[go: up one dir, main page]

CN117327670A - 一种用于哺乳动物细胞表达的荧光素酶及其应用 - Google Patents

一种用于哺乳动物细胞表达的荧光素酶及其应用 Download PDF

Info

Publication number
CN117327670A
CN117327670A CN202311344338.4A CN202311344338A CN117327670A CN 117327670 A CN117327670 A CN 117327670A CN 202311344338 A CN202311344338 A CN 202311344338A CN 117327670 A CN117327670 A CN 117327670A
Authority
CN
China
Prior art keywords
luciferase
mutant
vector
recombinant
application
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN202311344338.4A
Other languages
English (en)
Inventor
文丽瑛
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Genomedi Tech Shanghai Co ltd
Original Assignee
Genomedi Tech Shanghai Co ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Genomedi Tech Shanghai Co ltd filed Critical Genomedi Tech Shanghai Co ltd
Priority to CN202311344338.4A priority Critical patent/CN117327670A/zh
Publication of CN117327670A publication Critical patent/CN117327670A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/0004—Oxidoreductases (1.)
    • C12N9/0069—Oxidoreductases (1.) acting on single donors with incorporation of molecular oxygen, i.e. oxygenases (1.13)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/70—Vectors or expression systems specially adapted for E. coli
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C12N5/0602—Vertebrate cells
    • C12N5/0684—Cells of the urinary tract or kidneys
    • C12N5/0686—Kidney cells
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/66—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving luciferase
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y113/00—Oxidoreductases acting on single donors with incorporation of molecular oxygen (oxygenases) (1.13)
    • C12Y113/12—Oxidoreductases acting on single donors with incorporation of molecular oxygen (oxygenases) (1.13) with incorporation of one atom of oxygen (internal monooxygenases or internal mixed function oxidases)(1.13.12)
    • C12Y113/12007—Photinus-luciferin 4-monooxygenase (ATP-hydrolysing) (1.13.12.7), i.e. firefly-luciferase
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2510/00—Genetically modified cells
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2800/00—Nucleic acids vectors
    • C12N2800/10—Plasmid DNA
    • C12N2800/106—Plasmid DNA for vertebrates
    • C12N2800/107—Plasmid DNA for vertebrates for mammalian
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
    • G01N2333/90—Enzymes; Proenzymes
    • G01N2333/902—Oxidoreductases (1.)
    • G01N2333/90241—Oxidoreductases (1.) acting on single donors with incorporation of molecular oxygen, i.e. oxygenases (1.13)

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Enzymes And Modification Thereof (AREA)

Abstract

本申请公开了一种用于哺乳动物细胞表达的荧光素酶及其应用。一方面，本申请提供一种用于哺乳动物细胞表达的荧光素酶，所述荧光素酶的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，所述荧光素酶的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。第二方面，本申请还提供了上述用于哺乳动物细胞表达的荧光素酶的突变体，突变位点包括第530位的亮氨酸、第214位的苏氨酸和第290位的苏氨酸。此外，本申请还提供了上述荧光素酶、荧光素酶突变体，以及其制备的重组载体、重组菌或蛋白表达宿主细胞的应用。本申请的荧光素酶和荧光素酶突变体的酶活性较高，不易失活，热稳定性较好，成本也相对低廉。

