CN104974231A - 一种新的猪繁殖与呼吸综合征病毒变异株gp5重组蛋白及其制备方法及应用 - Google Patents
一种新的猪繁殖与呼吸综合征病毒变异株gp5重组蛋白及其制备方法及应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了一种新的猪繁殖与呼吸综合征病毒变异株GP5重组蛋白及其制备方法及应用，所述新的猪繁殖与呼吸综合征病毒变异株GP5重组蛋白为可溶性表达PRRSV GP5完整蛋白或者可溶性表达融合TAT的PRRSV GP5蛋白，选用pCold 1F DNA高效可溶性表达了PRRSV变异株GP5蛋白及TAT-GP5融合蛋白，保证了重组蛋白的生物学功能，解决了现有的技术难以表达出完整的GP5蛋白的问题；豚鼠免疫接种试验表明，TAT-GP5融合蛋白能够显著提高机体体液免疫和细胞免疫水平。
Description
技术领域
本发明涉及一种猪繁殖与呼吸综合征病毒变异株GP5重组蛋白，具体是一种新的猪繁殖与呼吸综合征病毒变异株GP5重组蛋白及其制备方法及应用。
背景技术
猪繁殖与呼吸综合征是PRRSV引起的以妊娠母猪繁殖障碍以及仔猪的呼吸道症状和高死亡率为特征的猪的一种病毒性传染病，该病给各国养猪业造成了巨大的经济损失。自我国分离到该病毒以来，国内至少有22个省份发现该传染病，该传染病在有些省份甚至流行过。随着PRRSV的遗传和变异，尤其是2006年后，HP-PRRSV变异株的出现，给养猪业造成了巨大经济损失。免疫接种是目前防制PRRS的主要措施，但是PRRS灭活疫苗保护率低，活疫苗不能免疫妊娠母猪和种猪，使猪群存在免疫空白，不利于该病的彻底防制。PRRSV的高变异性也给疫苗免疫带来新的挑战。
GP5蛋白是PRRSV的重要结构蛋白之一，能起到参与体液免疫和细胞免疫的作用，并具有较高的免疫原性和中和活性，是研究PRRSV免疫保护的热点蛋白。但是，以GP5蛋白为靶蛋白的亚单位疫苗免疫效果并不理想，可能原因是：(1)GP5蛋白是糖基化的囊膜蛋白，含有高度保守的N-糖基化位点和高疏水区的信号肽序列，因而在大肠埃希菌等表达系统中的表达一直不够理想，很难表达出完整的GP5蛋白，在以往的研究中，多通过去除基因N端的信号肽序列或跨膜区或通过密码子优化等手段以期获得GP5蛋白的表达，但多以包涵体形式存在，可能影响GP5蛋白的生物学功能，尤其后期还需蛋白质复性才能获得可溶性蛋白，而复性是十分复杂的过程，且复性效率往往与特定蛋白质的性质有关，选择何种方法也需要反复试验，操作繁琐；(2)GP5蛋白抗原递呈作用比较弱。
pCold TF DNA为重组质粒载体，带有cspA(冷休克蛋白A)启动子及相关元件，使得菌体在低温15℃环境下培养时，目的蛋白质的产量得到了提高，此外，pCold TF DNA自带一段可溶性标签Trigger Factor(TF)，其作用是促使融合蛋白尽可能以可溶的形式存在，有效提高目的蛋白质的可溶性。
TAT是人免疫缺陷病毒1型(human immunodeficiency virus type 1，HIV-1)编码的反式转录激活因子蛋白(trans-activator of transcription)的英文简称。TAT蛋白中含有蛋白转导域(PTD)，是一段富含碱性氨基酸且带正电荷的多肽(含有11个核心氨基酸YGRKKRRQRRR)，该区域与蛋白的转导功能有关，能够携带外源生物大分子物质如蛋白质、多肽、核酸等通过细胞膜等生物活性膜，甚至可以通过血脑屏障。近年来，关于TAT跨膜转导作用的应用及免疫促进等方面的研究越来越多。2006年，Kittiworakarn J等的实验研究表明，HIV-TAT具有自佐剂(autoadjuvant)的能力，在没有佐剂存在的情况下，合成的TAT101即能增强体液免疫反应，而这种罕见的功能受控于HIV-TAT蛋白核心区域以及其形成半胱氨酸介导的寡聚物的能力(Kittiworakarn J，Lecoq A，Moine G，et al.HIV-1Tat raises an adjuvant-free humoral immune response controlled by its coreregion and its ability to formcysteine-mediated oligomers[J].J Biol Chem，2006，281(6)：3105-3115)。2010年，Kronenberg等在抗击利什曼原虫的研究中，利用TAT融合蛋白能有效刺激CD8+T细胞介导的保护性免疫反应(Kronenberg K，BroschS，Butsch F，et al.Vaccination with TAT-antigen fusion protein inducesprotective，CD8(+)T cell-mediated immunity against Leishmania major[J].Journalof Investigative Dermatology，2010，130(11)：2602-2610)。Gadzinski等于2012年发现HIV-TAT蛋白增强体液免疫应答的这种能力可以转移到无关抗原DT92-106(白喉毒素多肽)及T24-36(黑颈眼镜蛇α毒素多肽)上，即增强这两种合成抗原引起的免疫反应，而相比之下完整的TAT1-57多肽片段比部分片段TAT37-57的免疫效果好(Gadzinski A，MatzD，Favre E，et al.Transfer of the ability of HIV-1 Tat to raise an adjuvant-freehumoral immune response to unrelated antigens[J].Vaccine，2012，30(18)：2859-2868)。