CN115884973A

CN115884973A - 用于治疗疾病的嘌呤化合物

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Publication number: CN115884973A
Application number: CN202180020893.4A
Authority: CN
Inventors: M·威廉姆斯
Original assignee: Miracle Biotechnology
Current assignee: Miracle Biotechnology
Priority date: 2020-03-10
Filing date: 2021-03-09
Publication date: 2023-03-31
Anticipated expiration: 2041-03-09
Also published as: WO2021179074A1; EP4118083A4; CA3170917A1; AU2021235803A1; US20230151011A1; KR20220152308A; JP2023521291A; IL296215A; CN115884973B; EP4118083A1

Abstract

式(I)‑(III)的取代的嘌呤化合物及其盐作为腺苷A2a受体(A2aR)拮抗剂用于癌症免疫治疗、抑郁症、焦虑症、多发性硬化症、NASH、硬皮病、ADHD、阿尔茨海默病和帕金森病。还教导了包含该化合物的药物组合物以及在治疗抑郁症中使用其的方法。

Description

用于治疗疾病的嘌呤化合物

发明领域

本发明总体涉及作为腺苷A2a受体(A2aR)拮抗剂用于癌症、抑郁症、焦虑症、多发性硬化症、NASH、硬皮病、ADHD、阿尔茨海默病和帕金森病的取代的嘌呤化合物及其盐，包含该化合物的药物组合物、以及其用于治疗癌症、抑郁症、焦虑症、多发性硬化症、NASH、硬皮病、ADHD、阿尔茨海默病和帕金森病的方法。

发明背景

腺苷通过一类膜特异性受体实现其生物学作用，所述受体属于与G蛋白偶联的受体超家族。已识别出至少四种腺苷受体亚型：A1、A2a、A1b和A3。

已证明A2aR在免疫系统中具有调节作用。已证明一种A2aR拮抗剂伊曲茶碱(istradefylline)可减少运动障碍，进而改善在神经退行性疾病(如帕金森病和相关运动障碍(如亨廷顿病))中的功能。

WO2013058681A2公开了使用A2aR拮抗剂治疗中枢神经系统疾病、肿瘤疾病以及病毒和细菌疾病。

需要适合于治疗神经疾病、纤维化相关疾病(NASH和硬皮病)和癌症的A2aR拮抗剂。

发明概述

发明人已经发现某些嘌呤化合物可用作治疗疾病如抑郁症的A2aR拮抗剂。

在一个方面中，提供式(I)的化合物或其药学上可接受的盐：

8-[(E)-2[3,4-双(二氟甲氧基)苯基]乙烯基]-1,3-二乙基-7-甲基-嘌呤-2,6-二酮:氢氟化物

在一个方面中，提供式(II)的化合物或其药学上可接受的盐：

8-[(E)-2[3,4-双(二氟甲氧基)苯基]乙烯基]-1,3-二乙基-7-甲基-嘌呤-2,6-二酮

在一个方面中，提供式(III)的化合物或其药学上可接受的盐：

8-[(E)-2-(3,4-二甲氧基苯基)乙烯基]-1,3-二乙基-7-甲基-6-硫酮基-嘌呤-2-酮

在一个方面中，发现式(IV)的伊曲茶碱(Istradefylline)E)-8-(3,4-二甲氧基苯乙烯基)-1,3-二乙基-7-甲基黄嘌呤或其药学上可接受的盐是A2aR拮抗剂，其可用于治疗癌症、抑郁症、焦虑症、多发性硬化症、NASH、硬皮病、ADHD、阿尔茨海默病和帕金森病：

在一个方面中，发现式(V)的SCH 442416 2-(2-呋喃基)-7-[3-(4-甲氧基苯基)丙基]-7H-吡唑并[4,3-e][1,2,4]三唑并[1,5-c]嘧啶-5-胺或其药学上可接受的盐是A2aR拮抗剂，其可用于治疗癌症、抑郁症、焦虑症、多发性硬化症、NASH、硬皮病、ADHD、阿尔茨海默病和帕金森病：

本公开还包括一种药物组合物，其包含治疗有效量的一种或多种式I、II和III的化合物或其药学上可接受的盐以及药学上可接受的赋形剂。

本公开还包括提供使用一种或多种式I、II和III的化合物或其药学上可接受的盐治疗抑郁症的方法。该方法包括：将一种或多种化合物给药需要该治疗的对象，由此治疗抑郁症。

本公开还包括提供使用一种或多种式I、II和III的化合物及其药学上可接受的盐治疗癌症、焦虑症、多发性硬化症、NASH、硬皮病、ADHD、阿尔茨海默病和帕金森病的方法。该方法包括：将一种或多种化合物给药需要该治疗的对象，由此治疗癌症、焦虑症、多发性硬化症、NASH、硬皮病、ADHD、阿尔茨海默病和帕金森病。

在一些实施方式中，化合物通过静脉注射、组织注射、腹腔内、口服或鼻内给药。在一些实施方式中，组合物具有溶液、分散体、悬浮液、粉末、胶囊、片剂、丸剂、长效释放胶囊、长效释放片剂或长效释放丸剂的形式。

提供了用于合成式I、II和II的化合物的方法。

本公开提供了一种方法，所述方法包括：提供至少一种该化合物，测量化合物对A2aR活性的抑制，并确定抑制是否高于预期水平。

附图简要说明

图1是显示式I化合物的GPCR筛选结果的图；

图2是显示式II化合物的GPCR筛选结果的图；

图3是显示式III化合物(SD-007)的GPCR筛选结果的图；

图4是显示式IV化合物伊曲茶碱的GPCR筛选结果的图；

图5是显示5'-N-乙基酰胺基腺苷(NECA)的GPCR筛选结果的图；

图6是显示SCH 442416的GPCR筛选结果的图；

图7是显示式I化合物的血浆浓度和脑浓度随时间变化的图；

图8是显示在式I化合物的1mg/kg静脉注射或3mg//kg口服给药后血浆浓度随时间变化的图；

图9是显示式II化合物的血浆浓度和脑浓度随时间变化的图；

图10是显示式II化合物1mg/kg静脉注射或3mg//kg口服给药后血浆浓度随时间变化的图；

图11是显示式III化合物(SD-007)的血浆浓度和脑浓度随时间变化的图；

图12是显示在式III化合物SD-007的1mg/kg静脉注射或3mg//kg口服给药后血浆浓度随时间变化的图；

图13是显示化合物伊曲茶碱(式IV)的血浆浓度和脑浓度随时间变化的图；

图14是显示在式IV化合物的1mg/kg静脉注射或3mg//kg口服给药后的血浆浓度随时间变化的图；

图15是比较各种化合物的不动潜伏期(from latency to immobility)时间。

图16是比较各种化合物的不动时间(immobility time)的图。

具体实施方式

本公开的实施方式在下文详细讨论。在所述实施方式中，为了清楚起见，使用了特定术语。然而，本公开并未意图受限于选择的特定术语。相关领域的技术人员将认识到，在的情况下，以使用其他等效部件部分并开发其他方法而不背离本公开的精神和范围。本文引用的所有参考文献通过引用全文纳入，如同各文献单独纳入合并那样。

除非另外定义，否则，本文使用的所有技术和科学术语都具有本发明所属领域普通技术人员通常所理解的同样含义。

在本说明书和权利要求中，除非上下文中另有明确表示，所用的单数形式“一个”、“一种”和“该”包括多个指示物。

本文中使用的术语“包括/包含”将理解为表示以下列表是非穷举的，并且可以包含或可以不包含任何其他合适的项目，例如，一个或多个其他特征、组分和/或成分(视情况而定)。

本文所用术语“药学上有效的量”、“治疗有效量”或“治疗有效剂量”、“有效量”是指研究人员、兽医、医生或其它临床工作人员寻求的将引起组织、系统、动物或人类的生物学或医学反应的受试化合物的量。术语“治疗有效量”包括当给药时足以防止或在某种程度上缓解正在治疗的病症或疾病的一种或多种症状的化合物量。治疗有效量将取决于化合物、病症或病症和其严重程度，以及待治疗哺乳动物的年龄、体重等而变化。

本公开中，“药学上可接受的盐”包括根据本文所述化合物上发现的具体取代基，用相对无毒的酸或碱制备的本公开化合物的盐。当本公开的化合物含有相对酸性的官能性时，可通过使这种化合物的中性形式接触足量的所需碱(纯的或在合适的惰性溶剂中)获得碱加成盐。例如，盐可以源自药学上可接受的无机碱，其包含铝、铵、钙、铜、铁、亚铁、锂、镁、锰、亚锰、钾、钠、锌等。例如，盐可衍生自药学上可接受的有机碱，包括伯胺、仲胺和叔胺的盐，所述胺包括取代的胺、环胺、天然存在的胺等，如精氨酸、甜菜碱、咖啡因、胆碱、N,N'-二苄基乙二胺、二乙胺、2-二乙氨基乙醇、2-二甲氨基乙醇、乙醇胺、乙二胺、N-乙基吗啉、N-乙基哌啶、还原葡糖胺(glucamine)、葡萄糖胺(glucosamine)、组氨酸、肼胺、异丙胺、赖氨酸、甲基葡胺、吗啉、哌嗪、哌啶、多胺树脂、普鲁卡因、嘌呤、可可碱、三乙胺、三甲胺、三丙胺、氨基丁三醇(tromethamine)等。当本公开的化合物含有相对碱性的官能性时，可通过使该化合物的中性形式与足量的所需酸(纯的或在合适的惰性溶剂中)接触来获得酸加成盐。药学上可接受酸加成盐的示例包括：衍生自无机酸的盐，所述无机酸如盐酸、氢溴酸、硝酸、碳酸、碳酸氢、磷酸、磷酸一氢、磷酸二氢、硫酸、硫酸氢、氢碘酸或亚磷酸等，以及衍生自相对无毒有机酸的盐，所述有机酸如乙酸、丙酸、异丁酸、丙二酸、苯甲酸、琥珀酸、辛二酸、富马酸、扁桃酸、邻苯二甲酸、苯磺酸、对甲基苯磺酸、柠檬酸、酒石酸、甲磺酸等。还包括氨基酸(如精氨酸)的盐和有机酸(如葡萄糖醛酸或半乳糖醛酸)的盐(参见例如，Berge,S.M.等，“Pharmaceutical Salts(药用盐)”，药物科学杂志(Journal of PharmaceuticalScience)，66:1-19，1977)。本公开的某些特定化合物含有允许该化合物转化为碱或酸加成盐的碱性和酸性官能团。

在一些实施方式中，所述化合物的中性形式通过使盐与碱或酸接触并以传统方式分离母体化合物来进行再生。所述化合物的母体形式在某些物理性质(例如，在极性溶剂中的溶解度)与多种盐形式不同，但其它情况下所述盐等同于用于本公开目的的化合物的母体形式。

术语“对象”在本文中限定为包括指动物，如哺乳动物，包括但不限于：灵长类动物(例如，人)、牛、绵羊、山羊、马、犬、猫、兔、大鼠、小鼠等。在一些实施方式中，该对象是人。

本公开中使用的术语“治疗”、“进行治疗”、“处理”及其语法变体包括部分或完全延迟、缓解、减轻或减少一种或多种疾病或病症伴随症状的强度、进展或恶化并且/或者缓解、减轻或阻碍一种或多种病症或病症原因。根据本公开的治疗可以防预性(preventively)、预防性(prophylactically)、姑息性或补救性地施用。

本公开所述的化合物在组成该化合物的一个或多个原子处也可含有非天然比例的原子同位素。例如，可用同位素，如例如氘(²H)、氚(³H)、碘-125(¹²⁵I)或碳-14(¹⁴C)放射性标记该化合物。无论是否有放射性，本公开化合物的所有同位素变体都意图包括在本公开的范围内。

本发明人开发了式I和II化合物，并开发了制备式I和式II化合物的有效方法：

为了确定化合物是否是合适的A2aR拮抗剂，使用A2aR作为靶对式I、II、III和IV的化合物进行GPCR筛选。使用Eurofins DiscoverX公司的GPCR筛选和分析服务进行筛选。为了比较，还筛选了NECA和SCH 442416。结果显示于图1-6和实验。

筛选结果表明，这些化合物具有显著的A2aR拮抗剂性质。

Robert D.Leone、Ying Chun Lo和Jonathan D.Powell，“A2aR拮抗剂：癌症免疫治疗的下一代检查点阻断”(A2aR antagonists:Next generation checkpoint blockadefor cancer immunotherapy)，Comput Struct Biotechnol J.2015；13：265–272公开了可用于癌症免疫治疗的某些A2aR拮抗剂，其通过引用全文纳入本文。因此，本文所述的化合物可用于治疗癌症。Domenici MR等人，“腺苷A2A受体作为神经精神障碍的潜在治疗靶点”(Adenosine A2A receptor as potential therapeutic target in neuropsychiatricdisorders)，Pharmacol Res 2019；147:104338公开了某些A2aR拮抗剂可用于治疗阿尔茨海默病、帕金森病、注意力缺陷多动障碍(attention-deficit hyperactivity disorder)、脆性X综合征、抑郁症和焦虑症。因此，本文所述的化合物可用于治疗神经疾病。CronsteinB.，“腺苷受体与纤维化：转译观点”(Adenosine receptors and fibrosis:atranslational view)，F1000 Biol Rep.2011；3:21公开了某些A2aR拮抗剂可用于治疗纤维化，特别是肝纤维化(例如，NASH)和皮肤纤维化(例如硬皮病)。

本文所述的一种或多种化合物可以用于治疗癌症、抑郁症、焦虑症、多发性硬化症、NASH、硬皮病、ADHD、阿尔茨海默病或帕金森病。

在一些实施方式中，本公开的化合物为可以其纯的形式使用。在一些实施方式中，本公开的化合物可作为治疗有效量的如本文所定义的化合物和药学上可接受的赋形剂(例如运载体或稀释剂)制备的药物组合物使用。

在一些实施方式中，所述化合物与药学上可接受的载体如惰性稀释剂或可吸收的可食用载体组合进行系统性给药，例如口服；或通过吸入或吹入给药。它们可以封装在硬壳或软壳明胶胶囊中，可以压缩成片剂，或者可以直接与患者饮食中的食物掺和。对于口服治疗性给药，化合物可与赋形剂混合，并以可摄取的片剂、口腔片剂、锭剂、胶囊、酏剂、悬浮剂、糖浆、薄片等形式使用。化合物可与细惰性粉末载体结合，并由对象吸入或吹入。当然，组合物和制剂的百分比可以变化，并且可以是给定单位剂型重量的合适百分比。在这种治疗上有用的组合物中的化合物量使得可以获得有效剂量水平。

在一些实施方式中，所述片剂、锭剂、丸剂、胶囊等还可包含以下物质：粘合剂，如黄蓍胶、阿拉伯树胶(acacia)、玉米淀粉或明胶；赋形剂，如磷酸二钙；崩解剂，如玉米淀粉、马铃薯淀粉、褐藻酸等；润滑剂，如硬脂酸镁；以及甜味剂，如蔗糖、果糖、乳糖或阿斯巴甜，或可以添加调味剂如薄荷、冬青油或樱桃调味剂。应当理解，除了上述类型的材料之外，胶囊还可以包含液体载体，例如植物油或聚乙二醇。可以存在各种各样的其它材料作为包衣或者以其它方式改变固体单位剂型的外形。例如，片剂、丸剂或胶囊可以用明胶、蜡、虫胶或糖等包衣。糖浆或酏剂可含有活性化合物，用作甜味剂的蔗糖或果糖，用作防腐剂的对羟基苯甲酸甲酯和对羟基苯甲酸丙酯，染料和调味剂如樱桃或橙风味剂。应理解，用于制备任何单位剂型的任何材料应当是药学上可接受的，并且以所使用的量基本是无毒的。在一些实施方式中，将这些化合物掺入缓释制剂和装置中。例如，可以将所述化合物掺入长效释放胶囊、长效释放片剂和长效释放丸剂中。

在一些实施方式中，化合物通过静脉内或腹腔内输注或注射给药。化合物的溶液可在水中制备，任选与无毒表面活性剂混合。在一些实施方式中，分散体在甘油、液体聚乙二醇、三醋酸甘油酯或它们的混合物、或油中来制备。在一些实施方式中，在常见的储存和使用条件下，这些制剂含有防腐剂以防止微生物生长。

在一些实施方式中，用于注射或输注的药物剂型是包含化合物的无菌水溶液或分散体或无菌粉末，所述化合物适于临时制备无菌可注射或可输注溶液或分散体，任选地包封在脂质体中。在所有情况下，最终剂型在制造和储存条件下应是无菌、流动和稳定的。在一些实施方式中，液体载体或介质可以是包含例如水、乙醇、多元醇(例如甘油、丙二醇和液体聚乙二醇等)、植物油、无毒甘油酯及其合适的混合物的溶剂或分散介质。在一些实施方式中，适当的流动性通过形成脂质体、通过在分散体的情况下维持所需的粒径或通过使用表面活性剂来维持。在一些实施方式中，各种抗菌剂和抗真菌剂(例如，对羟基苯甲酸酯、氯丁醇、苯酚、山梨酸、硫柳汞等)用于防止微生物活动。在一些实施方式中，包括等渗剂，例如糖、缓冲剂或氯化钠。在一些实施方式中，使用延迟吸收的试剂如单硬脂酸铝或明胶来延长可注射组合物的吸收。

在一些实施方式中，通过将所需量的化合物掺入适当溶剂中，并根据需要任选地与上文列举的一些其他成分掺混，然后过滤灭菌，来制备无菌可注射溶液。当无菌粉末用于制备无菌可注射溶液时，该组合物可以真空干燥和/或冷冻干燥，产生了活性成分加上存在于先前无菌过滤溶液中的任何额外所需成分的粉末。

在一些实施方式中，对于局部施用，化合物以纯的形式施用。在一些实施方式中，所述化合物作为组合物或制剂与皮肤学上可接受的载体(其可以是固体或液体)组合给药至皮肤。

在一些实施方式中，固体载体包含细碎固体，如滑石、粘土、微晶纤维素、二氧化硅、氧化铝等。在一些实施方式中，固体载体包括无毒聚合物纳米颗粒或微粒。在一些实施方式中，液体载体包括水、醇或二醇或水/醇/二醇共混物，其中，化合物可以有效水平溶解或分散，任选地借助于无毒表面活性剂。在一些实施方式中，添加佐剂如香料和其他抗微生物剂，以优化给定用途的性能。得到的液体组合物可由吸收垫施用，用于浸渍绷带和其他敷料，或使用泵型或气溶胶喷雾器喷洒到受影响区域。

在一些实施方式中，增稠剂(如，合成聚合物、脂肪酸、脂肪酸盐和酯、脂肪醇、改性纤维素或改性矿物材料)与液体载体一起使用，以形成可铺展的糊料、凝胶、软膏、皂等，用于直接施用至使用者的皮肤。

在一些实施方式中，这些化合物以冻干形式配制，用于肠道外给药。在一些实施方式中，冻干制剂通过添加水或其他水介质进行重构，然后在使用前用合适的稀释剂进一步稀释。在一些实施方式中，液体制剂为缓冲的等渗水溶液。在一些实施方式中，稀释剂为等渗盐水溶液、5％葡萄糖水溶液和缓冲的乙酸钠或乙酸铵溶液。可添加药学上可接受的固体或液体赋形剂以增强或稳定组合物，或方便组合物的制备。

在一些实施方式中，除了本文所述的化合物之外，药物组合物可以额外含有一种或多种其他药物活性剂。

在一些实施方式中，化合物的有效剂量可通过比较它们的体外活性和动物模型中的体内活性来确定。本领域已知用于将有效剂量从小鼠和其他动物外推至人类的方法；例如，参见美国专利第4938949号，其通过引用纳入本文。

应理解的是，治疗使用中所需的化合物的量不仅随所选的特定盐而变化，而且还随给药途径、所治疗疾病的性质以及患者的年龄和状况而变化，并且最终由助理医生或临床医生决定。

在一些实施方式中，本公开的药剂的有效剂量和给药途径是常规的。化合物的确切量(有效剂量)可因对象而异，取决于例如对象的种类、年龄、体重和一般或临床状况、所治疗的任何病症的严重性或机理、所用的特定化合物或载剂、给药方法和时间安排等。在一些实施方式中，治疗有效剂量是通过本领域技术人员已知的常规程序根据经验确定的。例如，本领域的技术人员可以参考纽约麦克米伦出版公司Goodman和Gilman编辑的《治疗学药理学基础》(The Pharmacological Basis of Therapeutics,Goodman and Gilman,eds.,Macmillan Publishing Co.,New York)。在一些实施方式中，有效剂量最初在细胞培养检测或合适的动物模型中进行估算。在一些实施方式中，动物模型用于确定给药的适当浓度范围和途径。在一些实施方式中，这些信息随后用于确定人给药的有效剂量和途径。在一些实施方式中，通过类似于参照治疗剂的剂量来选择治疗剂量。

例如，剂量可以为每天约0.001至约100mg/kg体重，例如，约0.01至约100mg/kg体重，例如高于每天约0.1mg/kg体重，或每天约1至约10mg/kg体重。例如，合适剂量可以为每天约0.3mg/kg、0.7mg/kg、1mg/kg、10mg/kg或50mg/kg体重。

在一些实施方式中，化合物以单位剂型给药；例如，每单位剂型含有0.05至10000mg、0.5至10000mg，5至1000mg或约100mg活性成分。

在一些实施方式中，给药化合物以获得例如约0.5至约75μM、约1至50μM，约2至约30μM或约5至约25μM的峰值血浆浓度。示例性的理想血浆浓度包括至少或不超过0.25、0.5、1、5、10、25、50、75、100或200μM。例如，血浆水平可为约1至100微摩尔或约10至约25微摩尔。在一些实施方式中，这通过静脉注射0.05-5％的化合物溶液(任选地在盐水中)或以含有约1-100mg化合物的大丸(bolus)口服给药来实现。在一些实施方式中，通过连续输注维持理想的血液水平，以每小时提供约0.00005-5mg/kg体重，例如，至少或不超过0.00005、0.0005、0.005、0.05、0.5或5mg/kg/小时。在一些实施方式中，该水平通过含有约0.0002-20mg化合物/kg体重，例如，至少或不超过0.0002、0.002、0.02、0.2、2、20或50mg化合物/kg体重的间歇输注来获得。

在一个实施方式中，所用嘌呤化合物的量为0.1至5mg/kg对象/天。在优选实施方式中，所用嘌呤化合物的量为0.2至1.3mg/kg对象/天。在进一步优选的实施方式中，所用嘌呤化合物的量为0.3至0.7mg/kg对象/天。

在一些实施方式中，化合物以单剂量呈现，或以适当间隔给药的分次剂量呈现，例如，以每天两次、三次、四次或更多次子剂量呈现。在一些实施方式中，子剂量本身进行进一步划分，例如，划分为多个离散的松散间隔的给药；例如，来自吹入器的多次吸入。

在一些实施方式中，本公开的药物组合物包装在容器中，所述容器带有标签和/或说明书，指示药物组合物在治疗所述疾病中的使用。

应当理解，本公开的一种或多种化合物可以独立使用或以其任意组合使用。

实施例1

使用A2aR作为靶来筛选式I、II、III和IV化合物的GPCR活性。为了比较，还筛选了NECA和SCH 442416。NECA是A2aR激动剂。SCH 442416是A2aR拮抗剂。

检测设计：钙动员

细胞处理

细胞系根据标准程序由冷冻储备扩增。将总体积为20μL的细胞接种到黑壁、透明底部、聚D-赖氨酸涂覆的384孔微型板中，并在测试前在37℃下孵育适当时间。

染料加载

在由1x染料、1x添加剂A和2.5mM的HBSS/20mM Hepes中的丙磺舒(Probenecid)组成的1x染料加载缓冲液中进行检测。对一苯甲酸(Probenicid)是新鲜制备的。在测试之前，细胞加载有染料。从细胞吸出培养基，并用20μL染料加载缓冲液(Dye Loading Buffer)代替。细胞在37℃下孵育30至60分钟。

激动剂形式

对于激动剂测定，将细胞与样品一起孵育以诱导应答。在染料加载后，从培养箱中取出细胞，并加入10μL HBSS/20mM Hepes。当实践激动剂剂量曲线以确定随后拮抗剂检测的EC80时，将3x载剂包含在缓冲液中。细胞在室温和黑暗中孵育30分钟以使板温平衡。进行样品储备的中间稀释，以在检测缓冲液中产生4X样品。在FLIPR Tetra(MDS)上测量化合物激动剂活性。监测钙动员2分钟，并将10μL的4X样品(HBSS/20mM Hepes中)添加至细胞5秒，以进行检测。

变构调节形式

对于变构测定，细胞与样品一起预孵育，然后以EC20浓度进行激动剂诱导。进行样品储备的中间稀释，以在检测缓冲液中产生3X样品。在染料加载后，从培养箱中取出细胞，并加入10μL 3X样品。细胞在室温和黑暗中孵育30分钟以使板温平衡。载剂浓度为1％。在FLIPR Tetra(MDS)上测量化合物变构活性。监测钙动员2分钟，并将10μL的4X EC20激动剂(HBSS/20mM Hepes中)添加至细胞5秒，以进行检测。

拮抗剂形式

对于拮抗剂测定，细胞与样品一起预孵育，然后以EC80浓度进行激动剂挑战。进行样品储备的中间稀释，以在检测缓冲液中产生3X样品。在染料加载后，从培养箱中取出细胞，并加入10μL 3X样品。细胞在室温和黑暗中孵育30分钟以使板温平衡。载剂浓度为1％。在FLIPR Tetra(MDS)上测量化合物拮抗剂活性。监测钙动员2分钟，并将10μL的EC 80激动剂(HBSS/20mM Hepes中)添加至细胞5秒，以进行检测。

数据分析

使用CBIS数据分析套件(加利福尼亚ChemInnovation公司)分析化合物活性。对于激动剂形式检测，使用以下公式计算活性百分比：

％活性＝100％x(测试样品的平均RFU–载剂对照的平均RFU)/(平均MAX RFU对照配体–载剂对照的平均RFU)。

对于正向变构模式检测，使用以下公式计算调节百分比：

％调节＝100％x(测试样品的平均RFU–EC20对照的平均RFU)/(MAX对照配体的平均RFU–EC20对照的平均RFU)。

对于拮抗剂和负性变构调节模式检测，使用以下公式计算抑制百分比：

％抑制＝100％x(1-(测试样品的平均RFU–载剂对照的平均RFU)/(EC80对照的平均RFU–载剂对照的平均RFU))。

图1至图6显示了使用A2aR作为目标通过Eurofins DiscoverX公司(EurofinsDiscoverX Corporation)的GPCR筛选和分析服务得到的G蛋白偶联受体(GPCR)筛选结果。

在筛选时，A2aR的激活导致钙动员，其使用钙敏感染料监测。当钙释放时，染料的荧光增加，并对增加进行实时测量。

图1至图6显示了反应百分比(Y)与以μM计的浓度(X)的关系。用所要求的GPCR生物传感器检测以拮抗模式对化合物进行测试。对于拮抗剂检测，将数据标准化为在EC80配体和载剂存在下观察到的最大和最小应答。使用以下EC80浓度：ADORA2A钙流(CalciumFlux)：0.021μM NECA。

图1显示了式I化合物的结果。半最大抑制浓度(IC₅₀)为0.08851μM。

图2显示了式I化合物的结果。IC₅₀为0.07545μM。

图3显示了式III化合物的结果。IC₅₀为0.1438μM。

图4显示了式IV化合物伊曲茶碱的结果。IC₅₀为0.0667μM。

图5显示NECA结果。半最大有效浓度(EC₅₀)为0.007637μM。

图6显示SCH 442416结果。IC₅₀为0.0113μM。

结果总结

实施例2

式I、II、III和IV化合物的药代动力学数据。

给雄性CD-1小鼠1mg/kg单次快速静脉注射或3mg/kg口服的所示化合物，并测量血浆或脑浓度。

式I化合物的1mg/kg单次快速静脉注射(bolus i.v.)给药后的血浆浓度。

式I化合物的1mg/kg单次快速静脉注射给药后的脑浓度。

1a的1mg/kg单次快速静脉注射给药后的脑/血浆浓度比。

图7是显示式I化合物的血浆浓度和脑浓度随时间变化的图。

式I化合物3mg/kg口服给药后的血浆浓度。

图8是显示在式I化合物的1mg/kg静脉注射或3mg//kg口服给药后血浆浓度随时间变化的图。

式I化合物的血浆PK参数总结。

^a n/a表示不适用；并且^b由于从tlast外推到无穷的AUC％>20％，因此认为该值不准确。

式I化合物的脑PK参数总结。

^a由于从tlast外推到无穷的AUC％>20％，因此认为该值不准确。

对于式I化合物，静脉注射制剂和口服制剂的所测量投药溶液浓度分别为0.203mg/mL和0.296mg/mL。

其中：

C₀ 静脉注射剂量后外推至时间零的浓度

t_最大观察到最大浓度的时间

C_最大最大观察浓度

Apparent t_1/2 表观终末半衰期

AUC_0-tlast 浓度-时间曲线下从时间0到最后一个可测量浓度的时间的面积

AUC_0-inf 浓度-时间曲线下从时间0到无穷的面积

CL 总清除率

MRT_0-inf 时间0至无穷的平均停留时间

V_ss 稳态分布体积

F 口服生物利用度＝(剂量^静脉注射*AUC^口服)/(剂量^口服*AUC^静脉注射)*100

式II化合物的1mg/kg单次快速静脉注射给药后的血浆浓度。

式II化合物的1mg/kg单次快速静脉注射给药后的脑浓度。

式II化合物的1mg/kg单次快速静脉注射给药后的脑/血浆浓度比。

图9是显示式II化合物的血浆浓度和脑浓度随时间变化的图。

式II化合物3mg/kg口服给药后的血浆浓度。

图10是显示在式II化合物的1mg/kg静脉注射或3mg//kg口服给药后血浆浓度随时间变化的图。

式II化合物的血浆PK参数总结。

^a nc表示不可计算，因为t_最大＞第一时间点(0.0833小时)，可能是由于投给药后TA沉淀；并且^b n/a表示不适用。

式II化合物的脑PK参数总结。

参数	估算
		t_最大(小时)	0.0833
C_最大(ng/g)	473
		Apparent t_1/2(小时)	3.52
AUC_0-tlast(小时*ng/g)	856
		AUC_0-inf(小时*ng/g)	1076
MRT_0-inf(小时)	4.84
		脑/血浆AUC_0-inf比	0.739

对于式II化合物，静脉注射制剂和口服制剂的所测量投药溶液浓度分别为0.193mg/mL和0.299mg/mL。

式III化合物(SD-007)的1mg/kg单次快速静脉注射给药后的血浆浓度。

式III化合物的1mg/kg单次快速静脉注射给药后的脑浓度。

式III化合物的1mg/kg单次快速静脉注射给药后的脑/血浆浓度比。

图11是显示式III化合物的血浆浓度和脑浓度随时间变化的图。

式III化合物3mg/kg口服给药后的血浆浓度。

图12是显示在式III化合物的1mg/kg静脉注射或3mg//kg口服给药后血浆浓度随时间变化的图。

式III化合物的血浆PK参数总结。

式III化合物的脑PK参数总结。

参数	估算
		t_最大(小时)	0.0833
C_最大(ng/g)	414
		Apparent t_1/2(小时)	2.83
AUC_0-tlast(小时*ng/g)	1315
		AUC_0-inf(小时*ng/g)	1517
MRT_0-inf(小时)	3.94
		脑/血浆AUC_0-inf比	0.963

对于式III化合物，静脉注射制剂和口服制剂的所测量投药溶液浓度分别为0.196mg/mL和0.282mg/mL。

伊曲茶碱1mg/kg单次快速静脉注射给药后的血浆浓度。

伊曲茶碱1mg/kg单次快速静脉注射给药后的脑浓度。

伊曲茶碱的1mg/kg单次快速静脉注射给药后的脑/血浆浓度比。

图13是显示式IV化合物的血浆浓度和脑浓度随时间变化的图。

伊曲茶碱3mg/kg口服给药后的血浆浓度。

斜体的值低于定量下限水平(BLQ，0.5ng/mL)，但包含在计算中；BLQ表示低于较低定量水平(0.5ng/mL)；n/a表示不适用。

图14是显示在式IV化合物1mg/kg静脉注射或3mg//kg口服给药后血浆浓度随时间变化的图。

伊曲茶碱血浆pK参数的总结。

伊曲茶碱脑pK参数的总结。

对于式IV化合物，静脉注射制剂和口服制剂的所测量投药溶液浓度分别为0.221mg/mL和0.325mg/mL。

实施例3

在使用小鼠的抑郁症研究和强迫游泳试验中对式I、II、III和IV的化合物进行了测试。结果显示于图15和16中。

强迫游泳测试也被称为行为绝望测试，用于测试抑郁症样行为。测试包括将大鼠或小鼠放在填充水的筒内。“漂浮行为”(动物几乎保持不动，头部高于水面)被用作分析“绝望”和抑郁样行为的参数。服用抗抑郁药的啮齿动物比对照组游得更久。通过各种抗抑郁药减少不动时间。

40只雄性CD-1小鼠(每组N＝8只小鼠)在试验前1小时口服载剂(0.3％吐温80)或式I(目标1a)、II(目标1b)、III(SD-007)或IV(伊曲茶碱，KW-6002)的测试制品(1mg/kg)。在t＝0处，将小鼠置于填充水的玻璃筒中。在一段时间的剧烈活动后，小鼠会采取一种特征性的不动姿势，很容易评分。在6分钟的测试阶段中，记录第一次不动的潜伏期(以秒计算)。还测量了测试最后4分钟期间的不动持续时间(以秒计)。

式II在统计学上显著延迟了发生不动的时间(time to immobility)(单因素方差分析和Dunnett多重比较测试)。在不动时间(2-6分钟)中，观察到式II和IV的类似效果。因此，证明了这些化合物在减少抑郁样行为上的功效。

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