CN115869250A - 一种注射用透明质酸或透明质酸钠组合物及其制备方法和用途 - Google Patents

Abstract

本发明提供一种注射用组合物，其特征在于，含有高分子量透明质酸或透明质酸钠、中分子量或低分子量透明质酸或透明质酸钠和缓冲溶液，通过将不同分子量的透明质酸或透明质酸钠配合，获得了低粘度、低推注力、较长的降解周期，制备工艺简单，未添加任何交联剂，具有更高的安全性。

Description

一种注射用透明质酸或透明质酸钠组合物及其制备方法和 用途

技术领域

本发明属于生物医药与医学美容领域，尤其涉及一种注射用透明质酸或透明质酸钠组合物及其制备方法，以及其在生物医药和医学美容领域中的应用。

背景技术

在过去的几十年之中，人们对生物相容性高分子材料的研究，在生物医药和医学美容领域成为热点并至今已取得了长足进步，其中几种具有代表性的生物相容性高分子及其衍生物、化学修饰物起到了关键的物质基础作用。

透明质酸(Hyaluronic acid，HA)是一种由重复单元为D-葡萄糖醛酸及N-乙酰葡糖胺双糖交替链接构成的阴离子天然糖胺聚糖。HA是非硫酸化糖胺聚糖。超过50％的透明质酸存在于皮肤、肺和肠。此外，在关节滑液、软骨、脐带、血管壁等组织间质中也有存在。人体内合成的透明质酸主要发挥润滑及缓冲作用、填充剂和扩散屏障、清除自由基等生理功能。目前市场上所用的透明质酸产品可以从动物组织(如鸡冠、眼玻璃体、脑软骨、关节液)中提取，也可由细菌(如链球菌、绿脓杆菌等)发酵而来。HA的平均分子量范围一般在从5kDa到10MDa之间不等，常见的分子量大小范围为从2.0MDa到5.0MDa。

透明质酸作为细胞外基质的主要组成成分，20岁时约50％都存在于皮肤组织中，其有着500倍于自身重量的保水能力。随着年龄的增加，皮肤内透明质酸的含量逐渐降低。至60岁时透明质酸的含量下降至20岁时的25％，同时皮肤表层的含水量也降低，造成角质层老化，皮肤出现皱纹并失去弹性。皮肤组织中透明质酸的分子量大致范围为50万至200万道尔顿。高分子量的透明质酸由于其大分子尺寸的特殊性质，可以有效地调节组织含水量、渗透压平衡，并通过水合作用构建稳定的细胞外环境，为周围的细胞、胶原蛋白、弹性蛋白纤维等组分提供牢固的结合位点并保护他们免受环境因素的损害。除此之外，高分子量的透明质酸还可以有效的减少注射后皮肤红肿炎症的发生概率。低分子量的透明质酸可以通过与细胞表面CD44受体结合，加速细胞的迁移及增殖并促进新生血管的生成以及细胞外基质的重建。

皮肤皱纹的出现往往伴随着皮肤松弛及弹性的降低，而其中最主要的原因便是作为细胞外基质的重要组成物质-透明质酸含量的降低。近年来大量的研究致力于开发可注射的透明质酸溶液或交联透明质酸水凝胶，通过真皮注射填充的方式来改善皮肤的外形并提升皮肤质量。

近年来，随着对HA功能的深入研究，HA已广泛应用于医药领域，如用于制备药物传递系统以及用于骨科疾病和眼科疾病的治疗、手术后粘连的预防及软组织修复等，已成为组织工程领域的研究热点。易降解的天然HA可通过化学改性获得较好的物理稳定性和机械强度。HA的化学交联一般通过小分子交联剂使HA分子内交联或通过对HA进行化学修饰后交联来完成。通过化学方式交联获得的HA水凝胶已被广泛应用于组织工程领域。

然而，众多制备HA水凝胶的化学方法存在多种局限性和安全隐患，如使用有毒性小分子交联剂制备凝胶、化学修饰HA的效率低、不易操作、成本高等。交联透明质酸水凝胶虽然由于具有一定的力学支撑性能从而有效的提供了填充功能。但不可忽略的是，一方面交联剂的使用使得水凝胶有着一定的生物安全隐患，另一方面胶体的注射往往会使病人在术中及术后产生疼痛，并且这种疼痛随着水凝胶粘弹性的增加进一步加剧，而且由于胶体硬度较高，不适合诸如脖颈部、额头的浅层皱纹填充。目前已有大量商业化产品通过交联配合非交联相透明质酸来提升注射舒适性及填充有效时间，但仍有如工艺复杂、安全性低、操作繁琐、成本高填充效果差、易引起红肿炎症等缺陷。到目前，开发交联机制更优的新型HA材料，或开发HA与其它种类生物相容性高分子化合物的复合材料，都已成为解决现有问题的途径之一。