同时，Wu等通过实验发现了HIV-TAT的另一功能，该研究采用融合表达的方法，利用TAT的核心肽段可以提高外源蛋白EGFP在大肠杆菌中的高效可溶性表达(Wu Y，Ren C，Gao Y et al.A novel method for promot ing heterologous proteinexpression in Escherichia coli by fusion with the HIV-1 TAT core domain[J].AminoAcids，2010，39：811-820)。
因此，本发明选用pCold TF DNA高效可溶性表达了PRRSV变异株GP5蛋白及TAT-GP5融合蛋白，豚鼠免疫接种试验表明，TAT-GP5融合蛋白能够显著提高机体体液免疫和细胞免疫水平。
发明内容
本发明的目的在于提供一种新的可溶性表达的猪繁殖与呼吸综合征病毒变异株GP5重组蛋白及其制备方法及应用，融合TAT后，提高了重组蛋白的免疫原性。
为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：
一种新的猪繁殖与呼吸综合征病毒变异株GP5重组蛋白，为可溶性表达PRRSV GP5完整蛋白或者可溶性表达融合TAT的PRRSV GP5蛋白，所述可溶性表达PRRSV GP5完整蛋白的核苷酸序列为：GGGGTACCATGTTGGGGAAGTGCTTGACCGCGTGCTGTTGCTCGCGATTGCTTTCTTTGTGGTGTATCGTGCTGTGCTATCTTGCTGTGCTCGTCAACGCCAGCAACAACAACAGCTCTCATATTCAGTTGATTTATAACTTAACGCTATGTGAGCTGAATGGCACAGATTGGCTGGCACAAAAATTTGACTGGGCAGTGGAGACTTTTGTCATCTTCCCCGCGTTGACTCACATTGTTTCCTATGGGGCACTCACCACCAGCCATTTCCTTGACACAGTTGGTCTGGCCACTGTGTCCACCGCCGGATATTATCACGGGCGGTATGTCTTGAGTAGCATTTACGCAGTCTGTGCTCTGGCTGCGCTGATTTGCTTTGTCATTAGGCTTGCGAAGAACTGCATGTCCTGGCGCTACTCTTGTACCAGATATACCAACTTCCTTCTGGACACTAAGGGCAGACTTTATCGTTGGCGGTCGCCCGTCATTGTGGAGAAAAGGGGTAAGGTTGAGGTCGAAGGTCACCTGATCGACCTCAAGAGAGTTGTGCTTGATGGTTCCGCGGCAACCCCTTTAACCAGAGTTTCAGCGGAACTATGGGGTCGTCCCTAG，如SEQID NO：1所示，其中，斜体部分为引物区域；所述可溶性表达融合TAT的PRRSV GP5蛋白的核苷酸序列为：GGGGTACCGGCAGGAAGAAGCGGAGACAGCGACGAAGACCTCCTCAATGCATGTTGGGGAAGTGCTTGACCGCGTGCTGTTGCTCGCGATTGCTTTCTTTGTGGTGTATCGTGCTGTGCTATCTTGCTGTGCTCGTCAACGCCAGCAACAACAACAGCTCTCATATTCAGTTGATTTATAACTTAACGCTATGTGAGCTGAATGGCACAGATTGGCTGGCACAAAAATTTGACTGGGCAGTGGAGACTTTTGTCATCTTCCCCGCGTTGACTCACATTGTTTCCTATGGGGCACTCACCACCAGCCATTTCCTTGACACAGTTGGTCTGGCCACTGTGTCCACCGCCGGATATTATCACGGGCGGTATGTCTTGAGTAGCATTTACGCAGTCTGTGCTCTGGCTGCGCTGATTTGCTTTGTCATTAGGCTTGCGAAGAACTGCATGTCCTGGCGCTACTCTTGTACCAGATATACCAACTTCCTTCTGGACACTAAGGGCAGACTTTATCGTTGGCGGTCGCCCGTCATTGTGGAGAAAAGGGGTAAGGTTGAGGTCGAAGGTCACCTGATCGACCTCAAGAGAGTTGTGCTTGATGGTTCCGCGGCAACCCCTTTAACCAGAGTTTCAGCGGAACTATGGGGTCGTCCCTAG，如SEQ ID NO：2所示，其中，斜体部分为引物区域，粗体部分为TAT序列。
所述的新的猪繁殖与呼吸综合征病毒变异株GP5重组蛋白的制备方法，包括以下步骤：
(1)目的基因的克隆，包括以下步骤：
