CN115902212A - 一种可视化检测多粘菌素耐药大肠杆菌的方法及试剂 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种以12肽(NYSSFISSXRAC)为抗原，量子点13肽(KNYSSSIFFIHAC)为抗体检测多粘菌素耐药的大肠杆菌的检测方法，包括：将样品涂或在滴在含有12肽的玻璃上，孵育后洗涤，甩干；滴加量子点标记的13肽，孵育后洗涤；甩干后，滴加甘油盖玻片封片，荧光镜下观察。本发明的创新在于避开了基于PCR仪的检测，不再扩增核酸序列，而是将大肠杆菌菌体作为一种检测样本，在一个能发红绿蓝三色光谱的便携式仪器帮助下，使用本发明的试剂，短时间内(根据温度的不同从一两个小时到十几小时)可以检测出多粘菌素耐药的大肠杆菌及初步定量，为多粘菌素的减量使用提供技术支撑。

Description

一种可视化检测多粘菌素耐药大肠杆菌的方法及试剂

技术领域

本发明属于微生物耐药菌检测领域，具体涉及一种量子点标记的小肽可视化检测多粘菌素耐药大肠杆菌的方法及试剂。

背景技术

自20世纪20年代开始，大量天然抗生素相继被发现，开启了抗生素时代，但随着对抗生素使用的过度依赖，产生了耐药细菌，耐药细菌的反馈性反应使得抗生素药效减弱、甚至失效，由此引发的细菌抗药甚至多重耐药细菌(超级耐药菌)的问题日益凸显，例如在院感或周围环境中，由于缺乏高质量的临床数据来指导目标患者人群的使用抗生素，敏感性测试方法的批准经常延迟，一些抗生素有复杂的抗菌谱，高昂的成本也使得廉价的耐药菌的检测方法及试剂盒的研制成为急待解决的问题。随着多重耐药细菌的出现，人类正在逐渐陷入“无药可用”的境地之中。为尽早发现耐药菌，人们已研究出了多种检测方法，如Etest法、基因(PCR)检测法、PCR介导的单链构象多态性分析法(PCR-SSCP)等，但这些方法均存在仪器要求高、检测试剂成本高、条件严格、费时费力等缺点。多粘菌素(Polymyxins)是多粘杆菌培养液中提得的一组多肽类抗生素，有5种成分(A,B,C,D,E)，临床常用的是多粘菌素(PolymyxinB)和多粘菌素E(colislin,抗敌素)。多粘菌素被认为是人类抗击细菌的最后防线；近几年来，耐药质粒介导的多粘菌素耐药基因mcr的快速进化及其在全球范围内的广泛传播，给公共卫生和人类健康造成了严重威胁。

免疫荧光试验是用特异性抗体与标本中相应抗原反应后，再用荧光素标记的二抗(抗抗体)与之结合，然后在荧光显微镜下观察实验结果。该方法具有诸多优点，因而被广泛应用于细胞生物学研究中。

羧基水溶性量子点(Q625)使用聚合物对油溶性量子点的表面修饰而得到，可以均匀的分散于水溶液中(如硼酸盐缓冲、PBS缓冲溶液等)，表面羧基具有反应活性。通过偶联生物分子(蛋白、抗体、核酸等)可以作为一种新型的荧光探针应用于生物医学检测领域。由于量子点一元激发，多元发射的光学特性，在使用常用的荧光显微镜进行量子点的免疫荧光检测时配备长通滤光片(LP)就能够达到常规的三色荧光(蓝，黄，绿)显微镜的效果。与传统荧光染料相比,QDs具有许多独特的性质如激发光谱宽而连续、荧光强度高,发光时间长,光化学稳定性好等特点，用全光谱量子点(最大发射波长625nm)标记的肽段(本例中为13肽)为荧光抗体，就能够对大肠杆菌(革兰阴性菌)的细胞壁的脂多糖LPS进行全光谱的标记与检测，使之成为近乎完美的可视化新型荧光标志物。

