CN115894735A - 一种老鹰茶酸性多糖及其提取纯化方法和抗癌应用 - Google Patents

Abstract

本申请公开了医药技术领域中一种老鹰茶酸性多糖HTPA3，主要由甘露糖：鼠李糖：葡萄糖：半乳糖：木糖：阿拉伯糖组成，其百分比为1％‑5％：2％‑6％：5％‑10％：15％‑20％：3％‑8％：55％‑65％。经研究表明，老鹰茶总多糖和老鹰茶酸性多糖HTPA3具备抗肺癌和抗结肠癌活性，且老鹰茶酸性多糖HTPA3的效果更显著。

Description

一种老鹰茶酸性多糖及其提取纯化方法和抗癌应用

技术领域

本发明涉及医药化学技术领域，尤其涉及一种老鹰茶酸性多糖及其提取纯化方法和抗癌应用。

背景技术

肺癌的发展严重威胁着全世界人类的健康。2020年最新一份肿瘤数据报告显示，每年因肺癌而去世的肿瘤病人约有176万人，其中肿瘤患者病死率在我国乃至全世界呈明显上升的趋势，有研究表明，肺癌死亡率均位于所有癌症首位，其5年生存率极低，大约在15％左右。且肺癌具有较高的复发率和转移率，肺癌已经成为全球“头号癌症杀手”。

全球每年新发癌症和癌症相关死亡病例中，约有10％是结肠癌，其死亡率高居所有病例的第三位。国家癌症中心最新发布的《中国肿瘤登记年报》显示，我国每年结肠癌的新发病例数为37.63万人，死亡人数19.10万人，发病率和死亡率分别高达9.88％和8％。在数据统计的十余年间，随着民众饮食结构的变化与癌症筛查技术的进步，我国结肠癌发病率、死亡率均呈逐年稳步提升趋势。在各阶段癌症的治疗中，化学药物治疗占有重要地位，已成为抗癌的主体治疗方式。但是，化疗药物都具有较强的毒副作用，影响了患者的生活质量，故有必要研发疗效好、毒副作用低的抗癌新药或能够对传统化疗药物起到减毒增效作用的药物。因此传统中草药中分离筛选无毒或低毒的天然抗肿瘤有效成分具有重要意义。

老鹰茶是由樟科，木姜子属，植物学名毛豹皮樟的叶或枝叶加工制作而成。在四川、重庆、云南、贵州、安徽等地十分普遍且饮用历史悠久，且无毒副作用，为药食同源植物。目前，对老鹰茶有效成分的研究利用主要集中在黄酮类。主要药理活性有抗氧化、抗炎、保肝、降血糖和抗菌等。多糖广泛存在于动物、植物和微生物中。作为生命物质的组成成分之一，它广泛参与了细胞的各种生命现象及生理过程的调节，如免疫细胞间信息的传递与感受，细胞的转化、分裂及再生等活动。到目前为止报道的多糖有100多种，具有抗病毒、抗感染、抗肿瘤、抗氧化、抗辐射、降血糖、保肝、调节免疫等生理活性，且副作用小。目前，对于老鹰茶多糖报道主要集中在抗氧化功能研究，鲜有关于老鹰茶多糖抗癌活性的报道。因此，分类开发能充分发挥老鹰茶多糖功效使之用于抗癌的产品是非常必要的。

发明内容

本发明针对现有技术的不足，提供一种对结肠癌和肺癌均具有较好活性的老鹰茶酸性多糖HTPA3。

本发明的目的之一是提供一种老鹰茶酸性多糖HTPA3，主要由甘露糖：鼠李糖：葡萄糖：半乳糖：木糖：阿拉伯糖组成，其百分比为1％-5％：2％-6％：5％-10％：15％-20％：3％-8％：55％-65％。