11)引物的设计与合成：根据美洲型PRRSV变异株LX13(2)核苷酸序列，设计扩增TAT-ORF5(V)及ORF5(V)基因的两对特异性引物TAT-ORF5(V)-P1、TAT-ORF5(V)-P2和ORF5(V)-P1、ORF5(V)-P2，引物TAT-ORF5(V)-P1的核苷酸序列为5’-GGGGTACCGGCAGGAAGAAGCGGAGACAGCGACGAAGACCTCCTCAATGCATGTTGGGGAAGTGCTTG-3’，如SEQ ID NO：3所示，引物TAT-ORF5(V)-P2的核苷酸序列为5’-GGAATTCCTAGAGACGACCCCATAG-3’，如SEQ ID NO：4所示，引物ORF5(V)-P1的核苷酸序列为5’-GGGGTACCATGTTGGGGAAGTGCTTG-3’，如SEQ ID NO：5所示，引物ORF5(V)-P2的核苷酸序列为5’-GGAATTCCTAGAGACGACCCCATAG-3’，如SEQID NO：6所示；其中，粗体部分为TAT序列，并在引物的上、下游5’端分别引入EcoR I和Kpn I酶切位点；在引物合成后，用ddH2O稀释为终浓度为20pmol/μL，置-20℃保存；
12)TAT-ORF5(V)及ORF5(V)的扩增：以重组质粒pMD18-T-ORF5(V)为模板，用无菌ddH2O稀释20倍后，以引物TAT-ORF5(V)-P1/TAT-ORF5(V)-P2进行PCR扩增TAT-ORF5(V)；以引物ORF5(V)-P1/ORF5(V)-P2扩增ORF5(V)基因；PCR产物进行1％琼脂糖凝胶电泳，并利用MiniBESTDNA快速胶回收试剂盒回收PCR产物；
(2)重组原核表达载体pCold-TF-TAT-GP5(V)及pCold-TF-GP5(V)的构建及鉴定，包括以下步骤：
21)原核表达载体pCold TF DNA和目的基因的双酶切回收；
22)目的片段与表达载体的连接；
23)重组表达质粒pCold-TF-TAT-GP5(V)和pCold-TF-GP5(V)的鉴定；
(3)重组原核表达质粒pCold-TF-TAT-GP5(V)及pCold-TF-GP5(V)的诱导表达，包括以下步骤：
31)重组表达质粒转化BL21感受态细胞；
32)重组菌的IPTG诱导表达；
33)重组蛋白的可溶性分析；
(4)重组表达蛋白TF-TAT-GP5(V)及TF-GP5(V)的检测：对SDS-PAGE验证正确的蛋白进行Western-Blot鉴定；分别重新诱导BL21/pCold-TF-GP5、BL21/pCold-TF-TAT-GP5及BL21/pCold TF DNA对照，将菌液处理后进行SDS-PAGE电泳，待电泳结束后，将凝胶上的条带转印到固相载体膜上，并以鼠抗His标签单克隆抗体作为一抗，以HRP标记的羊抗鼠IgG作为二抗，进行Western-Blot鉴定；
(5)重组蛋白TF-TAT-GP5(V)及TF-GP5(V)的纯化，包括以下步骤：
51)重组蛋白的大量诱导表达；
52)重组蛋白的纯化回收。
作为本发明进一步的方案：所述步骤32)包括以下步骤：挑取阳性克隆接种到6ml Amp+(50μg/ml)LB肉汤培养基，置于37℃，200rpm振荡培养过夜；按1∶100比例接种于6ml含有50μg/ml Amp的LB液体培养基中，37℃，220rpm剧烈振荡2-3h，当培养液的D600nm值为0.4-0.9时，立即将培养液移至15℃放置30min；添加异丙基硫代-β-D-半乳糖苷(IPTG)至终浓度为0.1-1.0mM，15℃条件下培养19-25h；培养结束后取1ml菌液，10000rpm离心5min，弃去上清，将菌体沉淀用30μL PBS重悬后，加入10μL 4×SDS上样缓冲液，混合均匀后煮沸10min，冷却至室温，取样进行SDS-PAGE电泳检测；并设空载体表达菌对照及未诱导的重组质粒表达菌对照。
作为本发明进一步的方案：培养液的D600nm值为0.4-0.5；添加异丙基硫代-β-D-半乳糖苷(IPTG)至终浓度为0.1-1.0mM，15℃条件下培养24h。
所述的新的猪繁殖与呼吸综合征病毒变异株GP5重组蛋白的应用，用于预防猪繁殖与呼吸综合征病毒变异株的感染，包括：(1)制备猪繁殖与呼吸综合征病毒疫苗；(2)制备预防或治疗猪繁殖与呼吸综合征的药物；(3)制备诊断或检测猪繁殖与呼吸综合征的产品。
与现有技术相比，本发明的有益效果是：本发明选用pCold TF DNA高效可溶性表达了PRRSV变异株GP5蛋白及TAT-GP5融合蛋白，保证了重组蛋白的生物学功能，解决了现有的技术难以表达出完整的GP5蛋白的问题；豚鼠免疫接种试验表明，TAT-GP5融合蛋白能够显著提高机体体液免疫和细胞免疫水平，即融合了TAT，提高了重组蛋白的免疫原性。
附图说明
图1是PCR扩增TAT-ORF5(V)基因；
图2是PCR扩增ORF5(V)基因；
图3是重组质粒pCold-TF-TAT-GP5(V)的PCR及双酶切鉴定；
图4是重组质粒pCold-TF-GP5(V)的PCR及双酶切鉴定；
图5是pCold-TF-TAT-GP5(V)在BL21中的表达；
图6是pCold-TF-GP5(V)在BL21中的表达及可溶性分析；
图7是pCold-TF-TAT-GP5(V)在BL21中表达产物的可溶性分析；
图8是重组质粒pCold-TF-GP5(V)经不同浓度IPTG诱导表达；
图9是重组质粒pCold-TF-GP5(V)经不同时间诱导表达；
图10是诱导前菌液浓度优化；
图11是重组蛋白的Westen-Blot；
图12是重组蛋白TF-TAT-GP5(V)的纯化；
图13是重组蛋白TF-GP5(V)的纯化；
图14是免疫豚鼠血清IFN-γ含量检测；
图15是免疫豚鼠血清IL-4含量检测。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例及附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