目前市面上常见的透明质酸注射液通常为低分子量产品，在体内降解周期短，皮肤填充效果差、只能维持很短周期的作用，也无法发挥重建细胞外基质的活性作用。分子量超过约100万道尔顿的高分子量透明质酸可以与真皮环境中的蛋白和多糖产生复杂的相互作用，并实现稳定的力学支撑能力以保持皮肤光滑的外观，但过高的分子量也造成了溶液粘度的大幅升高以致难以应用于临床及医学美容的实践中。

Profhilo是第一个用于治疗皮肤松弛症的、不使用化学交联剂的注射用透明质酸产品，其透明质酸的浓度最高可达32mg/mL，不仅可以实现皮肤保湿的目标，还可以改观或改善衰老及下垂的面部组织，可以在28天左右的时间内保持皮肤状态，针对人群如下：1.颈纹明显；2.苹果肌下垂；3.抗老，紧致和提升；4.皮肤松弛。Profhilo透明质酸是通过发酵生产的，生产过程中不添加外源性交联剂，而是通过热能交联，优势为生物适应性好，副作用低、风险低。Profhilo虽然有着高分子量及3.2％高浓度的特征，使其在人体内能维持较长时间，但其通常需要在初次治疗后的一个月进行二次注射纠正，之后再根据注射部位的具体情况增加纠正次数来获得诱导自体胶原分泌的效果，导致疗程长、注射次数多、治疗成本居高不下。

综上，开发一种既能在人体内维持有效的降解周期，又能实现临床和医学美容实践中实际应用的透明质酸类填充产品，成为临床医生和使用者的实际呼声。

发明内容

本发明针对天然来源或发酵来源的生物相容性透明质酸或透明质酸钠代谢速度快、填充效果短暂的缺点，同时针对使用外源性交联剂的化学修饰透明质酸凝胶毒性成分残留、导致人体毒性反应、副作用较高、风险高的缺点，并克服天然来源透明质酸凝胶疗程较长、注射次数多、使用时推注力过大并用户顺应性不好、治疗成本居高不下等问题，开发一种新型的注射型透明质酸或透明质酸钠产品，该产品不仅可克服现有产品的上述缺点，安全性高，注射时推注力较低、用户顺应性好，同时具有较长的体内代谢周期，能实现优异的人体局部塑型效果。

根据本发明的一个方面，本发明提供一种注射用组合物，其特征在于，含有高分子量透明质酸(或透明质酸钠)，中分子量透明质酸(或透明质酸钠)和/或低分子量透明质酸(或透明质酸钠)，和缓冲溶液，所述高分子量透明质酸(或透明质酸钠)的分子量为800kDa-1800kDa，优选800-1200kDa，所述中分子量透明质酸(或透明质酸钠)的分子量为200kDa-700kDa，所述低分子量透明质酸(或透明质酸钠)的分子量为80kDa-120kDa，所述高分子量透明质酸(或透明质酸钠)与中分子量透明质酸(或透明质酸钠)和/或低分子量透明质酸(或透明质酸钠)的重量比为(8-10):1，所有透明质酸(或透明质酸钠)总和的浓度为1.0-3.5％，优选2.8-3.3％。