本发明的目的之二是提供一种老鹰茶酸性多糖HTPA3的提取纯化方法，包括以下步骤：

步骤S1、粗多糖制备：称取老鹰茶，加入水，加热提取，过滤，将滤液减压浓缩后离心，取上清液，将上清液透析后加无水乙醇，醇沉过夜，离心，加蒸馏水溶解沉淀，减压浓缩挥发乙醇，将浓缩液进行冷冻干燥，即得老鹰茶总多糖；

步骤S2、分级处理：称取老鹰茶总多糖，加适量蒸馏水溶解，配成质量浓度为30mg/ml的粗多糖溶液，在10000r/min离心10min，取上清液采用DEAE sepharose fast flow阴离子交换层析柱，依次用蒸馏水、0.1mol/L、0.22mol/L、0.32mol/L NaCl溶液洗脱，收集0.32mol/LNaCl溶液洗脱液，透析，冻干，即得老鹰茶酸性多糖HTPA3。

进一步的，步骤S1中加热提取的具体操作为：称取老鹰茶，第一次加入15倍量水，沸水煎煮3.5h，收集滤液，第二次加入10倍量水，沸水煎煮3.5h，第三次加入10倍量水，沸水煎煮3.5h，第四次加入10倍量水，沸水煎煮3.5h。

进一步的，步骤S1中加热提取过滤后所得滤液减压浓缩后的浓缩液，用3000D透析袋透析48h。

进一步的，步骤S2中不同浓度NaCl溶液均洗脱3倍柱体积。

进一步的，步骤S2中老鹰茶多糖各个级分冻干时间为94h。

本发明的目的之三是提供老鹰茶酸性多糖HTPA3在制备抗肺癌和结肠癌的药物中的应用。

以老鹰茶干燥叶片为原料，采用水提醇沉法，得到老鹰茶总多糖，采用DEAEsepharose fast flow阴离子交换层析纯化老鹰茶总多糖，经透析纯化，冷冻干燥后得到中性老鹰茶多糖HTPN及老鹰茶酸性多糖HTPA1、老鹰茶酸性多糖HTPA2、老鹰茶酸性多糖HTPA3共4个级分。

测定老鹰茶酸性多糖HTPA3对人肺癌A549细胞和人结肠癌细胞HCT-116体外增殖的影响，证明老鹰茶酸性多糖HTPA3能显著抑制人肺癌A549细胞和人结肠癌HCT-116增殖且该多糖的毒副作用较小，因此老鹰茶酸性多糖HTPA3可作为开发抗肺癌与结肠癌新药的重要药物中间体及功能性保健食品的天然原料。

附图说明

图1为老鹰茶总多糖梯度洗脱曲线示意图；

图2为老鹰茶总多糖固定浓度洗脱曲线示意图；

图3为老鹰茶酸性多糖HTPA3单糖组成示意图；

图4为老鹰茶总多糖对人肺癌A549细胞体外增殖的影响示意图；

图5为老鹰茶各级分多糖对人肺癌A549细胞体外增殖的影响示意图；

图6为老鹰茶总多糖对人结肠癌HCT-116细胞体外增殖的影响示意图；

图7为老鹰茶各级分多糖对人结肠癌HCT-116细胞体外增殖的影响示意图。

具体实施方式

下面通过具体实施方式进一步详细说明：

实施例1、一种老鹰茶酸性多糖HTPA3的提取方法

1.1老鹰茶总多糖的提取：

老鹰茶分级多糖的制备

老鹰茶总多糖的提取：称取提取过老鹰茶1kg，第一次加入15倍量水，沸水煎煮3.5h，收集滤液，第二次加入10倍量水，沸水煎煮3.5h，第三次加入10倍量水，沸水煎煮3.5h，第四次加入10倍量水，沸水煎煮3.5h。合并四次滤液，80℃减压浓缩至1.5L，3000D透析袋透析48h，透析后4000rpm离心15min，取上清。缓慢加入四倍无水乙醇，边加边搅拌，室温放置过夜，4000rpm离心15min得沉淀。用蒸馏水复溶沉淀，50℃减压浓缩挥发乙醇，分装，冷冻干燥，即得老鹰茶总多糖10g。

