。そのような断片は、必ずしもタンパク質分解断片ではなく、むしろ標的に対する親和性を付与することのできるポリペプチド配列の一部である。抗ＨＬＡ－Ａ２抗体断片の中には、単一ドメイン抗体（ｓｄＡｂ）が更に含まれる（例えばＬｉ他（２０１７年）；Ｊａｍｎａｎｉ他（２０１４）を参照）。そのような単一ドメイン抗体は、本発明のＣＡＲ改変免疫細胞におけるターゲティングアームとして用いることができる。
抗体のパパイン消化により、「Ｆａｂ」断片と呼ばれる２つの同一の抗原結合断片と、容易に結晶化する能力を反映した命名である残りの「Ｆｃ」断片とが生成される。Ｆａｂ断片は、Ｈ鎖の可変領域ドメイン（ＶＨ）と１つの重鎖の第１の定常ドメイン（ＣＨ１）に加えて、Ｌ鎖全体から構成される。各Ｆａｂ断片は、抗原結合に関して一価であり、つまり、単一の抗原結合部位を有する。抗体のペプシン処理により、２価の抗原結合活性を有する２つのジスルフィド結合Ｆａｂ断片にほぼ対応し、依然として抗原を架橋することが可能である、単一の大きなＦ（ａｂ’）２断片が生じる。Ｆａｂ’断片は、抗体のヒンジ領域からの１つ以上のシステインを含むＣＨ１ドメインのカルボキシ末端にいくつかの残基が追加されていることにより、Ｆａｂ断片とは異なる。Ｆａｂ’－ＳＨは、定常ドメインのシステイン残基（複数可）が遊離チオール基を有するＦａｂ’の、本明細書での命名である。Ｆ（ａｂ’）２抗体断片は、元々、間にヒンジシステインを有するＦａｂ’断片のペアとして作成された。抗体断片の他の化学的カップリングも公知である。
Ｆｃ断片は、ジスルフィドによって保持された両方のＨ鎖のカルボキシ末端部分を含む。抗体のエフェクター機能は、Ｆｃ領域の配列によって決定され、この領域は、特定の種類の細胞上に見られるＦｃ受容体（ＦｃＲ）によって認識される部分でもある。
「Ｆｖ」は、完全な抗原認識と抗原結合部位を含む最小の抗体断片である。この断片は、密接な非共有結合で結合している１つの重鎖可変領域ドメインと１つの軽鎖可変領域ドメインの二量体から成る。単鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）種では、１つの重鎖可変ドメインと１つの軽鎖可変ドメインを可動性ペプチドリンカーによって共有結合することができるので、軽鎖と重鎖は、２鎖Ｆｖ種の構造に類似した「二量体」構造で関連付けることができる。これら２つのドメインの折り畳みから、抗原結合のアミノ酸残基に寄与し、抗体に抗原結合特異性を付与する６つの超可変ループ（Ｈ鎖とＬ鎖からそれぞれ３つのループ）が発生する。しかしながら、単一の可変ドメイン（又は、抗原に特異的な３つのＣＤＲのみを含むＦｖの半分）でさえ、結合部位全体よりも低い親和性ではあるが、抗原を認識し結合する能力を有する。
「ｓＦｖ」又は「ｓｃＦｖ」とも略される「単鎖Ｆｖ」は、単一のポリペプチド鎖に接続されたＶＨ抗体ドメイン及びＶＬ抗体ドメインを含む抗体断片である。ｓｃＦｖポリペプチドは、ｓｃＦｖが抗原結合のための所望の構造を形成することを可能にするポリペプチドリンカーを、ＶＨドメインとＶＬドメインとの間に更に含むことがある。特記しない限り、本明細書で使用するｓｃＦｖは、例えばポリペプチドのＮ末端及びＣ末端に関して、ＶＬ可変領域とＶＨ可変領域をいずれかの順序で有してよく、ｓｃＦｖは、ＶＬ－リンカー－ＶＨを含んでも、ＶＨ－リンカー－ＶＬを含んでもよい。ｓｃＦｖの概説については、Ｐｌｕｃｋｔｈｕｎ ｉｎ Ｔｈｅ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ ｏｆ Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ、第１１３巻、Ｒｏｓｅｎｂｕｒｇ及びＭｏｏｒｅ編、Ｓｐｒｉｎｇｅｒ－Ｖｅｒｌａｇ、ニューヨーク、２６９－３１５頁（１９９４）；Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ、Ｂｏｒｒｅｂａｅｃｋ編、オックスフォード大学出版局、ニューヨーク（１９９５）を参照されたい。一実施形態では、抗ＨＬＡ－Ａ２抗体由来ｓｃＦｖは、本明細書に開示されるＣＡＲ改変免疫細胞のターゲティングアームとして用いることができる。
モノボディとしても知られる用語「アドネクチン」は、当技術分野において周知であり、抗原に対して高い親和性と特異性で結合するように設計されたタンパク質を指す。それらは、まとめて「抗体ミメティック」と呼ばれる分子のクラスに属する。
用語「アルファボディ」は、細胞透過性アルファボディと呼ばれ、様々な抗原に結合するように遺伝子操作された小さな１０ｋＤａタンパク質から成る抗体ミメティックの一種を指す。アルファボディは、細胞内タンパク質の標的に到達し結合することができる。
用語「アフィボディ」は、当技術分野において周知であり、ブドウ球菌プロテインＡのＩｇＧ結合ドメインの１つに由来する５８アミノ酸残基のタンパク質ドメインに基づく親和性タンパク質を指す。
用語「アンチカリン」は、当技術分野において周知であり、結合特異性がリポカリンに由来する抗体ミメティック技術を指す。アンチカリンは、デュオカリンと呼ばれる二重ターゲティングタンパク質としてフォーマットすることもできる。
用語「アルマジロリピートタンパク質ベースの足場」は、アルマジロリピートタンパク質に基づく人工ペプチド結合足場に対応する抗体ミメティックの一種を指す。アルマジロリピートタンパク質は、ペプチド又はタンパク質との相互作用を媒介する約４２個のアミノ酸のタンデムアルマジロリピートで構成されるアルマジロドメインによって特徴付けられる。
用語「アビマー」は、当技術分野において周知であり、抗体ミメティック技術を指す。用語「ＤＡＲＰｉｎ」（Ｄｅｓｉｇｎｅｄ Ａｎｋｙｒｉｎ Ｒｅｐｅａｔ Ｐｒｏｔｅｉｎ（設計されたアンキリンリピートタンパク質））は、当技術分野において周知であり、非抗体ポリペプチドの結合能力を活用するために開発された抗体ミメティックＤＲＰ（ｄｅｓｉｇｎｅｄ ｒｅｐｅａｔ ｐｒｏｔｅｉｎ（設計されたリピートタンパク質））技術を指す。
用語「ダイアボディ」は、Ｖドメインの鎖間ではなく鎖内のペアリングが達成され、２価の断片、つまり２つの抗原結合部位を有する断片が得られるように、ＶＨドメインとＶＬドメインの間に短いリンカー（約５～１０残基）を有するｓｃＦｖ断片を構築することによって調製された小さな抗体断片を指す。二重特異性ダイアボディは、２つの抗体のＶＨドメイン及びＶＬドメインが異なるポリペプチド鎖上に存在する、２つの「クロスオーバー」ｓｃＦｖ断片のヘテロダイマーである。ダイアボディは、例えば、ＥＰ０４０４０９７；ＷＯ９３／１１１６１；及びＨｏｌｌｉｇｅｒ他、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９０：６４４４－６４４８（１９９３）においてより完全に記載されている。
用語「エバシン」は、当技術分野において周知であり、ケモカイン結合タンパク質のクラスを指す。
用語「フィノマー」は、当技術分野において周知であり、抗体ミメティックのクラスに属するタンパク質を指す。それらは、熱安定性が高く、免疫原性が低いので、魅力的な結合分子である。
用語「ノッティン」（インヒビターシスチンノットとも呼ばれ得る）は、３つのジスルフィド架橋を含むタンパク質構造モチーフを含む抗体ミメティックを指す。
用語「クニッツドメインペプチド」は、抗体ミメティックの一種を指し、プロテアーゼの機能を阻害するタンパク質の活性ドメインに基づく。
用語「ナノボディ」は、当技術分野において周知であり、天然に存在する重鎖抗体の独特の構造的特性及び機能的特性を含む抗体由来の治療用タンパク質を指す。これらの重鎖抗体は、単一の可変ドメイン（ＶＨＨ）と２つの定常ドメイン（ＣＨ２及びＣＨ３）を含む。
用語「ユニボディ」は、当技術分野において周知であり、ＩｇＧ４抗体のヒンジ領域を欠く抗体断片を指す。ヒンジ領域の欠失により、従来のＩｇＧ４抗体のサイズの本質的に半分の分子が得られ、ＩｇＧ４抗体の二価結合領域ではなく一価結合領域を有する。
用語「バーサボディ」は、当技術分野において周知であり、別の抗体ミメティック技術を指す。それらは、１５％超のシステインを有する３～５ｋＤａの小さなタンパク質であり、高ジスルフィド密度の足場を形成し、典型的なタンパク質が有する疎水性コアに置き換わる。
ｓｃＦｖの文脈において用いられる用語「可動性ポリペプチドリンカー」又は「リンカー」は、可変重鎖領域と可変軽鎖領域を結合するために、単独又は組合せで用いられるグリシン残基及び／又はセリン残基等のアミノ酸から成るペプチドリンカーを指す。一実施形態では、可動性ポリペプチドリンカーはＧｌｙ／Ｓｅｒリンカーであり、アミノ酸配列（Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｓｅｒ）ｎを含み、ｎは１以上の正の整数である。例えば、ｎ＝１、ｎ＝２、ｎ＝３、ｎ＝４、ｎ＝５、ｎ＝６、ｎ＝７、ｎ＝８、ｎ＝９、及びｎ＝１０である。別の実施形態では、可動性ポリペプチドリンカーはＧｌｙ／Ｓｅｒリンカーであり、アミノ酸配列（Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｓｅｒ）ｎを含み、ｎは１以上の正の整数である。例えば、ｎ＝１、ｎ＝２、ｎ＝３、ｎ＝４、ｎ＝５、ｎ＝６、ｎ＝７、ｎ＝８、ｎ＝９及びｎ＝１０である。一実施形態では、可動性ポリペプチドリンカーは、（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）４又は（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）３を含むが、これらに限定されない。別の実施形態では、リンカーは、（Ｇｌｙ２Ｓｅｒ）、（ＧｌｙＳｅｒ）又は（Ｇｌｙ３Ｓｅｒ）の複数の反復を含む。また、参照により本明細書に組み込まれるＷＯ２０１２／１３８４７５に記載されているリンカーも、本発明の範囲内に含まれる。
用語「重鎖」は、天然に存在する立体構造において抗体分子に存在する２つのタイプのポリペプチド鎖の大きい方を指し、通常、抗体が属するクラスを決定する。
用語「軽鎖」は、天然に存在する立体構造において抗体分子に存在する２つの種類のポリペプチド鎖の小さい方を指す。カッパ（Κ）軽鎖及びラムダ（λ）軽鎖は、２つの主要な抗体軽鎖アイソタイプを指す。
用語「超可変領域」、「ＨＶＲ」又は「ＨＶ」は、本明細書で用いられる場合、配列において超可変でありかつ／又は構造的に定義されたループを形成する抗体可変ドメインの領域を指す。一般に、抗体は、６つの超可変領域、すなわちＶＨの３つ（Ｈ１、Ｈ２、Ｈ３）とＶＬの３つ（Ｌ１、Ｌ２、Ｌ３）を含む。多くの超可変領域の描写が使用されており、本明細書に包含される。Ｋａｂａｔ相補性決定領域（ＣＤＲ）は、配列多様性に基づいており、最も一般的に用いられている（Ｋａｂａｔ他、１９９１）。Ｃｈｏｔｈｉａは、代わりに構造的ループの場所に言及する（Ｃｈｏｔｈｉａ他、１９８７）。Ｋａｂａｔナンバリング法を用いて番号付けした場合のＣｈｏｔｈｉａ ＣＤＲ－Ｈ１ループの終わりは、ループの長さによってＨ３２とＨ３４の間で異なる（これは、ＫａｂａｔナンバリングスキームがＨ３５ＡとＨ３５Ｂに挿入を配置するからである。３５Ａも３５Ｂも存在しない場合、ループは３２で終了する。３５Ａしか存在しない場合、ループは３３で終了する。３５Ａと３５Ｂの両方が存在する場合、ループは３４で終了する）。ＡｂＭ超可変領域は、Ｋａｂａｔ ＣＤＲとＣｈｏｔｈｉａ構造ループとの中間物であり、Ｏｘｆｏｒｄ ＭｏｌｅｃｕｌａｒのＡｂＭ抗体モデリングソフトウェアによって使用されている。「接触」超可変領域は、利用可能な複雑な結晶構造の分析に基づくものである。これらの超可変領域の各々の残基を以下に示す。これらの超可変領域の各々の残基を以下に示す。
Figure 0007578939000001
用語「超可変領域」及び「相補性決定領域」と、それらのそれぞれの略語（ＨＶＲ、ＨＶ、ＣＤＲ）は、本明細書では互換的に用いられる。更に、以下の用語のペアも、本明細書では互換的に用いられる：
「ＶＨ ＣＤＲ１」と「ＨＣＤＲ１」；
「ＶＨ ＣＤＲ２」と「ＨＣＤＲ２」；
「ＶＨ ＣＤＲ３」と「ＨＣＤＲ３」；
「ＶＬ ＣＤＲ１」と「ＬＣＤＲ１」；
「ＶＬ ＣＤＲ２」と「ＬＣＤＲ２」；及び
「ＶＬ ＣＤＲ３」と「ＬＣＤＲ３」。
超可変領域は、次のように「伸長した超可変領域」を有してよい：ＶＬでは２４－３６又は２４－３４（Ｌ１）、４６－５６又は５０－５６（Ｌ２）及び８９－９７（Ｌ３）と、ＶＨでは２６－３５Ｂ（ＨＩ）、５０－６５、４７－６５又は４９－６５（Ｈ２）及び９３－１０２、９４－１０２又は９５－１０２（Ｈ３）可変ドメイン残基は、これらの定義の各々について、Ｋａｂａｔ他（Ｋａｂａｔ他、１９９１年）に従って番号付けされる。
「フレームワーク」又は「ＦＲ」残基は、本明細書において定義される超可変領域残基以外の可変ドメイン残基である。
用語「Ｋａｂａｔのような可変ドメイン残基ナンバリング」又は「Ｋａｂａｔのようなアミノ酸位置ナンバリング」及びそれらの変形は、Ｋａｂａｔ他（Ｋａｂａｔ他、１９９１）における抗体のコンパイルの重鎖可変ドメイン又は軽鎖可変ドメインに用いられるナンバリングシステムを指す。このナンバリングシステムを用いると、実際の直鎖アミノ酸配列は、可変ドメインのＦＲ又はＣＤＲの短縮又は挿入に対応する、より少ない又は追加のアミノ酸を含むことができる。例えば、重鎖可変ドメインは、Ｈ２の残基５２の後に単一のアミノ酸挿入（Ｋａｂａｔによれば残基５２ａ）と、重鎖ＦＲ残基８２の後に挿入された残基（Ｋａｂａｔによれば、例えば残基８２ａ、８２ｂ及び８２ｃ等）を含むことができる。残基のＫａｂａｔナンバリングは、抗体の配列と「標準」Ｋａｂａｔナンバリングされた配列との相同性領域でのアラインメントにより、所定の抗体について決定することができる。
可変ドメイン内の残基（軽鎖の残基１～１０７と重鎖の残基１～１３）を指す場合、Ｋａｂａｔナンバリングシステムが一般に用いられる（例えばＫａｂａｔ他、１９９１）。免疫グロブリン重鎖の定常領域内の残基を指す場合には、「ＥＵナンバリングシステム」又は「ＥＵインデックス」が一般に用いられる（例えば、上記のＫａｂａｔ他で報告されたＥＵインデックス）。「ＫａｂａｔのようなＥＵインデックス」は、ヒトＩｇＧ１ ＥＵ抗体の残基ナンバリングを指す。本明細書において別段の記載がない限り、抗体の可変ドメインにおける残基番号への言及は、Ｋａｂａｔナンバリングシステムによる残基ナンバリングを意味する。
用語「特異的に結合する」は、リガンド（例えばヒト化抗ＨＬＡ－Ａ２抗体）が、試料に存在する同族の結合パートナー（例えばＨＬＡ－Ａ２）タンパク質を認識して結合するが、リガンドは、試料内の他の分子を実質的に認識又は結合しないことを指す。非特異的結合は、１０－７Ｍ未満の親和性での結合、例えば１０－６Ｍ、１０－５Ｍ、１０－４Ｍ等の親和性での結合を指す。
目的の抗原又はエピトープに「特異的に結合する」抗体は、非特異的な相互作用とは明らかに異なる十分な親和性で抗原又はエピトープに結合する抗体である。特異的結合は、例えば、対照分子の結合と比較した分子の結合を決定することによって測定することができる。
用語「組換え抗体」は、例えばバクテリオファージや酵母の発現系によって発現される抗体等、組換えＤＮＡ技術を用いて生成される抗体を指す。また、この用語は、抗体をコードするＤＮＡ分子の合成によって生成され、該ＤＮＡ分子が抗体タンパク質又は抗体を指定するアミノ酸配列を発現する抗体を意味すると解釈されるべきであり、ここでＤＮＡ又はアミノ酸配列は、当技術分野で利用可能であり周知である組換えＤＮＡ又はアミノ酸配列技術を用いて取得されている。
本明細書において用いられる用語「モノクローナル抗体」は、実質的に均一な抗体の集団（すなわち、集団を構成する個々の抗体は、少量存在する可能性のある自然発生の突然変異を除いて同一である）から得られる抗体を指す。モノクローナル抗体は非常に特異的であり、単一の抗原部位を対象とする。更に、異なる決定基（エピトープ）を対象とする異なる抗体を含むポリクローナル抗体の調製とは対照的に、各モノクローナル抗体は、抗原上の単一の決定基を対象とする。それらの特異性に加えて、モノクローナル抗体は、他の抗体に汚染されずに合成できるという利点がある。修飾語「モノクローナル」は、特定の方法による抗体の産生を必要とすると解釈されるべきではない。例えば、本発明において有用なモノクローナル抗体は、Ｋｏｈｌｅｒ他、Ｎａｔｕｒｅ、２５６：４９５（１９７５）によって最初に記述されたハイブリドーマ方法論によって調製することができ、又は、細菌、真核動物又は植物細胞における組換えＤＮＡ法を用いて作製することができる（例えば米国特許第４，８１６，５６７号を参照）。「モノクローナル抗体」は、例えばＣｌａｃｋｓｏｎ他、Ｎａｔｕｒｅ，３５２：６２４－６２８（１９９１）及びＭａｒｋｓ他、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２２２：５８１－５９７（１９９１）に記載されている技術を用いて、ファージ抗体ライブラリから単離することもできる。
用語「抗原」は、免疫応答を引き起こす分子を指す。この免疫応答は、抗体産生若しくは特異的免疫適格細胞の活性化のいずれか、又は両者を伴うことができる。当業者には当然のことながら、実質的に全てのタンパク質又はペプチドを含むあらゆる巨大分子が、抗原として機能し得る。更に、抗原は、組換えＤＮＡ又はゲノムＤＮＡに由来し得る。当業者には当然のことながら、免疫応答を引き起こすタンパク質をコードするヌクレオチド配列又は部分的ヌクレオチド配列を含むあらゆるＤＮＡは、したがって、本明細書で用いられる用語としての「抗原」をコードする。更に、当業者には当然のことながら、抗原は必ずしも、遺伝子の完全長ヌクレオチド配列によってのみコードされる必要はない。容易に分かるように、本発明は、複数の遺伝子の部分的ヌクレオチド配列の使用を含むが、これに限定されず、また、これらのヌクレオチド配列は、所望の免疫応答を引き起こすポリペプチドをコードするために様々な組合せで配置される。更に、当業者には当然のことながら、抗原が「遺伝子」によってコードされる必要は全くない。容易に分かるように、抗原は、生体試料から生成又は合成することができ、又は生体試料に由来してよく、又はポリペプチド以外の巨大分子であってよい。そのような生体試料として、他の生体成分を有する組織試料、腫瘍試料、細胞又は流体等が含まれ得るが、これらに限定されない。
本明細書で用いられる場合、用語「親和性」は、２つの薬剤の可逆的結合の平衡定数を指し、解離定数（Ｋｄ）として表される。親和性は、無関係なアミノ酸配列に対する抗体の親和性よりも、少なくとも１倍、少なくとも２倍、少なくとも３倍、少なくとも４倍、少なくとも５倍、少なくとも６倍、少なくとも７倍、少なくとも８倍、少なくとも９倍、少なくとも１０倍、少なくとも２０倍、少なくとも３０倍、少なくとも４０倍、少なくとも５０倍、少なくとも６０倍、少なくとも７０倍、少なくとも８０倍、少なくとも９０倍、少なくとも１００倍、又は少なくとも１０００倍、又はそれ以上大きくてよい。標的タンパク質に対する抗体の親和性は、例えば、約１００ナノモル（ｎＭ）～約０．１ｎＭ、約１００ｎＭ～約１ピコモル（ｐＭ）、又は約１００ｎＭ～約１フェムトモル（ｆＭ）、又はそれ以上であってよい。本明細書で用いられる場合、用語「アビディティ」は、希釈後の解離に対する２つ以上の薬剤の複合体の耐性を指す。用語「免疫反応性」、「優先的に結合する」及び「特異的に結合する」は、抗体及びその断片に関して本明細書では互換的に用いられる。そのような用語が本明細書において用いられる場合、ヒト化抗ＨＬＡ－Ａ２抗体を含む本発明の抗ＨＬＡ－Ａ２抗体とその断片は、ＨＬＡ－Ａ２に特異的に結合する。
用語「結合」は、例えば、塩橋や水橋等の相互作用を含む、共有結合、静電結合、疎水結合、並びにイオン結合及び／又は水素結合の相互作用による、２つの分子間の直接的な会合を指す。非特異的結合は、１０－７Ｍ未満の親和性での結合、例えば１０－６Ｍ、１０－５Ｍ、１０－４Ｍ等の親和性での結合を指す。
本明細書で用いられる用語「反応性」は、分子と反応する（すなわち、結合する）抗体の能力を指す（例えば、分子に特異的に結合する）。第１の抗体が第２の抗体と比較して分子への結合の低下を示す場合、第１の抗体は第２の抗体よりも分子（例えばＨＬＡ分子）に対して「反応性が低い」。１つ以上の特定のＨＬＡ分子に対する第１及び第２の抗体の反応性を容易に比較するためのアプローチが知られている。アプローチの一例は、本明細書の実施例のセクションに提供されており、ＦｌｏｗＰＲＡ（登録商標） Ｓｉｎｇｌｅ Ａｎｔｉｇｅｎビーズ（Ｏｎｅ Ｌａｍｂｄａ）を採用して、特定のＨＬＡ分子と反応（又は結合）する能力について抗体を調べた。そのようなフローサイトメトリーアプローチは、高スループットの抗体反応性分析に適している。
本明細書で用いられる場合、用語「ヒンジ領域」は、隣接するポリペプチド領域に構造的な可動性と間隔を提供する可動性ポリペプチドコネクター領域（本明細書では「ヒンジ」又は「スペーサー」とも呼ばれる）を指し、天然又は合成のポリペプチドから成ることができる。ヒンジ領域は、ＣＡＲを発現する免疫細胞の効力に影響を与える可能性がある（例えばＷａｔａｎａｂｅ他（２０１６年）を参照）。免疫グロブリン（例えばＩｇＧ１）に由来する「ヒンジ領域」は、一般に、ヒトＩｇＧ１のＧｌｕ２１６からＰｒｏ２３０まで伸びていると定義されている（Ｂｕｒｔｏｎ（１９８５）Ｍｏｌｅｃ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，２２：１６１－２０６）．。他のＩｇＧアイソタイプのヒンジ領域は、重鎖間ジスルフィド（Ｓ－Ｓ）結合を形成する最初と最後のシステイン残基を同じ位置に配置することにより、ＩｇＧ１配列と整列させることができる。ヒンジ領域は、米国特許第５，６７７，４２５号に記載されている改変ヒンジ領域を含むが、これに限定されない自然発生又は非自然発生のものであってよい。ヒンジ領域は、ＣＨ１ドメインのものとは異なるクラス又はサブクラスの抗体に由来する完全なヒンジ領域を含むことができる。用語「ヒンジ領域」は、ＣＤ８及び他の受容体に由来する領域も含むことができ、これらの領域は、隣接領域に可動性及び間隔を提供する際に同様の機能を提供する。
本明細書で用いられる場合、用語「免疫細胞」は、一般に、骨髄で産生される造血幹細胞（ＨＳＣ）に由来する血液細胞（白血球）を含む。「免疫細胞」には、例えばリンパ球（Ｔ細胞、Ｂ細胞、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞）及び骨髄由来細胞（好中球、好酸球、好塩基球、単球、マクロファージ、樹状細胞）が含まれる。
「Ｔ細胞」は、Ｔヘルパー細胞（ＣＤ４＋細胞）、ＣＤ８＋Ｔ細胞（例えば細胞傷害性ＣＤ８＋Ｔ細胞、制御性ＣＤ８＋Ｔ細胞）、制御性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）、ガンマデルタＴ細胞及びダブルネガティブＴ細胞を含む、ＣＤ３を発現する全ての種類の免疫細胞を含む。
「細胞傷害性細胞」は、細胞傷害性ＣＤ８＋Ｔ細胞、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞及び好中球を含み、これらの細胞は細胞傷害性応答を媒介することが可能である。
本明細書で用いられる場合、用語「制御性免疫細胞」は、免疫系の活性化を抑制し、それによって免疫系のホメオスタシスと自己抗原に対する寛容を維持するように、「制御」的に作用する免疫細胞を指す。「制御性免疫細胞」は、組織の修復又は再生の促進等、臨床状態の改善をもたらす非免疫細胞にも影響を与える場合がある。制御性免疫細胞には、制御性Ｔ細胞、ＣＤ４＋制御性Ｔ細胞、ＣＤ８＋制御性Ｔ細胞、制御性γδＴ細胞、制御性ＤＮ Ｔ細胞、制御性Ｂ細胞、制御性ＮＫ細胞、制御性マクロファージ及び制御性樹状細胞が含まれる。
本明細書及び特許請求の範囲で用いられる「制御性Ｔリンパ球」、「制御性Ｔ細胞」、「Ｔ制御性細胞」、「Ｔｒｅｇ細胞」又は「Ｔｒｅｇ」は同義語であり、当技術分野で用いられるその標準的な定義を有するものと意図される。Ｔｒｅｇ細胞は、免疫系の活性化を抑制し、それによって免疫系のホメオスタシスと自己抗原に対する寛容を維持するように「制御」的に作用する、Ｔ細胞の特殊な亜集団である。Ｔｒｅｇは、サプレッサーＴ細胞と呼ばれることもある。Ｔｒｅｇ細胞は、常にではないが、多くの場合、フォークヘッドファミリー転写因子Ｆｏｘｐ３（フォークヘッドボックスｐ３）の発現によって特徴付けられる。また、ＣＤ４又はＣＤ８表面タンパク質を発現することもある。通常、ＣＤ２５も発現する。本明細書及び特許請求の範囲で用いられる場合、別段の指定がない限り、Ｔｒｅｇには、胸腺で発生する「天然」のＴｒｅｇと、胸腺の外側（例えば組織若しくは２次リンパ器官、又は規定の培養条件下の実験室）で起こる分化過程を介して生じる誘導性／適応／末梢Ｔｒｅｇと、組換えＤＮＡ技術を用いて（例えばＦＯＸＰ３の発現操作によって）作製されたＴｒｅｇとが含まれる。自然発生のＴｒｅｇ細胞（ＣＤ４＋ＣＤ２５＋Ｆｏｘｐ３＋）は、胸腺の他の全てのＴ細胞と同様に発生する。対照的に、誘導性／適応／末梢Ｔｒｅｇ細胞（ＣＤ４＋ＣＤ２５＋Ｆｏｘｐ３＋Ｔｒｅｇ、Ｔｒ１細胞、Ｔｈ３細胞その他を含む）は、胸腺の外側で発生する。Ｔｒｅｇを誘導するひとつの方法は、Ｔエフェクター細胞をＩＬ－１０又はＴＧＦ－βに曝すことである。Ｔ細胞は、Ｆｏｘｐ３遺伝子をＴ細胞の混合集団にトランスフェクション又は形質導入することによって、Ｔｒｅｇ細胞に変換することもできる。Ｆｏｘｐ３を発現させられるＴ細胞はＴｒｅｇ表現型を採用し、そのような組換えＴｒｅｇも本明細書では「Ｔｒｅｇ」と定義される。
本明細書で用いられる場合、用語「免疫エフェクター細胞」は、特定の免疫応答を開始することのできる形態にある、免疫系の細胞を指す。
本明細書で用いられる場合、用語「免疫応答」は、Ｔ細胞媒介及び／又はＢ細胞媒介の免疫応答を含む。例示的な免疫応答には、Ｔ細胞応答、例えばサイトカイン産生や細胞の細胞傷害が含まれる。更に、免疫応答という用語は、Ｔ細胞の活性化、例えば抗体産生（体液性応答）と、サイトカイン応答性細胞（例えばマクロファージ）の活性化により、間接的に影響を受ける免疫応答を含む。免疫応答に関与する免疫細胞には、Ｂ細胞やＴ細胞（ＣＤ４＋、ＣＤ８＋、Ｔｈ１細胞、及びＴｈ２細胞）等のリンパ球；抗原提示細胞（例えば樹状細胞、マクロファージ、Ｂリンパ球、ランゲルハンス細胞等のプロフェッショナル抗原提示細胞、及びケラチノサイト、内皮細胞、アストロサイト、線維芽細胞、オリゴデンドロサイト等の非プロフェッショナル抗原提示細胞）；ナチュラルキラー細胞；マクロファージ、好酸球、マスト細胞、好塩基球、及び顆粒球等の骨髄性細胞が含まれる。
用語「拒絶反応」は、移植された器官又は組織がレシピエントの体に受け入れられない状態を指す。拒絶反応は、レシピエントの免疫系が移植された器官又は組織を攻撃することに起因する。拒絶反応は、移植後数日から数週間（急性）又は移植後数ヶ月から数年（慢性）に発生するおそれがある。
本明細書で用いられる用語「移植片対宿主病」又は「ＧＶＨＤ」は、遺伝的に異なる人から移植組織を受け取った後の医学的合併症を指す。提供された組織（移植片）の免疫細胞は、レシピエント（宿主）を異物として認識する。そして、移植された免疫細胞は、宿主の体細胞を攻撃する。ＧＶＨＤは、一般に幹細胞移植に関連する。ただし、該用語は、他の形態の組織移植片から生じるＧＶＨＤを含む。ＧＶＨＤは、輸血後に発生することもある。
本明細書で用いられる場合、用語「免疫学的寛容」又は「免疫寛容」は、未処置の対象と比較して、処置された対象の一部に対して実行される方法を指す：ａ）特異的な免疫学的応答（少なくとも一部は、抗原特異的エフェクターＴリンパ球、Ｂリンパ球、抗体又はそれらの均等物によって媒介されると考えられる）のレベルの低下；ｂ）特異的な免疫学的応答の開始若しくは進行の遅延；又はｃ）特異的な免疫学的応答の開始若しくは進行のリスクの低下。「特異的な」免疫学的寛容又は免疫寛容は、他の抗原と比較して特定の抗原に対して免疫学的寛容又は免疫寛容が優先的に引き起こされる場合に生じる。
本明細書で用いられる場合、用語「移植後の免疫寛容（ｏｐｅｒａｔｉｏｎａｌ ｔｏｌｅｒａｎｃｅ）」とは、感染症を含む他の負荷に応答できる免疫能力のある宿主において、免疫抑制薬による治療が全くない状態で、拒絶反応（急性又は慢性の拒絶反応を含む）の組織学的兆候がなく、安定した移植片機能が少なくとも１年間続いている臨床状態を指す。
本明細書で用いられる場合、用語「免疫順応」は、器官又は組織の移植片に特異的な抗体がレシピエントに存在するにもかかわらず、器官又は組織の移植片が正常に機能する、移植レシピエントの状態を指す。
本明細書で用いられる場合、用語「幹細胞」は、概して、多能性又は多分化能性の幹細胞を含む。「幹細胞」には、例えば胚性幹細胞（ＥＳ）；間葉系幹細胞（ＭＳＣ）；人工多能性幹細胞（ｉＰＳ）；及び単分化能前駆細胞（ｃｏｍｍｉｔｔｅｄ ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒ ｃｅｌｌ）（造血幹細胞（ＨＳＣ）；骨髄由来細胞等）を含む。
本明細書で用いられる場合、「治療」、「治療する」等の用語は、所望の薬理学的効果及び／又は生理学的効果を得ることを指す。効果は、疾患の部分的又は完全な治癒、及び／又は、疾患に起因する副作用の点で、治療的であってよい。本明細書において用いられる「治療」は、哺乳類、例えばヒトの疾患のあらゆる治療を包含し、疾患の緩和、すなわち疾患の退行及び／又は疾患の１つ以上の症状の軽減を引き起こすことを含む。
本明細書で用いられる場合、「予防」、「予防する」、「予防すること」等の用語は、疾患若しくは病状の予防的又は保護的な治療を提供することを意味する。その効果は、疾患又はその症状を完全に又は部分的に予防するという点で、予防的であってよい。本明細書において用いられる「予防」は、哺乳類、例えばヒトの疾患に対するあらゆる予防効果を包含し、以下を含む：（ａ）疾患の素因がある可能性があるがまだ疾患を有すると診断されていない対象において、疾患が発生するのを防ぐこと；及び（ｂ）疾患の抑制、すなわちその発症の阻止。
「患者」、「対象」、「個体」、「宿主」等の用語は、本明細書では互換的に用いられ、本明細書に記載される方法に従うことができる、インビトロ若しくはインサイチュのいずれの動物又はその細胞を指す。「患者」、「対象」、「個体」、「宿主」等の用語は、免疫応答を誘発することができる生物（例えば哺乳類）を含むことが意図されている。「患者」、「対象」、「個体」、「宿主」の例には、マウス類（例えばラット、マウス）、ウサギ類（例えばウサギ）、非ヒト霊長類、ヒト、イヌ、ネコ、有蹄動物（例えばウマ、ウシ、ヒツジ、ブタ、ヤギ）等と、それらのトランスジェニック種が含まれる。特定の非限定的な実施形態では、患者、対象、宿主又は個体は、ヒトである。
用語「有効量」又は「治療有効量」は、本明細書では互換的に用いられ、研究者、獣医、医師、又は他の臨床医が求めている組織、系若しくは対象の生物学的応答又は医学的応答を誘発し得る治療薬の量、又は複数の治療薬の合計量を指す。用語「治療有効量」は、投与されたときに、治療される障害若しくは疾患の兆候又は症状の１つ以上の発症を予防する（又はある程度緩和する）のに十分な治療薬の量を含む。治療有効量は、治療薬、疾患及びその重症度、並びに治療対象の年齢、体重等に応じて異なる。
本明細書において用いられる用語「活性化」は、検出可能な細胞応答を誘導するのに十分に刺激されたＴ細胞（例えば制御性Ｔ細胞）の状態を指す。活性化は、サイトカイン産生や抑制活性等の検出可能なエフェクター機能（複数可）にも関連付けることができる。「活性化された」制御性Ｔ細胞という用語は、とりわけ、免疫応答を抑制することが可能である制御性Ｔ細胞を指す。
用語「キメラ抗原受容体」或いは「ＣＡＲ」は、抗原結合ドメインを含む細胞外ドメインと、膜貫通ドメインと、細胞内シグナル伝達ドメインを含む細胞質ドメインとを含む組換えポリペプチドコンストラクトを指す。一実施形態では、ＣＡＲは任意にヒンジを含む。用語「キメラ受容体」又は「キメラ抗原受容体」又は「ＣＡＲ」は、特に、免疫細胞内にある場合、標的リガンドに対する特異性と細胞内シグナル生成を細胞に提供する、１つのポリペプチド又はポリペプチドのセット（通常、最も単純な実施形態では２つ）を指してよい。一部の実施形態では、ポリペプチドのセットは互いに近接している。一部の実施形態では、キメラ受容体は、ポリペプチドのセットを含むキメラ融合タンパク質である。一部の実施形態では、ポリペプチドのセットは、二量体化分子の存在により、ポリペプチドを互いにカップリングすることができる（例えばリガンド結合ドメインを細胞内シグナル伝達ドメインにカップリングすることができる）二量体化スイッチを含む。一実施形態では、キメラ受容体は、キメラ受容体融合タンパク質のアミノ末端（Ｎ－ｔｅｒ）に、任意のリーダー配列を含む。一実施形態では、キメラ受容体は、細胞外リガンド結合ドメインのＮ末端にリーダー配列を更に含み、リーダー配列は、細胞性プロセシングとキメラ受容体の細胞膜への局在化の間に、リガンド結合ドメインから任意で切断される。
用語「シグナル伝達ドメイン」は、セカンドメッセンジャーを生成するか、そのようなメッセンジャーに応答することによってエフェクターとして機能することにより、定められたシグナル伝達経路を介して細胞活性を調節するために、細胞内で情報を伝達することによって作用するタンパク質の機能部分を指す。
用語「自己」は、同じ対象に由来する物質であって、後に該対象に再導入されるものを指す。
用語「同種異系」は、物質が導入される対象と同じ種の異なる対象に由来するあらゆる物質を指す。１つ以上の座位の遺伝子が同一でないとき、２つ以上の対象は互いに同種異系であると言える。一部の態様では、同じ種の対象からの同種異系物質は、遺伝的に十分類似しない結果、抗原的に相互作用する可能性がある。用語「同種移植片」は、同じ種の異なる対象に由来する移植片を指す。
用語「異種」は、異なる種の対象に由来するあらゆる物質を指す。用語「異種移植片」は、異なる種の対象に由来する移植片を指す。
本明細書で用いられる場合、「説明資料」には、本発明の組成物及び方法の有用性を伝えるために用いることのできる、出版物、記録、図表又は任意の他の表現媒体が含まれる。本発明のキットの説明資料は、例えば、本発明の核酸、ペプチド、細胞及び／若しくは組成物を含む容器に貼付されてよく、又は、核酸、ペプチド、細胞及び／若しくは組成物を含む容器と一緒に出荷されてもよい。或いは、説明資料と核酸、ペプチド、細胞及び／又は組成物が受領者によって共同で使用されることを意図して、説明資料は容器とは別に出荷されてよい。
アミノ酸残基／位置の「修飾」とは、本明細書で用いられる場合、開始アミノ酸配列と比較した場合の１次アミノ酸配列の変化を指し、この変化は、前記アミノ酸残基／位置を含む配列変化から生じる。例えば、典型的な修飾には、該残基の（又は前記位置における）別のアミノ酸への置換（例えば保存的置換又は非保存的置換）、前記残基／位置に近接する１つ以上の（一般には５又は３より少ない）アミノ酸の挿入、前記残基／位置の欠損が含まれる。「アミノ酸置換」又はその変形は、所定の（開始）アミノ酸配列中に存在するアミノ酸残基の異なるアミノ酸残基への置換を指す。一般に、かつ好ましくは、修飾によって、開始（又は「野生型」）アミノ酸配列を含むポリペプチドと比較して、変異体ポリペプチドの少なくとも１つの物理生化学的活性に変化が生じる。例えば、抗体の場合、変化する物理生化学的活性は、標的分子に対する結合親和性、結合能力及び／又は結合効果であり得る。
用語「保存的配列修飾」は、アミノ酸配列を含む抗体若しくは抗体断片の結合特性に有意に影響又は変化を与えないアミノ酸修飾を指す。そのような保存的修飾には、アミノ酸の置換、追加及び除去が含まれる。修飾は、部位特異的変異誘発やＰＣＲ介在変異誘発等、当技術分野で公知の標準的な技術により、本発明の抗体又は抗体断片に導入することができる。保存的アミノ酸置換は、アミノ酸残基が、類似側鎖を有するアミノ酸残基で置換されるものである。類似側鎖を有するアミノ酸残基のファミリーは、当技術分野において定義されている。これらのファミリーは、塩基性側鎖（例えばリジン、アルギニン、ヒスチジン）、酸性側鎖（例えばアスパラギン酸、グルタミン酸）、無電荷極性側鎖（例えばグリシン、アスパラギン、グルタミン、セリン、スレオニン、チロシン、システイン、トリプトファン）、非極性側鎖（例えばアラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン）、ベータ分枝側鎖（例えばスレオニン、バリン、イソロイシン）及び芳香族側鎖（例えばチロシン、フェニルアラニン、トリプトファン、ヒスチジン）を有するアミノ酸を含む。よって、本発明のＣＡＲ内の１つ以上のアミノ酸残基を、同じ側鎖ファミリーからの他のアミノ酸残基で置換することができ、改変されたＣＡＲを、本明細書に記載の機能的アッセイを用いて試験することができる。
用語「刺激」は、刺激性分子（例えばＴＣＲ／ＣＤ３複合体）とその同族リガンドの結合により誘発され、それにより、限定されないが、ＴＣＲ／ＣＤ３複合体を介するシグナル伝達等のシグナル伝達事象を媒介する、一次応答を指す。刺激は、サイトカイン及び細胞表面タンパク質の上方制御又は下方制御等の、特定分子の発現の変化、及び／又は、細胞骨格構造の再構成等を媒介することができる。
用語「刺激性分子」は、Ｔ細胞シグナル伝達経路の少なくとも一部の側面について、刺激性の方法でＴＣＲ複合体の１次活性化を調節する１次細胞質シグナル伝達配列（複数可）を提供するＴ細胞によって発現される分子を指す。一態様において、１次シグナルは、例えば、ペプチドと結合したＭＨＣ分子とのＴＣＲ／ＣＤ３複合体の結合によって開始され、増殖、活性化、分化を含むが、これらに限定されないＴ細胞応答の媒介につながる。刺激性で作用する１次細胞質シグナル伝達配列（「１次シグナル伝達ドメイン」とも呼ばれる）は、免疫受容体チロシンベース活性化モチーフ（ＩＴＡＭ）として知られるシグナル伝達モチーフを含み得る。
用語「抗原提示細胞」又は「ＡＰＣ」は、主要組織適合遺伝子複合体（ＭＨＣ）と複合した抗原を表面に表示し、Ｔ細胞等の特定のリンパ球が認識できるようにする、アクセサリー細胞など（例えばＢ細胞、樹状細胞、マクロファージ、ランゲルハンス細胞など）の免疫系細胞を指す。Ｔ細胞は、そのＴ細胞受容体（ＴＣＲ）を用いて、これらの複合体を認識することができる。抗原提示細胞は、ＭＨＣとともに提示するための抗原を処理することができる。本明細書で用いられる用語「抗原提示細胞」又は「ＡＰＣ」は、ＡＰＣが抗原を提示している状態とＡＰＣが抗原を提示していない状態とを含む。場合によっては、ＡＰＣは抗原を処理し、Ｔ細胞に提示する。他の例では、Ｔ細胞は、抗原提示の非存在下でＡＰＣを認識することができ、この場合、ＴＣＲがＭＨＣタンパク質に直接結合する。例えば、移植の状況では、ＡＰＣは、外来ＭＨＣタンパク質の発現を介してＴ細胞を直接刺激することがある。
「細胞内シグナル伝達ドメイン」という用語は、本明細書において用いられる場合、ＣＡＲの細胞内部分を指す。細胞内シグナル伝達ドメインは、ＣＡＲ含有細胞、例えばＣＡＲ Ｔｒｅｇ細胞の免疫エフェクター機能を促進するシグナルを生成する。例えばＣＡＲ Ｔｒｅｇ細胞において、免疫エフェクター機能の例には、他の免疫細胞のエフェクター機能の抑制又は下方制御が含まれる。他の免疫細胞には、あらゆる種類の白血球、例えば（限定されないが）Ｔ細胞、Ｂ細胞、ＮＫ細胞が含まれる。更に、Ｔｒｅｇの免疫エフェクター機能には、組織の修復又は再生の促進等、臨床状態の改善をもたらす非免疫細胞への作用が含まれる。
用語「ゼータ」或いは「ゼータ鎖」、又は「ＣＤ３ゼータ」は、ＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＢＡＧ３６６６４．１として提供されるタンパク質、又は非ヒト種（例えばマウス、齧歯類、サル、類人猿等）由来の等価な残基として定義され、「ゼータ刺激性ドメイン」又は「ＣＤ３ゼータ刺激性ドメイン」は、Ｔ細胞活性化に必要な初期シグナルの機能的伝達に十分であるゼータ鎖の細胞質ドメインからのアミノ酸残基として定義される。一態様では、ゼータの細胞質ドメインは、ＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＢＡＧ３６６６４．１の残基５２～１６４、又は、その機能的オルソログである非ヒト種（例えばマウス、齧歯類、サル、類人猿等）からの等価な残基を含む。
「共刺激リガンド」という用語は、本明細書において用いられる場合、Ｔ細胞上で同族の共刺激分子に特異的に結合する抗原提示細胞（例えばＡＰＣ、樹状細胞、Ｂ細胞等）上の分子を含み、それにより、例えばＴＣＲ／ＣＤ３複合体とペプチドを搭載したＭＨＣ分子との結合によって提供される一次シグナルに加えて、増殖、活性化、分化等を含むが、これらに限定されないＴ細胞応答を媒介するシグナルを提供する。共刺激リガンドには、ＣＤ７、Ｂ７－１（ＣＤ８０）、Ｂ７－２（ＣＤ８６）、ＰＤ－Ｌ１、ＰＤ－Ｌ２、４－１ＢＢＬ、ＯＸ４０Ｌ、誘導性共刺激リガンド（ＩＣＯＳ－Ｌ）、細胞間接着分子（ＩＣＡＭ）、ＣＤ３０Ｌ、ＣＤ４０、ＣＤ７０、ＣＤ８３、ＨＬＡ－Ｇ、ＭＩＣＡ、ＭＩＣＢ、ＨＶＥＭ、リンホトキシンベータ受容体、３／ＴＲ６、ＩＬＴ３、ＩＬＴ４、ＨＶＥＭ、Ｔｏｌｌリガンドに結合するアゴニスト又は抗体受容体、Ｂ７－Ｈ３と特異的に結合するリガンド等が含まれる。共刺激リガンドはまた、とりわけ、限定されないが、ＭＨＣクラスＩ分子、ＢＴＬＡ、Ｔｏｌｌリガンド受容体、ＯＸ４０、ＣＤ２７、ＣＤ２８、リンパ球機能関連抗原－１（ＬＦＡ－１）（ＣＤ１１ａ／ＣＤ１８）、ＴＮＦＲ１（ＣＤ１２０ａ／ＴＮＦＲＳＦ１Ａ）、ＴＮＦＲ２（ＣＤ１２０ｂ／ＴＮＦＲＳＦ１Ｂ）、ＣＴＬＡ－４（ＣＤ１５２）、ＣＤ９５、ＩＣＯＳ（ＣＤ２７８）、４－１ＢＢ（ＣＤ１３７）、ＣＤ２、ＣＤ３０、ＣＤ４０、ＰＤ－１、ＣＤ７、ＬＩＧＨＴ、ＮＫＧ２Ｃ、Ｂ７－Ｈ３、ＩＣＡＭ－１、ＧＩＴＲ、ＨＶＥＭ、ＳＬＡＭＦ７、ＮＫｐ８０、ＣＤ１６０、ＩＬ２ｒａ、ＩＬ６Ｒａ、ＩＬ－７Ｒａ、ＩＬ－１３ＲＡ１／ＲＡ２、ＩＬ－３３Ｒ（ＩＬ１ＲＬ１）、ＩＬ－１０ＲＡ／ＲＢ、ＩＬ－４Ｒ、ＩＬ－５Ｒ（ＣＳＦ２ＲＢ）、ＡＲＨＲ、ＢＡＦＦ受容体、ＩＬ－２１Ｒ、ＴＧＦｂＲ１／２／３、共通ガンマ鎖、ＣＤ８３と特異的に結合するリガンド、及びそれらの任意の組合せ等の、Ｔ細胞上に存在する共刺激分子と特異的に結合する抗体を含むリガンドを包含する。
用語「共刺激分子」は、共刺激リガンドと特異的に結合し、それにより、限定されないが、増殖等のＴ細胞による共刺激応答を媒介する、Ｔ細胞上の同族結合パートナーを指す。共刺激分子は、効率的な免疫応答に必要となる、抗原受容体又はそのリガンド以外の細胞表面分子である。共刺激分子は、ＴＮＦ受容体タンパク質、免疫グロブリン様タンパク質、サイトカイン受容体、インテグリン、シグナル伝達リンパ球活性化分子（ＳＬＡＭタンパク質）及び活性化ＮＫ細胞受容体というタンパク質ファミリーで表すことができる。共刺激分子には、限定されないが、ＭＨＣクラスＩ分子、ＢＴＬＡ、Ｔｏｌｌリガンド受容体、ＯＸ４０、ＣＤ２７、ＣＤ２８、リンパ球機能関連抗原－１（ＬＦＡ－１）（ＣＤ１１ａ／ＣＤ１８）、ＴＮＦＲ１（ＣＤ１２０ａ／ＴＮＦＲＳＦ１Ａ）、ＴＮＦＲ２（ＣＤ１２０ｂ／ＴＮＦＲＳＦ１Ｂ）、ＣＴＬＡ－４（ＣＤ１５２）、ＣＤ９５、ＩＣＯＳ（ＣＤ２７８）、４－１ＢＢ（ＣＤ１３７）、ＣＤ２、ＣＤ３０、ＣＤ４０、ＰＤ－１、ＣＤ７、ＬＩＧＨＴ、ＮＫＧ２Ｃ、Ｂ７－Ｈ３、ＩＣＡＭ－１、ＧＩＴＲ、ＨＶＥＭ、ＳＬＡＭＦ７、ＮＫｐ８０、ＣＤ１６０、ＩＬ２ｒａ、ＩＬ６Ｒａ、ＩＬ－７Ｒａ、ＩＬ－１３ＲＡ１／ＲＡ２、ＩＬ－３３Ｒ（ＩＬ１ＲＬ１）、ＩＬ－１０ＲＡ／ＲＢ、ＩＬ－４Ｒ、ＩＬ－５Ｒ（ＣＳＦ２ＲＢ）、ＡＲＨＲ、ＢＡＦＦ受容体、ＩＬ－２１Ｒ、ＴＧＦｂＲ１／２／３、共通ガンマ鎖、ＣＤ８３と特異的に結合するリガンド、及びそれらの任意の組合せ等が含まれる。
「共刺激細胞内シグナル伝達ドメイン」又は「共刺激ドメイン」は、共刺激分子の細胞内部分とすることができる。そのような分子の例には、ＭＨＣクラスＩ分子、ＢＴＬＡ、Ｔｏｌｌリガンド受容体、ＯＸ４０、ＣＤ２７、ＣＤ２８、リンパ球機能関連抗原－１（ＬＦＡ－１）（ＣＤ１１ａ／ＣＤ１８）、ＴＮＦＲ１（ＣＤ１２０ａ／ＴＮＦＲＳＦ１Ａ）、ＴＮＦＲ２（ＣＤ１２０ｂ／ＴＮＦＲＳＦ１Ｂ）、ＣＴＬＡ－４（ＣＤ１５２）、ＣＤ９５、ＩＣＯＳ（ＣＤ２７８）、４－１ＢＢ（ＣＤ１３７）、ＣＤ２、ＣＤ３０、ＣＤ４０、ＰＤ－１、ＣＤ７、ＬＩＧＨＴ、ＮＫＧ２Ｃ、Ｂ７－Ｈ３、ＩＣＡＭ－１、ＧＩＴＲ、ＨＶＥＭ、ＳＬＡＭＦ７、ＮＫｐ８０、ＣＤ１６０、ＩＬ２ｒａ、ＩＬ６Ｒａ、ＩＬ－７Ｒａ、ＩＬ－１３ＲＡ１／ＲＡ２、ＩＬ－３３Ｒ（ＩＬ１ＲＬ１）、ＩＬ－１０ＲＡ／ＲＢ、ＩＬ－４Ｒ、ＩＬ－５Ｒ（ＣＳＦ２ＲＢ）、ＡＲＨＲ、ＢＡＦＦ受容体、ＩＬ－２１Ｒ、ＴＧＦｂＲ１／２／３、共通ガンマ鎖、ＣＤ８３と特異的に結合するリガンド等が含まれる。
本明細書で用いられる場合「共刺激シグナル」は、ＴＣＲ／ＣＤ３ライゲーション等の一次シグナルとの組合せで、Ｔ細胞の増殖及び／又は主要な分子の上方制御又は下方制御をもたらすシグナルを指す。
細胞内シグナル伝達ドメインは、それが由来する分子の細胞内部分全体、又は天然の細胞内シグナル伝達ドメイン全体、又はその機能的断片を含むことができる。
「疾患」とは、動物がホメオスタシスを維持できず、疾患が改善されないと動物の健康が悪化し続ける、動物の健康状態である。対照的に、動物の「障害」とは、動物がホメオスタシスを維持できるが、動物の健康状態が障害のない場合よりも良くない、健康状態である。治療せずに放置した場合、障害は必ずしも動物の健康状態を更に低下させるとは限らない。
用語「コードする」は、生物学的プロセスにおいて、定められたヌクレオチド（例えば、ｒＲＮＡ、ｔＲＮＡ及びｍＲＮＡ）配列又は定められたアミノ酸配列のいずれかを有する他のポリマー及び巨大分子の合成の鋳型として機能する、遺伝子、ｃＤＮＡ、又はｍＲＮＡ等のポリヌクレオチド内の特異的ヌクレオチド配列の固有の特性及びそれらから生じる生物学的特性を指す。よって、遺伝子、ｃＤＮＡ又はＲＮＡは、その遺伝子に対応するｍＲＮＡの転写及び翻訳によって細胞又は他の生物系においてタンパク質が産生される場合、タンパク質をコードする。コード鎖（そのヌクレオチド配列がｍＲＮＡ配列と同一であり、通常、配列リストで提供される）と非コード鎖（遺伝子又はｃＤＮＡの転写の鋳型として用いられる）の両方は、タンパク質又はその遺伝子若しくはｃＤＮＡの他の産物をコードするものと呼ぶことができる。
別段の指定がない限り、アミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列又は核酸配列には、相互の縮退バージョンであり同じアミノ酸配列をコードする全てのヌクレオチド配列又は核酸配列が含まれる。タンパク質又はＲＮＡをコードするヌクレオチド配列又は核酸配列という語句はまた、タンパク質をコードするヌクレオチド又は核酸配列が一部のバージョンでイントロン（複数可）を含むことができる程度まで、イントロンを含んでもよい。
本明細書で用いられる場合、「移植片」とは、対象に導入される細胞、組織又は器官を指す。移植される物質の供給源は、（例えば、細胞がインビトロで培養された後の）培養細胞、別の対象からの細胞、又は同じ対象からの細胞であってよい。例示的な器官移植片は、腎臓、肝臓、心臓、肺及び膵臓である。例示的な組織移植片は膵島である。例示的な細胞移植片は、同種異系の造血幹細胞移植である。
用語「外来」は、生物、細胞、組織又は系の外部から導入又は産生された物質を指す。
用語「発現」は、プロモーターによって駆動される特定のヌクレオチド配列の転写及び／又は翻訳を指す。
用語「発現ベクター」は、発現されるべきヌクレオチド配列に操作可能に連結される発現調節配列を含む組換えポリヌクレオチドを有するベクターを指す。発現ベクターは、発現に十分なシス作用性エレメントを含み、発現のための他のエレメントは、宿主細胞によって又はインビトロ発現系で供給され得る。発現ベクターは、コスミド、プラスミド（例えばむき出しか、又はリポソームに含まれる）、組換えポリヌクレオチドを組み込むウイルス（例えばレンチウイルス、レトロウイルス、アデノウイルス及びアデノ随伴ウイルス）を含む、当技術分野で公知の全てのものを含む。
用語「レンチウイルス」は、レトロウイルス科ファミリーの属を指す。レンチウイルスは、非分裂細胞に感染する能力がある点でレトロウイルスの中でも独特であり、相当量の遺伝情報を宿主細胞のＤＮＡに送達することができるので、遺伝子送達ベクターの最も効率的な方法のひとつである。ＨＩＶ、ＳＩＶ及びＦＩＶは、全てレンチウイルスの例である。
用語「レンチウイルスベクター」は、特にＭｉｌｏｎｅ他，Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．１７（８）：１４５３－１４６４（２００９）に提供された自己不活性化レンチウイルスベクターを含む、レンチウイルスゲノムの少なくとも一部に由来するベクターを指す。臨床で使用され得るレンチウイルスベクターの他の例には、例えば、Ｏｘｆｏｒｄ ＢｉｏＭｅｄｉｃａからのＬＥＮＴＩＶＥＣＴＯＲ（登録商標）遺伝子送達テクノロジー、ＬｅｎｔｉｇｅｎからのＬＥＮＴＩＭＡＸ（商標）ベクター系が含まれるが、これらに限定されない。非臨床型のレンチウイルスベクターも利用可能であり、当業者には周知であろう。
用語「相同」又は「同一性」は、２つのポリマー分子間、例えば２つのＤＮＡ分子や２つのＲＮＡ分子等の２つの核酸分子間、又は２つのポリペプチド分子間のサブユニット配列の同一性を指す。２つの分子の両方のサブユニット位置が同じモノマーサブユニットで占められている場合、例えば２つのＤＮＡ分子の各々の位置がアデニンで占められている場合、それらはその位置において相同又は同一である。２つの配列間の相同性は、一致する又は相同である位置の数の直接的な関数であり、例えば、２つの配列の位置の半分（例えば１０サブユニット長のポリマーの５つの位置）が相同である場合、２つの配列は５０％相同であり、位置の９０％（例えば１０分の９）が一致するか又は相同である場合、２つの配列は９０％相同である。
非ヒト（例えばマウス）抗体の「ヒト化」型は、非ヒト免疫グロブリンに由来する最小配列を含むキメラ免疫グロブリン、免疫グロブリン鎖又はその断片（抗体のＦｖ、ｓｃＦｖ、Ｆａｂ、ｓｃＦａｂ、ｓｄＡｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ）２、又は他の抗原結合部分配列等）である。大部分について、ヒト化抗体及びその抗体断片は、レシピエントの相補性決定領域（ＣＤＲ）からの残基が、所望の特異性、親和性及び能力を有するマウス、ラット又はウサギ等の非ヒト種（ドナー抗体）のＣＤＲ由来の残基で置換された、ヒト免疫グロブリン（レシピエント抗体又は抗体断片）である。一部の例では、ヒト免疫グロブリンのＦｖフレームワーク領域（ＦＲ）残基は、対応する非ヒト残基によって置換される。更に、ヒト化抗体／抗体断片は、レシピエント抗体にも移入されたＣＤＲ若しくはフレームワーク配列にも見られない残基を含んでよい。これらの修飾により、抗体又は抗体断片の性能を更に洗練させ最適化することができる。一般に、ヒト化抗体又はその抗体断片は、少なくとも１つ、典型的には２つ、の可変ドメインのうちほぼ全てを含み、ここで、ＣＤＲ領域の全部又はほぼ全部は非ヒト免疫グロブリンのＣＤＲ領域に対応し、ＦＲ領域の全部又はかなりの部分はヒト免疫グロブリン配列のＦＲ領域である。また、ヒト化抗体又は抗体断片は、免疫グロブリン定常領域（Ｆｃ）の少なくとも一部、典型的にはヒト免疫グロブリンのものも含むことができる。さらなる詳細については、Ｊｏｎｅｓ他、Ｎａｔｕｒｅ、３２１：５２２－５２５、１９８６；Ｒｅｉｃｈｍａｎｎ他、Ｎａｔｕｒｅ、３３２：３２３－３２９、１９８８；Ｐｒｅｓｔａ，Ｃｕｒｒ．Ｏｐ．Ｓｔｒｕｃｔ．Ｂｉｏｌ．，２：５９３－５９６，１９９２を参照されたい。
「ヒト」免疫グロブリン、抗体又は抗体断片とは、分子全体がヒト起源であるか、又はヒト型の抗体若しくは免疫グロブリンと同一のアミノ酸配列から成る、抗体や抗体断片等の免疫グロブリンを指す。
用語「単離」は、天然状態から変化又は除去されたことを意味する。例えば、生きている動物に天然に存在する核酸又はペプチドは「単離」されていないが、天然状態での共存物質から部分的若しくは完全に分離されている同じ核酸又はペプチドは「単離」されている。単離された核酸又はタンパク質は、実質的に精製された形態で存在することができ、又は、例えば宿主細胞等の非天然環境で存在することができる。「単離された抗体」とは、その自然環境の成分から同定及び分離され、かつ／又は回収された抗体である。その自然環境の汚染成分は、抗体の治療的使用を妨げる物質であり、酵素、ホルモン、及び他のタンパク質性又は非タンパク質性の溶質を含んでよい。
本発明との関連において、一般に存在する核酸塩基について以下の略語が用いられる。「Ａ」はアデノシンを指し、「Ｃ」はシトシンを指し、「Ｇ」はグアノシンを指し、「Ｔ」はチミジンを指し、「Ｕ」はウリジンを指す。
用語「操作可能に連結」は、制御性配列と異種核酸配列との、後者の発現を生じる機能的連結を指す。例えば、第１の核酸配列が第２の核酸配列と機能的関係にある場合、第１の核酸配列は第２の核酸配列と操作可能に連結される。例えば、プロモーターがコーディング配列の転写又は発現に影響を及ぼす場合、プロモーターはコーディング配列に操作可能に連結される。操作可能に連結されたＤＮＡ配列は、互いに連続的であってよく、例えば、２つのタンパク質コード領域を連結する必要があるとき、同じリーディングフレーム内にある。
免疫原性組成物の「非経口」投与という用語は、例えば、皮下（ｓ．ｃ．）、皮内、結節内、髄内、腹腔内、静脈内（ｉ．ｖ．）、筋肉内（ｉ．ｍ．）又は胸骨内の注射、腫瘍内、又は注入技術を含む。
本明細書において互換的に用いられる用語「核酸」又は「ポリヌクレオチド」は、任意の長さのヌクレオチドのポリマー形態、リボヌクレオチド又はデオキシリボヌクレオチドのいずれかを指す。よって、この用語には、一本鎖、二本鎖若しくは多重鎖のＤＮＡ又はＲＮＡ、ゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡ、ＤＮＡ－ＲＮＡハイブリッド、又はプリン及びピリミジン塩基又は他の天然、化学的若しくは生化学的に修飾された、非天然若しくは誘導体化されたヌクレオチド塩基を含むポリマーが含まれる。よって、具体的な限定がない限り、この用語は、参照核酸と同様の結合特性を有し、天然に存在するヌクレオチドと同様の方法で代謝される、天然ヌクレオチドの公知の類似体を含む核酸を包含する。別段の指示がない限り、特定の核酸配列はまた、その保存的に改変された変異体（例えば縮重コドン置換）、対立遺伝子、オルソログ、ＳＮＰ及び相補的配列と、明示的に示された配列とを、暗黙的に包含する。具体的には、縮重コドン置換は、１つ以上の選択された（又は全ての）コドンの３番目の位置が混合塩基及び／又はデオキシイノシン残基で置換された配列を生成することによって実現することができる（Ｂａｔｚｅｒ他、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｒｅｓ．１９：５０８１（１９９１）；Ｏｈｔｓｕｋａ他、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６０：２６０５－２６０８（１９８５）；及びＲｏｓｓｏｌｉｎｉ他、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｐｒｏｂｅｓ ８：９１－９８（１９９４））。