本发明实施例中，一种新的猪繁殖与呼吸综合征病毒变异株GP5重组蛋白，为可溶性表达PRRSV GP5完整蛋白或者可溶性表达融合TAT的PRRSV GP5蛋白，所述可溶性表达PRRSVGP5完整蛋白的核苷酸序列为：GGGGTACCATGTTGGGGAAGTGCTTGACCGCGTGCTGTTGCTCGCGATTGCTTTCTTTGTGGTGTATCGTGCTGTGCTATCTTGCTGTGCTCGTCAACGCCAGCAACAACAACAGCTCTCATATTCAGTTGATTTATAACTTAACGCTATGTGAGCTGAATGGCACAGATTGGCTGGCACAAAAATTTGACTGGGCAGTGGAGACTTTTGTCATCTTCCCCGCGTTGACTCACATTGTTTCCTATGGGGCACTCACCACCAGCCATTTCCTTGACACAGTTGGTCTGGCCACTGTGTCCACCGCCGGATATTATCACGGGCGGTATGTCTTGAGTAGCATTTACGCAGTCTGTGCTCTGGCTGCGCTGATTTGCTTTGTCATTAGGCTTGCGAAGAACTGCATGTCCTGGCGCTACTCTTGTACCAGATATACCAACTTCCTTCTGGACACTAAGGGCAGACTTTATCGTTGGCGGTCGCCCGTCATTGTGGAGAAAAGGGGTAAGGTTGAGGTCGAAGGTCACCTGATCGACCTCAAGAGAGTTGTGCTTGATGGTTCCGCGGCAACCCCTTTAACCAGAGTTTCAGCGGAACTATGGGGTCGTCCCTAG，如SEQ ID NO：1所示，其中，斜体部分为引物区域；所述可溶性表达融合TAT的PRRSV GP5蛋白的核苷酸序列为：GGGGTACCGGCAGGAAGAAGCGGAGACAGCGACGAAGACCTCCTCAATGCATGTTGGGGAAGTGCTTGACCGCGTGCTGTTGCTCGCGATTGCTTTCTTTGTGGTGTATCGTGCTGTGCTATCTTGCTGTGCTCGTCAACGCCAGCAACAACAACAGCTCTCATATTCAGTTGATTTATAACTTAACGCTATGTGAGCTGAATGGCACAGATTGGCTGGCACAAAAATTTGACTGGGCAGTGGAGACTTTTGTCATCTTCCCCGCGTTGACTCACATTGTTTCCTATGGGGCACTCACCACCAGCCATTTCCTTGACACAGTTGGTCTGGCCACTGTGTCCACCGCCGGATATTATCACGGGCGGTATGTCTTGAGTAGCATTTACGCAGTCTGTGCTCTGGCTGCGCTGATTTGCTTTGTCATTAGGCTTGCGAAGAACTGCATGTCCTGGCGCTACTCTTGTACCAGATATACCAACTTCCTTCTGGACACTAAGGGCAGACTTTATCGTTGGCGGTCGCCCGTCATTGTGGAGAAAAGGGGTAAGGTTGAGGTCGAAGGTCACCTGATCGACCTCAAGAGAGTTGTGCTTGATGGTTCCGCGGCAACCCCTTTAACCAGAGTTTCAGCGGAACTATGGGGTCGTCCCTAG，如SEQ ID NO：2所示，其中，斜体部分为引物区域，粗体部分为TAT序列。
实施例1 GP5重组蛋白的设计、表达与纯化
1.1 目的基因的克隆
1.1.1 引物的设计与合成
根据美洲型PRRSV变异株LX13(2)核苷酸序列，应用Primer 5.0软件设计可以扩增TAT-ORF5(V)及ORF5(V)基因的两对特异性引物，并在引物的上、下游5’端分别引入EcoRI和Kpn I酶切位点，并交由宝生物工程(大连)有限公司合成，预期扩增的片段长度分别在660bp和618bp左右。用ddH2O稀释为终浓度为20pmol/μL，置-20℃保存。具体引物信息见表1，如SEQ ID NO：3-6所示。
表1 PRRSV TAT-ORF5(V)及ORF5(V)基因扩增引物序列
注：粗体部分为TAT序列，在上游引物引入TAT，使之和GP5融合表达
1.1.2 TAT-ORF5(V)及ORF5(V)的扩增
以重组质粒pMD18-T-ORF5(V)为模板，用无菌ddH2O稀释20倍后，以引物TAT-ORF5(V)-P1/TAT-ORF5(V)-P2进行PCR扩增TAT-ORF5(V)；以引物ORF5(V)-P1/ORF5(V)-P2扩增ORF5(V)基因。在PCR管中依次加入以下试剂，配成体积为25μL的扩增体系(见表2)，所有操作均在冰盒上进行。PCR产物进行1％琼脂糖凝胶电泳，并利用MiniBEST DNA快速胶回收试剂盒回收PCR产物。
表2 PCR反应体系(25μL)
| 组分 | 体积 |
| 5×PrimeSTAR Buffer(Mg2+plus) | 5.0μL |
| dNTP Mixture(2.5mM) | 1.5μL |
| PrimeSTAR HS DNA polymerase | 0.5μL |
| P1(20pmol/μL) | 0.5μL |
| P2(20pmol/μL) | 0.5μL |
| DNA模板 | 1.0μL |
| 灭菌ddH2O | 16μL |
| 总体积 | 25μL |