1.2DEAE sepharose fast flow阴离子交换层析纯化粗多糖：

称取老鹰茶总多糖3g，加100ml蒸馏水溶解，配成质量浓度为30mg/mL的总多糖溶液，10000rpm离心10min，取上清液利用DEAE sepharose fast flow柱色谱(柱体积2.5L)进行分级，依次用蒸馏水、0.1mol/L、0.22mol/L、0.32mol/L NaCl溶液洗脱3倍柱体积，分别收集不同浓度NaCl溶液洗脱液，透析，冻干，得老鹰茶分级多糖。其中，0.32mol/L NaCl溶液洗脱的级分为HTPA3，冻干后得到159mg。

实施例2、老鹰茶酸性多糖HTPA3的单糖组成分析

HPLC条件：流动相组成为乙腈：磷酸缓冲盐＝18.2:81.8。检测器型号：VarianProstar325，检测波长：245nm。色谱柱型号：Thermo ScientificODS-2(c18)Hypersil Dim.(mm)150×4.6；柱温：35℃。进样量：20μL，流速：1mL/min。

样品前处理：

(1)酸水解：称取4mg老鹰茶酸性多糖HTPA3样品置于棕色小瓶中，使其溶于2mL4M的三氟乙酸(TFA)，加盖密封。在110℃的条件下加热水解4h，取出冷却至室温，使用甲醇减压浓缩，重复操作直至除尽TFA。蒸干后，残渣溶解200μL蒸馏水中。

(2)PMP衍生化：取100μL(1)中的完全酸水解溶液，加入浓度为0.6M的NaOH溶液100μL混匀，再加入200μL现配置的浓度为0.5M的PMP甲醇溶液，密封后涡漩混匀。水浴温度为70℃条件下反应100min后，冷却至室温，用浓度为0.3M的HCl 200μL进行中和，加蒸馏水补足至1mL。再加入1mL三氯甲烷萃取，取出上层水相，多次重复萃取，尽量除尽PMP。涡旋后取15μL上清液进样分析。

(3)取100μL 1mg/mL单糖标准品(Man，Rha，Gal，GalA，Glc，GlcA，Xyl，Ara，Fuc)混合液，按样品PMP衍生同法处理，然后进样分析。

结果显示如图3所示，老鹰茶酸性多糖HTPA3主要由甘露糖：鼠李糖：葡萄糖：半乳糖：木糖：阿拉伯糖组成，其百分比为1％-5％：2％-6％：5％-10％：15％-20％：3％-8％：55％-65％。

实施例3、老鹰茶多糖各级分抗肺癌、结肠癌活性实验

人肺癌A549细胞和人结肠癌HCT-116细胞培养于DMEM完全培养基，于37℃、5％CO2饱和湿度的孵箱中贴壁培养，隔天换液，显微镜下观察待融合度达到90％后，用0.25％胰蛋白酶消化传代。

人肺癌A549细胞和人结肠癌HCT-116细胞传代3代后，将处于对数生长期的细胞用胰蛋白酶消化，计数，以每孔5×10³个细胞的密度接种于96孔板内，培养16h，待细胞完全贴壁后，分别加入老鹰茶总多糖和不同浓度的老鹰茶分级多糖，对照组加入DMEM培养基，每组平行设5复孔，培养48h，每孔加入5g/L MTT溶液20μl，在37℃培养箱中孵育4h，加入DMSO150μl，振荡仪上室振摇20min，使结晶物充分溶解，在自动酶标仪波长490nm处测定各孔吸光度值。计算加入不同药物及不同浓度药物后A549细胞株及HCT-116细胞株的存活率率。存活率(％)＝(对照组吸光度值－实验组吸光度值)/对照组吸光度值×100％。

所有实验均采用5个重复作为统计结果。采用GraphPad Prism 8.0.1软件进行单因素方差分析评估组间差异。差异为*P<0.05、**P<0.01、***P<0.0001有统计学意义。

根据MTT的结果可知，老鹰茶总多糖对肺癌A549细胞、结肠癌HCT-116细胞具有显著的抑制作用，且呈浓度递增。如图4、图6所示。

老鹰茶酸性多糖HTPA3对于肺癌A549细胞、结肠癌HCT-116细胞有显著的抑制作用呈浓度递增。且活性较总糖高抑制效果更显著。如图5、图7所示。

本发明中的老鹰茶酸性多糖HTPA3为天然植物提取物对人体毒副作用小，对肺癌A549细胞和结肠癌HCT-116细胞的增殖具有显著抑制作用。本发明中的老鹰茶酸性HTPA3可作为开发新药的重要药物中间体，功能性保健食品的天然原料。

以上所述的仅是本发明的实施例，方案中公知的具体结构及特性等常识在此未作过多描述。应当指出，对于本领域的技术人员来说，在不脱离本发明结构的前提下，还可以作出若干变形和改进，这些也应该视为本发明的保护范围，这些都不会影响本发明实施的效果和专利的实用性。本申请要求的保护范围应当以其权利要求的内容为准，说明书中的具体实施方式等记载可以用于解释权利要求的内容。

Claims (8)

1.一种老鹰茶酸性多糖HTPA3，其特征在于，主要由甘露糖：鼠李糖：葡萄糖：半乳糖：木糖：阿拉伯糖组成，其百分比为1％-5％：2％-6％：5％-10％：15％-20％：3％-8％：55％-65％。

2.根据权利要求1所述的一种老鹰茶酸性多糖HTPA3的提取纯化方法，其特征在于，包括以下步骤：

步骤S1、粗多糖制备：称取老鹰茶，加入水，加热提取，过滤，将滤液减压浓缩后离心，取上清液，将上清液透析后加无水乙醇，醇沉过夜，离心，加蒸馏水溶解沉淀，减压浓缩挥发乙醇，将浓缩液进行冷冻干燥，即得老鹰茶总多糖；

步骤S2、分级处理：称取老鹰茶总多糖，加适量蒸馏水溶解，配成质量浓度为30mg/ml的粗多糖溶液，在10000r/min离心10min，取上清液采用DEAE纤维素阴离子交换层析柱，依次用蒸馏水、0.1mol/L、0.22mol/L、0.32mol/L NaCl溶液洗脱，收集0.32mol/L NaCl溶液洗脱液，透析，冻干，即得老鹰茶酸性多糖HTPA3。

3.根据权利要求2所述的一种老鹰茶酸性多糖HTPA3的提取纯化方法，其特征在于，步骤S1中加热提取的具体操作为：称取老鹰茶，第一次加入15倍量水，沸水煎煮3.5h，收集滤液，第二次加入10倍量水，沸水煎煮3.5h，第三次加入10倍量水，沸水煎煮3.5h，第四次加入10倍量水，沸水煎煮3.5h。

4.根据权利要求3所述的一种老鹰茶酸性多糖HTPA3的提取纯化方法，其特征在于，步骤S1中加热提取过滤后所得滤液减压浓缩后的浓缩液，用3000D透析袋透析48h。

5.根据权利要求4所述的一种老鹰茶酸性多糖HTPA3的提取纯化方法，其特征在于，步骤S2中不同浓度的NaCl溶液均洗脱3倍柱体积。

6.根据权利要求5所述的一种老鹰茶酸性多糖HTPA3的提取纯化方法，其特征在于，步骤S2中老鹰茶多糖各个级分冻干时间为94h。

7.根据权利要求1所述的老鹰茶酸性多糖HTPA3在制备抗肺癌药物中的应用。

8.根据权利要求1所述的老鹰茶酸性多糖HTPA3在制备抗结肠癌药物中的应用。

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