CN115873812A

CN115873812A - 适用于哺乳动物细胞表达系统的高活性和高热稳定性荧光素酶突变体

Info

Publication number: CN115873812A
Application number: CN202210904607.7A
Authority: CN
Inventors: 文丽瑛; 徐毅; 董海阳
Original assignee: Shanghai Institute of Technology
Current assignee: Shanghai Institute of Technology
Priority date: 2022-07-29
Filing date: 2022-07-29
Publication date: 2023-03-31
Anticipated expiration: 2042-07-29
Also published as: CN115873812B

Abstract

本发明公开了一种适用于哺乳动物细胞表达系统的高活性和高热稳定性荧光素酶突变体。本发明在密码子优化的萤火虫荧光素酶基础上利用理性设计的方法改造荧光素酶的分子结构，得到热稳定性和活性均提高的荧光素酶突变体，其突变体的氨基酸序列如SEQ ID NO.3‑5所示。编码其蛋白质的核苷酸序列如SEQID NO.6‑8所示。突变体包括双突变位点T214N T290P、T214N K28R和A532RT214N中的至少一个。本发明获得的荧光素酶突变体，相比现有技术，其在293细胞中能够高效表达，并且表达产物具有高活性和高热稳定性的特点。

Description

适用于哺乳动物细胞表达系统的高活性和高热稳定性荧光素酶突变体

技术领域

本发明涉及一种适用于哺乳动物细胞表达系统的高活性和高热稳定性荧光素酶突变体，属于基因工程技术领域。

背景技术

北美萤火虫(Photinus pyralis)中提取的荧光素酶的相对分子质量为60kDa，是由551个氨基酸残基构成的含有大量疏水氨基酸残基的单一多肽链。其由2个结构域组成，分别为N端结构域(1-436)和C端结构域(440-550)，通过中间的连接序列(436-440)联系在一起，两个结构域相对形成的裂口被认为是反应活性位点(薛秀花,黄晨西.荧光素酶基因的研究进展[J].生物学通报,2013,48(09):1-4；Zako T,Ayabe K,Aburatani T,etal.Luminescent and substrate binding activities of firefly luciferase N-terminal domain[J].BBA-Proteins and Proteomics,2003,1649(2):183-189.)。

荧光素酶的催化反应过程是：在氧气、ATP、Mg²⁺的条件下，荧光素酶催化底物荧光素氧化的同时发出荧光，此过程不需要激发光源，发光能量主要来自化学反应并且发光可持续一定的时间。因此，在科研、医药及食品行业等都有广泛的应用。

综合荧光素酶基因在科研和医药领域中的应用发现，其在基因表达、焦磷酸测序技术、药物筛选、标记微生物(示踪)、蛋白质相互作用研究、RNA干扰、标记细胞活体成像、检测细胞凋亡等多方面有广泛的应用。除此之外，荧光素酶在食品行业也具有广阔应用前景，因荧光素-荧光素酶发光体系灵敏度高，发光强度与体系中的ATP含量成正比，通过ATP的测定可以直接反应细胞或微生物的含量。随着荧光素酶的应用的普及，需求持续增多，研究具有高活性且对温度、pH耐受性良好，成本低廉的荧光素酶具有重要意义。

然而，野生型和重组型的荧光素酶很不稳定，当它们暴露于30℃，尤其是35℃以上时会迅速失去活性(许勇,张忠东,李静,王红萍,王娟,胡倩,赵娜娜.萤火虫Luc基因的克隆及生物信息学分析[J].生物技术,2020,30(04):328-334.DOI:10.16519/j.cnki.1004-311x.2020.04.0053.于浩然.理性设计改造荧光素酶的热稳定性[D].天津大学,2014.)。导致荧光素酶热稳定性差的原因如荧光素酶中大量的疏水氨基酸残基，二级结构中大量的无规则卷曲结构，荧光素酶结构中不含二硫键，这些都不利于维持蛋白质的结构稳定。制成试剂保存时易失活，因此对荧光素酶进行改造提高其活性和热稳定性在酶的应用上有重要的意义。近年来通过基因工程技术改造萤火虫荧光素酶的方法也已经成熟，如通过使用随机突变、半理性设计、理性设计、密码子优化等方法来探索酶的发光强度、稳定性、生物发光光学特性的变化规律等方面的特性，目前尽管在提高虫荧光素酶的稳定性及活性方面取得了一定进展，但目前该方面研究主要集中于西方国家。随着萤火虫荧光素酶在国内应用的普遍，非常有必要生产具有自主知识产权的高稳定性萤火虫荧光素酶。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是：现有的荧光素酶存在热稳定性较差、易失活、酶活不高等问题。

为了解决上述技术问题，本发明提供了一种萤火虫荧光素酶突变体所述萤火虫荧光素酶经过哺乳动物密码子优化，其野生型密码子优化后的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示；所述突变体包括双突变位点T214N T290P、T214N K28R和A532R T214N中的至少一个；