1.2 重组原核表达载体pCold-TF-TAT-GP5(V)及pCold-TF-GP5(V)的构建及鉴定
1.2.1 原核表达载体pCold TF DNA和目的基因的双酶切回收
按天根公司TIANpure Mini Plasmid Kit高纯度质粒小提试剂盒的方法制备pCold TFDNA质粒。将获得的pCold TF DNA质粒和纯化回收后的含目的基因TAT-ORF5(V)和ORF5(V)的PCR产物分别用EcoR I和Kpn I限制性内切酶于37℃作用3h进行双酶切反应。酶切产物进行1％琼脂糖凝胶电泳，并利用MiniBEST DNA快速胶回收试剂盒回收具有粘性末端的载体基因片段。
1.2.2 目的片段与表达载体的连接
分别将回收的目的基因片段TAT-ORF5(V)和ORF5(V)与原核表达载体pCold TF DNA片段用T4连接酶进行连接，在冰上操作。混合均匀后，16℃，过夜反应。连接产物转化大肠杆菌DH-5α。
1.2.3 重组表达质粒pCold-TF-TAT-GP5(V)和pCold-TF-GP5(V)的鉴定
在转化平板上用无菌枪头挑取6-8个单菌落，接种于含Amp(100μg/ml)的LB液体培养基中，37℃，220rpm振荡培养9-12h，按天根公司TIANpure Mini Plasmid Kit高纯度质粒小提试剂盒的方法制备重组质粒。对质粒进行PCR鉴定和EcoR I/Kpn I双酶切鉴定，鉴定正确的质粒及保存的相应菌液，送至北京六合华大基因科技股份有限公司测序。
1.3 重组原核表达质粒pCold-TF-TAT-GP5(V)及pCold-TF-GP5(V)的诱导表达
1.3.1 重组表达质粒转化BL21感受态细胞
取1.2.3 保存的重组表达质粒pCold-TF-TAT-GP5(V)和pCold-TF-GP5(V)各8μL，分别接种到100μL大肠杆菌BL21感受态细胞中，按照常规方法转化，并在LB平板上筛选转化子。
1.3.2 重组菌的IPTG诱导表达
挑取阳性克隆接种到6ml Amp+(50μg/ml)LB肉汤培养基，置于37℃，200rpm振荡培养过夜。按1∶100比例接种于6ml含有50μg/ml Amp的LB液体培养基中，37℃，220rpm剧烈振荡2-3h，当培养液的D600nm值为0.4-0.5时，立即将培养液移至15℃放置30min。添加异丙基硫代-β-D-半乳糖苷(IPTG)至终浓度为1.0mM，15℃条件下培养24h。培养结束后取1ml菌液，10000rpm离心5min，弃去上清，将菌体沉淀用30μL PBS重悬后，加入10μL 4×SDS上样缓冲液，混合均匀后煮沸10min，冷却至室温，取样进行SDS-PAGE电泳检测。并设空载体表达菌(BL21/pCold TF DNA)对照及未诱导的重组质粒表达菌(BL21/pCold-TF-TAT-GP5(V)和BL21/pCold-TF-GP5(V))对照。
1.3.3 重组蛋白的可溶性分析
取5ml诱导表达后的菌液10000rpm离心5min，并收集菌体，经200μL PBS缓冲液重悬后，进行超声波破碎，超声条件为：超声2s，间隔4s，再超声2s，直至菌液较为清亮时停止。4℃，12000rpm离心10min，分离上清和沉淀，在沉淀中加入200μL PBS重悬。按3∶1比例加入等量的4×SDS上样缓冲液，煮沸10min。分别取样进行SDS-PAGE电泳，确定表达产物的存在形式。
1.3.4 重组蛋白诱导表达条件的优化
1.3.4.1 IPTG诱导浓度的优化
挑取阳性克隆接种到3ml Amp+(50μg/ml)LB肉汤培养基，置于37℃，200rpm振荡培养过夜。按1∶100比例，各取50μL分别接种于5ml含有50μg/ml Amp的LB液体培养基中，37℃，220rpm剧烈振荡约2h，使菌液的D600nm值达到0.4-0.5，立即将培养液移至15℃水浴30min。分别添加IPTG至终浓度为0.1、0.2、0.5、0.8、1.0mM，15℃条件下175rpm震荡培养24h。取1ml菌液，10000rpm离心5min，弃去上清，将菌体沉淀用30μLPBS重悬后，加入10μL 4×SDS上样缓冲液，混合均匀后煮沸10min，冷却至室温，取样进行SDS-PAGE电泳检测。并分别设未诱导的重组质粒表达菌(BL21/pCold-TF-TAT-GP5(V)和BL21/pCold-TF-GP5(V))对照。
1.3.4.2 最佳诱导时间的优化
挑取阳性克隆接种到3ml Amp+(50μg/ml)LB肉汤培养基，置于37℃，200rpm振荡培养过夜。按1∶100比例，各取50μL分别接种于5ml含有50μg/ml Amp的LB液体培养基中，37℃，220rpm剧烈振荡约2h，使菌液的D600nm值达到0.4-0.5，立即将培养液移至15℃水浴30min。分别添加IPTG至终浓度为1.0mM，15℃条件下175rpm震荡培养19h、20h、21h、22h、23h、24h、25h。取1ml菌液，10000rpm离心5min，弃去上清，将菌体沉淀用30μL PBS重悬后，加入10μL 4×SDS上样缓冲液，混合均匀后煮沸10min，冷却至室温，取样进行SDS-PAGE电泳检测。并分别设未诱导的重组质粒表达菌(BL21/pCold-TF-TAT-GP5(V)和BL21/pCold-TF-GP5(V))对照。
1.3.4.3 诱导前菌液浓度的优化
