CN115192779B

CN115192779B - Pluronic F127/透明质酸复合水凝胶生物墨水的制备方法

Info

Publication number: CN115192779B
Application number: CN202211033973.6A
Authority: CN
Inventors: 毛宏理; 顾忠伟; 郝莉莉; 冯苗
Original assignee: Nanjing Tech University
Current assignee: Nanjing Tech University
Priority date: 2022-08-26
Filing date: 2022-08-26
Publication date: 2023-09-15
Anticipated expiration: 2042-08-26
Also published as: CN115192779A

Abstract

本发明公开了Pluronic F127/透明质酸复合水凝胶生物墨水的制备方法，将巯基封端改性的Pluronic F127的预聚液加入到甲基丙烯酸酐修饰的透明质酸的预聚液中，进行预交联反应，接着在紫外灯照射下发生光交联反应，即得。本发明所述的巯基封端改性的Pluronic F127在水介质中自组装形成胶束，表现出随温度变化的溶胶‑凝胶相变行为，且光交联有利于固定打印结构。本发明制备得到的复合水凝胶生物墨水具有良好的机械性能和保水性，快速凝胶行为和生物相容性，可载干细胞打印且有利于加速皮肤伤口愈合的过程。

Description

Pluronic F127/透明质酸复合水凝胶生物墨水的制备方法

技术领域

本发明属于医用生物材料技术领域，涉及Pluronic F127/透明质酸复合水凝胶生物墨水的制备方法。

背景技术

皮肤作为人体中一类重要的软组织，具有防止外来细菌感染、为人类提供保护的作用。除浅表伤口外，严重的皮肤创伤一般会丧失再生修复能力，且原有的伤口闭合机制无法实现皮肤组织的修复。在这种情况下，皮肤创伤修复只能通过手术来实现如自体皮肤移植，但这往往会因为供体不足或植皮坏死而达不到理想的治疗效果。组织工程的出现为治疗皮肤创伤提供了一种方法，在修复受损组织方面具有潜在的优势。三维(3D)生物打印是一种可以制造皮肤替代品的极具前景的技术，在组织工程中占有重要地位，然而开发出适用于创伤修复、3D生物打印、可工程化制造的生物墨水仍具有挑战。理想的生物墨水应具有足够的机械性能、良好的打印性能，且支持支架内细胞的存活并维护其生物学功能。水凝胶具有类似于天然细胞外基质的特征，可以在伤口界面处保持湿润的环境、吸收体液、渗透氧气，还有利于细胞粘附，增殖，营养物质运输和代谢废物，因此开发基于水凝胶生物墨水用于全层皮肤缺损治疗具有重要意义。

透明质酸(HA)是一种天然的非硫酸化糖胺聚糖，它是一种无毒，可生物降解且具有生物相容性的天然聚合物，在临床上已被广泛用于皮肤填充剂。作为细胞外基质的主要成分，透明质酸结构中可用的大量羧基和羟基使其具有高度亲水性，在止血、调节炎症、促进上皮的再形成过程中起着至关重要的作用，且基于HA的水凝胶因其可调节理化和生物学特性使之成为3D生物打印中最有吸引力的材料。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是针对现有技术的不足，提供一种用于全层皮肤缺损修复的Pluronic F127/透明质酸复合水凝胶生物墨水的制备方法。

发明思路：本发明中，由甲基丙烯酸酐修饰的透明质酸(HAMA)和巯基封端改性的Pluronic F127(F127-SH)混合制备出具有光敏和温敏性质的复合水凝胶作为生物墨水。首先，在混合过程中F127-SH中巯基之间会形成双硫键并在37℃条件下通过疏水相互作用自缔合形成胶束，随后在紫外光照下，进一步通过F127-SH中巯基和HAMA中烯烃之间的硫醇-烯“点击”反应形成稳定的结构。具有温敏性质的Pluronic F127可以在打印过程中调节生物墨水的黏度，具有优异生物学功能的透明质酸可修复缺损皮肤，并且基于硫醇-烯快速的“点击”反应有利于减少长时间光照对细胞造成的伤害。