所述T214N T290P为第214和第290位的苏氨酸分别突变为天冬酰胺和脯氨酸；

所述T214N K28R为第214和第28位的苏氨酸和赖氨酸分别突变为天冬酰胺和精氨酸；

所述A532R T214N为第214和第532位的苏氨酸和丙氨酸分别突变为天冬酰胺和精氨酸。

其中，上述密码子优化的荧光素酶的氨基酸序列如下：

MEDAKNIKKGPAPFYPLEDGTAGEQLHKAMKRYALVPGTIAFTDAHIEVDITYAEYFEMSVRLAEAMKRYGLNTNHRIVVCSENSLQFFMPVLGALFIGVAVAPANDIYNERELLNSMGISQPTVVFVSKKGLQKILNVQKKLPIIQKIIIMDSKTDYQGFQSMYTFVTSHLPPGFNEYDFVPESFDRDKTIALIMNSSGSTGLPKGVALPHRTACVRFSHARDPIFGNQIIPDTAILSVVPFHHGFGMFTTLGYLICGFRVVLMYRFEEELFLRSLQDYKIQSALLVPTLFSFFAKSTLIDKYDLSNLHEIASGGAPLSKEVGEAVAKRFHLPGIRQGYGLTETTSAILITPEGDDKPGAVGKVVPFFEAKVVDLDTGKTLGVNQRGELCVRGPMIMSGYVNNPEATNALIDKDGWLHSGDIAYWDEDEHFFIVDRLKSLIKYKGYQVAPAELESILLQHPNIFDAGVAGLPDDDAGELPAAVVVLEHGKTMTEKEIVDYVASQVTTAKKLRGGVVFVDEVPKGLTGKLDARKIREILIKAKKGGKIAV(SEQ ID NO.1)；

上述密码子优化的荧光素酶的基因序列如下：

atggaggacgccaagaacatcaagaaggggcccgcccccttctaccccctggaggacggcacagccggcgagcagctgcacaaggccatgaagcggtacgccctggtgccaggcactatcgccttcaccgatgcccacattgaggtggatatcacatacgccgagtactttgagatgagcgtgcggctggccgaggccatgaagcggtacgggctgaacaccaaccaccggatcgtggtgtgcagcgagaactccctgcagttcttcatgcctgtgctgggcgccctgtttatcggggtggccgtggcccccgccaacgacatctacaacgagagggagctgttgaacagcatgggaatctcccagcccacagtggtgttcgtgagcaagaaggggctgcagaagattctgaacgtgcagaagaagctgccaatcatccagaagatcatcattatggactccaagacagactaccagggcttccagtccatgtacaccttcgtgacaagccacctcccccctggattcaacgagtacgacttcgtgcccgagtccttcgatagggataagaccatcgccctgatcatgaacagcagcggcagcacaggcctgcccaagggcgtggccctgccccaccggacagcctgcgtgcggtttagccacgccagggatcccattttcgggaaccagatcattcccgacaccgccattctgagcgtggtgcccttccaccacggctttggcatgttcacaaccctcgggtacctgatctgcgggttccgggtggtgctcatgtaccggttcgaggaggagctgttcctgaggagcctgcaggactacaagatccagtccgccctgctggtccccacactgttcagcttcttcgccaagtccaccctgattgataagtacgacctgtccaacctccacgagatcgcctccgggggggcccccctgagcaaggaggtgggcgaggccgtggccaagcggttccacctgccagggattaggcagggctacggcctgacagagaccaccagcgccatcctgatcactcctgagggggacgataagcctggggccgtgggcaaggtcgtgcccttcttcgaggccaaggtggtggacctggacacaggcaagacactgggcgtgaaccagcggggggagctgtgcgtgcgggggccaatgattatgagcggctacgtgaacaaccctgaggccacaaacgccctgatcgataaggatgggtggctccacagcggggatatcgcctactgggatgaggacgagcacttcttcatcgtggatagactgaagagcctgatcaagtacaaggggtaccaggtcgcccccgccgagctggagagcatcctgctgcagcaccctaacatttttgatgccggcgtggccggcctgcccgatgatgacgccggcgagctccccgccgccgtggtggtgctggagcacggcaagaccatgacagagaaggagatcgtggactacgtggccagccaggtgacaaccgccaagaagctgaggggcggggtggtgttcgtggatgaggtgcctaagggcctgacagggaagctggacgccaggaagattagggagatcctgatcaaggccaagaagggcggcaagatcgccgtgtga(SEQ IDNO.2)；