挑取阳性克隆接种到3ml Amp+(50μg/ml)LB肉汤培养基，置于37℃，200rpm振荡培养过夜。按1∶100比例，各取50μL分别接种于5ml含有50μg/ml Amp的LB液体培养基中，37℃，220rpm剧烈振荡约1-3h，使菌液的D600nm值分别达到0.4-0.5、0.5-0.6、0.6-0.7、0.7-0.8、0.8-0.9，立即将培养液移至15℃水浴30min。分别添加IPTG至终浓度为1.0mM，15℃条件下175rpm震荡培养24h。取1ml菌液，10000rpm离心5min，弃去上清，将菌体沉淀用30μL PBS重悬后，加入10μL 4×SDS上样缓冲液，混合均匀后煮沸10min，冷却至室温，取样进行SDS-PAGE电泳检测。并分别设未诱导的重组质粒表达菌(BL21/pCold-TF-TAT-GP5(V)和BL21/pCold-TF-GP5(V))对照。
1.4 重组表达蛋白TF-TAT-GP5(V)及TF-GP5(V)的检测
对SDS-PAGE验证正确的蛋白进行Western-Blot鉴定。分别重新诱导BL21/pCold-TF-GP5、BL21/pCold-TF-TAT-GP5及BL21/pCold TF DNA对照，将菌液处理后按常规方法进行SDS-PAGE电泳(使用蛋白预染Marker)，待电泳结束后，将凝胶上的条带转印到固相载体膜上，并以鼠抗His标签单克隆抗体作为一抗，以HRP标记的羊抗鼠IgG作为二抗，进行Western-Blot鉴定。
1.5 重组蛋白TF-TAT-GP5(V)及TF-GP5(V)的纯化
1.5.1 重组蛋白的大量诱导表达
(1)无菌吸取阳性转化菌菌液BL21/pCold-TF-GP5和BL21/pCold-TF-TAT-GP5各30μL，接种于4ml含有50μg/ml Amp的LB液体培养基中，37℃，190rpm振荡培养过夜。
(2)次日，取上述菌液3ml各接种于300ml含有50μg/ml Amp的LB液体培养基中，并按100ml/瓶分装至灭菌的500ml锥形瓶中，37℃，220rpm剧烈振荡约2.5h，使菌液的D600nm值分别达到0.6-0.8。
(3)立即将培养液移至15℃水浴30min后，分别添加IPTG至终浓度为1.0mM，15℃条件下175rpm震荡培养22h。取样进行SDS-PAGE电泳。
1.5.2 重组蛋白的纯化回收
按照GE Healthcare公司的His Trap HP亲和层析柱的步骤进行蛋白的纯化回收。
1.6 结果
1.6.1 目的基因的PCR扩增
请参阅图1和2，TAT-ORF5(V)和ORF5(V)基因的PCR扩增产物分别经1.0％琼脂糖凝胶电泳检测，结果表明，在660bp和618bp左右各出现一条特异性条带，与预期的两个目的片段大小一致；其中，M为分子量对照，泳道1为阴性对照，泳道2为TAT-ORF5(V)基因的PCR扩增产物。
1.6.2 重组表达质粒pCold-TF-TAT-GP5(V)和pCold-TF-GP5(V)的鉴定
1.6.2.1 重组质粒pCold-TF-TAT-GP5(V)和pCold-TF-GP5(V)的PCR鉴定
请参阅图3和4，以蓝白斑筛选获得的重组质粒pCold-TF-TAT-GP5(V)和pCold-TF-GP5(V)为模板，经PCR扩增和琼脂糖凝胶电泳后，在紫外下可以分别看到长约660bp和618bp左右的片段，与预期结果一致；其中，M为分子量对照，泳道3为重组质粒pCold-TF-TAT-GP5(V)或者重组质粒pCold-TF-GP5(V)的PCR鉴定。
1.6.2.2 重组质粒pCold-TF-TAT-GP5(V)和pCold-TF-GP5(V)的双酶切鉴定
请参阅图3和4，重组质粒pCold-TF-TAT-GP5(V)和pCold-TF-GP5(V)分别经EcoR I和Kpn I酶切，经1.0％琼脂糖凝胶电泳后，均可得到2条特异条带，其中一条都是长约5769bp(pCold TF DNA载体片段)，另一条则分别为660bp的TAT-ORF5(A)片段和618bp的ORF5(A)片段，与预期结果一致；表明两段目的基因均已正确插入到pCold TF DNA载体的EcoR I和Kpn I位点中；其中，M为分子量对照，泳道1为pCold TF DNA的双酶切产物，泳道2为重组质粒pCold-TF-TAT-GP5(V)或者重组质粒pCold-TF-GP5(V)的双酶切产物。
1.6.2.3 重组质粒pCold-TF-TAT-GP5(V)和pCold-TF-GP5(V)的测序结果
经北京六合华大基因科技股份有限公司测序以及DNA序列分析，结果表明，目的基因TAT-ORF5(V)和ORF5(V)均分别插入载体pCold TF DNA中，其插入位置、方向和阅读框均完全正确；且目的基因片段的碱基未发生突变。
1.6.3 表达产物的SDS-PAGE
请参阅图5和6，pCold-TF-TAT-GP5(V)和pCold-TF-GP5(V)重组转化菌经IPTG于15℃诱导24h后，经SDS-PAGE电泳，分别在77.0kDa和75.2kDa附近出现一特异性蛋白条带，与预期大小基本一致，而未经诱导的重组菌均为出现特有的目的条带。同时，空载体pColdTF DNA转化菌经IPTG诱导后可表达大小为52.0kDa左右的TF蛋白；其中，图5的M为低分子质量蛋白质Marker，泳道1为TF空载体对照，泳道2为未诱导BL21/pCold-TF-TAT-GP5(V)，泳道3为IPTG诱导BL21/pCold-TF-TAT-GP5(V)；图6的M为低分子质量蛋白质Marker，泳道1为未诱导BL21/pCold-TF-GP5(V)，泳道2为IPTG诱导BL21/pCold-TF-GP5(V)，泳道3为IPTG诱导BL21/pCold-TF-GP5(V)裂解上清，泳道4为IPTG诱导BL21/pCold-TF-GP5(V)裂解沉淀，泳道5为IPTG诱导BL21/pCold-TF-GP5(V)裂解全菌，泳道6为TF空载体对照。
