CN115887763B

CN115887763B - 一种基于肽类树状大分子增强的透明质酸基生物墨水及其制备方法

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Publication number: CN115887763B
Application number: CN202211591365.7A
Authority: CN
Inventors: 顾忠伟; 毛宏理; 周可
Original assignee: Nanjing Tech University
Current assignee: Nanjing Tech University
Priority date: 2022-12-12
Filing date: 2022-12-12
Publication date: 2024-07-16
Anticipated expiration: 2042-12-12
Also published as: CN115887763A

Abstract

本发明属于医用生物材料技术领域，涉及一种基于肽类树状大分子增强的透明质酸基生物墨水及其制备方法，将巯基基团修饰的透明质酸溶于磷酸盐缓冲液中，得到第一预聚液；将肽类树状大分子溶于磷酸盐缓冲液中，得到第二预聚液；将第一预聚液和第二预聚液进行混合，得到第一混合液，向第一混合液中加入交联剂和光引发剂混匀，进行光交联反应，即得生物墨水。本发明的生物墨水引入端基修饰降冰片烯基团的肽类树状大分子与巯基化透明质酸进行硫醇烯光点击交联，在理化性能方面可以实现更优异的流变与压缩性能；同时，本发明的生物墨水可以使细胞实现更好的增殖行为、可以引发细胞内更低的活性氧水平、可以实现较高的可打印性和形状保真度。

Description

一种基于肽类树状大分子增强的透明质酸基生物墨水及其制备方法

技术领域

本发明属于医用生物材料技术领域，涉及一种基于肽类树状大分子增强的透明质酸基生物墨水及其制备方法。

背景技术

基于增材制造原理，生物3D打印技术将生物材料、细胞及生长因子等混合成分作为打印单元，通过逐层堆积构建出具有组织功能的复杂结构。其中，生物墨水作为生物3D打印过程中的关键，既决定了细胞存在的三维环境，也决定了打印技术的具体实施。理想的生物墨水首先应具备优异的细胞相容性，其次应保证成型后的形状保真度、与组织相比配的力学性能以及支持并调节细胞的功能等基本条件。水凝胶材料是目前生物墨水的首选，作为一类极为亲水的生物材料，水凝胶能够在水中迅速溶胀并为细胞提供与细胞外基质(ECM)类似的水溶性环境。此外，水凝胶独特的三维网络结构对包括氧气在内的营养物质具有较高的透过性，并且能够支持细胞在网络内部发生迁移和建立通讯。

其中，甲基丙烯酰化透明质酸(HAMA)是由甲基丙烯酸酐修饰透明质酸糖链得到的多糖类衍生物，可在光引发剂和光源条件下发生自由基聚合交联形成水凝胶。因其具有优异的细胞相容性、较低的免疫原性以及合成方法简单，被认为是用作生物墨水的理想材料。然而，这种由单一天然凝胶网络构建的生物墨水，在力学性能上仍存在局限性，难以满足更大尺寸的肝模型构建与力学支撑。因此，增强生物墨水的力学性能，改善其交联网络的同时而不影响其生物特性是当前生物3D打印领域的一个重要分支。树状大分子是一种纳米尺度的高度支化的单分散性大分子，具有精准的三维分子结构、明确可控的分子量与尺寸、丰富且可修饰的表面基团和内部空腔等特点。而肽类树状大分子则是一类以氨基酸为骨架的树状大分子，除了具有传统树状大分子的优点外，还具有诸如类蛋白结构、生物可降解性和优良的生物相容性等独特的性质。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是针对现有技术的不足，提供一种基于肽类树状大分子增强的透明质酸基生物墨水。

本发明还要解决的技术问题是提供上述基于肽类树状大分子增强的透明质酸基生物墨水的制备方法。

为了解决上述技术问题，本发明采用的技术方案如下：

本发明公开了一种基于肽类树状大分子增强的透明质酸基生物墨水的制备方法，将巯基基团修饰的透明质酸溶于磷酸盐缓冲液中，得到第一预聚液；将肽类树状大分子溶于磷酸盐缓冲液中，得到第二预聚液；将第一预聚液和第二预聚液进行混合，得到第一混合液，向第一混合液中加入交联剂和光引发剂混匀，进行光交联反应，即得生物墨水。

其中，所述的磷酸缓冲盐溶液(PBS)，pH＝7.2～7.4，磷酸缓冲盐溶液中钠离子的浓度为3.61g/L，钾离子的浓度为0.17g/L，氯离子的浓度为4.95g/L，磷酸氢根的浓度是0.98g/L，磷酸二氢根的浓度是0.17g/L。