优选地，所述突变体的氨基酸序列如SEQ ID NO.3-5所示。

其中，T214N T290P突变体的氨基酸序列如下：

MEDAKNIKKGPAPFYPLEDGTAGEQLHKAMKRYALVPGTIAFTDAHIEVDITYAEYFEMSVRLAEAMKRYGLNTNHRIVVCSENSLQFFMPVLGALFIGVAVAPANDIYNERELLNSMGISQPTVVFVSKKGLQKILNVQKKLPIIQKIIIMDSKTDYQGFQSMYTFVTSHLPPGFNEYDFVPESFDRDKTIALIMNSSGSTGLPKGVALPHRNACVRFSHARDPIFGNQIIPDTAILSVVPFHHGFGMFTTLGYLICGFRVVLMYRFEEELFLRSLQDYKIQSALLVPPLFSFFAKSTLIDKYDLSNLHEIASGGAPLSKEVGEAVAKRFHLPGIRQGYGLTETTSAILITPEGDDKPGAVGKVVPFFEAKVVDLDTGKTLGVNQRGELCVRGPMIMSGYVNNPEATNALIDKDGWLHSGDIAYWDEDEHFFIVDRLKSLIKYKGYQVAPAELESILLQHPNIFDAGVAGLPDDDAGELPAAVVVLEHGKTMTEKEIVDYVASQVTTAKKLRGGVVFVDEVPKGLTGKLDARKIREILIKAKKGGKIAV(SEQ ID NO.3)；

T214N K28R突变体的氨基酸序列如下：

MEDAKNIKKGPAPFYPLEDGTAGEQLHRAMKRYALVPGTIAFTDAHIEVDITYAEYFEMSVRLAEAMKRYGLNTNHRIVVCSENSLQFFMPVLGALFIGVAVAPANDIYNERELLNSMGISQPTVVFVSKKGLQKILNVQKKLPIIQKIIIMDSKTDYQGFQSMYTFVTSHLPPGFNEYDFVPESFDRDKTIALIMNSSGSTGLPKGVALPHRNACVRFSHARDPIFGNQIIPDTAILSVVPFHHGFGMFTTLGYLICGFRVVLMYRFEEELFLRSLQDYKIQSALLVPTLFSFFAKSTLIDKYDLSNLHEIASGGAPLSKEVGEAVAKRFHLPGIRQGYGLTETTSAILITPEGDDKPGAVGKVVPFFEAKVVDLDTGKTLGVNQRGELCVRGPMIMSGYVNNPEATNALIDKDGWLHSGDIAYWDEDEHFFIVDRLKSLIKYKGYQVAPAELESILLQHPNIFDAGVAGLPDDDAGELPAAVVVLEHGKTMTEKEIVDYVASQVTTAKKLRGGVVFVDEVPKGLTGKLDARKIREILIKAKKGGKIAV(SEQ ID NO.4)；

A532R T214N突变体的氨基酸序列如下：

MEDAKNIKKGPAPFYPLEDGTAGEQLHKAMKRYALVPGTIAFTDAHIEVDITYAEYFEMSVRLAEAMKRYGLNTNHRIVVCSENSLQFFMPVLGALFIGVAVAPANDIYNERELLNSMGISQPTVVFVSKKGLQKILNVQKKLPIIQKIIIMDSKTDYQGFQSMYTFVTSHLPPGFNEYDFVPESFDRDKTIALIMNSSGSTGLPKGVALPHRNACVRFSHARDPIFGNQIIPDTAILSVVPFHHGFGMFTTLGYLICGFRVVLMYRFEEELFLRSLQDYKIQSALLVPTLFSFFAKSTLIDKYDLSNLHEIASGGAPLSKEVGEAVAKRFHLPGIRQGYGLTETTSAILITPEGDDKPGAVGKVVPFFEAKVVDLDTGKTLGVNQRGELCVRGPMIMSGYVNNPEATNALIDKDGWLHSGDIAYWDEDEHFFIVDRLKSLIKYKGYQVAPAELESILLQHPNIFDAGVAGLPDDDAGELPAAVVVLEHGKTMTEKEIVDYVASQVTTAKKLRGGVVFVDEVPKGLTGKLDRRKIREILIKAKKGGKIAV(SEQ ID NO.5)。

本发明还提供了一种编码上述的萤火虫荧光素酶突变体的基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO.6-8所示。