Description

一种用于哺乳动物细胞表达的荧光素酶及其应用
技术领域
本申请涉及基因工程技术领域，尤其涉及一种用于哺乳动物细胞表达的荧光素酶及其应用。
背景技术
萤光素酶是自然界中能够产生生物荧光的酶的统称，荧光素酶可以催化荧光素氧化成氧化荧光素，在荧光素氧化的过程中，会发出生物荧光。目前，现有技术应用最多的荧光素酶，是一种从北美萤火虫（Photinus pyralis）体内提取的荧光素酶。这种荧光素酶的相对分子质量为60kDa，是由551个氨基酸残基构成的含有大量疏水氨基酸残基的单一多肽链。该荧光素酶由2个结构域组成，分别为N端结构域（1~436）和C端结构域（440~550），通过中间的连接序列（436~440）联系在一起，两个结构域相对形成的裂口被认为是反应活性位点。
北美萤火虫荧光素酶的发光原理是：在氧气、ATP、Mg2+的条件下，荧光素酶催化底物荧光素氧化的同时发出荧光，此过程不需要激发光源，发光能量主要来自化学反应并且发光可持续一定的时间。目前，北美萤火虫荧光素酶在基因表达、焦磷酸测序技术、药物筛选、标记微生物（示踪）、蛋白质相互作用研究、RNA干扰、标记细胞活体成像、检测细胞凋亡等多方面有广泛的应用。此外，由于北美萤火虫荧光素酶的荧光素-荧光素酶发光体系，灵敏度高，发光强度与体系中的ATP含量成正比，通过ATP的测定可以直接反应细胞或微生物的含量，该荧光素酶在食品行业也具有广阔应用前景。
现有的北美萤火虫荧光素酶，无论是野生型还是突变型，其热稳定性均较差，使用温度超过30℃，尤其是35℃以上时，北美萤火虫荧光素酶会迅速失去活性。北美萤火虫荧光素酶的酶活性和发光持久性也存在缺陷，酶活性并不高，使用时发光强度不足，持续发光时间也较短。目前，现有技术通过随机突变、半理性设计、理性设计、密码子优化等方法，对北美萤火虫荧光素酶进行改造，以提升其上述性能，然而进展有限。
发明内容
为了解决上述至少一种技术问题，开发一种酶活性较高，不易失活，热稳定性较好，且成本相对低廉的荧光素酶，本申请提供一种用于哺乳动物细胞表达的荧光素酶及其应用。
一方面，本申请提供一种用于哺乳动物细胞表达的荧光素酶，所述荧光素酶的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，所述荧光素酶的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。
通过采用上述技术方案，本申请设计了一种荧光素酶，对现有野生型北美萤火虫荧光素酶进行了针对哺乳动物的密码子优化，改造了萤火虫荧光素酶的分子结构，本申请改造后的荧光素酶与现有野生型北美萤火虫荧光素酶相比，酶活性有大幅提高，发光强度有明显的提高，且有效发光时长明显延长；本申请改造后的荧光素酶，热稳定性也有明显的改善，在35℃的温度下，酶活性仍然能保持较高的水平。
第二方面，本申请提供一种用于哺乳动物细胞表达的荧光素酶的突变体，由上述荧光素酶突变得到，所述突变体的突变位点包括第530位的亮氨酸、第214位的苏氨酸和第290位的苏氨酸。
可选的，所述突变体的氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示，所述突变体的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示。
通过采用上述技术方案，本申请以上述设计的荧光素酶为基础，通过将第530位的亮氨酸、第214位的苏氨酸和第290位的苏氨酸突变替换，得到了荧光素酶突变体，酶活性、有效发光时长和热稳定性有了进一步的明显提升，酶活性比野生型荧光毒酶提高了0.7倍。
第三方面，本申请提供了上述用于哺乳动物细胞表达的荧光素酶和/或用于哺乳动物细胞表达的荧光素酶的突变体，在制备荧光试剂产品领域的应用。
第四方面，本申请提供了一种含有上述用于哺乳动物细胞表达的荧光素酶的突变体核苷酸序列的重组载体、重组菌或蛋白表达宿主细胞。
可选的，所述重组载体为在表达载体中插入了上述的核苷酸序列得到的重组载体。
可选的，所述目的菌为大肠杆菌。
可选的，所述目的细胞为293细胞。
第五方面，本申请提供了一种上述重组载体的制备方法，包括以下步骤：
S1、将上述荧光素酶的基因序列插入表达载体，得到重组荧光素酶载体；
S2、通过反向PCR将步骤S1得到的重组荧光素酶载体的荧光素酶基因段的第530位的亮氨酸、第214位的苏氨酸和第290位的苏氨酸密码子分别改变成异亮氨酸、天冬酰胺及脯氨酸的密码子，得到重组载体。
第六方面，本申请提供了上述的重组载体、重组菌或蛋白表达宿主细胞，在制备荧光检测产品领域的应用。
综上所述，本发明包括以下至少一种有益技术效果：