具体地，所述的第一预聚液中巯基基团修饰的透明质酸的浓度为2～6％g/mL，优选为4％g/mL；所述的第二预聚液中肽类树状大分子的浓度为8～12％g/mL，优选为10％g/mL；所述的第一预聚液与第二预聚液的体积比为0.5～1：0.5～1，优选为1：1。

具体地，所述的交联剂为二硫苏糖醇或巯基化聚乙二醇，优选二硫苏糖醇(DTT)；所述的光引发剂为苯基(2,4,6-三甲基苯甲酰基)磷酸锂或光引发剂2959，优选苯基(2,4,6-三甲基苯甲酰基)磷酸锂(LAP)；所述的光交联反应，可见光的波长为405nm，交联温度为室温，交联时间为20～40s，优选为30s。

具体地，所述的生物墨水中，巯基基团修饰的透明质酸的最终浓度为1～3％g/mL，优选为2％g/mL，肽类树状大分子的最终浓度为4～6％g/mL，优选为5％g/mL，交联剂的最终浓度为1.5～4.5mmol/L，优选为3mmol/L，光引发剂的最终浓度为0.3～0.6％g/mL，优选为0.5％g/mL。

其中，所述的巯基基团修饰的透明质酸可以按照现有技术进行制备，也可以根据以下方法进行制备：

将透明质酸溶于MES缓冲溶液中，并加入1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸(EDC)和N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)在冰浴条件下活化，活化结束后向反应体系中加入半胱胺盐酸盐避光搅拌过夜；随后再向反应体系中二硫苏糖醇(DTT)继续反应，反应结束后，将反应液透析处理，冷冻，干燥，即得巯基基团修饰的透明质酸(HC)，-20℃冰箱中保存备用。

具体地，所述的肽类树状大分子为降冰片烯化三代赖氨酸修饰聚乙二醇，所述的降冰片烯化三代赖氨酸修饰聚乙二醇的制备方法，包括如下步骤：

(1)将L-赖氨酸甲酯盐酸盐、(S)-2,6-二叔丁氧羰基氨基己酸、1-羟基苯并三唑、苯并三氮唑-N,N,N',N'-四甲基脲六氟磷酸盐和N,N-二异丙基乙胺溶于N,N-二甲基甲酰胺，进行第一反应，反应结束后经后处理，得到端基Boc保护的二代赖氨酸；

(2)将步骤(1)得到的端基Boc保护的二代赖氨酸和三氟乙酸溶于二氯甲烷，进行第二反应，反应结束后经后处理，得到脱掉Boc基团的二代赖氨酸；

(3)将步骤(2)中得到的脱掉Boc基团的二代赖氨酸与(S)-2,6-二叔丁氧羰基氨基己酸、1-羟基苯并三唑、苯并三氮唑-N,N,N',N'-四甲基脲六氟磷酸盐和N,N-二异丙基乙胺溶于N,N-二甲基甲酰胺，进行第三反应，反应结束后经后处理，得到端基Boc保护的三代赖氨酸；

(4)将步骤(3)得到的端基Boc保护的三代赖氨酸溶于含有氢氧化钠的甲醇溶液中，进行第四反应，反应结束后经后处理，得到脱甲酯保护的三代赖氨酸；

(5)将步骤(3)得到的脱甲酯保护的三代赖氨酸与氨基封端的四臂聚乙二醇、1-羟基苯并三唑、苯并三氮唑-N,N,N',N'-四甲基脲六氟磷酸盐和N,N-二异丙基乙胺溶于N,N-二甲基甲酰胺，进行第五反应，反应结束后经后处理，得到三代赖氨酸修饰的超支化聚乙二醇；

(6)将步骤(5)得到的三代赖氨酸修饰的超支化聚乙二醇和三氟乙酸溶于二氯甲烷，进行第六反应，反应结束后经后处理，得到脱掉Boc基团的三代赖氨酸修饰的超支化聚乙二醇；

(7)步骤(6)得到的脱掉Boc基团的三代赖氨酸修饰的超支化聚乙二醇与5-降冰片烯-2-羧酸、1-羟基苯并三唑、苯并三氮唑-N,N,N',N'-四甲基脲六氟磷酸盐和N,N-二异丙基乙胺溶于N,N-二甲基甲酰胺，进行第七反应，反应结束后经后处理，得到降冰片烯化三代赖氨酸修饰聚乙二醇；

步骤(1)、步骤(2)、步骤(3)、步骤(5)、步骤(6)和步骤(7)在惰性气体保护下进行。

具体地，所述的降冰片烯化三代赖氨酸修饰聚乙二醇的制备方法，步骤(1)中，所述的L-赖氨酸甲酯盐酸盐、(S)-2,6-二叔丁氧羰基氨基己酸、1-羟基苯并三唑、苯并三氮唑-N,N,N',N'-四甲基脲六氟磷酸盐与N,N-二异丙基乙胺的摩尔比为0.8～1.2：3.5～4.5：5.5～7：5.5～7：7～9，优选为1：4：6：6：8；所述的第一反应，先在冰浴条件下反应15～30min，优选为20min，撤去冰浴后再在室温下反应20～30h，优选为24h。

