CN115850523B - 一种单纯疱疹病毒ⅰ型特异性融合蛋白抗原及其制备方法和检测试剂盒 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种单纯疱疹病毒Ⅰ型特异性融合蛋白抗原及其制备方法和检测试剂盒，该单纯疱疹病毒Ⅰ型特异性融合蛋白抗原包含单纯疱疹病毒Ⅰ型糖蛋白G_22‑187序列片段的2倍重复，所述单纯疱疹病毒Ⅰ型糖蛋白G_22‑187序列片段的序列如SEQ ID NO:2所示。本发明还公开了一种前述的单纯疱疹病毒Ⅰ型特异性融合蛋白抗原的编码基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示。所述单纯疱疹病毒Ⅰ型特异性融合蛋白抗原可采用大肠杆菌表达体系进行高效表达，得到的融合蛋白抗原具备特异性好，灵敏度高的特点，重复表达的特异性位点使其抗原表位有效暴露，防止漏检，且使检测特异性得到提高。

Description

一种单纯疱疹病毒Ⅰ型特异性融合蛋白抗原及其制备方法和 检测试剂盒

技术领域

本发明涉及生物技术领域，尤其涉及一种单纯疱疹病毒Ⅰ型特异性融合蛋白抗原及其制备方法和检测试剂盒。

背景技术

单纯疱疹病毒I型(HSV-I)是一种嗜神经性的双链DNA包膜病毒，大量生存于自然界，可侵入人体和动物体发生感染，病毒通常经由黏膜、皮肤、神经组织等感染机体而致相关的病变，HSV-1型是世界上流行最广的病毒性感染之一，成年人血清中阳性率高达85％以上，某些国家和地区甚至达到100％。

HSV-I不仅可引起原发感染，而且可造成潜伏感染和再发。原发感染最常引起口咽部疱疹、疱疹性角膜结膜炎、脑炎和皮肤疱疹性湿疹等。感染后病毒可长期潜伏于机体内引起潜伏感染，期间疱疹病毒的结构与功能都不会遭到损坏与影响，并且这时病毒基因转录和表达有关的所有调节均为停滞状况，这期间不存在全面的基因组复制，可存有少量的局部基因转录，潜伏部位为三叉神经节和颈上神经节。潜伏的病毒可被激活，转为增殖性感染，引起局部复发性疱疹。

针对HSV-I的检查方法有很多，包括病毒分离培养、补体结合试验、中和试验、免疫荧光及酶联免疫吸附试验和DNA检测等，但是目前针对单纯疱疹病毒1的检测方法主要还是血清学检测和PCR检测，分别针对血清中存在抗体和病原核酸进行检测。

其中，PCR方法灵敏度高、特异性强，但反应条件要求高，并且也存在一定的假阳性反应。而HSV-I抗体检测仍是临床上最常用来检测HSV-I感染的手段，但血清学检测的特异性和灵敏性不高，常常造成假阳性结果。因此选用简便、快速准确，便于推广使用的诊断方法对于HSV-I的诊断具有重大意义。

免疫学检测主要包括酶联免疫吸附试验(ELISA)及胶体金等方法，速度快，对实验要求不高，不需要无菌操作，可以快速的、高通量的检测大量样品，同时也比较灵敏、可靠，并且已经在不同的病原检测中得到广泛应用。

但是从现有技术中公开的单纯疱疹病毒的血清学诊断方面的资料来看，免疫学检测目前主要存在以下方面的问题：一方面，不同单纯疱疹病毒之间存在严重的血清学交叉反应，在那些存在多种疱疹病毒流行的区域，由于混合感染，患者体内存在交叉抗体，使得免疫学诊断及鉴别诊断十分困难；另一方面，由于抗体可以在宿主体内存在很长时间，使得鉴别过去、最近还是现在感染流行性单纯疱疹病毒十分困难，对抗原的质量也提出了更高的要求。

但是目前还没有较为有效的单纯疱疹病毒Ⅰ型特异性抗原，高效应用于HSV-I的免疫学检测，这也是需要进一步解决的问题。

发明内容

针对上述问题，本发明提供了一种单纯疱疹病毒Ⅰ型特异性融合蛋白抗原及其制备方法和检测试剂盒，该特异性融合蛋白抗原具有特异性强、亲和力高的特点，其可在原核表达系统中进行高效表达，制备工艺相对简单，产量高，可适合进行大批量生产。