1. 本申请设计了一种荧光素酶，对现有野生型北美萤火虫荧光素酶进行了针对哺乳动物的密码子优化，改造了萤火虫荧光素酶的分子结构，本申请改造后的荧光素酶与现有野生型北美萤火虫荧光素酶相比，酶活性有大幅提高，发光强度有明显的提高，且有效发光时长明显延长；本申请改造后的荧光素酶，热稳定性也有明显的改善，在35℃的温度下，酶活性仍然能保持较高的水平。
2. 本申请以上述设计的荧光素酶为基础，通过将第530位的亮氨酸、第214位的苏氨酸和第290位的苏氨酸突变替换，得到了荧光素酶突变体，酶活性、有效发光时长和热稳定性有了进一步的明显提升，酶活性比现有野生型北美萤火虫荧光素酶提高了近70%。
3. 本申请可以用于重组载体、重组菌或蛋白表达宿主细胞的制备，用于各种荧光素酶检测中，本申请制备的上述产品具有较高的发光强度和热稳定性，能够有效提升检测精度和检测灵敏度。
附图说明
图1为本申请的荧光素酶突变体重组质粒的载体图谱；
图2为本申请荧光素酶突变体重组质粒的双酶切验证图；
图3为野生型萤火虫荧光素酶与本申请荧光素酶突变体的发光强度对比图；
图4为本申请荧光素酶突变体与野生型荧光素酶的热稳定性对比图；
图5为本申请荧光素酶突变体与野生型萤火虫荧光素酶在不同温度下的热稳定性对比图。
实施方式
以下结合实施例对本申请作进一步详细说明。
本申请设计了一种用于哺乳动物细胞表达的荧光素酶，所述荧光素酶的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，所述荧光素酶的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。
萤火虫萤光素酶具有较佳的生物发光特性、极高的灵敏度和快速简单的检测流程等特点，被作为一种灵敏、非放射性且低成本的报告基因载体，广泛应用于各种生物分析检测。
目前，野生型萤火虫萤光素酶的相对分子质量为60kDa，是由551个氨基酸残基构成的含有大量疏水氨基酸残基的单一多肽链。虽然其灵敏度极高，生物发光特性也较佳，但是其热稳定性存在很大的缺陷。目前的野生型萤火虫萤光素酶的使用温度需要进行严格的控制，30℃温度下，就能让其失活，酶活性大幅降低，发光强度大幅减弱。而一旦使用温度达到35℃，目前的野生型萤火虫萤光素酶的酶活会下降近90%。
本领域对目前的野生型萤火虫萤光素酶进行了大量研究，通过基因工程技术改造萤火虫荧光素酶，以增强酶的各项性能。目前，现有技术通过使用随机突变、半理性设计、理性设计、密码子优化等方法来探索酶的发光强度、稳定性、生物发光光学特性的变化规律等方面的特性，进而进行高性能酶的研发。但是目前，现有技术对于萤火虫萤光素酶热稳定性的改进，成果有限。目前基因工程技术改造的萤火虫荧光素酶，在使用温度达到35℃时，酶活下降同样十分明显。
本申请同样通过基因工程技术改造萤火虫荧光素酶，通过特定的密码子优化，设计出了一种新的荧光素酶，热稳定性十分优异，且酶活也有明显的提升。
本申请的发明人还对本申请设计的荧光素酶做了进一步研究，经发明人研究发现，以本申请的荧光素酶为基础，通过将第530位的亮氨酸、第214位的苏氨酸和第290位的苏氨酸进行突变替换，得到的荧光素酶突变体，各项性能均有进一步提升。
本申请发明人依据上述研究，设计了本申请的用于哺乳动物细胞表达的荧光素酶的突变体，由本申请的荧光素酶突变得到，所述突变体的突变位点包括第530位的亮氨酸、第214位的苏氨酸和第290位的苏氨酸。本申请可以将上述三位点的突变替换成其它可替换的任意氨基酸，得到的突变体的热稳定性均会较本申请的荧光素酶有所提高。
优选的，所述突变体的氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示，所述突变体的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示。
将本申请的荧光素酶第530位的亮氨酸、第214位的苏氨酸和第290位的苏氨酸突变替换为异亮氨酸、天冬酰胺及脯氨酸时，性能最优。
本申请的发明人还基于本申请设计的荧光素酶突变体，设计了重组载体、重组菌或蛋白表达宿主细胞，应用于制备荧光检测产品。
以下为本申请实施例。
实施例
制备本申请的荧光素酶：
取野生型萤火虫荧光素酶，交由生工生物工程（上海）股份有限公司进行基因改造，制得荧光素酶。
对制得的荧光素酶进行测序鉴定，氨基酸序列为SEQ ID NO.1，核苷酸序列为SEQID NO.2，与本申请设计的荧光素酶一致。
制备本申请的荧光素酶突变体：
取本实施例制得的荧光素酶，交由生工生物工程（上海）股份有限公司进行突变体制备，制得荧光素酶突变体。
对制得的荧光素酶突变体进行测序鉴定，氨基酸序列为SEQ ID NO.3，核苷酸序列为SEQ ID NO.4，与本申请设计的荧光素酶突变体一致。