现有的用于检测多粘菌素耐药性的检测技术均以聚合酶链反应技术和专用的PCR仪为基础的一种检测方法，需要设计MCR基因的特异性引物，所需要仪器要求高，检测试剂成本高，条件要求严，且样本中的活菌与死菌无法区分，增加了检测结果的假阳性几率，另外用PCR方法直接检测环境(例子如土壤，海水)样本中的抗性基因的报道还较少,因为其样品预处理较为复杂(需要专门的核酸提取试剂盒，价格昂贵)，另一方面是因为该方法的检出限相对较低。免疫荧光芯片在检测通量和敏感性方面具备优势，本发明利用免疫荧光的原理，以防脱玻片为载体，以自行设计的12肽(大肠杆菌(革兰氏阴性菌)LPS的受体TRL4,CD14,LBP的氨基酸序列为参考)为抗原(也包括具体条件下直接将待检样固定于玻片上作为抗原)，以全光谱的量子点标记的小肽为荧光抗体的直接检测或夹芯式检测法，克服现有技术存在的缺陷，特提出本发明。

发明内容

本发明旨在克服现有技术的不足，一种量子点标记的小肽可视化检测多粘菌素耐药的大肠杆菌的方法。

本发明上述目的通过如下技术方案实现：

一种可视化检测多粘菌素耐药的试剂，包括：

由Asn-Tyr-Ser-Ser-Phe-Ile-Ser-Ser-Xaa-Arg-Ala-Cys所示的氨基酸序列组成的12肽(SEQ ID NO.1，NYSSFISSXRAC)为抗原；

由Lys-Asn-Tyr-Ser-Ser-Ser-Ile-Phe-Phe-Ile-His-Ala Cys((SEQ ID NO.2，KNYSSSIFFIHAC)所示的氨基酸序列组成的13肽为抗体。

一种量子点标记的小肽可视化检测多粘菌素耐药大肠杆菌的方法，采用可视化检测多粘菌素耐药的试剂，包括如下步骤：

步骤S1、制备含有12肽的玻璃；

步骤S2、将样品涂或在滴在含有12肽的玻璃上，孵育后洗涤，甩干；

步骤S3、滴加量子点标记的13肽，孵育后洗涤；

步骤S4、甩干后，滴加甘油盖玻片封片，荧光镜下观察。

步骤S1中，含有12肽的玻璃的制备包括：12肽先固定于含防脱液的玻璃上，10℃～40℃干燥6～12小时。

步骤S2中，孵育的温度为36～38℃。

步骤S2中，洗涤采用PBS缓冲液。

步骤S3中，量子点采用羧基水溶性量子点(Q625)。

1、小肽的设计：

筛选分析大肠杆菌细胞壁中脂多糖LPS的受体复合物(先分别依次分析TRL4，CD14，LBP的氨基酸序列，然后再取三者作用力的交集)序列及空间结构获得其模体序列：XSS/FS/FISSXRAC，对其进行分析后设计出能识别LPS的肽段，送去商业化学公司根据合成的难易程度及稳定性评估与初试后，并将肽段优化为的12-13个氨基酸的小肽，其中12肽为NYSSFISSXRAC，13肽为KNYSSSIFFIHAC，使其适用于制作成检测大肠杆菌菌体的抗原或抗体(包括预留N端标记与C端标记)。

2、量子点小肽的标记：

一种量子点标记的13肽可视化检测多粘菌素耐药的大肠杆菌的方法首先用商用羧基水溶性量子点-625(羧基水溶性量子点QDs)对13肽进行标记，该QDs激发波长(Excitation Wavelength)：紫外或蓝光，荧光最大发射波长(Emisson Maximum)：625±5nm，具有一元激发，多元发射的光学特性。标记方法如下：