其中，T214N T290P突变体的核苷酸序列如下：

atggaggacgccaagaacatcaagaaggggcccgcccccttctaccccctggaggacggcacagccggcgagcagctgcacaaggccatgaagcggtacgccctggtgccaggcactatcgccttcaccgatgcccacattgaggtggatatcacatacgccgagtactttgagatgagcgtgcggctggccgaggccatgaagcggtacgggctgaacaccaaccaccggatcgtggtgtgcagcgagaactccctgcagttcttcatgcctgtgctgggcgccctgtttatcggggtggccgtggcccccgccaacgacatctacaacgagagggagctgttgaacagcatgggaatctcccagcccacagtggtgttcgtgagcaagaaggggctgcagaagattctgaacgtgcagaagaagctgccaatcatccagaagatcatcattatggactccaagacagactaccagggcttccagtccatgtacaccttcgtgacaagccacctcccccctggattcaacgagtacgacttcgtgcccgagtccttcgatagggataagaccatcgccctgatcatgaacagcagcggcagcacaggcctgcccaagggcgtggccctgccccaccggaacgcctgcgtgcggtttagccacgccagggatcccattttcgggaaccagatcattcccgacaccgccattctgagcgtggtgcccttccaccacggctttggcatgttcacaaccctcgggtacctgatctgcgggttccgggtggtgctcatgtaccggttcgaggaggagctgttcctgaggagcctgcaggactacaagatccagtccgccctgctggtcccccccctgttcagcttcttcgccaagtccaccctgattgataagtacgacctgtccaacctccacgagatcgcctccgggggggcccccctgagcaaggaggtgggcgaggccgtggccaagcggttccacctgccagggattaggcagggctacggcctgacagagaccaccagcgccatcctgatcactcctgagggggacgataagcctggggccgtgggcaaggtcgtgcccttcttcgaggccaaggtggtggacctggacacaggcaagacactgggcgtgaaccagcggggggagctgtgcgtgcgggggccaatgattatgagcggctacgtgaacaaccctgaggccacaaacgccctgatcgataaggatgggtggctccacagcggggatatcgcctactgggatgaggacgagcacttcttcatcgtggatagactgaagagcctgatcaagtacaaggggtaccaggtcgcccccgccgagctggagagcatcctgctgcagcaccctaacatttttgatgccggcgtggccggcctgcccgatgatgacgccggcgagctccccgccgccgtggtggtgctggagcacggcaagaccatgacagagaaggagatcgtggactacgtggccagccaggtgacaaccgccaagaagctgaggggcggggtggtgttcgtggatgaggtgcctaagggcctgacagggaagctggacgccaggaagattagggagatcctgatcaaggccaagaagggcggcaagatcgccgtgtga(SEQ IDNO.6)；

T214N K28R突变体的核苷酸序列如下：

atggaggacgccaagaacatcaagaaggggcccgcccccttctaccccctggaggacggcacagccggcgagcagctgcacagggccatgaagcggtacgccctggtgccaggcactatcgccttcaccgatgcccacattgaggtggatatcacatacgccgagtactttgagatgagcgtgcggctggccgaggccatgaagcggtacgggctgaacaccaaccaccggatcgtggtgtgcagcgagaactccctgcagttcttcatgcctgtgctgggcgccctgtttatcggggtggccgtggcccccgccaacgacatctacaacgagagggagctgttgaacagcatgggaatctcccagcccacagtggtgttcgtgagcaagaaggggctgcagaagattctgaacgtgcagaagaagctgccaatcatccagaagatcatcattatggactccaagacagactaccagggcttccagtccatgtacaccttcgtgacaagccacctcccccctggattcaacgagtacgacttcgtgcccgagtccttcgatagggataagaccatcgccctgatcatgaacagcagcggcagcacaggcctgcccaagggcgtggccctgccccaccggaacgcctgcgtgcggtttagccacgccagggatcccattttcgggaaccagatcattcccgacaccgccattctgagcgtggtgcccttccaccacggctttggcatgttcacaaccctcgggtacctgatctgcgggttccgggtggtgctcatgtaccggttcgaggaggagctgttcctgaggagcctgcaggactacaagatccagtccgccctgctggtccccacactgttcagcttcttcgccaagtccaccctgattgataagtacgacctgtccaacctccacgagatcgcctccgggggggcccccctgagcaaggaggtgggcgaggccgtggccaagcggttccacctgccagggattaggcagggctacggcctgacagagaccaccagcgccatcctgatcactcctgagggggacgataagcctggggccgtgggcaaggtcgtgcccttcttcgaggccaaggtggtggacctggacacaggcaagacactgggcgtgaaccagcggggggagctgtgcgtgcgggggccaatgattatgagcggctacgtgaacaaccctgaggccacaaacgccctgatcgataaggatgggtggctccacagcggggatatcgcctactgggatgaggacgagcacttcttcatcgtggatagactgaagagcctgatcaagtacaaggggtaccaggtcgcccccgccgagctggagagcatcctgctgcagcaccctaacatttttgatgccggcgtggccggcctgcccgatgatgacgccggcgagctccccgccgccgtggtggtgctggagcacggcaagaccatgacagagaaggagatcgtggactacgtggccagccaggtgacaaccgccaagaagctgaggggcggggtggtgttcgtggatgaggtgcctaagggcctgacagggaagctggacgccaggaagattagggagatcctgatcaaggccaagaagggcggcaagatcgccgtgtga(SEQ IDNO.7)；