其中，步骤(1)中，N,N-二甲基甲酰胺的用量为：将反应体系中的反应物溶解完全即可，且粘度适中。

具体地，所述的降冰片烯化三代赖氨酸修饰聚乙二醇的制备方法，步骤(2)中，所述的端基Boc保护的二代赖氨酸与三氟乙酸的摩尔比为1：18～22，优选为1：20；所述的三氟乙酸与二氯甲烷的体积比为1：1；所述的第二反应，反应温度为室温，反应时间为4～8h，优选为6h。

具体地，所述的降冰片烯化三代赖氨酸修饰聚乙二醇的制备方法，步骤(3)中，所述的脱掉Boc基团的二代赖氨酸、(S)-2,6-二叔丁氧羰基氨基己酸、1-羟基苯并三唑、苯并三氮唑-N,N,N',N'-四甲基脲六氟磷酸盐与N,N-二异丙基乙胺的摩尔比为0.8～1.2：10～14：18～22：18～22：38～42，优选为1：12：20：20：40；所述的第三反应，先在冰浴条件下反应15～30min，优选为20min，撤去冰浴后再在室温下反应40～50h，优选为48h。

其中，步骤(3)中，N,N-二甲基甲酰胺的用量为：将反应体系中的反应物溶解完全即可，且粘度适中。

具体地，所述的降冰片烯化三代赖氨酸修饰聚乙二醇的制备方法，步骤(4)中，所述的含有氢氧化钠的甲醇溶液中，氢氧化钠的浓度为0.5mol/L；所述的第四反应，反应温度为室温，反应时间为4～8h，优选为6h。

其中，步骤(4)中，含有氢氧化钠的甲醇溶液的用量为：将反应体系中的端基Boc保护的三代赖氨酸溶解完全即可，且粘度适中。

具体地，所述的降冰片烯化三代赖氨酸修饰聚乙二醇的制备方法，步骤(5)中，所述的氨基封端的四臂聚乙二醇中端氨基、脱甲酯保护的三代赖氨酸、1-羟基苯并三唑、苯并三氮唑-N,N,N',N'-四甲基脲六氟磷酸盐与N,N-二异丙基乙胺的摩尔比为0.8～1.2：8～12：38～42：38～42：38～42，优选为1：10：40：40：40；所述的第五反应，反应温度为室温，反应时间为45～50h，优选为48h。

其中，步骤(5)中，N,N-二甲基甲酰胺的用量为：将反应体系中的反应物溶解完全即可，且粘度适中。

具体地，所述的降冰片烯化三代赖氨酸修饰聚乙二醇的制备方法，步骤(6)中，所述的三氟乙酸与二氯甲烷的体积比为1：1；所述的第六反应，反应温度为室温，反应时间为4～8h，优选为6h。

其中，步骤(6)中，二氯甲烷的用量为：将反应体系中的反应物溶解完全即可，且粘度适中。

具体地，所述的降冰片烯化三代赖氨酸修饰聚乙二醇的制备方法，步骤(7)中，所述的脱掉Boc基团的三代赖氨酸修饰的超支化聚乙二醇中端氨基、5-降冰片烯-2-羧酸、1-羟基苯并三唑、苯并三氮唑-N,N,N',N'-四甲基脲六氟磷酸盐与N,N-二异丙基乙胺的摩尔比为0.8～1.2：18～22：8～12：8～12：8～12，优选为1：20：10：10：10；所述的第七反应，反应温度为室温，反应时间为45～50h，优选为48h。

其中，步骤(7)中，N,N-二甲基甲酰胺的用量为：将反应体系中的反应物溶解完全即可，且粘度适中。

上述的制备方法制备得到的基于肽类树状大分子增强的透明质酸基生物墨水也在本发明的保护范围之内。

有益效果：

(1)与传统的甲基丙烯酸酐修饰的透明质酸HAMA生物墨水相比，本发明的生物墨水引入端基修饰降冰片烯基团的肽类树状大分子与巯基化透明质酸进行硫醇烯光点击交联，在理化性能方面可以实现更优异的流变与压缩性能。