为了解决上述技术问题，本发明公开了Pluronic F127/透明质酸复合水凝胶生物墨水的制备方法，将巯基封端改性的Pluronic F127的预聚液加入到甲基丙烯酸酐修饰的透明质酸的预聚液中，进行预交联反应，接着在紫外灯照射下发生光交联反应，即得。

其中，所述的巯基封端改性的Pluronic F127的制备方法包括如下步骤：

(1)将对氯甲酸-4-硝基苯酯、三乙胺与Pluronic F127反应得到活化后的Pluronic F127；

(2)将β-巯基乙胺与步骤(1)得到的活化后的Pluronic F127反应，即得巯基封端的Pluronic F127。

具体地，所述的巯基封端改性的Pluronic F127的制备方法包括如下步骤：

(1)将Pluronic F127和三乙胺溶于有机溶剂，得到混合液A；将对氯甲酸-4-硝基苯酯溶于有机溶剂，得到混合液B；将混合液A加入到混合液B中进行反应，得到活化后的Pluronic F127；

(2)将步骤(1)得到的活化后的Pluronic F127溶于有机溶剂，得到混合液C；将β-巯基乙胺溶于有机溶剂，得到混合液D；将混合液C加入到混合液D中进行反应，即得巯基封端的Pluronic F127；

步骤(1)和步骤(2)在惰性气体保护下进行。

具体地，步骤(1)中，所述的Pluronic F127、三乙胺与对氯甲酸-4-硝基苯酯的摩尔比为1：2～4：5～7；所述的有机溶剂为二氯甲烷，二氯甲烷的用量将混合液中的固体溶解且混合液粘度适中即可；所述的反应，反应温度为22～27℃，反应时间为40～60h。

具体地，步骤(2)中，所述的活化后的Pluronic F127与β-巯基乙胺的摩尔比为1：10～20；所述的有机溶剂为二氯甲烷，二氯甲烷的用量将混合液中的固体溶解且混合液粘度适中即可；所述的反应，反应温度为22～27℃，反应时间为20～30h。

其中，所述的甲基丙烯酸酐修饰的透明质酸的制备方法为：将甲基丙烯酸酐与透明质酸反应得到甲基丙烯酸酐修饰的透明质酸，在反应前14h内控制反应体系的pH值在8～10之间，在总反应时间24h后，反应体系的pH值保持在中性7.35～7.45。

具体地，所述的甲基丙烯酸酐修饰的透明质酸的制备方法为：将透明质酸溶于去离子水得到混合液E，随后将甲基丙烯酸酐加入到混合液E中，冰浴中避光反应，在反应前14h内控制反应体系的pH值在8～10之间，在总反应时间24h后，反应体系的pH值保持在中性7.35～7.45，将反应液透析，冻干，即得。

具体地，所述的透明质酸中羟基与甲基丙烯酸酐中双键的摩尔比为1：15～20；所述的混合液E中透明质酸的浓度为0.5～1.5g/mL。

具体地，所述的巯基封端改性的Pluronic F127(F127-SH)在预聚液中的浓度为5～20％g/mL；所述的甲基丙烯酸酐修饰的透明质酸(HAMA)在预聚液中的浓度为1～3％g/mL；所述的巯基封端改性的Pluronic F127的预聚液与甲基丙烯酸酐修饰的透明质酸的预聚液的体积比为1：1。

具体地，所述的预聚液中溶剂为含有2-羟基-4'-(2-羟乙氧基)-2-甲基苯丙酮的磷酸盐缓冲液，2-羟基-4'-(2-羟乙氧基)-2-甲基苯丙酮的浓度为0.1～0.3％g/mL；所述的复合水凝胶生物墨水，巯基封端改性的Pluronic F127的最终浓度为2.5～10％g/mL，优选为7.5％g/mL，甲基丙烯酸酐修饰的透明质酸的最终浓度为1.0％g/mL，2-羟基-4'-(2-羟乙氧基)-2-甲基苯丙酮的最终浓度为0.1％g/mL。