根据本发明，缓冲溶液为枸橼酸-枸橼酸钠-乳酸缓冲溶液，含有枸橼酸钠2.0％、枸橼酸为0.4％、乳酸为0.01％，pH为5.0。

根据本发明，所述注射用药物组合物中还可含有稀释剂、稳定剂、等渗调节剂、和/或增溶或助溶剂等，还可进一步含有止痛剂例如利多卡因等。

根据本发明，本发明注射组合物的粘度小于60000cP，储能模量小于60Pa并且大于40Pa，推注力小于30N，体内降解时间超过6周。

根据本发明的另一个方面，本发明提供上述注射用组合物的制备方法，包括如下步骤：

(1)将高分子量的透明质酸或透明质酸钠溶解于缓冲溶液中；

(2)将低分子量的透明质酸或透明质酸钠溶解于缓冲溶液中；

(3)将步骤(1)和(2)所得溶液混合、均质、超声；

(4)灭菌。

优选地，在11000-13000RPM均质10-20min。

优选地，在800-1600w超声10-25min。

优选地，向步骤(3)所得溶液中，加入稀释剂、稳定剂、等渗调节剂、和/或增溶或助溶剂等，优选进一步加入止痛剂例如利多卡因等，混匀。

根据本发明的另一个方面，本发明涉及上述注射用组合物在制备美容和医疗产品中的应用。

本发明中通过高分子量透明质酸或透明质酸钠与中和/或低分子量透明质酸或透明质酸钠配制来制备获得低粘度、高生物活性的透明质酸或透明质酸钠注射液。在高分子量透明质酸或透明质酸钠遇水溶解的过程中，大分子链之间会通过氢键及疏水相互作用产生类似于网络的连接构型，另一方面大分子链间的缠绕也使得溶液的粘度极高。当溶液搅拌均质并超声至一定程度时，这些链间的相互作用会被短暂的破坏，随之透明质酸链的构型也会发生变化。在搅拌均质及超声过后的阶段，链间的连接又重新形成。通过在组分中混入中分子量或低分子量透明质酸或透明质酸钠，可以让这种氢键重组随机的发生在不同分子量的链之间，并极为显著的降低了溶液的粘度。在注射入皮下组织后，组分中的中分子量或低分子量的透明质酸或透明质酸钠会率先被周围细胞识别，并促进周围细胞向缺损部位迁移增殖，及加速新生细胞外基质的构建。而在此之间，高分子量透明质酸或透明质酸钠组分除了发挥力学支撑作用之外还为新生细胞、胶原蛋白、弹性蛋白纤维等组分提供连接靶点及保护作用。通过对透明质酸或透明质酸钠混合溶液进行搅拌均质及超声可以得到一系列低粘度的注射液。由于搅拌均质及超声处理前后透明质酸或透明质酸钠的分子量并未发生变化，所得低粘度的注射液除了具有易注射的优势外，还可因含有不同分子量透明质酸或透明质酸钠可实现快速细胞外基质的构建及稳定且长效的皮肤填充功能。

本发明的高分子量透明质酸或透明质酸钠与中和/或低分子量透明质酸或透明质酸钠复合溶液除了在物理性能上能够替代交联透明质酸钠凝胶，其具有更优异的力学性能及生物活性，包括相似的粘弹性、更低的注射推力、促进细胞外基质再生的能力以及长效且安全的皮肤填充效果。特别是生产工艺简单，在制备过程中并未添加任何交联剂或催化剂组分，与现有的交联透明质酸产品相比能提供更好的胶原蛋白刺激效果及促进面部血液循环效果。本发明在制备不同分子量的透明质酸或透明质酸钠复合物时，所选用的水溶液介质，其中各成分都复合人体组织填充剂的生物相容性，这些成分不需经过去除工艺；选用不同分子量透明质酸或透明质酸钠作为原料，不添加任何交联剂，组分简单且安全，且避免了交联剂的潜在毒性和潜在不良反应；仅通过可控搅拌均质及超声过程即可在不降低分子量的同时有效降低粘度及推注力，操作简单易行，提高了使用时操作者的可操作性，也提高了使用时用户的顺应性；高分子量透明质酸或透明质酸钠可以提供长效且稳定的力学支撑能力，中分子量及低分子量透明质酸或透明质酸钠提供了优异的生物活性。

具体实施方式

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。此外，应理解，在阅读了本发明所记载的内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本发明所限定的范围。

制备例1缓冲介质M1的配制(枸橼酸-枸橼酸钠-乳酸缓冲溶液)

1、取枸橼酸钠20.0g，溶于500mL水中，得枸橼酸钠水溶液A1；

2、取枸橼酸4.0g，溶于300mL水中，得枸橼酸水溶液B1；

3、取乳酸0.1g，溶于100mL水中，得乳酸水溶液C；

4、配制2015年版中国药典附录所收载的稀盐酸溶液；

5、将本制备例步骤1枸橼酸钠水溶液A1和步骤2枸橼酸水溶液B1混合均匀，得枸橼酸缓冲溶液D1；取本制备例步骤3乳酸水溶液C10mL，缓慢滴加到枸橼酸缓冲溶液D1中，混合均匀，再滴加适量本制备例步骤4的稀盐酸，调节pH值至5.0，随后加水定容至1000mL，混匀，得枸橼酸-枸橼酸钠-乳酸缓冲溶液，以下简称缓冲介质M1。