A532R T214N突变体的核苷酸序列如下：

atggaggacgccaagaacatcaagaaggggcccgcccccttctaccccctggaggacggcacagccggcgagcagctgcacaaggccatgaagcggtacgccctggtgccaggcactatcgccttcaccgatgcccacattgaggtggatatcacatacgccgagtactttgagatgagcgtgcggctggccgaggccatgaagcggtacgggctgaacaccaaccaccggatcgtggtgtgcagcgagaactccctgcagttcttcatgcctgtgctgggcgccctgtttatcggggtggccgtggcccccgccaacgacatctacaacgagagggagctgttgaacagcatgggaatctcccagcccacagtggtgttcgtgagcaagaaggggctgcagaagattctgaacgtgcagaagaagctgccaatcatccagaagatcatcattatggactccaagacagactaccagggcttccagtccatgtacaccttcgtgacaagccacctcccccctggattcaacgagtacgacttcgtgcccgagtccttcgatagggataagaccatcgccctgatcatgaacagcagcggcagcacaggcctgcccaagggcgtggccctgccccaccggaacgcctgcgtgcggtttagccacgccagggatcccattttcgggaaccagatcattcccgacaccgccattctgagcgtggtgcccttccaccacggctttggcatgttcacaaccctcgggtacctgatctgcgggttccgggtggtgctcatgtaccggttcgaggaggagctgttcctgaggagcctgcaggactacaagatccagtccgccctgctggtccccacactgttcagcttcttcgccaagtccaccctgattgataagtacgacctgtccaacctccacgagatcgcctccgggggggcccccctgagcaaggaggtgggcgaggccgtggccaagcggttccacctgccagggattaggcagggctacggcctgacagagaccaccagcgccatcctgatcactcctgagggggacgataagcctggggccgtgggcaaggtcgtgcccttcttcgaggccaaggtggtggacctggacacaggcaagacactgggcgtgaaccagcggggggagctgtgcgtgcgggggccaatgattatgagcggctacgtgaacaaccctgaggccacaaacgccctgatcgataaggatgggtggctccacagcggggatatcgcctactgggatgaggacgagcacttcttcatcgtggatagactgaagagcctgatcaagtacaaggggtaccaggtcgcccccgccgagctggagagcatcctgctgcagcaccctaacatttttgatgccggcgtggccggcctgcccgatgatgacgccggcgagctccccgccgccgtggtggtgctggagcacggcaagaccatgacagagaaggagatcgtggactacgtggccagccaggtgacaaccgccaagaagctgaggggcggggtggtgttcgtggatgaggtgcctaagggcctgacagggaagctggacaggaggaagattagggagatcctgatcaaggccaagaagggcggcaagatcgccgtgtga(SEQ IDNO.8)。

本发明还提供了一种含有上述的基因的重组载体、重组菌或蛋白表达宿主细胞。

优选地，所述的重组载体是通过将包含密码子优化Luc基因的载体进行定点突变得到，所述定点突变是通过反向PCR将密码子优化后的北美萤火虫荧光素酶(P.Pyralisluciferase)基因上第214和第290位的苏氨酸密码子分别改变成天冬酰胺和脯氨酸的密码子，第214和第28位的苏氨酸和赖氨酸密码子分别改变成天冬酰胺和精氨酸的密码子，或第214和第532位的苏氨酸和丙氨酸密码子分别改变成天冬酰胺和精氨酸的密码子；

所述的重组菌是将上述的重组载体转化进入大肠杆菌stbl3中得到；

所述的蛋白表达宿主细胞是将上述的重组载体转入293细胞中得到。

本发明还提供了上述的突变体，上述的基因，上述的表达载体重组载体、重组菌或蛋白表达宿主细胞在制备荧光素酶检测试剂中的应用。

本发明与现有技术相比，具有如下有益效果：

(1)本发明从理性设计(基于共识序列和表面氨基酸替换)改造萤火虫荧光素酶的分子结构入手，得到了热稳定性和酶活性均提高的荧光素酶突变体；本发明获得的荧光素酶突变体发光强度高：同等条件下，经过本发明改造后获得的荧光素酶突变体与野生型相比，发光强度有所提高，表现出酶活性的提高；其中，T214N K28R、A532R T214N、T214NT290P双位点组合突变体酶活性相比野生型分别提高了1.6、1.4、1.0倍；

(2)本发明获得的荧光素酶突变体热稳定性好：野生型及codon opt在35℃金属浴5min后酶活性不到25％，发光强度很弱，T214N T290P、A532R T214N、T214N K28R在35℃金属浴5min后还分别有89％、79％、74％左右的发光强度，T214N T290P在40℃金属浴5min后还有20％左右的发光强度；在同等测定条件下，野生型荧光素酶在35℃金属浴10min后发光强度降到原来的3％不到，时间越久，发光强度越弱，T214N T290P、T214N K28R、A532RT214N组合突变体在35℃金属25min后仍有28％、13％和12％左右的发光强度。

附图说明

图1为本发明的萤火虫荧光素酶突变体重组质粒构建所用的载体图谱；

图2为萤火虫荧光素酶突变体重组质粒的双酶切验证图；

图3为野生型萤火虫荧光素酶与突变体发光强度比较示意图；WT:野生型荧光素酶，codon opt：密码子优化的荧光素酶；

图4为本发明的萤火虫荧光素酶突变体与野生型在35℃金属浴不同时间后的热稳定性比较；具体为将野生型萤火虫荧光素酶与改造的荧光素酶分别在35℃金属浴5min，10min，15min，20min，25min后置于冰上，待冷却后同等条件下测定荧光素酶的发光情况，与金属浴前的发光强度进行比较；WT:野生型荧光素酶，codon opt：密码子优化的荧光素酶，con：空白对照；