标记反应体系中包括三种成份，一是待标记的13肽，量子点QDs-625，量子点活化剂EDC(硼酸盐缓冲液)，化学合成13肽，购买量子点QDs-625，EDC为母液为50mM硼酸盐缓冲液，pH9.0，而反应液为pH7.4的10mg/ml的硼酸盐缓冲液，羧基量子点QDs为8.01μM，13肽为干粉状，用超纯水配制成10mg/ml，制摩尔比为：QDs：EDC活化剂：小肽＝1：2000：200的标记反应溶液，其中，(1)QDs取8μl加入pH 7.4硼酸盐缓冲液36μl，共44μl；(2)加入1mg/ml小肽18μl；(3)加入10mg/ml EDC 2μl；(4)混合均匀，25℃反应2小时；(5)8000r/min 25℃离心3min，除去沉淀；(6)将上清液转移至超滤管内管，加入2ml Buffer，4400r/min离心5min。每次离心后加入2ml Buffer，再次离心，一共离心5次；(7)紫外下观察，如果有荧光再进行电泳，如果没有则重新选择条件。(8)电泳检查200V，根据电泳前沿(溴酚兰的泳动速度)的距离来决定终止的时间，制备10ml/ml的琼脂糖凝胶外观体积为10X10X2，插上梳子，将标记的结果进行电泳检测，如果已标让成功，则跑得慢的条带为标记成功的小肽。

3.检测步骤：

在组织防脱载玻片上用记号笔画出3行*6个直径5-6mm圆圈，左侧的粗糙面的空白处为标记样品信息的地方，将12肽按2ng/ul的浓度涂铺在玻璃片孔内的相应位置，装入搪瓷盘60度干燥5-8小时，干燥后储存备用。第二组前面步骤一样，在干燥步骤用滴加无水乙醇进行干燥，干燥后储存备用。第三组直接将待检样品涂抹于玻片上，然后进行与上面两组相同的方法干燥后备用。

步骤1.取出玻片，PBS浸润潮湿后，滴加指数菌或涂抹单菌落或野外样1-3微升，37度湿盒内孵1小时使其与小肽结合，PBS洗二遍，甩干；

步骤2.滴加荧光标记的13肽(量子点标记的荧光肽)，37度湿盒孵1-2小时或4℃孵育过夜，PBS洗二遍甩干，滴加甘油封片，荧光观察。

与现有技术相比，本发明具有如下优点：

(1)本发明新型荧光检测试剂可特异性检测多粘菌素耐药性的大肠杆菌，稳定性好、灵敏度高、使用方便、常温保存和运输，试剂通过荧光仪可定量检测样品的耐药性含量。

(2)本发明方法在多粘菌素耐药的大田试验中，能帮助排除PCR法对样本制备成本高时间的缺点，且不需要考虑样品怕污染的要求，专门针对污染样本进行检测，有利于环境保护及公共卫生中的抗生素耐药性的确定及治理。

附图说明

图1为量子点标记13肽过程中两小时孵育过程中样品的状态(红色为孵育中的QDS-625量子点)；

图2为标记反应后期超滤时浓缩时的状态(黑色点为浓缩后的产物)；

图3为浓缩结束时琼脂糖凝胶检测时凝胶上点样的状态(孔内发黄色为量子点标记小肽的泳道，蓝色为电泳前沿)；

图4为标记样品的电泳检测结果(左侧量子点原液，右侧标记13肽)。

图5中图A展示了FITC标记法激发出含阳性菌的绿色荧光，图B阴性对照为没有荧光不含MCR-1基因的工程菌。

图6中图C量子点法阳性菌的绿色荧光，图D量子点法阴性菌的绿色荧光。图E量子点法阳性菌的红色荧光，图F量子点法阴性菌的红色荧光。图G量子点法阳性菌的蓝色荧光，图H量子点法阴性菌的蓝色荧光。

图7为FITC与量子点两种标记法的绿色荧光对比(抗体1:5000)，其中I图为FITC法的绿色荧光图，J图为量子点法的绿色荧光图，I与J相比，其中的荧光点数相对较少，但并没有影响对其阴阳性的判定。

图8为FITC与量子点两种标记法的绿色荧光对比(抗体1:10000)，L与K相比，荧光抗体稀释倍数加大后，已经影响到了对其阴阳性结果的判定。其中FITC判定为阴性，而量子点法判为阳性。