1.6.4 目的蛋白的可溶性分析
请参阅图6和7，将诱导表达后的菌体经超声波破碎菌体后，经离心获得重组菌上清及沉淀。分别取裂解后的全菌、上清及沉淀进行SDS-PAGE电泳，结果显示，融合蛋白TF-TAT-GP5(V)和TF-GP5(V)的目的条带(77.0kDa和75.2kDa)，均主要出现在菌体裂解上清中，且条带清晰，沉淀中则几乎没有，表明融合蛋白TF-TAT-GP5(V)和TF-GP5(V)主要以可溶性形式存在；其中，图7的M为低分子质量蛋白质Marker，泳道1为IPTG诱导BL21/pCold-TF-TAT-GP5(V)裂解全菌，泳道2为IPTG诱导BL21/pCold-TF-TAT-GP5(V)裂解沉淀，泳道3为IPTG诱导BL21/pCold-TF-TAT-GP5(V)裂解上清。
1.6.5 重组蛋白的最佳诱导条件
以融合蛋白TF-GP5(V)的表达为例，分别对IPTG诱导浓度、诱导时间以及诱导前菌液浓度3个条件进行了优化，获得了重组蛋白TF-GP5(V)的最佳诱导表达条件，该条件同样适用于融合蛋白TF-TAT-GP5(V)的表达。结果如下：
1.6.5.1 最佳IPTG诱导浓度
请参阅图8，在菌液(OD600＝0.4-0.5)中分别添加IPTG至终浓度为0.1、0.2、0.5、0.8、1.0、1.2、1.5mM，15℃条件下175rpm震荡培养24h，其余条件均保持不变，分别取样进行SDS-PAGE电泳检测；电泳结果表明，当IPTG终浓度为1.0mM时，目的蛋白有较高水平的表达量；其中，图8中的M为低分子质量蛋白质Marker，泳道1-7是BL21/pCold-TF-GP5(V)分别用0.1、0.2、0.5、0.8、1.0、1.2、1.5mM IPTG诱导。
1.6.5.2 最佳诱导时间
请参阅图9，在其它条件均保持不变的情况下，在菌液(OD600＝0.4-0.5)中分别添加IPTG至终浓度1.0mM，15℃条件下175rpm分别震荡培养19h、20h、21h、22h、23h、24h、25h，分别取样进行SDS-PAGE电泳检测；电泳结果表明，当诱导时间为22h时，目的蛋白有较高水平的表达量；其中，图9中的M为低分子质量蛋白质Marker，泳道1-7是BL21/pCold-TF-GP5(V)分别诱导19h-25h。
1.6.5.3 最佳诱导前菌液浓度
请参阅图10，诱导前，菌液在37℃，220rpm剧烈振荡约1-3h，使菌液的D600nm值分别达到0.4-0.5、0.5-0.6、0.6-0.7、0.7-0.8、0.8-0.9，立即将培养液移至15℃水浴30min。分别添加IPTG至终浓度为1.0mM，15℃条件下175rpm震荡培养24h，其余诱导条件均一致。分别取样进行SDS-PAGE电泳检测。电泳结果表明，当诱导前菌液的浓度达到D600nm值为0.7-0.8时，目的蛋白表达量最高；其中，图10中的M为低分子质量蛋白质Marker，泳道1-5是BL21/pCold-TF-GP5(V)菌液浓度为OD600＝0.4-0.5、0.5-0.6、0.6-0.7、0.7-0.8、0.8-0.9时进行IPTG诱导。
1.6.6 重组蛋白的Western-Blot鉴定
请参阅图11，目的蛋白转至PVDF膜上，经一抗、二抗孵育，DAB显色后的结果显示，重组融合蛋白TF-TAT-GP5(V)和TF-GP5(V)均能与鼠抗His标签单克隆抗体发生特异性反应，并分别在77.0kDa和75.2kDa大小附近出现清晰的反应条带，表明该融合蛋白具有良好的抗原性。带有His标签的TF空载体蛋白也出现一条清晰的条带(52.0kDa)；其中，图11中的M为PageRuler预染蛋白质Marker，泳道1为IPTG诱导BL21/pCold-TF-TAT-GP5(V)，泳道2为IPTG诱导BL21/pCold-TF-GP5(V)，泳道3为TF空载体对照。
1.6.7 重组蛋白的纯化
请参阅图12和13，经纯化获得较纯的重组蛋白，蛋白质分子质量与理论预测值一致，约为75.2kDa；其中，图12中的M为PageRuler预染蛋白质Marker，泳道1为IPTG诱导BL21/pCold-TF-TAT-GP5(V)或BL21/pCold-TF-GP5(V)纯化后，泳道2为IPTG诱导BL21/pCold-TF-GP5(V)纯化前。
实施例2 豚鼠免疫接种试验
2.1 豚鼠的免疫及血清制备
2.1.1 纯化蛋白TF-TAT-GP5(V)和TF-GP5(V)的预处理/免疫原的制备
将重组蛋白的纯化回收收集到的含有纯化蛋白TF-TAT-GP5(V)和TF-GP5(V)的洗脱液吸出，分别转至经缓冲液处理好的透析袋中(透析袋要预留出一段空间以防透析过程中，袋外的水和缓冲液过量进入袋内将袋涨破)，用封口夹夹住透析袋的两端后，分别悬空放置在盛满PBS缓冲液的大烧杯中，烧杯中放入磁力棒，将烧杯置于加热磁力搅拌器上，只打开搅拌电源(不加热)，调整搅拌速度。每隔12h更换一次PBS缓冲液，共透析72h。收集透析后的纯化蛋白。以相同方法准备空载体TF蛋白。
2.1.2 豚鼠的分组及免疫