可见，本申请的荧光素酶和荧光素酶突变体，均可以通过基因工程的方法制备获得。
本申请的荧光素酶和荧光素酶突变体的复制：
使用Pharmacia公司的pGEX26p21质粒，使用质粒说明书记载的方法，分别将本申请的荧光素酶和荧光素酶突变体连接至质粒上。
将载体转化至宿主菌BL21，使用质粒说明书记载的方法，37℃培养；然后从培养的菌落中挑取几个单菌落扩大培养。
使用天根的无内毒素质粒小量制备试剂盒（目录号：GK2007-20）进行质粒提取，将提取的质粒酶切获得对应的基因片段。
分别取荧光素酶和荧光素酶突变体的连接质粒得到的基因片段，测序鉴定。荧光素酶连接质粒得到的基因片段，氨基酸序列为SEQ ID NO.1，核苷酸序列为SEQ ID NO.2，与本申请设计的荧光素酶一致。荧光素酶突变体连接质粒得到的基因片段，氨基酸序列为SEQID NO.3，核苷酸序列为SEQ ID NO.4，与本申请设计的荧光素酶突变体一致。
可见，本申请的荧光素酶和荧光素酶突变体，均可以通过连接质粒和克隆的方式复制。
实施例
1）本申请荧光素酶载体的构建
选择吉满生物科技（上海）有限公司的载体PGL3-basic-Rluc-IRES-MCS。将载体使用XhoI和XbaI双酶切而后连接本申请实施例1制备的荧光素酶，将PGL3-basic载体上的北美萤火虫（P.Pyralis）基因替换为本申请实施例1制备的荧光素酶，命名为PGL3-basic-Rluc-IRES-Luc（codon opt）。
采用IRES-F、48256W1F-61161、48256W2F-61162和48256W3F-61163测序引物对Luc（codon opt）序列进行测序，测序由生工生物工程（上海）股份有限公司完成。所述测序引物的具体序列见下表1。
表1 载体测序引物表
测序结果显示，PGL3-basic-Rluc-IRES-Luc（codon opt）插入基因序列与SEQ IDNO:2所示序列相同。
2）本申请荧光素酶突变体载体的构建
以前期构建的PGL3-basic-Rluc-IRES-Luc（codon opt）质粒为模板，设计PCR扩增引物，通过反向PCR的方法获得PCR产物Luc-PW，然后进行无缝克隆连接。采用的载体图谱如图1所示。
具体使用的扩增引物见下表2。
表2 扩增序引物表
具体使用的PCR体系见下表3。
表3 PCR体系
具体采用的PCT反应条件见下表4。
表4 PCR反应条件
无缝克隆连接使用Hieff cloneTM Plus One Step Cloning Kit 一步快速克隆试剂盒（来源于Yeasen）。采用的连接体系见下表5。连接反应在50℃温度下，反应20min。
表5 连接体系
然后转化到大肠杆菌stbl3菌株，涂含有50mg/L氨苄青霉素的LB培养基平皿，分离抗氨苄青霉素的转化体，提取质粒。
通过质粒大小（6863bp左右）和双酶切鉴定对质粒进行测定。
双酶切鉴定胶图见图2，由图2所示的结果可知，重组载体长度正确。
采用IRES-F、48256W1F-61161、48256W2F-61162和48256W3F-61163测序引物对Luc（codon opt）序列进行测序，测序由生工生物工程（上海）股份有限公司完成。测序比对显示目的区域完全正确。
本申请的荧光素酶突变体载体，命名为PGL3-basic-Rluc-IRES-Luc（L530I/T214N/T290P）。
实施例3
本实施例制备蛋白表达HEK-293细胞。
1）HEK-293细胞培养：
采用贴壁依赖型成上皮样细胞，培养基为DMEM+10FBS+1%P/S，培养环境为：空气95%+二氧化碳（CO2）5%。
2）质粒瞬转细胞及表达：
HEK-293细胞铺板：转染前一天，将状态良好，处于对数生长期的空白细胞用0.25%胰酶消化，用完全培养基悬浮成单细胞悬液，细胞计数后，接种于24孔板培养板中，当细胞长到70%~80%时准备转染。
转染2h前换液为新鲜的培养基。取无菌1.5mLEP管，转染体系见表6。
表6 转染体系
其中，内参：目的质粒=1:9。
取2支EP管，各加25μL的opti-MEM，一支EP管加上述质粒混匀，另外一支EP管加1.5μg HG transgene reagent转染试剂混匀，各自室温孵育5min后将两管液体混匀，室温放置15min~20min后，滴加到提前换过液的培养板中，后置于CO2培养箱中培养。
转染后48h收样检测。
3）酶的收集
转染后从培养箱中取靶细胞，轻吸将培养液吸净，PBS洗涤2次。
弃去PBS，每孔加入100μL（对应孔板体系）的Cell Lysis buffer细胞裂解液。
细胞裂解后，将样品酶转移入Ep管中，-80度冰箱保存。
对收集的酶进行测序检测，使用实施例2的测序检测方法。测序结果显示，样品酶的基因序列与本申请荧光素酶突变体的序列相同。