制备例2缓冲介质M2的配制(枸橼酸-枸橼酸钠缓冲溶液)

1、按制备例1步骤1、2、4配制枸橼酸钠水溶液A1、枸橼酸水溶液B1、稀盐酸溶液；

2、将本制备例步骤1枸橼酸钠水溶液A1和枸橼酸水溶液B1混合均匀，得枸橼酸缓冲溶液D1；随后滴加适量本制备例步骤1稀盐酸，调节pH值至5.0，随后加水定容至1000mL，混匀，得枸橼酸-枸橼酸钠缓冲溶液，以下简称缓冲介质M2。

实施例1 HA复合溶液1的制备

制备方法如下：称取2.70克高分子量透明质酸(重均分子量为100万道尔顿)，称取0.30克低分子量透明质酸(重均分子量10万道尔顿)，将上述高、低分子量透明质酸分别溶解于50毫升介质溶液中，所选介质溶液为按制备例1中方法所制得的缓冲溶液M1，制得高、低分子量的透明质酸溶液；

将高、低分子量的透明质酸溶液放置4h后，搅拌使之分散完全。待分散完全后分别将高、低分子量透明质酸溶液按1:1混合均匀，获得终浓度为3.0％的高低分子量透明质酸混合溶液。使用IKA-T25均质机对溶液进行搅拌均质处理，分别设定刀头转速为12000rpm，混合溶液的处理时间均为15分钟；

然后使用超声波清洗仪对所得溶液进行超声处理15分钟，超声功率设定为1200w，即得HA复合溶液1。

实施例2 HA复合溶液2的制备

制备方法如下：称取2.50克高分子量透明质酸(重均分子量为120万道尔顿)，称取0.30克低分子量透明质酸(重均分子量8万道尔顿)，将上述高、低分子量透明质酸分别溶解于50毫升介质溶液中，所选介质溶液为按制备例1中方法所制得的缓冲溶液M1，制得高、低分子量的透明质酸溶液；

将高、低分子量的透明质酸溶液放置4h后，搅拌使之分散完全。待分散完全后分别将高、低分子量透明质酸溶液按1:1混合均匀，获得终浓度为2.8％的高低分子量透明质酸混合溶液。使用IKA-T25均质机对溶液进行搅拌均质处理，分别设定刀头转速为11000rpm，混合溶液的处理时间均为20分钟；

然后使用超声波清洗仪对所得溶液进行超声处理10分钟，超声功率设定为1600w，即得HA复合溶液2。

实施例3 HA复合溶液3的制备

制备方法如下：称取3.00克高分子量透明质酸(重均分子量为80万道尔顿)，称取0.30克低分子量透明质酸(重均分子量12万道尔顿)，将上述高、低分子量透明质酸分别溶解于50毫升介质溶液中，所选介质溶液为按制备例1中方法所制得的缓冲溶液M1，制得高、低分子量的透明质酸溶液；

将高、低分子量的透明质酸溶液放置4h后，搅拌使之分散完全。待分散完全后分别将高、低分子量透明质酸溶液按1:1混合均匀，获得终浓度为3.3％的高低分子量透明质酸混合溶液。使用IKA-T25均质机对溶液进行搅拌均质处理，分别设定刀头转速为13000rpm，混合溶液的处理时间均为10分钟；

然后使用超声波清洗仪对所得溶液进行超声处理25分钟，超声功率设定为800w，即得HA复合溶液3。

实施例4 HA复合溶液4的制备

制备方法如下：称取2.70克高分子量透明质酸(重均分子量为100万道尔顿)，称取0.30克中分子量透明质酸(重均分子量20万道尔顿)，将上述高、低分子量透明质酸分别溶解于50毫升介质溶液中，所选介质溶液为按制备例1中方法所制得的缓冲溶液M1，制得高、中分子量的透明质酸溶液；