(2)本发明的肽类树状大分子增强的透明质酸基生物墨水在与内皮细胞共培养后，可以使细胞实现更好的增殖行为。

(3)本发明的肽类树状大分子增强的透明质酸基生物墨水在光照条件下可以引发细胞内更低的活性氧水平。

(4)本发明的肽类树状大分子增强的透明质酸基生物墨水在悬浮打印后，可以实现较高的可打印性和形状保真度。

附图说明

下面结合附图和具体实施方式对本发明做更进一步的具体说明，本发明的上述和/或其他方面的优点将会变得更加清楚。

图1为端基修饰降冰片烯基团的肽类树状大分子(PDN)的分子结构。

图2为验证PDN的结构的相关表征图谱。

图3为肽类树状大分子增强的透明质酸基生物墨水的成胶图。

图4为肽类树状大分子增强的透明质酸基生物墨水的力学表征。

图5为肽类树状大分子增强的透明质酸基生物墨水的流变学表征。

图6为与肽类树状大分子增强的透明质酸基生物墨水共培养的细胞增殖染色。

图7为肽类树状大分子增强的透明质酸基生物墨水在光照条件下引发的细胞内的活性氧水平。

图8为肽类树状大分子增强的透明质酸基生物墨水悬浮打印三维结构。

具体实施方式

下述实施例中所述实验方法，如无特殊说明，均为常规方法；所述试剂和材料，如无特殊说明，均可从商业途径获得。

下述实施例中所述w/v，如无特殊说明，均为g/mL。

实施例中使用的反应原料的缩写及中文化学名称：

Boc-Lys(Boc)-OH：(S)-2,6-二叔丁氧羰基氨基己酸，CAS：2483-46-7，MW＝346.42；

H-Lys-OMe·2HCl：L-赖氨酸甲酯盐酸盐，CAS：26348-70-9，MW＝233.14；

HOBT：1-羟基苯并三唑，CAS：2592-95-2，MW＝135.12；

HBTU：苯并三氮唑-N,N,N',N'-四甲基脲六氟磷酸盐，CAS：94790-37-1，MW＝379.25；

DMF：N,N-二甲基甲酰胺，CAS：68-12-2，MW＝73.09，密度＝0.948g/cm³；

DIEA：N,N-二异丙基乙胺，CAS：7087-68-5，MW＝129.24，密度＝0.742g/cm³；

TFA：三氟乙酸，CAS：76-05-1，MW＝114.02，密度＝1.535g/cm³；

DCM：二氯甲烷，CAS：75-09-2，MW＝84.93，密度＝1.325g/cm³；

4-Arm-PEG：四臂聚乙二醇，MW＝20000；

NOR：5-降冰片烯-2-羧酸，CAS：120-74-1，MW＝138.16，密度＝1.129g/cm³；

NaOH/MeOH：氢氧化钠/甲醇溶液。

本发明中使用的磷酸缓冲盐溶液(PBS)，pH＝7.2～7.4，磷酸缓冲盐溶液中钠离子的浓度为3.61g/L，钾离子的浓度为0.17g/L，氯离子的浓度为4.95g/L，磷酸氢根的浓度是0.98g/L，磷酸二氢根的浓度是0.17g/L。

本发明使用的MES缓冲溶液，0.1M，pH＝5.0，商业途径购买得到。

实施例1

(1)室温下，称取2.00g H-Lys-OMe·2HCl、5.94g的Boc-Lys(Boc)-OH、3.48g的缩合剂HOBT以及9.77g HBTU于反应茄形瓶中，双排管抽真空充氮气反复循环3次，冰浴条件下加入50mL DMF、5.98mL的DIEA至该体系中反应20分钟后撤去冰浴，室温下反应24小时，反应结束后旋蒸去除有机相，加入300mL氯仿复溶产物，再依次使用饱和NaHCO₃、NaCl、稀盐酸对产物水洗，水洗完成后收集有机层溶液，加入无水硫酸镁固体干燥隔夜，干燥后使用砂芯漏斗过滤收集产物，旋蒸浓缩氯仿使用硅胶柱层析纯化，将提纯产物旋转蒸发后真空干燥，得到端基Boc保护的二代赖氨酸，分子量为816.52。

(2)称取1.00g的端基Boc保护的二代赖氨酸于50mL反应茄形瓶中，双排管抽真空充氮气反复循环三次，向体系中加入1.81mL TFA和1.81mL DCM，室温下反应6小时，反应结束后旋蒸去除有机相，冰浴条件下加入无水乙醚沉淀产物，反复3次后离心收集产生并对其进行真空干燥处理，得到脱掉Boc基团的二代赖氨酸，分子量为416.31。