可见，本申请可以通过制备出的荧光素酶突变体载体，制备HEK-293细胞。
检测实验1
本实验对野生型萤火虫荧光素酶，与本申请的荧光素酶和荧光素酶突变体，进行ATP标准液体系活性测定。
本实验根据报告基因检测试剂盒（由广州市达瑞生物技术股份有限公司提供）说明书操作进行检测。
本实验的酶液采用实施例3的方法，分别用PGL3-basic-Rluc-IRES-Luc（codonopt）载体和PGL3-basic-Rluc-IRES-Luc（L530I/T214N/T290P）载体制备得到本申请的荧光素酶酶液和荧光素酶突变体酶液。
1）酶液处理
将荧光素酶酶液和荧光素酶突变体酶液，分别以10000~15000rpm，离心3~5min。离心后将上清液移入新的EP管进行荧光素酶检测。配制100μL的荧光素酶活性测定体系（20μL的荧光素酶，15nM的荧光素，40pM的ATP，200mM的Hepes，3mM的EDTA，2mM的MgSO4，pH7.6），使用SpectraMax L化学发光型酶标仪迅速测定发光强度。
2）检测方法
按照仪器说明书要求将荧光检测打开，设定参数，测定时间为10s，测定间隔为2s。
将样品按照20μL的体积加入测量管中（保持每次样品的加样量一致），另外加入20μL的Firefly Luciferase Assay Reagent混匀2~3次（不能漩涡混匀），充分混匀后测定RLU（Relative light unit），同时设置Cell Lysis buffer为空白对照孔。
将检测后的样品，加入20μL配制的Renilla Luciferase Assay工作液混匀2~3次，充分混匀后测定RLU。
将两次检测出的RLU值进行比较，通过得出的比值来确定报告基因的荧光强度。
3）检测结果
具体检测结果如图3所示。其中，WT为野生型荧光素酶，codon opt为本申请的荧光素酶，L530I/T214N/T290P为本申请的荧光素酶突变体。
由图3所示结果可以看出，在同等条件下，本申请改造后获得的荧光素酶和荧光素酶突变体，与野生型荧光素酶相比，发光强度有明显的提高，提高幅度超过了50%，表现出极高的酶活性。
检测实验2
本实验为热稳定性评估实验。
本实验的酶液采用实施例3的方法，分别用PGL3-basic-Rluc-IRES-Luc（codonopt）载体和PGL3-basic-Rluc-IRES-Luc（L530I/T214N/T290P）载体制备得到本申请的荧光素酶酶液和荧光素酶突变体酶液。
1）35℃金属浴不同时间后的热稳定性检测
分别取50μL荧光素酶酶液和荧光素酶突变体酶液，35℃下放置60min，每隔5min取出一定量样品冰浴10min，而后在室温下测定酶活，测定进行三次，取平均值后计算酶的残留活性。以空白细胞裂解液作为对照，以野生型荧光素酶酶液作为对比。
2）不同温度下的热稳定性检测
将荧光素酶酶液和荧光素酶突变体酶液分别放置在25℃，30℃，35℃，40℃，45℃金属浴中，5min后置于冰上，10min后测定发光强度，计算其残留活性。以空白细胞裂解液作为对照，以野生型荧光素酶酶液作为对比。
3）检测结果
具体检测结果如图4和图5所示。图4和图5中，WT为野生型荧光素酶，codon opt为本申请的荧光素酶，L530I/T214N/T290P为本申请的荧光素酶突变体，con为空白对照。
由图4所示结果可以看出，野生型荧光素酶和本申请的荧光素酶在35℃金属浴10min后，发光强度下降了90％以上，且随着金属浴时间的加长，发光性能几乎完全丧失。而本申请的荧光素酶突变体在35℃金属浴25min后，仍有13%左右的发光强度，耐高温性能明显较优，这对荧光素酶可以用于固相免疫分析等有着重要意义。
由图5所示结果可以看出，野生型荧光素酶和本申请的荧光素酶的发光强度，均随着金属浴温度的增加而降低。野生型荧光素酶和本申请的荧光素酶在35℃金属浴5min后，发光强度降至原来的20％以下，而本申请的荧光素酶突变体在35℃金属浴5min后，还能够有接近80%的发光强度，可见本申请的荧光素酶突变体具有十分优异的热稳定性。
通过检测实验1和检测实验2的结果可以看出，本申请通过对荧光素酶进行基因改造，得到的本申请的荧光素酶，酶活性比目前现有野生型的荧光素酶有明显的提高，提高幅度超过了50%，表现出极高的酶活性。而本申请通过特定的突变控制，得到的本申请的荧光素酶突变体，不但酶活性有进一步提升，比本申请的荧光素酶酶活性更高；而且，热稳定性极为优异，在3535℃金属浴5min后，失活率能够控制在20%左右，明显优于现有野生型的荧光素酶。
以上均为本申请的较佳实施例，并非依此限制本申请的保护范围，故:凡依本申请的结构、形状、原理所做的等效变化，均应涵盖于本申请的保护范围之内。