将高、中分子量的透明质酸溶液放置4h后，搅拌使之分散完全。待分散完全后分别将高、中分子量透明质酸溶液按1:1混合均匀，获得终浓度为3.0％的高中分子量透明质酸混合溶液。使用IKA-T25均质机对溶液进行搅拌均质处理，分别设定刀头转速为12000rpm，混合溶液的处理时间均为15分钟；

然后使用超声波清洗仪对所得溶液进行超声处理15分钟，超声功率设定为1200w，即得HA复合溶液4。

实施例5 HA复合溶液5的制备

制备方法如下：称取2.50克高分子量透明质酸(重均分子量为120万道尔顿)，称取0.30克中分子量透明质酸(重均分子量50万道尔顿)，将上述高、中分子量透明质酸分别溶解于50毫升介质溶液中，所选介质溶液为按制备例1中方法所制得的缓冲溶液M1，制得高、中分子量的透明质酸溶液；

将高、中分子量的透明质酸溶液放置4h后，搅拌使之分散完全。待分散完全后分别将高、中分子量透明质酸溶液按1:1混合均匀，获得终浓度为2.8％的高中分子量透明质酸混合溶液。使用IKA-T25均质机对溶液进行搅拌均质处理，分别设定刀头转速为11000rpm，混合溶液的处理时间均为20分钟；

然后使用超声波清洗仪对所得溶液进行超声处理10分钟，超声功率设定为1600w，即得HA复合溶液5。

实施例6 HA复合溶液6的制备

制备方法如下：称取3.00克高分子量透明质酸(重均分子量为80万道尔顿)，称取0.30克中分子量透明质酸(重均分子量70万道尔顿)，将上述高、中分子量透明质酸分别溶解于50毫升介质溶液中，所选介质溶液为按制备例1中方法所制得的缓冲溶液M1，制得高、中分子量的透明质酸溶液；

将高、中分子量的透明质酸溶液放置4h后，搅拌使之分散完全。待分散完全后分别将高、中分子量透明质酸溶液按1:1混合均匀，获得终浓度为3.3％的高中分子量透明质酸混合溶液。使用IKA-T25均质机对溶液进行搅拌均质处理，分别设定刀头转速为13000rpm，混合溶液的处理时间均为10分钟；

然后使用超声波清洗仪对所得溶液进行超声处理25分钟，超声功率设定为800w，即得HA复合溶液6。

实施例7 HA复合溶液7的制备

制备方法如下：称取1.50克高分子量透明质酸(重均分子量为100万道尔顿)，称取1.50克低分子量透明质酸(重均分子量10万道尔顿)，将上述高、低分子量透明质酸分别溶解于50毫升介质溶液中，所选介质溶液为按制备例1中方法所制得的缓冲溶液M1，制得高、低分子量的透明质酸溶液；

后续制备方法同实施例1，即得HA复合溶液7。

实施例8 HA复合溶液8的制备

制备方法如下：称取2.70克高分子量透明质酸(重均分子量为100万道尔顿)，称取0.30克低分子量透明质酸(重均分子量10万道尔顿)，将上述高、低分子量透明质酸分别溶解于50毫升介质溶液中，所选介质溶液为按制备例2中方法所制得的缓冲溶液M2，制得高、低分子量的透明质酸溶液；

后续制备方法同实施例1，即得HA复合溶液8。

实施例9 HA复合溶液9的制备

制备方法如下：称取1.35克高分子量透明质酸(重均分子量为100万道尔顿)，称取0.15克低分子量透明质酸(重均分子量10万道尔顿)，将上述高、低分子量透明质酸分别溶解于100毫升介质溶液中，所选介质溶液为按制备例2中方法所制得的缓冲溶液M2，制得高、低分子量的透明质酸溶液；

后续制备方法同实施例1，即得HA复合溶液9。

实施例10 HA复合溶液10的制备

制备方法如下：称取2.70克高分子量透明质酸(重均分子量为100万道尔顿)，称取0.30克低分子量透明质酸(重均分子量10万道尔顿)，将上述高、低分子量透明质酸分别溶解于50毫升介质溶液中，所选介质溶液为按制备例1中方法所制得的缓冲溶液M1，制得高、低分子量的透明质酸溶液；

将高、低分子量的透明质酸溶液放置4h后，搅拌使之分散完全。待分散完全后分别将高、低分子量透明质酸溶液按1:1混合均匀，获得终浓度为3.0％的高低分子量透明质酸混合溶液。使用IKA-T25均质机对溶液进行搅拌均质处理，分别设定刀头转速为14000rpm，混合溶液的处理时间均为15分钟，即得HA复合溶液10。