用語「ペプチド」、「ポリペプチド」及び「タンパク質」は、互換的に用いられ、ペプチド結合によって共有結合されたアミノ酸残基で構成される化合物を指す。タンパク質又はペプチドは、少なくとも２つのアミノ酸を含む必要があり、タンパク質又はペプチドの配列を含むことのできるアミノ酸の最大数に限定はない。ポリペプチドは、ペプチド結合により互いに結合した２つ以上のアミノ酸を含むあらゆるペプチド又はタンパク質を含む。本明細書で用いられる場合、該用語は、短鎖（例えば当技術分野において、通常、ペプチド、オリゴペプチド及びオリゴマーとも呼ばれる）と長鎖（当技術分野において、一般にタンパク質と呼ばれ、その種類は豊富である）の両方を指す。「ポリペプチド」は、例えば、とりわけ、生物学的に活性な断片、実質的に相同なポリペプチド、オリゴペプチド、ホモダイマー、ヘテロダイマー、ポリペプチドの変異体、修飾ポリペプチド、誘導体、類似体、融合タンパク質を含む。ポリペプチドは、天然ペプチド、組換えペプチド、又はそれらの組合せを含む。
用語「プロモーター／制御配列」は、プロモーター／制御配列に操作可能に連結された遺伝子産物の発現に必要となる核酸配列を指す。一部の例では、この配列はコアプロモーター配列であることがあり、他の例では、この配列は、エンハンサー配列と、遺伝子産物の発現に必要となる他の制御エレメントも含むことがある。プロモーター／制御配列は、例えば、組織特異的に遺伝子産物を発現するものであってよい。
用語「構成的」プロモーターは、遺伝子産物をコード又は特定するポリヌクレオチドと操作可能に連結されたとき、細胞の大部分又は全ての生理学的条件下において細胞内で遺伝子産物を産生させるヌクレオチド配列を指す。
用語「誘導性」プロモーターは、遺伝子産物をコード又は特定するポリヌクレオチドと操作可能に連結されたとき、実質的にプロモーターに対応するインデューサーが細胞内に存在する場合にのみ細胞内で遺伝子産物を産生させるヌクレオチド配列を指す。
本明細書で用いられる場合、「一時的」とは、数時間、数日又は数週間にわたる非統合導入遺伝子の発現を指し、ゲノムに組み込まれた場合、又は宿主細胞内の安定したプラスミドレプリコン内に含まれている場合、発現期間は遺伝子の発現期間よりも短い。
用語「実質的に精製された」細胞は、基本的に他の細胞型を含まない細胞を指す。また、実質的に精製された細胞は、天然に存在する状態では通常関連している他の細胞型から分離されている細胞も指す。一部の例では、実質的に精製された細胞の集団は、細胞の同種集団を指す。他の例では、この用語は、単に、天然状態では自然に関連している細胞から分離されている細胞を指す。一部の態様では、細胞はインビトロで培養される。他の態様では、細胞はインビトロで培養されない。
用語「トランスフェクト」又は「形質転換」又は「形質導入」は、外来核酸が宿主細胞に移行又は導入されるプロセスを指す。「トランスフェクトされた」又は「形質転換された」又は「形質導入された」細胞は、外来核酸によってトランスフェクト、形質転換又は形質導入された細胞である。細胞には、初代の対象細胞とその子孫が含まれる。
本開示全体にわたって、本発明の様々な態様は範囲の形式で提示され得る。当然のことながら、範囲の形式の記載は、簡便さと簡潔さのためのものにすぎず、本発明の範囲に対する柔軟性のない限定として解釈されるべきではない。したがって、範囲の記載は、その範囲内の全ての可能性のある部分範囲だけでなく個々の数値も具体的に開示していると解釈されるべきである。例えば、１～６のような範囲の記載は、１～３、１～４、１～５、２～４、２～６、３～６等の部分範囲だけでなく、その範囲内の個々の数字、例えば１、２、２．７、３、４、５、５．３及び６も具体的に開示していると解釈されるべきである。別の例として、９５～９９％の同一性等の範囲は、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％の同一性を有するものを含み、また、９６～９９％、９６～９８％、９６～９７％、９７～９９％、９７～９８％及び９８～９９％の同一性等の部分範囲を含む。これは、範囲の広さに関係なく適用される。
ＩＩＩ．抗ＨＬＡ－Ａ２抗体
一態様では、本発明は抗ＨＬＡ－Ａ２抗体を提供する。例示的な抗体には、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、組換え抗体、キメラ抗体、ヒト抗体、ヒト化抗体及びそれらの抗原結合断片が含まれる。
一実施形態では、本発明は、ヒト化抗ＨＬＡ－Ａ２抗体を提供する。本明細書で提供されるヒト化抗ＨＬＡ－Ａ２抗体は、ＨＬＡ－Ａ２に特異的に結合する。一実施形態では、本明細書で提供されるヒト化抗ＨＬＡ－Ａ２抗体は、ＨＬＡ－Ａ＊０２：０１に特異的に結合する。当業者には当然のことながら、ＨＬＡ－Ａ２に結合する抗体の能力は、当技術分野で公知の技術の使用によって検出することができる。例えば、抗体のＨＬＡ－Ａ２への結合は、本明細書に例示されるＨＬＡ－Ａ２四量体の使用によって検出することができる。一実施形態では、本明細書で提供されるヒト化抗ＨＬＡ－Ａ２抗体は、ＨＬＡ－Ａ２への結合について、配列番号１８３のアミノ酸配列を有する重鎖相補性決定領域１（ＨＣＤＲ１）、配列番号１８５のアミノ酸配列を有する重鎖相補性決定領域２（ＨＣＤＲ２）、配列番号１８７のアミノ酸配列を有する重鎖相補性決定領域３（ＨＣＤＲ３）、配列番号１８８のアミノ酸配列を有する軽鎖相補性決定領域１（ＬＣＤＲ１）、配列番号１８９のアミノ酸配列を有する軽鎖相補性決定領域２（ＬＣＤＲ２）、及び配列番号１９０のアミノ酸配列を有する軽鎖相補性決定領域３（ＬＣＤＲ３）を含む抗体と競合する。一実施形態では、本明細書で提供されるヒト化抗ＨＬＡ－Ａ２抗体は、配列番号１８３のアミノ酸配列を有する重鎖相補性決定領域１（ＨＣＤＲ１）、配列番号１８５のアミノ酸配列を有する重鎖相補性決定領域２（ＨＣＤＲ２）、配列番号１８７のアミノ酸配列を有する重鎖相補性決定領域３（ＨＣＤＲ３）、配列番号１８８のアミノ酸配列を有する軽鎖相補性決定領域１（ＬＣＤＲ１）、配列番号１８９のアミノ酸配列を有する軽鎖相補性決定領域２（ＬＣＤＲ２）、及び配列番号１９０のアミノ酸配列を有する軽鎖相補性決定領域３（ＬＣＤＲ３）を有する抗体と同じＨＬＡ－Ａ２エピトープに結合する。一実施形態では、本明細書で提供されるヒト化抗ＨＬＡ－Ａ２抗体は、ＨＬＡ－Ａ２への結合についてＢＢ７．２抗体と競合する。
一実施形態では、本明細書で提供されるヒト化抗ＨＬＡ－Ａ２抗体は、ＢＢ７．２抗体と同じＨＬＡ－Ａ２エピトープに結合する。一実施形態では、本明細書で提供されるヒト化抗ＨＬＡ－Ａ２抗体は、ＢＢ７．２抗体と比較して、ＨＬＡ－Ａ＊０３、ＨＬＡ－Ａ＊２５、ＨＬＡ－Ａ＊２９、ＨＬＡ－Ａ＊３０、ＨＬＡ－Ａ＊３１、ＨＬＡ－Ａ＊３３、ＨＬＡ－Ａ＊３６、ＨＬＡ－Ａ＊６８のうちの１つ以上から選択される少なくとも１つのＨＬＡ－Ａサブタイプに対する反応性が低い。一実施形態では、本明細書で提供されるヒト化抗ＨＬＡ－Ａ２抗体は、ＢＢ７．２抗体と比較して、ＨＬＡ－Ａ＊０３、ＨＬＡ－Ａ＊２５、ＨＬＡ－Ａ＊２９、ＨＬＡ－Ａ＊３０、ＨＬＡ－Ａ＊３１、ＨＬＡ－Ａ＊３３、ＨＬＡ－Ａ＊３６、ＨＬＡ－Ａ＊６８のうちの２つ以上から選択される少なくとも１つのＨＬＡ－Ａサブタイプに対する反応性が低い。一実施形態では、本明細書で提供されるヒト化抗ＨＬＡ－Ａ２抗体は、ＢＢ７．２抗体と比較して、ＨＬＡ－Ａ＊０３、ＨＬＡ－Ａ＊２５、ＨＬＡ－Ａ＊２９、ＨＬＡ－Ａ＊３０、ＨＬＡ－Ａ＊３１、ＨＬＡ－Ａ＊３３、ＨＬＡ－Ａ＊３６、ＨＬＡ－Ａ＊６８のうちの３つ以上から選択される少なくとも１つのＨＬＡ－Ａサブタイプに対する反応性が低い。一実施形態では、本明細書で提供されるヒト化抗ＨＬＡ－Ａ２抗体は、ＢＢ７．２抗体と比較して、ＨＬＡ－Ａ＊０３、ＨＬＡ－Ａ＊２５、ＨＬＡ－Ａ＊２９、ＨＬＡ－Ａ＊３０、ＨＬＡ－Ａ＊３１、ＨＬＡ－Ａ＊３３、ＨＬＡ－Ａ＊３６、ＨＬＡ－Ａ＊６８のうちの４つ以上から選択される少なくとも１つのＨＬＡ－Ａサブタイプに対する反応性が低い。一実施形態では、本明細書で提供されるヒト化抗ＨＬＡ－Ａ２抗体は、ＢＢ７．２抗体と比較して、ＨＬＡ－Ａ＊０３、ＨＬＡ－Ａ＊２５、ＨＬＡ－Ａ＊２９、ＨＬＡ－Ａ＊３０、ＨＬＡ－Ａ＊３１、ＨＬＡ－Ａ＊３３、ＨＬＡ－Ａ＊３６、ＨＬＡ－Ａ＊６８のうちの５つ以上から選択される少なくとも１つのＨＬＡ－Ａサブタイプに対する反応性が低い。一実施形態では、本明細書で提供されるヒト化抗ＨＬＡ－Ａ２抗体は、ＢＢ７．２抗体と比較して、ＨＬＡ－Ａ＊０３、ＨＬＡ－Ａ＊２５、ＨＬＡ－Ａ＊２９、ＨＬＡ－Ａ＊３０、ＨＬＡ－Ａ＊３１、ＨＬＡ－Ａ＊３３、ＨＬＡ－Ａ＊３６、ＨＬＡ－Ａ＊６８のうちの６つ以上から選択される少なくとも１つのＨＬＡ－Ａサブタイプに対する反応性が低い。一実施形態では、本明細書で提供されるヒト化抗ＨＬＡ－Ａ２抗体は、ＢＢ７．２抗体と比較して、ＨＬＡ－Ａ＊０３、ＨＬＡ－Ａ＊２５、ＨＬＡ－Ａ＊２９、ＨＬＡ－Ａ＊３０、ＨＬＡ－Ａ＊３１、ＨＬＡ－Ａ＊３３、ＨＬＡ－Ａ＊３６、ＨＬＡ－Ａ＊６８のうちの７つ以上から選択される少なくとも１つのＨＬＡ－Ａサブタイプに対する反応性が低い。一実施形態では、本明細書で提供されるヒト化抗ＨＬＡ－Ａ２抗体は、ＢＢ７．２抗体と比較して、ＨＬＡ－Ａ＊０３、ＨＬＡ－Ａ＊２５、ＨＬＡ－Ａ＊２９、ＨＬＡ－Ａ＊３０、ＨＬＡ－Ａ＊３１、ＨＬＡ－Ａ＊３３、ＨＬＡ－Ａ＊３６、ＨＬＡ－Ａ＊６８のうちの各々から選択される少なくとも１つのＨＬＡ－Ａサブタイプに対する反応性が低い。一実施形態では、本明細書で提供されるヒト化抗ＨＬＡ－Ａ２抗体は、ＢＢ７．２抗体と比較して、ＨＬＡ－Ａ＊２５、ＨＬＡ－Ａ＊２９、ＨＬＡ－Ａ＊３０のうちの１つ以上から選択される少なくとも１つのＨＬＡ－Ａサブタイプに対する反応性が低い。一実施形態では、本明細書で提供されるヒト化抗ＨＬＡ－Ａ２抗体は、ＢＢ７．２抗体と比較して、ＨＬＡ－Ａ＊２５、ＨＬＡ－Ａ＊２９、ＨＬＡ－Ａ＊３０のうちの２つ以上から選択される少なくとも１つのＨＬＡ－Ａサブタイプに対する反応性が低い。一実施形態では、本明細書で提供されるヒト化抗ＨＬＡ－Ａ２抗体は、ＢＢ７．２抗体と比較して、ＨＬＡ－Ａ＊２５、ＨＬＡ－Ａ＊２９、ＨＬＡ－Ａ＊３０のうちの各々から選択される少なくとも１つのＨＬＡ－Ａサブタイプに対する反応性が低い。一実施形態では、本明細書で提供されるヒト化抗ＨＬＡ－Ａ２抗体は、ＢＢ７．２抗体と比較して、ＨＬＡ－Ａ＊０３：０１、ＨＬＡ－Ａ＊２５：０１、ＨＬＡ－Ａ＊２９：０２、ＨＬＡ－Ａ＊３０：０１、ＨＬＡ－Ａ＊３１：０１、ＨＬＡ－Ａ＊３３：０１、ＨＬＡ－Ａ＊３６：０１及びＨＬＡ－Ａ＊６８：０１のうちの少なくとも１つに対する反応性が低い。一実施形態では、本明細書で提供されるヒト化抗ＨＬＡ－Ａ２抗体は、ＢＢ７．２抗体と比較して、ＨＬＡ－Ａ＊０３：０１、ＨＬＡ－Ａ＊２５：０１、ＨＬＡ－Ａ＊２９：０２、ＨＬＡ－Ａ＊３０：０１、ＨＬＡ－Ａ＊３１：０１、ＨＬＡ－Ａ＊３３：０１、ＨＬＡ－Ａ＊３６：０１及びＨＬＡ－Ａ＊６８：０１のうちの少なくとも２つに対する反応性が低い。一実施形態では、本明細書で提供されるヒト化抗ＨＬＡ－Ａ２抗体は、ＢＢ７．２抗体と比較して、ＨＬＡ－Ａ＊０３：０１、ＨＬＡ－Ａ＊２５：０１、ＨＬＡ－Ａ＊２９：０２、ＨＬＡ－Ａ＊３０：０１、ＨＬＡ－Ａ＊３１：０１、ＨＬＡ－Ａ＊３３：０１、ＨＬＡ－Ａ＊３６：０１及びＨＬＡ－Ａ＊６８：０１のうちの少なくとも３つに対する反応性が低い。一実施形態では、本明細書で提供されるヒト化抗ＨＬＡ－Ａ２抗体は、ＢＢ７．２抗体と比較して、ＨＬＡ－Ａ＊０３：０１、ＨＬＡ－Ａ＊２５：０１、ＨＬＡ－Ａ＊２９：０２、ＨＬＡ－Ａ＊３０：０１、ＨＬＡ－Ａ＊３１：０１、ＨＬＡ－Ａ＊３３：０１、ＨＬＡ－Ａ＊３６：０１及びＨＬＡ－Ａ＊６８：０１のうちの少なくとも４つに対する反応性が低い。一実施形態では、本明細書で提供されるヒト化抗ＨＬＡ－Ａ２抗体は、ＢＢ７．２抗体と比較して、ＨＬＡ－Ａ＊０３：０１、ＨＬＡ－Ａ＊２５：０１、ＨＬＡ－Ａ＊２９：０２、ＨＬＡ－Ａ＊３０：０１、ＨＬＡ－Ａ＊３１：０１、ＨＬＡ－Ａ＊３３：０１、ＨＬＡ－Ａ＊３６：０１及びＨＬＡ－Ａ＊６８：０１のうちの少なくとも５つに対する反応性が低い。一実施形態では、本明細書で提供されるヒト化抗ＨＬＡ－Ａ２抗体は、ＢＢ７．２抗体と比較して、ＨＬＡ－Ａ＊０３：０１、ＨＬＡ－Ａ＊２５：０１、ＨＬＡ－Ａ＊２９：０２、ＨＬＡ－Ａ＊３０：０１、ＨＬＡ－Ａ＊３１：０１、ＨＬＡ－Ａ＊３３：０１、ＨＬＡ－Ａ＊３６：０１及びＨＬＡ－Ａ＊６８：０１のうちの少なくとも６つに対する反応性が低い。一実施形態では、本明細書で提供されるヒト化抗ＨＬＡ－Ａ２抗体は、ＢＢ７．２抗体と比較して、ＨＬＡ－Ａ＊０３：０１、ＨＬＡ－Ａ＊２５：０１、ＨＬＡ－Ａ＊２９：０２、ＨＬＡ－Ａ＊３０：０１、ＨＬＡ－Ａ＊３１：０１、ＨＬＡ－Ａ＊３３：０１、ＨＬＡ－Ａ＊３６：０１及びＨＬＡ－Ａ＊６８：０１のうちの少なくとも７つに対する反応性が低い。一実施形態では、本明細書で提供されるヒト化抗ＨＬＡ－Ａ２抗体は、ＢＢ７．２抗体と比較して、ＨＬＡ－Ａ＊０３：０１、ＨＬＡ－Ａ＊２５：０１、ＨＬＡ－Ａ＊２９：０２、ＨＬＡ－Ａ＊３０：０１、ＨＬＡ－Ａ＊３１：０１、ＨＬＡ－Ａ＊３３：０１、ＨＬＡ－Ａ＊３６：０１及びＨＬＡ－Ａ＊６８：０１に対する反応性が低い。一実施形態では、本明細書で提供されるヒト化抗ＨＬＡ－Ａ２抗体は、ＢＢ７．２抗体と比較して、ＨＬＡ－Ａ＊２５：０１、ＨＬＡ－Ａ＊２９：０２及びＨＬＡ－Ａ＊３０：０１のうちの少なくとも１つに対する反応性が低い。一実施形態では、本明細書で提供されるヒト化抗ＨＬＡ－Ａ２抗体は、ＢＢ７．２抗体と比較して、ＨＬＡ－Ａ＊２５：０１、ＨＬＡ－Ａ＊２９：０２及びＨＬＡ－Ａ＊３０：０１のうちの少なくとも２つに対する反応性が低い。一実施形態では、本明細書で提供されるヒト化抗ＨＬＡ－Ａ２抗体は、ＢＢ７．２抗体と比較して、ＨＬＡ－Ａ＊２５：０１、ＨＬＡ－Ａ＊２９：０２及びＨＬＡ－Ａ＊３０：０１に対する反応性が低い。一実施形態では、本明細書で提供されるヒト化抗ＨＬＡ－Ａ２抗体は、ＢＢ７．２抗体と比較して、ＨＬＡ－Ａ＊２５：０１に対する反応性が低い。一実施形態では、本明細書で提供されるヒト化抗ＨＬＡ－Ａ２抗体は、ＢＢ７．２抗体と比較して、ＨＬＡ－Ａ＊２９：０２に対する反応性が低い。一実施形態では、本明細書で提供されるヒト化抗ＨＬＡ－Ａ２抗体は、ＢＢ７．２抗体と比較して、ＨＬＡ－Ａ＊３０：０１に対する反応性が低い。一実施形態では、本明細書で提供されるヒト化抗ＨＬＡ－Ａ２抗体は、ＢＢ７．２抗体と比較して、ＨＬＡ－Ａ＊０３：０１に対する反応性が低い。一実施形態では、本明細書で提供されるヒト化抗ＨＬＡ－Ａ２抗体は、ＢＢ７．２抗体と比較して、ＨＬＡ－Ａ＊３１：０１に対する反応性が低い。一実施形態では、本明細書で提供されるヒト化抗ＨＬＡ－Ａ２抗体は、ＢＢ７．２抗体と比較して、ＨＬＡ－Ａ＊３３：０１に対する反応性が低い。一実施形態では、本明細書で提供されるヒト化抗ＨＬＡ－Ａ２抗体は、ＢＢ７．２抗体と比較して、ＨＬＡ－Ａ＊３６：０１に対する反応性が低い。一実施形態では、本明細書で提供されるヒト化抗ＨＬＡ－Ａ２抗体は、ＢＢ７．２抗体と比較して、ＨＬＡ－Ａ＊６８：０１に対する反応性が低い。ＢＢ７．２抗体は、ＢＢ７．２ハイブリドーマ（ＡＴＣＣ寄託番号ＨＢ－８２）から単離することができる。
ＨＬＡ－Ａサブタイプに対するヒト化抗ＨＬＡ－Ａ２抗体の反応性を決定するための技術は、当業者には公知であろう。例えば、ＨＬＡ－Ａサブタイプに対するヒト化抗ＨＬＡ－Ａ２抗体の反応性は、単一抗原ビーズアッセイによって決定されてよい。そのような単一抗原ビーズアッセイは市販されている（例えばＦｌｏｗＰＲＡ Ｓｉｎｇｌｅ Ａｎｔｉｇｅｎ Ａｎｔｉｂｏｄｙ；ＯＮＥ ＬＡＭＢＤＡ）。
一実施形態では、本明細書で提供されるヒト化抗ＨＬＡ－Ａ２抗体は、ＢＢ７．２抗体と比較して、例えば試験Ａの条件で測定した場合、ＢＢ７．２ ｓｃＦｖと比較して、ＨＬＡ－Ａ＊０３、ＨＬＡ－Ａ＊２５、ＨＬＡ－Ａ＊２９、ＨＬＡ－Ａ＊３０、ＨＬＡ－Ａ＊３１、ＨＬＡ－Ａ＊３３、ＨＬＡ－Ａ＊３６、ＨＬＡ－Ａ＊６８及びそれらの任意の組合せのうちの１つ以上から選択される少なくとも１つのＨＬＡ－Ａサブタイプに対する反応性が低い。例えば、一部の実施形態では、本明細書で提供されるヒト化抗ＨＬＡ－Ａ２抗体は、ＢＢ７．２抗体と比較して、例えば試験Ａの条件で測定した場合、ＢＢ７．２ ｓｃＦｖと比較して、ＨＬＡ－Ａ＊２５、ＨＬＡ－Ａ＊２９、ＨＬＡ－Ａ＊３０及びそれらの任意の組合せのうちの１つ以上から選択される少なくとも１つのＨＬＡ－Ａサブタイプに対する反応性が低い。
試験Ａ：
ヒト化抗ＨＬＡ－Ａ２抗体又はＢＢ７．２抗体、例えばＢＢ７．２ ｓｃＦｖ（ｍＡ２ ＣＡＲ）を含むＣＡＲを発現するＴ細胞０．２５×１０６個を、ＦｌｏｗＰＲＡ単一抗原抗体ビーズパネル（ＦＬ１ＨＤ０１、ＦＬ１ＨＤ０２、ＦＬ１ＨＤ０３、ＦＬ１ＨＤ０４、ＦＬ１ＨＤ０６及びＦＬ１ＨＤ０８、Ｏｎｅ Ｌａｍｂｄａ）及び固定可能な生死判別色素（ＦＶＤ、ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ、６５－０８６５－１４、ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）とともに、室温で３０分間インキュベートする。試料を洗浄し、０．５％ホルムアルデヒドで固定し、フローサイトメトリーによって分析する。試料ごとに、２００個の陰性対照ビーズを得る。ビーズ単体を陰性対照として使用した。分析のために、まず、固定可能な生死判別色素を用いて死細胞を除去する。次に、死細胞とダブレットを排除した後、単一抗原ビーズをゲーティングする。次に、ＨＬＡあたりのビーズ数を、それぞれのＰＥ強度ピークによって決定する。各ＨＬＡピークにおける関心ビーズ数に２００を掛け、試料内の陰性ビーズ数で割ることにより、データを正規化する。各ＨＬＡピークについて、対照試料のビーズ数からＣＡＲ－Ｔｒｅｇのビーズ数を引いてから、非ＣＡＲ発現対照のビーズ平均数を割り、１００倍することによって、対照（非ＣＡＲ発現細胞）と比較したＣＡＲ Ｔｒｅｇの相対結合率を決定する。
一実施形態では、本発明のヒト化抗ＨＬＡ－Ａ２抗体は、ＨＬＡ－Ａ＊０３、ＨＬＡ－Ａ＊２５、ＨＬＡ－Ａ＊２９、ＨＬＡ－Ａ＊３０、ＨＬＡ－Ａ＊３１、ＨＬＡ－Ａ＊３３、ＨＬＡ－Ａ＊３６、ＨＬＡ－Ａ＊６８を含む群から選択される少なくとも１つのＨＬＡ－Ａサブタイプに対する反応性が、例えば試験Ａの条件で測定した場合に、ＢＢ７．２抗体よりも統計的に劣る。
一実施形態では、本発明のヒト化抗ＨＬＡ－Ａ２抗体は、ＨＬＡ－Ａ＊２５、ＨＬＡ－Ａ＊２９、ＨＬＡ－Ａ＊３０を含む群から選択される少なくとも１つのＨＬＡ－Ａサブタイプに対する反応性が、例えば試験Ａの条件で測定した場合に、ＢＢ７．２抗体よりも統計的に劣る。
一実施形態では、「統計的に劣る」という用語は、本発明の抗ＨＬＡ－Ａ２抗体について測定された反応性（例えば試験Ａの条件における相対的結合）が、特に２元配置分散分析、Ｄｕｎｎｅｔｔポストテストで分析したときに、ＢＢ７．２抗体について測定された反応性よりも、最大で約０．０５、好ましくは最大で約０．０１、より好ましくは最大で約０．００５、更に好ましくは最大で約０．００１のｐ値で劣ることを意味する。
一実施形態では、本発明の抗ＨＬＡ－Ａ２抗体は、ＨＬＡ－Ａ＊０３、ＨＬＡ－Ａ＊２５、ＨＬＡ－Ａ＊２９、ＨＬＡ－Ａ＊３０、ＨＬＡ－Ａ＊３０、ＨＬＡ－Ａ＊３１、ＨＬＡ－Ａ＊３３、ＨＬＡ－Ａ＊３６、ＨＬＡ－Ａ＊６８を含む群から選択される少なくとも１つのＨＬＡ－Ａサブタイプに対する反応性が、ＢＢ７．２抗体よりも劣る。一部の実施形態では、該抗ＨＬＡ－Ａ２抗体は、ＨＬＡ－Ａ＊０３、ＨＬＡ－Ａ＊２５、ＨＬＡ－Ａ＊２９、ＨＬＡ－Ａ＊３０、ＨＬＡ－Ａ＊３１、ＨＬＡ－Ａ＊３３、ＨＬＡ－Ａ＊３６、ＨＬＡ－Ａ＊６８を含む群から選択される少なくとも１つのＨＬＡ－Ａサブタイプに対する相対的結合が、試験Ａの条件で測定した場合に、ＢＢ７．２抗体よりも劣る。特定の態様において、該抗ＨＬＡ－Ａ２抗体について測定された相対的結合は、ＢＢ７．２抗体について測定された相対的結合の、最大で約９０％、８０％、７０％、６０％、５０％、４０％、３０％、２０％、１０％以下である。
一実施形態では、本発明の抗ＨＬＡ－Ａ２抗体は、ＨＬＡ－Ａ＊２５、ＨＬＡ－Ａ＊２９、ＨＬＡ－Ａ＊３０を含む群から選択される少なくとも１つのＨＬＡ－Ａサブタイプに対する反応性が、ＢＢ７．２抗体よりも劣る。一部の実施形態では、該抗ＨＬＡ－Ａ２抗体は、ＨＬＡ－Ａ＊２５、ＨＬＡ－Ａ＊２９、ＨＬＡ－Ａ＊３０を含む群から選択される少なくとも１つのＨＬＡ－Ａサブタイプに対する相対的結合が、試験Ａの条件で測定した場合に、ＢＢ７．２抗体よりも劣る。特定の態様において、該抗ＨＬＡ－Ａ２抗体について測定された相対的結合は、ＢＢ７．２抗体について測定された相対的結合の、最大で約９０％、８０％、７０％、６０％、５０％、４０％、３０％、２０％、１０％以下である。
更に、本明細書で提供される抗原結合活性を有するヒト化抗ＨＬＡ－Ａ２抗体は、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）の抗原結合ドメインを構成することが可能であり、該ＣＡＲは、ＣＡＲがＨＬＡ－Ａ２に特異的に結合するようにヒト細胞において発現することが可能である。一実施形態では、ＣＡＲは、ＨＬＡ－Ａ＊０２：０１に特異的に結合する。当業者には当然のことながら、ＨＬＡ－Ａ２に結合するＣＡＲの能力は、当技術分野で公知の技術の使用によって検出することができる。例えば、ＣＡＲのＨＬＡ－Ａ２への結合は、本明細書に例示されるＨＬＡ－Ａ２四量体の使用によって検出することができる。一実施形態では、ヒト細胞は免疫細胞である。一実施形態では、免疫細胞は制御性免疫細胞である。一実施形態では、免疫細胞は制御性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）である。一実施形態では、免疫細胞はＴ細胞である。一実施形態では、Ｔ細胞はＴｒｅｇである。
更に、本明細書で提供される抗原結合活性を有するヒト化抗ＨＬＡ－Ａ２抗体は、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）の抗原結合ドメインを構成することが可能であり、該ＣＡＲは、ＣＡＲがＨＬＡ－Ａ２に特異的に結合するように、制御性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）において発現することが可能である。一実施形態では、ＣＡＲはＨＬＡ－Ａ＊０２：０１に特異的に結合する。一実施形態では、ＴｒｅｇはヒトＴｒｅｇである。
一実施形態では、ヒト化抗ＨＬＡ－Ａ２抗体は、ＣＡＲの抗原結合ドメインを構成することが可能であり、該ＣＡＲは、免疫細胞がＨＬＡ－Ａ２によって活性化されるように免疫細胞において発現することが可能である。一実施形態では、免疫細胞は、ＨＬＡ－Ａ＊０２：０１によって活性化される。一実施形態では、免疫細胞は制御性免疫細胞である。一実施形態では、免疫細胞は制御性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）である。一実施形態では、免疫細胞はＴ細胞である。一実施形態では、Ｔ細胞はＴｒｅｇである。一実施形態では、免疫細胞はヒト免疫細胞である。一実施形態では、制御性免疫細胞はヒト制御性免疫細胞である。一実施形態では、Ｔ細胞はヒトＴ細胞である。一実施形態では、ＴｒｅｇはヒトＴｒｅｇである。
一実施形態では、ヒト化抗ＨＬＡ－Ａ２抗体は、ＳＹＨＩＱ（配列番号１）及びＧＹＴＦＴＳＹ（配列番号２）から成る群から選択されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域を含む。
一実施形態では、ヒト化抗ＨＬＡ－Ａ２抗体は、配列番号１～２から選択される相補性決定領域１（ＶＨ ＣＤＲ１）を有する重鎖可変領域を含む。一実施形態では、ヒト化抗ＨＬＡ－Ａ２抗体は、配列番号1によって定められるＶＨ ＣＤＲ１を有する重鎖可変領域を含む。一実施形態では、ヒト化抗ＨＬＡ－Ａ２抗体は、配列番号２によって定められるＶＨ ＣＤＲ１を有する重鎖可変領域を含む。
一実施形態では、ヒト化抗ＨＬＡ－Ａ２抗体は、ＹＰＧＤＧＳ（配列番号４）及びＷＩＹＰＧＤＧＳＴＸ１０ＹＸ１２Ｘ１３ＫＦＸ１６Ｇ（配列番号１０）から成る群から選択されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域を含み、配列番号１０において、１０位のアミノ酸（Ｘ１０）はＱ又はＫであり、１２位のアミノ酸（Ｘ１２）はＮ又はＳであり、１３位のアミノ酸（Ｘ１３）はＥ又はＱであり、１６位のアミノ酸（Ｘ１６）はＫ又はＱである。
一実施形態では、ヒト化抗ＨＬＡ－Ａ２抗体は、アミノ酸配列ＷＩＹＰＧＤＧＳＴＸ１０ＹＸ１２Ｘ１３ＫＦＸ１６Ｇ（配列番号１０）を含む重鎖可変領域を含み、１０位（Ｘ１０）のアミノ酸はＱ又はＫであり、１２位のアミノ酸（Ｘ１２）はＮ又はＳであり、１３位のアミノ酸（Ｘ１３）はＥ又はＱであり、１６位のアミノ酸（Ｘ１６）はＫ又はＱである。
一実施形態では、ヒト化抗ＨＬＡ－Ａ２抗体は、ＹＰＧＤＧＳ（配列番号４）及びＷＩＹＰＧＤＧＳＴＸ１０ＹＸ１２Ｘ１３ＫＦＸ１６Ｇ（配列番号１０）から成る群から選択されるアミノ酸配列を含む相補鎖決定領域２（ＶＨ ＣＤＲ２）を含む重鎖可変領域を含み、配列番号１０において、１０位のアミノ酸（Ｘ１０）はＱ又はＫであり、１２位のアミノ酸（Ｘ１２）はＮ又はＳであり、１３位のアミノ酸（Ｘ１３）はＥ又はＱであり、１６位のアミノ酸（Ｘ１６）はＫ又はＱである。一実施形態では、ヒト化抗ＨＬＡ－Ａ２抗体は、アミノ酸配列ＷＩＹＰＧＤＧＳＴＸ１０ＹＸ１２Ｘ１３ＫＦＸ１６Ｇ（配列番号１０）を含む相補性決定領域２（ＶＨ ＣＤＲ２）を含む重鎖可変領域を含み、１０位のアミノ酸（Ｘ１０）はＱ又はＫであり、１２位のアミノ酸（Ｘ１２）はＮ又はＳであり、１３位のアミノ酸（Ｘ１３）はＥ又はＱであり、１６位のアミノ酸（Ｘ１６）はＫ又はＱである。一実施形態では、重鎖可変領域は、配列番号１０に記載のアミノ酸配列を含むＶＨ ＣＤＲ２を含み、１０位のアミノ酸はＱ又はＫであり、１２位のアミノ酸はＳであり、１３位のアミノ酸はＱであり、１６位のアミノ酸はＱである。一実施形態では、重鎖可変領域は、配列番号１０に記載のアミノ酸配列を含むＶＨ ＣＤＲ２を含み、１０位のアミノ酸はＫであり、１２位のアミノ酸はＮ又はＳであり、１３位のアミノ酸はＱであり、１６位のアミノ酸はＱである。一実施形態では、重鎖可変領域は、配列番号１０に記載のアミノ酸配列を含むＶＨ ＣＤＲ２を含み、１０位のアミノ酸はＫであり、１２位のアミノ酸はＳであり、１３位のアミノ酸はＥ又はＱであり、１６位のアミノ酸はＱである。一実施形態では、重鎖可変領域は、配列番号１０に記載のアミノ酸配列を含むＶＨ ＣＤＲ２を含み、１０位のアミノ酸はＫであり、１２位のアミノ酸はＳであり、１３位のアミノ酸はＱであり、１６位のアミノ酸はＫ又はＱである。一実施形態では、重鎖可変領域は、配列番号１０に記載のアミノ酸配列を含むＶＨ ＣＤＲ２を含み、１０位のアミノ酸はＱ又はＫであり、１２位のアミノ酸はＮ又はＳであり、１３位のアミノ酸はＱであり、１６位のアミノ酸はＱである。一実施形態では、重鎖可変領域は、配列番号１０に記載のアミノ酸配列を含むＶＨ ＣＤＲ２を含み、１０位のアミノ酸はＱ又はＫであり、１２位のアミノ酸はＳであり、１３位のアミノ酸はＥ又はＱであり、１６位のアミノ酸はＱである。一実施形態では、重鎖可変領域は、配列番号１０に記載のアミノ酸配列を含むＶＨ ＣＤＲ２を含み、１０位のアミノ酸はＱ又はＫであり、１２位のアミノ酸はＳであり、１３位のアミノ酸はＱであり、１６位のアミノ酸はＫ又はＱである。一実施形態では、重鎖可変領域は、配列番号１０に記載のアミノ酸配列を含むＶＨ ＣＤＲ２を含み、１０位のアミノ酸はＫであり、１２位のアミノ酸はＮ又はＳであり、１３位のアミノ酸はＥ又はＱであり、１６位のアミノ酸はＱである。一実施形態では、重鎖可変領域は、配列番号１０に記載のアミノ酸配列を含むＶＨ ＣＤＲ２を含み、１０位のアミノ酸はＫであり、１２位のアミノ酸はＮ又はＳであり、１３位のアミノ酸はＱであり、１６位のアミノ酸はＫ又はＱである。一実施形態では、重鎖可変領域は、配列番号１０に記載のアミノ酸配列を含むＶＨ ＣＤＲ２を含み、１０位のアミノ酸はＫであり、１２位のアミノ酸はＳであり、１３位のアミノ酸はＥ又はＱであり、１６位のアミノ酸はＫ又はＱである。一実施形態では、重鎖可変領域は、配列番号１０に記載のアミノ酸配列を含むＶＨ ＣＤＲ２を含み、１０位のアミノ酸はＱ又はＫであり、１２位のアミノ酸はＮ又はＳであり、１３位のアミノ酸はＥ又はＱであり、１６位のアミノ酸はＱである。一実施形態では、重鎖可変領域は、配列番号１０に記載のアミノ酸配列を含むＶＨ ＣＤＲ２を含み、１０位のアミノ酸はＱ又はＫであり、１２位のアミノ酸はＮ又はＳであり、１３位のアミノ酸はＱであり、１６位のアミノ酸はＫ又はＱである。一実施形態では、重鎖可変領域は、配列番号１０に記載のアミノ酸配列を含むＶＨ ＣＤＲ２を含み、１０位のアミノ酸はＱ又はＫであり、１２位のアミノ酸はＳであり、１３位のアミノ酸はＥ又はＱであり、１６位のアミノ酸はＫ又はＱである。一実施形態では、重鎖可変領域は、配列番号１０に記載のアミノ酸配列を含むＶＨ ＣＤＲ２を含み、１０位のアミノ酸はＫであり、１２位のアミノ酸はＮ又はＳであり、１３位のアミノ酸はＥ又はＱであり、１６位のアミノ酸はＫ又はＱである。
一実施形態では、ヒト化抗ＨＬＡ－Ａ２抗体は、ＷＩＹＰＧＤＧＳＴＱＹＮＥＫＦＫＧ（配列番号３）、ＹＰＧＤＧＳ（配列番号４）及びＷＩＹＰＧＤＧＳＴＫＹＳＱＫＦＱＧ（配列番号５）から成る群から選択されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域を含む。一実施形態では、ヒト化抗ＨＬＡ－Ａ２抗体は、ＷＩＹＰＧＤＧＳＴＱＹＮＥＫＦＫＧ（配列番号３）及びＹＰＧＤＧＳ（配列番号４）から成る群から選択されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域を含む。一実施形態では、ヒト化抗ＨＬＡ－Ａ２抗体は、ＹＰＧＤＧＳ（配列番号４）及びＷＩＹＰＧＤＧＳＴＫＹＳＱＫＦＱＧ（配列番号５）から成る群から選択されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域を含む。
一実施形態では、ヒト化抗ＨＬＡ－Ａ２抗体は、配列番号３によって定められるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域を含む。一実施形態では、ヒト化抗ＨＬＡ－Ａ２抗体は、配列番号４によって定められるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域を含む。一実施形態では、ヒト化抗ＨＬＡ－Ａ２抗体は、配列番号５によって定められるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域を含む。
一実施形態では、ヒト化抗ＨＬＡ－Ａ２抗体は、配列番号３～５から選択される相補性決定領域２（ＶＨ ＣＤＲ２）を有する重鎖可変領域を含む。一実施形態では、ヒト化抗ＨＬＡ－Ａ２抗体は、配列番号３～４から選択される相補性決定領域２（ＶＨ ＣＤＲ２）を含む重鎖可変領域を含む。一実施形態では、ヒト化抗ＨＬＡ－Ａ２抗体は、配列番号４～５から選択される相補性決定領域２（ＶＨ ＣＤＲ２）を含む重鎖可変領域を含む。一実施形態では、ヒト化抗ＨＬＡ－Ａ２抗体は、配列番号５によって定められる相補性決定領域２（ＶＨ ＣＤＲ２）を含む重鎖可変領域を含む。一実施形態では、ヒト化抗ＨＬＡ－Ａ２抗体は、配列番号３によって定められるＶＨ ＣＤＲ２を含む重鎖可変領域を含む。一実施形態では、ヒト化抗ＨＬＡ－Ａ２抗体は、配列番号４によって定められるＶＨ ＣＤＲ２を含む重鎖可変領域を含む。
一実施形態では、ヒト化抗ＨＬＡ－Ａ２抗体は、アミノ酸配列ＥＧＴＹＹＡＭＤＹ（配列番号６）を含む重鎖可変領域を含む。
一実施形態では、ヒト化抗ＨＬＡ－Ａ２抗体は、配列番号６によって定められる相補性決定領域３（ＶＨ ＣＤＲ３）を有する重鎖可変領域を含む。
一実施形態では、ヒト化抗ＨＬＡ－Ａ２抗体は、以下のＣＤＲのうちの少なくとも１つを含む重鎖可変領域を含む：
配列番号１によって定められるＶＨ ＣＤＲ１；又は、
配列番号１０によって定められるＶＨ ＣＤＲ２であって、１０位のアミノ酸（Ｘ１０）はＱ又はＫであり、１２位のアミノ酸（Ｘ１２）はＮ又はＳであり、１３位のアミノ酸（Ｘ１３）はＥ又はＱであり、１６位のアミノ酸（Ｘ１６）はＫ又はＱである、ＶＨ ＣＤＲ２；又は、
配列番号６によって定められるＶＨ ＣＤＲ３。
一実施形態では、ヒト化抗ＨＬＡ－Ａ２抗体は、以下のＣＤＲのうちの少なくとも１つを含む重鎖可変領域を含む：
配列番号１によって定められるＶＨ ＣＤＲ１；又は、
配列番号３によって定められるＶＨ ＣＤＲ２；又は、
配列番号６によって定められるＶＨ ＣＤＲ３。
一実施形態では、ヒト化抗ＨＬＡ－Ａ２抗体は、以下のＣＤＲのうちの少なくとも１つを含む重鎖可変領域を含む：
配列番号１によって定められるＶＨ ＣＤＲ１；又は、
配列番号５によって定められるＶＨ ＣＤＲ２；又は、
配列番号６によって定められるＶＨ ＣＤＲ３。
一実施形態では、ヒト化抗ＨＬＡ－Ａ２抗体は、配列番号１によって定められる１つのＶＨ ＣＤＲ１と、配列番号１０によって定められる１つのＶＨ ＣＤＲ２であって、１０位のアミノ酸（Ｘ１０）はＱ又はＫであり、１２位のアミノ酸（Ｘ１２）はＮ又はＳであり、１３位のアミノ酸（Ｘ１３）はＥ又はＱであり、１６位のアミノ酸（Ｘ１６）はＫ又はＱであるＶＨ ＣＤＲ２と、配列番号６によって定められる１つのＶＨ ＣＤＲ３とを含む重鎖可変領域を含む。
一実施形態では、ヒト化抗ＨＬＡ－Ａ２抗体は、配列番号１によって定められる１つのＶＨ ＣＤＲ１と、配列番号３によって定められる１つのＶＨ ＣＤＲ２と、配列番号６によって定められる１つのＶＨ ＣＤＲ３とを含む重鎖可変領域を含む。
一実施形態では、ヒト化抗ＨＬＡ－Ａ２抗体は、配列番号１によって定められる１つのＶＨ ＣＤＲ１と、配列番号５によって定められる１つのＶＨ ＣＤＲ２と、配列番号６によって定められる１つのＶＨ ＣＤＲ３とを含む重鎖可変領域を含む。
本発明によれば、重鎖のＣＤＲ１、２又は３のいずれかは、対応する配列番号１、３、５、６及び１０に記載のＣＤＲの特定のセットと少なくとも約６０％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％の同一性を共有するアミノ酸配列を有するものとして、特徴付けることができる。
一実施形態では、ヒト化抗ＨＬＡ－Ａ２抗体は、以下のＣＤＲのうちの少なくとも１つを含む重鎖可変領域を含む：
配列番号２によって定められるＶＨ ＣＤＲ１；又は、
配列番号４によって定められるＶＨ ＣＤＲ２；又は、
配列番号６によって定められるＶＨ ＣＤＲ３。
一実施形態では、ヒト化抗ＨＬＡ－Ａ２抗体は、配列番号２によって定められる１つのＶＨ ＣＤＲ１と、配列番号４によって定められる１つのＶＨ ＣＤＲ２と、配列番号６によって定められる１つのＶＨ ＣＤＲ３とを含む重鎖可変領域を含む。
本発明によれば、重鎖のＣＤＲ１、２又は３のいずれかは、対応する配列番号２、４及び６に記載のＣＤＲの特定のセットと少なくとも約６０％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％の同一性を共有するアミノ酸配列を有するものとして、特徴付けることができる。
一実施形態では、ヒト化抗ＨＬＡ－Ａ２抗体は、アミノ酸配列ＲＳＳＱＳＩＶＨＳＮＧＮＴＹＬＥ（配列番号７）を含む軽鎖可変領域を含む。
一実施形態では、ヒト化抗ＨＬＡ－Ａ２抗体は、配列番号７によって定められる相補性決定領域１（ＶＬ ＣＤＲ１）を含む軽鎖可変領域を含む。
一実施形態では、ヒト化抗ＨＬＡ－Ａ２抗体は、アミノ酸配列ＫＶＳＮＲＦＳ（配列番号８）を含む軽鎖可変領域を含む。
一実施形態では、ヒト化抗ＨＬＡ－Ａ２抗体は、配列番号８によって定められる相補性決定領域２（ＶＬ ＣＤＲ２）を有する軽鎖可変領域を含む。
一実施形態では、ヒト化抗ＨＬＡ－Ａ２抗体は、アミノ酸配列ＦＱＧＳＨＶＰＲＴ（配列番号９）を含む軽鎖可変領域を含む。
一実施形態では、ヒト化抗ＨＬＡ－Ａ２抗体は、配列番号９によって定められる相補性決定領域３（ＶＬ ＣＤＲ３）を含む軽鎖可変領域を含む。
一実施形態では、ヒト化抗ＨＬＡ－Ａ２抗体は、以下のＣＤＲのうちの少なくとも１つを含む軽鎖可変領域を含む：
配列番号７によって定められるＶＬ ＣＤＲ１；又は、
配列番号８によって定められるＶＬ ＣＤＲ２；又は、
配列番号９によって定められるＶＬ ＣＤＲ３。
一実施形態では、ヒト化抗ＨＬＡ－Ａ２抗体は、配列番号７によって定められる１つのＶＬ ＣＤＲ１と、配列番号８によって定められる１つのＶＬ ＣＤＲ２と、配列番号９によって定められる１つのＶＬ ＣＤＲ３とを含む軽鎖可変領域を含む。
本発明によれば、軽鎖のＣＤＲ１、２又は３のいずれかは、対応する配列番号７、８及び９に記載のＣＤＲの特定のセットと少なくとも約６０％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％の同一性を共有するアミノ酸配列を有するものとして、特徴付けることができる。
一実施形態では、ヒト化抗ＨＬＡ－Ａ２抗体は、ＱＶＱＬＶＱＳＧＡＥＶＫＫＰＧＡＳＶＫＶＳＣＫＡＳ（配列番号１１）及びＱＶＱＬＶＱＳＧＡＥＶＫＫＰＧＡＳＶＫＶＳＣＫＡＳＧＹＴＦＴ（配列番号１２）から成る群から選択されるアミノ酸配列を含むフレームワーク領域１（ＶＨ ＦＲ１）を含む重鎖可変領域を含む。
一実施形態では、ヒト化抗ＨＬＡ－Ａ２抗体は、アミノ酸配列ＱＶＱＬＶＱＳＧＡＥＶＫＫＰＧＡＳＶＫＶＳＣＫＡＳ（配列番号１１）を含むフレームワーク領域１（ＶＨ ＦＲ１）を含む重鎖可変領域を含む。一実施形態では、ヒト化抗ＨＬＡ－Ａ２抗体は、配列番号１１に対して約８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含むフレームワーク領域１（ＶＨ ＦＲ１）を含む重鎖可変領域を含む。
一実施形態では、ヒト化抗ＨＬＡ－Ａ２抗体は、アミノ酸配列ＱＶＱＬＶＱＳＧＡＥＶＫＫＰＧＡＳＶＫＶＳＣＫＡＳＧＹＴＦＴ（配列番号１２）を含むフレームワーク領域１（ＶＨ ＦＲ１）を含む重鎖可変領域を含む。一実施形態では、ヒト化抗ＨＬＡ－Ａ２抗体は、配列番号１２に対して約８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含むフレームワーク領域１（ＶＨ ＦＲ１）を含む重鎖可変領域を含む。
一実施形態では、ヒト化抗ＨＬＡ－Ａ２抗体は、
ＷＶＲＱＡＰＧＱＸ９ＬＥＷＭＧＸ１５（配列番号１３）、
ＷＶＲＱＡＰＧＱＸ９ＬＥＷＭＧＸ１５ＷＩ（配列番号１７）、
ＨＩＱＷＶＲＱＡＰＧＱＸ１２ＬＥＷＭＧＸ１８ＷＩ（配列番号２１）、及び
ＨＩＱＷＶＲＱＡＰＧＱＸ１２ＬＥＷＭＧＸ１８（配列番号２５）
から成る群から選択されるアミノ酸配列を含むフレームワーク領域２（ＶＨ ＦＲ２）を含む重鎖可変領域を含み、
配列番号１３において、Ｘ９はＲ又はＧであり、Ｘ１５はＩ又は非存在であり、
配列番号１７において、Ｘ９はＲ又はＧであり、Ｘ１５はＩ又は非存在であり、
配列番号２１において、Ｘ１２はＲ又はＧであり、Ｘ１８はＩ又は非存在であり、
配列番号２５において、Ｘ１２はＲ又はＧであり、Ｘ１８はＩ又は非存在である。
一実施形態では、ヒト化抗ＨＬＡ－Ａ２抗体は、アミノ酸配列ＷＶＲＱＡＰＧＱＸ９ＬＥＷＭＧＸ１５（配列番号１３）を含むフレームワーク領域２（ＶＨ ＦＲ２）を含む重鎖可変領域を含み、９位のアミノ酸（Ｘ９）はＲ又はＧであり、１５位のアミノ酸（Ｘ１５）はＩ又は非存在である。
一実施形態では、重鎖可変領域は、配列番号１３に記載のアミノ酸配列を含むフレームワーク領域２（ＶＨ ＦＲ２）を含み、９位のアミノ酸はＲ又はＧであり、１５位のアミノ酸は存在しない。
一実施形態では、重鎖可変領域は、配列番号１４、１５又は１６に定められるアミノ酸配列を含むフレームワーク領域２（ＶＨ ＦＲ２）を含む。一実施形態では、重鎖可変領域は、配列番号１４、１５又は１６に対して約８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含むフレームワーク領域２（ＶＨ ＦＲ２）を含む。
一実施形態では、ヒト化抗ＨＬＡ－Ａ２抗体は、アミノ酸配列ＨＩＱＷＶＲＱＡＰＧＱＸ１２ＬＥＷＭＧＸ１８（配列番号２５）を含むフレームワーク領域２（ＶＨ ＦＲ２）を含む重鎖可変領域を含み、１２位のアミノ酸（Ｘ１２）はＲ又はＧであり、１８位のアミノ酸（Ｘ１８）はＩ又は非存在である。
一実施形態では、重鎖可変領域は、配列番号２５に定められるアミノ酸配列を含むフレームワーク領域２（ＶＨ ＦＲ２）を含み、１２位のアミノ酸はＲ又はＧであり、１８位のアミノ酸は非存在である。
一実施形態では、重鎖可変領域は、配列番号２６、２７又は２８に定められるアミノ酸配列を含むフレームワーク領域２（ＶＨ ＦＲ２）を含む。一実施形態では、重鎖可変領域は、配列番号２６、２７又は２８に対して約８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含むフレームワーク領域２（ＶＨ ＦＲ２）を含む。
一実施形態では、ヒト化抗ＨＬＡ－Ａ２抗体は、アミノ酸配列ＷＶＲＱＡＰＧＱＸ９ＬＥＷＭＧＸ１５ＷＩ（配列番号１７）を含むフレームワーク領域２（ＶＨ ＦＲ２）を含む重鎖可変領域を含み、９位のアミノ酸（Ｘ９）はＲ又はＧであり、１５位のアミノ酸（Ｘ１５）はＩ又は非存在である。
一実施形態では、重鎖可変領域は、配列番号１７に定められるアミノ酸配列を含むフレームワーク領域２（ＶＨ ＦＲ２）を含み、９位のアミノ酸はＲ又はＧであり、１５位のアミノ酸は存在しない。
一実施形態では、重鎖可変領域は、配列番号１８、１９又は２０に定められるアミノ酸配列を含むフレームワーク領域２（ＶＨ ＦＲ２）を含む。一実施形態では、重鎖可変領域は、配列番号１８、１９又は２０に対して約８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含むフレームワーク領域２（ＶＨ ＦＲ２）を含む。
一実施形態では、ヒト化抗ＨＬＡ－Ａ２抗体は、アミノ酸配列ＨＩＱＷＶＲＱＡＰＧＱＸ１２ＬＥＷＭＧＸ１８ＷＩ（配列番号２１）を含むフレームワーク領域２（ＶＨ ＦＲ２）を含む重鎖可変領域を含み、１２位のアミノ酸（Ｘ１２）はＲ又はＧであり、１８位のアミノ酸（Ｘ１８）はＩ又は非存在である。
一実施形態では、重鎖可変領域は、配列番号２１に定められるアミノ酸配列を含むフレームワーク領域２（ＶＨ ＦＲ２）を含み、１２位のアミノ酸はＲ又はＧであり、１８位のアミノ酸は存在しない。
一実施形態では、重鎖可変領域は、配列番号２２、２３又は２４に定められるアミノ酸配列を含むフレームワーク領域２（ＶＨ ＦＲ２）を含む。一実施形態では、重鎖可変領域は、配列番号２２、２３又は２４に対して約８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含むフレームワーク領域２（ＶＨ ＦＲ２）を含む。
一実施形態では、ヒト化抗ＨＬＡ－Ａ２抗体は、
Ｘ１ＶＴＸ４ＴＸ６ＤＴＳＸ１０ＳＴＡＹＭＸ１６ＬＳＸ１９ＬＲＳＸ２３ＤＸ２５ＡＶＹＹＣＡＲ（配列番号２９）、
ＴＸ２ＹＸ４Ｘ５ＫＦＸ８ＧＸ１０ＶＴＸ１３ＴＸ１５ＤＴＳＸ１９ＳＴＡＹＭＸ２５ＬＳＸ２８ＬＲＳＸ３２ＤＸ３４ＡＶＹＹＣＡＲ（配列番号３５）、
ＴＱＹＮＥＫＦＫＧＸ１０ＶＴＸ１３ＴＸ１５ＤＴＳＸ１９ＳＴＡＹＭＸ２５ＬＳＸ２８ＬＲＳＸ３２ＤＸ３４ＡＶＹＹＣＡＲ（配列番号３６）、及び
ＴＫＹＳＱＫＦＱＧＸ１０ＶＴＸ１３ＴＸ１５ＤＴＳＸ１９ＳＴＡＹＭＸ２５ＬＳＸ２８ＬＲＳＸ３２ＤＸ３４ＡＶＹＹＣＡＲ（配列番号３７）
から成る群から選択されるアミノ酸配列を含むフレームワーク領域３（ＶＨ ＦＲ３）を含む重鎖可変領域を含み、
配列番号２９において、Ｘ１はＲ又は非存在であり、Ｘ４はＩ又はＭであり、Ｘ６はＲ又はＡであり、Ｘ１０はＡ、Ｔ又はＩであり、Ｘ１６はＥ又はＬであり、Ｘ１９はＳ又はＲであり、Ｘ２３はＥ又はＤであり、Ｘ２５はＴ又はＭであり、
配列番号３５において、Ｘ２はＱ又はＫであり、Ｘ４はＮ又はＳであり、Ｘ５はＥ又はＱであり、Ｘ８はＫ又はＱであり、Ｘ１０はＲ又は非存在であり、Ｘ１３はＩ又はＭであり、Ｘ１５はＲ又はＡであり、Ｘ１９はＡであり、Ｔ又はＩであり、Ｘ２５はＥ又はＬであり、Ｘ２８はＳ又はＲであり、Ｘ３２はＥ又はＤであり、Ｘ３４はＴ又はＭであり、
配列番号３６において、Ｘ１０はＲ又は非存在であり、Ｘ１３はＩ又はＭであり、Ｘ１５はＲ又はＡであり、Ｘ１９はＡ、Ｔ又はＩであり、Ｘ２５はＥ又はＬであり、Ｘ２８はＳ又はＲであり、Ｘ３２はＥ又はＤであり、Ｘ３４はＴ又はＭであり、
配列番号３７において、Ｘ１０はＲ又は非存在であり、Ｘ１３はＩ又はＭであり、Ｘ１５はＲ又はＡであり、Ｘ１９はＡ、Ｔ又はＩであり、Ｘ２５はＥ又はＬであり、Ｘ２８はＳ又はＲであり、Ｘ３２はＥ又はＤであり、Ｘ３４はＴ又はＭである。
一実施形態では、ヒト化抗ＨＬＡ－Ａ２抗体は、アミノ酸配列Ｘ１ＶＴＸ４ＴＸ６ＤＴＳＸ１０ＳＴＡＹＭＸ１６ＬＳＸ１９ＬＲＳＸ２３ＤＸ２５ＡＶＹＹＣＡＲ（配列番号２９）を含むフレームワーク領域３（ＶＨ ＦＲ３）を含む重鎖可変領域を含み、１位のアミノ酸（Ｘ１）はＲ又は非存在であり、４位のアミノ酸（Ｘ４）はＩ又はＭであり、６位のアミノ酸（Ｘ６）はＲ又はＡであり、１０位のアミノ酸（Ｘ１０）はＡ、Ｔ又はＩであり、１６位のアミノ酸（Ｘ１６）はＥ又はＬであり、１９位のアミノ酸（Ｘ１９）はＳ又はＲであり、２３位のアミノ酸（Ｘ２３）はＥ又はＤであり、２５位のアミノ酸（Ｘ２５）はＴ又はＭである。
一実施形態では、重鎖可変領域は、配列番号２９に定められるアミノ酸配列を含むフレームワーク領域３（ＶＨ ＦＲ３）を含み、１位のアミノ酸はＲであり、４位のアミノ酸はＩ又はＭであり、６位のアミノ酸はＲであり、１０位のアミノ酸はＡ又はＩであり、１６位のアミノ酸はＥであり、１９位のアミノ酸はＳ又はＲであり、２３位のアミノ酸はＥ又はＤであり、２５位のアミノ酸はＴ又はＭである。
一実施形態では、重鎖可変領域は、配列番号２９によって定められるアミノ酸配列を含むフレームワーク領域３（ＶＨ ＦＲ３）を含み、１位のアミノ酸はＲであり、４位のアミノ酸はＩ又はＭであり、６位のアミノ酸はＲであり、１０位のアミノ酸はＡ又はＩであり、１６位のアミノ酸はＥであり、１９位のアミノ酸はＳ又はＲであり、２３位のアミノ酸はＥ又はＤであり、２５位のアミノ酸はＴである。
一実施形態では、重鎖可変領域は、配列番号２９によって定められるアミノ酸配列を含むフレームワーク領域３（ＶＨ ＦＲ３）を含み、１位のアミノ酸はＲであり、４位のアミノ酸はＩであり、６位のアミノ酸はＲであり、１０位のアミノ酸はＡであり、１６位のアミノ酸はＥであり、１９位のアミノ酸はＳであり、２３位のアミノ酸はＥであり、２５位のアミノ酸はＴ又はＭである。
一実施形態では、重鎖可変領域は、配列番号３０、３１、３２、３３又は３４に定められるアミノ酸配列を含むフレームワーク領域３（ＶＨ ＦＲ３）を含む。一実施形態では、重鎖可変領域は、配列番号３０、３１、３２、３３又は３４に対して約８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含むフレームワーク領域３（ＶＨ ＦＲ３）を含む。
一実施形態では、ヒト化抗ＨＬＡ－Ａ２抗体は、アミノ酸配列ＴＸ２ＹＸ４Ｘ５ＫＦＸ８ＧＸ１０ＶＴＸ１３ＴＸ１５ＤＴＳＸ１９ＳＴＡＹＭＸ２５ＬＳＸ２８ＬＲＳＸ３２ＤＸ３４ＡＶＹＹＣＡＲ（配列番号３５）を含むフレームワーク領域３（ＶＨ ＦＲ３）を含む重鎖可変領域を含み、２位のアミノ酸（Ｘ２）はＱ又はＫであり、４位のアミノ酸（Ｘ４）はＮ又はＳであり、５位のアミノ酸（Ｘ５）はＥ又はＱであり、８位のアミノ酸（Ｘ８）はＫ又はＱであり、１０位のアミノ酸（Ｘ１０）はＲ又は非存在であり、１３位のアミノ酸（Ｘ１３）はＩ又はＭであり、１５位のアミノ酸（Ｘ１５）はＲ又はＡであり、１９位のアミノ酸（Ｘ１９）はＡ、Ｔ又はＩであり、２５位のアミノ酸（Ｘ２５）はＥ又はＬであり、２８位のアミノ酸（Ｘ２８）はＳ又はＲであり、３２位のアミノ酸（Ｘ３２）はＥ又はＤであり、３４位のアミノ酸（Ｘ３４）はＴ又はＭである。
一実施形態では、重鎖可変領域は、配列番号３５に定められるアミノ酸配列を含むフレームワーク領域３（ＶＨ ＦＲ３）を含み、２位のアミノ酸はＱ又はＫであり、４位のアミノ酸はＮ又はＳであり、５位のアミノ酸はＥ又はＱであり、８位のアミノ酸はＫ又はＱであり、１０位のアミノ酸はＲであり、１３位のアミノ酸はＩ又はＭであり、１５位のアミノ酸はＲであり、１９位のアミノ酸はＡ又はＩであり、２５位のアミノ酸はＥであり、２８位のアミノ酸はＳ又はＲであり、３２位のアミノ酸はＥ又はＤであり、３４位のアミノ酸はＴ又はＭである。
一実施形態では、重鎖可変領域は、配列番号３５に定められるアミノ酸配列を含むフレームワーク領域３（ＶＨ ＦＲ３）を含み、２位のアミノ酸はＱ又はＫであり、４位のアミノ酸はＮ又はＳであり、５位のアミノ酸はＥ又はＱであり、８位のアミノ酸はＫ又はＱであり、１０位のアミノ酸はＲであり、１３位のアミノ酸はＩ又はＭであり、１５位のアミノ酸はＲであり、１９位のアミノ酸はＡ又はＩであり、２５位のアミノ酸はＥであり、２８位のアミノ酸はＳ又はＲであり、３２位のアミノ酸はＥ又はＤであり、３４位のアミノ酸はＴである。
一実施形態では、重鎖可変領域は、配列番号３５に定められるアミノ酸配列を含むフレームワーク領域３（ＶＨ ＦＲ３）を含み、２位のアミノ酸はＱ又はＫであり、４位のアミノ酸はＮ又はＳであり、５位のアミノ酸はＥ又はＱであり、８位のアミノ酸はＫ又はＱであり、１０位のアミノ酸はＲであり、１３位のアミノ酸はＩであり、１５位のアミノ酸はＲであり、１９位のアミノ酸はＡであり、２５位のアミノ酸はＥであり、２８位のアミノ酸はＳであり、３２位のアミノ酸はＥであり、３４位のアミノ酸はＴ又はＭである。
一実施形態では、重鎖可変領域は、配列番号３５に定められるアミノ酸配列を含むフレームワーク領域３（ＶＨ ＦＲ３）を含み、２位のアミノ酸はＱ又はＫであり、４位のアミノ酸はＮであり、５位のアミノ酸はＥであり、８位のアミノ酸はＫであり、１０位のアミノ酸はＲであり、１３位のアミノ酸はＩ又はＭであり、１５位のアミノ酸はＲであり、１９位のアミノ酸はＡ又はＩであり、２５位のアミノ酸はＥであり、２８位のアミノ酸はＳ又はＲであり、３２位のアミノ酸はＥ又はＤであり、３４位のアミノ酸はＴ又はＭである。
一実施形態では、重鎖可変領域は、配列番号３５に定められるアミノ酸配列を含むフレームワーク領域３（ＶＨ ＦＲ３）を含み、２位のアミノ酸はＱであり、４位のアミノ酸はＮ又はＳであり、５位のアミノ酸はＥであり、８位のアミノ酸はＫであり、１０位のアミノ酸はＲであり、１３位のアミノ酸はＩ又はＭであり、１５位のアミノ酸はＲであり、１９位のアミノ酸はＡ又はＩであり、２５位のアミノ酸はＥであり、２８位のアミノ酸はＳ又はＲであり、３２位のアミノ酸はＥ又はＤであり、３４位のアミノ酸はＴ又はＭである。
一実施形態では、重鎖可変領域は、配列番号３５に定められるアミノ酸配列を含むフレームワーク領域３（ＶＨ ＦＲ３）を含み、２位のアミノ酸はＱであり、４位のアミノ酸はＮであり、５位のアミノ酸はＥ又はＱであり、８位のアミノ酸はＫであり、１０位のアミノ酸はＲであり、１３位のアミノ酸はＩ又はＭであり、１５位のアミノ酸はＲであり、１９位のアミノ酸はＡ又はＩであり、２５位のアミノ酸はＥであり、２８位のアミノ酸はＳ又はＲであり、３２位のアミノ酸はＥ又はＤであり、３４位のアミノ酸はＴ又はＭである。
一実施形態では、重鎖可変領域は、配列番号３５に定められるアミノ酸配列を含むフレームワーク領域３（ＶＨ ＦＲ３）を含み、２位のアミノ酸はＱであり、４位のアミノ酸はＮであり、５位のアミノ酸はＥであり、８位のアミノ酸はＫ又はＱであり、１０位のアミノ酸はＲであり、１３位のアミノ酸はＩ又はＭであり、１５位のアミノ酸はＲであり、１９位のアミノ酸はＡ又はＩであり、２５位のアミノ酸はＥであり、２８位のアミノ酸はＳ又はＲであり、３２位のアミノ酸はＥ又はＤであり、３４位のアミノ酸はＴ又はＭである。
一実施形態では、重鎖可変領域は、配列番号３５に定められるアミノ酸配列を含むフレームワーク領域３（ＶＨ ＦＲ３）を含み、２位のアミノ酸はＱ又はＫであり、４位のアミノ酸はＮ又はＳであり、５位のアミノ酸はＥであり、８位のアミノ酸はＫであり、１０位のアミノ酸はＲであり、１３位のアミノ酸はＩ又はＭであり、１５位のアミノ酸はＲであり、１９位のアミノ酸はＡ又はＩであり、２５位のアミノ酸はＥであり、２８位のアミノ酸はＳ又はＲであり、３２位のアミノ酸はＥ又はＤであり、３４位のアミノ酸はＴ又はＭである。
一実施形態では、重鎖可変領域は、配列番号３５に定められるアミノ酸配列を含むフレームワーク領域３（ＶＨ ＦＲ３）を含み、２位のアミノ酸はＱ又はＫであり、４位のアミノ酸はＮであり、５位のアミノ酸はＥ又はＱであり、８位のアミノ酸はＫであり、１０位のアミノ酸はＲであり、１３位のアミノ酸はＩ又はＭであり、１５位のアミノ酸はＲであり、１９位のアミノ酸はＡ又はＩであり、２５位のアミノ酸はＥであり、２８位のアミノ酸はＳ又はＲであり、３２位のアミノ酸はＥ又はＤであり、３４位のアミノ酸はＴ又はＭである。
一実施形態では、重鎖可変領域は、配列番号３５に定められるアミノ酸配列を含むフレームワーク領域３（ＶＨ ＦＲ３）を含み、２位のアミノ酸はＱ又はＫであり、４位のアミノ酸はＮであり、５位のアミノ酸はＥであり、８位のアミノ酸はＫ又はＱであり、１０位のアミノ酸はＲであり、１３位のアミノ酸はＩ又はＭであり、１５位のアミノ酸はＲであり、１９位のアミノ酸はＡ又はＩであり、２５位のアミノ酸はＥであり、２８位のアミノ酸はＳ又はＲであり、３２位のアミノ酸はＥ又はＤであり、３４位のアミノ酸はＴ又はＭである。
一実施形態では、重鎖可変領域は、配列番号３５に定められるアミノ酸配列を含むフレームワーク領域３（ＶＨ ＦＲ３）を含み、２位のアミノ酸はＱであり、４位のアミノ酸はＮ又はＳであり、５位のアミノ酸はＥ又はＱであり、８位のアミノ酸はＫであり、１０位のアミノ酸はＲであり、１３位のアミノ酸はＩ又はＭであり、１５位のアミノ酸はＲであり、１９位のアミノ酸はＡ又はＩであり、２５位のアミノ酸はＥであり、２８位のアミノ酸はＳ又はＲであり、３２位のアミノ酸はＥ又はＤであり、３４位のアミノ酸はＴ又はＭである。
一実施形態では、重鎖可変領域は、配列番号３５に定められるアミノ酸配列を含むフレームワーク領域３（ＶＨ ＦＲ３）を含み、２位のアミノ酸はＱであり、４位のアミノ酸はＮ又はＳであり、５位のアミノ酸はＥであり、８位のアミノ酸はＫ又はＱであり、１０位のアミノ酸はＲであり、１３位のアミノ酸はＩ又はＭであり、１５位のアミノ酸はＲであり、１９位のアミノ酸はＡ又はＩであり、２５位のアミノ酸はＥであり、２８位のアミノ酸はＳ又はＲであり、３２位のアミノ酸はＥ又はＤであり、３４位のアミノ酸はＴ又はＭである。
一実施形態では、重鎖可変領域は、配列番号３５に定められるアミノ酸配列を含むフレームワーク領域３（ＶＨ ＦＲ３）を含み、２位のアミノ酸はＱであり、４位のアミノ酸はＮであり、５位のアミノ酸はＥ又はＱであり、８位のアミノ酸はＫ又はＱであり、１０位のアミノ酸はＲであり、１３位のアミノ酸はＩ又はＭであり、１５位のアミノ酸はＲであり、１９位のアミノ酸はＡ又はＩであり、２５位のアミノ酸はＥであり、２８位のアミノ酸はＳ又はＲであり、３２位のアミノ酸はＥ又はＤであり、３４位のアミノ酸はＴ又はＭである。