Claims (10)

1. 一种用于哺乳动物细胞表达的荧光素酶，其特征在于，所述荧光素酶的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，所述荧光素酶的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。
2.一种如权利要求1所述的用于哺乳动物细胞表达的荧光素酶的突变体，其特征在于，所述突变体的突变位点包括第530位的亮氨酸、第214位的苏氨酸和第290位的苏氨酸。
3. 根据权利要求2所述的用于哺乳动物细胞表达的荧光素酶的突变体，其特征在于，所述突变体的氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示，所述突变体的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示。
4.一种权利要求1所述的用于哺乳动物细胞表达的荧光素酶和/或权利要求2或3所述的用于哺乳动物细胞表达的荧光素酶的突变体，在制备荧光试剂产品领域的应用。
5.一种含有权利要求2或3所述的用于哺乳动物细胞表达的荧光素酶的突变体核苷酸序列的重组载体、重组菌或蛋白表达宿主细胞。
6.根据权利要求5所述的重组载体，其特征在于，所述重组载体为在表达载体中插入权利要求3所述的核苷酸序列得到的重组载体。
7.根据权利要求5所述的重组菌，其特征在于，所述目的菌为大肠杆菌。
8.根据权利要求5所述的蛋白表达宿主细胞，其特征在于，所述目的细胞为293细胞。
9.一种权利要求6所述的重组载体的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
S1、将权利要求1所述的荧光素酶的基因序列插入表达载体，得到重组荧光素酶载体；
S2、通过反向PCR将步骤S1得到的重组荧光素酶载体的荧光素酶基因段的第530位的亮氨酸、第214位的苏氨酸和第290位的苏氨酸密码子分别改变成异亮氨酸、天冬酰胺及脯氨酸的密码子，得到重组载体。
10.一种权利要求5所述的重组载体、重组菌或蛋白表达宿主细胞，在制备荧光检测产品领域的应用。
CN202311344338.4A 2023-10-18 2023-10-18 一种用于哺乳动物细胞表达的荧光素酶及其应用 Pending CN117327670A (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202311344338.4A CN117327670A (zh) 2023-10-18 2023-10-18 一种用于哺乳动物细胞表达的荧光素酶及其应用