图9为用量子点法进行野外样品检测(浙江五个县)，在阴阳性对照结果成立的情况下(M中荧光点数面积小于20％、N中荧光点数面积大于90％)，O县土样呈阴性，P县粪样呈阳性，R县泥水样呈阳性，Q县土样呈阴性，S县土样呈阳性。

具体实施方式

下面结合附图和实施例具体介绍本发明实质性内容，但并不以此限定本发明的保护范围。

具体实施例1

1.将异硫氰酸荧光素(Fluorescein isothiocyanate，FITC)标记的13肽与量子点标记的13肽同时检测多粘菌素耐药性阴性与阳性的菌，并进行比较在组织防脱载玻片上用记号笔画出3行*6个直径5-6mm圆圈，左侧的粗糙面的空白处为标记样品信息的地方，将12肽按2ng/ul的浓度涂铺在玻璃片孔内的相应位置，干燥5-8小时储存备用。

(1)FITC法

取出玻片，PBS浸润潮湿后，滴加指数菌或涂抹单菌落37度湿盒内孵1小时使其与小肽结合，PBS洗二遍，甩干；滴加FITC荧光标记的13肽(1:5000稀释)，37度湿盒孵1-2小时或4℃孵育过夜，PBS洗二遍甩干，滴加甘油封片，荧光观察。荧光如图5所示：阳性菌(蓝色)、阴性菌(无色)。

(2)量子点法

取出玻片，PBS浸润潮湿后，滴加指数菌或涂抹单菌落37度湿盒内孵1小时使其与小肽结合，PBS洗二遍，甩干；滴加量子点标记的13肽，37度湿盒孵1-2小时或4℃孵育过夜，PBS洗二遍甩干，滴加甘油封片，荧光观察。如荧光图6：阳性菌(红色)、阴性菌(无色)、阳性(绿色)、阴性菌(无色)、阳性菌(紫色)，阴性菌(无色)。

二种荧光标记进行比较

(1)量子点具有光谱范围宽，对仪器要求少

二种荧光标记相比较，FITC的荧光谱相对窄，只有绿荧光效果好，清晰可辨别，而量子点从紫光(395nm)，蓝光(470-490)，绿光(509-540)到红光(605-625)，近红外(700-3000nm)均能观察，且特异性强。这意味着用该检测进行野外检测时，可以采用通用仪器，而降低了对仪器专一性的要求。

200-500倍镜下观察结果如图5所示，FITC组(即图B)阳性样品可以观察到明显发绿色荧光的杆状细菌，阴性样品呈黑色或暗色。说明大肠杆菌的细胞壁已与小肽结合。同个样品的一个视野内大于80-90％的区域有荧光判为阳性，如果仅有少数稀疏或零星的荧光且无呈现菌体形状(包括不同焦距下观察到的杆状细菌形态)，则判为阴性。量子点组，阳性样品可以观察到明显发绿色荧光的杆状细菌，阴性样品呈黑色或暗色。说明大肠杆菌的细胞壁已与小肽结合。同个样品的一个视野内大于60-90％的区域有荧光判为阳性，如果仅有少数稀疏或零星的荧光且不出现在菌体上(包括不同焦距下观察到的杆状细菌形态)，则判为阴性，如果有空白对照出现的荧光，则说明检测过程中出现了典型的假阳性结果。

(2)敏感性强，特异性优

二种方法对指数菌和单菌落检出效率相同，用麦氏比浊法测量时，样品OD为0.4-0.5时，样品需要稀释250倍，FITC的荧光抗体的工作浓度为1：5000(两种方法均显示出良好的检测结果)，而量子点荧光抗体工作浓度达到1：10000(此时FITC法已无法分辨，而量子点仍保持良好的分辨率)，且在假阳性与假阴性出现的频率上相当，因此，量子点荧光抗体法优于FITC法。图7为1：5000稀释的两种荧光抗体的图片；图8为1：10000稀释的两种荧光抗体的图片。