(3)室温下，称取1.00g脱掉Boc基团的二代赖氨酸以及9.99g的Boc-Lys(Boc)-OH、6.49g的缩合剂HOBT以及18.21g HBTU于反应茄形瓶中，双排管抽真空充氮气反复循环3次，冰浴条件下加入50mL DMF、16.74mL的DIEA至该体系中反应20分钟后撤去冰浴，室温下反应48小时，反应结束后旋蒸去除有机相，加入300mL氯仿复溶产物，依次使用饱和NaHCO₃、NaCl、稀盐酸对产物水洗，水洗完成后收集有机层溶液，加入无水硫酸镁固体干燥隔夜，干燥后使用砂芯漏斗过滤收集产物，旋蒸浓缩氯仿使用硅胶柱层析纯化，将提纯产物旋转蒸发后真空干燥，得到端基Boc保护的三代赖氨酸，分子量1729.11。

(4)称取1.00g的端基Boc保护的三代赖氨酸于反应茄形瓶中，加入适量的0.5M的NaOH/MeOH溶液将端基Boc保护的三代赖氨酸溶解，室温下反应6小时，旋转蒸发去除体系中的甲醇溶液，加入氯仿复溶产物，通过1M稀盐酸将体系pH调至2-3，分液漏斗去除水相后收集有机层溶液，加入无水硫酸镁固体干燥隔夜，干燥后使用砂芯漏斗过滤收集产物并干燥，得到脱甲酯保护的三代赖氨酸，分子量为1715.09。

(5)室温下，向1.00g氨基封端的4-Arm-PEG中加入3.43g脱甲酯保护的三代赖氨酸、1.08g的HOBT以及3.03g的HBTU于200mL反应茄形瓶中，双排管抽真空充氮气反复循环三次，冰浴条件下加入50mL DMF及1.39mL DIEA至该体系中，室温下反应48小时，反应结束后旋蒸去除有机相，冰浴条件下加入无水乙醚沉淀产物，反复3次后离心收集产生并对其进行真空干燥处理，得到三代赖氨酸修饰的超支化聚乙二醇。

(6)将三代赖氨酸修饰的超支化聚乙二醇置于200mL反应茄形瓶中，双排管抽真空充氮气反复循环三次，向体系中加入适量的DCM和TFA(DCM与TFA的体积比为1：1)将三代赖氨酸修饰的超支化聚乙二醇溶解，室温下反应6小时，反应结束后旋蒸去除有机相，冰浴条件下加入无水乙醚沉淀产物，反复3次后离心收集产生并对其进行真空干燥处理，得到脱掉Boc基团的三代赖氨酸修饰的超支化聚乙二醇。

(7)室温下，称取0.96g脱掉Boc基团的三代赖氨酸修饰的超支化聚乙二醇以及1.88g的HOBT以及5.27g的HBTU于200mL反应茄形瓶中，双排管抽真空充氮气反复循环3次，冰浴条件下加入50mL DMF、2.42mL的DIEA、3.4mL的NOR至该体系中，室温下反应48小时。反应结束后，旋蒸去除DMF溶剂，冰浴条件下加入无水乙醚沉淀产物，反复3次后离心收集产生并对其进行真空干燥处理。将干燥后的产物复溶于去离子水中，使用1KDa透析袋对产物透析处理5天以除去未反应原料或其他副产物，每12小时更换一次去离子水，透析结束后，对其冷冻干燥处理得白色粉末状产物，即降冰片烯化三代赖氨酸修饰聚乙二醇(PDN)，即端基修饰降冰片烯基团的肽类树状大分子，具体的分子结构请见图1。

通过HR-MS、¹H-NMR分析证实了所得产物的化学结构，如图2所示，分别对应端基Boc保护的二代赖氨酸的质谱(图2A)、端基Boc保护的三代赖氨酸的质谱(图2B)，端基Boc保护的二代赖氨酸的核磁(图2C)、端基Boc保护的三代赖氨酸的核磁(图2D)以及降冰片烯化三代赖氨酸修饰聚乙二醇的核磁谱图(图2E)，表明了PDN的成功合成。

(8)室温下，将1g的透明质酸钠以0.5％g/mL的浓度溶于pH为5的MES缓冲溶液中搅拌2h至完全溶解，加入1.43g的EDC和0.86g的NHS在冰浴条件下活化30min，然后将1.41g的半胱胺盐酸盐加至反应溶液中避光搅拌过夜，然后加入0.38g的DTT搅拌3h以断裂体系中生成的二硫键。反应结束后，使用3.5KDa透析袋分别在pH为5的NaCl溶液及水溶液中分别透析处理3天，每12h更换一次水以除去副产物。透析结束后，对其冷冻干燥处理得絮状产物巯基基团修饰的透明质酸(HC)，-20℃冰箱中保存备用。