实施例11 HA复合溶液11的制备

制备方法如下：称取2.70克高分子量透明质酸(重均分子量为100万道尔顿)，称取0.30克低分子量透明质酸(重均分子量10万道尔顿)，将上述高、低分子量透明质酸分别溶解于50毫升介质溶液中，所选介质溶液为按制备例1中方法所制得的缓冲溶液M1，制得高、低分子量的透明质酸溶液；

将高、低分子量的透明质酸溶液放置4h后，搅拌使之分散完全。待分散完全后分别将高、低分子量透明质酸溶液按1:1混合均匀，获得终浓度为3.0％的高低分子量透明质酸混合溶液。使用IKA-T25均质机对溶液进行搅拌均质处理，分别设定刀头转速为10000rpm，混合溶液的处理时间均为15分钟，即得HA复合溶液11。

实施例12 HA复合溶液12的制备

制备方法如下：称取2.70克高分子量透明质酸(重均分子量为200万道尔顿)，称取0.30克低分子量透明质酸(重均分子量10万道尔顿)，将上述高、低分子量透明质酸分别溶解于50毫升介质溶液中，所选介质溶液为按制备例1中方法所制得的缓冲溶液M1，制得高、低分子量的透明质酸溶液；

后续制备方法同实施例1，制得HA复合溶液12。

实施例13 HA复合溶液13的制备

制备方法如下：称取2.70克高分子量透明质酸(重均分子量为60万道尔顿)，称取0.30克低分子量透明质酸(重均分子量10万道尔顿)，将上述高、低分子量透明质酸分别溶解于50毫升介质溶液中，所选介质溶液为按制备例1中方法所制得的缓冲溶液M1，制得高、低分子量的透明质酸溶液；

后续制备方法同实施例1，制得HA复合溶液13。

实施例14 HA复合溶液14的制备

制备方法如下：称取2.70克高分子量透明质酸(重均分子量为100万道尔顿)，称取0.30克低分子量透明质酸(重均分子量5万道尔顿)，将上述高、低分子量透明质酸分别溶解于50毫升介质溶液中，所选介质溶液为按制备例1中方法所制得的缓冲溶液M1，制得高、低分子量的透明质酸溶液；

后续制备方法同实施例1，制得HA复合溶液14。

实施例15 HA复合溶液15的制备

制备方法如下：称取2.25克高分子量透明质酸(重均分子量为100万道尔顿)，称取0.75克中分子量透明质酸(重均分子量20万道尔顿)，将上述高、低分子量透明质酸分别溶解于50毫升介质溶液中，所选介质溶液为按制备例1中方法所制得的缓冲溶液M1，制得高、低分子量的透明质酸溶液；

后续制备方法同实施例1，制得HA复合溶液15。

实施例16 HA复合溶液1-15的推注力、粘度、储能模量测定

1.推注力测定方法

以注射器柄挤压力的测定而获得推注力，具体测定方法如下：

在注射器上安装27G的针头，以32.34mm/min的速度推进注射器柄，注射器柄的平均挤压力测定结果，即为推注力。

以上述方法测定实施例1-15中所制得的各HA复合溶液的样品，获得推注力测定值，具体测定结果见表1。

2.粘度测定方法

使用MYR-3000旋转粘度计以及三号探头对所得HA复合溶液粘度进行测试。每组样品取30mL置于50mL离心管中，旋转粘度计开机并校准探头。将探头浸入样品溶液中至探头刻度线处，启动旋转探头，待粘度示数稳定后记录数据。每组溶液平行检测三次。

以上述方法测定实施例1-15中所制得的各HA复合溶液的样品，获得粘度测定值，具体测定结果见表1。

3.储能模量测定方法

取200μL样品置于TA-DHR2流变仪平行夹具中心，使用20mm平行板探头与样品表面接触，确保探头全覆盖。检测温度25摄氏度，剪切频率：1Hz，每组样品测试时间1分钟。

以上述方法测定实施例1-15中所制得的各HA复合溶液的样品，获得储能模量测定值，具体测定结果见表1。

表1 HA复合溶液1-15的推注力、粘度、储能模量、体内降解时间

实施例17 HA复合溶液1-15的动物体内降解性能测定

分别按实施例1-15所述方法制备HA复合溶液样品，制备完成后，以动物体内降解周期的考察方式，测定评价各样品在动物体内的降解周期，具体测定数据见表2，体内降解时间见表1。