阳性样品可以观察到明显发绿色荧光的杆状细菌，阴性样品呈黑色或暗色。说明大肠杆菌的细胞壁已与小肽结合。同个样品的一个视野内大于80-90％的区域有荧光判为阳性，如果仅有少数稀疏或零星的荧光且无呈现菌体形状(包括不同焦距下观察到的杆状细菌形态)

综上可见，本发明提供的量子点检测技术，在大肠杆菌多粘菌素耐药性的验证实验中，利用自行设计的小肽直接检测细菌体，即通过直观的可视化方法证实多粘菌素耐药性大肠杆菌的存在，且能最大程度地排除PCR法对专用PCR仪器的要求，及过于灵敏的假阳性，且能将假阴性控制在一定范围内，有利于相关检测实验的开展。

上述实施例的作用在于具体介绍本发明的实质性内容，但本领域技术人员应当知道，不应将本发明的保护范围局限于该具体实施例。

具体实施例子2—野外样品的检测

直接检测环境样本中的抗性基因的报道还较少,一方面因为PCR法或基于PCR法的其他检测法，样品预处理及制备相对较为复杂，需要专门的试剂盒，且价格不非(如果用沸水裂解法，则存在非特异性干扰)，另一方面是因为该方法的检出限较低(需要至少500/ml拷贝的核酸)，常用的有微阵列杂交芯片，PCR，荧光法还是空白。

1.野外样品的制备

取5个县内土壤、粪样、水样、泥水样4种样品各50mg-1g，500ul～1ml生理盐水溶解样品(水样为单纯静置得到的样品)，1500RPM(或掌中宝离心机)离心5-10分钟，生理盐水恢复体积至1ML，最后取上清100-200ul作为待检样。

2.检测

取出固定12肽的玻片,将100ul样品滴于玻片上，37度孵1小时，PBS洗片3次，加量子点标记的小肽100ul(1：10000稀释)，37度孵育1小时，PBS洗片3次，甘油封片，荧光镜检。

3.结果判断

阴性阳性参照均成立的情况下，阳性菌体呈现出荧光，阴性菌少荧光或无荧光，一个视野下出现80％的区域有荧光出现判为强阳性，一个视野下10％的区域出现荧光则判为阴性。

用量子点法进行野外样品检测(浙江五个县)如图9所示。

Claims (6)

1.一种可视化检测多粘菌素耐药的试剂，其特征在于，包括：

由Asn-Tyr-Ser-Ser-Phe-Ile-Ser-Ser-Xaa-Arg-Ala-Cys所示的氨基酸序列组成的12肽为抗原；

由Lys-Asn-Tyr-Ser-Ser-Ser-Ile-Phe-Phe-Ile-His-Ala Cys所示的氨基酸序列组成的13肽为抗体。

2.一种量子点标记的小肽可视化检测多粘菌素耐药大肠杆菌的方法，其特征在于，采用权利要求1所述的可视化检测多粘菌素耐药的试剂，包括如下步骤：

步骤S1、制备含有12肽的玻璃；

步骤S2、将样品涂或在滴在含有12肽的玻璃上，孵育后洗涤，甩干；

步骤S3、滴加量子点标记的13肽，孵育后洗涤；

步骤S4、甩干后，滴加甘油盖玻片封片，荧光镜下观察。

3.根据权利要求1所述的量子点标记的小肽可视化检测多粘菌素耐药大肠杆菌的方法，其特征在于，步骤S1中，含有12肽的玻璃的制备包括：12肽先固定于含防脱液的玻璃上，10℃～40℃干燥6～12小时。

4.根据权利要求1所述的量子点标记的小肽可视化检测多粘菌素耐药大肠杆菌的方法，其特征在于，步骤S2中，孵育的温度为36～38℃。

5.根据权利要求1所述的量子点标记的小肽可视化检测多粘菌素耐药大肠杆菌的方法，其特征在于，步骤S2中，洗涤采用PBS缓冲液。

6.根据权利要求1所述的量子点标记的小肽可视化检测多粘菌素耐药大肠杆菌的方法，其特征在于，步骤S3中，量子点采用羧基水溶性量子点。

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