为解决上述问题，本申请采用以下的技术方案：

第一方面，本申请提供一种单纯疱疹病毒Ⅰ型特异性融合蛋白抗原，其特征在于，其包含单纯疱疹病毒Ⅰ型糖蛋白G_22-187序列片段的2倍重复，所述单纯疱疹病毒Ⅰ型糖蛋白G_22-187序列片段的序列如SEQ ID NO:2所示。

上述两个G_22-187序列片段进行前后串联连接，两者可进行直接连接，也可通过一段短肽进行连接。

优选地，所述单纯疱疹病毒Ⅰ型特异性融合蛋白抗原的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示，两个单纯疱疹病毒Ⅰ型糖蛋白G_22-187序列片段是通过柔性连接子Linker(GGGGS)4(即连接肽)串联而形成，为二价诊断抗原。

可选的实施例中，单纯疱疹病毒Ⅰ型特异性融合蛋白抗原是两个G_22-187序列片段直接连接而成，序列如SEQ ID NO:4所示。

第二方面，本申请提供一种前述单纯疱疹病毒Ⅰ型特异性融合蛋白抗原的编码基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示。

上述序列是针对大肠杆菌表达密码子优化后的优选核苷酸序列，表达量好。但是本申请的单纯疱疹病毒Ⅰ型特异性融合蛋白抗原的编码基因序列不限于SEQ ID NO:3所示的序列。

第三方面，本申请还提供一种重组载体，其由克隆载体或表达载体和前述的单纯疱疹病毒Ⅰ型特异性融合蛋白抗原的编码基因重组而成。

可选地，所述克隆载体和表达载体采用现有公开的，不限于本申请中的表达载体采用的pET28a-sumo。优选地，所述表达载体为pET28a-sumo。

第四方面，本申请还提供一种重组工程菌，所述重组工程菌是向宿主菌中转化前述的重组载体而成。

可选地，所述宿主菌为大肠杆菌。优选地，所述重组工程菌为大肠杆菌BL21(DE3)。大肠杆菌作为宿主用于表达本申请的重组抗原，具有培养成本低、生产工艺简单，易于监控，便于进行大批量生产。

第五方面，本申请还提供前述的单纯疱疹病毒Ⅰ型特异性融合蛋白抗原的制备方法，其包括以下步骤：

S1、将前述的编码基因序列连接至表达载体，构建重组表达载体；

S2、将重组表达载体转化至宿主菌中，筛选得到重组工程菌；

S3、将重组工程菌进行培养并诱导表达，并对产物进行分离和纯化得到单纯疱疹病毒Ⅰ型特异性融合蛋白抗原。

优选地，S3步骤后进行如下操作：

S4、得到的融合蛋白保存在保存缓存液中，所述保存缓冲液包括以下浓度的各成分10mM PBS，6％蔗糖，10％甘油(其余为水，即水为溶剂)中。保存在该保存缓冲液中的融合蛋白抗原更稳定，易于长期保存。

第六方面，本申请还提供一种检测试剂盒，其诊断抗原为前述的单纯疱疹病毒Ⅰ型特异性融合蛋白。采用这种检测试剂盒可检测样品中的单纯疱疹病毒I型，检测结果准确度高。

本发明具有以下有益效果：

(1)本发明提供了一种单纯疱疹病毒Ⅰ型特异性融合蛋白抗原，其采用大肠杆菌表达体系进行高效表达，通过优化密码子提高表达量。通过连接肽将优选的抗原位点的二倍体间进行串联，从而增加抗原位点的暴漏，提高融合蛋白的效价以及灵敏度。上述方法从源头上提高了单纯疱疹病毒Ⅰ型抗原的效价，减少诊断试剂盒中抗原的用量，增大了经济效益，且降低了该抗原的生产成本。

(2)本发明提供了一种适用于本申请的融合蛋白抗原的保存缓存液(10mM PBS，6％蔗糖，10％甘油)。本缓存液是在长期尝试中发现的稳定性缓冲液。其中，10mM PBS方便本融合蛋白可以直接应用于化学发光平台包被磁珠，6％蔗糖可以提高融合蛋白液态稳定性，10％甘油可以保护融合蛋白经受住反复冻融。虽然本缓冲液成分简单，但是诊断抗原追求的就是简单的缓冲液有利于诊断试剂盒的应用。

附图说明

图1为Bepipred Linear Epitope Prediction 2.0抗原分析结果；横坐标为氨基酸位置，纵坐标为抗原性分析分值，大于0.5为抗原位点；

图2为G-pET28a-sumo重组质粒双酶切琼脂糖凝胶电泳鉴定图；

图3为重组蛋白诱导表达鉴定图；

图4液态稳定性鉴定图。

具体实施方式

下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。在本发明中，若非特指，所采用的设备和原料等均可从市场购得或是本领域常用的。下述实施例中的方法，如无特别说明，均为本领域的常规方法。

实施例1一种单纯疱疹病毒1抗原表达载体的构建

(1)G-pET28a-sumo重组质粒构建

通过IEDB数据库和Bepipred Linear Epitope Prediction 2.0在线软件进行分析G的抗原位点，综合分析结果选择G_22-187，其氨基酸序列为SEQ ID NO:2，此抗原位点比较全面不会造成漏检。通过柔性Linker(即连接肽)进行抗原位点G_22-187二倍串联，增加抗原的暴漏性提高效价和灵敏度，从而得到单纯疱疹病毒Ⅰ型特异性融合蛋白抗原的氨基酸序列，其序列如SEQ ID NO:1所示。

接着，根据大肠杆菌的密码子偏好性进行优化密码子得到上述单纯疱疹病毒Ⅰ型特异性融合蛋白抗原的编码基因序列，其核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示，送生工生物技术有限公司进行序列合成。

利用BamHⅠ和EcoRⅠ对上述步骤合成的核苷酸序列及表达载体pET28a-sumo进行双酶切，酶切反应体系为：BamHⅠ(1ul)、EcoRⅠ(1ul)、10×QuickCut buffer(3ul)、G基因(20ul)、ddH₂O(5ul)，37℃酶切2h；反应结束后经1％的琼脂糖凝胶电泳，按照胶回收试剂盒的要求回收基因片段。将胶回收的特异性核苷酸序列和表达载体加入连接反应体系，连接反应体系为：特异性核苷酸(2μL)、线性化载体(2μL)、T4 DNALigase(1μL)、10×T4DNALigase Buffer(1μL)，16℃连接2h，连接后即为重组表达载体。

实施例2一种单纯疱疹病毒1抗原表达工程菌获得

(1)连接产物的转化

取10μl前述连接后产物加入到100μl的感受态细胞BL21中，轻轻混匀，置于冰上放置30min；42℃，热休克90s，迅速放入冰上，冰浴3min；加入500μl LB液体培养基，37℃180rpm温育1h；将转化菌液，常温，5000rpm离心10min，吸去部分上清培养基，剩余约100μl混匀，涂布于含有抗生素的LB平板上，37℃，培养过夜。

(2)重组工程菌获得

挑取阳性克隆接种于2ml的含有氨苄青霉素的LB培养基中培养，按质粒提取试剂盒说明书提取重组质粒，进行双酶切，酶切完毕的样品进行1％琼脂糖凝胶电泳作进行初步鉴定(酶切鉴定图如图2所示)。鉴定正确的菌株即为重组工程菌，保菌备用。

(3)重组抗原表达鉴定

用10μl枪头挑取平板上生长的阳性单菌落接种于含有LB培养基的试管中，37℃220rpm培养过夜，取200μl试管中生长的菌液至灭菌的含有2ml LB培养基的试管中，37℃，220rpm，至OD值约0.8，加入终浓度1mM IPTG，诱导表达5h，诱导条件是30℃，220rpm，5h。

收集菌落进行SDS-PAGE，鉴定目的蛋白在大肠杆菌BL21中表达情况(见图3)，其大小在50KD附近。

实施例3单纯疱疹病毒1抗原的表达和分离纯化

(1)重组抗原诱导表达

挑取阳性单克隆菌株接种于10mL含氨苄青霉素的LB培养液中，于温度为37℃，转速220r/min条件下，过夜培养，此为种子液；取5mL种子液接种于500mL含有氨苄青霉素的LB培养液，震荡培养2h后，测定OD₆₀₀在0.6-0.9之间，加入终浓度为1mM的诱导剂IPTG，继续以30℃，220rpm振荡培养5h，然后4℃，转速9000rpm条件下，离心15min，收集沉淀，-20℃保存备用。

(2)超声破碎

将每1g菌体沉淀用20mL超声用洗涤缓冲液(20mM咪唑、50mM NaH₂PO₄·2H₂O和500mM NaCl，Ph7.6)充分重悬，然后进行超声破碎，功率为250W，工作时间为超声2秒，停3秒，总时间8分钟，细菌破碎液4℃，90000r/min，离心10min，收集上清，得到破碎细菌上清。

(3)蛋白纯化

取2mL镍NTA琼脂糖凝胶FF预装柱，用40ml洗涤缓冲液平衡，将破碎细菌上清用0.45微米微孔滤膜过滤，然后以2ml/min上样，收集流出液，将流出液再次上样，以使蛋白样品充分结合到凝胶上，用40mL的洗涤缓冲液洗去未吸附的样品，流速2mL/min，用15ml的Elution buffer(配方：100mM咪唑、50mM NaH₂PO₄·2H₂O、500mM NaCl，Ph7.6)将靶蛋白洗脱下来，流速2mL/min，再用纯水冲洗柱子，灌满20％乙醇，封闭，以备下次使用。

最终通过上述方法得到的单纯疱疹病毒Ⅰ型特异性融合蛋白抗原的产量为15mg/L，纯化后的融合蛋白抗原的纯度为90％以上。

实施例4实施例和对比例的对比分析

1、实验设置

实验组是采用前述实施例1～3的方法操作制备得到单纯疱疹病毒Ⅰ型特异性融合蛋白抗原；分别设置对比例1～4，对比例1～4的抗原制备方法分别如下：

(1)对比例1抗原采用的蛋白与实验组一致，也采用G_22-187，不同之处在于，G_22-187两段序列之间的串联没有用Linker，为直接串联，序列如SEQ ID NO.4；其抗原参照实施例1-3步骤进行原核表达。

(2)对比例2采用的序列如SEQ ID NO.2所示，该序列没有进行二倍串联，仅采用一个G_22-187的序列，其他实验操作与实验组一致。

(3)对比例3采用的序列如SEQ ID NO.5所示，对比例4采用的序列如SEQ ID NO.6所示，其他实验操作与实验组一致。

表1 实施例和对比例抗原序列

试验组	序号	序列	氨基酸位置	特殊处理
					实验组	1	SEQ ID NO.1	22-187	Linker串联二倍体
对比例1	2	SE Q ID NO.4	22-187	直接串联二倍体
					对比例2	3	SEQ ID NO.2	22-187	单倍体未串联
对比例3	4	SEQ ID NO.5	100-238	单倍体未串联
					对比例4	5	SEQ ID NO.6	22-120	单倍体未串联

2、检测方法：

对实验组和各对比例制备的目的蛋白分别进行包被，标记鼠抗人IgG抗体，通过胶体金层析法分析临床阳性血清和阴性血清的特异性和灵敏度。

本实验具体测试步骤如下：

(1)用包被液(10mM PBS)分别将本发明中制备的重组抗原(实验组)和对比例1、对比例2，对比例3、对比例4的目的蛋白进行胶体金包被，鼠抗人IgG抗体经过标记预实验后进行标记；质控线(羊抗鼠)，所有包被原料使用划膜仪在NC膜上划线，37℃烘30min固相。将已固相化的NC膜与样品垫、金标垫、PVC底板、吸水纸、Mark贴组装，用切条机切成3～4mm的试纸条待用。

特异性＝真阴性/(真阴性+假阳性)，临床特异性评估样本：健康体检样本。

敏感性＝真阳性/(真阳性+假阴性)，临床敏感性评估样本：临床阳性样本。

(2)本检测卡对1000例RA临床阳性样本、100例健康体检样本进行检测。具体数据如下表2所示。

表2实验数据列表

3、实验结果及分析

(1)由表2的结果可知，本发明的实验组的重组抗原针对临床阳性样本的敏感性比对比例1提高了1.6％，相对于对比例2提高了24.7％；本发明的实验组的重组抗原针对临床阴性样本的特异性比对比例1提高了3％，相对于对比例2提高了8％；；这说明本申请通过Linker进行抗原位点的二倍串联可以大大提高敏感性和特异性。

(2)本发明的实验组的重组抗原针对临床阳性样本的敏感性比对比例3提高了47％，比对比例4提高了38.7％，本发明的实验组的重组抗原针对临床阳性样本的特异性比对比例3提高了59％，比对比例4提高了16％；这说明本申请选择的抗原位点可以大大提高临床阳本检测的敏感性和特异性。

综上所述，与对比例相比，本发明提供的重组抗原具有更好的敏感度和特异性，可以进一步应用到临床检测中。

实施例4重组蛋白的液态稳定性测试

1、实验方法

对实验组制备获得的前述重组抗原进行稳定性验证实验，分别设置为两组，具体验证稳定性方法如下：

将实验组1的重组抗原溶解在保存缓存液1(10mMPBS，6％蔗糖，10％甘油)，将实验组2的重组抗原溶解在保存缓冲液2(10mMPBS，10％甘油)中，两组分别在37℃放置7天，7天后取出实验组1、2的重组抗原，将其和-20℃冻存的重组抗原分别包被并用于检测相同的阳性质控血清和阴性质控血清。

2、实验结果及分析

结果见图4，实验结果表明，37℃放置7天后的实验1组的重组抗原的检测效果与-20℃冻存的检测效果相当；但是实验组2的重组抗原在37℃放置7天后的显色比-20℃冻存的显色降低，条带变浅。本发明的重组抗原的保存缓存液1为发明人经过多次验证后选择，使重组抗原的37℃液态稳定性较好，可以满足破坏实验的要求。

可以理解的是，对本领域普通技术人员来说，可以根据本发明的技术方案及本发明构思加以等同替换或改变，而所有这些改变或替换都应属于本发明所附的权利要求的保护范围。

Claims (9)

1.一种单纯疱疹病毒Ⅰ型特异性融合蛋白抗原，其特征在于，其由单纯疱疹病毒Ⅰ型糖蛋白G_22-187序列片段的2倍重复构成，所述单纯疱疹病毒Ⅰ型糖蛋白G_22-187序列片段的序列如SEQ ID NO:2所示，所述融合蛋白抗原的氨基酸序列如SEQ ID NO:4所示。

2.一种单纯疱疹病毒Ⅰ型特异性融合蛋白抗原，其特征在于，其氨基酸序列如SEQ IDNO:1所示，两个如权利要求1所述的单纯疱疹病毒Ⅰ型糖蛋白G_22-187序列片段由一个连接肽进行连接。

3.一种如权利要求2所述的单纯疱疹病毒Ⅰ型特异性融合蛋白抗原的编码基因，其特征在于，其核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示。

4.一种重组载体，其特征在于，由克隆载体或表达载体和如权利要求3所述的单纯疱疹病毒Ⅰ型特异性融合蛋白抗原的编码基因重组而成。

5.根据权利要求4所述的重组载体，其特征在于，所述重组载体为pET28a-sumo。

6.一种重组工程菌，其特征在于，所述重组工程菌是向宿主菌中转化如权利要求4所述的重组载体而成。

7.根据权利要求6所述的重组工程菌，其特征在于，所述重组工程菌为大肠杆菌BL21(DE3)。

8.如权利要求2所述的单纯疱疹病毒Ⅰ型特异性融合蛋白抗原的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

S1、将如权利要求3所述的编码基因序列连接至表达载体，构建重组表达载体；

S2、将重组表达载体转化至宿主菌中，筛选得到重组工程菌；

S3、将重组工程菌进行培养并诱导表达，并对产物进行分离和纯化得到单纯疱疹病毒Ⅰ型特异性融合蛋白抗原。

9.一种检测试剂盒，其特征在于，它的诊断抗原为权利要求1或2所述的单纯疱疹病毒Ⅰ型特异性融合蛋白。