(9)HC-PDN生物墨水的配置：将HC溶于PBS缓冲液中，得到第一预聚液(第一预聚液中HC的浓度为4％g/mL)；将PDN溶于PBS缓冲液中，得到第二预聚液(第二预聚液中PDN的浓度为10％g/mL)；将第一预聚液和第二预聚液按照体积比为1：1进行混合，得到第一混合液，向第一混合液中加入交联剂DTT和光引发剂LAP涡旋超声至均匀溶液，得到HC-PDN生物墨水前驱液。随后将生物墨水前驱液经移液器加入PDMS模具中，进行光交联反应，可见光的波长为405nm，在室温下反应30s，光照成型即得凝胶态的HC-PDN生物墨水(如图3所示)，HC-PDN生物墨水中HC的的最终浓度为2％g/mL，PDN的最终浓度为5％g/mL，DTT的最终浓度为3mmol/L，LAP的最终浓度为0.5％g/mL。

对比例1

1)室温下，将1g的透明质酸以0.5％g/mL的浓度溶于超纯水中搅拌2h至完全溶解，然后将反应体系移至4℃水浴中，再缓慢滴加10mL甲基丙烯酸酐于溶液中，并通过0.5mol/L的NaOH调节溶液pH值维持在8～10之间2h，再放置于4℃下持续反应24h。反应结束后，使用3.5KDa透析袋对产物透析处理3天，每12h更换一次水以除去未反应原料或其他副产物。透析结束后，对其冷冻干燥处理得白色絮状产物HAMA，-20℃冰箱中保存备用。

2)HAMA生物墨水的配置：将HAMA以2％g/mL的浓度溶于PBS缓冲液中，加入光引发剂LAP(终浓度为0.5％g/mL)涡旋超声至均匀溶液，即得HAMA生物墨水前驱液；将所述生物墨水前驱液经移液器加入PDMS模具中，进行光交联反应，可见光的波长为405nm，在室温下反应30s，光照成型即得凝胶态的HAMA生物墨水。

实施例2

将实施例1中HC-PDN生物墨水前驱液和对比例1中HAMA生物墨水前驱液置于PDMS模具中光照成型(可见光的波长为405nm，在室温下反应30s)为直径5mm，高度10mm的圆柱体样品，将样品置于夹具正中间，使得上夹具与样品表面完全接触，设置压缩速度为1mm/min，取3组样品进行平行样测试。如图4所示，可以观察到随着压缩应变的升高，生物墨水的压缩应力均随之升高，且HAMA生物墨水在40％处出现断裂点，而HC-PDN生物墨水具有超过80％的压缩应变，并且在压缩过程中，生物墨水并未出现明显的屈服点和断裂点，显示出优异的压缩性能。

实施例3

将实施例1中HC-PDN生物墨水前驱液和和对比例1中HAMA生物墨水前驱液置于PDMS模具中光照成型(可见光的波长为405nm，在室温下反应30s)为直径10mm，厚度为2mm的圆薄片样品，放置于流变仪夹具中，使得测量间距为1000μm，设置温度为25℃，角频率为10rad/s，剪切应变测试参数为0.1-1000％，观察样品模量G'，G"随振幅的变化。如图5所示，G'代表材料存储弹性变形能量的能力，G'越大，代表材料硬度越大，难以变形。G"代表材料在遭受不可逆形变下而损耗的能量。图中可观察到，初始测试在较小应变条件下，HAMA和HC-PDN的水凝胶储能模量都较为稳定，增大应变时，储能模量逐渐下降，而损耗模量逐渐上升，且随着剪切应变的不断升高，HAMA在1％～10％剪切应变范围下出现溶胶-凝胶转变点，而HC-PDN在10％～100％剪切应变范围下出现溶胶-凝胶转变点，说明HC-PDN的粘弹性和延展性较好，在高剪切力条件下依然能够保持凝胶态。

实施例4

将实施例1中HC-PDN生物墨水前驱液和对比例1中HAMA生物墨水前驱液经滤膜过滤灭菌处理后，冷冻干燥放置-20℃冰箱备用。使用前在超净台无菌环境下，将冻干后的水凝胶溶于基础培养基，涡旋超声至完全溶解。将EA.hy.926细胞在添加了体积分数为10％胎牛血清和体积分数为1％青霉素、体积分数为1％链霉素的DMEM培养基中于体积分数为5％CO₂(标准大气压)湿润的气氛中于37℃培养。待细胞增殖至所需数目时，采用共培养方式来评价细胞的增殖行为。首先将上述实施例1中HC-PDN生物墨水前驱液和对比例1中HAMA生物墨水前驱液转至紫外灭菌的PDMS模具中光照交联，可见光的波长为405nm，在室温下反应30s，待生物墨水完全成型后将其转至48孔板内，加入500μL完全培养基清洗三次，每次5min。再将生长情况良好的EA.hy.926细胞通过胰酶消化计数，重悬成细胞密度为4×10⁴cells/ml接种于上述孔板中，每隔一天更换新鲜培养液，连续培养3天后采用Edu染色法考察EA.hy.926细胞的增殖情况。如图6所示，培养3天后，实施例1的HC-PDN生物墨水共培养的细胞增殖水平明显高于对比例1的HAMA生物墨水共培养的细胞。