图5为本发明的突变酶与野生型萤火虫荧光素酶在不同温度下的热稳定性比较，具体为将野生型萤火虫荧光素酶与改造的荧光素酶分别在25℃，30℃，35℃，40℃中金属浴5min后置于冰上，待冷却后同等条件下测定金属浴后的荧光素酶发光情况，与金属浴前的发光强度进行比较；WT:野生型荧光素酶，codon opt：密码子优化的荧光素酶，con：空白对照。

具体实施方式

为使本发明更明显易懂，兹以优选实施例，并配合附图作详细说明如下。

实施例1：荧光素酶哺乳密码子优化及其突变体构建

1、哺乳动物密码子优化载体构建

载体PGL3-basic-Rluc-IRES-MCS使用XhoI和XbaI双酶切，将PGL3-basic载体上的北美萤火虫(P.Pyralis)基因luc经过哺乳动物密码子优化后由生工生物工程(上海)股份有限公司合成(SEQ ID NO:2)，使用XhoI和XbaI双酶切并连接至酶切后的线性PGL3-basic-Rluc-IRES-MCS载体(来自吉满生物科技(上海)有限公司公司)上，命名为PGL3-basic-Rluc-IRES-Luc(codon opt)。采用IRES-F、48256W1F-61161、48256W2F-61162和48256W3F-61163测序引物对Luc(codon opt)序列进行测序，测序由生工生物工程(上海)股份有限公司完成。测序结果显示，PGL3-basic-Rluc-IRES-Luc(codon opt)插入基因序列与SEQ IDNO:2所示序列相同。酶切鉴定显示重组载体长度正确。

2、荧光素酶双位点组合突变体构建

使用Consensus Finder(http://kazlab.umn.edu/)和GETAREA(http://curie.utmb.edu/getarea.html)预测稳定性提高的萤火虫荧光素酶突变位点。首先针对突变点设计含有同源臂的一对突变引物，然后通过引物扩增出突变后序列，并使用无缝克隆试剂盒将其重新重组为环；将重组产物转入制备好的细菌感受态细胞，对长出的单克隆菌落送测序公司进行测序鉴定，比对正确的克隆即为构建成功的载体。具体步骤如下：

以PGL3-basic-Rluc-IRES-Luc(codon opt)质粒为模板，设计PCR扩增引物，通过反向PCR的方法获得PCR产物，然后进行无缝克隆连接；PCR产物及其使用的扩增引物命名如下表：

反向PCR具体实施例，如以PGL3-basic-Rluc-IRES-Luc(codon opt)质粒为模板，使用Luc(T214N T290P)-F1和Luc(T214N T290P)-R1引物扩增得到产物Luc(T214N T290P)-PW1，以PGL3-basic-Rluc-IRES-Luc(codon opt)为模板，使用Luc(T214N T290P)-F2和Luc(T214N T290P)-R2引物扩增得到产物Luc(T214N T290P)-PW2；以PGL3-basic-Rluc-IRES-Luc(codon opt)质粒为模板，使用Luc(T214N K28R)-F1和Luc(T214N K28R)-R1引物扩增得到产物Luc(T214N K28R)-PW1，以PGL3-basic-Rluc-IRES-Luc(codon opt)质粒为模板，使用Luc(T214N K28R)-F2和Luc(T214N K28R)-R2引物扩增得到产物Luc(T214N K28R)-PW2；以PGL3-basic-Rluc-IRES-Luc(codon opt)质粒为模板，使用Luc(A532R T214N)-F1和Luc(A532R T214N)-R1引物扩增得到产物Luc(A532R T214N)-PW1，以PGL3-basic-Rluc-IRES-Luc(codon opt)质粒为模板，使用Luc(A532R T214N)-F2和Luc(A532R T214N)-R2引物扩增得到产物Luc(A532R T214N)-PW2；

PCR体系为：10×PCR Buffer for KOD-Plus-Neo 5μL，KOD-Plus-Neo(1.0U/μL)1μL，2mM dNTPs 5μL，25mM MgSO₄ 3μL，质粒模板1μL(10ng/μL)，引物(10μM each)1.5μL，ddH₂O29μL。PCR反应进程为：1)94℃预变性2min；2)98℃变性10s；3)68℃退火30s；4)72℃延伸1min；步骤2)-4)重复29个循环；5)72℃继续延伸30s，冷却至4℃。胶回收PCR产物。

无缝克隆连接：使用Hieff clone^TM Plus One Step Cloning Kit一步快速克隆试剂盒(来源于Yeasen)将上述得到的PCR产物进行无缝克隆连接。