其中，磷酸盐缓冲液是由磷酸二氢钠和磷酸氢二钠组成，pH为7.2～7.4。

具体地，所述的预交联反应，反应温度为36～40℃，反应时间为1～3min；所述的光交联反应，紫外照射的波长为365nm，紫外照射的功率为5mW/cm²，紫外照射的时间为1～2min。

上述制备方法制备得到Pluronic F127/透明质酸复合水凝胶生物墨水也在本发明的保护范围之内。

所述的Pluronic F127/透明质酸复合水凝胶生物墨水在制备皮肤创面闭合材料中的应用。制备皮肤创面闭合材料的技术优选为3D生物打印。

优选地，选择最终浓度为7.5％g/mL F127-SH、1％g/mL HAMA和0.1％g/mL 2-羟基-4'-(2-羟乙氧基)-2-甲基苯丙酮(I 2959)的F127-SH/HAMA复合水凝胶(SM7.5)作为生物墨水打印载干细胞支架。

其中，所述的载干细胞支架中，采用P6代干细胞。

其中，所述的复合水凝胶生物墨水制备的支架的工艺参数为：1.3bar的压力、20mm/s的速度、27G的打印针头，采用悬浮打印的方式。

有益效果：与现有技术相比，本发明具有如下优势：

1、本发明的复合水凝胶，成胶时间快，机械性能、保水性能和细胞相容性良好且有利于皮肤伤口愈合。

2、自由基聚合成胶时间较慢，但本发明所述的巯基封端改性的Pluronic F127和甲基丙烯酸酐修饰的透明质酸采用基于硫醇-烯“点击”反应的逐步链增长使复合水凝胶成胶时间大大缩短。

3、通常生物墨水过稠会增大剪切力伤害细胞，过稀会导致细胞沉积不利于挤出并堵塞打印针头。本发明所述的复合水凝胶，其中巯基封端改性的Pluronic F127表现出随温度变化的溶胶-凝胶相变行为，可以调节生物墨水的黏度，而光交联有利于最终打印结构的固定，且可提高复合水凝胶生物墨水的机械性能。

4、本发明选用透明质酸为基体材料，引入Pluronic F127，随着F127-SH浓度的增加使复合水凝胶内部交联位点增多，提高了交联密度导致更致密的内部结构，具有良好好的保水性，有利于伤口愈合。

5、本发明选用透明质酸和Pluronic F127为水凝胶原料，两种原料通过简单改性可发生交联作用，且制备简单，原料并已实现商业化。因此，其选用及对此类凝胶方法的建立、推广和促进其在组织工程和再生医学中的应用具有非常重要的价值。

6、本发明所述的复合水凝胶生物墨水采用悬浮打印的方式，具有打印复杂结构能力的同时保证了打印细胞的存活率。

附图说明

下面结合附图和具体实施方式对本发明做更进一步的具体说明，本发明的上述和/或其他方面的优点将会变得更加清楚。

图1(a)改性Pluronic F127的核磁图谱；图1(b)为改性透明质酸的核磁图谱；

图2为复合水凝胶的压缩应力-应变曲线；

图3为复合水凝胶的保水率图像；

图4为复合水凝胶生物墨水SM7.5载干细胞打印时细胞在支架内的生长状况；

图5为复合水凝胶生物墨水SM7.5打印复杂结构图像；

图6为水凝胶支架处理的小鼠背部伤口的图片和定量分析；

图7为水凝胶支架处理的小鼠伤口Masson染色图片以及胶原蛋白定量分析。

具体实施方式

下述实施例中所述实验方法，如无特殊说明，均为常规方法；所述试剂和材料，如无特殊说明，均可从商业途径获得。

实施例1

(1)称取10g Pluronic F127将其放入两口烧瓶中，抽真空30min通氮气5min，重复此步骤两遍，加入70mL二氯甲烷，300μL三乙胺，充分搅拌均匀，得到混合液A。另称取0.96g对氯甲酸-4-硝基苯酯(p-NPC)抽真空30min通氮气5min，重复此步骤两遍，加入10mL二氯甲烷，充分搅拌均匀，得到混合液B。将混合液A加入到50mL的恒压滴液漏斗中，滴加到混合液B中，30min内滴加完毕。在25℃下反应48h，待反应结束后，配置饱和NaCl溶液进行盐洗、分液漏斗静置分液，取下层有机层用无水硫酸镁干燥过夜、砂芯漏斗进行抽滤、抽滤得到的有机相进行旋蒸，旋至粘稠状态即可。之后加入冷乙醚沉淀、离心后放入真空干燥箱干燥过夜，得到白色粉末状活化产物(F127-NPC)，放入干燥器中干燥备用。

(2)称取1g F127-NPC放入两口烧瓶中，抽真空30min通氮气5min，重复此步骤两遍，加入50mL二氯甲烷，充分搅拌均匀，得到混合液C。另称取0.086gβ-巯基乙胺抽真空30min通氮气5min，重复此步骤两遍，加入10mL二氯甲烷，充分搅拌均匀，得到混合液D。将混合液C加入到混合液D中，在25℃下反应24h，随后进行盐洗、静置分液、干燥、抽滤、旋蒸、沉淀、离心、干燥、透析三天后，将透析完成的产物放入冷冻干燥机中冻干，最终得到白色产物F127-SH，即巯基封端的Pluronic F127，避光保存至干燥器中。

(3)取10.00mg F127、10.00mg F127-NPC和10.00mg 127-SH分别溶解在CDCl₃(600μL)中。用核磁共振波谱仪记录样品的¹H NMR谱图。

在F127和F127-SH的核磁谱图中(图1(a))可以看出活化后F127(F127-NPC)在δ＝7.37-7.39ppm(e-f)和8.26-8.28ppm(g-h)左右出现两个新的信号峰，是活化后苯环上-CH-的核磁峰。δ＝1.12ppm(a)的宽多重峰则是F127中PPO嵌段的甲基基团(-CH₃)，δ＝2.62-2.65ppm(i-j)和1.41ppm(h)处则是半胱胺上亚甲基(-CH₂)基团和巯基氢质子的核磁峰，这证明了F127-SH的成功合成。

实施例2

1)称取1g透明质酸(HA，Mw：200～400kDa)溶于去离子水中，待充分溶解形成透明质酸浓度为1g/mL的混合液E，在4℃冰浴中避光反应，加入8mL甲基丙烯酸酐(MA)，并配置5MNaOH调节反应pH值，反应前14h内控制反应体系的pH值在8～10之间，在充分反应24h后，检测反应体系的pH值并保持在7.35～7.45，将反应溶液置于透析袋(8000-14000Da)中透析3天，前两天每4h换一次水，后几天每天换三次水。将透析完成的产物放入冷冻干燥机中冻干，最终得到白色海绵状样品，避光保存至干燥器中。

2)将10.00mg HA和10.00mg HAMA分别溶解在D₂O(600μL)中，用核磁共振波谱仪记录样品的¹H NMR谱图。

3)在甲基丙烯酸酐(MA)和HAMA的核磁谱图中(图1(b))可以看出经MA接枝后的HA会在δ＝6.10ppm(a)和5.71ppm(b)左右出现两个新的信号峰，而在δ＝1.86ppm(c)左右出现一个分叉的峰型，分别是甲基丙烯酸酯基上双键氢的核磁峰与甲基氢的核磁峰，δ＝1.96ppm(d)处的核磁峰则是透明质酸侧链上甲基氢的峰，这证明透明质酸已被成功甲基丙烯酸化。

实施例3

(1)将实施例2中制备的HAMA溶于0.1％g/mL的2-羟基-4'-(2-羟乙氧基)-2-甲基苯丙酮的磷酸盐缓冲水中配成含有HAMA的预聚液，HAMA在预聚液中的浓度为1％g/mL，将预聚液置于玻璃样品瓶中，在37℃下进行预交联反应2min，随后放置在波长365nm、功率5mW/cm²的紫外光照射1min发生光交联得到HAMA水凝胶。

(2)将实施例1中制备的F127-SH溶于0.1％g/mL的2-羟基-4'-(2-羟乙氧基)-2-甲基苯丙酮的磷酸盐缓冲水中配成不同浓度含有F127-SH的预聚液，F127-SH在预聚液中的浓度为分别为5％g/mL、10％g/mL、15％g/mL和20％g/mL；将实施例2中制备的HAMA溶于0.1％g/mL的2-羟基-4'-(2-羟乙氧基)-2-甲基苯丙酮的磷酸盐缓冲水中配成含有HAMA的预聚液，HAMA在预聚液中的浓度为2％g/mL；在4℃条件下，将两份预聚液按照体积比1：1混合，使体系中HAMA的最终浓度为1％g/mL，各组中F127-SH的最终浓度分别为2.5％g/mL、5％g/mL、7.5％g/mL、10％g/mL，在37℃下进行预交联反应2min，随后在37℃下经5mW/cm²紫外(365nm)光照1min发生光交联得到复合水凝胶，并分别标记为SM2.5、SM5、SM7.5、SM10。

(3)使用流变仪中上夹具为20mm进行水凝胶的压缩性能测试，将500μL水凝胶注入2mL玻璃瓶中，经温度、光照成胶后加入到平行板中。以10.0μm/s压缩试样，在37℃下达到100％应变，获得应力-应变曲线。见图2为水凝胶的压缩应力-应变曲线，其可以反映出水凝胶的力学性能；其中，SM7.5和SM10相较于水凝胶HAMA表现出较高的断裂应力，这可能是因为F127-SH的引入提高了水凝胶的交联密度，从而提高了水凝胶的机械性能。其中，SM10水凝胶的断裂应力最高，达到了0.097MPa，这可以得出随着F127-SH浓度的增加，水凝胶网络内部交联位点增多，水凝胶的机械强度进一步增强。

实施例4

(1)将实施例3中制备的水凝胶SM2.5、SM5、SM7.5、SM10、HAMA应用于本实施例。

(2)采用模具制作圆形水凝胶样品，在PBS溶液浸泡，待溶胀平衡后，记录此时质量Wt，将水凝胶置于37℃恒温摇床中，在每10h取出测量其质量Wd，计算公式：Weight(％)＝Wd/Wt×100％。

F127-SH/HAMA复合水凝胶的保水性在0～60h范围内随时间的变化如图3所示。24h后，HAMA的保水率小于20％，复合水凝胶组的保水率在40％～60％之间。随着F127-SH浓度的增加，复合水凝胶的保水率逐渐增加。其高保水率是由于透明质酸优异的保水性能和高交联密度，使水分子不易渗出。

实施例5

(1)将实施例3中制备的水凝胶SM7.5应用于本实施例。

(2)将培养到P6代的干细胞消化、离心，在4℃条件下，配置SM7.5(实施例3制备)生物墨水并以1.6×106细胞/mL重悬细胞，将混合完成后的生物墨水置于无菌打印料筒中，在速度为20mm/s，打印针头为27G，压力为1.3bar的条件下打印载细胞支架结构(直径7.5mm，高度1.5mm)，将经灭菌的生物墨水材料与干细胞混合的大块水凝胶作为对照组，与载干细胞打印支架进行对比，在培养1天、3天、7天后，采用CCK-8试剂盒检测支架内细胞的增殖活力，将酶标仪的程序设置在450nm处测试孔板内各组的OD值，空白孔作为背景板，用于扣除孔板自身产生的OD值，细胞的相对活力计算公式：细胞活力(％)＝[(ODs-ODb)/(ODc-ODb)]×100％

为了更加直观地观测到支架内细胞活/死情况，采用Calcein-AM/PI试剂盒对细胞进行染色。将5μL钙黄绿素(Calcein-AM)和5μL碘化丙啶(PI)加入10mL的无血清培养基中，每孔加入100μL，孵育40min，染完后用PBS清洗两遍，以除去多余的染色剂。将样品置于倒置荧光显微镜中观察。如图4所示，与未打印的大块水凝胶相比，细胞在支架上生长良好，载细胞支架组比未经打印的水凝胶组具有更多的活细胞并表现良好的增殖活力。

实施例6

(1)将实施例3中制备的水凝胶SM7.5应用于本实施例。

(2)在打印系统中设置不同形状进行打印，在图5可以看出打印的平面结构网格边界清晰，且打印出了复杂的立体结构，这结果证明生物墨水材料(SM7.5)具有打印复杂结构的能力。

实施例7

(1)将实施例3中制备的水凝胶SM7.5应用于本实施例。

(2)将40只ICR雄性小鼠(20g)腹腔注射水合氯醛(0.1mL/10g)麻醉后，剔除背部毛发，在背侧表面制造2个7mm圆形缺损伤口。经医用酒精消毒后，在随机分成5组的小鼠中，挑选3组放置载干细胞打印支架、不载干细胞打印支架以及载干细胞不打印水凝胶。使用透明医用胶带将支架结构固定在伤口部位，其余两组分别采用一种Tegaderm^TM3M^TM商业产品作为阳性对照，生理盐水处理组作为阴性对照。在治疗后的3天、7天和14天观察伤口的大小，并拍照记录使用以下公式，伤口收缩率％＝[原始伤口面积-治疗当天伤口面积]/原始伤口面积×100％。

如图6所示，在所有治疗组均观察到伤口面积的缩小，经3天的治疗后，对照组、商品组、不载细胞打印支架组、载细胞不打印水凝胶组的伤口量化闭合率分别约为14.95％、27.45％、42.00％、49.95％，而载细胞打印支架组为67.00％，与其他组具有统计学差异(p<0.01)。在治疗的第7天，与对照组和商品组相比(49.18％，69.87％)，载细胞打印支架组闭合率为88.82％，并且在整个治疗过程中载细胞打印支架组表现出比其他组更快的伤口愈合速度，在14天时基本实现了毛发的全覆盖，这表明它对伤口愈合具有促进作用。

(3)马松染色(图7)被用于观察伤口愈合时的胶原蛋白沉积，在第3天，支架组与对照相比开始出现更多的胶原蛋白沉积，商品组几乎未观测到。治疗7天后，各组均出现不同量的胶原蛋白沉积，而打印组胶原蛋白沉积量进一步增加。经14天的治疗后，载细胞打印支架组的胶原蛋白沉积表现得更加致密与健康皮肤相似。定量数据分析显示，载细胞打印支架组处理的伤口具有最高的胶原密度约为74.09％，而载细胞不打印水凝胶组、不载细胞打印支架组、商品组、对照组分别为63.54％,、61.75％、49.89％、47.55％。不载细胞打印支架组表现出比商品组和对照组好的伤口修复效果可能是由于透明质酸在伤口愈合中起到的作用。而载细胞打印支架组表现出最好的伤口愈合，可能是透明质酸与干细胞起到的作用。

本发明提供了Pluronic F127/透明质酸复合水凝胶生物墨水的制备方法的思路及方法，具体实现该技术方案的方法和途径很多，以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。本实施例中未明确的各组成部分均可用现有技术加以实现。

Claims

1.Pluronic F127/透明质酸复合水凝胶生物墨水的制备方法，其特征在于，将巯基封端改性的Pluronic F127的预聚液加入到甲基丙烯酸酐修饰的透明质酸的预聚液中，进行预交联反应，接着在紫外灯照射下发生光交联反应，即得；

所述的巯基封端改性的Pluronic F127的制备方法包括如下步骤：

（1）将对氯甲酸-4-硝基苯酯、三乙胺与Pluronic F127反应得到活化后的PluronicF127；

（2）将β-巯基乙胺与步骤（1）得到的活化后的Pluronic F127反应，即得巯基封端的Pluronic F127；

所述的巯基封端改性的Pluronic F127在预聚液中的浓度为5~20% g/mL；所述的甲基丙烯酸酐修饰的透明质酸在预聚液中的浓度为1~3% g/mL；所述的巯基封端改性的Pluronic F127的预聚液与甲基丙烯酸酐修饰的透明质酸的预聚液的体积比为1：1；

所述的预聚液中溶剂为含有2-羟基-4'-(2-羟乙氧基)-2-甲基苯丙酮的磷酸盐缓冲液，2-羟基-4'-(2-羟乙氧基)-2-甲基苯丙酮的浓度为0.1~0.3% g/mL；所述的复合水凝胶生物墨水，巯基封端改性的Pluronic F127的最终浓度为2.5~10% g/mL，甲基丙烯酸酐修饰的透明质酸的最终浓度为1.0% g/mL，2-羟基-4'-(2-羟乙氧基)-2-甲基苯丙酮的最终浓度为0.1% g/mL。

2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述的巯基封端改性的PluronicF127的制备方法包括如下步骤：

（1）将Pluronic F127和三乙胺溶于有机溶剂，得到混合液A；将对氯甲酸-4-硝基苯酯溶于有机溶剂，得到混合液B；将混合液A加入到混合液B中进行反应，得到活化后的Pluronic F127；

（2）将步骤（1）得到的活化后的Pluronic F127溶于有机溶剂，得到混合液C；将β-巯基乙胺溶于有机溶剂，得到混合液D；将混合液C加入到混合液D中进行反应，即得巯基封端的Pluronic F127；

步骤（1）和步骤（2）在惰性气体保护下进行。

3.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，步骤（1）中，所述的Pluronic F127、三乙胺与对氯甲酸-4-硝基苯酯的摩尔比为1：2~4：5~7；所述的有机溶剂为二氯甲烷；所述的反应，反应温度为22~27℃，反应时间为40~60 h。

4.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，步骤（2）中，所述的活化后的PluronicF127与β-巯基乙胺的摩尔比为1：10~20；所述的有机溶剂为二氯甲烷；所述的反应，反应温度为22~27℃，反应时间为20~30 h。

5.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述的甲基丙烯酸酐修饰的透明质酸的制备方法为：将甲基丙烯酸酐与透明质酸反应得到甲基丙烯酸酐修饰的透明质酸，在反应前14 h内控制反应体系的pH值在8~10之间，在总反应时间24 h后，反应体系的pH值保持在中性7.35~7.45。

6.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于，所述的甲基丙烯酸酐修饰的透明质酸的制备方法为：将透明质酸溶于去离子水得到混合液E，随后将甲基丙烯酸酐加入到混合液E中，冰浴中避光反应，在反应前14 h内控制反应体系的pH值在8~10之间，在总反应时间24h后，反应体系的pH值保持在中性7.35~7.45，将反应液透析，冻干，即得。

7.根据权利要求6所述的制备方法，其特征在于，所述的透明质酸中羟基与甲基丙烯酸酐中双键的摩尔比为1：15~20；所述的混合液E中透明质酸的浓度为0.5~1.5 g/mL。

8.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述的预交联反应，反应温度为36~40^oC，反应时间为1~3 min；所述的光交联反应，紫外照射的波长为365 nm，紫外照射的功率为5 mW/cm²，紫外照射的时间为1~2 min。

9.权利要求1~8中任意一项所述的制备方法制备得到Pluronic F127/透明质酸复合水凝胶生物墨水。

10.权利要求9所述的Pluronic F127/透明质酸复合水凝胶生物墨水在制备皮肤创面闭合材料中的应用。