实施例5

将实施例1中HC-PDN生物墨水前驱液和对比例1中HAMA生物墨水前驱液经滤膜过滤灭菌处理后，冷冻干燥放置-20℃冰箱备用。使用前在超净台无菌环境下，将冻干后的水凝胶溶于基础培养基，涡旋超声至完全溶解。将EA.hy.926细胞在添加了体积分数为10％胎牛血清和体积分数为1％青霉素、体积分数为1％链霉素的DMEM培养基中于体积分数为5％CO₂(标准大气压)湿润的气氛中于37℃培养。待细胞增殖至所需数目时，将EA.hy.926细胞重悬于上述实施例1中HC-PDN生物墨水前驱液和对比例1中HAMA生物墨水前驱液中，后转至紫外灭菌的PDMS模具中光照交联，可见光的波长为405nm，在室温下反应30s，成型后使用DCFH-DA试剂盒表征细胞内的活性氧水平，使用荧光显微镜拍摄荧光显微图。如图7所示，经光照交联后，观察到实施例1的HC-PDN生物墨水共培养的细胞内活性氧水平明显低于对比例1的HAMA生物墨水共培养的细胞活性氧。

实施例6

采用实施例1中HC-PDN生物墨水前驱液悬浮打印不同形状的三维结构。首先，将0.8wt％的卡波姆树脂加入纯水中搅拌至完全分散，加入NaOH调节溶液pH至7，3500转离心3min至树脂内气泡消除，4℃冰箱中保存备用。打印前取10mL悬浮浴装载至模具中，分别载入截面为正方形、三角形、五角星、圆形、星形和不规则多边形的三维立体STL模型，由计算机程序将STL模型切片处理转为3D生物打印机能够识别的G代码，打印完成后在室温下、405nm可见光光源照射1min进行交联成型。成型后将打印结构转至培养皿中使用PBS冲洗以进一步去除打印结构中悬浮浴，清洗完成后得到打印模型。HC-PDN生物墨水的最佳打印速度为20mm/s、打印压强为1.0Bar。如图8所示，HC-PDN生物墨水打印成型的三维结构固化成型速度快，且均与设计的模型具有较高的一致性，没有发生任何的孔隙坍塌，表现出较高的打印精度及可打印。

本发明提供了一种基于肽类树状大分子增强的透明质酸基生物墨水及其制备方法的思路及方法，具体实现该技术方案的方法和途径很多，以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。本实施例中未明确的各组成部分均可用现有技术加以实现。

Claims

1.一种基于肽类树状大分子增强的透明质酸基生物墨水的制备方法，其特征在于，将巯基基团修饰的透明质酸溶于磷酸盐缓冲液中，得到第一预聚液；将肽类树状大分子溶于磷酸盐缓冲液中，得到第二预聚液；将第一预聚液和第二预聚液进行混合，得到第一混合液，向第一混合液中加入交联剂和光引发剂混匀，进行光交联反应，即得生物墨水；

所述的肽类树状大分子为降冰片烯化三代赖氨酸修饰聚乙二醇。

2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述的第一预聚液中巯基基团修饰的透明质酸的浓度为2~6% g/mL；所述的第二预聚液中肽类树状大分子的浓度为8~12% g/mL；所述的第一预聚液与第二预聚液的体积比为0.5~1：0.5~1。

3.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述的交联剂为二硫苏糖醇或巯基化聚乙二醇；所述的光引发剂为苯基(2,4,6-三甲基苯甲酰基)磷酸锂或光引发剂2959；所述的光交联反应，可见光的波长为405 nm，交联温度为室温，交联时间为20~40 s。

4.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述的生物墨水中，巯基基团修饰的透明质酸的最终浓度为1~3% g/mL，肽类树状大分子的最终浓度为4~6% g/mL，交联剂的最终浓度为1.5~4.5 mmol/L，光引发剂的最终浓度为0.3~0.6% g/mL。

5.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述的降冰片烯化三代赖氨酸修饰聚乙二醇的制备方法，包括如下步骤：

（1）将L-赖氨酸甲酯盐酸盐、(S)-2,6-二叔丁氧羰基氨基己酸、1-羟基苯并三唑、苯并三氮唑-N,N,N',N'-四甲基脲六氟磷酸盐和N,N-二异丙基乙胺溶于N,N-二甲基甲酰胺，进行第一反应，反应结束后经后处理，得到端基Boc保护的二代赖氨酸；

（2）将步骤（1）得到的端基Boc保护的二代赖氨酸和三氟乙酸溶于二氯甲烷，进行第二反应，反应结束后经后处理，得到脱掉Boc基团的二代赖氨酸；

（3）将步骤（2）中得到的脱掉Boc基团的二代赖氨酸与(S)-2,6-二叔丁氧羰基氨基己酸、1-羟基苯并三唑、苯并三氮唑-N,N,N',N'-四甲基脲六氟磷酸盐和N,N-二异丙基乙胺溶于N,N-二甲基甲酰胺，进行第三反应，反应结束后经后处理，得到端基Boc保护的三代赖氨酸；

（4）将步骤（3）得到的端基Boc保护的三代赖氨酸溶于含有氢氧化钠的甲醇溶液中，进行第四反应，反应结束后经后处理，得到脱甲酯保护的三代赖氨酸；

（5）将步骤（3）得到的脱甲酯保护的三代赖氨酸与氨基封端的四臂聚乙二醇、1-羟基苯并三唑、苯并三氮唑-N,N,N',N'-四甲基脲六氟磷酸盐和N,N-二异丙基乙胺溶于N,N-二甲基甲酰胺，进行第五反应，反应结束后经后处理，得到三代赖氨酸修饰的超支化聚乙二醇；

（6）将步骤（5）得到的三代赖氨酸修饰的超支化聚乙二醇和三氟乙酸溶于二氯甲烷，进行第六反应，反应结束后经后处理，得到脱掉Boc基团的三代赖氨酸修饰的超支化聚乙二醇；

（7）步骤（6）得到的脱掉Boc基团的三代赖氨酸修饰的超支化聚乙二醇与5-降冰片烯-2-羧酸、1-羟基苯并三唑、苯并三氮唑-N,N,N',N'-四甲基脲六氟磷酸盐和N,N-二异丙基乙胺溶于N,N-二甲基甲酰胺，进行第七反应，反应结束后经后处理，得到降冰片烯化三代赖氨酸修饰聚乙二醇；

步骤（1）、步骤（2）、步骤（3）、步骤（5）、步骤（6）和步骤（7）在惰性气体保护下进行。

6.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于，步骤（1）中，所述的L-赖氨酸甲酯盐酸盐、(S)-2,6-二叔丁氧羰基氨基己酸、1-羟基苯并三唑、苯并三氮唑-N,N,N',N'-四甲基脲六氟磷酸盐与N,N-二异丙基乙胺的摩尔比为0.8~1.2：3.5~4.5：5.5~7：5.5~7：7~9；所述的第一反应，先在冰浴条件下反应15~30 min，撤去冰浴后再在室温下反应20~30 h。

7.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于，步骤（2）中，所述的端基Boc保护的二代赖氨酸与三氟乙酸的摩尔比为1：18~22；所述的三氟乙酸与二氯甲烷的体积比为1：1；所述的第二反应，反应温度为室温，反应时间为4~8 h。

8.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于，步骤（3）中，所述的脱掉Boc基团的二代赖氨酸、(S)-2,6-二叔丁氧羰基氨基己酸、1-羟基苯并三唑、苯并三氮唑-N,N,N',N'-四甲基脲六氟磷酸盐与N,N-二异丙基乙胺的摩尔比为0.8~1.2：10~14：18~22：18~22：38~42；所述的第三反应，先在冰浴条件下反应15~30 min，撤去冰浴后再在室温下反应40~50 h。

9.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于，步骤（4）中，所述的含有氢氧化钠的甲醇溶液中，氢氧化钠的浓度为0.5 mol/L；所述的第四反应，反应温度为室温，反应时间为4~8 h。

10.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于，步骤（5）中，所述的氨基封端的四臂聚乙二醇中端氨基、脱甲酯保护的三代赖氨酸、1-羟基苯并三唑、苯并三氮唑-N,N,N',N'-四甲基脲六氟磷酸盐与N,N-二异丙基乙胺的摩尔比为0.8~1.2：8~12：38~42：38~42：38~42；所述的第五反应，反应温度为室温，反应时间为45~50 h。

11.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于，步骤（6）中，所述的三氟乙酸与二氯甲烷的体积比为1：1；所述的第六反应，反应温度为室温，反应时间为4~8 h。

12.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于，步骤（7）中，所述的脱掉Boc基团的三代赖氨酸修饰的超支化聚乙二醇中端氨基、5-降冰片烯-2-羧酸、1-羟基苯并三唑、苯并三氮唑-N,N,N',N'-四甲基脲六氟磷酸盐与N,N-二异丙基乙胺的摩尔比为0.8~1.2：18~22：8~12：8~12：8~12；所述的第七反应，反应温度为室温，反应时间为45~50 h。

13.权利要求1~12任意一项所述的制备方法制备得到的基于肽类树状大分子增强的透明质酸基生物墨水。