动物体内降解试验的方法如下：

筛选健康SD大鼠120只，取实施例1-15所制得的HA复合溶液1-15作为样品，将大鼠随机分成15个组，每组8只，每组分别给予HA复合溶液1-15。将样品植入大鼠皮下，每只大鼠分别植入3个HA复合溶液(200μl)、一个PE管(对照)、生理盐水(200μl，对照)。植入后，每组8只大鼠，在第1、2、3、4、5、6、7、8周分别处死一只大鼠，对植入物的直径和高度进行测量直至植入物完全消失，经过偏球体体积计算得到植入物体积大小(见下表)。以样品体积小于第1周时样品体积的20％作为降解周期的终点。观察期未发现的擦伤和外伤，未发现植入部位皮肤发生皮肤瘀青、水肿和红斑现象。

由于按实施例12中方法所制备的HA复合溶液12，其推注力、粘度均过大，测定动物体内降解试验结果已无实际意义。

表2 HA复合溶液1-15的动物体内降解性能测定数据

实施例18动物体内安全性研究

试验方法为：筛选健康家兔45只，随机分成HA复合溶液组和生理盐水组。将样品随机植入去毛的家兔背部皮内，每个样品注射5个点，每个点注射0.2ml。注射后24h、48h、72h观察各注射部位反应情况，根据皮内反应计分标准对每一观察期各注射部位的红斑和水肿的组织反应评分。

结果：在本实验条件下，实验样品家兔皮内反应实验没有观察到注射部位发生明显红斑和水肿反应，最终计分之差小于等于1.0。

按照上述试验方法考察本专利实施例1-15所制得的HA复合溶液样品，结果表明实施例1-15的所制得的HA复合溶液样品的安全性符合要求。

Claims (10)

1.一种注射用组合物，其特征在于，含有高分子量透明质酸(或透明质酸钠)，中分子量透明质酸(或透明质酸钠)和/或低分子量透明质酸(或透明质酸钠)，和缓冲溶液，所述高分子量透明质酸(或透明质酸钠)的分子量为800kDa-1800kDa，优选800-1200kDa，所述中分子量透明质酸(或透明质酸钠)的分子量为200kDa-700kDa，所述低分子量透明质酸(或透明质酸钠)的分子量为80kDa-120kDa。

2.如权利要求1所述的注射用组合物，其特征在于，所述高分子量透明质酸(或透明质酸钠)与所述中分子量透明质酸(或透明质酸钠)和/或低分子量透明质酸(或透明质酸钠)的重量比为(8-10):1。

3.如权利要求1或2所述的注射用组合物，其特征在于，所有透明质酸(或透明质酸钠)总和的浓度为1.0-3.5％，优选2.8-3.3％。

4.如权利要求1-3中任一项所述的注射用组合物，其特征在于，所述缓冲溶液为枸橼酸-枸橼酸钠-乳酸缓冲溶液，含有枸橼酸钠2.0％、枸橼酸为0.4％、乳酸为0.01％，pH为5.0。

5.如权利要求1-4中任一项所述的注射用组合物，其特征在于，所述注射用药物组合物中还可含有稀释剂、稳定剂、等渗调节剂、和/或增溶或助溶剂等，还可进一步含有止痛剂例如利多卡因等。

6.如权利要求1-5中任一项所述的注射用组合物的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：

(1)将高分子量的透明质酸或透明质酸钠溶解于缓冲溶液中；

(2)将中分子量或低分子量的透明质酸或透明质酸钠溶解于缓冲溶液中；

(3)将步骤(1)和(2)所得溶液混合、均质、超声；

(4)灭菌。

7.如权利要求6所述的制备方法，其特征在于，在11000-13000RPM均质10-20min。

8.如权利要求6所述的制备方法，其特征在于，在800-1600w超声10-25min。

9.如权利要求6-8中任一项所述的制备方法，其特征在于，向步骤(3)所得溶液中，加入稀释剂、稳定剂、等渗调节剂、和/或增溶或助溶剂等，优选进一步加入止痛剂例如利多卡因等，混匀。

10.如权利要求1-5中任一项所述的注射用组合物在制备美容和医疗产品中的应用。