连接反应体系如下：5×CE Buffer 4μL，PCR产物1 0.5μL，PCR产物2 0.5μL，无缝克隆酶2μL，ddH₂O 13μL，于50℃连接20min。然后转化到大肠杆菌stbl3菌株，涂含有50mg/L氨苄青霉素的LB培养基平皿，分离抗氨苄青霉素的转化体，提质粒，通过质粒大小(6863bp左右)和双酶切鉴定判断。具体实施例中PCR产物包括Luc(T214N T290P)-PW1、Luc(T214NT290P)-PW2、Luc(T214NK28R)-PW1、Luc(T214N K28R)-PW2、Luc(A532R T214N)-PW1、Luc(A532RT214N)-PW2。

双酶切鉴定胶图见图2；

测序：将构建好的3个双位点组合突变体质粒使用测序引物送生工公司进行测序，测序比对显示目的区域正确。采用IRES-F、48256W1F-61161、48256W2F-61162和48256W3F-61163对PGL3-basic-Rluc-IRES-Luc(codon opt)进行测序。

将构建好的3个双位点位点组合突变体命名为PGL3-basic-Rluc-IRES-Luc(T214NT290P)、PGL3-basic-Rluc-IRES-Luc(T214NK28R)、PGL3-basic-Rluc-IRES-Luc(A532RT214N)。

其中，上述各步骤引物序列如下：

1)PCR扩增引物序列

Luc(T214N T290P)-F1：

CTGCCCCACCGGAACGCCTGCGTGCGGTTTAGCC(SEQ ID NO.9)；

Luc(T214N T290P)-R1：

AAGAAGCTGAACAGGGGGGGGACCAGCAGGGCGGAC(SEQ ID NO.10)；

Luc(T214N T290P)-F2：

CCCCCCTGTTCAGCTTCTTCGCCAAGTC(SEQ ID NO.11)；

Luc(T214N T290P)-R2：

GTTCCGGTGGGGCAGGGCCAC(SEQ ID NO.12)；

Luc(T214N K28R)-F1：

AGCTGCACAGGGCCATGAAGCGGTACGCCCT(SEQ ID NO.13)；

Luc(T214N K28R)-R1：

GTTCCGGTGGGGCAGGGCCAC(SEQ ID NO.14)；

Luc(T214N K28R)-F2：

CTGCCCCACCGGAACGCCTGCGTGCGGTTTAGCC(SEQ ID NO.15)；

Luc(T214N K28R)-R2：

CATGGCCCTGTGCAGCTGCTCGCCG(SEQ ID NO.16)；

Luc(A532R T214N)-F1：

CCACCGGAACGCCTGCGTGCGGTTTAGCC(SEQ ID NO.17)；

Luc(A532R T214N)-R1：

CTAATCTTCCTCCTGTCCAGCTTCCCTGTCAGGC(SEQ ID NO.18)；

Luc(A532R T214N)-F2：

GGACAGGAGGAAGATTAGGGAGATCCTGATCAAGG(SEQ ID NO.19)；

Luc(A532R T214N)-R2：

CAGGCGTTCCGGTGGGGCAGGGCCAC(SEQ ID NO.20)。

2)测序引物序列

IRES-F：TCACCTCAAGCGTATTCAAC(SEQ ID NO.21)；

48256W1F-61161：GTTGAACAGCATGGGAATCTCC(SEQ ID NO.22)；

48256W2F-61162：GACTACAAGATCCAGTCCGCC(SEQ ID NO.23)；

48256W3F-61163：GTGGATAGACTGAAGAGCCTGATC(SEQ ID NO.24)。

实施例2：HEK-293细胞培养、野生型荧光素酶优化体及其突变基因的表达

1、HEK-293细胞培养：为贴壁依赖型成上皮样细胞，生长条件为DMEM+10FBS+1％P/S，培养环境为：空气95％+二氧化碳(CO₂)5％。

2、质粒瞬转细胞及表达：

1)HEK-293细胞铺板：转染前一天，将状态良好，处于对数生长期的空白细胞用0.25％胰酶消化，用完全培养基悬浮成单细胞悬液，细胞计数后，接种于24孔板培养板中，当细胞长到70％～80％时准备转染。

2)转染2h前换液为新鲜的培养基。取无菌的1.5mL EP管，转染体系按下表：

组分	量
		opti-MEM	50μL
pRL-TK	50ng
		目的质粒	500ng
HG transgene reagent	1.5μg

其中，内参：目的质粒＝1:9；

取2支EP管，各加25μL的opti-MEM，一支EP管加上述质粒混匀，另外一支EP管加1.5μg HG transgene reagent转染试剂混匀，各自室温孵育5min后将两管液体混匀，室温放置15min-20min后，滴加到提前换过液的培养板中，后置于CO₂培养箱中培养。

3)转染后48h收样检测。

3、酶的收集：

1)转染后从培养箱中取靶细胞，轻轻吸净培养液，PBS洗涤2次。

2)弃去PBS，每孔加入100μL(对应孔板体系)的Cell Lysis buffer细胞裂解液。

3)细胞裂解后，将样品酶转移入Ep管中，-80度冰箱保存。

实施例3：野生型萤火虫荧光素酶及突变型酶ATP标准液体系活性测定

根据报告基因检测试剂盒(由吉满生物科技有限公司提供)说明书操作进行检测。

将实施例2得到的酶液，10,000-15,000rpm离心3-5min。离心后将上清液移入新的EP管进行荧光素酶检测。配制100μL的荧光素酶活性测定体系(20μL荧光素酶，15nM荧光素，40pM ATP，200mMHepes，3mM EDTA，2mM MgSO₄，pH 7.6)，使用SpectraMax L化学发光型酶标仪迅速测定发光强度。

检测方法为：1)按照仪器说明书要求将荧光检测打开，设定参数，测定时间为10s，测定间隔为2s。2)将样品按照20μL的体积加入测量管中(保持每次样品的加样量一致)，另外加入20μL Firefly Luciferase Assay Reagent混匀2-3次(不能漩涡混匀)，充分混匀后测定RLU(Relative light unit)，同时设置Cell Lysis buffer为空白对照孔。3)将检测后的样品，加入20μL配制的Renilla Luciferase Assay工作液混匀2-3次，充分混匀后测定RLU。4)将2)检测的RLU值与3)检测出的RLU值进行比较，通过得出的比值来确定报告基因的荧光强度。

结论：如图3结果显示，同等条件下，经过本发明改造后获得的荧光素酶突变体与野生型相比，发光强度有所提高，表现出酶活性的提高。一些具体实施例中，双位点组合突变体T214N K28R、A532R T214N、T214N T290P的酶活性相比野生型分别提高了1.6、1.4、1.0倍。

实施例4：双位点组合突变体稳定性评估

1、测定荧光素酶35℃金属浴不同时间后的热稳定性：

测定方法：取50μL荧光素酶裂解液，35℃下放置60min，每隔5min取出一定量样品冰浴10min，而后在室温下测定酶活，测定进行三次，取平均值后计算酶的残留活性。空白细胞裂解液作为对照；

结论：如图4结果显示，野生型和codon opt在10min后发光强度降至原来的3％不到，随着金属浴时间的加长，发光性能也几乎散失，而T214N T290P、T214N K28R、A532RT214N在35℃金属浴25min后仍有28％、13％和12％左右的发光强度，这对荧光素酶可以用于固相免疫分析等有着重要意义。

2、测定不同温度下萤火虫荧光素酶的热稳定性：

测定方法：野生型酶与突变型酶分别放置在25℃，30℃，35℃，40℃，45℃金属浴中，5min后置于冰上，10min后测定发光强度，计算其残留活性。空白细胞裂解液作为对照；

结论：如图5所示，可以发现野生型和突变型荧光素酶的发光强度都随着金属浴温度的增加而降低。结果显示，野生型和codon opt在35℃金属浴后发光强度降至原来的25％不到，而T214N T290P、T214N K28R、A532R T214N在35℃金属浴5min后还分别有89％、74％、79％左右的发光强度，T214N T290P在45℃金属浴5min后还有20％左右的发光强度；

结合上述热稳定性分析结果，可以知道将北美萤火虫荧光素酶的第214和290位的氨基酸的T分别突变为N和P，第214和28位的氨基酸的T和K分别突变为N和R，第532和214位的氨基酸的A和T分别突变为R和N，能够有效的提高酶的热稳定性和活性。

Claims

1.一种萤火虫荧光素酶突变体，其特征在于，所述萤火虫荧光素酶经过哺乳动物密码子优化，其野生型密码子优化后的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，核苷酸序列如SEQ IDNO.2所示；所述突变体包括双突变位点T214N T290P、T214N K28R和A532R T214N中的至少一个；

2.根据权利要求1所述的萤火虫荧光素酶突变体，其特征在于，所述突变体的氨基酸序列如SEQ ID NO.3-5所示。

3.一种编码权利要求2所述的萤火虫荧光素酶突变体的基因，其特征在于，其核苷酸序列如SEQ ID NO.6-8所示。

4.一种含有权利要求3所述的基因的重组载体、重组菌或蛋白表达宿主细胞。

5.根据权利要求4所述的重组载体、重组菌或蛋白表达宿主细胞，其特征在于，所述的重组载体是通过将包含密码子优化Luc基因的载体进行定点突变得到，所述定点突变是通过反向PCR将密码子优化后的北美萤火虫荧光素酶P.Pyralis luciferase基因上第214和第290位的苏氨酸密码子分别改变成天冬酰胺和脯氨酸的密码子，第214和第28位的苏氨酸和赖氨酸密码子分别改变成天冬酰胺和精氨酸的密码子，或第214和第532位的苏氨酸和丙氨酸密码子分别改变成天冬酰胺和精氨酸的密码子；

6.权利要求1或2所述的突变体，权利要求3所述的基因，权利要求4所述的表达载体重组载体、重组菌或蛋白表达宿主细胞在制备荧光素酶检测试剂中的应用。