一実施形態では、重鎖可変領域は、配列番号３５に定められるアミノ酸配列を含むフレームワーク領域３（ＶＨ ＦＲ３）を含み、２位のアミノ酸はＱ又はＫであり、４位のアミノ酸はＮ又はＳであり、５位のアミノ酸はＥ又はＱであり、８位のアミノ酸はＫであり、１０位のアミノ酸はＲであり、１３位のアミノ酸はＩ又はＭであり、１５位のアミノ酸はＲであり、１９位のアミノ酸はＡ又はＩであり、２５位のアミノ酸はＥであり、２８位のアミノ酸はＳ又はＲであり、３２位のアミノ酸はＥ又はＤであり、３４位のアミノ酸はＴ又はＭである。
一実施形態では、重鎖可変領域は、配列番号３５に定められるアミノ酸配列を含むフレームワーク領域３（ＶＨ ＦＲ３）を含み、２位のアミノ酸はＱ又はＫであり、４位のアミノ酸はＮ又はＳであり、５位のアミノ酸はＥであり、８位のアミノ酸はＫ又はＱであり、１０位のアミノ酸はＲであり、１３位のアミノ酸はＩ又はＭであり、１５位のアミノ酸はＲであり、１９位のアミノ酸はＡ又はＩであり、２５位のアミノ酸はＥであり、２８位のアミノ酸はＳ又はＲであり、３２位のアミノ酸はＥ又はＤであり、３４位のアミノ酸はＴ又はＭである。
一実施形態では、重鎖可変領域は、配列番号３５に定められるアミノ酸配列を含むフレームワーク領域３（ＶＨ ＦＲ３）を含み、２位のアミノ酸はＱ又はＫであり、４位のアミノ酸はＮであり、５位のアミノ酸はＥ又はＱであり、８位のアミノ酸はＫ又はＱであり、１０位のアミノ酸はＲであり、１３位のアミノ酸はＩ又はＭであり、１５位のアミノ酸はＲであり、１９位のアミノ酸はＡ又はＩであり、２５位のアミノ酸はＥであり、２８位のアミノ酸はＳ又はＲであり、３２位のアミノ酸はＥ又はＤであり、３４位のアミノ酸はＴ又はＭである。
一実施形態では、重鎖可変領域は、配列番号３５に定められるアミノ酸配列を含むフレームワーク領域３（ＶＨ ＦＲ３）を含み、２位のアミノ酸はＱであり、４位のアミノ酸はＮ又はＳであり、５位のアミノ酸はＥ又はＱであり、８位のアミノ酸はＫ又はＱであり、１０位のアミノ酸はＲであり、１３位のアミノ酸はＩ又はＭであり、１５位のアミノ酸はＲであり、１９位のアミノ酸はＡ又はＩであり、２５位のアミノ酸はＥであり、２８位のアミノ酸はＳ又はＲであり、３２位のアミノ酸はＥ又はＤであり、３４位のアミノ酸はＴ又はＭである。
一実施形態では、ヒト化抗ＨＬＡ－Ａ２抗体は、アミノ酸配列ＴＱＹＮＥＫＦＫＧＸ１０ＶＴＸ１３ＴＸ１５ＤＴＳＸ１９ＳＴＡＹＭＸ２５ＬＳＸ２８ＬＲＳＸ３２ＤＸ３４ＡＶＹＹＣＡＲ（配列番号３６）を含むフレームワーク領域３（ＶＨ ＦＲ３）を含む重鎖可変領域を含み、１０位のアミノ酸（Ｘ１０）はＲ又は非存在であり、１３位のアミノ酸（Ｘ１３）はＩ又はＭであり、１５位のアミノ酸（Ｘ１５）はＲ又はＡであり、１９位のアミノ酸（Ｘ１９）はＡ、Ｔ又はＩであり、２５位のアミノ酸（Ｘ２５）はＥ又はＬであり、２８位のアミノ酸（Ｘ２８）はＳ又はＲであり、３２位のアミノ酸（Ｘ３２）はＥ又はＤであり、３４位のアミノ酸（Ｘ３４）はＴ又はＭである。
一実施形態では、重鎖可変領域は、配列番号３６に定められるアミノ酸配列を含むフレームワーク領域３（ＶＨ ＦＲ３）を含み、１０位のアミノ酸はＲであり、１３位のアミノ酸はＩ又はＭであり、１５位のアミノ酸はＲであり、１９位のアミノ酸はＡ又はＩであり、２５位のアミノ酸はＥであり、２８位のアミノ酸はＳ又はＲであり、３２位はＥ又はＤでありであり、３４位のアミノ酸はＴ又はＭである。
一実施形態では、重鎖可変領域は、配列番号３６に定められるアミノ酸配列を含むフレームワーク領域３（ＶＨ ＦＲ３）を含み、１０位のアミノ酸はＲであり、１３位のアミノ酸はＩ又はＭであり、１５位のアミノ酸はＲであり、１９位のアミノ酸はＡ又はＩであり、２５位のアミノ酸はＥであり、２８位のアミノ酸はＳ又はＲであり、３２位はＥ又はＤであり、３４位のアミノ酸はＴである。
一実施形態では、重鎖可変領域は、配列番号３６に定められるアミノ酸配列を含むフレームワーク領域３（ＶＨ ＦＲ３）を含み、１０位のアミノ酸はＲであり、１３位のアミノ酸はＩであり、１５位のアミノ酸はＲであり、１９位のアミノ酸はＡであり、２５位のアミノ酸はＥであり、２８位のアミノ酸はＳであり、３２位のアミノ酸はＥであり、３４位のアミノ酸はＴ又はＭである。
一実施形態では、ヒト化抗ＨＬＡ－Ａ２抗体は、アミノ酸配列ＴＫＹＳＱＫＦＱＧＸ１０ＶＴＸ１３ＴＸ１５ＤＴＳＸ１９ＳＴＡＹＭＸ２５ＬＳＸ２８ＬＲＳＸ３２ＤＸ３４ＡＶＹＹＣＡＲ（配列番号３７）を含むフレームワーク領域３（ＶＨ ＦＲ３）を含む重鎖可変領域を含み、１０位のアミノ酸（Ｘ１０）はＲ又は非存在であり、１３位のアミノ酸（Ｘ１３）はＩ又はＭであり、１５位のアミノ酸（Ｘ１５）はＲ又はＡであり、１９位のアミノ酸（Ｘ１９）はＡ、Ｔ又はＩであり、２５位のアミノ酸（Ｘ２５）はＥ又はＬであり、２８位のアミノ酸（Ｘ２８）はＳ又はＲであり、３２位のアミノ酸（Ｘ３２）はＥ又はＤであり、３４位のアミノ酸（Ｘ３４）はＴ又はＭである。
一実施形態では、重鎖可変領域は、配列番号３７に定められるアミノ酸配列を含むフレームワーク領域３（ＶＨ ＦＲ３）を含み、１０位のアミノ酸はＲであり、１３位のアミノ酸はＩ又はＭであり、１５位のアミノ酸はＲであり、１９位のアミノ酸はＡ又はＩであり、２５位のアミノ酸はＥであり、２８位のアミノ酸はＳ又はＲであり、３２位のアミノ酸はＥ又はＤであり、３４位のアミノ酸はＴ又はＭである。
一実施形態では、重鎖可変領域は、配列番号３７に定められるアミノ酸配列を含むフレームワーク領域３（ＶＨ ＦＲ３）を含み、１０位のアミノ酸はＲであり、１３位のアミノ酸はＩ又はＭであり、１５位のアミノ酸はＲであり、１９位のアミノ酸はＡ又はＩであり、２５位のアミノ酸はＥであり、２８位のアミノ酸はＳ又はＲであり、３２位のアミノ酸はＥ又はＤであり、３４位のアミノ酸はＴである。
一実施形態では、重鎖可変領域は、配列番号３７に定められるアミノ酸配列を含むフレームワーク領域３（ＶＨ ＦＲ３）を含み、１０位のアミノ酸はＲ、１３位のアミノ酸はＩ、１５位のアミノ酸はＲ、１９位のアミノ酸はＡ、２５位のアミノ酸はＥ、２８位のアミノ酸はＳ、３２位のアミノ酸はＥ、３４位のアミノ酸はＴ又はＭである。
一実施形態では、重鎖可変領域は、配列番号３８、３９、４０、４１、４２又は４３に定められるアミノ酸配列を含むフレームワーク領域３（ＶＨ ＦＲ３）を含む。一実施形態では、重鎖可変領域は、配列番号３８、３９、４０、４１、４２又は４３に対して約８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含むフレームワーク領域３（ＶＨ ＦＲ３）を含む。
一実施形態では、ヒト化抗ＨＬＡ－Ａ２抗体は、アミノ酸配列ＷＧＱＧＴＴＶＴＶＳＳ（配列番号４４）を含むフレームワーク領域４（ＶＨ ＦＲ４）を含む重鎖可変領域を含む。一実施形態では、ヒト化抗ＨＬＡ－Ａ２抗体は、配列番号４４に対して約８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含むフレームワーク領域４（ＶＨ ＦＲ４）を含む重鎖可変領域を含む。
一実施形態では、重鎖可変領域は以下を含む：
配列番号１によって定められるＶＨ ＣＤＲ１；
配列番号１０によって定められるＶＨ ＣＤＲ２であって、１０位のアミノ酸（Ｘ１０）はＱ又はＫであり、１２位のアミノ酸（Ｘ１２）はＮ又はＳであり、１３位のアミノ酸（Ｘ１３）はＥ又はＱであり、１６位のアミノ酸（Ｘ１６）はＫ又はＱであるＶＨ ＣＤＲ２；
配列番号６によって定められるＶＨ ＣＤＲ３；
配列番号１２によって定められるＶＨ ＦＲ１；
配列番号１３によって定められるＶＨ ＦＲ２であって、９位のアミノ酸（Ｘ９）はＲ又はＧであり、１５位のアミノ酸（Ｘ１５）はＩ又は非存在であるＶＨ ＦＲ２；
配列番号２９によって定められるＶＨ ＦＲ３であって、１位のアミノ酸（Ｘ１）はＲ又は非存在であり、４位のアミノ酸（Ｘ４）はＩ又はＭであり、６位のアミノ酸（Ｘ６）はＲ又はＡであり、１０位（Ｘ１０）のアミノ酸はＡ、Ｔ又はＩであり、１６位のアミノ酸（Ｘ１６）はＥ又はＬであり、１９位（Ｘ１９）のアミノ酸はＳ又はＲであり、２３位のアミノ酸（Ｘ２３）はＥ又はＤであり、２５位のアミノ酸（Ｘ２５）はＴ又はＭであるＶＨ ＦＲ３；及び
配列番号４４によって定められるＶＨ ＦＲ４。
一実施形態では、重鎖可変領域は以下を含む：
配列番号２によって定められるＶＨ ＣＤＲ１；
配列番号１０によって定められるＶＨ ＣＤＲ２であって、１０位のアミノ酸（Ｘ１０）はＱ又はＫであり、１２位のアミノ酸（Ｘ１２）はＮ又はＳであり、１３位のアミノ酸（Ｘ１３）はＥ又はＱであり、１６位のアミノ酸は（Ｘ１６）Ｋ又はＱであるＶＨ ＣＤＲ２；
配列番号６によって定められるＶＨ ＣＤＲ３；
配列番号１１によって定められるＶＨ ＦＲ１；
配列番号２５によって定められるＶＨ ＦＲ２であって、１２位のアミノ酸（Ｘ１２）はＲ又はＧであり、１８位のアミノ酸（Ｘ１８）がＩ又は非存在であるＶＨ ＦＲ２；
配列番号２９によって定められるＶＨ ＦＲ３であって、１位のアミノ酸（Ｘ１）はＲ又は非存在であり、４位のアミノ酸（Ｘ４）はＩ又はＭであり、６位のアミノ酸（Ｘ６）はＲ又はＡであり、１０位のアミノ酸（Ｘ１０）はＡ、Ｔ又はＩであり、１６位のアミノ酸（Ｘ１６）はＥ又はＬであり、１９位のアミノ酸（Ｘ１９）はＳ又はＲであり、２３位のアミノ酸（Ｘ２３）はＥ又はＤであり、２５位のアミノ酸（Ｘ２５）はＴ又はＭであるＶＨ ＦＲ３；及び
配列番号４４によって定められるＶＨ ＦＲ４。
一実施形態では、重鎖可変領域は以下を含む：
配列番号２によって定められるＶＨ ＣＤＲ１；
配列番号４によって定められるＶＨ ＣＤＲ２；
配列番号６によって定められるＶＨ ＣＤＲ３；
配列番号１１によって定められるＶＨ ＦＲ１；
配列番号２１によって定められるＶＨ ＦＲ２であって、１２位のアミノ酸（Ｘ１２）はＲ又はＧであり、１８位のアミノ酸（Ｘ１８）はＩ又は非存在であるＶＨ ＦＲ２；
配列番号３５によって定められるＶＨ ＦＲ３であって、２位のアミノ酸（Ｘ２）はＱ又はＫであり、４位のアミノ酸（Ｘ４）はＮ又はＳであり、５位のアミノ酸（Ｘ５）はＥ又はＱであり、８位のアミノ酸（Ｘ８）はＫ又はＱであり、１０位のアミノ酸（Ｘ１０）はＲ又は非存在であり、１３位のアミノ酸（Ｘ１３）はＩ又はＭであり、１５位のアミノ酸（Ｘ１５）はＲ又はＡであり、１９位のアミノ酸（Ｘ１９）はＡ、Ｔ又はＩであり、２５位のアミノ酸（Ｘ２５）はＥ又はＬであり、２８位のアミノ酸（Ｘ２８）はＳ又はＲであり、３２位のアミノ酸（Ｘ３２）はＥ又はＤであり、３４位のアミノ酸（Ｘ３４）はＴ又はＭであるＶＨ ＦＲ３；及び
配列番号４４によって定められるＶＨ ＦＲ４。
一実施形態では、重鎖可変領域は以下を有する：
配列番号１によって定められるＶＨ ＣＤＲ１；
配列番号４によって定められるＶＨ ＣＤＲ２；
配列番号６によって定められるＶＨ ＣＤＲ３；
配列番号１２によって定められるＶＨ ＦＲ１；
配列番号１７によって定められるＶＨ ＦＲ２であって、９位のアミノ酸（Ｘ９）はＲ又はＧであり、１５位のアミノ酸（Ｘ１５）はＩ又は非存在であるＶＨ ＦＲ２；
配列番号３５によって定められるＶＨ ＦＲ３であって、２位のアミノ酸（Ｘ２）はＱ又はＫであり、４位のアミノ酸（Ｘ４）はＮ又はＳであり、５位のアミノ酸（Ｘ５）はＥ又はＱであり、８位のアミノ酸（Ｘ８）はＫ又はＱであり、１０位のアミノ酸（Ｘ１０）はＲ又は非存在であり、１３位のアミノ酸（Ｘ１３）はＩ又はＭであり、１５位のアミノ酸（Ｘ１５）はＲ又はＡであり、１９位のアミノ酸（Ｘ１９）はＡ、Ｔ又はＩであり、２５位のアミノ酸（Ｘ２５）はＥ又はＬであり、２８位のアミノ酸（Ｘ２８）はＳ又はＲであり、３２位のアミノ酸（Ｘ３２）はＥ又はＤであり、３４位のアミノ酸（Ｘ３４）はＴ又はＭであるＶＨ ＦＲ３；及び
配列番号４４によって定められるＶＨ ＦＲ４。
一実施形態では、ヒト化抗ＨＬＡ－Ａ２抗体は、アミノ酸配列ＱＶＱＬＶＱＳＧＡＥＶＫＫＰＧＡＳＶＫＶＳＣＫＡＳＧＹＴＦＴＳＹＨＩＱＷＶＲＱＡＰＧＱＸ４４ＬＥＷＭＧＸ５０ＷＩＹＰＧＤＧＳＴＸ６０ＹＸ６２Ｘ６３ＫＦＸ６６ＧＸ６８ＶＴＸ７１ＴＸ７３ＤＴＳＸ７７ＳＴＡＹＭＸ８３ＬＳＸ８６ＬＲＳＸ９０ＤＸ９２ＡＶＹＹＣＡＲＥＧＴＹＹＡＭＤＹＷＧＱＧＴＴＶＴＶＳＳ（配列番号４５）を含む重鎖可変領域を含み、４４位のアミノ酸（Ｘ４４）はＲ又はＧであり、５０位のアミノ酸（Ｘ５０）はＩ又は非存在であり、６０位のアミノ酸（Ｘ６０）はＱ又はＫであり、６２位のアミノ酸（Ｘ６２）はＮ又はＳであり、６３位のアミノ酸（Ｘ６３）はＥ又はＱであり、６６位のアミノ酸（Ｘ６６）はＫ又はＱであり、６８位のアミノ酸（Ｘ６８）はＲ又は非存在であり、７１位のアミノ酸（Ｘ７１）はＩ又はＭであり、７３位のアミノ酸（Ｘ７３）はＲ又はＡであり、７７位のアミノ酸（Ｘ７７）はＡ、Ｔ又はＩであり、８３位のアミノ酸（Ｘ８３）はＥ又はＬであり、８６位のアミノ酸（Ｘ８６）はＳ又はＲであり、９０位のアミノ酸（Ｘ９０）はＥ又はＤであり、９２位のアミノ酸（Ｘ９２）はＴ又はＭである。
一実施形態では、重鎖可変領域は、配列番号４５に定められるアミノ酸配列を含み、４４位のアミノ酸はＲ又はＧであり、５０位のアミノ酸は非存在であり、６０位のアミノ酸はＱ又はＫあり、６２位のアミノ酸はＮ又はＳであり、６３位のアミノ酸はＥ又はＱであり、６６位のアミノ酸はＫ又はＱであり、６８位のアミノ酸はＲであり、７１位のアミノ酸はＩ又はＭであり、７３位のアミノ酸はＲであり、７７位のアミノ酸はＡ又はＩであり、８３位のアミノ酸はＥであり、８６位のアミノ酸はＳ又はＲであり、９０位のアミノ酸はＥ又はＤであり、９２位のアミノ酸はＴ又はＭである。
一実施形態では、重鎖可変領域は、配列番号４５に定められるアミノ酸配列を含み、４４位のアミノ酸はＲ又はＧであり、５０位のアミノ酸は非存在であり、６０位のアミノ酸はＱ又はＫであり、６２位のアミノ酸はＮ又はＳであり、６３位のアミノ酸はＥ又はＱであり、６６位のアミノ酸はＫ又はＱであり、６８位のアミノ酸はＲであり、７１位のアミノ酸はＩ又はＭであり、７３位のアミノ酸はＲであり、７７位のアミノ酸はＡ又はＩであり、８３位のアミノ酸はＥであり、８６位のアミノ酸はＳ又はＲであり、９０位のアミノ酸はＥ又はＤであり、９２位のアミノ酸はＴである。
一実施形態では、重鎖可変領域は、配列番号４５に定められるアミノ酸配列を含み、４４位のアミノ酸はＲであり、５０位のアミノ酸は非存在であり、６０位のアミノ酸はＱ又はＫであり、６２位のアミノ酸はＮ又はＳであり、６３位のアミノ酸はＥ又はＱであり、６６位のアミノ酸はＫ又はＱであり、６８位のアミノ酸はＲであり、７１位のアミノ酸はＩであり、７３位のアミノ酸はＲであり、７７位のアミノ酸はＡであり、８３位のアミノ酸はＥであり、８６位のアミノ酸はＳであり、９０位のアミノ酸はＥであり、９２位のアミノ酸はＴ又はＭである。
一実施形態では、重鎖可変領域は、配列番号４５に定められるアミノ酸配列を含み、４４位のアミノ酸はＲ又はＧであり、５０位のアミノ酸は非存在であり、６０位のアミノ酸はＱであり、６２位のアミノ酸はＮであり、６３位のアミノ酸はＥであり、６６位のアミノ酸はＫであり、６８位のアミノ酸はＲであり、７１位のアミノ酸はＩ又はＭであり、７３位のアミノ酸はＲであり、７７位のアミノ酸はＡ又はＩであり、８３位のアミノ酸はＥであり、８６位のアミノ酸はＳ又はＲであり、９０位のアミノ酸はＥ又はＤであり、９２位のアミノ酸はＴ又はＭである。
一実施形態では、重鎖可変領域は、配列番号４５に定められるアミノ酸配列を含み、４４位のアミノ酸はＲ又はＧであり、５０位のアミノ酸は非存在であり、６０位のアミノ酸はＱであり、６２位のアミノ酸はＮであり、６３位のアミノ酸はＥであり、６６位のアミノ酸はＫであり、６８位のアミノ酸はＲであり、７１位のアミノ酸はＩ又はＭであり、７３位のアミノ酸はＲであり、７７位のアミノ酸はＡ又はＩであり、８３位のアミノ酸はＥであり、８６位のアミノ酸はＳ又はＲであり、９０位のアミノ酸はＥ又はＤであり、９２位のアミノ酸はＴである。
一実施形態では、重鎖可変領域は、配列番号４５に定められるアミノ酸配列を含み、４４位のアミノ酸はＲであり、５０位のアミノ酸は非存在であり、６０位のアミノ酸はＱであり、６２位のアミノ酸はＮであり、６３位のアミノ酸はＥであり、６６位のアミノ酸はＫであり、６８位のアミノ酸はＲであり、７１位のアミノ酸はＩであり、７３位のアミノ酸はＲであり、７７位のアミノ酸はＡであり、８３位のアミノ酸はＥであり、８６位のアミノ酸はＳであり、９０位のアミノ酸はＥであり、９２位のアミノ酸はＴ又はＭである。
一実施形態では、重鎖可変領域は、配列番号４５に定められるアミノ酸配列を含み、４４位のアミノ酸はＲ又はＧであり、５０位のアミノ酸は非存在であり、６０位のアミノ酸はＫであり、６２位のアミノ酸はＳであり、６３位のアミノ酸はＱであり、６６位のアミノ酸はＱであり、６８位のアミノ酸はＲであり、７１位のアミノ酸はＩ又はＭであり、７３位のアミノ酸はＲであり、７７位のアミノ酸はＡ又はＩであり、８３位のアミノ酸はＥであり、８６位のアミノ酸はＳ又はＲであり、９０位のアミノ酸はＥ又はＤであり、９２位のアミノ酸はＴ又はＭである。
一実施形態では、重鎖可変領域は、配列番号４５に定められるアミノ酸配列を含み、４４位のアミノ酸はＲ又はＧであり、５０位のアミノ酸は非存在であり、６０位のアミノ酸はＫであり、６２位のアミノ酸はＳであり、６３位のアミノ酸はＱであり、６６位のアミノ酸はＱであり、６８位のアミノ酸はＲであり、７１位のアミノ酸はＩ又はＭであり、７３位のアミノ酸はＲであり、７７位のアミノ酸はＡ又はＩであり、８３位のアミノ酸はＥであり、８６位のアミノ酸はＳ又はＲであり、９０位のアミノ酸はＥ又はＤであり、９２位のアミノ酸はＴである。
一実施形態では、重鎖可変領域は、配列番号４５に定められるアミノ酸配列を含み、４４位のアミノ酸はＲであり、５０位のアミノ酸は非存在であり、６０位のアミノ酸はＫであり、６２位のアミノ酸はＳであり、６３位のアミノ酸はＱであり、６６位のアミノ酸はＱであり、６８位のアミノ酸はＲであり、７１位のアミノ酸はＩであり、７３位のアミノ酸はＲであり、７７位のアミノ酸はＡであり、８３位のアミノ酸はＥであり、８６位のアミノ酸はＳであり、９０位のアミノ酸はＥであり、９２位のアミノ酸はＴ又はＭである。
一実施形態では、重鎖可変領域は、配列番号４５に定められるアミノ酸配列を含み、４４位のアミノ酸はＲ又はＧであり、５０位のアミノ酸は非存在であり、６０位のアミノ酸はＱ又はＫであり、６２位のアミノ酸はＳであり、６３位のアミノ酸はＱであり、６６位のアミノ酸はＱであり、６８位のアミノ酸はＲであり、７１位のアミノ酸はＩ又はＭであり、７３位のアミノ酸はＲであり、７７位のアミノ酸はＡ又はＩであり、８３位のアミノ酸はＥであり、８６位のアミノ酸はＳ又はＲであり、９０位のアミノ酸はＥ又はＤであり、９２位のアミノ酸はＴ又はＭである。
一実施形態では、重鎖可変領域は、配列番号４５に定められるアミノ酸配列を含み、４４位のアミノ酸はＲ又はＧであり、５０位のアミノ酸は非存在であり、６０位のアミノ酸はＫであり、６２位のアミノ酸はＮ又はＳであり、６３位のアミノ酸はＱであり、６６位のアミノ酸はＱであり、６８位のアミノ酸はＲであり、７１位のアミノ酸はＩ又はＭであり、７３位のアミノ酸はＲであり、７７位のアミノ酸はＡ又はＩであり、８３位のアミノ酸はＥであり、８６位のアミノ酸はＳ又はＲであり、９０位のアミノ酸はＥ又はＤであり、９２位のアミノ酸はＴ又はＭである。
一実施形態では、重鎖可変領域は、配列番号４５に定められるアミノ酸配列を含み、４４位のアミノ酸はＲ又はＧであり、５０位のアミノ酸は非存在であり、６０位のアミノ酸はＫであり、６２位のアミノ酸はＳであり、６３位のアミノ酸はＥ又はＱであり、６６位のアミノ酸はＱであり、６８位のアミノ酸はＲであり、７１位のアミノ酸はＩ又はＭであり、７３位のアミノ酸はＲであり、７７位のアミノ酸はＡ又はＩであり、８３位のアミノ酸はＥであり、８６位のアミノ酸はＳ又はＲであり、９０位のアミノ酸はＥ又はＤであり、９２位のアミノ酸はＴ又はＭである。
一実施形態では、重鎖可変領域は、配列番号４５に定められるアミノ酸配列を含み、４４位のアミノ酸はＲ又はＧであり、５０位のアミノ酸は非存在であり、６０位のアミノ酸はＱ又はＫであり、６２位のアミノ酸がＮ又はＳであり、６３位のアミノ酸はＱであり、６６位のアミノ酸はＱであり、６８位のアミノ酸はＲであり、７１位のアミノ酸はＩ又はＭであり、７３位のアミノ酸はＲであり、７７位のアミノ酸はＡ又はＩであり、８３位のアミノ酸はＥであり、８６位のアミノ酸はＳ又はＲであり、９０位のアミノ酸はＥ又はＤであり、９２位のアミノ酸はＴ又はＭである。
一実施形態では、重鎖可変領域は、配列番号４５に定められるアミノ酸配列を含み、４４位のアミノ酸はＲ又はＧであり、５０位のアミノ酸は非存在であり、６０位のアミノ酸はＱ又はＫであり、６２位のアミノ酸はＳであり、６３位のアミノ酸はＥ又はＱであり、６６位のアミノ酸はＱであり、６８位のアミノ酸はＲであり、７１位のアミノ酸はＩ又はＭであり、７３位のアミノ酸はＲであり、７７位のアミノ酸はＡ又はＩであり、８３位のアミノ酸はＥであり、８６位のアミノ酸はＳ又はＲであり、９０位のアミノ酸はＥ又はＤであり、９２位のアミノ酸はＴ又はＭである。
一実施形態では、重鎖可変領域は、配列番号４５に定められるアミノ酸配列を含み、４４位のアミノ酸はＲ又はＧであり、５０位のアミノ酸は非存在であり、６０位のアミノ酸はＱ又はＫであり、６２位のアミノ酸はＳであり、６３位のアミノ酸はＱであり、６６位のアミノ酸はＫ又はＱであり、６８位のアミノ酸はＲであり、７１位のアミノ酸はＩ又はＭであり、７３位のアミノ酸はＲであり、７７位のアミノ酸はＡ又はＩであり、８３位のアミノ酸はＥであり、８６位のアミノ酸はＳ又はＲであり、９０位のアミノ酸はＥ又はＤであり、９２位のアミノ酸はＴ又はＭである。
一実施形態では、重鎖可変領域は、配列番号４５に定められるアミノ酸配列を含み、４４位のアミノ酸はＲ又はＧであり、５０位のアミノ酸は非存在であり、６０位のアミノ酸はＫであり、６２位のアミノ酸がＮ又はＳであり、６３位のアミノ酸はＥ又はＱであり、６６位のアミノ酸はＱであり、６８位のアミノ酸はＲであり、７１位のアミノ酸はＩ又はＭであり、７３位のアミノ酸はＲであり、７７位のアミノ酸はＡ又はＩであり、８３位のアミノ酸はＥであり、８６位のアミノ酸はＳ又はＲであり、９０位のアミノ酸はＥ又はＤであり、９２位のアミノ酸はＴ又はＭである。
一実施形態では、重鎖可変領域は、配列番号４５に定められるアミノ酸配列を含み、４４位のアミノ酸はＲ又はＧであり、５０位のアミノ酸は非存在であり、６０位のアミノ酸はＫであり、６２位のアミノ酸がＮ又はＳであり、６３位のアミノ酸はＱであり、６６位のアミノ酸はＫ又はＱであり、６８位のアミノ酸はＲであり、７１位のアミノ酸はＩ又はＭであり、７３位のアミノ酸はＲであり、７７位のアミノ酸はＡ又はＩであり、８３位のアミノ酸はＥであり、８６位のアミノ酸はＳ又はＲであり、９０位のアミノ酸はＥ又はＤであり、９２位のアミノ酸はＴ又はＭである。
一実施形態では、重鎖可変領域は、配列番号４５に定められるアミノ酸配列を含み、４４位のアミノ酸はＲ又はＧであり、５０位のアミノ酸は非存在であり、６０位のアミノ酸はＫであり、６２位のアミノ酸はＳであり、６３位のアミノ酸はＥ又はＱであり、６６位のアミノ酸はＫ又はＱであり、６８位のアミノ酸はＲであり、７１位のアミノ酸はＩ又はＭであり、７３位のアミノ酸はＲであり、７７位のアミノ酸はＡ又はＩであり、８３位のアミノ酸はＥであり、８６位のアミノ酸はＳ又はＲであり、９０位のアミノ酸はＥ又はＤであり、９２位のアミノ酸はＴ又はＭである。
一実施形態では、重鎖可変領域は、配列番号４５に定められるアミノ酸配列を含み、４４位のアミノ酸はＲ又はＧであり、５０位のアミノ酸は非存在であり、６０位のアミノ酸はＱ又はＫであり、６２位のアミノ酸はＮ又はＳであり、６３位のアミノ酸はＥ又はＱであり、６６位のアミノ酸はＱであり、６８位のアミノ酸はＲであり、７１位のアミノ酸はＩ又はＭであり、７３位のアミノ酸はＲであり、７７位のアミノ酸はＡ又はＩであり、８３位のアミノ酸はＥであり、８６位のアミノ酸はＳ又はＲであり、９０位のアミノ酸はＥ又はＤであり、９２位のアミノ酸はＴ又はＭである。
一実施形態では、重鎖可変領域は、配列番号４５に定められるアミノ酸配列を含み、４４位のアミノ酸はＲ又はＧであり、５０位のアミノ酸は非存在であり、６０位のアミノ酸はＱ又はＫであり、６２位のアミノ酸はＮ又はＳであり、６３位のアミノ酸はＱであり、６６位のアミノ酸はＫ又はＱであり、６８位のアミノ酸はＲであり、７１位のアミノ酸はＩ又はＭであり、７３位のアミノ酸はＲであり、７７位のアミノ酸はＡ又はＩであり、８３位のアミノ酸はＥであり、８６位のアミノ酸はＳ又はＲであり、９０位のアミノ酸はＥ又はＤであり、９２位のアミノ酸はＴ又はＭである。
一実施形態では、重鎖可変領域は、配列番号４５に定められるアミノ酸配列を含み、４４位のアミノ酸はＲ又はＧであり、５０位のアミノ酸は非存在であり、６０位のアミノ酸はＱ又はＫであり、６２位のアミノ酸はＳであり、６３位のアミノ酸はＥ又はＱであり、６６位のアミノ酸はＫ又はＱであり、６８位のアミノ酸はＲであり、７１位のアミノ酸はＩ又はＭであり、７３位のアミノ酸はＲであり、７７位のアミノ酸はＡ又はＩであり、８３位のアミノ酸はＥであり、８６位のアミノ酸はＳ又はＲであり、９０位のアミノ酸はＥ又はＤであり、９２位のアミノ酸はＴ又はＭである。
一実施形態では、重鎖可変領域は、配列番号４５に定められるアミノ酸配列を含み、４４位のアミノ酸はＲ又はＧであり、５０位のアミノ酸は非存在であり、６０位のアミノ酸はＫであり、６２位のアミノ酸はＮ又はＳであり、６３位のアミノ酸はＥ又はＱであり、６６位のアミノ酸はＫ又はＱであり、６８位のアミノ酸はＲであり、７１位のアミノ酸はＩ又はＭであり、７３位のアミノ酸はＲであり、７７位のアミノ酸はＡ又はＩであり、８３位のアミノ酸はＥであり、８６位のアミノ酸はＳ又はＲであり、９０位のアミノ酸はＥ又はＤであり、９２位のアミノ酸はＴ又はＭである。
一実施形態では、ヒト化抗ＨＬＡ－Ａ２抗体は、配列番号６１、６２、６３、６４、６５又は６６に定められるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域を含む。一実施形態では、ヒト化抗ＨＬＡ－Ａ２抗体は、配列番号６１、６２、６３、６４、６５又は６６に対して約８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含む重鎖可変領域を含む。
一実施形態では、ヒト化抗ＨＬＡ－Ａ２抗体は、アミノ酸配列ＤＸ２ＶＭＴＱＸ７ＰＬＳＸ１１Ｘ１２ＶＴＸ１５ＧＱＰＡＳＩＳＸ２３（配列番号４６）を含むフレームワーク領域１（ＶＬ ＦＲ１）を含む軽鎖可変領域を含み、２位のアミノ酸（Ｘ２）はＶ又はＩであり、７位のアミノ酸（Ｘ７）はＳ又はＴであり、１１位のアミノ酸（Ｘ１１）はＬ又はＳであり、１２位のアミノ酸（Ｘ１２）はＰ又はＳであり、１５位のアミノ酸（Ｘ１５）はＬ又はＰであり、２３位のアミノ酸（Ｘ２３）はＣ又はＦである。
一実施形態では、軽鎖可変領域は、配列番号４６に定められるアミノ酸配列を含むフレームワーク領域１（ＶＬ ＦＲ１）を含み、２位のアミノ酸はＶ又はＩであり、７位のアミノ酸はＳ又はＴであり、１１位のアミノ酸はＬ又はＳであり、１２位のアミノ酸はＰ又はＳであり、１５位のアミノ酸はＬ又はＰであり、２３位のアミノ酸はＣである。
一実施形態では、軽鎖可変領域は、配列番号４６に定められるアミノ酸配列を含むフレームワーク領域１（ＶＬ ＦＲ１）を含み、２位のアミノ酸はＩであり、７位のアミノ酸はＴであり、１１位のアミノ酸はＬ又はＳであり、１２位のアミノ酸はＰ又はＳであり、１５位のアミノ酸はＬ又はＰであり、２３位のアミノ酸はＣである。
一実施形態では、軽鎖可変領域は、配列番号４６に定められるアミノ酸配列を含むフレームワーク領域１（ＶＬ ＦＲ１）を含み、２位のアミノ酸はＶ又はＩであり、７位のアミノ酸はＳ又はＴであり、１１位のアミノ酸はＬであり、１２位のアミノ酸はＰ又はＳであり、１５位のアミノ酸はＬ又はＰであり、２３位のアミノ酸はＣである。
一実施形態では、軽鎖可変領域は、配列番号４６に定められるアミノ酸配列を含むフレームワーク領域１（ＶＬ ＦＲ１）を含み、２位のアミノ酸はＶ又はＩであり、７位のアミノ酸はＳ又はＴであり、１１位のアミノ酸はＬ又はＳであり、１２位のアミノ酸はＰであり、１５位のアミノ酸はＬであり、２３位のアミノ酸はＣである。
一実施形態では、軽鎖可変領域は、配列番号４７、４８、４９又は５０に定められるアミノ酸配列を含むフレームワーク領域１（ＶＬ ＦＲ１）を含む。一実施形態では、軽鎖可変領域は、配列番号４７、４８、４９又は５０に対して約８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含むフレームワーク領域４（ＶＨ ＦＲ４）を含む。
一実施形態では、ヒト化抗ＨＬＡ－Ａ２抗体は、アミノ酸配列ＷＸ２Ｘ３ＱＸ５ＰＧＱＸ９ＰＸ１１Ｘ１２ＬＩＹ（配列番号５１）を含むフレームワーク領域２（ＶＬ ＦＲ２）を含む軽鎖可変領域を含み、２位のアミノ酸（Ｘ２）はＦ又はＹであり、３位のアミノ酸（Ｘ３）はＱ又はＬであり、５位のアミノ酸（Ｘ５）はＲ又はＫであり、９位のアミノ酸（Ｘ９）はＳ又はＰであり、１１位のアミノ酸（Ｘ１１）はＲ又はＱであり、１２位のアミノ酸（Ｘ１２）はＲ又はＬである。
一実施形態では、軽鎖可変領域は、配列番号５１に定められるアミノ酸配列を含むフレームワーク領域２（ＶＬ ＦＲ２）を定められる、２位のアミノ酸はＹであり、３位のアミノ酸はＱ又はＬであり、５位のアミノ酸はＲ又はＫであり、９位のアミノ酸はＳ又はＰであり、１１位のアミノ酸はＲ又はＱであり、１２位のアミノ酸はＬである。
一実施形態では、軽鎖可変領域は、配列番号５１に定められるアミノ酸配列を含むフレームワーク領域２（ＶＬ ＦＲ２）を含み、２位のアミノ酸はＹであり、３位のアミノ酸はＱ又はＬであり、５位のアミノ酸はＲ又はＫであり、９位のアミノ酸はＳであり、１１位のアミノ酸はＲ又はＱであり、１２位のアミノ酸はＬである。
一実施形態では、軽鎖可変領域は、配列番号５１に定められるアミノ酸配列を含むフレームワーク領域２（ＶＬ ＦＲ２）を含み、２位のアミノ酸はＹであり、３位のアミノ酸はＱであり、５位のアミノ酸はＲであり、９位のアミノ酸はＳ又はＰであり、１１位のアミノ酸はＲであり、１２位のアミノ酸はＬである。
一実施形態では、軽鎖可変領域は、配列番号５１に定められるアミノ酸配列を含むフレームワーク領域２（ＶＬ ＦＲ２）を含み、２位のアミノ酸はＦ又はＹであり、３位のアミノ酸はＱ又はＬであり、５位のアミノ酸はＲ又はＫであり、９位のアミノ酸はＳであり、１１位のアミノ酸はＲ又はＱであり、１２位のアミノ酸はＲ又はＬである。
一実施形態では、軽鎖可変領域は、配列番号５１に定められるアミノ酸配列を含むフレームワーク領域２（ＶＬ ＦＲ２）を含み、２位のアミノ酸はＦ又はＹであり、３位のアミノ酸はＱであり、５位のアミノ酸はＲであり、９位のアミノ酸はＳ又はＰであり、１１位のアミノ酸はＲであり、１２位のアミノ酸はＲ又はＬである。
一実施形態では、軽鎖可変領域は、配列番号５２、５３、５４又は５５に定められるアミノ酸配列を含むフレームワーク領域２（ＶＬ ＦＲ２）を含む。一実施形態では、軽鎖可変領域は、配列番号５２、５３、５４又は５５に対して約８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含むフレームワーク領域２（ＶＬ ＦＲ２）を含む。
一実施形態では、ヒト化抗ＨＬＡ－Ａ２抗体は、アミノ酸配列ＧＶＰＤＲＦＳＧＳＧＸ１１ＧＴＤＦＴＬＫＩＳＲＶＥＡＥＤＶＧＶＹＹＣ（配列番号５６）を含むフレームワーク領域３（ＶＬ ＦＲ３）を含む軽鎖可変領域を含み、１１位のアミノ酸（Ｘ１１）はＳ又はＡである。
一実施形態では、ヒト化抗ＨＬＡ－Ａ２抗体は、配列番号５７又は５８に定められるアミノ酸配列を含むフレームワーク領域３（ＶＬ ＦＲ３）を有する軽鎖可変領域を含む。一実施形態では、ヒト化抗ＨＬＡ－Ａ２抗体は、配列番号５７又は５８に対して約８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含むフレームワーク領域３（ＶＬ ＦＲ３）を含む軽鎖可変領域を含む。
一実施形態では、ヒト化抗ＨＬＡ－Ａ２抗体は、アミノ酸配列ＦＧＧＧＴＫＶＥＩＫ（配列番号５９）を含むフレームワーク領域４（ＶＬ ＦＲ４）を含む軽鎖可変領域を含む。一実施形態では、ヒト化抗ＨＬＡ－Ａ２抗体は、配列番号５９に対して約８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含むフレームワーク領域４（ＶＬ ＦＲ４）を含む軽鎖可変領域を含む。
一実施形態では、ヒト化抗ＨＬＡ－Ａ２抗体は、アミノ酸配列ＤＸ２ＶＭＴＱＸ７ＰＬＳＸ１１Ｘ１２ＶＴＸ１５ＧＱＰＡＳＩＳＸ２３ＲＳＳＱＳＩＶＨＳＮＧＮＴＹＬＥＷＸ４１Ｘ４２ＱＸ４４ＰＧＱＸ４８ＰＸ５０Ｘ５１ＬＩＹＫＶＳＮＲＦＳＧＶＰＤＲＦＳＧＳＧＸ７２ＧＴＤＦＴＬＫＩＳＲＶＥＡＥＤＶＧＶＹＹＣＦＱＧＳＨＶＰＲＴＦＧＧＧＴＫＶＥＩＫ（配列番号６０）を含む軽鎖可変領域を含み、２位のアミノ酸（Ｘ２）はＶ又はＩであり、７位のアミノ酸（Ｘ７）はＳ又はＴであり、１１位のアミノ酸（Ｘ１１）はＬ又はＳであり、１２位のアミノ酸（Ｘ１２）はＰ又はＳであり、１５位のアミノ酸（Ｘ１５）はＬ又はＰであり、２３位のアミノ酸（Ｘ２３）はＣ又はＦであり、４１位のアミノ酸（Ｘ４１）はＦ又はＹであり、４２位のアミノ酸（Ｘ４２）はＱ又はＬであり、４４位のアミノ酸（Ｘ４４）はＲ又はＫであり、４８位のアミノ酸（Ｘ４８）はＳ又はＰであり、５０位のアミノ酸（Ｘ５０）はＲ又はＱであり、５１位のアミノ酸（Ｘ５１）はＲ又はＬであり、７２位のアミノ酸（Ｘ７２）はＳ又はＡである。
一実施形態では、軽鎖可変領域は、配列番号６０に定められるアミノ酸配列を含み、２位のアミノ酸はＶ又はＩであり、７位のアミノ酸はＳ又はＴであり、１１位のアミノ酸はＬ又はＳであり、１２位のアミノ酸はＰ又はＳであり、１５位のアミノ酸はＬ又はＰであり、２３位のアミノ酸はＣであり、４１位のアミノ酸はＹであり、４２位のアミノ酸はＱ又はＬであり、４４位のアミノ酸はＲ又はＫであり、４８位のアミノ酸はＳ又はＰであり、５０位のアミノ酸はＲ又はＱであり、５１位のアミノ酸はＬであり、７２位のアミノ酸はＳ又はＡである。
一実施形態では、軽鎖可変領域は、配列番号６０に定められるアミノ酸配列を含み、２位のアミノ酸はＩであり、７位のアミノ酸はＴであり、１１位のアミノ酸はＬ又はＳであり、１２位のアミノ酸はＰ又はＳであり、１５位のアミノ酸はＬ又はＰであり、２３位のアミノ酸はＣであり、４１位のアミノ酸はＹであり、４２位はＱ又はＬであり、４４位のアミノ酸はＲ又はＫであり、４８位のアミノ酸はＳ又はＰであり、５０位のアミノ酸はＲ又はＱであり、５１位のアミノ酸はＬであり、７２位のアミノ酸はＳ又はＡである。
一実施形態では、軽鎖可変領域は、配列番号６０に定められるアミノ酸配列を含み、２位のアミノ酸はＶ又はＩであり、７位のアミノ酸はＳ又はＴであり、１１位のアミノ酸はＬであり、１２位のアミノ酸はＰ又はＳであり、１５位のアミノ酸はＬ又はＰであり、２３位のアミノ酸はＣであり、４１位のアミノ酸はＹであり、４２位の酸はＱ又はＬであり、４４位のアミノ酸はＲ又はＫであり、４８位のアミノ酸はＳであり、５０位のアミノ酸はＲ又はＱであり、５１位のアミノ酸はＬであり、７２位のアミノ酸はＳである。
一実施形態では、軽鎖可変領域は、配列番号６０に定められるアミノ酸配列を含み、２位のアミノ酸はＶ又はＩであり、７位のアミノ酸はＳ又はＴであり、１１位のアミノ酸はＬ又はＳであり、１２位のアミノ酸はＰであり、１５位のアミノ酸はＬであり、２３位のアミノ酸はＣであり、４１位のアミノ酸はＹであり、４２位はＱであり、４４位のアミノ酸はＲであり、４８位のアミノ酸はＳ又はＰであり、５０位のアミノ酸はＲであり、５１位のアミノ酸はＬであり、７２位のアミノ酸Ｓ又はＡである。
一実施形態では、軽鎖可変領域は、配列番号６０に定められるアミノ酸配列を含み、２位のアミノ酸はＶ又はＩであり、７位のアミノ酸はＳ又はＴであり、１１位のアミノ酸はＬ又はＳであり、１２位のアミノ酸はＰ又はＳであり、１５位のアミノ酸はＬ又はＰであり、２３位のアミノ酸はＣであり、４１位のアミノ酸はＦ又はＹであり、４２位のアミノ酸はＱ又はＬであり、４４位のアミノ酸はＲ又はＫであり、４８位のアミノ酸はＳ又はＰであり、５０位のアミノ酸はＲ又はＱであり、５１位はＲ又はＬであり、７２位のアミノ酸はＳ又はＡである。
一実施形態では、ヒト化抗ＨＬＡ－Ａ２抗体は、配列番号６７、６８、６９、７０又は７１に定められるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含む。一実施形態では、ヒト化抗ＨＬＡ－Ａ２抗体は、配列番号６７、６８、６９、７０又は７１に対して約８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含む。
一実施形態では、ヒト化抗ＨＬＡ－Ａ２抗体は、ｓｃＦｖ、ｓｃＦａｂ又はｓｄＡｂである。一実施形態では、ヒト化抗ＨＬＡ－Ａ２抗体は、ｓｃＦｖ又はｓｃＦａｂである。一実施形態では、ヒト化抗ＨＬＡ－Ａ２抗体はｓｄＡｂである。一実施形態では、ヒト化抗ＨＬＡ－Ａ２抗体はｓｃＦａｂである。一実施形態では、ヒト化抗ＨＬＡ－Ａ２抗体はｓｃＦｖである。一実施形態では、ヒト化抗ＨＬＡ－Ａ２抗体は、配列番号７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０又は９１に定められるアミノ酸配列を含むｓｃＦｖである。一実施形態では、ヒト化抗ＨＬＡ－Ａ２抗体は、配列番号７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０又は９１に対して約８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含むｓｃＦｖである。
一実施形態では、ヒト化抗ＨＬＡ－Ａ２抗体は、上記の配列番号に対して約８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。一実施形態では、ヒト化抗ＨＬＡ－Ａ２抗体は、上記の配列番号に対して約８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含むｓｃＦｖ又はｓｃＦａｂである。
一態様では、本発明は、アミノ酸配列ＷＩＹＰＧＤＧＳＴＫＹＳＱＫＦＱＧ（配列番号５）を含む重鎖可変領域を含む抗ＨＬＡ抗体を提供する。
一実施形態では、前記抗体は、アフィボディ、アルファボディ、アルマジロリピートタンパク質ベースの足場、ノッティン、クニッツドメインペプチド、アフィリン、アフィチン、アドネクチン、アトリマー、エバシン、ＤＡＲＰｉｎ、アンチカリン、アビマー、ファイノマー、バーサボディ及びデュオカリンから成る群から選択される抗体ミメティックである。
本明細書で提供される抗ＨＬＡ－Ａ２抗体は、ＨＬＡ－Ａ２に特異的に結合する。一実施形態では、本明細書で提供される抗ＨＬＡ－Ａ２抗体は、ＨＬＡ－Ａ＊０２：０１に特異的に結合する。当業者には当然のことながら、ＨＬＡ－Ａ２に結合する抗体の能力は、当技術分野で公知の技術の使用によって検出することができる。例えば、抗体のＨＬＡ－Ａ２への結合は、本明細書に例示されるＨＬＡ－Ａ２四量体の使用によって検出することができる。一実施形態では、本明細書で提供される抗ＨＬＡ－Ａ２抗体は、ＨＬＡ－Ａ２への結合について、配列番号１８３のアミノ酸配列を有する重鎖相補性決定領域１（ＨＣＤＲ１）、配列番号１８５のアミノ酸配列を有する重鎖相補性決定領域２（ＨＣＤＲ２）、配列番号１８７のアミノ酸配列を有する重鎖相補性決定領域３（ＨＣＤＲ３）、配列番号１８８のアミノ酸配列を有する軽鎖相補性決定領域１（ＬＣＤＲ１）、配列番号１８９のアミノ酸配列を有する軽鎖相補性決定領域２（ＬＣＤＲ２）、及び配列番号１９０のアミノ酸配列を有する軽鎖相補性決定領域３（ＬＣＤＲ３）を含む抗体と競合する。一実施形態では、本明細書で提供される抗ＨＬＡ－Ａ２抗体は、配列番号１８３のアミノ酸配列を有する重鎖相補性決定領域１（ＨＣＤＲ１）、配列番号１８５のアミノ酸配列を有する重鎖相補性決定領域２（ＨＣＤＲ２）、配列番号１８７のアミノ酸配列を有する重鎖相補性決定領域３（ＨＣＤＲ３）、配列番号１８８のアミノ酸配列を有する軽鎖相補性決定領域１（ＬＣＤＲ１）、配列番号１８９のアミノ酸配列を有する軽鎖相補性決定領域２（ＬＣＤＲ２）、及び配列番号１９０のアミノ酸配列を有する軽鎖相補性決定領域３（ＬＣＤＲ３）を含む抗体と同じＨＬＡ－Ａ２エピトープに結合する。一実施形態では、本明細書で提供される抗ＨＬＡ－Ａ２抗体は、ＨＬＡ－Ａ２への結合についてＢＢ７．２抗体と競合する。一実施形態では、本明細書で提供される抗ＨＬＡ－Ａ２抗体は、ＢＢ７．２抗体と同じＨＬＡ－Ａ２エピトープに結合する。一実施形態では、抗ＨＬＡ抗体は、配列番号５によって定められる相補性決定領域２（ＶＨ ＣＤＲ２）を含む重鎖可変領域を含む。一実施形態では、本明細書で提供される抗ＨＬＡ－Ａ２抗体は、ＢＢ７．２抗体と比較して、ＨＬＡ－Ａ＊０３、ＨＬＡ－Ａ＊２５、ＨＬＡ－Ａ＊２９、ＨＬＡ－Ａ＊３０、ＨＬＡ－Ａ＊３１、ＨＬＡ－Ａ＊３３、ＨＬＡ－Ａ＊３６、ＨＬＡ－Ａ＊６８のうちの１つ以上から選択される少なくとも１つのＨＬＡ－Ａサブタイプに対する反応性が低い。一実施形態では、本明細書で提供される抗ＨＬＡ－Ａ２抗体は、ＢＢ７．２抗体と比較して、ＨＬＡ－Ａ＊０３、ＨＬＡ－Ａ＊２５、ＨＬＡ－Ａ＊２９、ＨＬＡ－Ａ＊３０、ＨＬＡ－Ａ＊３１、ＨＬＡ－Ａ＊３３、ＨＬＡ－Ａ＊３６、ＨＬＡ－Ａ＊６８のうちの２つ以上から選択される少なくとも１つのＨＬＡ－Ａサブタイプに対する反応性が低い。一実施形態では、本明細書で提供される抗ＨＬＡ－Ａ２抗体は、ＢＢ７．２抗体と比較して、ＨＬＡ－Ａ＊０３、ＨＬＡ－Ａ＊２５、ＨＬＡ－Ａ＊２９、ＨＬＡ－Ａ＊３０、ＨＬＡ－Ａ＊３１、ＨＬＡ－Ａ＊３３、ＨＬＡ－Ａ＊３６、ＨＬＡ－Ａ＊６８のうちの３つ以上から選択される少なくとも１つのＨＬＡ－Ａサブタイプに対する反応性が低い。一実施形態では、本明細書で提供される抗ＨＬＡ－Ａ２抗体は、ＢＢ７．２抗体と比較して、ＨＬＡ－Ａ＊０３、ＨＬＡ－Ａ＊２５、ＨＬＡ－Ａ＊２９、ＨＬＡ－Ａ＊３０、ＨＬＡ－Ａ＊３１、ＨＬＡ－Ａ＊３３、ＨＬＡ－Ａ＊３６、ＨＬＡ－Ａ＊６８のうちの４つ以上から選択される少なくとも１つのＨＬＡ－Ａサブタイプに対する反応性が低い。一実施形態では、本明細書で提供される抗ＨＬＡ－Ａ２抗体は、ＢＢ７．２抗体と比較して、ＨＬＡ－Ａ＊０３、ＨＬＡ－Ａ＊２５、ＨＬＡ－Ａ＊２９、ＨＬＡ－Ａ＊３０、ＨＬＡ－Ａ＊３１、ＨＬＡ－Ａ＊３３、ＨＬＡ－Ａ＊３６、ＨＬＡ－Ａ＊６８のうちの５つ以上から選択される少なくとも１つのＨＬＡ－Ａサブタイプに対する反応性が低い。一実施形態では、本明細書で提供される抗ＨＬＡ－Ａ２抗体は、ＢＢ７．２抗体と比較して、ＨＬＡ－Ａ＊０３、ＨＬＡ－Ａ＊２５、ＨＬＡ－Ａ＊２９、ＨＬＡ－Ａ＊３０、ＨＬＡ－Ａ＊３１、ＨＬＡ－Ａ＊３３、ＨＬＡ－Ａ＊３６、ＨＬＡ－Ａ＊６８のうちの６つ以上から選択される少なくとも１つのＨＬＡ－Ａサブタイプに対する反応性が低い。一実施形態では、本明細書で提供される抗ＨＬＡ－Ａ２抗体は、ＢＢ７．２抗体と比較して、ＨＬＡ－Ａ＊０３、ＨＬＡ－Ａ＊２５、ＨＬＡ－Ａ＊２９、ＨＬＡ－Ａ＊３０、ＨＬＡ－Ａ＊３１、ＨＬＡ－Ａ＊３３、ＨＬＡ－Ａ＊３６、ＨＬＡ－Ａ＊６８のうちの７つ以上から選択される少なくとも１つのＨＬＡ－Ａサブタイプに対する反応性が低い。一実施形態では、本明細書で提供される抗ＨＬＡ－Ａ２抗体は、ＢＢ７．２抗体と比較して、ＨＬＡ－Ａ＊０３、ＨＬＡ－Ａ＊２５、ＨＬＡ－Ａ＊２９、ＨＬＡ－Ａ＊３０、ＨＬＡ－Ａ＊３１、ＨＬＡ－Ａ＊３３、ＨＬＡ－Ａ＊３６、ＨＬＡ－Ａ＊６８のうちの各々から選択される少なくとも１つのＨＬＡ－Ａサブタイプに対する反応性が低い。一実施形態では、本明細書で提供される抗ＨＬＡ－Ａ２抗体は、ＢＢ７．２抗体と比較して、ＨＬＡ－Ａ＊２５、ＨＬＡ－Ａ＊２９、ＨＬＡ－Ａ＊３０のうちの１つ以上から選択される少なくとも１つのＨＬＡ－Ａサブタイプに対する反応性が低い。一実施形態では、本明細書で提供される抗ＨＬＡ－Ａ２抗体は、ＢＢ７．２抗体と比較して、ＨＬＡ－Ａ＊２５、ＨＬＡ－Ａ＊２９、ＨＬＡ－Ａ＊３０のうちの２つ以上から選択される少なくとも１つのＨＬＡ－Ａサブタイプに対する反応性が低い。一実施形態では、本明細書で提供される抗ＨＬＡ－Ａ２抗体は、ＢＢ７．２抗体と比較して、ＨＬＡ－Ａ＊２５、ＨＬＡ－Ａ＊２９、ＨＬＡ－Ａ＊３０のうちの各々から選択される少なくとも１つのＨＬＡ－Ａサブタイプに対する反応性が低い。一実施形態では、本明細書で提供される抗ＨＬＡ－Ａ２抗体は、ＢＢ７．２抗体と比較して、ＨＬＡ－Ａ＊０３：０１、ＨＬＡ－Ａ＊２５：０１、ＨＬＡ－Ａ＊２９：０２、ＨＬＡ－Ａ＊３０：０１、ＨＬＡ－Ａ＊３１：０１、ＨＬＡ－Ａ＊３３：０１、ＨＬＡ－Ａ＊３６：０１及びＨＬＡ－Ａ＊６８：０１のうちの少なくとも１つに対する反応性が低い。一実施形態では、本明細書で提供される抗ＨＬＡ－Ａ２抗体は、ＢＢ７．２抗体と比較して、ＨＬＡ－Ａ＊０３：０１、ＨＬＡ－Ａ＊２５：０１、ＨＬＡ－Ａ＊２９：０２、ＨＬＡ－Ａ＊３０：０１、ＨＬＡ－Ａ＊３１：０１、ＨＬＡ－Ａ＊３３：０１、ＨＬＡ－Ａ＊３６：０１及びＨＬＡ－Ａ＊６８：０１のうちの少なくとも２つに対する反応性が低い。一実施形態では、本明細書で提供される抗ＨＬＡ－Ａ２抗体は、ＢＢ７．２抗体と比較して、ＨＬＡ－Ａ＊０３：０１、ＨＬＡ－Ａ＊２５：０１、ＨＬＡ－Ａ＊２９：０２、ＨＬＡ－Ａ＊３０：０１、ＨＬＡ－Ａ＊３１：０１、ＨＬＡ－Ａ＊３３：０１、ＨＬＡ－Ａ＊３６：０１及びＨＬＡ－Ａ＊６８：０１のうちの少なくとも３つに対する反応性が低い。一実施形態では、本明細書で提供される抗ＨＬＡ－Ａ２抗体は、ＢＢ７．２抗体と比較して、ＨＬＡ－Ａ＊０３：０１、ＨＬＡ－Ａ＊２５：０１、ＨＬＡ－Ａ＊２９：０２、ＨＬＡ－Ａ＊３０：０１、ＨＬＡ－Ａ＊３１：０１、ＨＬＡ－Ａ＊３３：０１、ＨＬＡ－Ａ＊３６：０１及びＨＬＡ－Ａ＊６８：０１のうちの少なくとも４つに対する反応性が低い。一実施形態では、本明細書で提供される抗ＨＬＡ－Ａ２抗体は、ＢＢ７．２抗体と比較して、ＨＬＡ－Ａ＊０３：０１、ＨＬＡ－Ａ＊２５：０１、ＨＬＡ－Ａ＊２９：０２、ＨＬＡ－Ａ＊３０：０１、ＨＬＡ－Ａ＊３１：０１、ＨＬＡ－Ａ＊３３：０１、ＨＬＡ－Ａ＊３６：０１及びＨＬＡ－Ａ＊６８：０１のうちの少なくとも５つに対する反応性が低い。一実施形態では、本明細書で提供される抗ＨＬＡ－Ａ２抗体は、ＢＢ７．２抗体と比較して、ＨＬＡ－Ａ＊０３：０１、ＨＬＡ－Ａ＊２５：０１、ＨＬＡ－Ａ＊２９：０２、ＨＬＡ－Ａ＊３０：０１、ＨＬＡ－Ａ＊３１：０１、ＨＬＡ－Ａ＊３３：０１、ＨＬＡ－Ａ＊３６：０１及びＨＬＡ－Ａ＊６８：０１のうちの少なくとも６つに対する反応性が低い。一実施形態では、本明細書で提供される抗ＨＬＡ－Ａ２抗体は、ＢＢ７．２抗体と比較して、ＨＬＡ－Ａ＊０３：０１、ＨＬＡ－Ａ＊２５：０１、ＨＬＡ－Ａ＊２９：０２、ＨＬＡ－Ａ＊３０：０１、ＨＬＡ－Ａ＊３１：０１、ＨＬＡ－Ａ＊３３：０１、ＨＬＡ－Ａ＊３６：０１及びＨＬＡ－Ａ＊６８：０１のうちの少なくとも７つに対する反応性が低い。一実施形態では、本明細書で提供される抗ＨＬＡ－Ａ２抗体は、ＢＢ７．２抗体と比較して、ＨＬＡ－Ａ＊０３：０１、ＨＬＡ－Ａ＊２５：０１、ＨＬＡ－Ａ＊２９：０２、ＨＬＡ－Ａ＊３０：０１、ＨＬＡ－Ａ＊３１：０１、ＨＬＡ－Ａ＊３３：０１、ＨＬＡ－Ａ＊３６：０１及びＨＬＡ－Ａ＊６８：０１に対する反応性が低い。一実施形態では、本明細書で提供される抗ＨＬＡ－Ａ２抗体は、ＢＢ７．２抗体と比較して、ＨＬＡ－Ａ＊２５：０１、ＨＬＡ－Ａ＊２９：０２及びＨＬＡ－Ａ＊３０：０１のうちの少なくとも１つに対する反応性が低い。一実施形態では、本明細書で提供される抗ＨＬＡ－Ａ２抗体は、ＢＢ７．２抗体と比較して、ＨＬＡ－Ａ＊２５：０１、ＨＬＡ－Ａ＊２９：０２及びＨＬＡ－Ａ＊３０：０１のうちの少なくとも２つに対する反応性が低い。一実施形態では、本明細書で提供される抗ＨＬＡ－Ａ２抗体は、ＢＢ７．２抗体と比較して、ＨＬＡ－Ａ＊２５：０１、ＨＬＡ－Ａ＊２９：０２及びＨＬＡ－Ａ＊３０：０１に対する反応性が低い。一実施形態では、本明細書で提供される抗ＨＬＡ－Ａ２抗体は、ＢＢ７．２抗体と比較して、ＨＬＡ－Ａ＊２５：０１に対する反応性が低い。一実施形態では、本明細書で提供される抗ＨＬＡ－Ａ２抗体は、ＢＢ７．２抗体と比較して、ＨＬＡ－Ａ＊２９：０２に対する反応性が低い。一実施形態では、本明細書で提供される抗ＨＬＡ－Ａ２抗体は、ＢＢ７．２抗体と比較して、ＨＬＡ－Ａ＊３０：０１に対する反応性が低い。一実施形態では、本明細書で提供される抗ＨＬＡ－Ａ２抗体は、ＢＢ７．２抗体と比較して、ＨＬＡ－Ａ＊０３：０１に対する反応性が低い。一実施形態では、本明細書で提供される抗ＨＬＡ－Ａ２抗体は、ＢＢ７．２抗体と比較して、ＨＬＡ－Ａ＊３１：０１に対する反応性が低い。一実施形態では、本明細書で提供される抗ＨＬＡ－Ａ２抗体は、ＢＢ７．２抗体と比較して、ＨＬＡ－Ａ＊３３：０１に対する反応性が低い。一実施形態では、本明細書で提供される抗ＨＬＡ－Ａ２抗体は、ＢＢ７．２抗体と比較して、ＨＬＡ－Ａ＊３６：０１に対する反応性が低い。一実施形態では、本明細書で提供される抗ＨＬＡ－Ａ２抗体は、ＢＢ７．２抗体と比較して、ＨＬＡ－Ａ＊６８：０１に対する反応性が低い。ＢＢ７．２抗体は、ＢＢ７．２ハイブリドーマ（ＡＴＣＣ寄託番号ＨＢ－８２）から単離することができる。ＨＬＡ－Ａサブタイプに対する抗ＨＬＡ－Ａ２抗体の反応性を決定するための技術は、当業者には公知であろう。例えば、ＨＬＡ－Ａサブタイプに対する抗ＨＬＡ－Ａ２抗体の反応性は、単一抗原ビーズアッセイによって決定されてよい。そのような単一抗原ビーズアッセイは市販されている（例えばＦｌｏｗＰＲＡ Ｓｉｎｇｌｅ Ａｎｔｉｇｅｎ Ａｎｔｉｂｏｄｙ；ＯＮＥ ＬＡＭＢＤＡ）。
一実施形態では、本明細書で提供される抗ＨＬＡ－Ａ２抗体は、試験Ａの条件で測定した場合、ＢＢ７．２抗体と比較して、ＨＬＡ－Ａ＊０３、ＨＬＡ－Ａ＊２５、ＨＬＡ－Ａ＊２９、ＨＬＡ－Ａ＊３０、ＨＬＡ－Ａ＊３１、ＨＬＡ－Ａ＊３３、ＨＬＡ－Ａ＊３６、ＨＬＡ－Ａ＊６８及びそれらの任意の組合せのうちの１つ以上から選択される少なくとも１つのＨＬＡ－Ａサブタイプに対する反応性が低い。例えば、一部の実施形態では、本明細書で提供される抗ＨＬＡ－Ａ２抗体は、試験Ａの条件で測定した場合、ＢＢ７．２抗体と比較して、ＨＬＡ－Ａ＊２５、ＨＬＡ－Ａ＊２９、ＨＬＡ－Ａ＊３０及びそれらの任意の組合せを含む群から選択される少なくとも１つのＨＬＡ－Ａサブタイプに対する反応性が低い。
試験Ａ：
抗ＨＬＡ－Ａ２抗体又はＢＢ７．２抗体（例えばＢＢ７．２ ｓｃＦｖ（ｍＡ２ ＣＡＲ））を含むＣＡＲを発現するＴ細胞０．２５×１０６個を、ＦｌｏｗＰＲＡ単一抗原抗体ビーズパネル（ＦＬ１ＨＤ０１、ＦＬ１ＨＤ０２、ＦＬ１ＨＤ０３、ＦＬ１ＨＤ０４、ＦＬ１ＨＤ０６及びＦＬ１ＨＤ０８、Ｏｎｅ Ｌａｍｂｄａ）及び固定可能な生死判別色素（ＦＶＤ、ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ、６５－０８６５－１４、ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）とともに、室温で３０分間インキュベートする。試料を洗浄し、０．５％ホルムアルデヒドで固定し、フローサイトメトリーによって分析する。試料ごとに、２００個の陰性対照ビーズを得る。ビーズ単体を陰性対照として使用した。分析のために、まず、固定可能な生死判別色素を用いて死細胞を除去する。次に、死細胞とダブレットを排除した後、単一抗原ビーズをゲーティングする。次に、ＨＬＡあたりのビーズ数を、それぞれのＰＥ強度ピークによって決定する。各ＨＬＡピークにおける関心ビーズ数に２００を掛け、試料内の陰性ビーズ数で割ることにより、データを正規化する。各ＨＬＡピークについて、対照試料のビーズ数からＣＡＲ－Ｔｒｅｇのビーズ数を引いてから、非ＣＡＲ発現対照のビーズ平均数を割り、１００倍することによって、対照（非ＣＡＲ発現細胞）と比較したＣＡＲ Ｔｒｅｇの相対結合率を決定する。
一実施形態では、本発明の抗ＨＬＡ－Ａ２抗体は、ＨＬＡ－Ａ＊０３、ＨＬＡ－Ａ＊２５、ＨＬＡ－Ａ＊２９、ＨＬＡ－Ａ＊３０、ＨＬＡ－Ａ＊３１、ＨＬＡ－Ａ＊３３、ＨＬＡ－Ａ＊３６、ＨＬＡ－Ａ＊６８を含む群から選択される少なくとも１つのＨＬＡ－Ａサブタイプに対する反応性が、例えば試験Ａの条件で測定した場合に、ＢＢ７．２抗体よりも統計的に劣る。
一実施形態では、本発明の抗ＨＬＡ－Ａ２抗体は、ＨＬＡ－Ａ＊２５、ＨＬＡ－Ａ＊２９、ＨＬＡ－Ａ＊３０を含む群から選択される少なくとも１つのＨＬＡ－Ａサブタイプに対する反応性が、例えば試験Ａの条件で測定した場合に、ＢＢ７．２抗体よりも統計的に劣る。
一実施形態では、「統計的に劣る」という用語は、本発明の抗ＨＬＡ－Ａ２抗体について測定された反応性（例えば試験Ａの条件における相対的結合）が、特に２元配置分散分析、Ｄｕｎｎｅｔｔポストテストで分析したときに、ＢＢ７．２抗体について測定された反応性よりも、最大で約０．０５、好ましくは最大で約０．０１、より好ましくは最大で約０．００５、更に好ましくは最大で約０．００１のｐ値で劣ることを意味する。
一実施形態では、本発明の抗ＨＬＡ－Ａ２抗体は、ＨＬＡ－Ａ＊０３、ＨＬＡ－Ａ＊２５、ＨＬＡ－Ａ＊２９、ＨＬＡ－Ａ＊３０、ＨＬＡ－Ａ＊３０、ＨＬＡ－Ａ＊３１、ＨＬＡ－Ａ＊３３、ＨＬＡ－Ａ＊３６、ＨＬＡ－Ａ＊６８を含む群から選択される少なくとも１つのＨＬＡ－Ａサブタイプに対する反応性が、ＢＢ７．２抗体よりも劣る。一部の実施形態では、該抗ＨＬＡ－Ａ２抗体は、ＨＬＡ－Ａ＊０３、ＨＬＡ－Ａ＊２５、ＨＬＡ－Ａ＊２９、ＨＬＡ－Ａ＊３０、ＨＬＡ－Ａ＊３１、ＨＬＡ－Ａ＊３３、ＨＬＡ－Ａ＊３６、ＨＬＡ－Ａ＊６８を含む群から選択される少なくとも１つのＨＬＡ－Ａサブタイプに対する相対的結合が、試験Ａの条件で測定した場合に、ＢＢ７．２抗体よりも劣る。特定の態様において、該抗ＨＬＡ－Ａ２抗体について測定された相対的結合は、ＢＢ７．２抗体について測定された相対的結合の、最大で約９０％、８０％、７０％、６０％、５０％、４０％、３０％、２０％、１０％以下である。
一実施形態では、本発明の抗ＨＬＡ－Ａ２抗体は、ＨＬＡ－Ａ＊２５、ＨＬＡ－Ａ＊２９、ＨＬＡ－Ａ＊３０を含む群から選択される少なくとも１つのＨＬＡ－Ａサブタイプに対する反応性が、ＢＢ７．２抗体よりも劣る。一部の実施形態では、該抗ＨＬＡ－Ａ２抗体は、ＨＬＡ－Ａ＊２５、ＨＬＡ－Ａ＊２９、ＨＬＡ－Ａ＊３０を含む群から選択される少なくとも１つのＨＬＡ－Ａサブタイプに対する相対的結合が、試験Ａの条件で測定した場合に、ＢＢ７．２抗体よりも劣る。特定の態様において、該抗ＨＬＡ－Ａ２抗体について測定された相対的結合は、ＢＢ７．２抗体について測定された相対的結合の、最大で約９０％、８０％、７０％、６０％、５０％、４０％、３０％、２０％、１０％以下である。
更に、本明細書で提供される抗原結合活性を有する抗ＨＬＡ－Ａ２抗体は、ＣＡＲの抗原結合ドメインを構成することが可能であり、該ＣＡＲは、ＣＡＲがＨＬＡ－Ａ２に特異的に結合するようにヒト細胞において発現することが可能である。一実施形態では、ＣＡＲは、ＨＬＡ－Ａ＊０２：０１に特異的に結合する。当業者によって理解されるように、ＨＬＡ－Ａ２に結合するＣＡＲの能力は、当技術分野で公知の技術の使用によって検出することができる。例えば、ＣＡＲのＨＬＡ－Ａ２への結合は、本明細書に例示されるＨＬＡ－Ａ２四量体の使用によって検出することができる。一実施形態では、ヒト細胞は免疫細胞である。一実施形態では、免疫細胞は制御性免疫細胞である。一実施形態では、免疫細胞は制御性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）である。一実施形態では、免疫細胞はＴ細胞である。一実施形態では、Ｔ細胞はＴｒｅｇである。
更に、本明細書で提供される抗原結合活性を有する抗ＨＬＡ－Ａ２抗体は、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）の抗原結合ドメインを構成することが可能であり、該ＣＡＲは、ＣＡＲがＨＬＡ－Ａ２に特異的に結合するように、制御性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）において発現することが可能である。一実施形態では、ＣＡＲは、ＨＬＡ－Ａ＊０２：０１に特異的に結合する。一実施形態では、ＴｒｅｇはヒトＴｒｅｇである。
一実施形態では、抗ＨＬＡ－Ａ２抗体は、ＣＡＲの抗原結合ドメインを構成することが可能であり、該ＣＡＲは、免疫細胞がＨＬＡ－Ａ２によって活性化されるように免疫細胞において発現することが可能である。一実施形態では、免疫細胞は、ＨＬＡ－Ａ＊０２：０１によって活性化される。一実施形態では、免疫細胞は制御性免疫細胞である。一実施形態では、免疫細胞は制御性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）である。一実施形態では、免疫細胞はＴ細胞である。一実施形態では、Ｔ細胞はＴｒｅｇである。一実施形態では、免疫細胞はヒト免疫細胞である。一実施形態では、制御性免疫細胞はヒト制御性免疫細胞である。一実施形態では、Ｔ細胞はヒトＴ細胞である。一実施形態では、ＴｒｅｇはヒトＴｒｅｇである。
一実施形態では、該抗ＨＬＡ－Ａ２抗体は、ＳＹＨＩＱ（配列番号１）及びＧＹＴＦＴＳＹ（配列番号２）から成る群から選択されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域を含む。
一実施形態では、抗ＨＬＡ－Ａ２抗体は、配列番号１～２から選択される相補性決定領域１（ＶＨ ＣＤＲ１）を含む重鎖可変領域を含む。一実施形態では、抗ＨＬＡ－Ａ２抗体は、配列番号１によって定められるＶＨ ＣＤＲ１を含む重鎖可変領域を含む。一実施形態では、抗ＨＬＡ－Ａ２抗体は、配列番号２によって定められるＶＨ ＣＤＲ１を有する重鎖可変領域を含む。
一実施形態では、抗ＨＬＡ－Ａ２抗体は、アミノ酸配列ＥＧＴＹＹＡＭＤＹ（配列番号６）を含む重鎖可変領域を含む。
一実施形態では、抗ＨＬＡ－Ａ２抗体は、配列番号６によって定められる相補性決定領域３（ＶＨ ＣＤＲ３）を含む重鎖可変領域を含む。
一実施形態では、抗ＨＬＡ－Ａ２抗体は、配列番号５によって定められる１つのＶＨ ＣＤＲ２と、以下のＣＤＲのうちの少なくとも１つとを含む重鎖可変領域を含む：
配列番号１によって定められるＶＨ ＣＤＲ１；又は
配列番号６によって定められるＶＨ ＣＤＲ３。
一実施形態では、抗ＨＬＡ－Ａ２抗体は、配列番号１によって定められる１つのＶＨ ＣＤＲ１と、配列番号５によって定められる１つのＶＨ ＣＤＲ２と、配列番号６によって定められる１つのＶＨ ＣＤＲ３とを含む重鎖可変領域を含む。
本発明によれば、重鎖のＣＤＲ１、２又は３のいずれかは、対応する配列番号１、５及び６に記載のＣＤＲの特定のセットと少なくとも約６０％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％の同一性を共有するアミノ酸配列を有するものとして、特徴付けることができる。
一実施形態では、抗ＨＬＡ－Ａ２抗体は、配列番号５によって定められる１つのＶＨ ＣＤＲ２と、以下のＣＤＲのうちの少なくとも１つとを含む重鎖可変領域を含む：配列番号２によって定められるＶＨ ＣＤＲ１；又は配列番号６によって定められるＶＨ ＣＤＲ３。
一実施形態では、抗ＨＬＡ－Ａ２抗体は、配列番号２によって定められる１つのＶＨ ＣＤＲ１と、配列番号５によって定められる１つのＶＨ ＣＤＲ２と、配列番号６によって定められる１つのＶＨ ＣＤＲ３とを含む重鎖可変領域を含む。
本発明によれば、重鎖のＣＤＲ１、２又は３のいずれかは、対応する配列番号２、５及び６に記載のＣＤＲの特定のセットと少なくとも約６０％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％の同一性を共有するアミノ酸配列を有するものとして、特徴付けることができる。
一実施形態では、抗ＨＬＡ－Ａ２抗体は、アミノ酸配列ＲＳＳＱＳＩＶＨＳＮＧＮＴＹＬＥ（配列番号７）を含む軽鎖可変領域を含む。
一実施形態では、抗ＨＬＡ－Ａ２抗体は、配列番号７によって定められる相補性決定領域１（ＶＬ ＣＤＲ１）を含む軽鎖可変領域を含む。
一実施形態では、抗ＨＬＡ－Ａ２抗体は、アミノ酸配列ＫＶＳＮＲＦＳ（配列番号８）を含む軽鎖可変領域を含む。
一実施形態では、抗ＨＬＡ－Ａ２抗体は、配列番号８によって定められる相補性決定領域２（ＶＬ ＣＤＲ２）を含む軽鎖可変領域を含む。
一実施形態では、抗ＨＬＡ－Ａ２抗体は、アミノ酸配列ＦＱＧＳＨＶＰＲＴ（配列番号９）を含む軽鎖可変領域を含む。
一実施形態では、抗ＨＬＡ－Ａ２抗体は、配列番号９によって定められる相補性決定領域３（ＶＬ ＣＤＲ３）を含む軽鎖可変領域を含む。
一実施形態では、抗ＨＬＡ－Ａ２抗体は、以下のＣＤＲのうちの少なくとも１つを有する軽鎖可変領域を含む：
配列番号７によって定められるＶＬ ＣＤＲ１；又は、
配列番号８によって定められるＶＬ ＣＤＲ２；又は、
配列番号９によって定められるＶＬ ＣＤＲ３。
一実施形態では、抗ＨＬＡ－Ａ２抗体は、配列番号７によって定められる１つのＶＬ ＣＤＲ１と、配列番号８によって定められる１つのＶＬ ＣＤＲ２と、配列番号９によって定められる１つのＶＬ ＣＤＲ３とを含む軽鎖可変領域を含む。
本発明によれば、軽鎖のＣＤＲ１、２又は３のいずれかは、対応する配列番号７、８及び９に記載のＣＤＲの特定のセットと少なくとも約６０％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％の同一性を共有するアミノ酸配列を有するものとして特徴付けることができる。
一実施形態では、抗ＨＬＡ－Ａ２抗体は、ＱＶＱＬＶＱＳＧＡＥＶＫＫＰＧＡＳＶＫＶＳＣＫＡＳ（配列番号１１）及びＱＶＱＬＶＱＳＧＡＥＶＫＫＰＧＡＳＶＫＶＳＣＫＡＳＧＹＴＦＴ（配列番号１２）から成る群から選択されるアミノ酸配列を含むフレームワーク領域１（ＶＨ ＦＲ１）を含む重鎖可変領域を含む。
一実施形態では、抗ＨＬＡ－Ａ２抗体は、アミノ酸配列ＱＶＱＬＶＱＳＧＡＥＶＫＫＰＧＡＳＶＫＶＳＣＫＡＳ（配列番号１１）を含むフレームワーク領域１（ＶＨ ＦＲ１）を含む重鎖可変領域を含む。一実施形態では、抗ＨＬＡ－Ａ２抗体は、配列番号１１に対して約８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含むフレームワーク領域１（ＶＨ ＦＲ１）を含む重鎖可変領域を含む。
一実施形態では、抗ＨＬＡ－Ａ２抗体は、アミノ酸配列ＱＶＱＬＶＱＳＧＡＥＶＫＫＰＧＡＳＶＫＶＳＣＫＡＳＧＹＴＦＴ（配列番号１２）を含むフレームワーク領域１（ＶＨ ＦＲ１）を含む重鎖可変領域を含む。一実施形態では、ヒト化抗ＨＬＡ－Ａ２抗体は、配列番号１２に対して約８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含むフレームワーク領域１（ＶＨ ＦＲ１）を含む重鎖可変領域を含む。
一実施形態では、抗ＨＬＡ－Ａ２抗体は、ＷＶＲＱＡＰＧＱＸ９ＬＥＷＭＧＸ１５（配列番号１３）及びＨＩＱＷＶＲＱＡＰＧＱＸ１２ＬＥＷＭＧＸ１８（配列番号２５）から成る群から選択されるアミノ酸配列を含むフレームワーク領域２（ＶＨ ＦＲ２）を含む重鎖可変領域を含み、配列番号１３において、Ｘ９はＲ又はＧであり、Ｘ１５はＩ又は非存在であり、配列番号２５において、Ｘ１２はＲ又はＧであり、Ｘ１８はＩ又は非存在である。
一実施形態では、抗ＨＬＡ－Ａ２抗体は、アミノ酸配列ＷＶＲＱＡＰＧＱＸ９ＬＥＷＭＧＸ１５（配列番号１３）を含むフレームワーク領域２（ＶＨ ＦＲ２）を含む重鎖可変領域を含み、９位のアミノ酸（Ｘ９）はＲ又はＧであり、１５位のアミノ酸（Ｘ１５）はＩ又は非存在である。
一実施形態では、重鎖可変領域は、配列番号１３に定められるアミノ酸配列を含むフレームワーク領域２（ＶＨ ＦＲ２）を含み、９位のアミノ酸はＲ又はＧであり、１５位のアミノ酸は非存在である。
一実施形態では、重鎖可変領域は、配列番号１４、１５又は１６に定められるアミノ酸配列を含むフレームワーク領域２（ＶＨ ＦＲ２）を含む。一実施形態では、重鎖可変領域は、配列番号１４、１５又は１６に対して約８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含むフレームワーク領域２（ＶＨ ＦＲ２）を含む。
一実施形態では、抗ＨＬＡ－Ａ２抗体は、アミノ酸配列ＨＩＱＷＶＲＱＡＰＧＱＸ１２ＬＥＷＭＧＸ１８（配列番号２５）を含むフレームワーク領域２（ＶＨ ＦＲ２）を含む重鎖可変領域を含み、１２位のアミノ酸（Ｘ１２）はＲ又はＧであり、１８位のアミノ酸（Ｘ１８）はＩ又は非存在である。
一実施形態では、重鎖可変領域は、配列番号２５に定められるアミノ酸配列を含むフレームワーク領域２（ＶＨ ＦＲ２）を含み、１２位のアミノ酸はＲ又はＧであり、１８位のアミノ酸は非存在である。
一実施形態では、重鎖可変領域は、配列番号２６、２７又は２８に定められるアミノ酸配列を含むフレームワーク領域２（ＶＨ ＦＲ２）を含む。一実施形態では、重鎖可変領域は、配列番号２６、２７又は２８に対して約８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含むフレームワーク領域２（ＶＨ ＦＲ２）を含む。
一実施形態では、抗ＨＬＡ－Ａ２抗体は、アミノ酸配列Ｘ１ＶＴＸ４ＴＸ６ＤＴＳＸ１０ＳＴＡＹＭＸ１６ＬＳＸ１９ＬＲＳＸ２３ＤＸ２５ＡＶＹＹＣＡＲ（配列番号２９）を含むフレームワーク領域３（ＶＨ ＦＲ３）を含む重鎖可変領域を含み、１位のアミノ酸（Ｘ１）はＲ又は非存在であり、４位のアミノ酸（Ｘ４）はＩ又はＭであり、６位のアミノ酸（Ｘ６）はＲ又はＡであり、１０位のアミノ酸（Ｘ１０）はＡ、Ｔ又はＩであり、１６位のアミノ酸（Ｘ１６）はＥ又はＬであり、１９位のアミノ酸（Ｘ１９）はＳ又はＲであり、２３位のアミノ酸（Ｘ２３）はＥ又はＤであり、２５位のアミノ酸（Ｘ２５）はＴ又はＭである。
一実施形態では、重鎖可変領域は、配列番号２９に定められるアミノ酸配列を含むフレームワーク領域３（ＶＨ ＦＲ３）を含み、１位のアミノ酸はＲであり、４位のアミノ酸はＩ又はＭであり、６位のアミノ酸はＲであり、１０位のアミノ酸はＡ又はＩであり、１６位のアミノ酸はＥであり、１９位のアミノ酸はＳ又はＲであり、２３位のアミノ酸はＥ又はＤであり、２５位のアミノ酸はＴ又はＭである。
一実施形態では、重鎖可変領域は、配列番号２９によって定められるアミノ酸配列を含むフレームワーク領域３（ＶＨ ＦＲ３）を含み、１位のアミノ酸はＲであり、４位のアミノ酸はＩ又はＭであり、６位のアミノ酸はＲであり、１０位のアミノ酸はＡ又はＩであり、１６位のアミノ酸はＥであり、１９位のアミノ酸はＳ又はＲであり、２３位のアミノ酸はＥ又はＤであり、２５位のアミノ酸はＴである。
一実施形態では、重鎖可変領域は、配列番号２９によって定められるアミノ酸配列を含むフレームワーク領域３（ＶＨ ＦＲ３）を含み、１位のアミノ酸はＲであり、４位のアミノ酸はＩであり、６位のアミノ酸はＲであり、１０位のアミノ酸はＡであり、１６位のアミノ酸はＥであり、１９位のアミノ酸はＳであり、２３位のアミノ酸はＥであり、２５位のアミノ酸はＴ又はＭである。
一実施形態では、重鎖可変領域は、配列番号３０、３１、３２、３３又は３４に定められるアミノ酸配列を含むフレームワーク領域３（ＶＨ ＦＲ３）を含む。一実施形態では、重鎖可変領域は、配列番号３０、３１、３２、３３又は３４に対して約８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含むフレームワーク領域３（ＶＨ ＦＲ３）を含む。
一実施形態では、抗ＨＬＡ－Ａ２抗体は、アミノ酸配列ＷＧＱＧＴＴＶＴＶＳＳ（配列番号４４）を含むフレームワーク領域４（ＶＨ ＦＲ４）を含む重鎖可変領域を含む。一実施形態では、抗ＨＬＡ－Ａ２抗体は、配列番号４４に対して約８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含むフレームワーク領域４（ＶＨ ＦＲ４）を含む重鎖可変領域を含む。
一実施形態では、重鎖可変領域は以下を含む：
配列番号１によって定められるＶＨ ＣＤＲ１；
配列番号５によって定められるＶＨ ＣＤＲ２；
配列番号６によって定められるＶＨ ＣＤＲ３；
配列番号１２によって定められるＶＨ ＦＲ１；
配列番号１３によって定められるＶＨ ＦＲ２であって、９位のアミノ酸（Ｘ９）はＲ又はＧであり、１５位のアミノ酸（Ｘ１５）はＩ又は非存在であるＶＨ ＦＲ２；
配列番号２９によって定められるＶＨ ＦＲ３であって、１位のアミノ酸（Ｘ１）はＲ又は非存在であり、４位のアミノ酸（Ｘ４）はＩ又はＭであり、６位のアミノ酸（Ｘ６）はＲ又はＡであり、１０位（Ｘ１０）のアミノ酸はＡ、Ｔ又はＩであり、１６位のアミノ酸（Ｘ１６）はＥ又はＬであり、１９位（Ｘ１９）のアミノ酸はＳ又はＲであり、２３位のアミノ酸（Ｘ２３）はＥ又はＤであり、２５位のアミノ酸（Ｘ２５）はＴ又はＭであるＶＨ ＦＲ３；及び
配列番号４４によって定められるＶＨ ＦＲ４。
一実施形態では、重鎖可変領域は以下を含む：
配列番号２によって定められるＶＨ ＣＤＲ１；
配列番号５によって定められるＶＨ ＣＤＲ２；
配列番号６によって定められるＶＨ ＣＤＲ３；
配列番号１１によって定められるＶＨ ＦＲ１；
配列番号２５によって定められるＶＨ ＦＲ２であって、１２位のアミノ酸（Ｘ１２）はＲ又はＧであり、１８位のアミノ酸（Ｘ１８）がＩ又は非存在であるＶＨ ＦＲ２；
配列番号２９によって定められるＶＨ ＦＲ３であって、１位のアミノ酸（Ｘ１）はＲ又は非存在であり、４位のアミノ酸（Ｘ４）はＩ又はＭであり、６位のアミノ酸（Ｘ６）はＲ又はＡであり、１０位のアミノ酸（Ｘ１０）はＡ、Ｔ又はＩであり、１６位のアミノ酸（Ｘ１６）はＥ又はＬであり、１９位のアミノ酸（Ｘ１９）はＳ又はＲであり、２３位のアミノ酸（Ｘ２３）はＥ又はＤであり、２５位のアミノ酸（Ｘ２５）はＴ又はＭであるＶＨ ＦＲ３；及び
配列番号４４によって定められるＶＨ ＦＲ４。
一実施形態では、抗ＨＬＡ－Ａ２抗体は、アミノ酸配列ＱＶＱＬＶＱＳＧＡＥＶＫＫＰＧＡＳＶＫＶＳＣＫＡＳＧＹＴＦＴＳＹＨＩＱＷＶＲＱＡＰＧＱＸ４４ＬＥＷＭＧＸ５０ＷＩＹＰＧＤＧＳＴＫＹＳＱＫＦＱＧＸ６８ＶＴＸ７１ＴＸ７３ＤＴＳＸ７７ＳＴＡＹＭＸ８３ＬＳＸ８６ＬＲＳＸ９０ＤＸ９２ＡＶＹＹＣＡＲＥＧＴＹＹＡＭＤＹＷＧＱＧＴＴＶＴＶＳＳ（配列番号９２）を含む重鎖可変領域を含み、４４位のアミノ酸はＲ又はＧであり、５０位のアミノ酸はＩ又は非存在であり、６８位のアミノ酸はＲ又は非存在であり、７１位のアミノ酸はＩ又はＭであり、７３位のアミノ酸はＲ又はＡであり、７７位のアミノ酸はＡ、Ｔ又はＩであり、８３位のアミノ酸はＥ又はＬであり、８６位のアミノ酸はＳ又はＲであり、９０位のアミノ酸はＥ又はＤであり、９２位のアミノ酸はＴ又はＭである。
一実施形態では、重鎖可変領域は、配列番号９２に定められるアミノ酸配列を含み、４４位のアミノ酸はＲ又はＧであり、５０位のアミノ酸は非存在であり、６８位のアミノ酸はＲであり、７１位のアミノ酸はＩ又はＭであり、７３位のアミノ酸はＲであり、７７位のアミノ酸はＡ又はＩであり、８３位のアミノ酸はＥであり、８６位のアミノ酸はＳ又はＲであり、９０位のアミノ酸はＥ又はＤであり、９２位のアミノ酸はＴ又はＭである。
一実施形態では、重鎖可変領域は、配列番号９２に定められるアミノ酸配列を含み、４４位のアミノ酸はＲ又はＧであり、５０位のアミノ酸は非存在であり、６８位のアミノ酸はＲであり、７１位のアミノ酸はＩ又はＭであり、７３位のアミノ酸はＲであり、７７位のアミノ酸はＡ又はＩであり、８３位のアミノ酸はＥであり、８６位のアミノ酸はＳ又はＲであり、９０位のアミノ酸はＥ又はＤであり、９２位のアミノ酸はＴである。
一実施形態では、重鎖可変領域は、配列番号９２に定められるアミノ酸配列を含み、４４位のアミノ酸はＲであり、５０位のアミノ酸は非存在であり、６８位のアミノ酸はＲであり、７１位のアミノ酸はＩであり、７３位のアミノ酸はＲであり、７７位のアミノ酸はＡであり、８３位のアミノ酸はＥであり、８６位のアミノ酸はＳであり、９０位のアミノ酸はＥであり、９２位のアミノ酸はＴ又はＭである。
一実施形態では、抗ＨＬＡ－Ａ２抗体は、配列番号６６に定められるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域を含む。一実施形態では、抗ＨＬＡ－Ａ２抗体は、配列番号６６に対して約８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含む重鎖可変領域を含む。
一実施形態では、抗ＨＬＡ－Ａ２抗体は、本明細書のどこかで定義される軽鎖可変領域を含む。例えば、一実施形態では、抗ＨＬＡ－Ａ２抗体は、ヒト化抗ＨＬＡ－Ａ２抗体について本明細書のいずれかで定義される軽鎖可変領域を含んでよい。
一実施形態では、抗ＨＬＡ－Ａ２抗体は、ｓｃＦｖ、ｓｃＦａｂ又はｓｄＡｂである。一実施形態では、抗ＨＬＡ－Ａ２抗体は、ｓｃＦｖ又はｓｃＦａｂである。一実施形態では、抗ＨＬＡ－Ａ２抗体はｓｄＡｂである。一実施形態では、抗ＨＬＡ－Ａ２抗体はｓｃＦａｂである。一実施形態では、抗ＨＬＡ－Ａ２抗体はｓｃＦｖである。一実施形態では、抗ＨＬＡ－Ａ２抗体は、配列番号９１に定められるアミノ酸配列を含むｓｃＦｖである。一実施形態では、抗ＨＬＡ－Ａ２抗体は、配列番号９１に対して約８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含むｓｃＦｖである。
一実施形態では、抗ＨＬＡ－Ａ２抗体は、ヒト化抗ＨＬＡ－Ａ２抗体である。一実施形態では、抗ＨＬＡ－Ａ２抗体は、ヒト抗体である。一実施形態では、抗ＨＬＡ－Ａ２抗体は、非ヒト化抗体である。一実施形態では、抗ＨＬＡ－Ａ２抗体は、非ヒト抗体である。
一実施形態では、抗ＨＬＡ－Ａ２抗体は、上記の配列番号に対して約８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。一実施形態では、抗ＨＬＡ－Ａ２抗体は、上記の配列番号に対して約８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含むｓｃＦｖ又はｓｃＦａｂである。
本発明の少なくとも１つの抗ＨＬＡ－Ａ２抗体を含む、本質的にそれから成る、又はそれから成る組成物も提供される。
本明細書で用いられる場合、組成物に関して「本質的に～から成る」とは、上記の本発明の少なくとも１つの抗ＨＬＡ－Ａ２抗体が、前記組成物内で生物学的活性を有する唯一の治療薬又は薬剤であることを意味する。
別の実施形態では、本発明の少なくとも１つの抗ＨＬＡ－Ａ２抗体と薬学的に許容される担体とを含む医薬組成物が提供される。
一実施形態では、抗ＨＬＡ－Ａ２抗体は、ヒト化抗ＨＬＡ－Ａ２抗体である。
薬学的に許容される担体の例には、媒体、溶媒、コーティング、等張剤及び吸収遅延剤、添加物、安定剤、防腐剤、界面活性剤、酵素分解を阻害する物質、アルコール、ｐＨ調整剤、酸化防止剤；ＥＤＴＡやグルタチオン等のキレート剤；アジュバント（例えば水酸化アルミニウム）；防腐剤及び推進剤が含まれるが、これらに限定されない。
薬学的に許容される媒体の例には、水、中性緩衝生理食塩水、リン酸緩衝生理食塩水、生理食塩水又は他の生理学的緩衝生理食塩水、又はグリコール、グリセロール等の他の溶媒、及びオリーブ油又は注射可能な有機エステル等の油が含まれるが、これらに限定されない。薬学的に許容される媒体は、リポソーム又はミセルを含むこともできる。
コーティング材料の例には、レシチンが含まれるが、これに限定されない。
等張剤の例には、糖、塩化ナトリウム等が含まれるが、これらに限定されない。
吸収を遅らせる薬剤の例には、モノステアリン酸アルミニウム及びゼラチンが含まれるが、これらに限定されない。
添加物の例には、マンニトール、デキストラン、炭水化物（例えばグルコース、マンノース、スクロース又はデキストラン等）；グリシン、ラクトース又はポリビニルピロリドン、又は抗酸化剤や不活性ガス、安定剤、組換えタンパク質（例えばヒト血清アルブミン）等のインビボ投与に適するその他の添加物が含まれるが、これらに限定されない。
適切な安定剤の例には、スクロース、ゼラチン、ペプトン、ＮＺ－アミンやＮＺ－アミンＡＳ等の消化タンパク質抽出物が含まれるが、これらに限定されない。
これらの組成物に使用することのできる薬学的に許容される担体には、更に、イオン交換体、アルミナ、ステアリン酸アルミニウム、レシチン、ヒト血清アルブミン等の血清タンパク質、リン酸塩等の緩衝物質、グリシン、ソルビン酸、ソルビン酸カリウム、飽和植物性脂肪酸の部分グリセリド混合物、水、塩又は電解質、例えば硫酸プロタミン、リン酸水素二ナトリウム、リン酸水素カリウム、塩化ナトリウム、亜鉛塩、コロイドシリカ、三ケイ酸マグネシウム、ポリビニルピロリドン、セルロース系物質、ポリエチレングリコール、カルボキシメチルセルロースナトリウム、ポリアクリレート、ワックス、ポリエチレンポリオキシプロピレンブロックポリマー、ポリエチレングリコール、及びウール脂肪が含まれるが、これらに限定されない。
また、上記の本発明の少なくとも１つの抗ＨＬＡ－Ａ２抗体を含む、それから成る、又は本質的にそれからなる薬剤も提供される。一実施形態では、抗ＨＬＡ－Ａ２抗体は、ヒト化抗ＨＬＡ－Ａ２抗体である。
ＩＶ．キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）
一態様において、本発明は、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を提供する。ＣＡＲは、標的抗原に対する抗体ベースの特異性と免疫細胞受容体活性化細胞内ドメインを組み合わせたキメラタンパク質分子である。
本発明のＣＡＲは、ＨＬＡ－Ａ２に特異的に結合する細胞外ドメインを含む。細胞外ドメインは、本発明の抗ＨＬＡ－Ａ２抗体を含む。一実施形態では、抗ＨＬＡ－Ａ２抗体は、ヒト化抗ＨＬＡ－Ａ２抗体である。本発明のＣＡＲは、膜貫通ドメインと、細胞内シグナル伝達ドメインを含む細胞質ドメインとを更に含む。一実施形態では、本発明のＣＡＲは、ＣＡＲがＨＬＡ－Ａ２に特異的に結合するように、ヒト細胞において発現することが可能である。他の実施形態では、本発明のＣＡＲは、ＣＡＬがＨＬＡ－Ａ２に特異的に結合するように、免疫細胞において発現することが可能である。一実施形態では、ＣＡＲは、ＨＬＡ－Ａ＊０２：０１に特異的に結合する。当業者には当然のことながら、ＨＬＡ－Ａ２に結合する抗体の能力は、当技術分野で公知の技術の使用によって検出することができる。例えば、ＣＡＲのＨＬＡ－Ａ２への結合は、本明細書に例示されるＨＬＡ－Ａ２四量体の使用によって検出することができる。一実施形態では、本明細書で提供されるＣＡＲは、ＢＢ７．２抗体を含むＣＡＲと比較して、ＨＬＡ－Ａ＊０３、ＨＬＡ－Ａ＊２５、ＨＬＡ－Ａ＊２９、ＨＬＡ－Ａ＊３０、ＨＬＡ－Ａ＊３１、ＨＬＡ－Ａ＊３３、ＨＬＡ－Ａ＊３６、ＨＬＡ－Ａ＊６８のうちの１つ以上から選択される少なくとも１つのＨＬＡ－Ａサブタイプに対する反応性が低い。一実施形態では、本明細書で提供されるＣＡＲは、ＢＢ７．２抗体を含むＣＡＲと比較して、ＨＬＡ－Ａ＊０３、ＨＬＡ－Ａ＊２５、ＨＬＡ－Ａ＊２９、ＨＬＡ－Ａ＊３０、ＨＬＡ－Ａ＊３１、ＨＬＡ－Ａ＊３３、ＨＬＡ－Ａ＊３６、ＨＬＡ－Ａ＊６８のうちの２つ以上から選択される少なくとも１つのＨＬＡ－Ａサブタイプに対する反応性が低い。一実施形態では、本明細書で提供されるＣＡＲは、ＢＢ７．２抗体を含むＣＡＲと比較して、ＨＬＡ－Ａ＊０３、ＨＬＡ－Ａ＊２５、ＨＬＡ－Ａ＊２９、ＨＬＡ－Ａ＊３０、ＨＬＡ－Ａ＊３１、ＨＬＡ－Ａ＊３３、ＨＬＡ－Ａ＊３６、ＨＬＡ－Ａ＊６８のうちの３つ以上から選択される少なくとも１つのＨＬＡ－Ａサブタイプに対する反応性が低い。一実施形態では、本明細書で提供されるＣＡＲは、ＢＢ７．２抗体を含むＣＡＲと比較して、ＨＬＡ－Ａ＊０３、ＨＬＡ－Ａ＊２５、ＨＬＡ－Ａ＊２９、ＨＬＡ－Ａ＊３０、ＨＬＡ－Ａ＊３１、ＨＬＡ－Ａ＊３３、ＨＬＡ－Ａ＊３６、ＨＬＡ－Ａ＊６８のうちの４つ以上から選択される少なくとも１つのＨＬＡ－Ａサブタイプに対する反応性が低い。一実施形態では、本明細書で提供されるＣＡＲは、ＢＢ７．２抗体を含むＣＡＲと比較して、ＨＬＡ－Ａ＊０３、ＨＬＡ－Ａ＊２５、ＨＬＡ－Ａ＊２９、ＨＬＡ－Ａ＊３０、ＨＬＡ－Ａ＊３１、ＨＬＡ－Ａ＊３３、ＨＬＡ－Ａ＊３６、ＨＬＡ－Ａ＊６８のうちの５つ以上から選択される少なくとも１つのＨＬＡ－Ａサブタイプに対する反応性が低い。一実施形態では、本明細書で提供されるＣＡＲは、ＢＢ７．２抗体を含むＣＡＲと比較して、ＨＬＡ－Ａ＊０３、ＨＬＡ－Ａ＊２５、ＨＬＡ－Ａ＊２９、ＨＬＡ－Ａ＊３０、ＨＬＡ－Ａ＊３１、ＨＬＡ－Ａ＊３３、ＨＬＡ－Ａ＊３６、ＨＬＡ－Ａ＊６８のうちの６つ以上から選択される少なくとも１つのＨＬＡ－Ａサブタイプに対する反応性が低い。一実施形態では、本明細書で提供されるＣＡＲは、ＢＢ７．２抗体を含むＣＡＲと比較して、ＨＬＡ－Ａ＊０３、ＨＬＡ－Ａ＊２５、ＨＬＡ－Ａ＊２９、ＨＬＡ－Ａ＊３０、ＨＬＡ－Ａ＊３１、ＨＬＡ－Ａ＊３３、ＨＬＡ－Ａ＊３６、ＨＬＡ－Ａ＊６８のうちの７つ以上から選択される少なくとも１つのＨＬＡ－Ａサブタイプに対する反応性が低い。一実施形態では、本明細書で提供されるＣＡＲは、ＢＢ７．２抗体を含むＣＡＲと比較して、ＨＬＡ－Ａ＊０３、ＨＬＡ－Ａ＊２５、ＨＬＡ－Ａ＊２９、ＨＬＡ－Ａ＊３０、ＨＬＡ－Ａ＊３１、ＨＬＡ－Ａ＊３３、ＨＬＡ－Ａ＊３６、ＨＬＡ－Ａ＊６８のうちの各々から選択される少なくとも１つのＨＬＡ－Ａサブタイプに対する反応性が低い。一実施形態では、本明細書で提供されるＣＡＲは、ＢＢ７．２抗体を含むＣＡＲと比較して、ＨＬＡ－Ａ＊２５、ＨＬＡ－Ａ＊２９、ＨＬＡ－Ａ＊３０のうちの１つ以上から選択される少なくとも１つのＨＬＡ－Ａサブタイプに対する反応性が低い。一実施形態では、本明細書で提供されるＣＡＲは、ＢＢ７．２抗体を含むＣＡＲと比較して、ＨＬＡ－Ａ＊２５、ＨＬＡ－Ａ＊２９、ＨＬＡ－Ａ＊３０のうちの２つ以上から選択される少なくとも１つのＨＬＡ－Ａサブタイプに対する反応性が低い。一実施形態では、本明細書で提供されるＣＡＲは、ＢＢ７．２抗体を含むＣＡＲと比較して、ＨＬＡ－Ａ＊２５、ＨＬＡ－Ａ＊２９、ＨＬＡ－Ａ＊３０のうちの各々から選択される少なくとも１つのＨＬＡ－Ａサブタイプに対する反応性が低い。一実施形態では、本明細書で提供されるＣＡＲは、ＢＢ７．２抗体を含むＣＡＲと比較して、ＨＬＡ－Ａ＊０３：０１、ＨＬＡ－Ａ＊２５：０１、ＨＬＡ－Ａ＊２９：０２、ＨＬＡ－Ａ＊３０：０１、ＨＬＡ－Ａ＊３１：０１、ＨＬＡ－Ａ＊３３：０１、ＨＬＡ－Ａ＊３６：０１及びＨＬＡ－Ａ＊６８：０１のうちの少なくとも１つに対する反応性が低い。一実施形態では、本明細書で提供されるＣＡＲは、ＢＢ７．２抗体を含むＣＡＲと比較して、ＨＬＡ－Ａ＊０３：０１、ＨＬＡ－Ａ＊２５：０１、ＨＬＡ－Ａ＊２９：０２、ＨＬＡ－Ａ＊３０：０１、ＨＬＡ－Ａ＊３１：０１、ＨＬＡ－Ａ＊３３：０１、ＨＬＡ－Ａ＊３６：０１及びＨＬＡ－Ａ＊６８：０１のうちの少なくとも２つに対する反応性が低い。一実施形態では、本明細書で提供されるＣＡＲは、ＢＢ７．２抗体を含むＣＡＲと比較して、ＨＬＡ－Ａ＊０３：０１、ＨＬＡ－Ａ＊２５：０１、ＨＬＡ－Ａ＊２９：０２、ＨＬＡ－Ａ＊３０：０１、ＨＬＡ－Ａ＊３１：０１、ＨＬＡ－Ａ＊３３：０１、ＨＬＡ－Ａ＊３６：０１及びＨＬＡ－Ａ＊６８：０１のうちの少なくとも３つに対する反応性が低い。一実施形態では、本明細書で提供されるＣＡＲは、ＢＢ７．２抗体を含むＣＡＲと比較して、ＨＬＡ－Ａ＊０３：０１、ＨＬＡ－Ａ＊２５：０１、ＨＬＡ－Ａ＊２９：０２、ＨＬＡ－Ａ＊３０：０１、ＨＬＡ－Ａ＊３１：０１、ＨＬＡ－Ａ＊３３：０１、ＨＬＡ－Ａ＊３６：０１及びＨＬＡ－Ａ＊６８：０１のうちの少なくとも４つに対する反応性が低い。一実施形態では、本明細書で提供されるＣＡＲは、ＢＢ７．２抗体を含むＣＡＲと比較して、ＨＬＡ－Ａ＊０３：０１、ＨＬＡ－Ａ＊２５：０１、ＨＬＡ－Ａ＊２９：０２、ＨＬＡ－Ａ＊３０：０１、ＨＬＡ－Ａ＊３１：０１、ＨＬＡ－Ａ＊３３：０１、ＨＬＡ－Ａ＊３６：０１及びＨＬＡ－Ａ＊６８：０１のうちの少なくとも５つに対する反応性が低い。一実施形態では、本明細書で提供されるＣＡＲは、ＢＢ７．２抗体を含むＣＡＲと比較して、ＨＬＡ－Ａ＊０３：０１、ＨＬＡ－Ａ＊２５：０１、ＨＬＡ－Ａ＊２９：０２、ＨＬＡ－Ａ＊３０：０１、ＨＬＡ－Ａ＊３１：０１、ＨＬＡ－Ａ＊３３：０１、ＨＬＡ－Ａ＊３６：０１及びＨＬＡ－Ａ＊６８：０１のうちの少なくとも６つに対する反応性が低い。一実施形態では、本明細書で提供されるＣＡＲは、ＢＢ７．２抗体を含むＣＡＲと比較して、ＨＬＡ－Ａ＊０３：０１、ＨＬＡ－Ａ＊２５：０１、ＨＬＡ－Ａ＊２９：０２、ＨＬＡ－Ａ＊３０：０１、ＨＬＡ－Ａ＊３１：０１、ＨＬＡ－Ａ＊３３：０１、ＨＬＡ－Ａ＊３６：０１及びＨＬＡ－Ａ＊６８：０１のうちの少なくとも７つに対する反応性が低い。一実施形態では、本明細書で提供されるＣＡＲは、ＢＢ７．２抗体を含むＣＡＲと比較して、ＨＬＡ－Ａ＊０３：０１、ＨＬＡ－Ａ＊２５：０１、ＨＬＡ－Ａ＊２９：０２、ＨＬＡ－Ａ＊３０：０１、ＨＬＡ－Ａ＊３１：０１、ＨＬＡ－Ａ＊３３：０１、ＨＬＡ－Ａ＊３６：０１及びＨＬＡ－Ａ＊６８：０１に対する反応性が低い。一実施形態では、本明細書で提供されるＣＡＲは、ＢＢ７．２抗体を含むＣＡＲと比較して、ＨＬＡ－Ａ＊２５：０１、ＨＬＡ－Ａ＊２９：０２及びＨＬＡ－Ａ＊３０：０１のうちの少なくとも１つに対する反応性が低い。一実施形態では、本明細書で提供されるＣＡＲは、ＢＢ７．２抗体を含むＣＡＲと比較して、ＨＬＡ－Ａ＊２５：０１、ＨＬＡ－Ａ＊２９：０２及びＨＬＡ－Ａ＊３０：０１のうちの少なくとも２つに対する反応性が低い。一実施形態では、本明細書で提供されるＣＡＲは、ＢＢ７．２抗体を含むＣＡＲと比較して、ＨＬＡ－Ａ＊２５：０１、ＨＬＡ－Ａ＊２９：０２及びＨＬＡ－Ａ＊３０：０１に対する反応性が低い。一実施形態では、本明細書で提供されるＣＡＲは、ＢＢ７．２抗体を含むＣＡＲと比較して、ＨＬＡ－Ａ＊２５：０１に対する反応性が低い。一実施形態では、本明細書で提供されるＣＡＲは、ＢＢ７．２抗体を含むＣＡＲと比較して、ＨＬＡ－Ａ＊２９：０２に対する反応性が低い。一実施形態では、本明細書で提供されるＣＡＲは、ＢＢ７．２抗体を含むＣＡＲと比較して、ＨＬＡ－Ａ＊３０：０１に対する反応性が低い。一実施形態では、本明細書で提供されるＣＡＲは、ＢＢ７．２抗体を含むＣＡＲと比較して、ＨＬＡ－Ａ＊０３：０１に対する反応性が低い。一実施形態では、本明細書で提供されるＣＡＲは、ＢＢ７．２抗体を含むＣＡＲと比較して、ＨＬＡ－Ａ＊３１：０１に対する反応性が低い。一実施形態では、本明細書で提供されるＣＡＲは、ＢＢ７．２抗体を含むＣＡＲと比較して、ＨＬＡ－Ａ＊３３：０１に対する反応性が低い。一実施形態では、本明細書で提供されるＣＡＲは、ＢＢ７．２抗体を含むＣＡＲと比較して、ＨＬＡ－Ａ＊３６：０１に対する反応性が低い。一実施形態では、本明細書で提供されるＣＡＲは、ＢＢ７．２抗体を含むＣＡＲと比較して、ＨＬＡ－Ａ＊６８：０１に対する反応性が低い。一実施形態では、ヒト細胞は免疫細胞である。一実施形態では、免疫細胞は制御性免疫細胞である。一実施形態では、免疫細胞は制御性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）である。一実施形態では、免疫細胞はＴ細胞である。一実施形態では、Ｔ細胞はＴｒｅｇである。
ＨＬＡ－Ａサブタイプに対する本発明のＣＡＲの反応性を決定するための技術は、当業者には公知であろう。例えば、ＨＬＡ－Ａサブタイプに対する本発明のＣＡＲの反応性は、単一抗原ビーズアッセイによって決定されてよい。そのような単一抗原ビーズアッセイは市販されている（例えばＦｌｏｗＰＲＡ Ｓｉｎｇｌｅ Ａｎｔｉｇｅｎ Ａｎｔｉｂｏｄｙ；ＯＮＥ ＬＡＭＢＤＡ）。
一実施形態では、本発明のＣＡＲは、本明細書において上述された試験Ａの条件で測定した場合、ＢＢ７．２抗体を含むＣＡＲと比較して、ＨＬＡ－Ａ＊０３、ＨＬＡ－Ａ＊２５、ＨＬＡ－Ａ＊２９、ＨＬＡ－Ａ＊３０、ＨＬＡ－Ａ＊３１、ＨＬＡ－Ａ＊３３、ＨＬＡ－Ａ＊３６、ＨＬＡ－Ａ＊６８及びそれらの任意の組合せを含む群から選択されるＨＬＡ－Ａサブタイプに対する反応性が低い。
一実施形態では、本発明のＣＡＲは、本明細書において上述された試験Ａの条件で測定した場合、ＢＢ７．２抗体を含むＣＡＲと比較して、ＨＬＡ－Ａ＊２５、ＨＬＡ－Ａ＊２９、ＨＬＡ－Ａ＊３０及びそれらの任意の組合せを含む群から選択されるＨＬＡ－Ａサブタイプに対する反応性が低い。
一実施形態では、本発明のＣＡＲは、ＨＬＡ－Ａ＊０３、ＨＬＡ－Ａ＊２５、ＨＬＡ－Ａ＊２９、ＨＬＡ－Ａ＊３０、ＨＬＡ－Ａ＊３１、ＨＬＡ－Ａ＊３３、ＨＬＡ－Ａ＊３６、ＨＬＡ－Ａ＊６８を含む群から選択される少なくとも１つのＨＬＡ－Ａサブタイプに対する反応性が、例えば試験Ａの条件で測定した場合に、ＢＢ７．２抗体を含むＣＡＲのものよりも統計的に劣る。
一実施形態では、本発明のＣＡＲは、ＨＬＡ－Ａ＊２５、ＨＬＡ－Ａ＊２９、ＨＬＡ－Ａ＊３０を含む群から選択される少なくとも１つのＨＬＡ－Ａサブタイプに対する反応性が、例えば試験Ａの条件で測定した場合に、ＢＢ７．２抗体を含むＣＡＲのものよりも統計的に劣る。
一実施形態では、「統計的に劣る」という用語は、本発明のＣＡＲについて測定された反応性（例えば試験Ａの条件における相対的結合）が、特に２元配置分散分析、Ｄｕｎｎｅｔｔポストテストで分析したときに、ＢＢ７．２抗体を含むＣＡＲについて測定された反応性よりも、最大で約０．０５、好ましくは最大で約０．０１、より好ましくは最大で約０．００５、更に好ましくは最大で約０．００１のｐ値で劣ることを意味する。
一実施形態では、本発明のＣＡＲは、ＨＬＡ－Ａ＊０３、ＨＬＡ－Ａ＊２５、ＨＬＡ－Ａ＊２９、ＨＬＡ－Ａ＊３０、ＨＬＡ－Ａ＊３１、ＨＬＡ－Ａ＊３３、ＨＬＡ－Ａ＊３６、ＨＬＡ－Ａ＊６８を含む群から選択される少なくとも１つのＨＬＡ－Ａサブタイプに対する反応性が、ＢＢ７．２抗体を含むＣＡＲよりも劣る。一部の実施形態では、該ＣＡＲは、ＨＬＡ－Ａ＊０３、ＨＬＡ－Ａ＊２５、ＨＬＡ－Ａ＊２９、ＨＬＡ－Ａ＊３０、ＨＬＡ－Ａ＊３１、ＨＬＡ－Ａ＊３３、ＨＬＡ－Ａ＊３６、ＨＬＡ－Ａ＊６８を含む群から選択される少なくとも１つのＨＬＡ－Ａサブタイプに対する相対的結合が、試験Ａの条件で測定した場合に、ＢＢ７．２抗体を有するＣＡＲよりも劣る。特定の態様において、該ＣＡＲの相対的結合は、ＢＢ７．２抗体を含むＣＡＲについて測定された相対結合の、最大で約９０％、８０％、７０％、６０％、５０％、４０％、３０％、２０％、１０％以下である。
一実施形態では、本発明のＣＡＲは、ＨＬＡ－Ａ＊２５、ＨＬＡ－Ａ＊２９、ＨＬＡ－Ａ＊３０を含む群から選択される少なくとも１つのＨＬＡ－Ａサブタイプに対する反応性が、ＢＢ７．２抗体を含むＣＡＲよりも劣る。一部の実施形態では、該ＣＡＲは、ＨＬＡ－Ａ＊２５、ＨＬＡ－Ａ＊２９、ＨＬＡ－Ａ＊３０を含む群から選択される少なくとも１つのＨＬＡ－Ａサブタイプに対する相対的結合が、試験Ａの条件で測定した場合に、ＢＢ７．２抗体を含むＣＡＲよりも劣る。特定の態様において、該ＣＡＲについて測定された相対的結合は、ＢＢ７．２抗体を含むＣＡＲの結合の、最大で約９０％、８０％、７０％、６０％、５０％、４０％、３０％、２０％、１０％以下である。
一実施形態では、ＣＡＲは、免疫細胞がＨＬＡ－Ａ２によって活性化されるように免疫細胞において発現することが可能である。一実施形態では、免疫細胞は、ＨＬＡ－Ａ＊０２：０１によって活性化される。一実施形態では、免疫細胞は制御性免疫細胞である。一実施形態では、免疫細胞は制御性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）である。一実施形態では、免疫細胞はＴ細胞である。一実施形態では、Ｔ細胞はＴｒｅｇである。一実施形態では、免疫細胞はヒト免疫細胞である。一実施形態では、制御性免疫細胞はヒト制御性免疫細胞である。一実施形態では、Ｔ細胞はヒトＴ細胞である。一実施形態では、ＴｒｅｇはヒトＴｒｅｇである。
一実施形態では、ＣＡＲは、ＨＬＡ－Ａ２への結合について、配列番号１８３のアミノ酸配列を有する重鎖相補性決定領域１（ＨＣＤＲ１）、配列番号１８５のアミノ酸配列を有する重鎖相補性決定領域２（ＨＣＤＲ２）、配列番号１８７のアミノ酸配列を有する重鎖相補性決定領域３（ＨＣＤＲ３）、配列番号１８８のアミノ酸配列を有する軽鎖相補性決定領域１（ＬＣＤＲ１）、配列番号１８９のアミノ酸配列を有する軽鎖相補性決定領域２（ＬＣＤＲ２）、及び配列番号１９０のアミノ酸配列を有する軽鎖相補性決定領域３（ＬＣＤＲ３）を含む抗体と競合する。一実施形態では、ＣＡＲは、配列番号１８３のアミノ酸配列を有する重鎖相補性決定領域１（ＨＣＤＲ１）、配列番号１８５のアミノ酸配列を有する重鎖相補性決定領域２（ＨＣＤＲ２）、配列番号１８７のアミノ酸配列を有する重鎖相補性決定領域３（ＨＣＤＲ３）、配列番号１８８のアミノ酸配列を有する軽鎖相補性決定領域１（ＬＣＤＲ１）、配列番号１８９のアミノ酸配列を有する軽鎖相補性決定領域２（ＬＣＤＲ２）、及び配列番号１９０のアミノ酸配列を有する軽鎖相補性決定領域３（ＬＣＤＲ３）を含む抗体と同じＨＬＡ－Ａ２エピトープに結合する。一実施形態では、ＣＡＲは、ＨＬＡ－Ａ２への結合についてＢＢ７．２抗体と競合する。一実施形態では、ＣＡＲは、ＢＢ７．２抗体と同じＨＬＡ－Ａ２エピトープに結合する。ＢＢ７．２抗体は、ＢＢ７．２ハイブリドーマ（ＡＴＣＣ寄託番号ＨＢ－８２）から単離することができる。
一実施形態では、本発明のＣＡＲは、抗ＨＬＡ－Ａ２抗体を含む細胞外ドメインと、膜貫通ドメインと、細胞内シグナル伝達ドメインを含む細胞質ドメインとを含む。一実施形態では、抗ＨＬＡ－Ａ２抗体は、ヒト化抗ＨＬＡ－Ａ２抗体である。
一実施形態では、キメラ受容体は、タグ及び／又はリーダー配列を更に含む。
一実施形態では、キメラ受容体は、例えば品質管理、濃縮、インビボ追跡等のためのタグ等のタグを更に含む。前記タグは、Ｎ末端、Ｃ末端及び／又は内部に局在化してよい。本発明のキメラ受容体において使用され得るタグの例は、当業者には周知である。例えば、限定されないが、本発明において用いられるタグは、ヘマグルチニンタグ、ポリアルギニンタグ、ポリヒスチジンタグ、Ｍｙｃタグ、Ｓｔｒｅｐタグ、Ｓ－Ｔａｇ、ＨＡＴタグ、３×Ｆｌａｇタグ、カルモジュリン結合ペプチドタグ、ＳＢＰタグ、キチン結合ドメインタグ、ＧＳＴタグ、マルトース結合タンパク質タグ、蛍光タンパク質タグ（例えばｅＧＦＰ）、Ｔ７タグ、Ｖ５タグ及びＸｐｒｅｓｓタグを含むか又はから成る群から選択されるタグであってよい。
細胞外ドメインは、ＣＡＲのターゲティングアームとも呼ばれる標的特異的結合エレメントである。細胞外ドメインは、特定の病状に関連する標的細胞上の細胞表面マーカーとして作用するリガンドを認識するように選択される。本発明のＣＡＲは、ＨＬＡ－Ａ２エピトープに特異的に結合する適切な細胞外ドメインを遺伝子操作することにより、ＨＬＡ－Ａ２を提示する細胞を標的とするように遺伝子操作される。本発明のＣＡＲの標的特異的結合エレメント又は抗原結合ドメインは、本明細書において抗ＨＬＡ－Ａ２結合ドメインと呼ばれることがある。一部の実施形態では、抗ＨＬＡ－Ａ２結合ドメインは、ヒト化抗ＨＬＡ－Ａ２結合ドメインであってよい。
膜貫通ドメインは、ＣＡＲの細胞外ドメイン及び細胞質ドメインに付着している。膜貫通ドメインは、ＣＡＲの細胞外ドメインが標的に結合するときはいつでも、細胞質ドメインの細胞内シグナル伝達ドメイン（複数可）にシグナル伝達することが可能である。
ＣＡＲの細胞内シグナル伝達ドメインを含む細胞質ドメインは、ＣＡＲが配置された免疫細胞（例えば制御性Ｔ細胞）の生理学的エフェクター機能のうちの少なくとも１つの活性化に関与する。用語「エフェクター機能」は、免疫細胞の特殊な機能を指す。例えば、制御性Ｔ細胞のエフェクター機能は、他の免疫細胞の誘導及び／若しくは増殖の抑制又は下方制御を含んでよい。更に、Ｔｒｅｇのエフェクター機能は、組織の修復又は再生の促進等の、臨床状態の改善をもたらす非免疫細胞に対する効果を含んでよい。よって、用語「細胞内シグナル伝達ドメイン」は、エフェクター機能シグナルを伝達し、免疫細胞にその特殊な機能を実行するよう指示するタンパク質の部分を指す。通常、細胞内シグナル伝達ドメイン全体を採用することができるが、多くの場合、鎖全体を用いる必要はない。細胞内シグナル伝達ドメインの切断部分が用いられる限りでは、そのような切断部分は、エフェクター機能シグナルを伝達する限り、インタクト鎖の代わりに用いられてよい。よって、細胞内シグナル伝達ドメインという用語は、エフェクター機能シグナルを伝達するのに十分な細胞内シグナル伝達ドメインの切断部分を含むことを意味する。
一実施形態では、ＣＡＲの抗原結合ドメインと膜貫通ドメインの間、又はＣＡＲの細胞内シグナル伝達ドメインと膜貫通ドメインの間に、スペーサードメイン（又はリンカー又はヒンジ）が組み込まれてよい。上記で定義したように、スペーサードメイン、リンカー及びヒンジは、膜貫通ドメインを、ポリペプチド鎖の抗原結合ドメイン又は細胞内シグナル伝達ドメインのいずれかに連結するように機能するオリゴペプチド又はポリペプチドである。スペーサードメインは、例えば、最大３００個のアミノ酸、１０～１００個のアミノ酸、２５～７５個のアミノ酸、又は２５～５０個のアミノ酸、又はこれらの範囲内の任意の部分範囲又は個々の数値のアミノ酸を含んでよい。
細胞外ドメイン
細胞外ドメインは、本発明の抗ＨＬＡ－Ａ２抗体を含む。一実施形態では、細胞外ドメインは、本発明のヒト化抗ＨＬＡ－Ａ２抗体を含む。
一実施形態では、細胞外ドメインは、ｓｃＦｖ、ｓｃＦａｂ又はｓｄＡｂである本発明の抗ＨＬＡ－Ａ２抗体を含む。一実施形態では、細胞外ドメインは、ｓｃＦｖ又はｓｃＦａｂである本発明の抗ＨＬＡ－Ａ２抗体を含む。一実施形態では、細胞外ドメインは、ｓｄＡｂである本発明の抗ＨＬＡ－Ａ２抗体を含む。一実施形態では、細胞外ドメインは、ｓｃＦｖである本発明の抗ＨＬＡ－Ａ２抗体を含む。一実施形態では、細胞外ドメインは、ｓｃＦａｂである本発明の抗ＨＬＡ－Ａ２抗体を含む。一実施形態では、細胞外ドメインは、本発明の任意のヒト化抗ＨＬＡ－Ａ２抗体を含み、ヒト化抗ＨＬＡ－Ａ２抗体は、ｓｃＦｖ、ｓｃＦａｂ又はｓｄＡｂである。一実施形態では、細胞外ドメインは、本発明の任意のヒト化抗ＨＬＡ－Ａ２抗体を含み、ヒト化抗ＨＬＡ－Ａ２抗体は、ｓｃＦｖ又はｓｃＦａｂである。一実施形態では、細胞外ドメインは、ｓｄＡｂである本発明のヒト化抗ＨＬＡ－Ａ２抗体を含む。一実施形態では、細胞外ドメインは、ｓｃＦｖである本発明のヒト化抗ＨＬＡ－Ａ２抗体を含む。一実施形態では、細胞外ドメインは、ｓｃＦａｂである本発明のヒト化抗ＨＬＡ－Ａ２抗体を含む。
一部の実施形態では、細胞外ドメインはヒンジを含んでよく、膜貫通ドメインは、ヒンジを介してＣＡＲの細胞外領域、例えばＣＡＲの抗原結合ドメインに付着する。一実施形態では、ヒンジはヒトタンパク質に由来してよい。例えば、一実施形態では、ヒンジは、ヒトＩｇ（免疫グロブリン）ヒンジ、例えばＩｇＧ４ヒンジ、又はＣＤ８αヒンジであってよい。一部の例では、本発明のＣＡＲの細胞外ドメインは、ＣＤ８αヒンジを含んでよい。一実施形態では、ヒンジ領域は、ＣＤ８αのストーク領域を含む。一実施形態では、ＣＤ８ヒンジは、米国特許第９，１０２，７６０号の配列番号１５の核酸配列によってコードされてよい。一実施形態では、ＣＤ８ヒンジは、米国特許第９，１０２，７６０号の配列番号２１のアミノ酸配列を含んでよい。別の実施形態では、ＣＤ８ヒンジは、米国特許第９，１０２，７６０号の配列番号２１のアミノ酸配列を含んでよい。一実施形態では、ヒンジ又はスペーサーは、表３の配列番号１１５又は２１９のアミノ酸配列を含んでよい。一実施形態では、ヒンジ又はスペーサーは、表４の配列番号１５９又は２２０の核酸配列によってコードされてよい。
膜貫通ドメイン
膜貫通ドメインは、天然源または合成源のいずれかに由来してよい。一実施形態では、膜貫通ドメインは、天然源、例えば膜結合タンパク質又は膜貫通タンパク質に由来してよい。
一実施形態では、ＣＡＲの膜貫通ドメインは、ＣＡＲのドメインの１つと自然に関連する膜貫通ドメインに由来してよい。他の実施形態では、膜貫通ドメインは、受容体複合体の他のメンバーとの相互作用を最小限に抑えるために、同じ又は異なる表面膜タンパク質の膜貫通ドメインへの該ドメインの結合を回避するように、アミノ酸置換によって選択又は修飾することができる。
一実施形態では、膜貫通ドメインは、膜貫通領域に隣接する１つ以上の追加のアミノ酸、例えば、膜貫通が由来するタンパク質の細胞外領域に関連する１つ以上のアミノ酸（例えば細胞外領域の１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４又は１５個のアミノ酸）及び／又は膜貫通タンパク質が由来するタンパク質の細胞質領域に関連する１つ以上の追加のアミノ酸（例えば細胞質領域の１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４又は１５個のアミノ酸）を含んでよい。
一実施形態では、膜貫通ドメインは、ＣＤ３ガンマ、ＣＤ３デルタ、ＣＤ３イプシロン、ＣＤ３ゼータ、Ｔ細胞受容体のアルファ鎖、Ｔ細胞受容体のベータ鎖、Ｔ細胞受容体のガンマ鎖、Ｔ細胞受容体のデルタ鎖、ＣＤ２８、ＣＤ４５、ＣＤ４、ＣＤ５、ＣＤ８、ＣＤ９、ＣＤ１６、ＣＤ２２、ＣＤ３３、ＣＤ３７、ＣＤ６４、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ１３４、ＣＤ１３７、ＫＩＲＤＳ２、ＯＸ４０、ＣＤ２、ＣＤ２７、ＬＦＡ－１（ＣＤｌ ｌａ、ＣＤ１８）、ＩＣＯＳ（ＣＤ２７８）、４－１ＢＢ（ＣＤ１３７）、ＧＩＴＲ、ＣＤ４０、ＢＡＦＦＲ、ＨＶＥＭ（ＬＩＧＨＴＲ）、ＳＬＡＭＦ７、ＮＫｐ８０（ＫＬＲＦｌ）、ＣＤ１６０、ＣＤ１９、ＩＬ２Ｒベータ、ＩＬ２Ｒガンマ、ＩＬ７Ｒａ、ＩＴＧＡ１、ＶＬＡ１、ＣＤ４９ａ、ＩＴＧＡ４、ＩＡ４、ＣＤ４９Ｄ、ＩＴＧＡ６、ＶＬＡ－６、ＣＤ４９ｆ、ＩＴＧＡＤ、ＣＤ１１ｄ、ＩＴＧＡＥ、ＣＤ１０３、ＩＴＧＡＬ、ＣＤ１１ａ、ＬＦＡ－１、ＩＴＧＡＭ、ＣＤ１１ｂ、ＰＤ１、ＩＴＧＡＸ、ＣＤｌ１ｃ、ＩＴＧＢ１、ＣＤ２９、ＩＴＧＢ２、ＣＤ１８、ＬＦＡ－１、ＩＴＧＢ７、ＴＮＦＲ２、ＤＮＡＭ１（ＣＤ２２６）、ＳＬＡＭＦ４（ＣＤ２４４、２Ｂ４）、ＣＤ８４、ＣＤ９６（Ｔａｃｔｉｌｅ）、ＣＥＡＣＡＭ１、ＣＲＴ ＡＭ、Ｌｙ９（ＣＤ２２９）、ＣＤ１６０（ＢＹ５５）、ＰＳＧＬ１、ＣＤＩＯＯ（ＳＥＭＡ４Ｄ）、ＳＬＡＭＦ６（ＮＴＢ－Ａ、Ｌｙｌ０８）、ＳＬＡＭ（ＳＬＡＭＦ１、ＣＤ１５０、ＩＰＯ－３）、ＢＬＡＭＥ（ＳＬＡＭＦ８）、ＳＥＬＰＬＧ（ＣＤ１６２）、ＬＴＢＲ、ＰＡＧ／Ｃｂｐ、ＮＫｐ４４、ＮＫｐ３０、ＮＫｐ４６、ＮＫＧ２Ｄ、及び／又はＮＫＧ２Ｃ及びＣＤ１５４、並びにそれらの任意の組合せから成る群から選択されるタンパク質の膜貫通ドメインを含んでよい。一実施形態では、膜貫通ドメインは、ＣＤ２８の膜貫通ドメインを含んでよい。一実施形態では、ＣＤ２８膜貫通ドメインは、表４の配列番号１６０の核酸配列によってコードされる。一実施形態では、ＣＤ２８膜貫通ドメインは、表３の配列番号１１６のアミノ酸配列を含む。別の実施形態では、ＣＤ２８膜貫通ドメインは、表３の配列番号１１６のアミノ酸配列を含む。
一実施形態では、膜貫通ドメインは、ＣＤ８の膜貫通ドメインを含んでよい。一実施形態では、ＣＤ８膜貫通ドメインは、米国特許第９，１０２，７６０号の配列番号１６の核酸配列によってコードされる。一実施形態では、ＣＤ８膜貫通ドメインは、米国特許第９，１０２，７６０号の配列番号２２のアミノ酸配列を含む。別の実施形態では、ＣＤ８膜貫通ドメインは、米国特許第９，１０２，７６０号の配列番号２２のアミノ酸配列を含む。
一実施形態では、ＣＤ８膜貫通ドメインは、表４の配列番号２２４の核酸配列によってコードされる。一実施形態では、ＣＤ８膜貫通ドメインは、表３の配列番号２２３のアミノ酸配列を含む。
他の実施形態では、膜貫通ドメインは合成であってよく、その場合、ロイシン及びバリンを含む疎水性優勢の残基を含んでよい。一実施形態では、フェニルアラニン、トリプトファン及びバリンのトリプレットは、合成膜貫通ドメインの各末端に見ることができる。
一実施形態では、短いオリゴペプチドリンカー又はポリペプチドリンカーは、ＣＡＲの膜貫通ドメインと細胞質ドメインの間に結合を形成してよい。一実施形態では、リンカーは、長さが１、２、３、４、５、６、７、８、９又は１０個のアミノ酸を含んでよい。一実施形態では、リンカーは、グリシン－セリンダブレットを含んでよい。
細胞質ドメイン
一実施形態では、本発明のＣＡＲにおいて用いられる細胞内シグナル伝達ドメインは、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）、及び抗原受容体の結合後にシグナル伝達を開始するために協調して作用する共受容体の細胞質配列だけでなくと、これらの配列の派生物又は変形、及び同じ機能的能力を有する任意の合成配列を含んでよい。
一次細胞質シグナル伝達配列は、ＴＣＲ複合体の一次活性化を刺激的又は抑制的に制御する。刺激的に作用する一次細胞質シグナル伝達配列は、免疫受容体チロシンベースの活性化モチーフ又はＩＴＡＭとして知られるシグナル伝達モチーフを含んでよい。本発明において特に有用な一次細胞質シグナル伝達配列を含むＩＴＡＭの例には、ＣＤ３ゼータ、ＦｃＲガンマ、ＣＤ３ガンマ、ＣＤ３デルタ、ＣＤ３イプシロン、ＣＤ５、ＣＤ２２、ＣＤ７９ａ、ＣＤ７９ｂ及びＣＤ６６ｄに由来するものが含まれる。一実施形態では、一次シグナル伝達ドメインは、改変されたＩＴＡＭドメイン、例えば天然のＩＴＡＭドメインと比較して活性が変化した（例えば増加又は減少した）変異ＩＴＡＭドメインを含む。一実施形態では、一次シグナル伝達ドメインは、改変されたＩＴＡＭ含有の一次細胞内シグナル伝達ドメイン、例えば、最適化されかつ／又は切断されたＩＴＡＭ含有の一次細胞内シグナル伝達ドメインを含む。一実施形態では、一次シグナル伝達ドメインは、１つ、２つ、３つ、４つ又はそれ以上のＩＴＡＭモチーフを含む。
一実施形態では、細胞内シグナル伝達ドメインは、ＣＤ３ガンマ、ＣＤ３デルタ、ＣＤ３イプシロン、ＣＤ３ゼータ、ＦｃＲガンマ（例えばＦＣγＲＩ、ＲＣγＲＩＩＡ、ＦｃγＲＩＩＢ１、ＦｃγＲＩＩＢ２、ＦｃγＲＩＩＩＡ又はＦｃγＲＩＩＩＢ）、ＦｃＲアルファ（例えばＦｃαＲＩ）、ＦｃＲイプシロン（例えばＦｃεＲＩ又はＦｃεＲＩＩ）、ＣＤ５、ＣＤ２２、ＣＤ７９ａ、ＣＤ７９ｂ、ＤＡＰ１０、ＤＡＰ１２及びＣＤ６６ｄ、並びにそれらの任意の組合せから成る群から選択されるタンパク質の機能的シグナル伝達ドメインを含む。一実施形態では、細胞内シグナル伝達ドメインは、ＣＤ３ゼータの一次シグナル伝達ドメインを含むか、又はそれから成る。
ＴＣＲのみを通して生成されたシグナルは、Ｔ細胞の完全な活性化には不十分である場合があり、二次又は共刺激シグナルも必要になる場合があることが知られている。よって、ある実施形態では、Ｔ細胞活性化は、２つのクラスの細胞質シグナル伝達配列：ＴＣＲを通して抗原依存性の一次活性化を開始するもの（一次細胞質シグナル伝達配列）と、二次又は共刺激シグナルを提供するために抗原非依存的に作用するもの（二次細胞質シグナル伝達配列）とによって媒介され得る。一実施形態では、細胞内シグナル伝達ドメインは、共刺激ドメインを更に含んでよい。
一実施形態では、ＣＡＲの細胞内シグナル伝達ドメインは、それ自体でＣＤ３－ゼータシグナル伝達ドメインを含むことができ、又は、本発明のＣＡＲとの関連において有用である他の所望の細胞内シグナル伝達ドメイン（複数可）と組み合せることができる。例えば、ＣＡＲの細胞内シグナル伝達ドメインは、ＣＤ３ゼータ鎖部分と共刺激シグナル伝達ドメインとを含むことができる。共刺激シグナル伝達ドメインとは、共刺激分子の細胞内ドメインを含む、ＣＡＲの一部を指す。共刺激分子は、抗原に対するリンパ球の効率的な応答に必要となる、抗原受容体又はそのリガンド以外の細胞表面分子である。そのような分子の例には、ＯＸ４０、ＣＤ２７、ＣＤ２８、リンパ球機能関連抗原－１（ＬＦＡ－１）（ＣＤ１１ａ／ＣＤ１８）、ＴＮＦＲ１（ＣＤ１２０ａ／ＴＮＦＲＳＦ１Ａ）、ＴＮＦＲ２（ＣＤ１２０ｂ／ＴＮＦＲＳＦ１Ｂ）、ＣＴＬＡ－４（ＣＤ１５２）、ＣＤ９５、ＩＣＯＳ（ＣＤ２７８）、４－１ＢＢ（ＣＤ１３７）、ＣＤ２、ＣＤ３０、ＣＤ４０、ＰＤ－１、ＣＤ７、ＬＩＧＨＴ、ＮＫＧ２Ｃ、Ｂ７－Ｈ３、ＩＣＡＭ－１、ＣＤ８３と特異的に結合するリガンド、ＩＬ２ｒａ（ＣＤ２５）、ＩＬ６Ｒａ（ＣＤ１２６）、ＩＬ－７Ｒａ（ＣＤ１２７）、ＩＬ－１３ＲＡ１、ＩＬ－１３ＲＡ２、ＩＬ－３３Ｒ（ＩＬ１ＲＬ１）、ＩＬ－１０ＲＡ、ＩＬ－１０ＲＢ、ＩＬ－４Ｒ、ＩＬ－５Ｒ（ＣＳＦ２ＲＢ）、ＡＲＨＲ、ＢＡＦＦ受容体、ＩＬ－２１Ｒ、ＴＧＦｂＲ１、ＴＧＦｂＲ２、ＴＧＦｂＲ３、共通ガンマ鎖、ＭＨＣクラスＩ分子、ＢＴＬＡ及びＴｏｌｌリガンド受容体、ＣＤ８３と特異的に結合するリガンド、ＣＤＳ、ＩＣＡＭ－１、ＧＩＴＲ、ＨＶＥＭ（ＬＩＧＨＴＲ）、ＳＬＡＭＦ７、ＮＫｐ８０（ＫＬＲＦ１）、ＮＫｐ４４、ＮＫｐ３０、ＮＫｐ４６、ＣＤ１６０（ＢＹ５５）、ＣＤ１９、ＣＤ１９ａ、ＣＤ４、ＣＤ８アルファ、ＣＤ８ベータ、ＩＬ２Ｒベータ、ＩＬ２Ｒガンマ、ＩＬ７Ｒアルファ、ＩＴＧＡ４、ＶＬＡ１、ＣＤ４９ａ、ＩＡ４、ＣＤ４９Ｄ、ＩＴＧＡ６、ＶＬＡ－６、ＣＤ４９ｆ、ＩＴＧＡＤ、ＣＤ１１ｄ、ＩＴＧＡＥ、ＣＤ１０３、ＩＴＧＡＬ、ＣＤ１１ａ、ＩＴＧＡＭ、ＣＤ１１ｂ、ＩＴＧＡＸ、ＣＤ１１ｃ、ＩＴＧＢ１、ＣＤ２９、ＩＴＧＢ２、ＣｉｔｇｂＤ１８、ＩＴＧＢ７、ＴＲＡＮＣＥ／ＲＡＮＫＬ、ＤＮＡＭ１（ＣＤ２２６）、ＳＬＡＭＦ４（ＣＤ２４４、２Ｂ４）、ＣＤ８４、ＣＤ９６（Ｔａｃｔｉｌｅ）、ＣＥＡＣＡＭ１、ＣＲＴＡＭ、Ｌｙ９（ＣＤ２２９）、ＰＳＧＬ１、ＣＤ１００（ＳＥＭＡ４Ｄ）、ＣＤ６９、ＳＬＡＭＦ６（ＮＴＢ－Ａ、Ｌｙｌ０８）、ＳＬＡＭ（ＳＬＡＭＦ１、ＣＤ１５０、ＩＰＯ－３）、ＢＬＡＭＥ（ＳＬＡＭＦ８）、ＳＥＬＰＬＧ（ＣＤ１６２）、ＬＴＢＲ、ＬＡＴ、ＧＡＤＳ、ＳＬＰ－７６、ＰＡＧ／Ｃｂｐ、ＮＫＧ２Ｄ等が含まれる。
本発明のＣＡＲの細胞質部分内の細胞内シグナル伝達配列は、ランダムな順序又は特定の順序で互いに連結されてよい。任意に、例えば、長さが１～１０個のアミノ酸（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９又は１０個のアミノ酸）の短いオリゴペプチドリンカー又はポリペプチドリンカーは、細胞内シグナル伝達配列間に結合を形成してよい。一実施形態では、グリシン－セリンダブレットを適切なリンカーとして使用することができる。一実施形態では、単一のアミノ酸、例えばアラニンやグリシンを、適切なリンカーとして用いることができる。
一実施形態では、細胞内シグナル伝達ドメインは、２つ以上、例えば２、３、４、５又はそれ以上の共刺激シグナル伝達ドメインを含むように設計される。一実施形態では、２つ以上、例えば２、３、４、５又はそれ以上の共刺激シグナル伝達ドメインは、リンカー分子、例えば本明細書に記載のリンカー分子によって分離される。一実施形態では、細胞内シグナル伝達ドメインは、２つの共刺激シグナル伝達ドメインを含む。一部の実施形態では、リンカー分子はグリシン残基である。一部の実施形態では、リンカーはアラニン残基である。
一実施形態では、細胞質ドメインは、ＣＤ３ゼータのシグナル伝達ドメイン及びＣＤ２８のシグナル伝達ドメインを含んでよい。別の実施形態では、細胞質ドメインは、ＣＤ３ゼータのシグナル伝達ドメイン及び４－１ＢＢのシグナル伝達ドメインを含んでよい。更に別の実施形態では、細胞質ドメインは、ＣＤ３ゼータのシグナル伝達ドメイン並びにＣＤ２８及び４－１ＢＢのシグナル伝達ドメインを含んでよい。
一実施形態では、細胞質ドメインは、ＣＤ２８のシグナル伝達ドメイン及びＣＤ３ゼータのシグナル伝達ドメインを含んでよく、ＣＤ２８のシグナル伝達ドメインは、表４の配列番号１６１に定められる核酸配列によってコードされ、ＣＤ３ゼータのシグナル伝達ドメインは、表４の配列番号１６２に定められる核酸配列によってコードされる。
一実施形態では、細胞質ドメインは、ＣＤ２８のシグナル伝達ドメイン及びＣＤ３ゼータのシグナル伝達ドメインを含んでよく、ＣＤ２８のシグナル伝達ドメインは、表３の配列番号１１７のアミノ酸配列を含み、ＣＤ３ゼータのシグナル伝達ドメインは、表３の配列番号１１８のアミノ酸配列を含む。
一実施形態では、細胞質ドメインは、ＣＤ２８のシグナル伝達ドメイン及びＣＤ３ゼータのシグナル伝達ドメインを含んでよく、ＣＤ２８のシグナル伝達ドメインは、表３の配列番号１１７に定められるアミノ酸配列を含み、ＣＤ３ゼータのシグナル伝達ドメインは、表３の配列番号１１８に定められるアミノ酸配列を含む。
一実施形態では、細胞質ドメインは、４－１ＢＢのシグナル伝達ドメイン及びＣＤ３ゼータのシグナル伝達ドメインを含んでよく、４－１ＢＢのシグナル伝達ドメインは、米国特許第９，１０２，７６０号の配列番号１７に定められる核酸配列によってコードされ、ＣＤ３ゼータのシグナル伝達ドメインは、表４の配列番号１６２に定められる核酸配列によってコードされる。
一実施形態では、細胞質ドメインは、４－１ＢＢのシグナル伝達ドメイン及びＣＤ３ゼータのシグナル伝達ドメインを含んでよく、４－１ＢＢのシグナル伝達ドメインは、米国特許第９，１０２，７６０号の配列番号２３のアミノ酸配列を含み、ＣＤ３ゼータのシグナル伝達ドメインは、表３の配列番号１１８のアミノ酸配列を含む。
一実施形態では、細胞質ドメインは、４－１ＢＢのシグナル伝達ドメイン及びＣＤ３ゼータのシグナル伝達ドメインを含んでよく、４－１ＢＢのシグナル伝達ドメインは、米国特許第９，１０２，７６０号の配列番号２３に定められるアミノ酸配列を含み、ＣＤ３ゼータのシグナル伝達ドメインは、表３の配列番号１１８に定められるアミノ酸配列を含む。
一実施形態では、ＣＡＲは、配列番号１１９、１２０、１２１、１２２、１２３、１２４、１２５、１２６、１２７、１２８、１２９、１３０、１３１、１３２、１３３、１３４、１３５、１３６、１３７、１３８又は２１３に定められるアミノ酸配列を含む。一実施形態では、ＣＡＲは、配列番号１１９、１２０、１２１、１２２、１２３、１２４、１２５、１２６、１２７、１２８、１２９、１３０、１３１、１３２、１３３、１３４、１３５、１３６、１３７、１３８又は２１３に対して、約８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。
Ｖ．核酸とベクター
一部の実施形態では、本発明は、本発明の抗ＨＬＡ－Ａ２抗体をコードする核酸を提供する。一部の実施形態では、本発明は、本発明のヒト化抗ＨＬＡ－Ａ２抗体をコードする核酸を提供する。一部の実施形態では、本発明は、配列番号７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０又は９１に定められるアミノ酸配列を含むタンパク質をコードする核酸を提供する。一部の実施形態では、本発明は、配列番号９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、１００、１０１、１０２、１０３、１０４、１０５、１０６、１０７、１０８、１０９、１１０、１１１又は１１２に定められるアミノ酸配列を含むタンパク質をコードする核酸を提供する。一部の実施形態では、本発明は、配列番号７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０又は９１に対して、約８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含むタンパク質をコードする核酸を提供する。一部の実施形態では、本発明は、配列番号９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、１００、１０１、１０２、１０３、１０４、１０５、１０６、１０７、１０８、１０９、１１０、１１１又は１１２に対して、約８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含むタンパク質をコードする核酸を提供する。一部の実施形態では、本発明は、配列番号１３９、１４０、１４１、１４２、１４３、１４４、１４５、１４６、１４７、１４８、１４９、１５０、１５１、１５２、１５３、１５４、１５５、１５６、１５７又は１５８に定められる核酸配列を含む核酸を提供する。一部の実施形態では、本発明は、配列番号１３９、１４０、１４１、１４２、１４３、１４４、１４５、１４６、１４７、１４８、１４９、１５０、１５１、１５２、１５３、１５４、１５５、１５６、１５７又は１５８に対して、約８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％の同一性を有する核酸配列を含む核酸を提供する。一部の実施形態では、本発明は、配列番号１３９、１４０、１４１、１４２、１４３、１４４、１４５、１４６、１４７、１４８、１４９、１５０、１５１、１５２、１５３、１５４、１５５、１５６、１５７又は１５８に定められる核酸配列を含む核酸によってコードされるタンパク質を提供する。一部の実施形態では、本発明は、配列番号１３９、１４０、１４１、１４２、１４３、１４４、１４５、１４６、１４７、１４８、１４９、１５０、１５１、１５２、１５３、１５４、１５５、１５６、１５７又は１５８に対して、約８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％の同一性を有する核酸配列を含む核酸によってコードされるタンパク質を提供する。一部の実施形態では、本発明は、配列番号６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０又は７１に定められるアミノ酸配列を含むタンパク質をコードする核酸を提供する。一部の実施形態では、本発明は、配列番号６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０又は７１に対して、約８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含むタンパク質をコードする核酸を提供する。
一部の実施形態では、本発明は、本発明のキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）をコードする核酸を提供する。本発明のＣＡＲをコードする核酸配列は、本明細書のどこかに記載されている細胞外ドメインを含むＣＡＲをコードしてよい。
細胞外ドメインは、本発明の抗ＨＬＡ－Ａ２抗体を含んでよい。細胞外ドメインは、本発明のヒト化抗ＨＬＡ－Ａ２抗体を含んでよい。一実施形態では、細胞外ドメインは、リーダー配列を更に含んでよい。一実施形態では、リーダー配列は、配列番号１１３に定められるアミノ酸配列を含む。一実施形態では、細胞外ドメインはヒンジ領域を含み、抗ＨＬＡ－Ａ２結合ドメインは、ヒンジ領域によって膜貫通ドメインに連結される。一実施形態では、ヒンジ領域は、ＣＤ８αのストーク領域を含む。
本発明の核酸配列は、本明細書のどこかに記載されている膜貫通ドメインを含むＣＡＲをコードしてよい。例えば、一実施形態では、膜貫通ドメインは、ＣＤ３ガンマ、ＣＤ３デルタ、ＣＤ３イプシロン、ＣＤ３ゼータ、Ｔ細胞受容体のアルファ鎖、Ｔ細胞受容体のベータ鎖、Ｔ細胞受容体のガンマ鎖、Ｔ細胞受容体のデルタ鎖、ＣＤ２８、ＣＤ４５、ＣＤ４、ＣＤ５、ＣＤ８、ＣＤ９、ＣＤ１６、ＣＤ２２、ＣＤ３３、ＣＤ３７、ＣＤ６４、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ１３４、ＣＤ１３７、ＫＩＲＤＳ２、ＯＸ４０、ＣＤ２、ＣＤ２７、ＬＦＡ－１（ＣＤ１１ａ、ＣＤ１８）、ＩＣＯＳ（ＣＤ２７８）、４－１ＢＢ（ＣＤ１３７）、ＧＩＴＲ、ＣＤ４０、ＢＡＦＦＲ、ＨＶＥＭ（ＬＩＧＨＴＲ）、ＳＬＡＭＦ７、ＮＫｐ８０（ＫＬＲＦ１）、ＣＤ１６０、ＣＤ１９、ＩＬ２Ｒベータ、ＩＬ２Ｒガンマ、ＩＬ７Ｒ ａ、ＩＴＧＡ１、ＶＬＡ１、ＣＤ４９ａ、ＩＴＧＡ４、ＩＡ４、ＣＤ４９Ｄ、ＩＴＧＡ６、ＶＬＡ－６、ＣＤ４９ｆ、ＩＴＧＡＤ、ＣＤ１１ｄ、ＩＴＧＡＥ、ＣＤ１０３、ＩＴＧＡＬ、ＣＤ１１ａ、ＬＦＡ－１、ＩＴＧＡＭ、ＣＤ１１ｂ、ＰＤ１、ＩＴＧＡＸ、ＣＤｌ１ｃ、ＩＴＧＢ１、ＣＤ２９、ＩＴＧＢ２、ＣＤ１８、ＬＦＡ－１、ＩＴＧＢ７、ＴＮＦＲ２、ＤＮＡＭ１（ＣＤ２２６）、ＳＬＡＭＦ４（ＣＤ２４４、２Ｂ４）、ＣＤ８４、ＣＤ９６（Ｔａｃｔｉｌｅ）、ＣＥＡＣＡＭ１、ＣＲＴ ＡＭ、Ｌｙ９（ＣＤ２２９）、ＣＤ１６０（ＢＹ５５）、ＰＳＧＬ１、ＣＤＩＯＯ（ＳＥＭＡ４Ｄ）、ＳＬＡＭＦ６（ＮＴＢ－Ａ、Ｌｙｌ０８）、ＳＬＡＭ（ＳＬＡＭＦ１、ＣＤ１５０、ＩＰＯ－３）、ＢＬＡＭＥ（ＳＬＡＭＦ８）、ＳＥＬＰＬＧ（ＣＤ１６２）、ＬＴＢＲ、ＰＡＧ／ＣＡＧ、ＮＫｐ４４、ＮＫｐ３０、ＮＫｐ４６、ＮＫＧ２Ｄ及び／又はＮＫＧ２ＣとＣＤ１５４、並びにそれらの任意の組合せから成る群から選択されるタンパク質の膜貫通ドメインを含む。一実施形態では、膜貫通ドメインは、ＣＤ２８の膜貫通ドメインを含む。
本発明の核酸配列は、本明細書のどこかに記載されている細胞質ドメインを含むＣＡＲをコードしてよい。更に、細胞質ドメインは、本明細書のどこかに記載されている細胞内シグナル伝達ドメインを含んでよい。例えば、一実施形態では、細胞内シグナル伝達ドメインは、ＣＤ３ガンマ、ＣＤ３デルタ、ＣＤ３イプシロン、ＣＤ３ゼータ、ＦｃＲガンマ（例えばＦＣγＲＩ、ＲＣγＲＩＩＡ、ＦｃγＲＩＩＢ１、ＦｃγＲＩＩＢ２、ＦｃγＲＩＩＩＡ又はＦｃγＲＩＩＩＢ）、ＦｃＲアルファ（例えばＦｃαＲＩ）、ＦｃＲイプシロン（例えばＦｃεＲＩ又はＦｃεＲＩＩ）、ＣＤ５、ＣＤ２２、ＣＤ７９ａ、ＣＤ７９ｂ、ＤＡＰ１０、ＤＡＰ１２及びＣＤ６６ｄ、並びにそれらの任意の組合せから成る群から選択されるタンパク質の機能的シグナル伝達ドメインを含む。一実施形態では、細胞内シグナル伝達ドメインは、ＣＤ３ゼータの機能的シグナル伝達ドメインを含む。一実施形態では、細胞内シグナル伝達ドメインは、共刺激ドメインを更に含む。本発明の核酸配列によってコードされるＣＡＲの共刺激ドメインは、本明細書のどこかに記載されている共刺激ドメインであってよい。例えば、一実施形態では、共刺激ドメインは、ＯＸ４０、ＣＤ２７、ＣＤ２８、リンパ球機能関連抗原－１（ＬＦＡ－１）（ＣＤ１１ａ／ＣＤ１８）、ＴＮＦＲ１（ＣＤ１２０ａ／ＴＮＦＲＳＦ１Ａ）、ＴＮＦＲ２（ＣＤ１２０ｂ／ＴＮＦＲＳＦ１Ｂ）、ＣＴＬＡ－４（ＣＤ１５２）、ＣＤ９５、ＩＣＯＳ（ＣＤ２７８）、４－１ＢＢ（ＣＤ１３７）、ＣＤ２、ＣＤ３０、ＣＤ４０、ＰＤ－１、ＣＤ７、ＬＩＧＨＴ、ＮＫＧ２Ｃ、Ｂ７－Ｈ３、ＩＣＡＭ－１、ＣＤ８３と特異的に結合するリガンド、ＩＬ２ｒａ（ＣＤ２５）、ＩＬ６Ｒａ（ＣＤ１２６）、ＩＬ－７Ｒａ（ＣＤ１２７）、ＩＬ－１３ＲＡ１、ＩＬ－１３ＲＡ２、ＩＬ－３３Ｒ（ＩＬ１ＲＬ１）、ＩＬ－１０ＲＡ、ＩＬ－１０ＲＢ、ＩＬ－４Ｒ、ＩＬ－５Ｒ（ＣＳＦ２ＲＢ）、ＡＲＨＲ、ＢＡＦＦ受容体、ＩＬ－２１Ｒ、ＴＧＦｂＲ１、ＴＧＦｂＲ２、ＴＧＦｂＲ３、共通ガンマ鎖、ＭＨＣクラスＩ分子、ＢＴＬＡ及びＴｏｌｌリガンド受容体、ＣＤ８３と特異的に結合するリガンド、ＣＤＳ、ＩＣＡＭ－１、ＧＩＴＲ、ＨＶＥＭ（ＬＩＧＨＴＲ）、ＳＬＡＭＦ７、ＮＫｐ８０（ＫＬＲＦ１）、ＮＫｐ４４、ＮＫｐ３０、ＮＫｐ４６、ＣＤ１６０（ＢＹ５５）、ＣＤ１９、ＣＤ１９ａ、ＣＤ４、ＣＤ８アルファ、ＣＤ８ベータ、ＩＬ２Ｒベータ、ＩＬ２Ｒガンマ、ＩＬ７Ｒアルファ、ＩＴＧＡ４、ＶＬＡ１、ＣＤ４９ａ、ＩＡ４、ＣＤ４９Ｄ、ＩＴＧＡ６、ＶＬＡ－６、ＣＤ４９ｆ、ＩＴＧＡＤ、ＣＤ１１ｄ、ＩＴＧＡＥ、ＣＤ１０３、ＩＴＧＡＬ、ＣＤ１１ａ、ＩＴＧＡＭ、ＣＤ１１ｂ、ＩＴＧＡＸ、ＣＤ１１ｃ、ＩＴＧＢ１、ＣＤ２９、ＩＴＧＢ２、ＣｉｔｇｂＤ１８、ＩＴＧＢ７、ＴＲＡＮＣＥ／ＲＡＮＫＬ、ＤＮＡＭ１（ＣＤ２２６）、ＳＬＡＭＦ４（ＣＤ２４４、２Ｂ４）、ＣＤ８４、ＣＤ９６（Ｔａｃｔｉｌｅ）、ＣＥＡＣＡＭ１、ＣＲＴＡＭ、Ｌｙ９（ＣＤ２２９）、ＰＳＧＬ１、ＣＤ１００（ＳＥＭＡ４Ｄ）、ＣＤ６９、ＳＬＡＭＦ６（ＮＴＢ－Ａ、Ｌｙｌ０８）、ＳＬＡＭ（ＳＬＡＭＦ１、ＣＤ１５０、ＩＰＯ－３）、ＢＬＡＭＥ（ＳＬＡＭＦ８）、ＳＥＬＰＬＧ（ＣＤ１６２）、ＬＴＢＲ、ＬＡＴ、ＧＡＤＳ、ＳＬＰ－７６、ＰＡＧ／Ｃｂｐ、ＮＫＧ２Ｄ並びにそれらの任意の組合せから成る群から選択されるタンパク質の機能的シグナル伝達ドメインを含む。一実施形態では、共刺激ドメインは、ＣＤ２８、４－１ＢＢ及びそれらの組合せから成る群から選択されるタンパク質の機能的シグナル伝達ドメインを含む。一実施形態では、共刺激ドメインは、ＣＤ２８の機能的シグナル伝達ドメインを含む。一実施形態では、共刺激ドメインは、４－１ＢＢの機能的シグナル伝達ドメインを含む。一実施形態では、細胞内シグナル伝達ドメインを含む配列は、同じフレームにおいて単一のポリペプチド鎖として発現する。
本発明の核酸配列は、単離された核酸配列であってよい。
一実施形態では、核酸は、メッセンジャーＲＮＡ転写物として提供される。一実施形態では、核酸はＤＮＡコンストラクトとして提供される。
一実施形態では、ＣＡＲをコードする配列を含む組換えＤＮＡコンストラクトが提供され、ＣＡＲは、（ｉ）抗ＨＬＡ－Ａ２抗体を含む細胞外ドメインと、（ｉｉ）膜貫通ドメインと、（ｉｉｉ）細胞内シグナル伝達ドメインを含む細胞質ドメインとを含み、コードされるＣＡＲは、ＣＡＲがＨＬＡ－Ａ２に特異的に結合できるように、ヒト細胞において発現することが可能である。一実施形態では、ＣＡＲは、ＨＬＡ－Ａ＊０２：０１に特異的に結合することができる。一実施形態では、抗ＨＬＡ－Ａ２抗体は、ヒト化抗ＨＬＡ－Ａ２抗体である。一実施形態では、ヒト細胞は免疫細胞である。一実施形態では、免疫細胞は制御性免疫細胞である。一実施形態では、免疫細胞は制御性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）である。一実施形態では、免疫細胞はＴ細胞である。一実施形態では、Ｔ細胞はＴｒｅｇである。
一実施形態では、ＣＡＲをコードする配列を含む組換えＤＮＡコンストラクトが提供され、ＣＡＲは、（ｉ）抗ＨＬＡ－Ａ２抗体を含む細胞外ドメインと、（ｉｉ）膜貫通ドメインと、（ｉｉｉ）細胞内シグナル伝達ドメインを含む細胞質ドメインとを含み、コードされるＣＡＲは、ＣＡＲがＨＬＡ－Ａ２に特異的に結合できるように、制御性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）において発現することが可能である。一実施形態では、ＣＡＲは、ＨＬＡ－Ａ＊０２：０１に特異的に結合することが可能である。一実施形態では、ＣＡＲのＨＬＡ－Ａ２への結合は、本明細書に例示されるＨＬＡ－Ａ２四量体の使用によって検出することができる。一実施形態では、抗ＨＬＡ－Ａ２抗体は、ヒト化抗ＨＬＡ－Ａ２抗体である。一実施形態では、ＴｒｅｇはヒトＴｒｅｇである。
一実施形態では、コードされるＣＡＲは、免疫細胞がＨＬＡ－Ａ２によって活性化されるように、免疫細胞において発現することが可能である。一実施形態では、免疫細胞は、ＨＬＡ－Ａ＊０２：０１によって活性化される。一実施形態では、免疫細胞は制御性免疫細胞である。一実施形態では、免疫細胞は制御性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）である。一実施形態では、免疫細胞はＴ細胞である。一実施形態では、Ｔ細胞はＴｒｅｇである。一実施形態では、免疫細胞はヒト免疫細胞である。一実施形態では、制御性免疫細胞はヒト制御性免疫細胞である。一実施形態では、Ｔ細胞はヒトＴ細胞である。一実施形態では、ＴｒｅｇはヒトＴｒｅｇである。
一実施形態では、コードされるＣＡＲは、ＨＬＡ－Ａ２への結合について、配列番号１８３のアミノ酸配列を有する重鎖相補性決定領域１（ＨＣＤＲ１）、配列番号１８５のアミノ酸配列を有する重鎖相補性決定領域２（ＨＣＤＲ２）、配列番号１８７のアミノ酸配列を有する重鎖相補性決定領域３（ＨＣＤＲ３）、配列番号１８８のアミノ酸配列を有する軽鎖相補性決定領域１（ＬＣＤＲ１）、配列番号１８９のアミノ酸配列を有する軽鎖相補性決定領域２（ＬＣＤＲ２）、及び配列番号１９０のアミノ酸配列を有する軽鎖相補性決定領域３（ＬＣＤＲ３）を含む抗体と競合する。一実施形態では、コードされたＣＡＲは、配列番号１８３のアミノ酸配列を有する重鎖相補性決定領域１（ＨＣＤＲ１）、配列番号１８５のアミノ酸配列を有する重鎖相補性決定領域２（ＨＣＤＲ２）、配列番号１８７のアミノ酸配列を有する重鎖相補性決定領域３（ＨＣＤＲ３）、配列番号１８８のアミノ酸配列を有する軽鎖相補性決定領域１（ＬＣＤＲ１）、配列番号１８９のアミノ酸配列を有する軽鎖相補性決定領域２（ＬＣＤＲ２）、及び配列番号１９０のアミノ酸配列を有する軽鎖相補性決定領域３（ＬＣＤＲ３）を含む抗体と同じＨＬＡ－Ａ２エピトープに結合する。一実施形態では、コードされたＣＡＲは、ＨＬＡ－Ａ２への結合についてＢＢ７．２抗体と競合する。一実施形態では、コードされるＣＡＲは、ＢＢ７．２抗体と同じＨＬＡ－Ａ２エピトープに結合する。
一部の実施形態では、本発明は、配列番号１１９、１２０、１２１、１２２、１２３、１２４、１２５、１２６、１２７、１２８、１２９、１３０、１３１、１３２、１３３、１３４、１３５、１３６、１３７、１３８又は２１３に定められるアミノ酸配列を含むタンパク質をコードする核酸を提供する。一部の実施形態では、本発明は、配列番号１１９、１２０、１２１、１２２、１２３、１２４、１２５、１２６、１２７、１２８、１２９、１３０、１３１、１３２、１３３、１３４、１３５、１３６、１３７、１３８又は２１３に対して、約８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含むタンパク質をコードする核酸を提供する。一部の実施形態では、本発明は、配列番号１６３、１６４、１６５、１６６、１６７、１６８、１６９、１７０、１７１、１７２、１７３、１７４、１７５、１７６、１７７、１７８、１７９、１８０、１８１、１８２又は２１４に定められる核酸配列を含む核酸を提供する。一部の実施形態では、本発明は、配列番号１６３、１６４、１６５、１６６、１６７、１６８、１６９、１７０、１７１、１７２、１７３、１７４、１７５、１７６、１７７、１７８、１７９、１８０、１８１、１８２又は２１４に対して、約８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％の同一性を有する核酸配列を含む核酸を提供する。一部の実施形態では、本発明は、配列番号１６３、１６４、１６５、１６６、１６７、１６８、１６９、１７０、１７１、１７２、１７３、１７４、１７５、１７６、１７７、１７８、１７９、１８０、１８１、１８２又は２１４に定められる核酸配列を含む核酸によってコードされるタンパク質を提供する。一部の実施形態では、本発明は、配列番号１６３、１６４、１６５、１６６、１６７、１６８、１６９、１７０、１７１、１７２、１７３、１７４、１７５、１７６、１７７、１７８、１７９、１８０、１８１、１８２又は２１４に対して、約８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％の同一性を有する核酸配列を含む核酸によってコードされるタンパク質を提供する。
所望の分子をコードする核酸配列は、例えば遺伝子を発現する細胞からライブラリをスクリーニングすること、又はそれを含むことが知られているベクターから遺伝子を誘導すること、又は標準技術を用いて、それを含む細胞及び組織から直接分離すること等により、当技術分野において公知の組換え法を用いて取得することができる。或いは、目的の核酸は、クローニングではなく、合成的に産生することができる。
本発明は更に、抗ＨＬＡ－Ａ２抗体をコードする核酸分子又はＣＡＲをコードする核酸分子を含むベクターを提供する。一実施形態では、本発明は、ヒト化抗ＨＬＡ－Ａ２抗体をコードする核酸分子を含むベクターを提供する。一実施形態では、本発明は、該核酸分子が挿入されているベクターを提供する。
一実施形態では、本発明は、本明細書のどこかに記載されている核酸配列を含むベクターを提供する。
一部の実施形態では、本発明は、本明細書に記載の抗ＨＬＡ－Ａ２抗体のいずれかをコードする核酸を含むベクターを提供する。他の実施形態では、本発明は、本明細書に記載のヒト化抗ＨＬＡ－Ａ２抗体のいずれかをコードする核酸を含むベクターを提供する。一部の実施形態では、本発明は、配列番号１３９、１４０、１４１、１４２、１４３、１４４、１４５、１４６、１４７、１４８、１４９、１５０、１５１、１５２、１５３、１５４、１５５、１５６、１５７又は１５８に定められる核酸配列を含む核酸を含むベクターを提供する。一部の実施形態では、本発明は、配列番号１３９、１４０、１４１、１４２、１４３、１４４、１４５、１４６、１４７、１４８、１４９、１５０、１５１、１５２、１５３、１５４、１５５、１５６、１５７又は１５８に対して、約８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％の同一性を有する核酸配列を含む核酸を含むベクターを提供する。特定の態様において、該ベクターを含む宿主細胞が提供される。
一実施形態では、本発明は、本発明のＣＡＲをコードする核酸を含むベクターを提供する。一部の実施形態では、本発明は、配列番号１６３、１６４、１６５、１６６、１６７、１６８、１６９、１７０、１７１、１７２、１７３、１７４、１７５、１７６、１７７、１７８、１７９、１８０、１８１、１８２又は２１４に定められる核酸配列を含むベクターを提供する。一部の実施形態では、本発明は、配列番号１６３、１６４、１６５、１６６、１６７、１６８、１６９、１７０、１７１、１７２、１７３、１７４、１７５、１７６、１７７、１７８、１７９、１８０、１８１、１８２又は２１４に対して、約８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％の同一性を有する核酸配列を含む核酸を含むベクターを提供する。
一実施形態では、本発明のベクターは、細胞に形質導入されてよい。一実施形態では、本発明のベクターは、非ウイルスベクター法によりヒト細胞に形質導入されるか、又は遺伝子操作されてよい。一実施形態では、本発明のベクターを免疫細胞に形質導入することができる。一実施形態では、免疫細胞は制御性免疫細胞である。一実施形態では、免疫細胞は制御性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）である。一実施形態では、免疫細胞はＴ細胞である。一実施形態では、Ｔ細胞はＴｒｅｇであってよい。一実施形態では、ベクターは、哺乳類免疫細胞においてＣＡＲを発現することができる。一実施形態では、哺乳類免疫細胞はヒト免疫細胞である。一実施形態では、ベクターは、哺乳類制御性免疫細胞においてＣＡＲを発現することができる。一実施形態では、哺乳類制御性免疫細胞は、ヒト制御性免疫細胞である。一実施形態では、ベクターは、哺乳類Ｔ細胞においてＣＡＲを発現することができる。一実施形態では、哺乳類Ｔ細胞は、哺乳類制御性Ｔ細胞である。一実施形態では、哺乳類Ｔ細胞はヒトＴ細胞である。一実施形態では、哺乳類Ｔ細胞はヒト制御性Ｔ細胞である。
一実施形態では、ベクターは、例えば、１つ以上のプラスミド（例えば発現プラスミド、クローニングベクター、ミニサークル、ミニベクター、二重微小染色体）、レトロウイルスベクターコンストラクト及びレンチウイルスベクターコンストラクトを含むが、これらに限定されないクローニングベクター又は発現ベクターである。
本発明は、細胞に直接形質導入できるＣＡＲを発現するレトロウイルスベクターコンストラクト及びレンチウイルスベクターコンストラクトを含む。レンチウイルス等のレトロウイルス由来のベクターは、導入遺伝子の長期にわたる安定した組込みと娘細胞でのその増殖を可能にするので、長期的な遺伝子導入を実現するのに適したツールである。レンチウイルスベクターには、肝細胞等の非増殖細胞を形質導入できるという点で、マウス白血病ウイルス等の腫瘍レトロウイルスに由来するベクターよりも優れた利点がある。また、免疫原性が低いというさらなる利点もある。
要約すると、ＣＡＲをコードする天然又は合成の核酸の発現は、典型的には、ＣＡＲポリペプチド又はその一部をコードする核酸をプロモーターに操作可能に連結し、該コンストラクトを発現ベクターに組み込むことによって達成される。ベクターは、真核生物の複製と統合に適切であり得る。典型的なクローニングベクターは、所望の核酸配列の発現の調節に有用な転写及び翻訳のターミネーター、開始配列及びプロモーターを含む。
上記の方法に加えて、以下の方法が用いられてもよい。
本発明の発現コンストラクトは、標準的な遺伝子送達プロトコルを用いて、核酸免疫化と遺伝子治療に用いられてもよい。遺伝子送達の方法は、当技術分野において公知である。例えば、米国特許第５，３９９，３４６号、第５，５８０，８５９号、第５，５８９，４６６号（その全体が参照により本明細書に組み込まれる）を参照されたい。別の実施形態では、本発明は、遺伝子治療ベクターを提供する。別の実施形態では、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９又はＴＡＬＥＮベースの技術等のゲノム編集技術を用いて、本発明のＣＡＲをコードする核酸をレシピエント免疫細胞のゲノムに導入することができる（Ｄｅｌｈｏｖｅ，Ｊ．Ｍ．Ｋ．Ｍ．，他、２０１７；Ｅｙｑｕｅｍ，Ｊ．他、２０１７）。
核酸は多くの種類のベクターにクローニングすることができる。例えば、核酸は、プラスミド、ファージミド、ファージ誘導体、動物ウイルス及びコスミドを含むが、これらに限定されないベクターにクローニングすることができる。特に興味深いベクターには、発現ベクター、複製ベクター、プローブ生成ベクター及び配列決定ベクターが含まれる。
更に、発現ベクターは、ウイルスベクターの形で細胞に提供されてよい。ウイルスベクター技術は当技術分野において周知であり、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ他（２００１年、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ）や他のウイルス学及び分子生物学のマニュアルに記載されている。ベクターとして有用なウイルスには、レトロウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、ヘルペスウイルス、ポックスウイルス及びレンチウイルス等が含まれるが、これらに限定されない（例えば米国特許第５，３５０，６７４号及び第５，５８５，３６２号を参照されたい）。概して、適切なベクターは、少なくとも１つの生物において機能する複製起点と、プロモーター配列と、便利な制限エンドヌクレアーゼ部位と、１つ以上の選択マーカーとを含む（例えばＷＯ０１／９６５８４；ＷＯ０１／２９０５８；及び米国特許第６，３２６，１９３号）。
哺乳類細胞へのトランスフェクションのために、多くのウイルスベースの系が開発されている。例えば、レトロウイルスは、遺伝子送達システムに便利なプラットフォームを提供する。選択された遺伝子は、当技術分野において公知の技術を用いて、ベクターに挿入し、レトロウイルス粒子にパッケージ化することができる。次いで、組換えウイルスを単離し、インビボ又はエクスビボのいずれかにおいて対象の細胞に送達することができる。当技術分野では、多くのレトロウイルス系が公知である。一部の実施形態では、アデノウイルスベクターが用いられる。当技術分野では、多くのアデノウイルスベクターが公知である。一実施形態では、レンチウイルスベクターが用いられる。
追加の転写活性エレメント、例えばプロモーターやエンハンサーは、転写開始の頻度を調節することができる。典型的には、コアプロモーターに関して、これらは開始部位の３０－１１０ｂｐ上流の領域に位置するが、最近では、多くのプロモーターが開始部位の下流にも機能エレメントを含むことと、エンハンサー要素は一般に開始部位の５００～２０００ｂｐ上流に位置することが示されている。プロモーターエレメント間の間隔は高頻度に変更可能であるので、エレメントが互いに反転又は移動してもプロモーター機能は保存される。チミジンキナーゼ（ｔｋ）プロモーターでは、活性が低下し始める前に、プロモーターエレメント間の間隔を５０ｂｐに広げることができる。プロモーターに応じて、個々のエレメントが協調的に又は独立して機能して、転写を活性化することができるようである。
適切なプロモーターの一例は、最初期サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーター配列である。このプロモーター配列は、それに操作可能に連結された任意のポリヌクレオチド配列の高レベルの発現を駆動することが可能である、強力な構成的プロモーター配列である。適切なプロモーターの別の例は、伸長成長因子－１α（ＥＦ－１α）である。適切なプロモーターの別の例は、ホスホグリセリン酸キナーゼ（ＰＧＫ）プロモーターである。しかしながら、シミアンウイルス４０（ＳＶ４０）初期プロモーター、マウス乳腺腫瘍ウイルス（ＭＭＴＶ）、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）末端反復配列（ＬＴＲ）プロモーター、ＭｏＭｕＬＶプロモーター、トリ白血病ウイルスプロモーター、エプスタインバールウイルス最初期プロモーター、ラウス肉腫ウイルスプロモーターだけでなく、限定されないが、アクチンプロモーター、ミオシンプロモーター、ヘモグロビンプロモーター、及びクレアチンキナーゼプロモーター等のヒト遺伝子プロモーターを含むが、これらに限定されない他の構成的プロモーター配列も用いることができる。更に、本発明は、構成的プロモーターの使用に限定されるべきではない。誘導性プロモーターも本発明の一部として意図される。誘導性プロモーターの使用は、そのような発現が望まれるときに操作可能に連結されたポリヌクレオチド配列の発現をオンにし、又は発現が望まれないときに発現をオフにすることが可能である分子スイッチを提供する。誘導性プロモーターの例には、メタロチオニンプロモーター、グルココルチコイドプロモーター、プロゲステロンプロモーター、及びテトラサイクリンプロモーター等が含まれるが、これらに限定されない。
ＣＡＲポリペプチド又はその部分の発現を評価するために、細胞に導入される発現ベクターは、選択マーカー遺伝子又はレポーター遺伝子のいずれか、又はその両方を含んで、ウイルスベクターを介してトランスフェクション又は感染させようとする細胞集団からの発現細胞の同定及び選択を容易にすることができる。他の態様では、選択マーカーは、ＤＮＡの別々の断片上で運ばれ、同時トランスフェクション手順において用いることができる。選択マーカーとレポーター遺伝子の両方に、宿主細胞における発現を可能にする適切な制御配列が隣接してもよい。有用な選択マーカーには、例えば、ネオ等の抗生物質耐性遺伝子が含まれる。
レポーター遺伝子は、トランスフェクトされる可能性のある細胞を特定し、制御配列の機能を評価するために用いられる。概して、レポーター遺伝子は、レシピエント生物若しくは組織に存在しないか、又は発現されない遺伝子であり、いくつかの容易に検出可能な特性、例えば酵素活性によってその発現が明示されるポリペプチドをコードする遺伝子である。レポーター遺伝子の発現は、ＤＮＡがレシピエント細胞に導入された後の適切な時間にアッセイされる。適切なレポーター遺伝子は、ルシフェラーゼ、ベータ－ガラクトシダーゼ、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ、分泌型アルカリホスファターゼ又は緑色蛍光タンパク質遺伝子をコードする遺伝子を含んでよい（例えばＵｉ－Ｔｅｉ他、２０００ ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔｅｒｓ ４７９：７９－８２）。適切な発現系は周知であり、公知の技術を用いて調製するか、商業的に入手してもよい。概して、レポーター遺伝子の最高レベルの発現を示す最小の５’隣接領域を有するコンストラクトが、プロモーターとして同定される。そのようなプロモーター領域は、レポーター遺伝子に連結することができ、プロモーター駆動転写を調節する能力について薬剤を評価するために用いてもよい。
遺伝子を細胞に導入し発現させる方法は、当技術分野において公知である。発現ベクターとの関連において、ベクターは、当技術分野の任意の方法により、宿主細胞、例えば哺乳類、細菌、酵母又は昆虫の細胞に容易に導入することができる。例えば、発現ベクターは、物理的、化学的又は生物学的な手段によって、宿主細胞にトランスフェクトすることができる。
ポリヌクレオチドを宿主細胞に導入する物理的方法には、リン酸カルシウム沈殿、リポフェクション、微粒子銃、マイクロインジェクション、エレクトロポレーション等が含まれる。ベクター及び／又は外来核酸を含む細胞を産生する方法は、当技術分野において周知である（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ他、２００１年を参照）。例えば、ポリヌクレオチドは、リン酸カルシウムトランスフェクションによって宿主細胞に導入してよい。或いは、エレクトロポレーションにより、宿主細胞にＲＮＡ等のポリヌクレオチドをトランスフェクトしてよい（例えばＷＯ２００７／０６５９５７を参照）。
ポリヌクレオチドを宿主細胞に導入する化学的手段には、巨大分子複合体、ナノカプセル、ミクロスフェア、ビーズ等のコロイド分散系と、水中油型エマルジョン、ミセル、混合ミセル、及びリポソームを含む脂質ベース系が含まれる。インビトロ及びインビボにおいて送達媒体として用いるための例示的なコロイド系は、リポソーム（例えば人工膜小胞）である。標的ナノ粒子又は他の適切なサブミクロンサイズの送達系によるポリヌクレオチドの送達等の、最先端の核酸の標的送達の他の方法が利用可能である。
非ウイルス送達系が利用される場合、例示的な送達ビヒクルはリポソームである。脂質製剤の使用が、核酸の宿主細胞への導入（インビトロ、エクスビボ又はインビボ）のために企図される。別の態様では、核酸は脂質と会合してもよい。脂質と会合した核酸は、リポソームの水性内部に封入され、リポソームの脂質二重層内に散在し、リポソームとオリゴヌクレオチドの両方に結合している連結分子を介してリポソームに付着し、リポソームに閉じ込められ、リポソームと錯体を形成し、脂質を含む溶液中に分散し、脂質と混合され、脂質と組み合され、脂質中の懸濁液として含有され、ミセルとともに含まれ若しくはミセルと錯体を形成し、又は他の方法で脂質と結合してよい。脂質、脂質／ＤＮＡ又は脂質／発現ベクター関連組成物は、溶液中の特定の構造に限定されない。例えば、ミセルとしての、又は「崩壊した」構造を有する二重層構造で存在し得る。また、単純に溶液中に散在し、サイズや形状が均一ではない凝集体を形成する可能性もある。脂質は、天然に存在する又は合成の脂質であり得る脂肪物質である。例えば、脂質は、細胞質に自然に発生する脂肪滴と、脂肪酸、アルコール、アミン、アミノアルコール、及びアルデヒド等の長鎖脂肪族炭化水素とその誘導体を含む化合物のクラスとを含む。
使用に適する脂質は、商業的供給源から入手することができる。例えば、ジミリスチルホスファチジルコリン（「ＤＭＰＣ」）は、Ｓｉｇｍａ（ミズーリ州セントルイス）から入手可能であり、リン酸ジセチル「“ＤＣＰ））は、Ｋ＆Ｋ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（ニューヨーク州プレインビュー）から入手可能であり、コレステロール（「Ｃｈｏｉ」）はＣａｌｂｉｏｃｈｅｍ－Ｂｅｈｒｉｎｇから入手可能であり、ジミリスチルホスファチジルグリセロール（「ＤＭＰＧ」）及び他の脂質は、Ａｖａｎｔｉ Ｐｏｌａｒ Ｌｉｐｉｄｓ，Ｉｎｃ．（アラバマ州バーミンガム）から入手可能である。クロロホルム又はクロロホルム／メタノール中の脂質の貯蔵液は、約－２０℃で保存することができる。クロロホルムはメタノールよりも蒸発しやすいので、唯一の溶媒として用いられる。「リポソーム」は、封入された脂質二重層又は凝集体の生成によって形成された、様々な単層及び多層の脂質ビヒクルを包含する総称である。リポソームは、リン脂質二重層膜と内部水性媒体を有する小胞構造を有するものとして特徴付けることができる。多重膜リポソームは、水性媒体によって分離された複数の脂質層を有する。リン脂質が過剰な水溶液に懸濁されると、自然に形成される。脂質成分は、閉じた構造が形成される前に自己再配列を受け、脂質二重層の間に水と溶解した溶質を閉じ込める（Ｇｈｏｓｈ他、１９９１）。しかしながら、通常の小胞構造とは異なる溶液構造を有する組成物も包含される。例えば、脂質は、ミセル構造をとってもよいし、脂質分子の不均一な凝集体として存在するだけであってもよい。リポフェクトアミン－核酸複合体も企図される。
外来核酸を宿主細胞に導入するために用いられる方法に関係なく、宿主細胞内の組換えＤＮＡ配列の存在を確認するために、様々なアッセイを実施してよい。そのようなアッセイには、例えば、当業者に周知の「分子生物学的」アッセイ（サザンブロット及びノーザンブロット、ＲＴ－ＰＣＲ及びＰＣＲ等）や、「生化学的」アッセイ（例えば免疫学的手段（ＥＬＩＳＡ及びウエスタンブロット）によるか、又は本発明の範囲に含まれる薬剤を特定するための本明細書に記載のアッセイによって特定のペプチドの有無を検出すること）が含まれる。
ＶＩ．ＣＡＲ改変免疫細胞
本発明のＣＡＲをコードする核酸は、免疫細胞に導入して、本発明のＣＡＲを発現するＣＡＲ改変免疫細胞を作製することができ、改変免疫細胞は本明細書に開示されるように使用される。また、ＣＡＲ改変免疫細胞は、本明細書では「ＣＡＲ遺伝子操作免疫細胞」と呼ばれることもある。一実施形態では、本明細書のどこかに記載されているＣＡＲを含む改変免疫細胞が提供される。別の実施形態では、本明細書のどこかに記載されている発現ベクターを含む免疫細胞が提供される。免疫細胞は、細胞療法での使用に適した任意の免疫細胞であってよい。一実施形態では、免疫細胞はヒト免疫細胞であってよい。
一実施形態では、免疫細胞は、リンパ球、骨髄由来細胞及びそれらの任意の組合せから成る群から選択される。一実施形態では、リンパ球は、Ｔ細胞、Ｂ細胞、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞及びそれらの任意の組合せから成る群から選択される。一実施形態では、免疫細胞はＴ細胞である。一実施形態では、Ｔ細胞は、ＣＤ４＋Ｔ細胞、ＣＤ８＋Ｔ細胞、γδＴ細胞、ダブルネガティブ（ＤＮ）Ｔ細胞及びそれらの任意の組合せから成る群から選択される。一実施形態では、ＣＤ４＋Ｔ細胞は、ヘルパーＴ細胞、制御性Ｔ細胞及びそれらの任意の組合せから成る群から選択される。一実施形態では、免疫細胞は制御性Ｔ細胞である。一実施形態では、Ｔｒｅｇは、胸腺由来Ｔｒｅｇ、又は適応Ｔｒｅｇ若しくは誘導Ｔｒｅｇである。一実施形態では、Ｔｒｅｇは、ＣＤ４＋ＦＯＸＰ３＋制御性Ｔ細胞又はＣＤ４＋ＦＯＸＰ３－制御性Ｔ細胞（ＴＲ１細胞）である。一実施形態では、ＴｒｅｇはＣＤ４＋ＦＯＸＰ３＋制御性Ｔ細胞である。一実施形態では、ＴｒｅｇはＣＤ４＋ＦＯＸＰ３－制御性Ｔ細胞（ＴＲ１細胞）である。一実施形態では、ＣＤ８＋Ｔ細胞は、細胞傷害性ＣＤ８＋Ｔ細胞又はＣＤ８＋制御性Ｔ細胞である。一実施形態では、ＣＤ８＋Ｔ細胞はＣＤ８＋制御性Ｔ細胞である。一実施形態では、ＣＤ８＋制御性Ｔ細胞は、ＣＤ８＋ＣＤ２８－制御性Ｔ細胞、ＣＤ８＋ＣＤ１０３＋制御性Ｔ細胞、ＣＤ８＋ＦｏｘＰ３＋制御性Ｔ細胞、ＣＤ８＋ＣＤ１２２＋制御性Ｔ細胞及びそれらの任意の組合せから成る群から選択される。一実施形態では、ＣＤ８＋制御性Ｔ細胞は、ＩＮＦγ＋ＩＬ１０＋ＩＬ３４＋ＣＤ８＋ＣＤ４５ＲＣｌｏｗ制御性Ｔ細胞である。一実施形態では、γδＴ細胞は制御性γδＴ細胞である。一実施形態では、ＤＮ Ｔ細胞は制御性ＤＮ Ｔ細胞である。一実施形態では、免疫細胞はＢ細胞である。一実施形態では、Ｂ細胞は制御性Ｂ細胞である。一実施形態では、制御性Ｂ細胞は、ＣＤ１９＋ＣＤ２４ｈｉＣＤ３８ｈｉＢ細胞である。一実施形態では、ＮＫ細胞は制御性ＮＫ細胞である。一実施形態では、骨髄由来細胞は、好中球、好酸球、好塩基球、単球、マクロファージ、樹状細胞又はそれらの任意の組合せから成る群から選択される。一実施形態では、マクロファージは制御性マクロファージである。一実施形態では、樹状細胞は制御性樹状細胞である。
一実施形態では、免疫細胞は制御性免疫細胞である。免疫細胞は、細胞療法での使用に適した任意の制御性免疫細胞であってよい（例えばＷｏｏｄ，Ｋ．Ｊ．他、２０１２；Ｐａｐｐ，Ｇ．他、２０１７を参照）。一実施形態では、制御性免疫細胞は、ヒト制御性免疫細胞であってよい。一実施形態では、制御性免疫細胞は、制御性Ｔ細胞、ＣＤ４＋制御性Ｔ細胞、ＣＤ８＋制御性Ｔ細胞、制御性γδＴ細胞、制御性ＤＮ Ｔ細胞、制御性Ｂ細胞、制御性ＮＫ細胞、制御性マクロファージ、制御性樹状細胞及びそれらの任意の組合せから成る群から選択される。一実施形態では、制御性免疫細胞はＣＤ８＋制御性Ｔ細胞である（例えばＧｕｉｌｌｏｎｎｅａｕ，Ｃ．他、２０１０年を参照）。一実施形態では、ＣＤ８＋制御性Ｔ細胞は、ＣＤ８＋ＣＤ２８－制御性Ｔ細胞、ＣＤ８＋ＣＤ１０３＋制御性Ｔ細胞、ＣＤ８＋ＦｏｘＰ３＋制御性Ｔ細胞、ＣＤ８＋ＣＤ１２２＋制御性Ｔ細胞及びそれらの任意の組合せから成る群から選択される。一実施形態では、ＣＤ８＋制御性Ｔ細胞は、ＩＮＦγ＋ＩＬ１０＋ＩＬ３４＋ＣＤ８＋ＣＤ４５ＲＣｌｏｗ制御性Ｔ細胞である。一実施形態では、制御性免疫細胞は制御性γδＴ細胞である（例えばＷｅｓｃｈ，Ｄ．，他、２０１４を参照）。一実施形態では、免疫細胞は制御性ＤＮ Ｔ細胞である（例えばＪｕｖｅｔ，Ｓ．Ｃ．，他、２０１２を参照）。一実施形態では、制御性免疫細胞は制御性Ｂ細胞である（例えばＣｈｏｎｇ，Ａ．Ｓ．，他、２０１７を参照）。一実施形態では、制御性Ｂ細胞はＣＤ１９＋ＣＤ２４ｈｉＣＤ３８ｈｉＢ細胞である。一実施形態では、制御性免疫細胞は制御性ＮＫ細胞である（例えばＦｕ，Ｂ．他、２０１３；Ｃｒｏｍｅ，Ｓ．Ｑ．，他、２０１３；Ｃｒｏｍｅ，Ｓ．Ｑ．，他、２０１７を参照）。一実施形態では、制御性免疫細胞は制御性マクロファージである（例えばＨｕｔｃｈｉｎｓｏｎ，Ｊ．Ａ．，他、２０１７を参照）。一実施形態では、制御性免疫細胞は制御性樹状細胞である。一実施形態では、制御性免疫細胞は制御性Ｔ細胞である。一実施形態では、Ｔｒｅｇは、胸腺由来のＴｒｅｇ又は適応Ｔｒｅｇ若しくは誘導Ｔｒｅｇである。一実施形態では、Ｔｒｅｇは、ＣＤ４＋ＦＯＸＰ３＋制御性Ｔ細胞又はＣＤ４＋ＦＯＸＰ３－制御性Ｔ細胞（ＴＲ１細胞）である。一実施形態では、ＴｒｅｇはＣＤ４＋ＦＯＸＰ３＋制御性Ｔ細胞である。一実施形態では、ＴｒｅｇはＣＤ４＋ＦＯＸＰ３－制御性Ｔ細胞（ＴＲ１細胞）である。
一実施形態では、制御性免疫細胞は以下の表現型を有する：ＣＤ４＋ＣＤ２５＋、例えばＣＤ４＋ＣＤ２５＋ＣＤ１２７－等、例えばＣＤ４＋ＣＤ２５＋ＣＤ１２７－ＣＤ４５ＲＡ＋等。更なる実施形態では、制御性免疫細胞は、以下の表現型を有する：ＦｏｘＰ３＋ＣＤ４＋ＣＤ２５＋、例えばＦｏｘＰ３＋ＣＤ４＋ＣＤ２５＋ＣＤ１２７等、例えばＦｏｘＰ３＋ＣＤ４＋ＣＤ２５＋ＣＤ１２７－ＣＤ４５ＲＡ＋等。
一実施形態では、免疫制御性細胞は、以下の表現型のうちの少なくとも１つを呈する：ＣＤ４＋ＣＤ２５＋、ＦｏｘＰ３＋、ＣＤ１２７ｌｏ／－、ＣＴＬＡ－４＋、ＣＤ３９＋、Ｈｅｌｉｏｓ＋、ＣＤ６２Ｌ＋／ｈｉ、ＶＬＡ４＋、ＬＦＡ１＋、ＣＤ４９ｂｉｎｔ、ＩＴＧｂ７ｉｎｔ、ＰＳＧＬ－１＋、ＩＣＯＳ＋、ＧＩＴＲ＋、ＰＤ－１ｉｎｔ、Ｐｅｒｆｌｏ／－、ＣＣＲ７＋。一実施形態では、免疫制御性細胞は、グランザイムＡ及び／又はグランザイムＢを発現しない。
一実施形態では、分子の発現レベルの決定は、フローサイトメトリー、免疫蛍光又は画像分析、例えばハイコンテント分析によって実施される。好ましくは、分子の発現レベルの決定は、フローサイトメトリーによって実施される。一実施形態では、フローサイトメトリー分析を実施する前に、細胞を固定及び透過処理し、それにより細胞内タンパク質の検出を可能にする。
一実施形態では、細胞集団における分子の発現レベルの決定は、分子を発現する細胞集団の細胞の割合（すなわち分子について「＋」である細胞）を決定することを含む。好ましくは、分子を発現する細胞の前記割合は、ＦＡＣＳにより測定される。
用語「発現する（又は＋）」及び「発現しない（又は－）」は、当技術分野において周知であり、目的の細胞マーカーの発現レベルを指し、「＋」に対応する細胞マーカーの発現レベルは高いか中程度であり、「＋／－」とも呼ばれ、「－」に対応する細胞マーカーの発現レベルはヌルである。
用語「低い（ｌｏｗ）」又は「低（ｌｏ）」又は「低／なし（ｌｏ／－）は、当技術分野において周知であり、全体として分析されている細胞集団におけるその細胞マーカーの発現レベルと比較すると、細胞マーカーの発現レベルは低いという点での目的の細胞マーカーの発現レベルを指す。より具体的には、「低い（ｌｏ）」という用語は、１つ以上の他の異なる細胞集団よりも低いレベルで細胞マーカーを発現する細胞の異なる集団を指す。
用語「高い（ｈｉｇｈ）」又は「高（ｈｉ）」又は「明るい（ｂｒｉｇｈｔ）」は、当技術分野において周知であり、全体として分析されている細胞集団におけるその細胞マーカーの発現レベルと比較すると、細胞マーカーの発現レベルは高いという点での目的の細胞マーカーの発現レベルを指す。
一般に、染色強度の上位２、３、４又は５％の細胞は「高」と指定され、集団の上位半分に属する細胞は「＋」として分類される。蛍光強度が５０％未満になる細胞は「低」細胞と指定され、５％未満は「－」細胞と指定される。
目的の細胞マーカーの発現レベルは、このマーカーに特異的な蛍光標識抗体によって染色された細胞集団の細胞の蛍光強度中央値（ＭＦＩ）を、無関係の特異性を有するが同じアイソタイプと同じ蛍光プローブを有し、かつ同じ種に由来する蛍光標識抗体（アイソタイプ対照と呼ばれる）によって染色された同じ細胞集団の細胞の蛍光強度（ＦＩ）と比較することによって決定される。このマーカーに特異的な蛍光標識抗体で染色され、アイソタイプ対照で染色された細胞と比べて同等のＭＦＩ又は低いＭＦＩを示す集団の細胞は、このマーカーを発現しておらず、（－）又は陰性と指定される。このマーカーに特異的な蛍光標識抗体で染色され、アイソタイプ対照で染色された細胞よりも優れたＭＦＩ値を示す集団の細胞は、このマーカーを発現しており、（＋）又は陽性と指定される。
一実施形態では、本発明の免疫細胞は、その細胞表面に、本発明のＣＡＲと、ＨＬＡ－Ａ２以外の別のリガンドに結合する別の受容体（本明細書では「第２の受容体」と呼ぶ）とを発現する。本発明によれば、この第２の受容体は、前述のように、細胞外リガンド結合ドメインと、必要に応じてヒンジと、必要に応じて膜貫通ドメインと、細胞内シグナル伝達ドメインとを含む。
一実施形態では、第２の受容体は内在性である（例えば内在性ＴＣＲ等）。別の実施形態では、第２の受容体は外来性であり、その発現は、それをコードする核酸の形質転換又は形質導入により、本発明の免疫細胞において誘導される。前記外来性受容体は、外来性のＴＣＲ又はキメラ抗原受容体であってよい。したがって、一実施形態では、本発明の免疫細胞は２つのキメラ抗原受容体を発現し、１つ目はＨＬＡ－Ａ２を認識し、２つ目は別々のリガンドを認識する。
別の実施形態では、本発明の免疫細胞は、その細胞表面に、本発明のＣＡＲと、ＨＬＡ－Ａ２の別のエピトープに結合する別の受容体（本明細書では「第２の受容体」と呼ぶ）を発現する。本発明によれば、この第２の受容体は、前述のように、細胞外リガンド結合ドメインと、必要に応じてヒンジと、必要に応じて膜貫通ドメインと、細胞内シグナル伝達ドメインとを含む。
別の実施形態では、本発明の免疫細胞は２つのＣＡＲを発現し、１つ目はＨＬＡ－Ａ２の第１のエピトープを認識し、２つ目はＨＬＡ－Ａ２上の別々のエピトープを認識する。
一実施形態では、本発明のＣＡＲは第１の細胞内シグナル伝達ドメインを含み、第２の受容体は別々の第２の細胞内シグナル伝達ドメインを含む。第１の実施形態では、本発明のＣＡＲは、Ｔ細胞一次シグナル伝達ドメイン（例えばＣＤ３ゼータ等）を含み、第２の受容体は共刺激シグナル伝達ドメイン（例えば４－１ＢＢ、ＣＤ２８、又は４－１ＢＢとＣＤ２８の共刺激シグナル伝達ドメインの組合せ等）を含む。第２の実施形態では、本発明のＣＡＲは共刺激シグナル伝達ドメイン（例えば４－１ＢＢ、ＣＤ２８、又は４－１ＢＢとＣＤ２８の共刺激シグナル伝達ドメインの組合せ等）を含み、第２の受容体はＴ細胞一次シグナル伝達ドメイン（例えばＣＤ３ゼータ等）を含む。
したがって、これらの実施形態によれば、本発明の免疫細胞の完全な活性化には、本発明のＣＡＲのＨＬＡ－Ａ２への結合と、第２受容体のそれが向けられているリガンドへの結合の両方が必要である。
一実施形態では、第２の受容体によって認識されるリガンドは、病気の組織若しくは器官、又は自己免疫応答の部位に発現又は存在する。
第２の受容体によって認識され得るリガンドの例には、一般的なヒトの食事からの食物抗原、自己抗原、吸入アレルゲン、摂取アレルゲン又は接触アレルゲン等が含まれるが、これらに限定されない。
「一般的なヒトの食事からの食物抗原」という用語は、以下の非限定的な列挙の食物抗原等、ヒトにとって一般的な食物に由来する免疫原性ペプチドを指す：リポカリン等のウシ抗原の、Ｃａ結合Ｓ１００、α－ラクトアルブミン、ベータ－ラクトグロブリン等のラクトグロブリン、ウシ血清アルブミン、カゼイン。食物抗原は、パルブアルブミン等のタイセイヨウサケ抗原；例えばオボムコイド、オボアルブミン、Ａｇ２２、コンアルブミン、リゾチーム又はニワトリ血清アルブミン等のニワトリ抗原；ピーナッツ抗原；トロポミオシン等のエビ抗原；アグルチニン又はグリアジン等のコムギ抗原；セロリプロフィリン等のセロリ抗原；ニンジンプロフィリン等のニンジン抗原；ソーマチン、リンゴ脂質転移タンパク質、又はリンゴプロフィリン等のリンゴ抗原；ナシプロフィリン又はイソフラボン還元酵素等のナシ抗原；エンドキチナーゼ等のアボカド抗原；アプリコット脂質転移タンパク質等のアプリコット抗原；モモ脂質転移タンパク質又はモモプロフィリン等のモモ抗原；ＨＰＳ、大豆プロフィリン又は（ＳＡＭ２２）ＰＲ－Ｉ０ ｐｒｏｔ等の大豆抗原；それらの断片、変異体及び混合物であってもよい。
一実施形態では、前記自己抗原は、多発性硬化症関連抗原、関節関連抗原、眼関連抗原、ヒトＨＳＰ抗原、皮膚関連抗原、又は移植片拒絶反応若しくはＧＶＨＤに関与する抗原である。
用語「多発性硬化症関連抗原」は、ミエリン塩基性タンパク質（ＭＢＰ）、ミエリン関連糖タンパク質（ＭＡＧ）、ミエリンオリゴデンドロサイト糖タンパク質（ＭＯＧ）、プロテオリピドタンパク質（ＰＬＰ）、オリゴデンドロサイトミエリンオリゴタンパク質（ＯＭＧＰ）、ミエリン関連オリゴデンドロサイト塩基性タンパク質（ＭＯＢＰ）、オリゴデンドロサイト特異的タンパク質（ＯＳＰ／Ｃｌａｕｄｉｎｌ １）、熱ショックタンパク質、オリゴデンドロサイト特異的タンパク質（ＯＳＰ）、ＮＯＧＯ Ａ、糖タンパク質Ｐｏ、末梢ミエリンタンパク質２２（ＰＭＰ２２）、２’３’－サイクリックヌクレオチド３’－ホスホジエステラーゼ（ＣＮＰａｓｅ）、それらの断片、変異体及び混合物を指す。
用語「関節関連抗原」は、シトルリン置換型の環状及び直鎖状のフィラグリンペプチド、ＩＩ型コラーゲンペプチド、ヒトの軟骨糖タンパク質３９（ＨＣｇｐ３９）ペプチド、ＨＳＰ、異種核リボヌクレオタンパク質（ｈｎＲＮＰ）Ａ２ペプチド、ｈｎＲＮＰ Ｂ１、ｈｎＲＮＰ Ｄ、Ｒｏ６０／５２、ＨＳＰ６０、ＨＳＰ６５、ＨＳＰ７０及びＨＳＰ９０、ＢｉＰ、ケラチン、ビメンチン、フィブリノゲン、Ｉ型、ＩＩＩ型、ＩＶ型及びＶ型コラーゲンペプチド、アネキシンＶ、グルコース６リン酸イソメラーゼ（ＧＰＩ）、アセチルカルパスタチン、ピルビン酸デヒドロゲナーゼ（ＰＤＨ）、アルドラーゼ、トポイソメラーゼＩ、ｓｎＲＮＰ、ＰＡＲＰ、Ｓｃｌ－７０、Ｓｃｌ－１００、アニオン性のカルジオリピン及びホスファチジルセリン、中性に荷電したホスファチジルエタノールアミン及びホスファチジルコリンを含むリン脂質抗原、マトリックスメタロプロテアーゼ、フィブリリン、アグリカン、それらの断片、変異体及び混合物を指す。
用語「眼関連抗原」は、ＩＩ型コラーゲン、網膜アレスチン、Ｓ－アレスチン、光受容体間レチノイド結合タンパク質（ＩＲＢＰ１）、ベータ－クリスタリンＢ１、網膜タンパク質、脈絡膜タンパク質、並びにそれらの断片、変異体及び混合物を指す。
用語「ヒトＨＳＰ抗原」は、ヒトＨＳＰ６０、ＨＳＰ７０、ＨＳＰ９０、それらの断片、変異体及び混合物を指す。
皮膚関連抗原の例には、ケラチノサイト抗原、真皮又は表皮に存在する抗原、メラニン細胞抗原（例えばメラニン又はチロシナーゼ等）、デスモグレイン（デスモグレイン１又は３、Ｄｓｇ１／３と呼ばれることもある）、ＢＰ１８０、ＢＰ２３０、プレクチン、インテグリン（例えばインテグリンα４β６）、コラーゲン（例えばＶＩＩ型コラーゲン）、ラミニン（例えばラミニン３３２又はラミニンγ１）、プラキン（例えばエンボプラキン、ペリプラキン又はデスモプラキン）、ケラチン（例えばＫＲＴ５、ＫＲＴ８、ＫＲＴ１５、ＫＲＴ１７及びＫＲＴ３１）、ケラチンフィラメント関連タンパク質、フィラグリン、コルネオデスモシン及びエラスチンが含まれるが、これらに限定されない。
一実施形態では、リガンドは、移植片拒絶反応又はＧＶＨＤに関与する抗原である。そのような抗原の例には、移植組織又は宿主に特異的なＭＨＣ、β２－ミクログロブリン、ＡＢＯ系の抗原、アカゲザル系の抗原（特にＣ、ｃ、Ｅ ｅｔ ｅ及びＤ系の抗原）及びイソヘマグルチニンが含まれるが、これらに限定されない。移植片拒絶反応又はＧＶＨＤに関与する可能性のある抗原の他の例として、ＨＬＡ－ＤＲ（特に移植後最初の６ヶ月間）、ＨＬＡ－Ｂ（特に移植後最初の２年間）、マイナー組織適合抗原（ｍｉＨＡ、例えばＨＬＡ－Ｅ、ＨＬＡ－Ｆ及びＨＬＡ－Ｇ）、ＭＨＣクラスＩに対応するＨＬＡ（Ｂ及びＣ）、ＭＨＣクラスＩＩに対応するＨＬＡ（ＤＰ、ＤＭ、ＤＯＡ、ＤＯＢ、ＤＱ及びＤＲ）及びＭＨＣクラスＩＩＩに対応するＨＬＡ（例えば補体系の成分）が含まれるが、これらに限定されない。
自己抗原の他の例には、限定されないが、アクアポリン水チャネル（例えばアクアポリン４水チャネル（ＡＱＰ４）等）、Ｈｕ、Ｍａ２、コラプシン応答メディエータータンパク質５（ＣＲＭＰ５）、及びアンフィフィシン、電位開口型カリウムチャネル（ＶＧＫＣ）、Ｎ－メチル－ｄ－アスパラギン酸受容体（ＮＭＤＡＲ）、α－アミノ－３－ヒドロキシ－５－メチル－４－イソオキサゾールプロピオン酸（ＡＭＰＡＲ）、甲状腺ペルオキシダーゼ、サイログロブリン、抗Ｎ－メチル－Ｄ－アスパラギン酸受容体（ＮＲ１サブユニット）、Ｒｈ血液型抗原、Ｉ抗原、デスモグレイン１又は３（Ｄｓｇ１／３）、ＢＰ１８０、ＢＰ２３０、アセチルコリンニコチン性シナプス後受容体、甲状腺刺激ホルモン受容体、血小板インテグリン、ＧｐＩＩｂ：ＩＩＩａ、コラーゲン（例えばコラーゲンα－３（ＩＶ）鎖等）、リウマチ因子、カルパスタチン、シトルリン化タンパク質、ミエリン塩基性タンパク質（ＭＢＰ）、ミエリンオリゴデンドロサイト糖タンパク質（ＭＯＧ）ペプチド、α－β－クリスタリン、ＤＮＡ、ヒストン、リボソーム、ＲＮＰ、組織トランスグルタミナーゼ（ＴＧ２）、内因子、６５ｋＤａ抗原、ホスファチジルセリン、リボソームリンタンパク質、抗好中球細胞質抗体、Ｓｃｌ－７０、Ｕ１－ＲＮＰ、ＡＮＡ、ＳＳＡ、抗ＳＳＢ、抗核抗体（ＡＮＡ）、抗好中球細胞質抗体（ＡＮＣＡ）、Ｊｏ－１、抗ミトコンドリア抗体、ｇｐ２１０、ｐ６２、ｓｐ１００、抗リン脂質抗体、Ｕ１－７０ｋｄ ｓｎＲＮＰ、ＧＱ１ｂガングリオシド、ＧＭ１、アシアロＧＭ１、ＧＤ１ｂ、抗平滑筋抗体（ＡＳＭＡ）、抗肝臓腎臓ミクロソーム－１抗体（ＡＬＫＭ－１）、抗肝臓サイトゾル抗体－１（ＡＬＣ－１）、ＩｇＡ抗筋内膜抗体、好中球顆粒タンパク質、連鎖球菌細胞壁抗原、胃壁細胞の内因子、インスリン（ＩＡＡ）、グルタミン酸脱炭酸酵素（ＧＡＡ又はＧＡＤ）及びタンパク質チロシンホスファターゼ（例えばＩＡ２又はＩＣＡ５１２等）、ＰＬＡ２Ｒ１及びＴＨＳＤ７Ａ１が含まれる。
一実施形態では、前記リガンドは、オボアルブミン、ＭＯＧ、ＩＩ型コラーゲン、それらの断片、変異体及び混合物を含む群から選択される。
一実施形態では、前記リガンドは、オボアルブミン、その断片、変異体及び混合物である。
別の実施形態では、前記リガンドは、ＭＯＧ、その断片、変異体及び混合物である。
別の実施形態では、前記リガンドは、ＩＩ型コラーゲン、その断片、変異体及び混合物である。
別の実施形態では、前記リガンドは、ＩＬ２３Ｒ、その断片、変異体及び混合物である。
一実施形態では、本発明のＣＡＲは、ＨＬＡ－Ａ２とは異なるリガンドを認識する細胞外リガンド結合ドメインを更に含む。一実施形態では、前記リガンド結合ドメインは、抗体又はその抗原結合断片である。
一実施形態では、本発明のＣＡＲのリガンド結合ドメインは、ＨＬＡ－Ａ２上の複数の異なるエピトープを認識する多機能抗体である。一実施形態では、本発明のＣＡＲのリガンド結合ドメインは、ＨＬＡ－Ａ２上の２つの別々のエピトープを認識する二機能性抗体である。
一実施形態では、本発明のＣＡＲは、ＨＬＡ－Ａ２結合ドメインとＨＬＡ－Ａ２とは異なるリガンドを認識する別のリガンド結合ドメインとを含む細胞外リガンド結合ドメインを含む。一実施形態では、前記リガンド結合ドメインは、ＨＬＡ－Ａ２と別のリガンドとの両方を認識する二機能性抗体である。
本発明のＣＡＲによって認識され得るＨＬＡ－Ａ２とは異なるリガンドの例は、上記に列挙されている。
一実施形態では、本発明のＣＡＲ改変免疫細胞は、所望のＣＡＲを含むレンチウイルスベクターを細胞に導入することによって生成してよい。一実施形態では、ＣＡＲを発現するように改変された免疫細胞を作製する方法が提供され、本方法は、本明細書のどこかに記載されているベクターを用いて免疫細胞に形質導入し、それによって前記改変免疫細胞を生成することを含む。
一実施形態では、本発明の遺伝子改変免疫細胞は、ＲＮＡの導入を通して改変される。一実施形態では、インビトロ転写ＲＮＡ ＣＡＲは、一時的トランスフェクションの形態として細胞に導入することができる。ＲＮＡは、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）生成鋳型を用いたインビトロ転写によって産生されてよい。任意の供給源からの目的ＤＮＡは、適切なプライマーとＲＮＡポリメラーゼを用いて、インビトロｍＲＮＡ合成用の鋳型にＰＣＲによって直接変換することができる。ＤＮＡの供給源は、例えば、ゲノムＤＮＡ、プラスミドＤＮＡ、ファージＤＮＡ、ｃＤＮＡ、合成ＤＮＡ配列、又は他の適切なＤＮＡ供給源であってよい。インビトロ転写のための望ましい鋳型は、本発明のＣＡＲである。
一実施形態では、ＰＣＲに用いられるＤＮＡはオープンリーディングフレームを含む。該ＤＮＡは、生物のゲノムからの自然発生ＤＮＡ配列に由来してよい。一実施形態では、該ＤＮＡは、目的遺伝子の全長又は遺伝子の一部である。該遺伝子は、５’及び／若しくは３’非翻訳領域（ＵＴＲ）の一部又は全部を含むことができる。該遺伝子は、エクソンとイントロンを含むことができる。一実施形態では、ＰＣＲに用いられるＤＮＡはヒト遺伝子である。別の実施形態では、ＰＣＲに用いられるＤＮＡは、５’及び３’ＵＴＲを含むヒト遺伝子である。或いは、該ＤＮＡは、天然に存在する生物では通常発現されない人工ＤＮＡ配列であってよい。例示的な人工ＤＮＡ配列は、融合タンパク質をコードするオープンリーディングフレームを形成するように一緒に連結された、遺伝子の部分を含むものである。一緒に連結されるＤＮＡの部分は、単一の生物又は２種以上の生物に由来してよい。
ＰＣＲを用いて、トランスフェクションに用いられるｍＲＮＡのインビトロ転写用の鋳型を生成することができる。ＰＣＲを実施する方法は、当技術分野において周知である。ＰＣＲに用いられるプライマーは、ＰＣＲの鋳型として用いられるＤＮＡの領域と実質的に相補的な領域を有するように設計される。本明細書において用いられる場合、「実質的に相補的」とは、プライマー配列の大部分又は全部の塩基が相補的であるか、又は１つ以上の塩基が非相補的若しくは不適合であるヌクレオチドの配列を指す。実質的に相補的な配列は、ＰＣＲに用いられるアニーリング条件下で、意図するＤＮＡ標的とアニーリング又はハイブリダイズすることが可能である。プライマーは、ＤＮＡ鋳型のいずれの部分にも実質的に相補的であるように設計することができる。例えば、プライマーは、５’及び３’ＵＴＲを含む、細胞において通常転写される遺伝子の部分（オープンリーディングフレーム）を増幅するように設計することができる。プライマーは、目的の特定のドメインをコードする遺伝子の一部を増幅するように設計することもできる。一実施形態では、プライマーは、５’及び３’ＵＴＲの全部又は一部を含む、ヒトｃＤＮＡのコード領域を増幅するように設計される。ＰＣＲに有用なプライマーは、当技術分野において周知の合成方法によって生成される。
「フォワードプライマー」は、増幅されるＤＮＡ配列の上流にあるＤＮＡ鋳型上のヌクレオチドに実質的に相補的なヌクレオチドの領域を含むプライマーである。「上流」は、本明細書では、コード鎖に対して増幅されるＤＮＡ配列の５’位を指すために用いられる。「リバースプライマー」は、増幅されるＤＮＡ配列の下流にある二本鎖ＤＮＡ鋳型に実質的に相補的なヌクレオチドの領域を含むプライマーである。「下流」は、本明細書では、コード鎖に対して増幅されるＤＮＡ配列の３’位を指すために用いられる。ＰＣＲに有用な任意のＤＮＡポリメラーゼは、本明細書に開示される方法において用いることができる。試薬及びポリメラーゼは、多くの供給源から市販されている。
安定性及び／又は翻訳効率を促進する能力を備えた化学構造も用いられてよい。ＲＮＡは、好ましくは５’及び３’ＵＴＲを有する。一実施形態では、５’ＵＴＲの長さは、０～３０００ヌクレオチドである。コード領域に追加される５’及び３’ＵＴＲ配列の長さは、ＵＴＲの異なる領域にアニールするＰＣＲのプライマーを設計することを含むが、これに限定されない異なる方法によって変更することができる。このアプローチを用いて、当業者であれば、トランスフェクション後に、転写されたＲＮＡの最適な翻訳効率を達成するために必要となる５’及び３’ＵＴＲの長さを修正することができる。５’及び３’ＵＴＲは、目的の遺伝子の天然に存在する内在性５’及び３’ＵＴＲであってよい。或いは、目的の遺伝子に対して内在性ではないＵＴＲ配列は、ＵＴＲ配列をフォワードプライマー及びリバースプライマーに組み込むことによって、又は鋳型の他の修飾によって、追加することができる。目的の遺伝子に対して内在性ではないＵＴＲ配列の使用は、ＲＮＡの安定性及び／又は翻訳効率の修正に有用であり得る。例えば、３’ＵＴＲ配列のＡＵリッチエレメントがｍＲＮＡの安定性を低下させることが知られている。したがって、３’ＵＴＲは、当技術分野において周知であるＵＴＲの特性に基づいて、転写されたＲＮＡの安定性を高めるように選択又は設計することができる。
一実施形態では、５’ＵＴＲは、内在性遺伝子のコザック配列を含むことができる。或いは、目的の遺伝子に対して内在性ではない５’ＵＴＲが上記のようにＰＣＲによって追加される場合、５’ＵＴＲ配列を追加することによってコンセンサスコザック配列を再設計することができる。コザック配列は、一部のＲＮＡ転写産物の翻訳効率を高めることができるが、効率的な翻訳を可能にするために全てのＲＮＡに必要なわけではないようである。多くのｍＲＮＡのためのコザック配列の要件は、当技術分野において公知である。他の実施形態では、５’ＵＴＲは、ＲＮＡゲノムが細胞内で安定しているＲＮＡウイルスに由来してよい。他の実施形態では、ｍＲＮＡのエキソヌクレアーゼ分解を妨害するために、３’又は５’ＵＴＲにおいて様々なヌクレオチド類似体を用いることができる。
遺伝子クローニングを必要とせずにＤＮＡ鋳型からＲＮＡを合成できるようにするには、転写のプロモーターを、転写される配列の上流のＤＮＡ鋳型に付着させる必要がある。ＲＮＡポリメラーゼのプロモーターとして機能する配列がフォワードプライマーの５’末端に付加されると、ＲＮＡポリメラーゼプロモーターは、転写されるオープンリーディングフレームの上流のＰＣＲ産物に組み込まれる。好ましい一実施形態では、プロモーターは、本明細書の他の場所に記載されているＴ７ポリメラーゼプロモーターである。他の有用なプロモーターには、Ｔ３及びＳＰ６ ＲＮＡポリメラーゼプロモーターが含まれるが、これらに限定されない。Ｔ７、Ｔ３及びＳＰ６プロモーターのコンセンサスヌクレオチド配列は、当技術分野において公知である。
好ましい実施形態では、ｍＲＮＡは、細胞内でリボソーム結合、翻訳の開始及びｍＲＮＡの安定性を決定する５’末端上のキャップと３’ポリ（Ａ）テールの両方を有する。環状ＤＮＡ鋳型、例えばプラスミドＤＮＡ上では、ＲＮＡポリメラーゼは、真核細胞での発現には適さない長い鎖状体産物を産生する。３’ＵＴＲの末端での線形プラスミドＤＮＡの転写は、転写後にポリアデニル化された場合でも、真核生物のトランスフェクションに効果のない通常サイズのｍＲＮＡをもたらす。
線形ＤＮＡ鋳型上で、ファージＴ７ ＲＮＡポリメラーゼは、転写産物の３’末端を鋳型の最後の塩基を超えて伸長させることができる（Ｓｃｈｅｎｂｏｒｎ及びＭｉｅｒｅｎｄｏｒｆ，Ｎｕｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，１３：６２２３－３６（１９８５）；Ｎａｃｈｅｖａ及びＢｅｒｚａｌ－Ｈｅｒｒａｎｚ，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，２７０：１４８５－６５（２００３）
ｐｏｌｙＡ／ＴストレッチをＤＮＡ鋳型に組み込む従来の方法は、分子クローニングである。しかしながら、プラスミドＤＮＡに組み込まれたｐｏｌｙＡ／Ｔ配列により、プラスミドの不安定性が生じるおそれがあり、これは、細菌細胞から得られたプラスミドＤＮＡ鋳型に、欠失やその他の異常が高度に混入する場合が多くなる理由となる。これにより、クローニング手順は面倒で時間がかかるだけでなく、多くの場合、信頼性が低くなる。これが、ポリＡ／Ｔ ３’ストレッチを有するＤＮＡ鋳型の構築をクローニングなしで可能にする方法が非常に望ましい理由である。
転写ＤＮＡ鋳型のポリＡ／Ｔセグメントは、ＰＣＲ中に１００Ｔテール（サイズは５０～５０００個のＴであり得る）等のポリＴテールを含むリバースプライマーを用いることにより、又はＰＣＲ後に、ＤＮＡライゲーション又はインビトロ組換えを含むが、これらに限定されない任意の他の方法により、産生することができる。ポリ（Ａ）テールはまた、ＲＮＡに安定性をもたらし、その分解を低減する。一般に、ポリ（Ａ）テールの長さは、転写されたＲＮＡの安定性と正に相関する。一実施形態では、ポリ（Ａ）テールは、１００～５０００個のアデノシンである。
ＲＮＡのポリ（Ａ）テールは、大腸菌ポリＡポリメラーゼ（Ｅ－ＰＡＰ）等のポリ（Ａ）ポリメラーゼを用いて、インビトロ転写後に更に伸長することができる。一実施形態では、ポリ（Ａ）テールの長さを１００ヌクレオチドから３００～４００ヌクレオチドに増大させることにより、ＲＮＡの翻訳効率が約２倍増大する。更に、異なる化学基を３’末端に付着させることにより、ｍＲＮＡの安定性を向上させることができる。そのような付着は、改変された／人工のヌクレオチド、アプタマー及び他の化合物を含むことができる。例えば、ポリ（Ａ）ポリメラーゼを用いて、ＡＴＰアナログをポリ（Ａ）テールに組み込むことができる。ＡＴＰアナログは、ＲＮＡの安定性を更に高めることができる。
ＲＮＡの５’キャップは、ＲＮＡ分子の安定性ももたらす。好ましい実施形態では、本明細書に開示される方法によって産生されるＲＮＡは、５’キャップを含む。５’キャップは、当技術分野において公知であり、かつ本明細書に記載の技術を用いて提供される（Ｃｏｕｇｏｔ他、Ｔｒｅｎｄｓ ｉｎ Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｓｃｉ．，２９：４３６－４４４（２００１）；Ｓｔｅｐｉｎｓｋｉ他、ＲＮＡ，７：１４６８－９５（２００１）；Ｅｌａｎｇｏ他、Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．，３３０：９５８－９６６（２００５））．
本明細書に開示される方法によって産生されるＲＮＡは、配列内リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）配列を含むこともできる。ＩＲＥＳ配列は、ｍＲＮＡへのキャップ非依存性リボソーム結合を開始し、翻訳の開始を促進する、ウイルス、染色体又は人工的に設計された配列であってよい。糖、ペプチド、脂質、タンパク質、抗酸化剤、及び界面活性剤等の、細胞の透過性と生存率を高める因子を含むことができる、細胞のエレクトロポレーションに適した溶質を含めることができる。
ＲＮＡは、いくつかの異なる方法、例えば、エレクトロポレーション（Ａｍａｘａ Ｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒ－ＩＩ（Ａｍａｘａ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、ケルン、ドイツ））、（ＥＣＭ ８３０（ＢＴＸ）（Ｈａｒｖａｒｄ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ、マサチューセッツ州ボストン）又はＧｅｎｅ Ｐｕｌｓｅｒ ＩＩ（ＢｉｏＲａｄ、コロラド州デンバー）、Ｍｕｌｔｉｐｏｒａｔｏｒ（Ｅｐｐｅｎｄｏｒｔ、ハンブルク、ドイツ）、リポフェクションを用いたカチオン性リポソーム媒介トランスフェクション、ポリマーカプセル化、ペプチド媒介トランスフェクション、又は「遺伝子銃」等の微粒子銃粒子送達システム（例えば、Ｎｉｓｈｉｋａｗａ他、Ｈｕｍ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．、１２（８）：８６１－７０（２００１）を参照）を含むが、これらに限定されない市販の方法のいずれかを用いて標的細胞に導入することができる。
一実施形態では、ＣＡＲ配列は、レトロウイルスベクター又はレンチウイルスベクターを用いて細胞に送達される。ＣＡＲを発現するレトロウイルスベクター及びレンチウイルスベクターは、キャリアとして形質導入細胞を用いるか、封入ベクター、結合ベクター若しくはネイキッドベクターの無細胞局所又は全身送達を用いて、異なる種類の真核細胞並びに組織及び生物全体に送達することができる。用いられる方法は、安定した発現が必要とされるか又は十分である任意の目的に用いることができる。
別の実施形態では、ＣＡＲ配列は、インビトロ転写されたｍＲＮＡを用いて細胞に送達される。インビトロ転写ｍＲＮＡ ＣＡＲは、キャリアとして形質導入細胞を用いるか、封入ｍＲＮＡ、結合ｍＲＮＡ若しくはネイキッドｍＲＮＡの無細胞局所又は全身送達を用いて、異なる種類の真核細胞並びに組織及び生物全体に送達することができる。用いられる方法は、一時的な発現が必要とされるか又は十分である任意の目的に用いることができる。
別の実施形態では、トランスポゾンを介して所望のＣＡＲを細胞内で発現させることができる。
一実施形態では、本発明の免疫細胞はＴ細胞である。本発明のＴ細胞の増殖及び遺伝子改変の前に、Ｔ細胞の供給源が対象から取得される。Ｔ細胞は、末梢血単核細胞、骨髄、リンパ節組織、臍帯血、胸腺組織、感染部位の組織、腹水、胸水、脾臓組織、及び腫瘍を含む多くの供給源から取得することができる。本発明の特定の実施形態では、当技術分野において利用可能な任意の数のＴ細胞株が用いられてよい。本発明の特定の実施形態では、Ｔ細胞は、Ｆｉｃｏｌｌ（商標）分離又はＳｅｐａｘ分離システム等の、当業者に知られている任意の数の技術を用いて、対象から収集された血液の単位から取得することができる。好ましい一実施形態では、個体の循環血液からの細胞は、アフェレーシスによって得られる。典型的には、アフェレーシス製品は、Ｔ細胞、単球、顆粒球、Ｂ細胞、その他の有核白血球、赤血球、及び血小板を含むリンパ球を含む。一実施形態では、アフェレーシスによって収集された細胞を洗浄して、血漿画分を除去し、その後の処理ステップに適切な緩衝液又は培地に細胞を入れてよい。本発明の一実施形態では、細胞はリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）で洗浄される。代替の実施形態では、洗浄溶液はカルシウムを欠き、また、マグネシウムを欠いてもよいし、又は全てではないにしても多くの二価カチオンを欠いてよい。洗浄後、細胞は、例えば、Ｃａ２＋フリー、Ｍｇ２＋フリーのＰＢＳ、ＰｌａｓｍａＬｙｔｅ Ａ、又は緩衝液を含む若しくは含まない他の生理食塩水等の、様々な生体適合性緩衝液に再懸濁されてよい。或いは、アフェレーシス試料の望ましくない成分を除去し、細胞を培地に直接再懸濁してもよい。
Ｔ細胞の供給源、活性化及び増殖
一実施形態では、免疫細胞はＴ細胞であってよい。本発明のＴ細胞の増殖及び遺伝的改変の前に、Ｔ細胞又はＴ細胞作製の元となる前駆細胞の供給源が対象から取得される。Ｔ細胞は、末梢血単核細胞、骨髄、リンパ節組織、臍帯血、胸腺組織、胚中心、感染部位からの組織、腹水、胸水、脾臓、腫瘍、及び移植された器官／組織を含めて、Ｔ細胞が存在する任意の供給源から取得することができる。本発明の特定の実施形態では、Ｔ細胞は、Ｆｉｃｏｌｌ（商標）分離等の、当業者に知られている任意の数の技術を用いて、対象から収集された血液の単位から取得することができる。一実施形態では、対象の循環血液からの細胞は、アフェレーシスによって得られる。典型的には、アフェレーシス製品は、Ｔ細胞、Ｔｒｅｇ、単球、顆粒球、Ｂ細胞、その他の有核白血球、赤血球、及び血小板を含むリンパ球を含む。一実施形態では、アフェレーシスによって収集された細胞を洗浄して、血漿画分を除去し、その後の処理ステップに適切な緩衝液又は培地に細胞を入れてよい。本発明の一実施形態では、細胞は、洗浄溶液（例えばリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ））で洗浄してよい。当業者であれば容易に理解できるように、洗浄ステップは、半自動化された「フロースルー」遠心分離機（例えば、Ｃｏｂｅ ２９９１細胞プロセッサー、Ｂａｘｔｅｒ ＣｙｔｏＭａｔｅ、又はＨａｅｍｏｎｅｔｉｃｓ Ｃｅｌｌ Ｓａｖｅｒ ５）をメーカーの指示に従って使用する等、当業者に公知の方法によって達成してよい。洗浄後、細胞は、例えば、Ｃａ２＋フリー、Ｍｇ２＋フリーのＰＢＳ、ＰｌａｓｍａＬｙｔｅ Ａ、又は緩衝液を含む若しくは含まない他の生理食塩水等の、様々な生体適合性緩衝液に再懸濁されてよい。或いは、アフェレーシス試料の望ましくない成分を除去し、細胞を培地に直接再懸濁してもよい。
別の実施形態では、Ｔ細胞は、例えばＰＥＲＣＯＬＬ（商標）勾配による遠心分離により、又は向流遠心溶出法により、赤血球を溶解し、単球を枯渇させることによって、末梢血リンパ球から単離される。ＣＤ３＋、ＣＤ２５＋、ＣＤ１２７ｎｅｇ、ＨＬＡ－ＤＲ＋、ＣＤ２８＋、ＣＤ４＋、ＣＤ８＋、ＣＤ４５ＲＡ＋及び／又はＣＤ４５ＲＯ＋Ｔ細胞等のＴ細胞の特定の亜集団は、陽性又は陰性選択技術によって更に分離することができる。当業者であれば理解できるように、本発明との関連において複数ラウンドの選択も用いることができる。ある実施形態では、選択手順を実行し、活性化及び増殖プロセスにおいて「非選択」細胞を用いることが望ましい場合がある。「非選択」細胞を更なる選択ラウンドに供することもできる。
陰性選択によるＴ細胞集団の濃縮は、陰性選択された細胞に固有の表面マーカーに対して作られた抗体の組合せを用いて達成することができる。１つの方法は、陰性選択された細胞上に存在する細胞表面マーカーに対して作られたモノクローナル抗体のカクテルを用いる陰性磁気免疫付着又はフローサイトメトリーによる細胞の選別及び／又は選択である。例えば、陰性選択によってＣＤ４＋細胞を濃縮するために、モノクローナル抗体カクテルは、典型的には、ＣＤ１４、ＣＤ２０、ＣＤ１１ｂ、ＣＤ１６、ＨＬＡ－ＤＲ及びＣＤ８に対する抗体を含む。ある実施形態では、典型的にはＣＤ４＋、ＣＤ２５＋、ＣＤ６２Ｌｈｉ、ＧＩＴＲ＋及びＦｏｘＰ３＋を発現する制御性Ｔ細胞を濃縮するか、又は陽性選択することが望ましい場合がある。
陽性又は陰性選択による所望の細胞集団の分離では、細胞と表面（例えばビーズ等の粒子）の濃度を変えることができる。ある実施形態では、細胞とビーズの最大の接触を確保するために、ビーズと細胞が一緒に混合される体積を著しく減少させる（すなわち、細胞の濃度を高める）ことが望ましい場合がある。例えば、一実施形態では、１ｍｌあたり２０億細胞の濃度が用いられる。一実施形態では、１ｍｌあたり１０億細胞の濃度が用いられる。更なる実施形態では、１ｍｌあたり１億個を超える細胞が用いられる。更なる実施形態では、１ｍｌあたり１０００万、１５００万、２０００万、２５００万、３０００万、３５００万、４０００万、４５００万又は５０００万個の細胞濃度が用いられる。更に別の実施形態では、１ｍｌあたり７５００万、８０００万、８５００万、９０００万、９５００万又は１億個の細胞濃度が用いられる。更なる実施形態では、１ｍｌあたり１億２５００万又は１億５０００万細胞の濃度を用いることができる。高濃度を使用すると、細胞収量、細胞活性化及び細胞増殖が増加する可能性がある。更に、高濃度の細胞の使用により、目的の標的抗原を弱く発現する可能性のある細胞、又は多くの腫瘍細胞が存在する試料（すなわち白血病血液、腫瘍組織等）からの、より効率的な細胞の捕捉が可能となる。そのような細胞集団には治療的価値がある場合があり、入手することが望ましいであろう。
関連する実施形態では、より低い濃度の細胞を用いることが望ましい場合がある。Ｔ細胞と表面（例えばビーズ等の粒子）の混合物を大幅に希釈することにより、粒子と細胞との間の相互作用が最小限に抑えられる。これにより、粒子に結合する所望の抗原を大量に発現する細胞が選択される。例えば、ＣＤ４＋Ｔ細胞は、ＣＤ２８をより高いレベルで発現し、希釈濃度のＣＤ８＋Ｔ細胞よりも効率的に捕捉される。一実施形態では、使用される細胞の濃度は１ｍｌあたり５×１０６個である。他の実施形態では、使用される濃度は、１ｍｌあたり約１×１０５個～１ｍｌあたり１×１０６個、及びその間の任意の整数値であってよい。
他の実施形態では、細胞は、２～１０℃又は室温のいずれかで、様々な速度で様々な長さの時間、ローテータ上でインキュベートされてよい。
刺激のためのＴ細胞は、洗浄ステップ後に凍結することもできる。理論に拘束されるものではないが、凍結及びその後の解凍ステップにより、細胞集団内の顆粒球とある程度の単球を除去することによって、より均一な産物が提供される。血漿及び血小板を除去する洗浄ステップの後、細胞を凍結溶液に懸濁してよい。多くの凍結溶液及びパラメーターが当技術分野において公知であり、この文脈において有用であるが、１つの方法は、２０％ＤＭＳＯ及び８％ヒト血清アルブミンを含むＰＢＳ、又は１０％デキストラン４０及び５％デキストロースを含む培地、２０％ヒト血清アルブミン及び７．５％ＤＭＳＯ、又は３１．２５％Ｐｌａｓｍａｌｙｔｅ－Ａ、３１．２５％デキストロース５％、０．４５％ＮａＣｌ、１０％デキストラン４０及び５％デキストロース、２０％ヒト血清アルブミン、及び７．５％ＤＭＳＯ、又は例えばＨｅｓｐａｎおよびＰｌａｓｍａＬｙｔｅ Ａを含むその他の適切な細胞凍結培地を用いることを伴い、その後、細胞は毎分１℃の速さで－８０℃まで凍結され、液体窒素貯蔵タンクの気相に貯蔵される。－２０℃又は液体窒素での制御されていない早急な凍結と同様に、制御された凍結の他の方法を用いてよい。
ある実施形態では、本明細書に記載されるように凍結保存細胞を解凍及び洗浄し、室温で１時間静置してから、本発明の方法を用いて活性化する。
また、本発明との関連において、本明細書に記載の増殖細胞が必要になる前の時点での、対象からの血液試料又はアフェレーシス生成物の収集も企図される。したがって、増殖される細胞の供給源は、必要な任意の時点で収集することができ、Ｔ細胞等の所望の細胞は、恩恵を受ける多くの疾患又は状態のＴ細胞療法（本明細書に記載のもの等）における後の使用のために、単離及び凍結することができる。ある実施形態では、血液試料又はアフェレーシスは、疾患を発症するリスクがあるが疾患をまだ発症していない対象から採取され、目的の細胞が単離され、後の使用のために凍結される。ある実施形態では、Ｔ細胞を増殖させ、凍結し、後で使用してよい。ある実施形態では、試料は、本明細書に記載の特定の疾患の診断の直後、しかし治療の前に、対象から収集される。更なる実施形態では、細胞は、ナタリズマブ、エファリズマブ、抗ウイルス剤、化学療法、放射線、シクロスポリン、アザチオプリン、メトトレキサート、ミコフェノール酸及びＦＫ５０６等の免疫抑制剤、抗体、又はキャンパス（ＣＡＭＰＡＴＨ）、抗ＣＤ３抗体、サイトキサン、フルダラビン、シクロスポリン、ＦＫ５０６、ラパマイシン、ミコフェノール酸、ステロイド、ＦＲ９０１２２８などの他の免疫除去剤等の薬剤、並びに照射）による治療を含むがこれらに限定されない、関連する任意の数の治療モダリティの前に、対象からの血液試料又はアフェレーシスから単離される。これらの薬物は、カルシウム依存性ホスファターゼカルシニューリン（シクロスポリン及びＦＫ５０６）を阻害するか、増殖因子誘導シグナル伝達に重要なｐ７０Ｓ６キナーゼ（ラパマイシン）を阻害する（Ｌｉｕ他、Ｃｅｌｌ ６６：８０７－８１５，１９９１；Ｈｅｎｄｅｒｓｏｎ他、Ｉｍｍｕｎ ７３：３１６－３２１，１９９１；Ｂｉｅｒｅｒ他、Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｉｍｍｕｎ ５：７６３－７７３，１９９３）。更なる実施形態では、細胞は患者から単離され、骨髄又は幹細胞移植、化学療法薬剤（フルダラビン、外照射療法（ＸＲＴ）、シクロスファミド等）、又は抗体（ＯＫＴ３若しくはキャンパス等）のいずれかを用いたＴ細胞除去療法と併せて（例えば前、同時又は後に）後の使用のために凍結される。別の実施形態では、細胞は、ＣＤ２０と反応する薬剤（例えばリツキサン）等のＢ細胞除去療法に先立って単離され、また、Ｂ細胞除去療法に続く治療のために後で使用するために凍結することができる。
本発明の更なる実施形態では、Ｔ細胞は治療直後の患者から取得される。これに関して、特定の免疫抑制治療、特に免疫系を損傷する薬物による治療の後、患者が通常治療から回復する期間の治療直後に、得られるＴ細胞の質が最適であるか、又はエクスビボで増殖する能力が改善し得ることが観察されている。同様に、本明細書に記載の方法を使用したエクスビボ操作後、これらの細胞は、生着の強化及びインビボ増殖に好ましい状態にあり得る。よって、この回復期の間に免疫細胞を収集することは、本発明との関連において企図される。更に、ある実施形態では、動員（例えばＧＭ－ＣＳＦによる動員）及び条件付けレジメンを用いて、特定の細胞型の再増殖、再循環、再生及び／又は増殖が、特に治療後の定められた時間帯に好まれる、対象の状態を作り出すことができる。
望ましいＣＡＲを発現するためのＴ細胞の遺伝子修飾の前か後かにかかわらず、Ｔ細胞は、一般に、例えば米国特許第６，３５２，６９４号、同第６，５３４，０５５号、同第６，９０５，６８０号、同第６，６９２，９６４号、同第５，８５８，３５８号、同第６，８８７，４６６号、同第６，９０５，６８１号、同第７，１４４，５７５号、同第７，０６７，３１８号、同第７，１７２，８６９号、同第７，２３２，５６６号、同第７，１７５，８４３号、同第５，８８３，２２３号、同第６，９０５，８７４号、同第６，７９７，５１４号、同第６，８６７，０４１号及び米国特許出願公開第２００６０１２１００５号に記載されている方法を用いて、活性化及び増殖させることができる。
一般に、本発明のＴ細胞は、ＣＤ３／ＴＣＲ複合体関連シグナルを刺激する薬剤と、Ｔ細胞の表面上の共刺激分子を刺激するリガンドとが付着した表面との接触によって増殖する。特に、Ｔ細胞集団は、抗ＣＤ３抗体、又はその抗原結合断片、又は表面に固定化された抗ＣＤ２抗体との接触により、又はカルシウムイオノフォアと組み合せたプロテインキナーゼＣ活性化因子（例えばブリオスタチン）との接触等により、本明細書に記載のように刺激されてよい。Ｔ細胞の表面上のアクセサリー分子の共刺激のために、アクセサリー分子に結合するリガンドが用いられる。例えば、Ｔ細胞の増殖を刺激するのに適切な条件下で、Ｔ細胞の集団を抗ＣＤ３抗体及び抗ＣＤ２８抗体と接触させることができる。ＣＤ４＋Ｔ細胞の増殖を刺激するために、抗ＣＤ３抗体と抗ＣＤ２８抗体。抗ＣＤ２８抗体の例には、９．３、Ｂ－Ｔ３が含まれ、当技術分野において一般に知られている他の方法のように、ＸＲ－ＣＤ２８ （Ｄｉａｃｌｏｎｅ，ブザンソン、フランス）を用いることができる（Ｂｅｒｇ他、Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔ Ｐｒｏｃ．３０（８）：３９７５－３９７７，１９９８；Ｈａａｎｅｎ他、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１９０（９）：１３１９１３２８，１９９９；Ｇａｒｌａｎｄ他、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｍｅｔｈ．２２７（１－２）：５３－６３，１９９９）
ある実施形態では、Ｔ細胞の一次刺激シグナル及び共刺激シグナルは、異なるプロトコルによって提供されてよい。例えば、各シグナルを提供する薬剤は、溶液中に存在してもよいし、表面にカップリングしていてもよい。表面にカップリングする場合、薬剤は同じ表面にカップリングするか（すなわち「シス」構造）、又は別々の表面にカップリングしてもよい（すなわち「トランス」構造）。或いは、一方の薬剤は表面にカップリングし、他方の薬剤は溶液中に存在してもよい。一実施形態では、共刺激シグナルを提供する薬剤は細胞表面に結合し、一次活性化シグナルを提供する薬剤は溶液中にあるか、又は表面にカップリングしている。ある実施形態では、両方の薬剤が溶液中に存在することができる。別の実施形態では、薬剤は可溶型であってもよく、その後、Ｆｃ受容体を発現する細胞又は抗体又は薬剤に結合する他の結合剤等の表面に架橋されてよい。これに関して、例えば、本発明におけるＴ細胞の活性化及び増殖に用いることが企図された人工抗原提示細胞（ａＡＰＣ）に関する米国特許出願公開第２００４０１０１５１９号及び同第２００６００３４８１０号を参照されたい。
一実施形態では、２つの薬剤は、同じビーズ（すなわち「シス」）又は別々のビーズ（すなわち「トランス」）のいずれかで、ビーズ上に固定されている。例として、一次活性化シグナルを提供する薬剤は、抗ＣＤ３抗体又はその抗原結合断片であり、共刺激シグナルを提供する薬剤は、抗ＣＤ２８抗体又はその抗原結合断片であり、両方の薬剤は、同等の分子量で同じビーズに共固定化される。一実施形態では、ＣＤ４＋Ｔ細胞の増殖及びＴ細胞増殖のために、ビーズに結合した各抗体の１：１比が用いられる。本発明のある態様では、１：１の比率を用いて観察される増殖と比較してＴ細胞増殖の増加が観察されるように、ビーズに結合した抗ＣＤ３：ＣＤ２８抗体の比率が用いられる。特定の一実施形態では、１：１の比を用いて観察される増殖と比較して、約１～約３倍の増加が観察される。一実施形態では、ビーズに結合したＣＤ３：ＣＤ２８抗体の比率は、１００：１～１：１００及びその間の全ての整数値の範囲である。本発明の一態様では、抗ＣＤ３抗体よりも多くの抗ＣＤ２８抗体が粒子に結合し、すなわち、ＣＤ３：ＣＤ２８の比率は１未満である。本発明のある実施形態では、ビーズに結合した抗ＣＤ２８抗体対抗ＣＤ３抗体の比率は２：１よりも大きい。特定の一実施形態では、ビーズに結合した抗体の１：１００のＣＤ３：ＣＤ２８比が用いられる。別の実施形態では、ビーズに結合した抗体の１：７５のＣＤ３：ＣＤ２８比が用いられる。更なる実施形態では、ビーズに結合した抗体の１：５０のＣＤ３：ＣＤ２８比が用いられる。別の実施形態では、ビーズに結合した抗体の１：３０のＣＤ３：ＣＤ２８比が用いられる。好ましい一実施形態では、ビーズに結合した抗体の１：１０のＣＤ３：ＣＤ２８比が用いられる。別の実施形態では、ビーズに結合した抗体の１：３のＣＤ３：ＣＤ２８比が用いられる。更に別の実施形態では、ビーズに結合した抗体の３：１のＣＤ３：ＣＤ２８比が用いられる。
１：５００～５００：１の粒子対細胞の比、及びその間の任意の整数値を用いて、Ｔ細胞又は他の標的細胞を刺激してよい。当業者であれば容易に理解できるように、細胞に対する粒子の比率は、標的細胞に対する粒子サイズに依存してよい。例えば、小さなサイズのビーズは少数の細胞しか結合することできなかったが、より大きなサイズのビーズは多くの細胞を結合することができた。ある実施形態では、細胞対粒子の比率は１：１００～１００：１及びその間の任意の整数値の範囲であり、更なる実施形態では、比率は１：９～９：１を含み、その間の任意の整数値も、Ｔ細胞を刺激するのに用いることができる。Ｔ細胞刺激をもたらす抗ＣＤ３及び抗ＣＤ２８カップリング粒子対Ｔ細胞の比率は、上記のように変化することができる。例えば、そのような値は、Ｔ細胞あたり１：１００、１：５０、１：４０、１：３０、１：２０、１：１０、１：９、１：８、１：７、１：６、１：５、１：４、１：３、１：２、１：１、２：１、３：１、４：１、５：１、６：１、７：１、８：１、９：１、１０：１、１５：１及び１：１の粒子を含んでよい。一実施形態では、１：１以下の粒子対細胞の比率が用いられる。特定の一実施形態では、粒子：細胞の比率は１：５であってよい。更なる実施形態では、粒子対細胞の比率は、刺激の日に応じて変更することができる。例えば、一実施形態では、粒子対細胞の比率は、初日は１：１～１０：１であり、その後、追加の粒子が最大１０日間、毎日又は隔日で細胞に追加され、最終比率は１：１～１：１０（追加日の細胞数に基づく）である。特定の一実施形態では、粒子対細胞の比率は、刺激の最初の日に１：１であり、刺激の３日目及び５日目に１：５に調整される。別の実施形態では、粒子は、毎日又は隔日で追加され、刺激の最初の日に１：１の最終比率まで、及び刺激の３日目及び５日目に１：５の最終比率まで追加される。別の実施形態では、粒子対細胞の比率は、刺激の最初の日に２：１であり、刺激の３日目及び５日目に１：１０に調整される。別の実施形態では、粒子は、毎日又は隔日で、刺激の最初の日に１：１の最終比率まで、及び刺激の３日目及び５日目に１：１０の最終比率まで追加される。当業者には当然のことながら、様々な他の比率が本発明での使用に適し得る。特に、比率は、粒子サイズと細胞のサイズ及び種類に応じて変化する。
本発明の更なる実施形態では、Ｔ細胞（例えばＴｒｅｇ細胞）等の細胞を薬剤コートビーズと組み合せ、ビーズと細胞をその後分離してから、細胞を培養する。代替の実施形態では、培養の前に、薬剤コーティングビーズと細胞は分離されず、一緒に培養される。更なる実施形態では、ビーズと細胞は、磁力等の力の適用によって最初に濃縮され、それによって細胞表面マーカーのライゲーションが増大することにより、細胞刺激が誘発される。
例として、抗ＣＤ３及び抗ＣＤ２８が付着した常磁性ビーズ（３×２８ビーズ）をＴ細胞に接触させることにより、細胞表面タンパク質を連結してよい。一実施形態では、細胞（例えば１０４～１０９個のＴ細胞）とビーズ（例えば１：１の比率のＤＹＮＡＢＥＡＤ（登録商標）Ｍ－４５０ ＣＤ３／ＣＤ２８ Ｔ常磁性ビーズ）が、緩衝液、好ましくはＰＢＳ（カルシウムやマグネシウム等の二価カチオンなし）中で組み合わされる。繰り返しになるが、当業者であれば容易に理解できるように、任意の細胞濃度を用いてよい。
例えば、試料において標的細胞が非常に稀であり、試料の０．０１％のみを構成する場合もあり、又は、試料全体（すなわち１００％）が目的の標的細胞を含む場合もある。したがって、任意の細胞数は本発明の文脈内にある。ある実施形態では、細胞と粒子の最大の接触を確実にするために、粒子と細胞が一緒に混合される体積を著しく減少させる（すなわち、細胞の濃度を高める）ことが望ましい場合がある。例えば、一実施形態では、１ｍｌあたり約２０億細胞の濃度が用いられる。別の実施形態では、１ｍｌあたり１億個を超える細胞が用いられる。更なる実施形態では、１ｍｌあたり１０００万、１５００万、２０００万、２５００万、３０００万、３５００万、４０００万、４５００万又は５０００万個の細胞濃度が用いられる。更に別の実施形態では、１ｍｌあたり７５００万、８０００万、８５００万、９０００万、９５００万又は１億個の細胞濃度が用いられる。更なる実施形態では、１ｍｌあたり１億２５００万又は１億５０００万個の細胞の濃度を用いることができる。高濃度を使用すると、細胞収量、細胞活性化及び細胞増殖を増加させることができる。更に、高濃度の細胞の使用により、目的の標的抗原を弱く発現する可能性のある細胞のより効率的な捕捉が可能となる。そのような細胞集団には治療的価値がある場合があり、特定の実施形態では入手することが望ましいであろう。
本発明の一実施形態では、混合物は、数時間（約３時間）から約１４日間、又はその間の任意の時間ごとの整数値で培養されてよい。別の実施形態では、混合物は２１日間培養されてよい。本発明の一実施形態では、ビーズとＴ細胞は、約８日間一緒に培養される。別の実施形態では、ビーズとＴ細胞は、２～３日間一緒に培養される。Ｔ細胞の培養時間が６０日以上になるように、数サイクルの刺激が望ましい場合もある。Ｔ細胞培養に適した条件には、血清（例えばウシ胎児又はヒトの血清）を含む、増殖及び生存に必要な因子を含み得る適切な培地（例えば最小必須培地又はＲＰＭＩ培地１６４０又はＸ－ｖｉｖｏ １５（Ｌｏｎｚａ））、インターロイキン－２（ＩＬ－２）、インスリン、ＩＦＮ－γ、ＩＬ－４、ＩＬ－７、ＧＭ－ＣＳＦ、ＩＬ－１０、ＩＬ－１２、ＩＬ－１５、ＴＧＦβ及びＴＮＦ－α、又は当業者に知られている細胞の増殖のための任意の他の添加物が含まれる。細胞の増殖のための他の添加物には、界面活性剤、プラスマネート、及びＮ－アセチルシステインや２－メルカプトエタノール等の還元剤が含まれるが、これらに限定されない。培地には、ＲＰＭＩ １６４０、Ｉｍｍｕｎｏｃｕｌｔ（ＳｔｅｍＣｅｌｌ）、ＡＩＭ－Ｖ、ＤＭＥＭ、ＭＥＭ、α－ＭＥＭ、Ｆ－１２、Ｘ－Ｖｉｖｏ １５及びＸ－Ｖｉｖｏ ２０、オプティマイザーが含まれ、追加のアミノ酸、ピルビン酸ナトリウム及びビタミンを有し、無血清であるか又は適切な量の血清（若しくは血漿）若しくは定義されたホルモンのセット、及び／又はＴ細胞の成長と増殖に十分な量のサイトカイン（複数可）を補充することができる。抗生物質、例えば、ペニシリンやストレプトマイシンは、実験培養液にのみ含まれ、対象に注入される細胞の培養液には含まれない。標的細胞は、増殖を支持するのに必要な条件下、例えば適切な温度（例えば３７℃）及び大気（例えば空気と５％ＣＯ２）で維持される。
様々な刺激時間に曝されたＴ細胞は、異なる特性を示す場合がある。例えば、典型的な血液又はアフェレーシス末梢血単核細胞生成物には、細胞傷害性又はサプレッサーＴ細胞集団（ＴＣ、ＣＤ８＋）よりも大きいヘルパーＴ細胞集団（ＴＨ、ＣＤ４＋）を有する。ＣＤ３受容体及びＣＤ２８受容体を刺激することによるＴ細胞のエクスビボでの増殖により、約８～９日目より前は主にＴＨ細胞から成るＴ細胞の集団が産生され、約８～９日目より後は、Ｔ細胞の集団はますますより大きなＴＣ細胞の集団を含む。
更に、ＣＤ４マーカー及びＣＤ８マーカーに加えて、他の表現型マーカーは大きく変化するが、大部分は細胞増殖プロセスの過程で再現可能である。よって、そのような再現性は、活性化Ｔ細胞産物を特定の目的用に仕立てる能力を可能にする。
一実施形態では、ＦＡＣＳＡｒｉａ ＩＩ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を用いて生きているＣＤ４＋ＣＤ１２７ｌｏＣＤ２５ｈｉＴｒｅｇを選別する前に、ＲｏｓｅｔｔｅＳｅｐ（Ｓｔｅｍｃｅｌｌ）を介してＨＬＡ－Ａ２－ドナーからＣＤ４＋Ｔ細胞を単離し、ＣＤ２５＋細胞（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ）を濃縮することにより、制御性Ｔ細胞を得てよい。選別されたＴｒｅｇは、１０００Ｕ／ｍｌのＩＬ－２中のＬ細胞とαＣＤ３ｍＡｂ（ＯＫＴ３；２００ｎｇ／ｍＬ）で刺激してよい。
本発明の一実施形態では、例えば参照により本明細書に組み込まれるＷＯ２００７１１０７８５に記載されているように制御性Ｔ細胞を得るために、Ｔ細胞をラパマイシン存在下で培養してよい。制御性Ｔ細胞を生成する別の方法は、参照により本明細書に組み込まれるＵＳ２０１６０２４４７０に記載されており、Ｔ細胞は、例えばＴＣＲ／ＣＤ３抗体等のＴ細胞受容体（ＴＣＲ）／ＣＤ３活性化因子、ＴＣＲ共刺激活性化因子（例えばＣＤ２８、ＣＤ１３７（４－１ ＢＢ）、ＧＩＴＲ、Ｂ７－１／２、ＣＤ５、ＩＣＯＳ、ＯＸ４０、ＣＤ４０又はＣＤ１３７抗体など）及びラパマイシンとともに培養される。
本発明の一実施形態では、ＣＡＲの発現により遺伝的に改変されたＴ細胞は、ＲＯＲ－Ｃ、Ｆｏｘｏ１、Ｔ－ｂｅｔ又はＧａｔａ ３、ｃ－Ｍａｆ、ＡｈＲ等の少なくとも１つの細胞内因子の発現によって遺伝的に改変されていてもよい。一実施形態では、本発明の遺伝子改変免疫細胞は、Ｆｏｘｏ１を発現する。
一実施形態では、本発明の遺伝子改変細胞は、例えば、同種異系のＴ細胞又はＴｒｅｇ細胞等の同種異系免疫細胞であってよい。例えば、同種異系免疫細胞は、機能的ヒト白血球抗原（ＨＬＡ）、例えばＨＬＡクラスＩ及び／若しくはＨＬＡクラスＩＩの発現を欠くか、又は機能的Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）の発現を欠く免疫細胞であってよい。
一実施形態では、機能性ＴＣＲを欠くＴ細胞を、その表面上に機能性ＴＣＲを発現しないように遺伝子操作するか、機能性ＴＣＲを含む１つ以上のサブユニットを発現しないように遺伝子操作するか、又は、その表面上にはほとんど機能的なＴＣＲを産生しないように遺伝子操作することができる。或いは、Ｔ細胞は、例えばＴＣＲの１つ以上のサブユニットの変異型又は切断型の発現により、実質的に障害性のＴＣＲを発現することができる。「実質的に障害性のＴＣＲ」という用語は、このＴＣＲが宿主において有害な免疫反応を誘発しないことを意味する。
別の実施形態では、本明細書に記載の遺伝子改変細胞を、その表面に機能的ＨＬＡを発現しないように遺伝子操作することができる。例えば、本明細書に記載の免疫細胞を、細胞表面発現ＨＬＡ、例えばＨＬＡクラス１及び／又はＨＬＡクラスＩＩ、又は非古典的ＨＬＡ分子が下方制御されるように遺伝子操作することができる。
別の実施形態では、Ｔ細胞は、機能的ＴＣＲ並びにＨＬＡクラスＩ及び／又はＨＬＡクラスＩＩ等の機能的ＨＬＡを欠いてよい。
機能的ＴＣＲの発現及び／ＨＬＡの発現を欠く改変免疫細胞（例えば改変Ｔ細胞又は改変Ｔｒｅｇ細胞等）は、ＴＣＲ及び／若しくはＨＬＡの１つ以上のサブユニットのノックアウト又はノックダウンを含む任意の適切な手段によって取得することができる。例えば、免疫細胞は、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ＣＲＩＳＰＲ（ｃｌｕｓｔｅｒｅｄ ｒｅｇｕｌａｒｌｙ ｉｎｔｅｒｓｐａｃｅｄ ｓｈｏｒｔ ｐａｌｉｎｄｒｏｍｉｃ ｒｅｐｅａｔｓ）転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）、ジンクフィンガーエンドヌクレアーゼ（ＺＦＮ）、メガヌクレアーゼ（ｍｎ、ホーミングエンドヌクレアーゼとしても知られている）又はｍｅｇａＴＡＬ（ＴＡＬエフェクターとｍｎ切断ドメインを組み合わせたもの）のノックダウンを含むことができる（Ｏｓｂｏｒｎ他，“Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ ｏｆ ＴＣＲ Ｇｅｎｅ Ｅｄｉｔｉｎｇ Ａｃｈｉｅｖｅｄ ｂｙ ＴＡＬＥＮｓ，ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９，ａｎｄ ｍｅｇａＴＡＬ Ｎｕｃｌｅａｓｅｓ” Ｍｏｌ Ｔｈｅｒ．２０１６ ３月；２４（３）：５７０－８１））。
一実施形態では、ＴＣＲ発現及び／又はＨＬＡ発現は、Ｔ細胞のＴＣＲ及び／若しくはＨＬＡをコードする核酸を標的とするｓｉＲＮＡ又はｓｈＲＮＡを用いて阻害することができる。Ｔ細胞でのｓｉＲＮＡとｓｈＲＮＡの発現は、例えば、レンチウイルス発現系等の従来の発現系を用いて実現することができる。ＨＬＡクラスＩ及び／又はＨＬＡクラスＩＩ遺伝子の発現を下方制御する例示的なｓｉＲＮＡ並びにｓｈＲＮＡは、例えばＵＳ２００７／００３６７７３に記載されている。ＴＣＲの成分の発現を下方制御する例示的なｓｈＲＮＡは、例えばＵＳ２０１２／０３２１６６７に記載されている。
本明細書で用いられる場合、「ＣＲＩＳＰＲ」又は「ＣＲＩＳＰＲからＴＣＲ及び／又はＨＬＡ」又は「ＴＣＲ及び／又はＨＬＡを阻害するためのＣＲＩＳＰＲ」とは、クラスター化された規則的な間隔の短いパリンドローム反復のセット、又はそのような一連の反復を含むシステムを指す。本明細書で用いられる場合、「Ｃａｓ」は、ＣＲＩＳＰＲ関連タンパク質を指す。「ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ」系とは、ＴＣＲ及び／若しくはＨＬＡ遺伝子をサイレンシング又は変異させるために用いることのできるＣＲＩＳＰＲ及びＣａｓに由来する系を指す。
天然に存在するＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系は、配列決定された真正細菌ゲノムの約４０％と配列決定された古細菌の９０％に見られる。Ｇｒｉｓｓａ他（２００７）ＢＭＣ Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ ８：１７２。この系は、原核生物の免疫系の一種であり、プラスミドやファージ等の外来遺伝子エレメントに対する耐性を付与し、後天性免疫の一形態を提供する。Ｂａｒｒａｎｇｏｕ他（２００７）Ｓｃｉｅｎｃｅ ３１５：１７０９－１７１２；Ｍａｒｒａｇｉｎｉ他（２００８）Ｓｃｉｅｎｃｅ ３２２：１８４３－１８４５。ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系は、マウスや霊長類等の真核生物における遺伝子編集（特定の遺伝子のサイレンシング、強化又は変更）に用いられるように改変されている。Ｗｉｅｄｅｎｈｅｆｔ他（２０１２）Ｎａｔｕｒｅ ４８２：３３１－８。これは、特別に設計されたＣＲＩＳＰＲと１つ以上の適切なＣａｓを含むプラスミドを真核細胞に導入することで実現される。ＣＲＩＳＰＲ遺伝子座と呼ばれることもあるＣＲＩＳＰＲ配列には、反復とスペーサーが交互に含まれる。天然に存在するＣＲＩＳＰＲでは、スペーサーは通常、プラスミドやファージ配列等、細菌にとって外来の配列を含む。ＴＣＲ及び／又はＨＬＡ ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系では、スペーサーは、ＴＣＲ又はＨＬＡ遺伝子配列に由来する。ＣＲＩＳＰＲ遺伝子座からのＲＮＡは構成的に発現され、Ｃａｓタンパク質によってプロセシングされて小さなＲＮＡとなる。これらは、反復配列に隣接するスペーサーを含む。ＲＮＡは、他のＣａｓタンパク質を導いて、ＲＮＡ又はＤＮＡレベルで外来遺伝要素を沈黙させる。Ｈｏｒｖａｔｈ他（２０１０）Ｓｃｉｅｎｃｅ ３２７：１６７－１７０；Ｍａｋａｒｏｖａ他（２００６）Ｂｉｏｌｏｇｙ Ｄｉｒｅｃｔ １：７。よって、スペーサーは、ｓｉＲＮＡと同様にＲＮＡ分子の鋳型として機能する。Ｐｅｎｎｉｓｉ（２０１３）Ｓｃｉｅｎｃｅ ３４１：８３３－８３６。よって、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系は、ＴＣＲ及び／又はＨＬＡ遺伝子の編集（塩基対の追加又は除去）に用いることができるか、又はＴＣＲ及び／若しくはＨＬＡの発現を低下させる早期停止の導入に用いることができる。ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系は、或いは、ＲＮＡ干渉のように用いることもでき、ＨＬＡ遺伝子を可逆的にオフにする。哺乳類細胞では、例えば、ＲＮＡがＣａｓタンパク質をＴＣＲ及び／又はＨＬＡプロモーターに導き、ＲＮＡポリメラーゼを立体的にブロックすることができる。
当技術分野で公知の技術、例えばＵＳ２０１４００６８７９７及びＣｏｎｇ（２０１３年）Ｓｃｉｅｎｃｅ ３３９：８１９－８２３に記載されているもの等を用いて、ＴＣＲ及び／又はＨＬＡを阻害する人工ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系を生成することができる。ＴＣＲ及び／又はＨＬＡを阻害する、当技術分野で公知の他の人工ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系、例えばＴｓａｉ（２０１４）Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，３２：６ ５６９－５７６，米国特許第８，８７１，４４５号；同第８，８６５，４０６号；同第８，７９５，９６５号；同第８，７７１，９４５号；及び同第８，６９７，３５９号に記載されているものを生成してもよい。
「ＴＡＬＥＮ」又は「ＴＣＲ及び／又はＨＬＡに対するＴＡＬＥＮ」又は「ＴＣＲ及び／又はＨＬＡを阻害するためのＴＡＬＥＮ」は、ＴＣＲ及び／又はＨＬＡの編集に用いることのできる人工ヌクレアーゼである、転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼを指す。ＴＡＬＥＮは、ＴＡＬエフェクターＤＮＡ結合ドメインをＤＮＡ切断ドメインに融合することによって人工的に産生される。転写活性化因子様エフェクター（ＴＡＬＥ）は、ＴＣＲ及び／又はＨＬＡ遺伝子の一部を含む、任意の所望のＤＮＡ配列に結合するように遺伝子操作することができる。遺伝子操作されたＴＡＬＥをＤＮＡ切断ドメインと組み合せることにより、ＴＣＲ及び／又はＨＬＡ配列を含む、任意の所望のＤＮＡ配列に特異的な制限酵素を産生することができる。次に、これらを細胞に導入し、ゲノム編集に使用することができる。Ｂｏｃｈ（２０１１）Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈ．２９：１３５－６；及びＢｏｃｈ他（２００９）Ｓｃｉｅｎｃｅ ３２６：１５０９－１２；Ｍｏｓｃｏｕ他（２００９）Ｓｃｉｅｎｃｅ ３２６：３５０１。
ＴＡＬＥは、キサントモナス菌によって分泌されるタンパク質である。ＤＮＡ結合ドメインには、１２番目と１３番目のアミノ酸を除き、高度に保存された３３～３４個のアミノ酸配列が繰り返し含まれている。これらの２つの位置は非常に可変性が高く、特定のヌクレオチド認識と強い相関関係を示す。よって、それらは、所望のＤＮＡ配列に結合するように遺伝子操作することができる。ＴＡＬＥＮを産生するには、ＴＡＬＥタンパク質を、野生型又は変異型Ｆｏｋｌエンドヌクレアーゼであるヌクレアーゼ（Ｎ）に融合する。ＴＡＬＥＮにおける使用のために、Ｆｏｋｌにはいくつかの変異が加えられた。これらは、例えば、切断の特異性又は活性を改善する。Ｃｅｒｍａｋ他（２０１１）Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．３９：ｅ８２；Ｍｉｌｌｅｒ他（２０１１）Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈ．２９：１４３－８；Ｈｏｃｋｅｍｅｙｅｒ他（２０１１）Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈ．２９：７３１－７３４；Ｗｏｏｄ他（２０１１）Ｓｃｉｅｎｃｅ ３３３：３０７；Ｄｏｙｏｎ他（２０１０）Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｔｈｏｄｓ ８：７４－７９；Ｓｚｃｚｅｐｅｋ他（２００７）Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈ．２５：７８６－７９３；及びＧｕｏ他（２０１０）／．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２００：９６。Ｆｏｋｌドメインは二量体として機能し、適切な配向と間隔を有する標的ゲノムの部位に固有のＤＮＡ結合ドメインを有する２つのコンストラクトを必要とする。ＴＡＬＥ ＤＮＡ結合ドメインとＦｏｋｌ切断ドメインとの間のアミノ酸残基の数と、２つの個々のＴＡＬＥＮ結合部位間の塩基の数は、両方とも高レベルの活性を達成するための重要なパラメーターであるようである。Ｍｉｌｌｅｒ他（２０１１）Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈ．２９：１４３－８。ＴＣＲ及び／又はＨＬＡ ＴＡＬＥＮを細胞内で使用して、二本鎖切断（ＤＳＢ）を産生することができる。修復機構が非相同末端結合を介して破損を不適切に修復した場合、破損部位に変異を導入することができる。例えば、不適切な修復は、フレームシフトの突然変異を引き起こす場合がある。或いは、外来ＤＮＡをＴＡＬＥＮとともに細胞に導入することができる。外来ＤＮＡの配列及び染色体配列に応じて、このプロセスを用いて、ＴＣＲ及び／又はＨＬＡ遺伝子の欠陥を修正するか、そのような欠陥をｗｔ ＴＣＲ及び／又はＨＬＡ遺伝子に導入して、ＴＣＲ及び／又はＨＬＡの発現を減少させることができる。ＴＣＲ及び／又はＨＬＡの配列に特異的なＴＡＬＥＮは、モジュールコンポーネントを用いる様々なスキームを含む、当技術分野で公知の任意の方法を用いて構築することができる。Ｚｈａｎｇ他（２０１１）Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈ．２９：１４９－５３；Ｇｅｉｂｌｅｒ他（２０１１）ＰＬｏＳ ＯＮＥ ６：ｅｌ９５０９。
「ＺＦＮ」又は「ジンクフィンガーヌクレアーゼ」又は「ＴＣＲ及び／又はＨＬＡに対するＺＦＮ」又は「ＴＣＲ及び／又はＨＬＡを阻害するためのＺＦＮ」は、ＴＣＲ及び／又はＨＬＡ遺伝子の編集に用いることのできる人工ヌクレアーゼである、ジンクフィンガーヌクレアーゼを指す。ＴＡＬＥＮと同様に、ＺＦＮは、ＤＮＡ結合ドメインに融合したＦｏｋ１ヌクレアーゼドメイン（又はその誘導体）を含む。ＺＦＮの場合、ＤＮＡ結合ドメインは１つ以上のジンクフィンガーを含む。Ｃａｒｒｏｌｌ他（２０１１）Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｓｏｃｉｅｔｙ ｏｆ Ａｍｅｒｉｃａ １８８：７７３－７８２；及びＫｉｍ他（１９９６）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９３：１１５６－１１６０。ジンクフィンガーは、１つ以上の亜鉛イオンによって安定化された小さなタンパク質構造モチーフである。ジンクフィンガーは、例えばＣｙｓ２Ｈｉｓ２を含むことができ、約３ｂｐの配列を認識することができる。公知の特異性を有する様々なジンクフィンガーを組み合せて、約６、９、１２、１５又は１８ｂｐの配列を認識するマルチフィンガーポリペプチドを産生することができる。ファージディスプレイ、イーストワンハイブリッド系、バクテリアワンハイブリッド系及びツーハイブリッド系及び哺乳類細胞を含む、特定の配列を認識するジンクフィンガー（及びその組合せ）を生成するために、様々な選択及びモジュールアセンブリ技術が利用可能である。
ＴＡＬＥＮのように、ＺＦＮはＤＮＡを切断するために二量化する必要がある。よって、非パリンドロームＤＮＡ部位を標的とするためには１組のＺＦＮが必要である。２つの個々のＺＦＮは、適切に間隔を空けたヌクレアーゼを用いて、ＤＮＡの反対側の鎖に結合しなければならない。Ｂｉｔｉｎａｉｔｅ他（１９９８）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９５：１０５７０－５。また、ＴＡＬＥＮのように、ＺＦＮはＤＮＡに二本鎖切断を引き起こす場合があり、不適切に修復された場合、フレームシフト変異を引き起こし、細胞内のＴＣＲ及び／又はＨＬＡの発現と量の減少をもたらす。ＺＦＮは、ＴＣＲ及び／又はＨＬＡ遺伝子を変異させるための相同組換えにも用いることができる。ＴＣＲ及び／又はＨＬＡの配列に特異的なＺＦＮは、当技術分野で公知の任意の方法を用いて構築することができる。例えば、Ｐｒｏｖａｓｉ（２０１１）Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｄ．１８：８０７－８１５；Ｔｏｒｉｋａｉ（２０１３）Ｂｌｏｏｄ １２２：１３４１－１３４９；Ｃａｔｈｏｍｅｎ他（２００８）Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．１６：１２００－７；Ｑｕｏ他（２０１０）／．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４００：９６；ＵＳ２０１１／０１５８９５７；及びＵＳ２０１２／００６０２３０を参照。
「メガヌクレアーゼ」又は「ＴＣＲ及び／又はＨＬＡに対するメガヌクレアーゼ」又は「ＴＣＲ及び／又はＨＬＡを阻害するためのメガヌクレアーゼ」は、ＴＣＲ及び／又はＨＬＡ遺伝子の編集に用いることのできる、大きな（＞１４塩基対）認識部位を有する単量体エンドヌクレアーゼを指す。メガヌクレアーゼ（ｍｎ）は、細菌のホーミングエンドヌクレアーゼに由来し固有の標的部位用に遺伝子操作された生来のヌクレアーゼ活性を有する単量体タンパク質である。ホーミングエンドヌクレアーゼは、ＤＮＡ切断酵素であり、宿主ゲノムの個々の遺伝子座で二本鎖切断を生成し、それによって部位特異的な遺伝子変換イベントを駆動することができる。（Ｓｔｏｄｄａｒｄ，Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ．２０１１ １月１２；１９（１）：７－１５）．ホーミングエンドヌクレアーゼはサイズが小さいにもかかわらず、長いＤＮＡ配列（典型的には２０～３０塩基対）を認識する。ホーミングエンドヌクレアーゼは非常に広く普及しており、微生物やファージやウイルスに見られる。ＬＡＧＬＩＤＡＤＧ及びＨｉｓ－Ｃｙｓボックス酵素（これらの酵素の中で最も配列特異的である）は、ＤＮＡ標的部位の主要な溝にドッキングする逆平行βシートに依存する（Ｆｌｉｃｋ他、１９９８年；Ｊｕｒｉｃａ他、１９９８）。そこで、複数の連続した塩基対に不均一に分布する配列特異的及び非特異的な接触のコレクションを確立する（Ｃｈｅｖａｌｉｅｒ他、２００３；Ｓｃａｌｌｅｙ－Ｋｉｍ他、２００７）。
ＬＡＧＬＩＤＡＤＧホーミングエンドヌクレアーゼ（ＬＨＥ）ファミリーは、遺伝子標的化用途に用いられる遺伝子操作された酵素の主な供給源である。ＬＨＥファミリーは、主に古細菌内にコードされており、藻類及び真菌の葉緑体ゲノム及びミトコンドリアゲノムにコードされている（Ｃｈｅｖａｌｉｅｒ他、２００５；Ｄａｌｇａａｒｄ他、１９９７；Ｓｅｔｈｕｒａｍａｎ他、２００９）。タンパク質鎖ごとに単一の保存されたＬＡＧＬＩＤＡＤＧモチーフ（配列番号８５）を有するメガヌクレアーゼは、パリンドローム及びほぼパリンドロームのＤＮＡ標的配列を切断するホモダイマータンパク質を形成するが、タンパク質鎖ごとに２つのそのようなモチーフを含むものは、完全に非対称のＤＮＡ配列を標的化することのできるより大きな擬似対称モノマーを形成する。
メガヌクレアーゼは、ＴＣＲ及び／又はＨＬＡを標的とするように遺伝子操作することができ、よって、ＤＮＡに二本鎖切断が生じ、これは、不適切に修復された場合にフレームシフト変異を引き起こし、細胞内のＴＣＲ及び／又はＨＬＡの発現と量の減少につながる。
「ＭｅｇａＴＡＬ」又は「ＴＣＲ及び／又はＨＬＡに対するｍｅｇａＴＡＬ」又は「ＴＣＲ及び／又はＨＬＡを阻害するためのｍｅｇａＴＡＬ」とは、ＴＣＲ及び／又はＨＬＡ遺伝子の編集に用いることのできる人工ヌクレアーゼを指す。ＭｅｇａＴＡＬは、ＬＡＧＬＩＤＡＤＧホーミングエンドヌクレアーゼファミリーに由来するメガヌクレアーゼのＮ末端にミニマルＴＡＬ（転写アクチベーター様）エフェクタードメインを融合することによって得られるハイブリッド単量体ヌクレアーゼである（Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２０１４ ２月；４２（４）：２５９１－６０１；Ｔａｋｅｕｃｈｉ他、Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ．２０１５；１２３９：１０５－３２．ｄｏｉ：１０．１００７／９７８－１－４９３９－１８６２－１＿６）。
よって、ＭｅｇａＴＡＬは、ＴＡＬエフェクターＤＮＡ結合ドメインによってもたらされる追加の親和性と特異性を備えた部位特異的メガヌクレアーゼ切断ヘッドから成る。ＭｅｇａＴＡＬは、ＴＣＲ及び／又はＨＬＡを標的とするように遺伝子操作することができ、よって、ＤＮＡに二本鎖切断が生じ、これは、不適切に修復された場合にフレームシフト変異を引き起こし、細胞内のＨＬＡの発現と量の減少につながる。Ｉ－ＯｎｕＩメガヌクレアーゼ（ｍｎ）の変異体を用いて、Ｔ細胞受容体アルファ（ＴＣＲα）遺伝子をノックアウトするＴＣＲα－ｍｅｇａＴＡＬを設計した。ＴＣＲαｍｎを、ＴＣＲαｍｎ結合部位の上流のＤＮＡ配列に結合するように設計された１０．５反復ＴＡＬＥアレイに融合した。ＴＣＲαを標的とするｍｅｇａＴＡＬは、ヒト初代Ｔ細胞において検出可能なオフターゲット切断を伴わずに、非常に高い遺伝子破壊を達成することが分かった。（Ｂｏｉｓｓｅｌ他、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２０１４ ２月；４２（４）：２５９１－６０１）。
特定の理論に拘束されるものではないが、一部の実施形態では、治療用Ｔ細胞は、Ｔ細胞の短縮されたテロメアにより、患者において短期間の持続性しかない。したがって、テロメラーゼ遺伝子のトランスフェクションにより、Ｔ細胞のテロメアを延長し、患者におけるＴ細胞の持続性を改善することができる。Ｃａｒｌ Ｊｕｎｅ、「Ａｄｏｐｔｉｖｅ Ｔ ｃｅｌｌ ｔｈｅｒａｐｙ ｆｏｒ ｃａｎｃｅｒ ｉｎ ｔｈｅ ｃｌｉｎｉｃ」、Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｏｎ、１１７：１４６６－１４７６（２００７）を参照されたい。よって、実施形態では、本発明の遺伝子改変免疫細胞は、テロメラーゼサブユニット、例えばテロメラーゼの触媒サブユニット、例えばＴＥＲＴ、例えばｈＴＥＲＴを異所的に発現する。一部の態様では、本開示は、テロメラーゼサブユニット、例えばテロメラーゼの触媒サブユニット、例えばＴＥＲＴ、例えばｈＴＥＲＴをコードする核酸と免疫細胞を接触させることを含む、ＣＡＲ発現免疫細胞を産生する方法を提供する。細胞は、ＣＡＲをコードするコンストラクトと接触する前、同時又は後に、核酸と接触させられてよい。
ＶＩＩ．治療用途
本発明は、特定の免疫応答又は炎症応答の部位に免疫細胞を動員し、その部位で免疫エフェクター細胞の免疫学的活性を抑制するために免疫細胞を活性化する手段として、ＨＬＡ－Ａ２抗原を標的とするＣＡＲを発現するように改変された免疫細胞を提供する。免疫細胞のＣＡＲ媒介動員及び活性化により、そのような免疫抑制活性が有益である多くの免疫学的疾患若しくは障害を予防又は治療する方法が提供される。
一実施形態では、免疫細胞は制御性免疫細胞である。免疫細胞は、細胞療法での使用に適した任意の制御性免疫細胞であってよい（例えばＷｏｏｄ，Ｋ．Ｊ．他、２０１２；Ｐａｐｐ，Ｇ．他、２０１７を参照）。一実施形態では、制御性免疫細胞は、制御性Ｔ細胞、ＣＤ４＋制御性Ｔ細胞、ＣＤ８＋制御性Ｔ細胞、制御性γδＴ細胞、制御性ＤＮ Ｔ細胞、制御性Ｂ細胞、制御性ＮＫ細胞、制御性マクロファージ、制御性樹状細胞及びそれらの任意の組合せから成る群から選択される。一実施形態では、免疫細胞はヒト免疫細胞である。別の実施形態では、制御性免疫細胞はヒト制御性免疫細胞である。一実施形態では、ヒト制御性免疫細胞は、制御性Ｔ細胞、ＣＤ４＋制御性Ｔ細胞、ＣＤ８＋制御性Ｔ細胞、制御性γδＴ細胞、制御性ＤＮ Ｔ細胞、制御性Ｂ細胞、制御性ＮＫ細胞、制御性マクロファージ、制御性樹状細胞及びそれらの任意の組合せから成る群から選択される。
一実施形態では、免疫細胞は制御性Ｔ細胞であってよい。別の実施形態では、制御性Ｔ細胞はヒト制御性Ｔ細胞であってよい。制御性Ｔ細胞の活性化は抗原依存的であるが、これらの細胞の抑制作用は、抗原、ＴＣＲ及びＭＨＣに非依存的である。したがって、制御性Ｔ細胞におけるＣＡＲの発現により、これらの細胞とその活性化は適切な標的組織に向けて再指令されるので、それらは抗原特異的に活性化される。しかしながら、それらの抑制効果は、疾患関連抗原の更なる認識を必要とせずに生じる。したがって、免疫エフェクター細胞が位置し、望ましくない効果を媒介している場所のすぐ近くに制御性Ｔ細胞が存在する限り、再指令された制御性Ｔ細胞を、その位置で抑制効果を提供するように誘発又は活性化することができる。
一実施形態では、標的ＨＬＡ－Ａ２抗原は、免疫エフェクター細胞によって媒介される望ましくない免疫応答若しくは炎症応答の部位又は標的組織に存在するか、又はそこで発現してよい。
一実施形態では、本発明のＣＡＲ改変免疫細胞を、器官若しくは組織の移植片に関連する１つ以上の疾患、障害、症状又は状態（例えば、器官若しくは組織の拒絶反応／機能不全、ＧＶＨＤ、及び／又はそれに関連する状態）の予防又は治療に用いてよい。移植片拒絶反応は、免疫応答を介した、レシピエントの免疫細胞によるドナーの移植組織の破壊を伴う。免疫応答もＧＶＨＤに関与している。しかしながら、この場合、レシピエントの組織は、移植片を介してレシピエントに移されたドナーの免疫細胞によって破壊される。したがって、ＣＡＲを介した免疫細胞の再指令及び活性化により、移植レシピエントにおける免疫エフェクター細胞による不適合の細胞及び／若しくは組織の拒絶反応を抑制するか、又はＧＶＨＤの場合に移植免疫担当細胞の病原作用を抑制する方法が提供される。一実施形態では、不適合の細胞及び／又は組織は、ＨＬＡ－Ａ２不適合の細胞及び／又は組織を含む。
よって、本発明の別の実施形態は、対象において器官又は組織の移植片に関連する１つ以上の疾患、障害、症状又は状態（例えば、器官若しくは組織の拒絶反応／機能不全、ＧＶＨＤ、及び／又はそれらに関連する状態）を治療する方法であり、前記方法は、本明細書に記載のＣＡＲ遺伝子操作免疫細胞又は組成物を対象に投与することを含む。
一実施形態では、本方法は細胞療法である。一実施形態では、細胞療法は自己由来である。一実施形態では、細胞療法は異種間である。一実施形態では、細胞療法は同種異系間である。一実施形態では、本方法は遺伝子治療法である。
よって、本発明の別の実施形態は、対象において器官若しくは組織の移植片に関連する１つ以上の疾患、障害、症状又は状態（例えば、器官若しくは組織の拒絶反応／機能不全、ＧＶＨＤ、及び／又はそれらに関連する状態）を治療する際に用いられる、本明細書に記載のＣＡＲ遺伝子操作免疫細胞又は組成物である。
本発明のＣＡＲ改変免疫細胞は、対象における免疫寛容、移植後の免疫寛容及び／又は免疫順応を促進するために用いることができる。本発明のＣＡＲ改変免疫細胞は、器官又は組織の移植後の対象において免疫寛容、移植後の免疫寛容及び／又は免疫順応を促進するために用いることができる。一実施形態では、対象における免疫寛容、移植後の免疫寛容及び／又は免疫順応を促進する方法が提供され、本方法は、本明細書のどこかに記載されているＣＡＲ改変免疫細胞を対象に投与することを含む。別の実施形態では、対象における免疫寛容、移植後の免疫寛容及び／又は免疫順応を促進する方法が提供され、本方法は、本明細書のどこかに記載されている医薬組成物を対象に投与することを含む。一実施形態では、使用は、対象における移植された器官又は組織に対する免疫寛容、移植後の免疫寛容及び／又は免疫順応を促進するためであってよい。一実施形態では、ＣＡＲ改変免疫細胞は、器官又は組織の移植と同時に、その前に、又はその後に投与される。一実施形態では、ＣＡＲ改変免疫細胞は、器官又は組織の移植と同時に投与される。別の実施形態において、ＣＡＲ改変免疫細胞は、器官又は組織の移植の前に投与される。一実施形態では、ＣＡＲ改変免疫細胞は、器官又は組織の移植の後に投与される。一実施形態では、免疫細胞は制御性免疫細胞である。一実施形態では、制御性免疫細胞は、制御性Ｔ細胞、ＣＤ４＋制御性Ｔ細胞、ＣＤ８＋制御性Ｔ細胞、制御性γδＴ細胞、制御性ＤＮ Ｔ細胞、制御性Ｂ細胞、制御性ＮＫ細胞、制御性マクロファージ、制御性樹状細胞及びそれらの任意の組合せから成る群から選択される。一実施形態では、免疫細胞は制御性Ｔ細胞である。一実施形態では、免疫細胞はＣＤ４＋制御性Ｔ細胞である。一実施形態では、免疫細胞はヒト免疫細胞である。別の実施形態では、制御性免疫細胞はヒト制御性免疫細胞である。一実施形態では、ヒト制御性免疫細胞は、制御性Ｔ細胞、ＣＤ４＋制御性Ｔ細胞、ＣＤ８＋制御性Ｔ細胞、制御性γδＴ細胞、制御性ＤＮ Ｔ細胞、制御性Ｂ細胞、制御性ＮＫ細胞、制御性マクロファージ、制御性樹状細胞及びそれらの任意の組合せから成る群から選択される。別の実施形態では、免疫細胞はヒト制御性Ｔ細胞である。一実施形態では、免疫細胞はヒトＣＤ４＋制御性Ｔ細胞である。
本発明のＣＡＲ改変免疫細胞は、移植された器官又は組織の拒絶反応を予防又は治療するために用いることができる。一実施形態では、本発明のＣＡＲ改変免疫（例えばＣＡＲ遺伝子操作Ｔｒｅｇ細胞）細胞は、移植された器官又は組織の超急性拒絶反応を予防又は治療するために用いてよい。一実施形態では、本発明のＣＡＲ改変免疫細胞（例えばＣＡＲ遺伝子操作Ｔｒｅｇ細胞）は、移植された器官又は組織の抗体媒介拒絶反応を予防又は治療するために用いてよい。一実施形態では、本方法は、本発明のＣＡＲ改変免疫細胞（例えばＣＡＲ遺伝子操作Ｔｒｅｇ細胞）を、移植された器官又は組織に曝露された対象に投与することを含む。一実施形態では、移植された器官又は組織は、対象に意図的に導入された、骨髄移植片、器官移植片、輸血又はその他の外来の組織若しくは細胞を包含してよい。一実施形態では、本発明のＣＡＲ改変免疫細胞（例えばＣＡＲ遺伝子操作Ｔｒｅｇ細胞）は、移植後の移植片拒絶反応を阻害するための治療法として用いてよい。一実施形態では、移植片拒絶反応は、同種移植片拒絶反応であってよい。一実施形態では、移植片拒絶反応は、異種移植片拒絶反応であってよい。一実施形態では、対象における器官又は組織の移植拒絶反応を予防又は治療する方法が提供され、本方法は、本明細書のどこかに記載されているＣＡＲ改変免疫細胞を対象に投与することを含む。一実施形態では、対象における器官又は組織の移植拒絶反応を予防又は治療する方法が提供され、本方法は、本明細書のどこかに記載されている医薬組成物を対象に投与することを含む。よって、本発明の別の実施形態は、対象における器官若しくは組織の移植拒絶反応の防止又は治療に用いるための、本発明のＣＡＲ操作免疫細胞（例えばＣＡＲ遺伝子操作Ｔｒｅｇ細胞）、又は前記免疫細胞を含む医薬組成物である。一実施形態では、本発明は、対象における移植片生存期間を延長する方法を提供し、本方法は、本明細書のどこかに記載されているＣＡＲ改変免疫細胞（例えばＣＡＲ遺伝子操作Ｔｒｅｇ細胞）を対象に投与することを含む。一実施形態では、本発明は、対象における移植片生存期間を延長する方法を提供し、本方法は、本明細書のどこかに記載されている医薬組成物を対象に投与することを含む。一実施形態では、本方法は、１週間、２週間、３週間、１ヶ月、２ヶ月、３ヶ月、４ヶ月、５ヶ月、６ヶ月、７ヶ月、８ヶ月、９ヶ月、１０ヶ月、１１ヶ月、１年、２年、３年、４年、５年、６年、７年、８年、９年、１０年、２０年、３０年、４０年、５０年、６０年、７０年、８０年、９０年、１００年又は対象の寿命の移植片生存期間を提供する。一実施形態では、対象は免疫抑制剤療法を受けていない。一実施形態では、本発明の免疫細胞又は組成物の投与により、対象が受ける免疫抑制剤療法の量を減らすことができる。一実施形態では、移植片は同種移植片であってよい。一実施形態では、移植片は、レシピエントへの移植片の移植と同時に、その前に、又はその後に、本発明のＣＡＲ改変免疫細胞に曝露されてよい。一実施形態では、器官又は組織の移植片は、心臓、心臓弁、肺、腎臓、肝臓、膵臓、腸、皮膚、血管、骨髄、幹細胞、骨又は膵島細胞であってよい。しかしながら、本発明は特定の種類の移植に限定されない。一実施形態では、レシピエントに対する移植片の免疫原性を低減することによって、移植片拒絶反応を軽減又予防するために、レシピエントへの移植の前の器官又は組織の移植片を本発明のＣＡＲ改変免疫細胞を用いて処理することにより、ドナー移植片を「プレコンディショニング」又は「前処理」することができる。一実施形態では、移植片宿主又はレシピエントは、ＨＬＡ－Ａ２陰性である。一実施形態では、移植片宿主又はレシピエントは、ＨＬＡ－Ａ２陰性であり、ＨＬＡ－Ａ＊０３、ＨＬＡ－Ａ＊２５、ＨＬＡ－Ａ＊２９、ＨＬＡ－Ａ＊３０、ＨＬＡ－Ａ＊３１、ＨＬＡ－Ａ＊３３、ＨＬＡ－Ａ＊３６、ＨＬＡ－Ａ＊６８のうちの１つ又は２つから選択される１つ又は２つの異なるＨＬＡ－Ａサブタイプに対して陽性である。一実施形態では、移植片宿主又はレシピエントは、ＨＬＡ－Ａ２陰性であり、ＨＬＡ－Ａ＊０３、ＨＬＡ－Ａ＊２５、ＨＬＡ－Ａ＊２９、ＨＬＡ－Ａ＊３０、ＨＬＡ－Ａ＊３１、ＨＬＡ－Ａ＊３３、ＨＬＡ－Ａ＊３６、ＨＬＡ－Ａ＊６８のうちの１つから選択される１つのＨＬＡ－Ａサブタイプに対して陽性である。一実施形態では、移植片宿主又はレシピエントは、ＨＬＡ－Ａ２陰性であり、ＨＬＡ－Ａ＊０３、ＨＬＡ－Ａ＊２５、ＨＬＡ－Ａ＊２９、ＨＬＡ－Ａ＊３０、ＨＬＡ－Ａ＊３１、ＨＬＡ－Ａ＊３３、ＨＬＡ－Ａ＊３６、ＨＬＡ－Ａ＊６８のうちの１つ又は２つから選択される２つの異なるＨＬＡ－Ａサブタイプに対して陽性である。一実施形態では、移植片宿主又はレシピエントは、ＨＬＡ－Ａ２陰性であり、ＨＬＡ－Ａ＊０３、ＨＬＡ－Ａ＊２５、ＨＬＡ－Ａ＊２９、ＨＬＡ－Ａ＊３０、ＨＬＡ－Ａ＊３１、ＨＬＡ－Ａ＊３３、ＨＬＡ－Ａ＊３６、ＨＬＡ－Ａ＊６８のうちの１つから選択される２つの異なるＨＬＡ－Ａサブタイプに対して陽性である。一実施形態では、移植片宿主又はレシピエントは、ＨＬＡ－Ａ２陰性であり、ＨＬＡ－Ａ＊０３、ＨＬＡ－Ａ＊２５、ＨＬＡ－Ａ＊２９、ＨＬＡ－Ａ＊３０、ＨＬＡ－Ａ＊３１、ＨＬＡ－Ａ＊３３、ＨＬＡ－Ａ＊３６、ＨＬＡ－Ａ＊６８のうちの２つから選択される２つの異なるＨＬＡ－Ａサブタイプについて陽性である。一実施形態では、移植片宿主又はレシピエントは、ＨＬＡ－Ａ２陰性であり、ＨＬＡ－Ａ＊２５、ＨＬＡ－Ａ＊２９、ＨＬＡ－Ａ＊３０のうちの１つ又は２つから選択される１つ又は２つの異なるＨＬＡ－Ａサブタイプに対して陽性である。一実施形態では、移植片宿主又はレシピエントは、ＨＬＡ－Ａ２陰性であり、ＨＬＡ－Ａ＊２５、ＨＬＡ－Ａ＊２９、ＨＬＡ－Ａ＊３０のうちの１つから選択される１つのＨＬＡ－Ａサブタイプに対して陽性である。一実施形態では、移植片宿主又はレシピエントは、ＨＬＡ－Ａ２陰性であり、ＨＬＡ－Ａ＊２５、ＨＬＡ－Ａ＊２９、ＨＬＡ－Ａ＊３０のうちの１つ又は２つから選択される２つの異なるＨＬＡ－Ａサブタイプに対して陽性である。一実施形態では、移植片宿主又はレシピエントは、ＨＬＡ－Ａ２陰性であり、ＨＬＡ－Ａ＊２５、ＨＬＡ－Ａ＊２９、ＨＬＡ－Ａ＊３０のうちの１つから選択される２つの異なるＨＬＡ－Ａサブタイプに対して陽性である。一実施形態では、移植片宿主又はレシピエントは、ＨＬＡ－Ａ２陰性であり、ＨＬＡ－Ａ＊２５、ＨＬＡ－Ａ＊２９、ＨＬＡ－Ａ＊３０のうちの２つから選択される２つの異なるＨＬＡ－Ａサブタイプに対して陽性である。一実施形態では、移植片宿主又はレシピエントは、ＨＬＡ－Ａ２陰性であり、ＨＬＡ－Ａ＊０３のＨＬＡ－Ａサブタイプに対して陽性である。一実施形態では、移植片宿主又はレシピエントは、ＨＬＡ－Ａ２陰性であり、ＨＬＡ－Ａ＊２５のＨＬＡ－Ａサブタイプに対して陽性である。一実施形態では、移植片宿主又はレシピエントは、ＨＬＡ－Ａ２陰性であり、ＨＬＡ－Ａ＊２９のＨＬＡ－Ａサブタイプに対して陽性である。一実施形態では、移植片宿主又はレシピエントは、ＨＬＡ－Ａ２陰性であり、ＨＬＡ－Ａ＊３０のＨＬＡ－Ａサブタイプに対して陽性である。一実施形態では、移植片宿主又はレシピエントは、ＨＬＡ－Ａ２陰性であり、ＨＬＡ－Ａ＊３１のＨＬＡ－Ａサブタイプに対して陽性である。一実施形態では、移植片宿主又はレシピエントは、ＨＬＡ－Ａ２陰性であり、ＨＬＡ－Ａ＊３３のＨＬＡ－Ａサブタイプに対して陽性である。一実施形態では、移植片宿主又はレシピエントは、ＨＬＡ－Ａ２陰性であり、ＨＬＡ－Ａ＊３６のＨＬＡ－Ａサブタイプに対して陽性である。一実施形態では、移植片宿主又はレシピエントは、ＨＬＡ－Ａ２陰性であり、ＨＬＡ－Ａ＊６８のＨＬＡ－Ａサブタイプに対して陽性である。一実施形態では、移植片宿主又はレシピエントは、ＨＬＡ－Ａ２陰性であり、ＨＬＡ－Ａ＊０３：０１、ＨＬＡ－Ａ＊２５：０１、ＨＬＡ－Ａ＊２９：０２、ＨＬＡ－Ａ＊３０：０１、ＨＬＡ－Ａ＊３１：０１、ＨＬＡ－Ａ＊３３：０１、ＨＬＡ－Ａ＊３６：０１及びＨＬＡ－Ａ＊６８：０１のうちの１つ又は２つに対して陽性である。一実施形態では、移植片宿主又はレシピエントは、ＨＬＡ－Ａ２陰性であり、ＨＬＡ－Ａ＊０３：０１、ＨＬＡ－Ａ＊２５：０１、ＨＬＡ－Ａ＊２９：０２、ＨＬＡ－Ａ＊３０：０１、ＨＬＡ－Ａ＊３１：０１、ＨＬＡ－Ａ＊３３：０１、ＨＬＡ－Ａ＊３６：０１及びＨＬＡ－Ａ＊６８：０１のうちの１つに対して陽性である。一実施形態では、移植片宿主又はレシピエントは、ＨＬＡ－Ａ２陰性であり、ＨＬＡ－Ａ＊０３：０１、ＨＬＡ－Ａ＊２５：０１、ＨＬＡ－Ａ＊２９：０２、ＨＬＡ－Ａ＊３０：０１、ＨＬＡ－Ａ＊３１：０１、ＨＬＡ－Ａ＊３３：０１、ＨＬＡ－Ａ＊３６：０１及びＨＬＡ－Ａ＊６８：０１のうちの２つに対して陽性である。一実施形態では、移植片宿主又はレシピエントは、ＨＬＡ－Ａ２陰性であり、ＨＬＡ－Ａ＊２５：０１、ＨＬＡ－Ａ＊２９：０２及びＨＬＡ－Ａ＊３０：０１のうちの１つ又は２つに対して陽性である。一実施形態では、移植片宿主又はレシピエントは、ＨＬＡ－Ａ２陰性であり、ＨＬＡ－Ａ＊２５：０１、ＨＬＡ－Ａ＊２９：０２及びＨＬＡ－Ａ＊３０：０１のうちの１つに対して陽性である。一実施形態では、移植片宿主又はレシピエントは、ＨＬＡ－Ａ２陰性であり、ＨＬＡ－Ａ＊２５：０１、ＨＬＡ－Ａ＊２９：０２及びＨＬＡ－Ａ＊３０：０１のうちの２つに対して陽性である。一実施形態では、移植片宿主又はレシピエントは、ＨＬＡ－Ａ２陰性であり、ＨＬＡ－Ａ＊２５：０１に対して陽性である。一実施形態では、移植片宿主又はレシピエントは、ＨＬＡ－Ａ２陰性であり、ＨＬＡ－Ａ＊２９：０２に対して陽性である。一実施形態では、移植片宿主又はレシピエントは、ＨＬＡ－Ａ２陰性であり、ＨＬＡ－Ａ＊３０：０１について陽性である。一実施形態では、移植片宿主又はレシピエントは、ＨＬＡ－Ａ２陰性であり、ＨＬＡ－Ａ＊０３：０１に対して陽性である。一実施形態では、移植片宿主又はレシピエントは、ＨＬＡ－Ａ２陰性であり、ＨＬＡ－Ａ＊３１：０１に対して陽性である。一実施形態では、移植片宿主又はレシピエントは、ＨＬＡ－Ａ２陰性であり、ＨＬＡ－Ａ＊３３：０１に対して陽性である。一実施形態では、移植片宿主又はレシピエントは、ＨＬＡ－Ａ２陰性であり、ＨＬＡ－Ａ＊３６：０１に対して陽性である。一実施形態では、移植片宿主又はレシピエントは、ＨＬＡ－Ａ２陰性であり、ＨＬＡ－Ａ＊６８：０１に対して陽性である。一実施形態では、移植片はＨＬＡ－Ａ２陽性である。
一実施形態では、免疫細胞は制御性免疫細胞である。一実施形態では、制御性免疫細胞は、制御性Ｔ細胞、ＣＤ４＋制御性Ｔ細胞、ＣＤ８＋制御性Ｔ細胞、制御性γδＴ細胞、制御性ＤＮ Ｔ細胞、制御性Ｂ細胞、制御性ＮＫ細胞、制御性マクロファージ、制御性樹状細胞及びそれらの任意の組合せから成る群から選択される。一実施形態では、免疫細胞は制御性Ｔ細胞である。一実施形態では、免疫細胞はＣＤ４＋制御性Ｔ細胞である。一実施形態では、免疫細胞はヒト免疫細胞である。別の実施形態では、制御性免疫細胞はヒト制御性免疫細胞である。一実施形態では、ヒト制御性免疫細胞は、制御性Ｔ細胞、ＣＤ４＋制御性Ｔ細胞、ＣＤ８＋制御性Ｔ細胞、制御性γδＴ細胞、制御性ＤＮ Ｔ細胞、制御性Ｂ細胞、制御性ＮＫ細胞、制御性マクロファージ、制御性樹状細胞及びそれらの任意の組合せから成る群から選択される。別の実施形態では、免疫細胞はヒト制御性Ｔ細胞である。一実施形態では、免疫細胞はヒトＣＤ４＋制御性Ｔ細胞である。
本発明のＣＡＲ改変免疫細胞（例えばＣＡＲ遺伝子操作Ｔｒｅｇ細胞）は、移植片対宿主病（ＧＶＨＤ）を予防又は治療するために用いてよい。一実施形態では、本方法は、本発明のＣＡＲ改変免疫細胞（例えばＣＡＲ遺伝子操作Ｔｒｅｇ細胞）を、移植された器官又は組織に曝露された対象に投与することを含む。一実施形態では、移植された器官又は組織は、対象に意図的に導入された、骨髄移植片、器官移植片、輸血又はその他の外来の組織若しくは細胞を包含してよい。例えば、ＧＶＨＤは、心臓、心臓弁、肺、腎臓、肝臓、膵臓、腸、皮膚、血管、骨髄、幹細胞、骨又は膵島細胞の移植後に発生するおそれがある。しかしながら、本発明は特定のタイプの移植に限定されない。一実施形態では、ＧＶＨＤは、造血幹細胞移植の後に発生し得る。一実施形態では、対象における移植片対宿主病（ＧＶＨＤ）を予防又は治療する方法が提供され、本方法は、本明細書のどこかに記載されているＣＡＲ改変免疫細胞を対象に投与することを含む。一実施形態では、対象における移植片対宿主病（ＧＶＨＤ）を予防又は治療する方法が提供され、本方法は、本明細書のどこかに記載されている医薬組成物を対象に投与することを含む。一実施形態では、本発明は、レシピエントへの移植片の移植と同時に、その前に、又はその後に、ドナー移植片、例えば生体適合性格子又はドナー組織、器官若しくは細胞を、本発明のＣＡＲ改変免疫細胞に接触させる方法を提供する。一実施形態では、本発明のＣＡＲ改変免疫細胞を用いて、レシピエントに対するドナー移植片による有害反応を改善、阻害又は低減し、それによりＧＶＨＤを予防又は治療してよい。一実施形態では、本発明は、対象におけるＧＶＨＤの発症を予防又は遅延させる方法を提供し、本方法は、本明細書のどこかに記載されているＣＡＲ改変免疫細胞を対象に投与することを含む。一実施形態では、本発明は、対象におけるＧＶＨＤの発症を予防又は遅延させる方法を提供し、本方法は、本明細書のどこかに記載されている医薬組成物を対象に投与することを含む。一実施形態では、ＧＶＨＤの発症は、１週間、２週間、３週間、１ヶ月、２ヶ月、３ヶ月、４ヶ月、５ヶ月、６ヶ月、７ヶ月、８ヶ月、９ヶ月、１０ヶ月、１１ヶ月、１年、２年、３年、４年、５年、６年、７年、８年、９年、１０年、２０年、３０年、４０年、５０年、６０年、７０年、８０年、９０年、１００年又は対象の寿命にわたって遅延させられる。一実施形態では、対象は免疫抑制剤療法を受けていない。一実施形態では、対象は免疫抑制療法を受けている。一実施形態では、本発明の免疫細胞は、前記免疫抑制療法の治療有効量を低減する目的で対象に投与される。一実施形態では、ＧＶＨＤは、急性ＧＶＨＤ又は慢性ＧＶＨＤであってよい。一実施形態では、レシピエントに対する移植片の免疫原性を低減することによって、ＧＶＨＤ軽減又予防するために、レシピエントへの移植の前の移植片を本発明のＣＡＲ改変免疫細胞（例えば遺伝子ＣＡＲ操作Ｔｒｅｇ細胞）を用いて処理することにより、ドナー移植片を「プレコンディショニング」又は「前処理」してよい。一実施形態では、移植片に関連し得るＴ細胞を活性化するために、移植の前に、移植片をレシピエントからの細胞又は組織と接触させてよい。レシピエントからの細胞又は組織による移植片の処置の後、細胞又は組織は移植片から除去されてよい。次いで、処置された移植片を本発明のＣＡＲ改変免疫細胞（例えばＣＡＲ遺伝子操作Ｔｒｅｇ細胞）と更に接触させて、レシピエントからの細胞又は組織の処置によって活性化された免疫エフェクター細胞の活性を低下、阻害又は排除してよい。この本発明のＣＡＲ改変免疫細胞による移植片の処置に続いて、レシピエントへの移植の前に、ＣＡＲ改変免疫細胞を移植片から除去してよい。しかしながら、一部のＣＡＲ改変免疫細胞は、移植片に接着する可能性があるので、移植片と共にレシピエントに導入されてよい。この状況では、レシピエントに導入されたＣＡＲ改変免疫細胞が、移植片に関連する細胞によって引き起こされるレシピエントに対する免疫応答を抑制する可能性がある。一実施形態では、移植片宿主又はレシピエントは、ＨＬＡ－Ａ２陰性である。一実施形態では、移植片宿主又はレシピエントは、ＨＬＡ－Ａ２陰性であり、ＨＬＡ－Ａ＊０３、ＨＬＡ－Ａ＊２５、ＨＬＡ－Ａ＊２９、ＨＬＡ－Ａ＊３０、ＨＬＡ－Ａ＊３１、ＨＬＡ－Ａ＊３３、ＨＬＡ－Ａ＊３６、ＨＬＡ－Ａ＊６８のうちの１つ又は２つから選択される１つ又は２つの異なるＨＬＡ－Ａサブタイプに対して陽性である。一実施形態では、移植片宿主又はレシピエントは、ＨＬＡ－Ａ２陰性であり、ＨＬＡ－Ａ＊０３、ＨＬＡ－Ａ＊２５、ＨＬＡ－Ａ＊２９、ＨＬＡ－Ａ＊３０、ＨＬＡ－Ａ＊３１、ＨＬＡ－Ａ＊３３、ＨＬＡ－Ａ＊３６、ＨＬＡ－Ａ＊６８のうちの１つから選択される１つのＨＬＡ－Ａサブタイプに対して陽性である。一実施形態では、移植片宿主又はレシピエントは、ＨＬＡ－Ａ２陰性であり、ＨＬＡ－Ａ＊０３、ＨＬＡ－Ａ＊２５、ＨＬＡ－Ａ＊２９、ＨＬＡ－Ａ＊３０、ＨＬＡ－Ａ＊３１、ＨＬＡ－Ａ＊３３、ＨＬＡ－Ａ＊３６、ＨＬＡ－Ａ＊６８のうちの１つ又は２つから選択される２つの異なるＨＬＡ－Ａサブタイプに対して陽性である。一実施形態では、移植片宿主又はレシピエントは、ＨＬＡ－Ａ２陰性であり、ＨＬＡ－Ａ＊０３、ＨＬＡ－Ａ＊２５、ＨＬＡ－Ａ＊２９、ＨＬＡ－Ａ＊３０、ＨＬＡ－Ａ＊３１、ＨＬＡ－Ａ＊３３、ＨＬＡ－Ａ＊３６、ＨＬＡ－Ａ＊６８のうちの１つから選択される２つの異なるＨＬＡ－Ａサブタイプに対して陽性である。一実施形態では、移植片宿主又はレシピエントは、ＨＬＡ－Ａ２陰性であり、ＨＬＡ－Ａ＊０３、ＨＬＡ－Ａ＊２５、ＨＬＡ－Ａ＊２９、ＨＬＡ－Ａ＊３０、ＨＬＡ－Ａ＊３１、ＨＬＡ－Ａ＊３３、ＨＬＡ－Ａ＊３６、ＨＬＡ－Ａ＊６８のうちの２つから選択される２つの異なるＨＬＡ－Ａサブタイプに対して陽性である。一実施形態では、移植片宿主又はレシピエントは、ＨＬＡ－Ａ２陰性であり、ＨＬＡ－Ａ＊２５、ＨＬＡ－Ａ＊２９、ＨＬＡ－Ａ＊３０のうちの１つ又は２つから選択される１つ又は２つの異なるＨＬＡ－Ａサブタイプに対して陽性である。一実施形態では、移植片宿主又はレシピエントは、ＨＬＡ－Ａ２陰性であり、ＨＬＡ－Ａ＊２５、ＨＬＡ－Ａ＊２９、ＨＬＡ－Ａ＊３０のうちの１つから選択される１つのＨＬＡ－Ａサブタイプに対して陽性である。一実施形態では、移植片宿主又はレシピエントは、ＨＬＡ－Ａ２陰性であり、ＨＬＡ－Ａ＊２５、ＨＬＡ－Ａ＊２９、ＨＬＡ－Ａ＊３０のうちの１つ又は２つから選択される２つの異なるＨＬＡ－Ａサブタイプに対して陽性である。一実施形態では、移植片宿主又はレシピエントは、ＨＬＡ－Ａ２陰性であり、ＨＬＡ－Ａ＊２５、ＨＬＡ－Ａ＊２９、ＨＬＡ－Ａ＊３０の１つから選択される２つの異なるＨＬＡ－Ａサブタイプに対して陽性である。一実施形態では、移植片宿主又はレシピエントは、ＨＬＡ－Ａ２陰性であり、ＨＬＡ－Ａ＊２５、ＨＬＡ－Ａ＊２９、ＨＬＡ－Ａ＊３０のうちの２つから選択される２つの異なるＨＬＡ－Ａサブタイプに対して陽性である。一実施形態では、移植片宿主又はレシピエントは、ＨＬＡ－Ａ２陰性であり、ＨＬＡ－Ａ＊０３のＨＬＡ－Ａサブタイプに対して陽性である。一実施形態では、移植片宿主又はレシピエントは、ＨＬＡ－Ａ２陰性であり、ＨＬＡ－Ａ＊２５のＨＬＡ－Ａサブタイプに対して陽性である。一実施形態では、移植片宿主又はレシピエントは、ＨＬＡ－Ａ２陰性であり、ＨＬＡ－Ａ＊２９のＨＬＡ－Ａサブタイプに対して陽性である。一実施形態では、移植片宿主又はレシピエントは、ＨＬＡ－Ａ２陰性であり、ＨＬＡ－Ａ＊３０のＨＬＡ－Ａサブタイプに対して陽性である。一実施形態では、移植片宿主又はレシピエントは、ＨＬＡ－Ａ２陰性であり、ＨＬＡ－Ａ＊３１のＨＬＡ－Ａサブタイプに対して陽性である。一実施形態では、移植片宿主又はレシピエントは、ＨＬＡ－Ａ２陰性であり、ＨＬＡ－Ａ＊３３のＨＬＡ－Ａサブタイプに対して陽性である。一実施形態では、移植片宿主又はレシピエントは、ＨＬＡ－Ａ２陰性であり、ＨＬＡ－Ａ＊３６のＨＬＡ－Ａサブタイプに対して陽性である。一実施形態では、移植片宿主又はレシピエントは、ＨＬＡ－Ａ２陰性であり、ＨＬＡ－Ａ＊６８のＨＬＡ－Ａサブタイプに対して陽性である。一実施形態では、移植片宿主又はレシピエントは、ＨＬＡ－Ａ２陰性であり、ＨＬＡ－Ａ＊０３：０１、ＨＬＡ－Ａ＊２５：０１、ＨＬＡ－Ａ＊２９：０２、ＨＬＡ－Ａ＊３０：０１、ＨＬＡ－Ａ＊３１：０１、ＨＬＡ－Ａ＊３３：０１、ＨＬＡ－Ａ＊３６：０１及びＨＬＡ－Ａ＊６８：０１のうちの１つ又は２つに対して陽性である。一実施形態では、移植片宿主又はレシピエントは、ＨＬＡ－Ａ２陰性であり、ＨＬＡ－Ａ＊０３：０１、ＨＬＡ－Ａ＊２５：０１、ＨＬＡ－Ａ＊２９：０２、ＨＬＡ－Ａ＊３０：０１、ＨＬＡ－Ａ＊３１：０１、ＨＬＡ－Ａ＊３３：０１、ＨＬＡ－Ａ＊３６：０１及びＨＬＡ－Ａ＊６８：０１のうちの１つに対して陽性である。一実施形態では、移植片宿主又はレシピエントは、ＨＬＡ－Ａ２陰性であり、ＨＬＡ－Ａ＊０３：０１、ＨＬＡ－Ａ＊２５：０１、ＨＬＡ－Ａ＊２９：０２、ＨＬＡ－Ａ＊３０：０１、ＨＬＡ－Ａ＊３１：０１、ＨＬＡ－Ａ＊３３：０１、ＨＬＡ－Ａ＊３６：０１及びＨＬＡ－Ａ＊６８：０１のうちの２つに対して陽性である。一実施形態では、移植片宿主又はレシピエントは、ＨＬＡ－Ａ２陰性であり、ＨＬＡ－Ａ＊２５：０１、ＨＬＡ－Ａ＊２９：０２及びＨＬＡ－Ａ＊３０：０１のうちの１つ又は２つに対して陽性である。一実施形態では、移植片宿主又はレシピエントは、ＨＬＡ－Ａ２陰性であり、ＨＬＡ－Ａ＊２５：０１、ＨＬＡ－Ａ＊２９：０２及びＨＬＡ－Ａ＊３０：０１のうちの１つに対して陽性である。一実施形態では、移植片宿主又はレシピエントは、ＨＬＡ－Ａ２陰性であり、ＨＬＡ－Ａ＊２５：０１、ＨＬＡ－Ａ＊２９：０２及びＨＬＡ－Ａ＊３０：０１のうちの２つに対して陽性である。一実施形態では、移植片宿主又はレシピエントは、ＨＬＡ－Ａ２陰性であり、ＨＬＡ－Ａ＊２５：０１に対して陽性である。一実施形態では、移植片宿主又はレシピエントは、ＨＬＡ－Ａ２陰性であり、ＨＬＡ－Ａ＊２９：０２に対して陽性である。一実施形態では、移植片宿主又はレシピエントは、ＨＬＡ－Ａ２陰性であり、ＨＬＡ－Ａ＊３０：０１について陽性である。一実施形態では、移植片宿主又はレシピエントは、ＨＬＡ－Ａ２陰性であり、ＨＬＡ－Ａ＊０３：０１に対して陽性である。一実施形態では、移植片宿主又はレシピエントは、ＨＬＡ－Ａ２陰性であり、ＨＬＡ－Ａ＊３１：０１に対して陽性である。一実施形態では、移植片宿主又はレシピエントは、ＨＬＡ－Ａ２陰性であり、ＨＬＡ－Ａ＊３３：０１に対して陽性である。一実施形態では、移植片宿主又はレシピエントは、ＨＬＡ－Ａ２陰性であり、ＨＬＡ－Ａ＊３６：０１に対して陽性である。一実施形態では、移植片宿主又はレシピエントは、ＨＬＡ－Ａ２陰性であり、ＨＬＡ－Ａ＊６８：０１に対して陽性である。一実施形態では、移植片はＨＬＡ－Ａ２陽性である。一実施形態では、免疫細胞は制御性免疫細胞である。一実施形態では、制御性免疫細胞は、制御性Ｔ細胞、ＣＤ４＋制御性Ｔ細胞、ＣＤ８＋制御性Ｔ細胞、制御性γδＴ細胞、制御性ＤＮ Ｔ細胞、制御性Ｂ細胞、制御性ＮＫ細胞、制御性マクロファージ、制御性樹状細胞及びそれらの任意の組合せから成る群から選択される。一実施形態では、免疫細胞は制御性Ｔ細胞である。一実施形態では、免疫細胞はＣＤ４＋制御性Ｔ細胞である。一実施形態では、免疫細胞はヒト免疫細胞である。別の実施形態では、制御性免疫細胞はヒト制御性免疫細胞である。一実施形態では、ヒト制御性免疫細胞は、制御性Ｔ細胞、ＣＤ４＋制御性Ｔ細胞、ＣＤ８＋制御性Ｔ細胞、制御性γδＴ細胞、制御性ＤＮ Ｔ細胞、制御性Ｂ細胞、制御性ＮＫ細胞、制御性マクロファージ、制御性樹状細胞及びそれらの任意の組合せから成る群から選択される。別の実施形態では、免疫細胞
はヒト制御性Ｔ細胞である。一実施形態では、免疫細胞はヒトＣＤ４＋制御性Ｔ細胞である。
一実施形態では、本発明は、免疫細胞集団を増殖させる方法を提供し、免疫細胞はキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を発現するように改変されており、本方法は、本明細書のどこかに記載されている免疫細胞を対象に投与することを含み、投与される改変免疫細胞は、対象において子孫免疫細胞集団を産生する。一実施形態では、免疫細胞は制御性免疫細胞である。一実施形態では、制御性免疫細胞は、制御性Ｔ細胞、ＣＤ４＋制御性Ｔ細胞、ＣＤ８＋制御性Ｔ細胞、制御性γδＴ細胞、制御性ＤＮ Ｔ細胞、制御性Ｂ細胞、制御性ＮＫ細胞、制御性マクロファージ、制御性樹状細胞及びそれらの任意の組合せから成る群から選択される。一実施形態では、免疫細胞は制御性Ｔ細胞であってよい。一実施形態では、免疫細胞はＣＤ４＋制御性Ｔ細胞であってよい。一実施形態では、免疫細胞はヒト免疫細胞である。別の実施形態では、制御性免疫細胞はヒト制御性免疫細胞である。一実施形態では、ヒト制御性免疫細胞は、制御性Ｔ細胞、ＣＤ４＋制御性Ｔ細胞、ＣＤ８＋制御性Ｔ細胞、制御性γδＴ細胞、制御性ＤＮ Ｔ細胞、制御性Ｂ細胞、制御性ＮＫ細胞、制御性マクロファージ、制御性樹状細胞及びそれらの任意の組合せから成る群から選択される。別の実施形態では、免疫細胞はヒト制御性Ｔ細胞である。一実施形態では、免疫細胞はヒトＣＤ４＋制御性Ｔ細胞である。一実施形態では、本発明のＣＡＲ改変Ｔｒｅｇ細胞は、インビボで複製することが可能であり、これが、標的細胞の免疫応答の持続的抑制と免疫寛容をもたらし得る長期持続につながる。一実施形態では、対象において制御性Ｔ細胞の持続的な集団を生成する方法が提供され、制御性Ｔ細胞はキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を発現するように改変されており、本方法は、本明細書のどこかに記載されている制御性Ｔ細胞を対象に投与することを含み、改変制御性Ｔ細胞の持続的な集団は、対象において、投与後少なくとも１日、２日、３日、４日、５日、６日、７日、８日、９日、１０日、１１日、１２日、１３日、１４日、１５日、１６日、１７日、１８日、１９日、２０日、３０日、４０日、５０日、６０日、７０日、８０日、９０日、１００日、２００日、３００日、４００日、５００日、６００日、７００日、８００日、９００日又は１０００日間持続する。一実施形態では、ＣＡＲ－Ｔｒｅｇ細胞は、標的細胞の免疫応答を抑制するために、インビボで自己再生及び再活性化されることが可能であってよい。一実施形態では、ＣＡＲ－Ｔｒｅｇ細胞は、標的細胞の免疫応答を抑制するために再活性化することができる記憶ＣＡＲＤ－Ｔｒｅｇ細胞であってよい。
免疫細胞は任意の供給源から取得されてよい。例えば、一実施形態では、免疫細胞は、本発明のＣＡＲ改変免疫細胞の生成のために、組織ドナー、移植片レシピエント又は他の関係のない供給源（全く異なる対象又は種）から取得されてよい。したがって、本発明のＣＡＲ改変免疫細胞は、移植レシピエント又は他の関係のない供給源に対して自己、同種異系又は異種であってよい。一実施形態では、本発明のＣＡＲ－Ｔｒｅｇ細胞は、移植片レシピエントに対して自己由来、同種異系又は異種であってよい。一実施形態では、本発明のＣＡＲ－Ｔｒｅｇ細胞は、移植レシピエントに対して自己由来であってよい。
一実施形態では、対象は哺乳類であってよい。一実施形態では、対象はヒトであってよい。
一実施形態では、本発明に従って活性化Ｔ細胞を対象に投与し、続いて再び採血（又はアフェレーシスを実施）し、そこからＴ細胞を活性化し、これらの活性化され増殖したＴ細胞を対象に再注入することが望ましい場合がある。このプロセスは、数週間ごとに複数回実施することができる。ある実施形態では、Ｔ細胞は、１０ｃｃ～４００ｃｃの採血から活性化することができる。ある実施形態では、Ｔ細胞は、２０ｃｃ、３０ｃｃ、４０ｃｃ、５０ｃｃ、６０ｃｃ、７０ｃｃ、８０ｃｃ、９０ｃｃ又は１００ｃｃの採血から活性化される。理論に拘束されるものではないが、この複数の採血／複数の再注入プロトコルを用いることは、Ｔ細胞の特定の集団を選択するのに役立つ場合がある。
本発明のＣＡＲ改変免疫細胞は、単独で、又は希釈剤及び／若しくは他の成分（ＩＬ－２若しくは他のサイトカイン若しくは細胞集団等）と組み合せた医薬組成物としてのいずれかで投与されてよい。一実施形態では、医薬組成物は、本明細書のどこかに記載されている複数の改変免疫細胞を含んでよい。一実施形態では、本発明の医薬組成物は、本明細書のどこかに記載されているＣＡＲ改変免疫細胞又は細胞集団を、１つ以上の薬学的若しくは生理学的に許容可能な担体、希釈剤又は賦形剤と組み合せて含んでよい。このような組成物は、中性緩衝生理食塩水、リン酸緩衝生理食塩水等の緩衝液；グルコース、マンノース、スクロース又はデキストラン、マンニトール等の炭水化物；タンパク質；ポリペプチド又はグリシン等のアミノ酸；抗酸化剤；ＥＤＴＡやグルタチオン等のキレート剤；アジュバント（例えば水酸化アルミニウム）；及び防腐剤を含んでよい。本発明の医薬組成物は、エアロゾル吸入、注射、経口摂取、輸血、留置又は移植を含む任意の適切な方法で対象に投与されてよい。本明細書のどこかに記載されている医薬組成物は、非経口投与によって対象に投与されてよい。本明細書のどこかに記載されている医薬組成物は、皮下、皮内、腫瘍内、結節内、髄内、筋肉内、胸骨内、静脈内（ｉ．ｖ．）注射により、注入技術により、又は腹腔内によって対象に投与されてよい。一実施形態では、本発明のＣＡＲ改変免疫細胞組成物は、皮内又は皮下注射によって対象に投与されてよい。別の実施形態では、本発明のＣＡＲ改変免疫細胞組成物は、ｉ．ｖ．注射によって投与されてよい。一実施形態では、ＣＡＲ改変免疫細胞の組成物は、リンパ節、感染部位、炎症部位、又は組織若しくは器官の駆出部位に直接注射されてよい。
本発明の医薬組成物は、予防又は治療される疾患に適切な方法で投与されてよい。投与の量と頻度は、対象の状態、対象の疾患の種類と重症度等の要因によって決定されるものであるが、適切な投与量は臨床試験によって決定されてよい。
「有効量」又は「治療量」が示される場合、投与される本発明の組成物の量は、対象の年齢、体重、抗体力価及び状態における個人差を考慮して決定されてよい。本明細書のどこかに記載されているＣＡＲ改変免疫細胞を含む医薬組成物は、体重１ｋｇあたり１×１０４～１×１０９細胞の投与量で投与することができると、一般に述べることができる。一実施形態では、ＣＡＲ改変免疫細胞は、それらの範囲内の全ての整数値を含めて、体重１ｋｇあたり１×１０５～１００×１０５細胞の投与量で投与されてよい。ＣＡＲ改変免疫細胞組成物は、これらの用量で複数回投与されてよい。ＣＡＲ改変免疫細胞は、免疫療法で一般に知られている注入技術を用いることによって投与することができる（例えばＲｏｓｅｎｂｅｒｇ他、１９８８を参照）。特定の対象に対する最適な投与量及び治療レジメンは、疾患の兆候について対象を監視し、それに応じて治療を調整することにより、容易に決定することができる。
一実施形態では、本発明の少なくとも１つのＣＡＲ遺伝子操作免疫細胞は、それを必要とする対象に、別の活性剤と組み合わせて投与される。一実施形態によれば、少なくとも１つの免疫細胞集団は、別の活性薬剤の投与の前、同時、又は後に投与される。
一実施形態では、本発明のＣＡＲ改変免疫細胞は、抗ウイルス療法等の薬剤による治療、化学療法、放射線、免疫抑制剤、抗体、免疫除去剤、サイトカイン、及び放射線を含むが、これらに限定されない任意の数の関連する治療法と組み合わせて（例えば、前に、同時に、又は後に）、対象に投与されてよい。一実施形態では、本発明のＣＡＲ改変免疫細胞は、免疫抑制剤と組み合せて投与されてよい。当技術分野で公知の任意の免疫抑制剤が用いられてよい。例えば、免疫抑制剤は、シクロスポリン等のカルシニューリン阻害剤、タクロリムス、アザチオプリン、メトトレキサート、メトキサレン、ラパマイシン、ミコフェノール酸モフェチル、ミコフェノール酸、ミコフェノール酸ナトリウム、６－メルカプトプリン、６－チオグアニン、リツキシマブ、シロリムス等のｍＴＯＲ阻害剤、エベロリムス、バシリキシマブ、ダクリズマブ、ベラタセプト、アレムツズマブ、ムロモナブＣＤ３、抗胸腺細胞グロブリン、グルココルチコステロイド、又はプレドニゾンやプレドニゾロン等の副腎皮質ステロイド、又はそれらの任意の組合せであってよい。本発明のＣＡＲ改変免疫細胞は、免疫抑制剤の前、後又は同時に、対象に投与することができる。例えば、本発明のＣＡＲ改変免疫細胞は、免疫抑制剤が対象に投与された後に投与されるか、又は、本発明のＣＡＲ改変免疫細胞は、免疫抑制剤が対象に投与される前に投与されてよい。或いは又は更に、本発明のＣＡＲ改変免疫細胞は、免疫抑制剤が対象に投与されるのと同時に投与されてよい。本発明のＣＡＲ改変免疫細胞及び／又は免疫抑制剤は、移植後に対象に投与されてよい。或いは又は更に、本発明のＣＡＲ改変免疫細胞及び／又は免疫抑制剤は、移植の前に対象に投与されてよい。本発明のＣＡＲ改変免疫細胞及び／又は免疫抑制剤は、移植手術中に対象に投与されてよい。一実施形態では、免疫抑制療法が開始された時点で、ＣＡＲ改変免疫細胞を対象に投与する本発明の方法が実施される。一部の実施形態では、本方法は、例えば、移植片レシピエントを経時的に監視するために、また該当する場合は異なる免疫抑制療法レジメンにおいて、複数回実施される。一部の実施形態では、移植片レシピエントが移植片に寛容性があると予測される場合、免疫抑制療法は低減される。一部の実施形態では、移植片レシピエントが移植片に寛容性があると予測される場合、免疫抑制療法は処方されず、例えば、免疫抑制療法は中止される。
対象における器官若しくは組織の移植拒絶反応を予防又は治療する方法も提供され、本方法は、対象に（ｉ）少なくとも１つの免疫抑制剤と、（ｉｉ）本発明のＣＡＲ遺伝子操作免疫細胞（例えばＣＡＲ遺伝子操作Ｔｒｅｇ細胞）又は前記免疫細胞を含む医薬組成物とを投与することを含む。
よって、本発明の別の実施形態は、対象における器官若しくは組織の移植拒絶反応の予防又は治療に用いるための、本発明のＣＡＲ遺伝子操作免疫細胞（例えばＣＡＲ遺伝子操作Ｔｒｅｇ細胞）又は前記免疫細胞を含む医薬組成物と、少なくとも１つの免疫抑制剤との組合せである。
対象における移植片生存期間を延長する方法も提供され、本方法は、少なくとも１つの免疫抑制剤と、本発明のＣＡＲ遺伝子操作免疫細胞（例えばＣＡＲ遺伝子操作Ｔｒｅｇ細胞）又はそれを含む医薬組成物とを、対象に投与することを含む。
一実施形態では、少なくとも１つの免疫抑制剤と本発明のＣＡＲ遺伝子操作免疫細胞（例えばＣＡＲ遺伝子操作Ｔｒｅｇ細胞）との組み合せは、移植片対宿主病（ＧＶＨＤ）を予防又は治療するために用いられる。一実施形態では、ＧＶＨＤは、造血幹細胞移植の後に発生し得る。
よって、本発明の別の実施形態は、対象における移植片対宿主病（ＧＶＨＤ）を予防又は治療する方法であり、本方法は、少なくとも１つの免疫抑制剤と、本明細書に記載のＣＡＲ遺伝子操作免疫細胞（例えばＣＡＲ遺伝子操作Ｔｒｅｇ細胞）又は医薬組成物とを、対象に投与することを含む。
一実施形態では、本発明は、レシピエントへの移植片の移植と同時に、その前に、又はその後に、ドナー移植片、例えば生体適合性格子又はドナー組織、器官若しくは細胞を、少なくとも１つの免疫抑制剤及び本発明のＣＡＲ遺伝子操作免疫細胞（例えばＣＡＲ遺伝子操作Ｔｒｅｇ細胞）と接触させる方法を提供する。
一実施形態では、少なくとも１つの免疫抑制剤と本発明のＣＡＲ遺伝子操作免疫細胞（例えばＣＡＲ遺伝子操作Ｔｒｅｇ細胞）との組合せを用いて、レシピエントに対するドナー移植片による有害反応を改善、阻害又は低減し、それによりＧＶＨＤを予防又は治療してよい。
よって、本発明の別の実施形態は、対象におけるＧＶＨＤの発症を予防又は遅延させる方法であり、本方法は、少なくとも１つの免疫抑制剤と、本明細書に記載のＣＡＲ遺伝子操作免疫細胞（例えばＣＡＲ遺伝子操作Ｔｒｅｇ細胞）又は医薬組成物とを、対象に投与することを含む。
一実施形態では、本発明のＣＡＲ遺伝子操作免疫細胞及び少なくとも１つの免疫抑制剤は、同時に又は連続して投与される。
一実施形態では、本発明のＣＡＲ遺伝子操作免疫細胞と、必要に応じて少なくとも１つの他の活性薬剤、例えば免疫抑制剤は、移植と併せて（例えば移植の前に、同時に又は後に）投与される。
本発明のＣＡＲ改変免疫細胞は、移植片の器官又は組織拒絶反応の診断後に投与されてよく、その後、器官又は組織の拒絶反応の症状が鎮まるまで、本発明のＣＡＲ改変免疫細胞と免疫抑制剤の両方の投与が続く。更なる実施形態では、本発明のＣＡＲ改変免疫細胞組成物は、骨髄移植と併せて（例えば前に、同時に又は後に）対象に投与されてよい。別の実施形態では、本発明のＣＡＲ改変免疫細胞は、ＣＤ２０と反応する薬剤、例えばリツキシマブ等のＢ細胞除去療法後に投与されてよい。例えば、一実施形態では、対象は、高用量化学療法とそれに続く末梢血幹細胞移植による標準治療を受けてよい。ある実施形態では、移植後、対象は、本発明の増殖させたＣＡＲ改変免疫細胞の注入を受けてよい。追加の実施形態では、増殖させたＣＡＲ改変免疫細胞は、手術の前又は後に投与されてよい。
一実施形態では、対象（例えばヒト）は、本発明の少なくとも１つの免疫細胞又は集団の初回投与と１回以上の後続投与を受け、１回以上の後続投与は、前回の投与から１５日未満、例えば１４、１３、１２、１１、１０、９、８、７、６、５、４、３又は２日後に投与される。一実施形態では、本発明の免疫細胞の治療上有効量が対象に投与されるか、又は投与される予定である。一実施形態では、対象に投与される本発明の少なくとも１つの免疫細胞集団の免疫細胞の量は、少なくとも１０２、１０３、１０４、１０５、１０６、１０７、１０８又は１０９細胞である。一実施形態では、対象に投与される本発明の免疫細胞の量は、約１０２～約１０９細胞、約１０３～約１０８細胞、約１０４～約１０７細胞、又は約１０５～約１０６細胞の範囲である。別の実施形態では、対象に投与される本発明の免疫細胞の量は、約１０６～約１０９、約１０６～１０７、約１０６～１０８、約１０７～１０９、約１０７～１０８、約１０８～１０９の範囲である。別の実施形態では、対象に投与される本発明の免疫細胞の量は、約１０６、約１０７、約１０８又は約１０９である。一実施形態では、対象に投与される本発明の少なくとも１つの免疫細胞集団の免疫細胞の量は、体重１ｋｇあたり少なくとも１０２、１０３、１０４、１０５、１０６、１０７、１０８又は１０９細胞である。一実施形態では、対象に投与される本発明の免疫細胞の量は、体重１ｋｇあたり約１０４～１０９細胞又は体重１ｋｇあたり１０５～１０８細胞の範囲であり、これらの範囲内の全ての整数値を含む。一実施形態では、本発明の少なくとも１つの免疫細胞又は集団の２回以上の投与は、例えば、１週間ごとに対象（例えばヒト）に投与され、例えば本発明の遺伝子改変免疫細胞又は集団は、１週間ごとに２、３又は４回投与される。
一部の実施形態では、インビボでのＣＡＲ改変免疫細胞の選択的破壊を可能にするために、本発明のＣＡＲ改変免疫細胞に自殺遺伝子を組み込むことが望ましい場合がある。一実施形態では、本発明のＣＡＲ改変免疫細胞は、自殺遺伝子系を更に含んでよい。一実施形態では、本発明のＣＡＲ改変免疫細胞は、自殺遺伝子系をコードする核酸を更に含んでよい。本明細書に記載される「自殺遺伝子治療」、「自殺遺伝子」及び「自殺遺伝子系」は、アポトーシスを通して細胞を選択的に破壊する方法を指す。そのような方法は、アポトーシスによって細胞を自殺させる自殺遺伝子を採用する。自殺遺伝子は、単独で、又は他の化合物の存在下で、細胞死を引き起こす産物をコードする。自殺遺伝子は、細胞療法での使用に適した任意の自殺遺伝子系に由来してよい（例えばＪｏｎｅｓ他、２０１４；Ｗａｎｇ他、２０１７；Ｚｈａｎｇ他、２０１７；Ｃａｓｕｃｃｉ他、２０１１；Ｇａｒｇｅｔｔ他、２０１４；Ｋｈａｌｅｇｈｉ、２０１２；Ｐｈｉｌｉｐ他、２０１４を参照）。
一実施形態では、自殺遺伝子系は、非毒性薬物（すなわち自殺遺伝子プロドラッグ）が自殺遺伝子改変細胞において毒性化合物に変換される遺伝子指向酵素プロドラッグ療法（ＧＤＥＰＴ）を伴ってよい。例えば、一実施形態では、自殺遺伝子系は、ヘルペスシンプレックスウイルス由来のチミジンキナーゼ遺伝子をプロドラッグガンシクロビルと組み合せて用いる、ヘルペスシンプレックスウイルスチミジンキナーゼ（ＨＳＶ－ＴＫ）／ガンシクロビル（ＧＣＶ）自殺遺伝子系であってよい。他の実施形態では、自殺遺伝子系は、シトシンデアミナーゼ／５－フルオロシトシン自殺遺伝子系であってよい。ＣＡＲ改変免疫細胞が自殺遺伝子系を含む本明細書において提供される方法の一部の代替では、本方法は、対象に自殺遺伝子プロドラッグを投与することを更に含む。
他の実施形態では、自殺遺伝子系は、カスパーゼ等のアポトーシス遺伝子がアポトーシスを誘導することによって細胞を破壊する二量体化誘導メカニズムを伴ってよい。自殺遺伝子系を誘導する二量体化には、化学的二量体化誘導物質（ＣＩＤ）の投与後の改変免疫細胞の条件付き二量体化とアポトーシスを可能にするアポトーシス経路の成分とリンクした薬物結合ドメインで構成されるキメラタンパク質が関与し得る。例えば、一実施形態では、自殺遺伝子系は、カスパーゼベースの自殺遺伝子系であってよい。誘導性カスパーゼ自殺遺伝子系の非限定的な例には、カスパーゼがＣＩＤ、ＦＫ５０６又はその類似体によって活性化される誘導性カスパーゼ－９自殺遺伝子系（ｉＣａｓｐ９）及びカスパーゼ－８自殺遺伝子系（ｉＣａｓｐ８）が含まれ得る。ＣＡＲ改変免疫細胞が自殺遺伝子系を含む本明細書において提供される方法の一部の代替では、本方法は、化学的二量体化誘導物質を対象に投与することを更に含む。
他の実施形態では、自殺遺伝子系は、治療用モノクローナル抗体によって媒介されてよい。治療用ｍＡｂを介した自殺遺伝子系は、改変免疫細胞に治療用ｍＡｂに対する感受性をもたせる細胞表面でのタンパク質の発現を伴う。改変免疫細胞は、特定の治療用ｍＡｂの投与後に選択的に破壊されてよい。治療用ｍＡｂ媒介自殺遺伝子系の非限定的な例には、治療用ｍＡｂが抗ＣＤ２０ ｍＡｂであるＣＤ２０自殺遺伝子系及びＲＱＲ８自殺遺伝子系が含まれ得る。一部の実施形態では、抗ＣＤ２０ ｍＡｂはリツキシマブであってよい。ＣＡＲ改変免疫細胞が自殺遺伝子系を含む本明細書において提供される方法の一部の代替では、本方法は、治療用モノクローナル抗体を対象に投与することを更に含む。
ＶＩＩＩ．製造品及びキット
別の実施形態では、本発明は、移植拒絶反応若しくはＧＶＨＤの予防及び／又は治療に有用な材料を含む製造品を提供する。該製造品は、容器と、容器上若しくは容器に関連付けられたラベル又は添付文書とを含む。適切な容器には、例えば瓶、バイアル、シリンジ等が含まれる。容器は、ガラスやプラスチック等の様々な材料から形成されてよい。容器は、移植拒絶反応又はＧＶＨＤ等の免疫学的状態を予防及び／又は治療するのに有効な組成物を保持し、滅菌アクセスポートを備えてよい（例えば、容器は、静脈内溶液バッグや、皮下注射針によって貫通可能なストッパーを有するバイアルであってよい）。組成物中の少なくとも１つの活性剤は、本発明のＣＡＲ改変免疫細胞である。一実施形態では、ＣＡＲ改変免疫細胞はＣＡＲ改変Ｔｒｅｇである。一実施形態では、ＣＡＲ改変Ｔｒｅｇは、ＣＡＲ改変ヒトＴｒｅｇである。ラベル又は添付文書は、組成物が移植拒絶反応若しくはＧＶＨＤの予防又は治療に使用されることを示す。製造品、ラベル又は添付文書は、ＣＡＲ改変免疫細胞組成物を患者に投与するための説明資料を更に含んでよい。更に、製造品は、静菌性注射用水（ＢＷＦＩ）、リン酸緩衝生理食塩水、リンゲル液及びデキストロース溶液等の薬学的に許容される緩衝液を含む第２の容器を更に含んでよい。他の緩衝液、希釈剤、フィルター、針、及びシリンジを含む、商業的な及びユーザーの観点から望ましい他の材料を更に含んでよい。
様々な目的（例えば移植拒絶反応若しくはＧＶＨＤの予防又は治療）に役立つキットも提供される。ＣＡＲ改変免疫細胞を含むキットを提供することができる。製造品と同様に、キットは、容器と、容器上若しくは容器に関連付けられたラベル又は添付文書とを含む。容器は、本発明の少なくとも１つのＣＡＲ改変免疫細胞を含む組成物を保持する。例えば、希釈剤及び緩衝液を含む追加の容器が含まれてよい。ラベル又は添付文書は、組成物の説明と使用目的の指示を提供してよい。一実施形態では、ＣＡＲ改変免疫細胞はＣＡＲ改変Ｔｒｅｇである。一実施形態では、ＣＡＲ改変ＴｒｅｇはＣＡＲ改変ヒトＴｒｅｇである。
よって、本発明は更に、第１の部品に本発明の免疫細胞又は免疫細胞集団を含み、第２の部品に、限定されないが、抗ウイルス療法、化学療法、放射線、免疫抑制剤、抗体、免疫除去剤、サイトカイン及び照射を含む別の活性薬剤を含む、部品のキットに関する。一部の実施形態では、本発明の部品のキットは、第１の部品に本発明の免疫細胞又は免疫細胞集団を含み、第２の部品に１つ以上の免疫抑制剤を含む。本発明のキットに存在し得る免疫抑制剤の例には、シクロスポリン等のカルシニューリン阻害剤、タクロリムス、アザチオプリン、メトトレキサート、メトキサレン、ラパマイシン、ミコフェノール酸モフェチル、ミコフェノール酸、ミコフェノール酸ナトリウム、６－メルカプトプリン、６－チオグアニン、リツキシマブ、シロリムス等のｍＴＯＲ阻害剤、エベロリムス、バシリキシマブ、ダクリズマブ、ベラタセプト、アレムツズマブ、ムロモナブＣＤ３、抗胸腺細胞グロブリン、グルココルチコステロイド、又はプレドニゾンやプレドニゾロン等の副腎皮質ステロイド、又はそれらの任意の組合せが含まれる。
表１
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表２
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表３
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表４
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表５
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表６
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表７
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実施例
方法
ヒト化ＨＬＡ－Ａ＊０２特異的ｓｃＦｖの生成。ヒト化遺伝子を、ホモ・サピエンスの設定を用いて、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ ＧｅｎｅＡｒｔ Ｇｅｎｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓサービスのコドンオプティマイザーを用いてコドン最適化した。キメラ抗原受容体の５’領域にコザック配列を含み、３６ ＮＴがｐｃＤＮＡ３プラスミドと重複するように、Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ ＤＮＡ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（アイオワ州コーラルビル）にｇＢｌｏｃｋｓ（登録商標）遺伝子断片を注文した。キメラ抗原受容体のＣＤ８ヒンジ及び細胞内シグナル伝達ドメインとインフレームでのプラスミドへのギブソンアセンブリを促進するために、３’末端は、ＢａｍＨＩ部位と、ＣＤ８ヒンジ配列との重複部分とを含む。
ｈＡ２－ＣＡＲの生成。ｓｃＦｖ変異体を、記載されているように、ヒトＣＤ８αからのストーク領域、ヒトＣＤ２８の膜貫通ドメイン及び細胞内ドメイン、並びにヒトＣＤ３ζに融合した（Ｓａｄｅｌａｉｎ他、２０１３年）。得られたｃＤＮＡを、マーカーとして切断型神経成長因子（ＴｒｋＡ）受容体（ΔＮＧＦＲ）の細胞表面発現をコードするレンチウイルスベクターにクローニングした（図１）。表面発現は、一時的にトランスフェクトされたＨＥＫ ２９３Ｔ細胞（ｊｅｔＰＲＩＭＥ（登録商標）、Ｐｏｌｙｐｌｕｓ Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ）を用いたフローサイトメトリーによって決定した。ウイルス粒子は、記載されているように産生した（Ａｌｌａｎ他、２００８）。
ＨＬＡ発現Ｋ５６２細胞株の生成。ＣＤ６４を発現するＫ５６２細胞（Ｋ５６２．６４）は、ペンシルベニア大学（米国フィラデルフィア）のＪａｍｅｓ Ｒｉｌｅｙから寄贈された。ＨＬＡ－Ａ＊０２：０１とＡ＊２４：０２のｃＤＮＡは、プライマー配列ｓ：５’－ＴＴＴＴＣＴＡＧＡＣＧＣＧＴＧＣＣＡＣＣＡＴＧＧＣＣＧＴＣＡＴＧＧＣＧＣＣ－３’（フォワード）（配列番号１９７）及び５’－ＡＡＧＴＣＧＡＣＧＣＴＡＧＣＴＣＡＣＡＣＴＴＴＡＣＡＡＧＣＴＧＴＧＡＧＡＧＡＣＡ－３’（リバース）（配列番号１９８）を用いて、ＨＬＡ－Ａ遺伝子座上のＡ＊０２：０１又はＡ＊２４：０２に対してホモ接合型であるドナーの末梢血単核細胞のｍＲＮＡからそれぞれ分離した。得られた配列を、ＩＰＤ及びＩＭＧＴ／ＨＬＡデータベース（Ｒｏｂｉｎｓｏｎ他、２０１５）から予想される配列に合わせてサンガーシーケンスによって確認し、レンチウイルス発現ベクターを用いて、それぞれＫ５６２細胞に形質導入した。Ａ２５－及びＡ６８－Ｋ５６２細胞を生成するために、Ａ＊２５：０１、Ａ＊６８：０１のＨＬＡ配列を、ＩＰＤ及びＩＭＧＴ／ＨＬＡデータベース（Ｒｏｂｉｎｓｏｎ他、２０１５）から抽出し、ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ ＧｅｎｅＡｒｔ Ｇｅｎｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓサービスからのコドンオプティマイザーツールを用いてコドン最適化し（ホモ・サピエンスに設定）、次にレンチウイルス発現ベクターにクローニングし、Ｋ５６２細胞に形質導入した。次に、得られたＫ５６２細胞株を、抗ＨＬＡ－ＡＢＣ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ、１２－９９８３－４１）を用いてＦＡＣＳＡｒｉａ ＩＩ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）でソートして、形質導入されたＨＬＡ及び抗ＨＬＡ－Ａ２（ＢＢ７．２）（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ、１７－９８７６－４２）の同等の表面発現を保証し、純度を保証した。
Ｔｒｅｇの選別、形質導入及び増殖。ＣＤ４＋Ｔ細胞を、ＲｏｓｅｔｔｅＳｅｐ（Ｓｔｅｍｃｅｌｌ）を介してＨＬＡ－Ａ２－ドナーから単離し、ＣＤ２５＋細胞（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ）について濃縮してから、ＭｏＦｌｏ（登録商標） Ａｓｔｒｉｏｓ（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ）又はＦＡＣＳＡｒｉａ ＩＩ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）をそれぞれ用いて、生きているＣＤ４＋ＣＤ２５ｈｉＣＤ１２７ｌｏＴｒｅｇ（インビトロ実験及びルシフェラーゼ実験用）又はＣＤ４＋ＣＤ１２７ｌｏＣＤ２５ｈｉＣＤ４５ＲＡ＋Ｔｒｅｇ（異種ＧｖＨＤ実験及び皮膚移植片実験用）を選別した。選別したＴｒｅｇを、ＩＬ－２（Ｐｒｏｌｅｕｋｉｎ）１０００Ｕ／ｍｌを有するｉｍｍｕｎｏｃｕｌｔ－ＸＦ Ｔ細胞増殖培地（ＳＴＥＭＣＥＬＬ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）中のＬ細胞及びαＣＤ３ｍＡｂ（ＯＫＴ３；１００ｎｇ／ｍＬ）で刺激した。１日後、１０個のウイルス粒子：１個の細胞の感染多重度で、レンチウイルスを細胞に形質導入した。７日目に、ΔＮＧＦＲ＋細胞を磁気選択（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ）によって精製し、アッセイで使用するか、又は上記のＬ細胞によって再刺激し、インビボ実験のために５日間増殖させた。ＨＬＡ－Ａ２を介した刺激の効果を検証するために、Ｔｒｅｇを制限ＩＬ－２（１００Ｕ／ｍＬ）で２４時間培養した後、再計数し、照射した抗ＣＤ３／抗ＣＤ２８搭載Ｋ５６２．６４細胞、又はＨＬＡ－Ａ＊０２：０１、Ａ＊２４：０２、Ａ＊２５：０１若しくはＡ＊６８：０１を発現するＫ５６２．６４細胞と、１：２（Ｋ５６２：Ｔ細胞）の比率で２４時間共培養した。
フローサイトメトリー。表現型分析のために、細胞を固定可能な生死判別色素（ＦＶＤ、６５－０８６５－１４、ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ；４２３１０２、Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）で染色し、表面マーカーについては、固定及び透過化の前に、ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ ＦＯＸＰ３／Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ Ｆａｃｔｏｒ Ｓｔａｉｎｉｎｇ Ｂｕｆｆｅｒ Ｓｅｔ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）で染色し、細胞内タンパク質を染色した。Ｃｙｔｏｆｌｅｘ（Ｂｅｃｋｍａｎ－Ｃｏｕｌｔｅｒ）で試料を読み取り、ＦｌｏｗＪｏソフトウエアバージョン９．９．４及び１０．３（Ｔｒｅｅ Ｓｔａｒ）を用いて結果を分析した。
表面染色は、ΔＮＧＦＲ（１３０－０９１－８８５，Ｍｉｌｔｅｎｙｉ）、ＣＤ３（５６４４６５，ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）、ＣＤ４（３１７４１０，Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）、ＣＤ２５（１３０－０９１－０２４，Ｍｉｌｔｅｎｙｉ）、ＬＡＰ（２５－９８２９－４２，ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）、ＣＤ６９（３１０９４６，Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）、ＣＤ１５４（５５５７０２，ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）、ＣＤ７１（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，５６３７６８）及びＣＤ１２７（４８－１２７８－４２，ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）について実施した。四量体染色は、ストレプトアビジン－アロフィコシアニン（ＰＪ２７Ｓ、Ｐｒｏｚｙｍｅ）を用いて四量体にしたＨＬＡ－Ａ＊０２：０１単量体を用いて実施した。ＣＴＬＡ－４（３６９６０６、Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）について、細胞内染色を実施した。
インビボ実験では、５０ｕＬの血液を毎週及びエンドポイントで収集した。赤血球溶解には塩化アンモニウムを用いた。細胞を抗マウスＣＤ１６／３２（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ、１４－０１６１－８２）を有するＰＢＳに再懸濁し、固定可能な生死判別色素（ＦＶＤ；ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ、６５－０８６５－１４）、抗マウスＣＤ４５（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ、２５－０４５１－８２）及び抗ヒトＣＤ４５（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、５６０７７７）、ＣＤ４（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ、３００５５４、３１７４３４）、ＣＤ８（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ、４８－００８７－４２）、抗ヒトＣＤ２７１（ＮＧＦＲ； ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、５５７１９６）ＨＬＡ－Ａ２（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、５５１２８５）を用いて、細胞外マーカーを染色した。ＦＯＸＰ３（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ、１２－４７７７－４２）の細胞内染色は、ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ ＦＯＸＰ３／Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ Ｆａｃｔｏｒ Ｓｔａｉｎｉｎｇ Ｂｕｆｆｅｒ Ｓｅｔ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ、００－５５２３－００）を用いて実施した。１０，０００個のカウントビーズを全ての試料に添加した（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ、０１－１２３４－４２）。異種ＧｖＨＤ、ルシフェラーゼ及び皮膚移植片実験のゲーティング戦略を、それぞれ図８Ｄ、図１０Ａ及び図１２Ａに示す。
ＨＬＡ対立遺伝子の交差反応性アッセイ。０．２５×１０６個のＣＡＲ Ｔｒｅｇ（上記のように調製したもの、培養７日後）を、個々のＦｌｏｗＰＲＡ Ｓｉｎｇｌｅ Ａｎｔｉｇｅｎ Ａｎｔｉｂｏｄｙビーズパネル（ＦＬ１ＨＤ０１、ＦＬ１ＨＤ０２、ＦＬ１ＨＤ０３、ＦＬ１ＨＤ０４、ＦＬ１ＨＤ０６及びＦＬ１ＨＤ０８、Ｏｎｅ Ｌａｍｂｄａ）及び固定可能な生死判別色素（ＦＶＤ、６５－０８６５－１４、ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）とともに室温で３０分間インキュベートしてから、洗浄し、０．５％ホルムアルデヒドで固定し、フローサイトメトリーで分析した。試料ごとに２００個の陰性対照ビーズを得た。分析のために、まず、固定可能な生死判別色素を用いて死細胞を除去した。次に、死細胞とダブレットを排除した後、単一ビーズをゲーティングした。次に、各ＨＬＡ抗原のビーズの数を、それぞれのＰＥ強度によって決定した。データは、試料の陰性ビーズの数をＴｒｅｇ－ＮＧＦＲ試料の陰性ビーズの数で割り、Ｔｒｅｇ－ＮＧＦＲ検体の陰性ビーズの数を掛けることによって正規化した。相対結合率は、１つの特定のＨＬＡに対するＮＧＦＲ検体におけるビーズ数から、そのＨＬＡに対する検体における正規化したビーズ数を引いたものを、ＮＧＦＲ検体におけるビーズ数で割り、１００を掛けたものである。
混合リンパ球反応の抑制。ＨＬＡ－Ａ２＋健康ドナーから得たＰＢＭＣからの付着細胞は、記載されているように単球由来の樹状細胞に分化した（Ｄｉｊｋｅ他、２０１５）。混合リンパ球反応のために、ＨＬＡ－Ａ２－ＰＢＭＣレスポンダー細胞を細胞増殖解析用色素ｅＦ４５０（６５－０８４２－８５、ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）で標識し、５×１０４個のＨＬＡ－Ａ２単球由来樹状細胞と、細胞増殖解析用色素ｅ６７０ （６５－０８４０－９０，ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）で標識したΔＮＧＦＲ発現Ｔｒｅｇ又はｈＡ２－ＣＡＲ発現Ｔｒｅｇの割合を高めたものとともにプレートに蒔いた。６日後、ＨＬＡ－Ａ２－ＣＤ４＋レスポンダーＴ細胞の分裂をフローサイトメトリーで測定した。抑制率は、所与の細胞の組合せの増殖指数と、陽性対照（ＨＬＡ－Ａ２＋単球由来樹状細胞とＨＬＡ－Ａ２－ＣＤ４＋レスポンダーＴ細胞のみ）に対する比率とに基づいて、記載されているように（ＭｃＭｕｒｃｈｙ及びＬｅｖｉｎｇｓ、２０１２）計算した。まず、抑制率を、抑制率＝１００－１００×（増殖指数（試料））／（増殖指数（ＤＣ＋レスポンダー対照））として計算することにより、データを正規化し、次に、それぞれ独立した実験ごとに、式：正規化された抑制率＝１００×（抑制率（試料））／（抑制率（ＤＣ＋レスポンダー対照）に従って０～１００％からの結果値を正規化した）。
インビボでの異種移植片対宿主病の抑制。８～１２週齢の雌ＮＳＧマウス（ジャクソン研究所、自社飼育）に、全身照射（１５０ ｃＧｙ、ＲＳ－２０００ Ｐｒｏ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｓｙｓｔｅｍ）を実施し、１日後、４×１０６個のｈＡ２－ＣＡＲ Ｔｒｅｇの尾静脈への静脈内注射の有無にかかわらず、８×１０６個のＨＬＡ－Ａ２ ＰＢＭＣを注射した。生理食塩水を注射したマウスを対照とした。ｈＡ２－ＣＡＲ Ｔｒｅｇは、４匹の異なる健康なドナーから生成した。ＧＶＨＤは、体重、毛皮の質感、姿勢、活動レベル及び皮膚の完全性に基づき、記載されているように（Ｃｏｏｋｅ他、１９９６；Ｈｉｌｌ他、１９９７）、カテゴリごとに０～２ポイントで採点した。ＧＶＨＤ採点は、盲検化された２人の調査員が実施した。伏在静脈からの末梢血を遠心分離し、その後、赤血球を溶解し、白血球をフローサイトメトリーで測定した。
研究の承認。ヒトＰＢＭＣについては、ブリティッシュコロンビア大学臨床研究倫理委員会及びカナダ血液サービスによって承認されたプロトコルに従って、健康なボランティアが書面によるインフォームドコンセントを行った。形成外科から廃棄されたヒトの皮膚の試料を、ブリティッシュコロンビア大学臨床研究倫理委員会が承認したプロトコルに従って、Ｈａｒｖａｒｄ Ｓｋｉｎ Ｒｅｓｏｕｒｃｅ Ｃｅｎｔｒｅ、Ｓｋｉｎ Ｗｏｒｋｓ又はＣａｍｂｉｅ Ｓｕｒｇｅｒｙ Ｃｌｉｎｉｃから入手した。動物プロトコルは、ＵＢＣ Ａｎｉｍａｌ Ｃａｒｅ Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅによって承認された。
皮膚移植。Ａ２－ＣＡＲ Ｔｒｅｇホーミングと皮膚拒絶反応を阻害する能力を評価するために、８～１２週齢の雌ＮＳＧマウス（ジャクソン研究所、自社飼育）に、トランスジェニックＨＬＡ－Ａ２＋ＮＳＧマウス（ジャクソン研究所、自社飼育）とからの皮膚とＮＳＧ皮膚（ＨＬＡ－Ａ２陰性）を移植した。マウス皮膚移植片について、８ｍｍの生検パンチを利用して皮膚を円形片に切り取り、ＰＢＳを入れた新しいプレートに皮膚を置き、移植するまで（約１～４時間）低温（４～８℃）で保存した。ヒト皮膚のＨＬＡ－Ａ２発現は、フローサイトメトリーとｑＰＣＲによって評価した。検体から脂肪をトリミングすることにより、分層外植片を作製した。外植片を滅菌ＰＢＳですすぎ、ＲＰＭＩで保存した。良質な皮膚外植片を１ｃｍ２の小片に切り取り、ＰＢＳを入れた新しいプレートに置き、移植するまで（約１～４時間）低温（４～８℃）で保存した。マウスとヒト皮膚移植片の両方について、事前に剃毛したマウスに麻酔をかけ、背部皮膚を肩の近くで切断し、同様のサイズのマウス皮膚を除去した後、移植片を露出部に置き、ステリストリップ（３Ｍ、Ｎｅｘｃａｒｅ）で安定させた。移植片をワセリンガーゼで覆い、２ｃｍ幅のＣｏＦｌｅｘ包帯（３Ｍ、Ｎｅｘｃａｒｅ）で包んで、細胞注射の１４日前まで移植片を固定した。
組織構造
ヒト皮膚移植片と周囲のマウス皮膚を細胞注射の２７日後に採取し、１０％ホルマリン（組織対ホルマリンの１：１０ｖ／ｖ比）で４℃にて一晩固定し、パラフィン包埋前に７０％エタノールで保存した。パラフィン切片（厚さ５μｍ）とＨ＆Ｅ染色は、ＢＣ Ｃｈｉｌｄｒｅｎ’ｓ Ｈｏｓｐｉｔａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ Ｈｉｓｔｏｌｏｇｙ Ｓｅｒｖｉｃｅｓ（カナダ、ブリティッシュコロンビア州バンクーバー）が準備した。免疫染色のために、一連のキシレン洗浄（×３）、段階的アルコール溶液（２×１００％エタノール、１×９５％エタノール及び１×７０％エタノール）及び１×ＰＢＳを用いて、切片を脱パラフィンし、再水和した。１０ｍＭクエン酸ナトリウム緩衝液（０．５％Ｔｗｅｅｎ－２０、ｐＨ６．０）で、９３～９５℃に達するマイクロ波（５分、高出力、その後２０分、低出力）を用いて、スライド上で熱誘導エピトープ回収（ＨＩＥＲ）を実施した。ＨＩＥＲの後、水道水、脱イオン水及びＰＢＳを流してスライドを洗浄した。非特異的抗体染色を制限するために、切片をＤＡＫＯ（登録商標）Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｂｌｏｃｋ，Ｓｅｒｕｍ－Ｆｒｅｅ（Ｄａｋｏ、バーリントン、カナダ、Ｘ０９０９）とともにインキュベートした。次に、切片を以下の一次抗体とともに４℃で一晩インキュベートした：ＦＯＸＰ３（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、ｃｌｏｎｅ ＰＣＨ１０１、１４－４７７６－８２）、ＣＤ４５（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、ｃｌｏｎｅ Ｈ１３０、１７－０４５９）、Ｋｉ６７（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、ｃｌｏｎｅ ２０Ｒａｊｉ、１７－５６９９）、インボルクリン（Ａｂｃａｍ、ａｂ５３１１２）。翌日、切片をＰＢＳで数回穏やかにすすぎ、以下の二次抗体を用いて１時間ＲＴで染色した：ロバ抗ラット４８８（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈ、Ａ１１００６）、ヤギ抗マウスＡＰＣ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、１８３４６９６）、ロバ抗ウサギ４８８（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈ、Ａ２１２０６）。最後に、切片を４’、６－ジアミジノ－２－フェニルインドール（ＤＡＰＩ）で対比染色して細胞核を特定し、ＶＥＣＴＡＳＨＩＥＬＤ（登録商標）Ｍｏｕｎｔｉｎｇ Ｍｅｄｉｕｍ ｗｉｔｈ ＤＡＰＩ（Ｖｅｃｔｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、カリフォルニア州バーリンゲーム、米国、Ｈ－１２００）を用いてマウントした。全ての抗体をＡｎｔｉｂｏｄｙ Ｄｉｌｕｅｎｔ（Ｄａｋｏ、バーリントン、カナダ、Ｓ３０２２）に希釈した。画像は、ＱＩｍａｇｉｎｇ Ｒｅｔｉｇａ ＥｘｉカメラとＯｌｙｍｐｕｓ ＤＰ７１カラーカメラを備えたＯｌｙｍｐｕｓ ＢＸ６１ Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ及びＢｒｉｇｈｔ Ｆｉｅｌｄ Ａｕｔｏｍａｔｅｄ Ｕｐｒｉｇｈｔ Ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｅを用いてキャプチャした。蛍光画像の定量分析は、ＦｉｊｉとＯｌｙｍｐｕｓ ｖｉｅｗｅｒ Ｐｌｕｇｉｎを用いて実行した（Ｓｃｈｎｅｉｄｅｒ他、２０１２年；Ｅｌｉｃｅｉｒｉ他、２０１２）。
Ｈ＆Ｅ染色スライドは、盲検化された臨床病理学者が、それぞれ０～３－４の８段階の因子によって定義される採点システムを使用して評価した：ラーナー悪性度（０、１－局所又はびまん性の液胞変性、２－角化異常、３－基底層又は表層の裂け目、４－表皮の明らかな喪失）、海綿状変化（０、１－基底層のみ、２－途中まで、３－全層）、壊死ケラチノサイト（０、１－低頻度（１／ｈｐｆ）、２－時々（２～３／ｈｐｆ））、３－多い（＞４／ｈｐｆ））、壊死ケラチノサイトの位置（０、１－基底のみ、２－上半分まで、３－全層）、衛星病変（０、１－１のみ、２－２～３／ｈｐｆ、３－＞４／ｈｐｆ）、エキソサイトーシス（０、１－局所、２－＜５０％生検、３－＞５０％生検）、付属器合併症（０、１－いずれかの付属器の軽度の合併症、２－＜５０％の付属器の顕著な合併症、３－＞５０％の付属器の顕著な合併症）及び真皮のリンパ組織の増生（０、１－わずか、２－豊富、３－帯状）（Ｍａｓｓｉ他、１９９９年；Ｆｉｓｃｈｅｒ他、２０１５、Ｋａｎｉｔａｋｉｓ他、２００８）。
ｑＰＣＲ。製造元の指示（ＲＮｅａｓｙ Ｐｌｕｓ Ｍｉｎｉ Ｋｉｔ；Ｑｉａｇｅｎ）に従ってヒト皮膚試料からＲＮＡを採取し、相補的ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）に変換した。ＳＹＰＣＲ－ｇｒｅｅｎ（Ｂｉｏｒａｄ）とＩＬ１７、ＩＬ６、ＩＬ１Ｂ、ＤＥＦＢ４、ＩＦＮｇ、ＴＮＦａ、１８ＳリボソームＲＮＡのプライマーを用いて、ｑＰＣＲを実行した（表８）。融解曲線とＳＹＢＲ緑色発光データを収集した。相対濃度は標準曲線を用いて計算し、１８ＳリボソームＲＮＡの増幅産物に対して値を正規化した。各試料のＬｏｇ２（ＲＱ）値を、ダブルデルタＣｔ（ΔΔＣｔ）メソッド（Ｓｃｈｍｉｔｔｇｅｎ他、２００８）を用いて取得した。各試料のΔＣｔ値は、平均化されたＣｔ（目的の遺伝子）－Ｃｔ（ハウスキーピング遺伝子）を計算することによって得た。ΔΔＣｔを得るために、対照試料のΔＣｔを処理試料のΔＣｔから引いた。次に、倍数遺伝子発現を２－（ΔΔＣｔ）によって計算した。
Figure 0007578939000045
ルシフェラーゼ。インビボでのＨＬＡ－Ａ２発現マウス皮膚移植片へのＴｒｅｇホーミングを評価するために、上記のように選別されたＴｒｅｇ（ＣＤ４＋ＣＤ２５ｈｉＣＤ１２７ｌｏ）をＬ細胞によって刺激した。翌日、ＭＯＩ１０でＨＥＲ２－ＣＡＲ、ｍＡ２－ＣＡＲ又はＨ１ｋ２ ｈＡ２－ＣＡＲレンチウイルスを細胞に形質導入し、８時間後に、ＭＯＩ５でルシフェラーゼ－ＧＦＰ－レンチウイルスを形質導入した。カブトムシルシフェラーゼ－ＧＦＰ－融合タンパク質をコードするレンチウイルスのプラスミド（ｐＥＬＮＳ．ＣＢＧ－Ｔ２Ａ－ＧＦＰ（ＣＢＲ））を、以前に記載されているように（Ｂａｒｒｅｔｔ他、２０１４）用いた。培養の７日後、ＣＡＲ及びルシフェラーゼを発現する二重形質導入ＧＦＰ＋ΔＮＧＦＲ＋Ｔｒｅｇを選別してから、上記のようにＬ細胞によって再刺激した。培養１２日目に、１～３×１０６個のルシフェラーゼ－ＣＡＲ Ｔｒｅｇ及び６×１０６個のヒト同種異系ＨＬＡ－Ａ２－ ＰＢＭＣを、皮膚移植ＮＳＧマウスに静脈内注射した。生物発光イメージングのために、イソフルランによる麻酔の直前に、Ｄ－ルシフェリンカリウム塩（１５０ｍｇ／ｋｇ、Ｇｏｌｄ Ｂｉｏ）を腹腔内注射し、Ａｍｉ－Ｘ（Ｓｐｅｃｔｒａｌ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ Ｉｍａｇｉｎｇ）で１５～２０分以内に画像を取得した。データをＡｍｉＶｉｅｗソフトウェア（Ｓｐｅｃｔｒａｌ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ Ｉｍａｇｉｎｇ、バージョン１．７．０６）で分析し、発光シグナルを、ＨＬＡ－Ａ２－皮膚移植片に対するＨＬＡ－Ａ２＋の光子／秒／ｃｍ２／ステラジアンの比率として定量化した。実験のエンドポイントにおいて、皮膚流入領域腋窩リンパ節と脾臓を採取し、７０μｍのセルストレーナー（ＢＤ Ｆａｌｃｏｎ）に置き、切片化し、１ｃｃシリンジのプランジャーを用いて濾過した。次に、細胞をフローサイトメトリー用に染色した。
統計分析。全ての統計はＰｒｉｓｍ ７．０ｂを用いて行われた。図９については、ＩＢＭ＊ＳＰＳＳ Ｓｔａｔｉｓｔｉｃｓバージョン２４．０． ０．０を用いた。
結果
ヒト化ＨＬＡ－Ａ２特異的ＣＡＲの構築
マウスＢＢ７．２ ｍＡｂからの重鎖及び軽鎖の可変領域のアミノ酸配列を、米国国立生物工学情報センター（ＮＣＢＩ）から入手可能なＩｇＢＬＡＳＴツールを用いて、国際的なＩｍＭｕｎｏＧｅｎｅＴｉｃｓ ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ ｓｙｓｔｅｍ（登録商標）（ＩＭＧＴ（登録商標））データベースから得られたヒト免疫グロブリン配列とアライメントした。Ｖ－ｇｅｎｅ画定システムを、Ｋａｂａｔ定義ＣＤＲ（Ｋａｂａｔ他、１９９１）を取得するためにＫａｂａｔ配列に設定した。更に、Ｃｈｏｔｈｉａ定義（Ｃｈｏｔｈｉａ他、１９８７）が特定した。
多数の異なるヒト生殖系列遺伝子を、ＣＤＲ移植のフレームワーク配列として検証した。マウス配列と最も同等であるヒト生殖系列配列を特定することに加えて、可能な限り構造を維持するために、ＣＤＲの長さも考慮された。ヒトＣＤＲ（Ｋａｂａｔナンバリング）を、ＢＢ７．２抗体からのマウス対応ＣＤＲを置換した。また、重鎖の追加のＣＤＲアミノ酸を、ＣｏｔｈｉａとＫａｂａｔのナンバリングを組み合せることによって置換した。最終的に、６つの異なるヒト化重鎖と５つの異なるヒト化軽鎖が生成され、ヒト化重鎖と軽鎖を組み合せることにより、合計２０の異なるキメラ抗原受容体を生成した。
ヒト化ＨＬＡ－Ａ２特異的ＣＡＲの発現と抗原特異性
抗原特異性を検証するために、様々なｈＡ２－ＣＡＲコンストラクトを２９３Ｔ細胞に一時的にトランスフェクトし、ＨＬＡ－Ａ＊０２：０１四量体で染色し、フローサイトメトリーによって分析した。１１個のｈＡ２－ＣＡＲコンストラクトが発現し、Ａ＊０２：０１四量体に結合した（図２）。
次に、様々なｈＡ２－ＣＡＲコンストラクトの結合強度を比較した。一次的にトランスフェクトした２９３Ｔ細胞を、Ａ＊０２：０１四量体の漸増希釈液で染色し、フローサイトメトリーによって分析した。図３（Ａ、Ｂ及びＣ）に示すように、１１個のｈＡ２－ＣＡＲコンストラクトがＡ＊０２：０１四量体に、四量体濃度依存的に高度に結合する。
ｈＡ２－ＣＡＲ媒介刺激はＴｒｅｇを活性化する
ＴｒｅｇにおけるＡ２－ＣＡＲの機能を検証するために、ＣＤ４＋ＣＤ２５ｈｉＣＤ１２７ｌｏ細胞を末梢血から選別した。図４（Ａ、Ｂ及びＣ）に示すように、更に６～７日間、Ｔｒｅｇを刺激、形質導入及び培養した。培養７～８日目の終わりに、細胞をＮＧＦＲ＋細胞として精製し、ｈＡ２－ＣＡＲ変異体の細胞表面発現をフローサイトメトリーによって検証した。図４に示すように、ｈＡ２－ＣＡＲコンストラクトによって形質導入されたＴｒｅｇは、ΔＮＧＦＲ対照コンストラクトによって形質導入されたＴｒｅｇと比較して、ＨＬＡ－Ａ２四量体による陽性染色を示し、これは、ｈＡ２－ＣＡＲを発現するＴｒｅｇに対する抗原特異性の保存を示している。（Ｈ１ｋ３）の高力価レンチウイルスの生産に技術的な問題が発生したので、この実験ではＴｒｅｇにおいてこのＣＡＲを検証しなかった。ＣＡＲ細胞表面の発現と特異性は、Ａ＊０２：０１四量体を用いて染色することによって検証し、その結果、Ｈ２ｋ２、Ｈ４ｋ４及びＨ５ｋ４がＴｒｅｇにおいて二峰性の発現パターンを示し、Ａ２－四量体＋細胞の平均蛍光強度（ＭＦＩ）が低いことが明らかとなった（図４Ｄ及び図４Ｅ）。
次に、切断型ＮＧＦＲ形質導入マーカー（ＮＧＦＲ Ｔｒｅｇ）のみを発現するＴｒｅｇと比較して、ｈＡ２－ＣＡＲを介した刺激がＴｒｅｇ（ｈＡ２－ＣＡＲ Ｔｒｅｇ）を活性化するかどうかを調べた。ＮＧＦＲ及びｈＡ２－ＣＡＲのＴｒｅｇを刺激せずに放置し、又はＨＬＡ－Ａ＊０２：０１を発現するＫ５６２細胞とともにＣＡＲを介して刺激し、又は事前に抗ＣＤ３／抗ＣＤ２８抗体を搭載した高親和性Ｆｃ受容体であるＣＤ６４を発現するＫ５６２細胞とともにＴＣＲを介して刺激した。ＮＧＦＲ ＴｒｅｇとｈＡ２－ＣＡＲ Ｔｒｅｇの比較により、複数の時点でほとんどのｈＡ２－ＣＡＲ ＴｒｅｇにおいてＣＡＲ刺激によるＣＤ６９及びＣＤ７１の発現がはるかに高いことが示された。対照的に、ＴＣＲを介して刺激された場合、ＮＧＦＲとｈＡ２－ＣＡＲの両方のＴｒｅｇはＣＤ６９を上方制御することができ、ＣＡＲ ＤＮＡの形質導入後もＴＣＲを介してシグナルを送る能力を保持していることが示された（図１３に図示）。また、ＴｒｅｇのｈＡ２－ＣＡＲを介した刺激は、Ｔｒｅｇ機能に関連するタンパク質の大幅な上方制御を引き起こし、ｈＡ２－ＣＡＲを介した刺激が、予想されるＣＴＬＡ－４及びＬＡＰの高発現を保存することが実証された（図５Ａ－Ｆ）。
他のクラスＩ ＨＬＡ対立遺伝子上のｈＡ２－ＣＡＲコンストラクトの交差反応性
少数の祖先対立遺伝子から時間とともに進化してきた、ＨＬＡの多くの異なる対立遺伝子が存在する。その結果、わずか数個のアミノ酸が異なり得る対立遺伝子ファミリーが存在し、単一の抗ＨＬＡ抗体が進化関連ファミリー内の複数の対立遺伝子を認識する場合がある。マウスモノクローナル抗体（ＢＢ７．２）は、追加のＨＬＡ－Ａ対立遺伝子と交差反応することが知られている（Ｈｉｌｔｏｎ＆Ｐａｒｈａｍ、２０１３年）。具体的には、固相アッセイで検証した場合、ＢＢ７．２抗体は、ＨＬＡ－Ａ２の５つのサブタイプ（＊０２：０１、＊０２：０２、＊０２：０３、＊０２：０５、＊０２：０６）を認識し、ＨＬＡ－Ａ＊６９：０１と交差反応することが判明し、高濃度で検証した場合、ＨＬＡ－Ａ＊２３：０１、Ａ＊２４：０２、Ａ＊２４：０３、Ａ＊６８：０１及びＡ＊６８：０２と交差反応することが判明した（Ｈｉｌｔｏｎ＆Ｐａｒｈａｍ、２０１３）。移植との関連において、同種の細胞、組織及び／又は器官への特異的ターゲティングを確実にするためには、ａｌｌｏＡｇ特異性の知識が必要である。Ｔ細胞のアロ反応性を測定する従来の方法は、ハプロタイプＰＢＭＣの大規模なバンクを用いた機能的ＭＬＲを伴うので、不正確で非定量的である。本発明のヒト化抗ＨＬＡ－Ａ２抗体の交差反応性を評価し、ＢＢ７．２抗体と比較するために、血清中の抗ＨＬＡ抗体を測定するために設計されたＯＮＥ Ｌａｍｂｄａ固相アッセイを、目的のヒト化ＣＡＲに結合するＨＬＡコーティングビーズを測定するように適合させた。ＢＢ７．２ ＣＡＲは、ＭａｃＤｏｎａｌｄ、Ｋ．Ｇ．（２０１６）の記載に従って生成した。指定のヒト化ＣＡＲを発現するＮＧＦＲ＋ＴｒｅｇをＦｌｏｗ Ｐａｎｅｌ Ｒｅａｃｔｉｖｅ Ｓｉｎｇｌｅ Ａｎｔｉｇｅｎビーズとともにインキュベートし、単一のクラスのビーズへの結合を、前方／側方散乱プロットのビーズゲートにおけるシグナルの損失として定量化した（詳細については方法を参照）。データを、試料中の陰性対照ビーズの数に対して正規化し、ｈＣＡＲ発現Ｔｒｅｇへの相対的結合の量は、ＮＧＦＲ検体中の陰性ビーズの数にＮＧＦＲ検体中の陰性ビーズの数を掛けたものによる、ＮＧＦＲ対照Ｔｒｅｇによる結合の量に関連して計算した。方法論を検証するために、ＦｌｏｗＰＲＴ細胞アッセイ（図６Ｂ）で決定した各ｍ／ｈＡ２－ＣＡＲコンストラクトのＨＬＡ－Ａ＊０２：０１への相対結合を、四量体結合のＭＦＩ（図６Ｃ）と比較した。この分析により、Ａ＊０２：０１結合を検出する２つの方法間に強い直接的な相関関係があることが明らかとなった。ＦｌｏｗＰＲＴ細胞アッセイによって決定されるＡ＊０２：０１結合の量が、Ａ＊０２：０１への曝露の生物学的効果と相関するかどうかを、更に検証した。実際、Ａ＊０２：０１発現ＡＰＣへの曝露後のＣＤ６９上方制御によって判断されるように、ＦｌｏｗＰＲＴ細胞アッセイによって定量化されたＡ＊０２：０１結合の量とＴｒｅｇ活性化の刺激との間に、直接的な相関関係があることが分かった（図６Ｄ）。これらのデータは、異なるＨＬＡ対立遺伝子に結合するａｌｌｏＡｇ特異的ＣＡＲの能力を測定するＦｌｏｗＰＲＴ細胞法の有用性を実証している。
図６及び表９に示すように、全てのｈＡ２－ＣＡＲコンストラクトはＨＬＡ－Ａ＊０２：０１に有意に結合し、四量体結合アッセイを裏付けた。単一抗原ＦｌｏｗＰＲＡアッセイにおいてＢＢ７．２抗体の結合を検証したとき、Ａ＊６９：０１への高い結合を確認したが、Ａ＊２３：０１又はＡ＊２４：０２への交差反応性を確認することはできなかった（図６）。様々なＨＬＡ－Ａ対立遺伝子に結合するｍ／ｈＡ２－ＣＡＲ Ｔｒｅｇの相対的能力を検証すると、ｍＡ２－ＣＡＲ－ＴｒｅｇｓがＨＬＡ－Ａ＊０３：０１、Ａ＊２５：０１、Ａ＊２９：０２、Ａ＊３０：０１、Ａ＊３１：０１、Ａ＊３３：０１、Ａ＊３６：０１、Ａ＊６８：０１及びＡ＊６９：０１に有意に結合したことが分かった（図６、表９）。対照的に、ｈＡ２－ＣＡＲ Ｔｒｅｇの全ての変異体は、ｍＡ２－ＣＡＲ Ｔｒｅｇと比較して、意外にも交差反応性の低下を示した（図６、表９）。予想どおり、全てのＣＡＲコンストラクトは、わずか６アミノ酸だけ異なるＡ＊０２：０１の変異体であるＨＬＡ－Ａ＊６９：０１に結合した。ＣＡＲコンストラクトのいずれも、ＨＬＡ－Ｂへの有意な結合を示さなかった（図６）。
ＣＡＲ－Ｔｒｅｇ Ａｇの結合度と生物活性の関係は不明である。ＨＬＡ交差反応性の生物学的意義を定義するために、ＨＬＡ－Ａ＊２４：０２、Ａ＊２５：０１又はＡ＊６８：０１を発現するＡＰＣを生成した。全ての細胞に同程度のＨＬＡ－Ａ発現レベルがあった（データ示さず）。ＣＤ６９、ＣＤ７１、ＬＡＰ、ＣＴＬＡ－４（図６Ｉ）又はＣＤ４０Ｌ（データ示さず）の発現亢進によって判断されるように、ＨＬＡ－Ａ＊０２：０１発現細胞との共培養のみが、ｍ／ｈＣＡＲ－Ｔｒｅｇの有意な活性化をもたらすことが分かった。これらのデータは、ＴｒｅｇのＣＡＲを介した効果的な活性化には、高い親和性及び／又はアビディティの相互作用が必要であることを示唆している。したがって、一部のｈＡ２－ＣＡＲはＦｌｏｗＰＲＴアッセイにおいてＡ＊２５：０１とＡ＊６８：０１の結合を示すが、結合の強度は細胞の活性化には不十分である。
表９．ｍ／ｈＡ２－ＣＡＲとＨＬＡ－Ａ／Ｂタンパク質との結合相互作用は、統計的に有意であることが判明した（２元配置分散分析、Ｄｕｎｎｅｔｔポストテスト）。
Figure 0007578939000046
Figure 0007578939000047

同種抗原に対するＣＡＲの特異性を体系的に検証する新しい方法を開発し、定義された対立遺伝子特異性を有するコンストラクトを包括的に識別する新しいプラットフォームを作成した。驚くべきことに、ｍＡ２－ＣＡＲと比較して、ＣＡＲのヒト化により、いくつかのＨＬＡ－Ａ対立遺伝子変異体に対する交差反応性が低下することが分かった。
ｈＡ２－ＣＡＲ Ｔｒｅｇは、インビトロでのＨＬＡ－Ａ２特異的抑制を媒介する
Ｔｒｅｇにおける抗原特異的抑制活性を刺激するｈＡ２－ＣＡＲの能力を検証するために、図７Ａに示す実験計画に従って混合リンパ球反応（ＭＬＲ）を用いた。具体的には、ＨＬＡ－Ａ＊０２：０１陰性Ｔ細胞の増殖を、Ｔｒｅｇ無しで、又はＴｒｅｇ（非形質導入型か、又は対照ＮＧＦＲレンチウイルス若しくはＨ１ｋ２ ｈＡ２－ＣＡＲをコードするレンチウイルスによる形質導入型のいずれか）の割合を増大させながら、成熟ＨＬＡ－Ａ＊０２：０１陽性樹状細胞との共培養によって刺激した。図７Ｂ－Ｅに示すように、ｈＡ２－ＣＡＲを発現するＴｒｅｇは、ＮＧＦＲ対照レンチウイルスコンストラクトによって形質導入された対照Ｔｒｅｇと比較して、ＣＤ４＋Ｔ細胞の同種抗原刺激による増殖を有意に抑制することができた。
ｈＡ２－ＣＡＲ Ｔｒｅｇは、インビボでの異種ＧＶＨＤのＨＬＡ－Ａ２特異的抑制を媒介する
インビボにおけるｈＡ２－ＣＡＲ Ｔｒｅｇの機能的能力を検証するために、免疫不全ＮＳＧマウスに移植されたヒトＰＢＭＣが異種ＧＶＨＤを引き起こすマウスモデルを用いた。ＨＬＡ－Ａ２ドナーからの８×１０６個のＰＢＭＣを、Ｈ１ｋ２ ｈＡ２－ＣＡＲを発現するＴｒｅｇの有無にかかわらず、照射されたＮＳＧマウスに注射した。検証したＰＢＭＣとｈＡ２－ＣＡＲのＴｒｅｇの比率は１：２であった（すなわち、８×１０６個のＰＢＭＣ対４×１０６個のＴｒｅｇ）。方法に記載したように、臨床スコアによりマウスを７週間監視した。図７のインビトロデータと一致して、ｈＡ２ ＣＡＲ発現Ｔｒｅｇを投与されたマウスは、ｈＡ２ ＣＡＲＴｒｅｇを投与されなかったマウスと比較して、生存率が改善し、体重減少が軽減され、ｘｅｎｏＧＶＨＤの発症が遅れた（灰色の実線）（図８Ａ、図８Ｂ及び図８Ｃ）。Ｔｒｅｇの生物学的効果は観察されたが、注射後１４日から測定された循環ｍ／ｈＡ２－ＣＡＲ Ｔｒｅｇは検出されなかった（図８Ｄ及び図８Ｅ）。
ｈＡ２－ＣＡＲ ＴｒｅｇはインビボにおいてＨＬＡ－Ａ２＋皮膚移植片に輸送される
ＣＡＲ指向の特異性がＴｒｅｇ輸送にどのように影響したかを検証するために、ＮＳＧ又はＮＳＧ－Ａ＊０２：０１トランスジェニックマウスからＮＳＧマウスへの並行皮膚移植を実施した（図９Ａ）。移植片回収後、ｍ／ｈＡ２－ＣＡＲ Ｔｒｅｇの非存在下若しくは存在下で、又は非特異的ポリクローナルＴｒｅｇ対照としてＨＥＲ２－ＣＡＲ Ｔｒｅｇとともに、ＰＢＭＣを注射した（ＭａｃＤｏｎａｌｄ他、２０１６年）。ＣＡＲに加えて、ルシフェラーゼ－ＧＦＰ融合タンパク質をコードするレンチウイルスと同時にＴｒｅｇを形質導入した。Ｄ－ルシフェリン注射後、Ｔｒｅｇ注射後２１日まで、生物発光イメージングを実施した（Ｂａｒｒｅｔｔ他、２０１４年）。ポリクローナルＨＥＲ２－ＣＡＲ Ｔｒｅｇは、同種移植片への輸送の指向パターンを示したが、Ａ２陽性移植片及びＡ２陰性移植片の間に均等に分布していた。遺伝子操作されていない免疫不全マウスではヒトＴ細胞は典型的には肺に輸送されるので、これらのポリクローナルＴｒｅｇは、術後の皮膚から発せられる炎症シグナルに応答して移動している可能性がある（Ｎｅｒｖｉ他、２００７）。Ａ２陰性皮膚とＡ２陽性皮膚に等しく輸送されたポリクローナルＨＥＲ２－ＣＡＲ Ｔｒｅｇとは対照的に、両方のｍ／ｈＡ２－ＣＡＲ Ｔｒｅｇは、Ａ２発現皮膚に迅速に輸送された。更に、ｍ／ｈＡ２－ＣＡＲ Ｔｒｅｇは、非特異的ＨＥＲ２－ＣＡＲ Ｔｒｅｇよりも長く持続した。ＨＥＲ２－ＣＡＲ Ｔｒｅｇは２１日目には検出できなかったが、強いｍ／ｈＡ２－ＣＡＲ Ｔｒｅｇシグナルが残っていた（図９Ｂ）。Ａ２陽性移植片対Ａ２陰性移植片の発光比の定量化により、Ａ２発現移植片へのＨ１ｋ２とｍＡ２－ＣＡＲ Ｔｒｅｇ両方の有意なＡｇ駆動輸送が明らかとなった（図９Ｃ及び９Ｄ）。
移植片に局在するｍ／ｈＡ２－ＣＡＲ Ｔｒｅｇに加えて、２１日目に、局所流入領域リンパ節の位置と一致する隣接シグナルに注目した。屠殺後、移植片流入領域リンパ節を収集し、フローサイトメトリー分析により、かなりの割合のｈＣＤ４＋ＦＯＸＰ３＋ΔＮＧＦＲ＋Ａ２四量体＋ＣＡＲ Ｔｒｅｇが明らかとなった。対照的に、脾臓では、これらの細胞はほとんど検出されなかった（図１０Ｂ及び図１０Ｃ）。移植片からリンパ節へのこの２段階の移動プロセスは、耐性誘導に必要であることが以前に報告されている（Ｚｈａｎｇ他、２００９）。重要なことに、リンパ節ホーミングＣＡＲ Ｔｒｅｇは、ＦＯＸＰ３とＣＡＲの発現を維持し、その安定した表現型を示した。
ｈＡ２－ＣＡＲ Ｔｒｅｇは、ヒト皮膚同種移植片の拒絶反応を防ぐ
実質臓器移植モデルにおけるｈＡ２－ＣＡＲ Ｔｒｅｇの免疫制御能を評価するために、ＮＳＧマウスにヒトＨＬＡ－Ａ２ｐｏｓ皮膚移植片を移植した皮膚移植のヒト化モデルを使用した。６週間後、マウスに、自己Ｈ１ｋ２ ｈＡ２－ＣＡＲ Ｔｒｅｇの有無にかかわらず、ＨＬＡ－Ａ２ｎｅｇＰＢＭＣを注射した。細胞注射の４週間後、マウスを屠殺し、病理及び炎症性サイトカイン発現の評価のために皮膚移植片を収集した。全てのマウスは安定した体重を維持し、異種ＧｖＨＤの欠如を示し（図１１Ａ）、血液及び脾臓において同様のレベルのヒト白血球の生着を示した（図１１Ｂ）。Ｈ＆Ｅ切片を、２５ポイントスケールを用いて評価し、ＰＢＭＣと比較して、Ｈ１ｋ２ ｈＡ２－ＣＡＲ Ｔｒｅｇを投与したマウスの累積病理学的拒絶反応スコアの有意な減少が明らかとなった（図１１Ｃ）。免疫染色により、ＰＢＭＣのみを投与したマウスと比較して、ＰＢＭＣ及びＨ１ｋ２ ｈＡ２－ＣＡＲ Ｔｒｅｇを投与したマウスでは、Ｋｉ６７＋ケラチノサイトが有意に減少し、インボルクリンの破壊が減少したことが明らかとなった（図１１Ｄ）。また、ｑＰＣＲの定量化により、Ｈ１ｋ２ ｈＡ２－ＣＡＲ Ｔｒｅｇ処理マウスの移植片内の炎症性サイトカインの全体的な減少が示された（図１１Ｅ）。
異種ＧＶＨＤモデルに関して、ＰＢＭＣは血中で検出可能であったが、ＣＡＲ Ｔｒｅｇは検出されなかった（図１２）。しかしながら、免疫染色により、ＰＢＭＣのみを投与したマウスと比較して、ＰＢＭＣ及びＨ１ｋ２ ｈＡ２－ＣＡＲ Ｔｒｅｇを投与したマウスは、移植片内のＦＯＸＰ３＋細胞の割合が有意に高いことが明らかとなった（図１１Ｆ）。ＦＯＸＰ３＋細胞の存在は、腸、肝臓又は肺では検出されなかったので、移植された皮膚移植片に特有であった（図１１Ｇ）。これらのデータは、Ａ２トランスジェニックＮＳＧ皮膚を用いたモデルについて、Ｈ１ｋ２ ｈＡ２－ＣＡＲ ＴｒｅｇｓがヒトＡ２＋皮膚同種移植片に特異的に輸送され、そこで無制限に持続することを示す。
本願には、電子形式の配列リストがテキストファイル「ＣＤＲＤ－００３ＷＯ＿ＳＥＱ ＬＩＳＴＩＮＧ＿ＳＴ２５」（２０１８年９月１８日作成、サイズ３２０ＫＢ）として含まれる。テキストファイルの内容は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。
参考文献
Figure 0007578939000048
Figure 0007578939000049
Figure 0007578939000050
Figure 0007578939000051
Figure 0007578939000052
Figure 0007578939000053
Figure 0007578939000054
Figure 0007578939000055
Figure 0007578939000056
前述の発明を、明確さと理解のためにある程度詳細に説明してきたが、当業者には、本開示を読むことにより、本発明の真の範囲から逸脱することなく形式及び詳細の様々な変更がなされ得ることが明らかであろう。例えば、上記の全ての技術と装置は、様々な組合せで使用することができる。本願において引用される全ての出版物、特許、特許出願及び／又は他の文書は、個々の出版物、特許、特許出願及び／又は他の文書があらゆる目的のために参照によって組み込まれることが個別に示されているのと同程度に、あらゆる目的のためにその全体が参照によって組み込まれる。

Claims (19)

  1. （ｉ）ＢＢ７．２抗体（ＡＴＣＣ寄託番号ＨＢ－８２）と比較して、ＨＬＡ－Ａ＊２５、ＨＬＡ－Ａ＊２９、ＨＬＡ－Ａ＊３０のうちの１つ以上から選択される１つ以上のＨＬＡ－Ａサブタイプへの結合の低下を示す、ヒト化抗ＨＬＡ－Ａ２抗体またはその抗原結合断片を含む、細胞外ドメインと、
    （ｉｉ）膜貫通ドメインと、
    （ｉｉｉ）細胞内シグナル伝達ドメインを含む細胞質ドメインと、
    を含むキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）をコードする核酸を含む、発現ベクターであって、
    前記ヒト化抗ＨＬＡ－Ａ２抗体またはその抗原結合断片は、
    （ａ）配列番号６１のアミノ酸配列を含む重鎖可変ドメイン（ＶＨ）および配列番号６８のアミノ酸配列を含む軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）；
    （ｂ）配列番号６４のアミノ酸配列を含むＶＨおよび配列番号６８のアミノ酸配列を含むＶＬ；
    （ｃ）配列番号６５のアミノ酸配列を含むＶＨおよび配列番号６８のアミノ酸配列を含むＶＬ；
    （ｄ）配列番号６６のアミノ酸配列を含むＶＨおよび配列番号６８のアミノ酸配列を含むＶＬ；
    （ｅ）配列番号６４のアミノ酸配列を含むＶＨおよび配列番号６９のアミノ酸配列を含むＶＬ；
    （ｆ）配列番号６５のアミノ酸配列を含むＶＨおよび配列番号６９のアミノ酸配列を含むＶＬ；または
    （ｇ）配列番号６３のアミノ酸配列を含むＶＨおよび配列番号７０のアミノ酸配列を含むＶＬ；
    を含み、
    前記ＣＡＲは、前記ＣＡＲがＨＬＡ－Ａ２に特異的に結合するように免疫細胞において発現することが可能であり、
    前記発現ベクターは、発現プラスミド、クローニングベクター、ミニサークル、ミニベクター、二重微小染色体、レトロウイルスベクターコンストラクト、およびレンチウイルスベクターコンストラクトから選択される、
    発現ベクター。
  2. 前記ヒト化抗ＨＬＡ－Ａ２抗体またはその抗原結合断片が、配列番号７３のアミノ酸配列を含むｓｃＦｖである、請求項１に記載の発現ベクター。
  3. 前記ＣＡＲが、
    （ｉ）ヒト化抗ＨＬＡ－Ａ２抗体またはその抗原結合断片を含む、細胞外ドメインであって、前記ヒト化抗ＨＬＡ－Ａ２抗体またはその抗原結合断片が、配列番号７３、８１、８３、８４、８７、８８、および９１から成る群から選択されるアミノ酸配列を含むｓｃＦｖである、細胞外ドメイン；
    （ｉｉ）ＣＤ８αのストーク領域を含むヒンジ領域；
    （ｉｉｉ）ＣＤ２８の膜貫通ドメイン；および
    （ｉｖ）ＣＤ３ゼータの機能的シグナル伝達ドメインと、ＣＤ２８及び４－１ＢＢ（ＣＤ１３７）から成る群から選択されるタンパク質の機能的シグナル伝達ドメインを含む共刺激ドメインと、を含む細胞内シグナル伝達ドメイン；
    を含む、請求項１または２に記載の発現ベクター。
  4. 請求項１～３のいずれか一項に記載の発現ベクターを含む、改変免疫細胞。
  5. 自殺遺伝子系をさらに含む、請求項４に記載の改変免疫細胞。
  6. 制御性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）である、請求項４または５に記載の改変免疫細胞。
  7. 請求項１～３のいずれか一項に記載の発現ベクター又は複数の請求項４～６のいずれか一項に記載の改変免疫細胞と、薬学的に許容される担体、希釈剤又は賦形剤と、を含む医薬組成物。
  8. 対象において免疫寛容を促進するのに使用するための、および／または対象において移植片対宿主病（ＧＶＨＤ）を予防又は治療するのに使用するための、請求項７に記載の医薬組成物であって、前記免疫寛容は、移植された器官又は組織に対する寛容である、医薬組成物。
  9. 体重１ｋｇあたり１×１０４～１×１０９細胞の投与量で対象に投与するための、請求項７または８に記載の医薬組成物。
  10. 少なくとも１０４細胞の投与量で対象に投与するための、請求項７～９のいずれか一項に記載の医薬組成物。
  11. 初回投与と１回以上の後続投与で対象に投与するための、請求項７～１０のいずれか一項に記載の医薬組成物。
  12. 対象への移植片の移植と同時に、対象への移植片の移植の前に、又は対象への移植片の移植の後に、投与するための、請求項７～１１のいずれか一項に記載の医薬組成物。
  13. 別の活性剤と組み合わせて対象に投与するための、請求項７～１２のいずれか一項に記載の医薬組成物であって、前記別の活性剤は免疫抑制剤である、医薬組成物。
  14. 免疫抑制剤の投与の前に、免疫抑制剤の投与と同時に、または免疫抑制剤の投与の後に、対象に投与するための、請求項７～１３のいずれか一項に記載の医薬組成物。
  15. 前記免疫抑制剤は、シクロスポリンなどのカルシニューリン阻害剤、タクロリムス、アザチオプリン、メトトレキサート、メトキサレン、ラパマイシン、ミコフェノール酸モフェチル、ミコフェノール酸、ミコフェノール酸ナトリウム、６－メルカプトプリン、６－チオグアニン、リツキシマブ、シロリムス等のｍＴＯＲ阻害剤、エベロリムス、バシリキシマブ、ダクリズマブ、ベラタセプト、アレムツズマブ、ムロモナブＣＤ３、抗胸腺細胞グロブリン、グルココルチコステロイド、又はプレドニゾンやプレドニゾロンなどの副腎皮質ステロイド、又はそれらの任意の組合せから成る群から選択される、請求項１３または１４に記載の医薬組成物。
  16. 免疫抑制剤の量を減らすために対象に投与するための、請求項７～１５のいずれか一項に記載の医薬組成物。
  17. 請求項４～６のいずれか一項に記載の改変免疫細胞を作製する方法であって、請求項１～３のいずれか一項に記載の発現ベクターを用いて免疫細胞を形質導入し、それにより前記改変免疫細胞を生成することを含む、方法。
  18. （ａ）請求項４～６のいずれか一項に記載の改変免疫細胞と、
    （ｂ）薬学的に許容される緩衝液と、
    を含むキット。
  19. 少なくとも１種の免疫抑制剤をさらに含む、請求項１８に記載のキット。

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