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202311344338.4A CN117327670A (zh) 2023-10-18 2023-10-18 一种用于哺乳动物细胞表达的荧光素酶及其应用

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN117327670A true CN117327670A (zh) 2024-01-02

Family

ID=89276978

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN202311344338.4A Pending CN117327670A (zh) 2023-10-18 2023-10-18 一种用于哺乳动物细胞表达的荧光素酶及其应用

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN117327670A (zh)

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN109312328B (zh) 突变型甲虫荧光素酶、基因、重组载体、转化体，以及突变型甲虫荧光素酶的制备方法
JP2003512071A (ja) 変異型ルシフェラーゼ
CN113061591B (zh) 一种新型萤火虫萤光素酶突变体、其制备方法和应用
CN113073089B (zh) 一种提高NMN生物合成酶Nampt的酶活的创新方法
CN102191213B (zh) 一种萤火虫荧光素酶的编码基因及制备方法和应用
CN112175980A (zh) 通过定点突变提高聚合酶大片段活性的方法及应用
WO2018168958A1 (ja) 耐熱性ルシフェラーゼ
CN115074338B (zh) 突变型甲虫荧光素酶、基因、重组载体、转化体以及突变型甲虫荧光素酶的制备方法
CN114686990A (zh) 一种启动子文库及其制备方法和应用
GB2441208A (en) Fusion proteins
CN117327670A (zh) 一种用于哺乳动物细胞表达的荧光素酶及其应用
CN116555204B (zh) 一种性能提升的突变荧光素酶及其应用
CN104946681A (zh) 一种检测水体重金属镉的微生物学方法
CN115873812B (zh) 适用于哺乳动物细胞表达系统的高活性和高热稳定性荧光素酶突变体
CN115161296B (zh) 一种刺虾荧光素酶Nluc的突变体及其应用
CN109520985A (zh) 一种快速检测大肠杆菌中乙醇酸产量的方法
CN111315875A (zh) 改进修饰的/突变的细菌萤光素酶
CN112608876B (zh) 一种生物素化Curli蛋白的活细胞标记方法及其应用
CN104388440A (zh) 铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)中表达3α-羟基类固醇脱氢酶的DNA序列
CN116121215A (zh) 一种甘油磷酸氧化酶的突变体及其用途
CN104789639B (zh) 用于对nadh依赖型酶底物进行检测的融合蛋白及其应用
CN118834846B (zh) 一种高效稳定的萤火虫荧光素酶突变体及其应用
CN116121287B (zh) 一种检测水体铜离子的荧光报告质粒载体及其应用
CN113151210B (zh) 一种高比酶活过氧化物酶突变体及其应用
CN110117605B (zh) 基于is26插入序列构建能表达荧光的自杀型质粒及菌株的方法

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination