CN1159047C - 一种具有减肥降脂作用的组合物 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了四十种中草药具有减肥降脂作用包括对脂肪酸合成酶活性有抑制作用对脂酰辅酶A合成酶活性有激活作用对小鼠、大鼠或人的前脂肪细胞向脂肪细胞分化有抑制作用这四十种中草药中部分或全部组合可以配制成减肥降脂药物。本发明可以用于开发制备功效成分明确、机理可靠、临床有效率高、毒副作用小的减肥降脂天然药物。并具体公开了一种由决明子、乌龙茶、菊花、陈皮、玉米须制成的减肥降脂组合物。
Description
技术领域：
本发明属于天然药物技术领域，尤其涉及用于减肥降脂的组合物。
背景技术：
肥胖是一个世界性的医学问题。已有大量证据表明肥胖和多种疾病密切相关，如高血压，高血脂，糖尿病，心脑血管疾病，乳腺癌，女性不孕症，少儿智力低下等。以BMI(Body Mass Index)男性大于27.8、女性大于27.3做为肥胖标准，我国目前18-74岁人口中肥胖人口总数约7000万，占人口总数的5.8％；美国同龄人口中肥胖人口总数约6800万，占人口总数的20％。我国每年用于减肥和肥胖相关疾病治疗的消费总额约100亿元人民币，而美国则为1000亿美元。目前我国肥胖人口比例增长迅速，少儿肥胖问题已显得越来越突出。
目前国际上减肥药物的开发主要依据两个原理：第一，抑制食欲，比如西布曲明(sibutramine)；第二，减少吸收，比如奥利斯他(orlistat)。二者也是目前中国市场上仅有的两个减肥药，前者商品名为曲美，可秀和奥曲轻，后者商品名为仙尼克。二者的副作用十分明显，西布曲明导致口干、心悸、乏力，奥利斯他导致油性便和脂溶性维生素缺乏。西方国家也一直在依据新的原理开发减肥药物，比如，发现黄嘌呤衍生物类物质可以通过加快体内氧化代谢而加大能量支出，大量临床试验证明咖啡因(caffeine)，麻黄素(ephedrine)单独使用或联合使用具有一定的减肥效果，但由于其可导致心率过速和心悸的副作用一直未获得临床许可；上世纪九十年代中期发现并克隆了小鼠ob基因的表达产物瘦素(leptin)，并证明其对于遗传型肥胖的大鼠具有一定的减肥作用，但遗传型肥胖的个体只占肥胖个体总数的5-10％，且此物质注射给药时导致严重局部红肿疼痛，因此也至今为获得临床许可。综上所述，现有减肥药物的主要不足之处是副作用大和临床有效率低下，而这两点不足都和药物靶点设计不够科学有关。
中草药是中国独具优势的药物资源，古今中医典籍中记载有大量的中草药减肥降脂的实例。但由于中草药活性成分不明确，药理机制不清楚等限制，使传统中草药不能走向世界，因此迄今我国还没有具有自主知识产权的减肥药物。2000年北京国际肥胖及减肥大会提出尽快开发出我国具有自主知识产权的减肥降脂新药的目标。
发明内容：
本发明的目的是解决现有减肥药物临床有效率低、副作用大的缺点，提供一种靶点设计科学，从而副作用小、临床有效率高的减肥药物。
本发明的技术方案如下：
鉴于下列各单味中草药中含有对脂肪酸合成酶(fatty acid synthase，FAS)活性有抑制作用的成分，对脂酰辅酶A合成酶(acyl-CoA synthase，ACS)活性有激活作用的成分，对小鼠、大鼠或人的前脂肪细胞(preadipocyte)向脂肪细胞(adipocyte)分化有抑制作用的成分：
大枣、大黄、山楂、乌龙茶、月见草、玉米须、甘草、代代花、半夏、地黄、决明子、当归、红花、麦芽、花椒、芦荟、何首乌、灵芝、陈皮、苦丁茶、茉莉花、刺五加叶、虎杖、罗布麻、泽泻、茵陈、茜草、茯苓、绞股篮、枸杞子、栀子、荷叶、柴胡、黄芩、黄芪、黄连、菊花、银杏叶、番泻叶、葛根
而这些活性成分或其组合具有显著的减肥降脂作用，上述中草药中的部分组合或全部组合可以配制成减肥降脂药物。
本发明具体提供的具有减肥降脂作用的组合物，是由以下列重量配比的原料制成：决明子300，乌龙茶180，菊花150，陈皮150，玉米须120。
上述中草药中相关活性成分的鉴定方法是：
一、鉴定中草药中是否含有对脂肪酸合成酶有抑制作用的活性成分的方法是：
1.分离纯化大鼠体内脂肪酸合成酶：
摘取大鼠皮下、肾周围及睾丸周围脂肪，合并，剪碎。加入约3倍体积的0.25M蔗糖溶液，匀浆。匀浆液于100000×g离心60分钟，取上清液，为FAS粗提液。在此粗提液中边搅动边加入固体硫酸铵至25％饱和度，继续搅动10分钟，12000×g离心10分钟，弃去沉淀，在上清中再加入固体硫酸铵至40％饱和度，搅动15分钟，离心收集沉淀，溶于适量含1mM DTT，1mM EDTA，pH7.0的4mM磷酸钾缓冲液中，为纯化的FAS。以上操作均在0-4℃下进行。
2.制备中草药的水提取物或乙醇提取物：
A、水提取物制备：
各单味中草药取饮片，预制、粉碎。加5倍体积蒸馏水，煮沸30分钟，8层白纱布过滤取清液；沉渣重新加入5倍体积蒸馏水，煮沸30分钟，8层白纱布过滤取清液。两次清液合并，冷冻干燥。将所得干粉溶于适量蒸馏水中，得到棕黄色或棕红色透明液体提取物，用减压蒸干法测定可溶性固形物含量，使各单味中草药的各次提取中稳定在30-100mg/ml。此提取物2-8℃下保存72小时以上有浑浊出现。
B、乙醇提取物制备：
各单味中草药取饮片，预制、粉碎。无水乙醇回流3次，回流液合并，得到棕黄色或棕红色透明液体提取物，用减压蒸干法测定可溶性固形物含量，使各单味中草药的各次提取中稳定在20-40mg/ml。
3.建立脂肪酸合成酶测活体系，在测活体系中加入中草药提取物，进行脂肪酸合成酶活性抑制实验，计算抑制程度，确认中草药中是否含有抑制脂肪酸合成酶活性的成分。
建立脂肪酸合成酶测活体系：用分光光度法。测活体系总体积1.0ml，包括反应启动物丙二酰辅酶A0.05ml。用37℃下每分钟催化1.0μmol依赖于丙二酰辅酶A的NADPH氧化的酶量为FAS的一个活力单位，每毫克酶蛋白含有的活力单位数为FAS的比活力(u/mg)。
进行脂肪酸合成酶活性抑制实验：在测活体系中加入中草药水提取物或乙醇提取物，使其和酶作用5分钟后加入反应起始物。中草药提取液加入量为每毫升测活体系5μl中草药提取液，以5μl双蒸水或无水乙醇为对照。计算抑制程度，确认有抑制作用的活性成分。
二、鉴定中草药中是否含有对脂酰辅酶A合成酶有激活作用的活性成分的方法是：
1.分离纯化大鼠肝组织脂酰辅酶A合成酶：
摘取大鼠肝脏约200g，切碎。加入约3倍体积的0.25M蔗糖溶液，匀浆。匀浆液于600×g离心10分钟，沉淀颗粒重新置于约3倍体积的0.25M蔗糖溶液中再次离心，两次离心上清液合并。用230000×g离心60分钟，取沉淀；将沉淀悬浮于适量混合液中(此混合液含有5mM Triton X-100，50mM pH7.4磷酸钾缓冲液，5mM β-巯基乙醇和1mM EDTA，蛋白质浓度约4.5mg/ml)，静置1小时，230000×g离心60分钟，取上清液，为ACS粗提液。用约5倍体积的含2mMTriton X-100和5mM β-巯基乙醇的溶液稀释ACS粗提液，将稀释液上Blue-Sepherose层析柱(CL-6B，2.6×18cm)用5倍体积的含10mM ATP和0.8M NaCl的Buffer A(100mM磷酸钠，25mM柠檬酸钾，pH7.0)洗柱，最后用含10mM ATP和0.8M NaCl的Buffer A洗脱，流速15ml/小时，每15ml收集。将含有最大酶活性的部分合并，为纯化的ACS。以上操作均在0-4℃下进行。
2.制备中草药水提取物或乙醇提取物：方法同将脂肪酸合成酶作为靶点进行分子水平筛选方法中的步骤。
3.建立脂酰辅酶A合成酶测活体系，在测活体系中加入中草药水提取物或乙醇提取物，进行脂酰辅酶A合成酶活性激活实验，计算激活程度，确认中草药中是否含有对脂酰辅酶A合成酶有激活作用的活性成分。
建立脂酰辅酶A合成酶测活体系：用同位素法。测活体系总体积1.0ml，包括反应启动物辅酶A 0.05ml。用35℃下每分钟生成1.0μmol C14-标记棕榈酸辅酶A的酶量代表ACS的一个活力单位，以每毫克酶蛋白含有的活力单位数代表ACS的比活力(u/mg)。
进行脂酰辅酶A合成酶活性激活实验：在测活体系中加入中草药水提取物或乙醇提取物，使其和酶作用5分钟后加入反应起始物。中草药提取液加入量为每毫升测活体系5μl中草药提取液，以5μl双蒸水或无水乙醇为对照。计算激活程度，确认中草药中是否含有对脂酰辅酶A合成酶有激活作用的活性成分。
三、鉴定中草药中是否含有对小鼠、大鼠或人前脂肪细胞向成熟脂肪细胞分化有抑制作用的活性成分的方法是：
1.制备中草药水提取物或乙醇提取物：方法同将脂肪酸合成酶作为靶点进行分子水平筛选方法中的步骤。
2.进行小鼠、大鼠或人脂肪细胞分化抑制实验，检测细胞分化被抑制的程度，从而确认中草药中是否含有对细胞分化有抑制作用的活性成分。方法可以为：
将小鼠、大鼠或人前脂肪细胞以一定密度接种于96孔板中，用生长培养基常规培养。细胞汇合后换成分化培养基，并加入不同浓度的中草药提取液，以相同体积的双蒸水或无水乙醇为对照，培养6天，期间根据需要换液。用油红O染色法测定细胞中脂肪含量，结合细胞形态确定分化程度，检测细胞分化被抑制的程度，从而确认中草药中是否含有对细胞分化有抑制作用的活性成分。
按照上述方法，我们对所述40种中草药中的相关活性成分进行了初步鉴定，该40种中草药提取物对脂肪酸合成酶(fatty acid synthase，FAS)活性的抑制作用、对脂酰辅酶A合成酶(acyl-CoA synthase，ACS)活性的激活作用、对小鼠、大鼠或人的前脂肪细胞(preadipocyte)向脂肪细胞(adipocyte)分化的抑制作用见表1，表中的“+”的数目表示其对相关指标影响的大小。
表1：
| 中草药名称 | 对FAS的抑制作用 | 对ACS的激活作用 | 脂肪细胞分化抑制 | |||
| 水提取物 | 醇提取物 | 水提取物 | 醇提取物 | 水提取物 | 醇提取物 | |
| 大枣 | + | |||||
| 大黄 | ++ | ++++ | +++ | |||
| 山楂 | + | |||||
| 乌龙茶 | ++ | + | ++ | |||
| 月见草 | + | |||||
| 玉米须 | +++ | |||||
| 甘草 | ++ | |||||
| 代代花 | + | |||||
| 半夏 | + | |||||
| 地黄 | + | |||||
| 决明子 | +++ | ++ | ||||
| 当归 | + | |||||
| 红花 | + | + | ||||
| 麦芽 | + | |||||
| 花椒 | + | + | ||||
| 芦荟 | ++ | + | + | |||
| 何首乌 | + | |||||
| 灵芝 | + | |||||
| 陈皮 | ++ | + | ++ | |||
| 苦丁茶 | +++ | ++ | ||||
| 茉莉花 | + | |||||
| 刺五加 | + | |||||
| 虎杖 | + | |||||
| 罗布麻 | + | + | ||||
| 泽泻 | + | |||||
| 茵陈 | ++ | ++ | + | |||
| 茜草 | + | |||||
| 茯苓 | + | |||||
| 绞股兰 | ++ | + | ||||
| 枸杞子 | + | + | ||||
| 栀子 | + | |||||
| 荷叶 | ++ | ++ | ||||
| 柴胡 | ++ | |||||
| 黄芩 | + | |||||
| 黄芪 | + | |||||
| 黄连 | + | |||||
| 菊花 | +++ | ++ | ||||
| 银杏叶 | + | |||||
| 番泻叶 | + | + | ||||
| 葛根 | + | |||||
参照上述表1对各中草药中含有的抑制脂肪酸合成酶、激活脂酰辅酶A合成酶和抑制脂肪细胞分化的活性成分的提示，取决明子300g，乌龙茶180g，菊花150g，陈皮150g，玉米须120g。选拣、混合。加2000ml水煮沸30分钟，用8层白纱布过滤；将药渣置于1500ml水中再次煮沸30分钟，过滤。两次滤液合并，冷冻干燥，得到约180g干粉。动物药效实验分为6个组：阴性对照、高脂对照、阳性对照1、阳性对照2、低剂量组、高剂量组。阴性对照为普通饲料，高脂对照为普通饲料加蛋黄粉、胆固醇、猪油，阳性对照1为高脂饲料加曲美，阳性对照2为高脂饲料加血脂康，低剂量组为高脂饲料加500mg受试物/公斤体重/天，高剂量组为高脂饲料加3000mg受试物/公斤体重/天。每只大鼠单笼饲养，实验时间为35天。
检测项目为每只大鼠的实验前体重(BWSE)、实验后体重(BWFE)、体重增加(IBW)、实验后脂肪重(BFFE)、脂体比(PBFBW)、总食物消耗量(TAIF)、食物利用率(GIBWGFI、IPBFGFI)、血清甘油三脂(TG)、总胆固醇(TC)、低密度脂蛋白(LDL)、脂肪组织脂肪酸合成酶(FAS)活性和肝组织脂酰辅酶A合成酶(ACS)活性。
药效实验结果表明上述受试物能明显降低大鼠体重、体内脂肪量、血清甘油三脂和总胆固醇量，并能显著抑制FAS和ACS活性。其减轻体重和体内脂肪重量的效果强于曲美，其降低TG、TC和LDL的效果优于血脂康。五种中草药提取物的减肥降脂实验结果见表2-5。
表2：曲美和血脂康对BWFE，IBW，BFFE，PBFBW，TG，TC and LDL的影响
Groups BWSE BWFE IBW BFFE PBFBW TG TC LDL
(g) (g) (g) (g) (％) mmol.L-1mmol.L-1mmol.L-1
B1 49.6 340.3 290.7 24.4 7.17 3.26 3.40 0.32
B2 47.8 328.2 280.4 26.0 7.92 3.34 4.31 0.38
B3 46.8 310.3 263.5 23.4 7.54 2.93 3.07 0.27
B4 55.0 344.1 289.1 28.8 8.37 3.60 3.78 0.39
B5 45.4 301.4 256.0 22.3 7.40 3.08 3.44 0.32
B6 48.2 325.6 277.4 24.9 7.65 3.55 3.57 0.28
B7 52.2 335.0 282.7 25.2 7.52 3.19 3.15 0.30
B8 46.0 315.5 269.5 26.7 8.46 3.81 3.99 0.40
average 48.9 325.1 276.2 25.2 7.75 3.35 3.59 0.33
±s 3.281 14.989 12.260 2.008 0.460 0.292 0.420 0.051
C1 54.4 279.0 224.6 21.8 7.81 2.50 3.34 0.29
C2 46.8 290.3 243.5 23.0 7.92 2.88 3.77 0.36
C3 56.0 291.8 235.8 20.8 7.13 3.75 3.52 0.37
C4 50.7 258.6 207.9 17.7 6.84 3.14 2.80 0.32
C5 45.3 255.0 209.7 18.4 7.22 3.33 3.03 0.41
C6 46.7 260.7 214.0 17.8 6.83 3.69 3.49 0.36
C7 48.1 244.0 195.9 17.9 7.34 2.97 3.28 0.40
C8 45.8 248.9 203.1 18.5 7.43 2.81 3.94 0.31
average 49.2 266.0**216.8**19.5**7.32* 3.13 3.40 0.35
±s 4.062 18.537 16.461 2.075 0.402 0.435 0.371 0.043
D1 48.6 318.8 270.2 23.1 7.25 2.66 2.33 0.22
D2 51.9 340.7 288.6 25.0 7.34 2.43 1.64 0.24
D3 46.5 334.9 288.4 24.2 7.23 2.28 2.52 0.17
D4 54.3 335.6 281.3 24.6 7.33 1.98 2.40 0.25
#D5 44.8 - - - - - - -
D6 46.0 306.2 260.2 21.1 6.89 2.74 1.88 0.27
D7 47.2 320.0 272.8 22.6 7.06 2.14 1.76 0.19
D8 45.3 308.3 263.0 22.0 7.14 2.19 2.09 0.18
average 48.1 323.5 274.9 23.2**7.18** 2.35** 2.09** 0.22**
±s 3.373 13.765 11.512 1.438 0.161 0.279 0.340 0.038
#：大鼠D5在实验中意外死亡。
表3：受试物对BWFE，IBW，BFFE，PBFBW，TG，TC and LDL的影响
Groups BWSE BWFE IBW BFFE PBFBW TG TC LDL
(g) (g) (g) (g) (％) mmol.L-1mmol.L-1mmol.L-1
B1 49.6 340.3 290.7 24.4 7.17 3.26 3.40 0.32
B2 47.8 328.2 280.4 26.0 7.92 3.34 4.31 0.38
B3 46.8 310.3 263.5 23.4 7.54 2.93 3.07 0.27
B4 55.0 344.1 289.1 28.8 8.37 3.60 3.78 0.39
B5 45.4 301.4 256.0 22.3 7.40 3.08 3.44 0.32
B6 48.2 325.6 277.4 24.9 7.65 3.55 3.57 0.28
B7 52.2 335.0 282.7 25.2 7.52 3.19 3.15 0.30
B8 46.0 315.5 269.5 26.7 8.46 3.81 3.99 0.40
average 48.9 325.1 276.2 25.2 7.75 3.35 3.59 0.33
±s 3.281 14.989 12.260 2.008 0.460 0.292 0.420 0.051
E1 52.0 310.8 258.8 21.1 6.79 3.27 2.93 0.18
E2 45.6 290.5 244.9 20.0 6.88 3.00 2.47 0.37
E3 47.3 320.3 272.9 21.0 6.56 2.75 3.13 0.26
E4 46.8 299.0 252.2 22.3 7.46 2.96 2.36 0.28
E5 54.5 295.4 240.9 20.4 6.91 2.67 3.20 0.41
E6 49.2 315.4 266.2 21.7 6.88 3.44 3.12 0.35
E7 45.0 301.5 256.5 19.5 6.47 2.89 3.44 0.33
E8 56.1 322.1 266.0 22.7 7.05 3.05 3.01 0.29
average 49.6 306.9** 257.3** 21.09** 6.88** 3.00** 2.96** 0.31
±s 4.183 11.897 11.019 1.110 0.303 0.255 0.368 0.072
F1 45.8 297.0 251.2 17.8 5.99 1.35 2.05 0.24
F2 53.0 294.5 241.5 16.7 5.67 1.68 1.89 0.26
F3 55.2 293.0 237.8 17.3 5.90 1.61 2.11 0.19
F4 45.8 288.4 242.6 16.9 5.85 1.48 1.73 0.28
F5 49.3 306.8 257.5 17.6 5.74 1.84 2.18 0.39
F6 48.1 311.2 263.1 19.2 6.17 1.26 1.69 0.22
F7 56.5 313.9 257.4 21.5 6.85 1.82 2.33 0.34
F8 51.1 317.9 266.8 18.0 5.66 2.01 2.75 0.38
average 50.6 302.8** 252.2** 18.125**5.98** 1.63** 2.09** 0.29
±s 4.071 10.979 10.704 1.565 0.391 0.258 0.345 0.075
表4：受试物、曲美和血脂康对TAIF，GIBWGFI and IPBFGFI的影响
Groups TAIF GIBWGFI IPBFGFI Groups TAIF GIBWGFI IPBFGFI
(g) (g) (％，×10-3) (g) (g) (％×10-3)
B1 709.5 0.4097 10.1057 D1 591.7 0.4566 12.2528
B2 677.2 0.4141 11.6952 D2 710.4 0.4063 10.3322
B3 639.0 0.4124 11.7997 D3 703.7 0.4098 10.2743
B4 688.4 0.4200 12.1586 D4 706.1 0.3984 10.3810
B5 650.1 0.3938 11.3829 #D5 - - -
B6 633.4 0.4380 12.0777 D6 598.5 0.4348 11.5121
B7 700.3 0.4037 10.7383 D7 638.4 0.4273 11.0589
B8 632.8 0.4259 13.3692 D8 628.6 0.4184 11.3586
average 666.3 0.415 11.666 average 653.9 0.422* 11.024**
±s 31.263 0.014 0.979 ±s 51.986 0.020 0.743
C1 489.6 0.4587 15.9518 E1 660.0 0.3921 10.2879
C2 584.4 0.4167 13.5534 E2 561.0 0.4365 12.2638
C3 681.5 0.3460 10.4622 E3 671.6 0.4063 9.7677
C4 486.5 0.4273 14.0596 E4 587.6 0.4292 12.6957
C5 555.7 0.3774 12.9926 E5 624.0 0.3861 11.0737
C6 718.2 0.2980 9.5099 E6 585.6 0.4546 11.7486
C7 434.9 0.4504 16.8774 E7 608.4 0.4216 10.6345
C8 428.5 0.4740 17.3396 E8 633.1 0.4202 11.1357
average 547.4** 0.406** 13.843** average 616.4** 0.418 11.201**
±s 108.520 0.061 2.852 ±s 38.165 0.023 0.992
F1 577.8 0.4348 10.3669
F2 601.3 0.4016 9.4296
F3 537.4 0.4425 10.9788
F4 609.0 0.3984 9.6059
F5 638.6 0.4032 8.9884
F6 571.0 0.4608 10.8056
F7 594.6 0.4329 11.5203
F8 619.7 0.4305 9.1335
average 593.7** 0.426**10.104**
±s 31.447 0.022 0.943
#大鼠D5在实验中意外死亡。
表5：受试物、曲美和血脂康对FAS和ACS活性的影响
Groups FAS比活性(u/mg) FAS相对活性 ACS比活性(u/mg) ACS相对活性
B2 210 413
B4 249 1.000 390 1.000
B6 238 382
average 232.3 395.0
C2 222 443
C4 207 0.907 398 1.061
C6 203 416
average 210.7 419.0
D2 217 500
D4 229 0.938 472 1.224
D6 208 478
average 218.0 483.3
E2 190 645
E4 156 0.758 530 1.422
E6 182 510
average 176.0 561.7
F2 109 1050
F4 118 0.505 973 2.455
F6 125 886
average 117.3 969.7
本发明的优点和积极效果：本发明首次对某些中草药中含有的抑制脂肪酸合成酶、激活脂酰辅酶A合成酶和抑制脂肪细胞分化的活性成分进行了鉴定；这些活性成分的组合具有明显的减肥降脂作用；其减肥降脂作用主要是通过抑制体内脂肪合成、促进脂肪分解和抑制前脂肪细胞向成熟脂肪细胞分化而实现的。
本发明可以用于开发制备功效成分明确、机理可靠、临床有效率高、毒副作用小的减肥降脂天然药物。
实施例：
参照发明内容部分中的表1给出的提示，取决明子300g，乌龙茶180g，菊花150g，陈皮150g，玉米须120g。选拣、混合。加2000ml水煮沸30分钟，用8层白纱布过滤；将药渣置于1500ml水中再次煮沸30分钟，过滤。两次滤液合并，冷冻干燥，得到约180g干粉。该干粉含有抑制脂肪酸合成酶、激活脂酰辅酶A合成酶和抑制脂肪细胞分化的活性成分，具有减肥降脂作用。
Claims (1)
1.一种具有减肥降脂作用的组合物，其特征在于是由以下重量配比的原料制成：决明子300，乌龙茶180，菊花150，陈皮150，玉米须120。
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