将购买自山东省济南西岭角养殖繁育中心的体重约为300g的清洁级豚鼠随机分为5组，每组5只。5组豚鼠的卫生消毒、饲料、饮水、用具、饲养环境等方面完全相同。将TF-TAT-GP5(V)蛋白\TF-GP5(V)蛋白和空载体TF蛋白分别以500μg/只的剂量混合弗氏佐剂进行皮下多点注射，共免疫3次，每次间隔2周，疫苗对照组注射等量疫苗，阴性对照组注射等量生理盐水，具体分组及免疫程序如表3所示。
表3 豚鼠免疫试验分组及免疫程序
| 分组 | 免疫情况 | 免疫途径 | 佐剂 | 免疫数量 | 剂量 | 次数 |
| A | TF-TAT-GP5(V)蛋白 | 皮下多点 | 弗氏佐剂 | 5只 | 500μg/ml/只 | 3次 |
| B | TF-GP5(V)蛋白 | 皮下多点 | 弗氏佐剂 | 5只 | 500μg/ml/只 | 3次 |
| C | 弱毒疫苗 | 皮下多点 | 无 | 5只 | 500μL/只 | 3次 |
| D | TF空载蛋白 | 皮下多点 | 弗氏佐剂 | 5只 | 500μg/ml/只 | 3次 |
| E | 生理盐水 | 皮下多点 | 无 | 5只 | 500μL/只 | 3次 |
2.1.3 豚鼠血清的采集和分离
分别在豚鼠首次免疫的第0、14、28、42、49天，对各组的豚鼠进行心脏采血，血液收集于灭菌离心管中，将离心管在室温条件下倾斜静置2h后，再置于4℃冰箱中静置30min。10000rpm离心15min，小心吸取上清至干净的离心管中，并做好标记，置-20℃冻存备用。
2.2 免疫豚鼠血清中和抗体的检测
2.2.1 Marc-145细胞的复苏与培养
从液氮罐中取出一管冻存的Marc-145细胞，用镊子夹住迅速置于事先准备好的盛有37℃温水的烧杯中快速搅动，使冻存的细胞能在最短的时间(小于1min)内融化。用一次性移液管在生物安全柜内将冻存液转至盛有10ml 10％DMEM细胞培养基的15ml离心管中，3000rpm，离心5min。轻轻弃去上清，并用一次性移液管吸取10ml 10％DMEM细胞培养基将其吹打均匀，全部转至细胞培养瓶中，于37℃含5％CO2的培养箱中静置培养。次日观察细胞贴壁情况，待其长出单层后，进行分瓶传代培养。
2.2.2 半数细胞培养物感染量(TCID50)的测定
待细胞传代状态良好，将传代消化后的细胞稀释成105-106个/ml，转到96孔细胞培养板中，每孔100μL。将待测病毒液用DMEM培养基在1.5离心管中作连续10倍稀释，每个稀释度接种4个孔，每孔100μL，并用等量DMEM生长液作为对照。将96孔细胞培养板置于37℃含5％CO2的培养箱中，逐日观察细胞病变并做好记录，按照Reed-Muench法计算待测病毒的TCID50。
2.2.3 微量中和试验(固定病毒一稀释血清法)
(1)分装重组TF-TAT-GP5(V)和TF-GP5(V)免疫豚鼠第42天的待检血清，经56℃灭活30min后直接用于试验或-20℃保存备用。
(2)用DMEM基础培养液在96孔细胞板上将待检血清作连续倍比稀释，从1∶4至1∶128，每个稀释度作4个重复，每孔50μL，每孔加入50μL 100TCID50的病毒悬液，充分混匀后在37℃含5％CO2的培养箱中感作1h。
(3)然后加入100μL消化好的Marc-145细胞悬液(约2×105个/ml)，放在37℃含5％CO2的培养箱中培养，同时设置血清毒性对照、病毒对照以及正常细胞对照。连续培养4天，观察细胞病变。
(4)按照Reed-Muench法计算待测血清的中和效价，以1∶4的血清滴度能中和100TCID50的PRRSV为阳性。
2.3 免疫豚鼠血清中细胞因子水平的检测
分别在豚鼠首次免疫的第0、14、28、42、49天，采集制备血清。通过ELISA方法来检测血清中的干扰素γ(IFN-γ)和白介素4(IL-4)水平。
2.3.1 豚鼠血清中IFN-γ的检测
取出豚鼠首次免疫的第0、14、28、42、49天时采集制备的血清，用R&D公司生产的豚鼠干扰素γ(IFN-γ)酶联免疫分析试剂盒对豚鼠血清中的IFN-γ水平进行定量检测。该试剂盒采用双抗体夹心法，以纯化的豚鼠IFN-γ抗体包被微孔板，在依次加入IFN-γ标准品以及待测血清后，经温育，洗涤去除未结合的游离部分，再与辣根过氧化物酶(HRP)标记的IFN-γ抗体结合，加入底物(TMB)，在HRP酶的催化下转化成蓝色，并在酸的作用下转化成最终的黄色。颜色的深浅和样品中的IFN-γ呈正相关。用酶标仪在450nm波长下测定吸光度(OD值)，通过标准曲线计算样品中豚鼠IFN-γ浓度。其中标准品的浓度分别为：80pg/ml、40pg/ml、20pg/ml、10pg/ml、5pg/ml、2.5pg/ml。
试剂盒的详细操作步骤如下：
(1)准备：将试剂盒从4℃冰箱中取出，在室温平衡15-30min。
(2)标准品的稀释：在1.5ml离心管中，按照试剂盒提供的方法将原倍标准品用标准品稀释液进行连续2倍稀释，获得5、4、3、2、1、0号标准品。稀释过程中用振荡器振荡混匀，否则得不到较好的标准曲线。加样前再振荡几下。
(3)加样：提前设定好空白孔、标准孔、待测样品孔，并在记录本上做好标记。按标准品加50μL，待测样品孔先加40μL样品稀释液，再加入10μL待测样品。
(4)温育：封板膜封板，37℃作用30min。
(5)配液：将20倍浓缩洗涤液用蒸馏水稀释20倍后备用。
(6)洗涤：揭去封板膜甩掉液体，吸水纸拍干后加入洗涤液，静置30s后弃去，重复5次，拍干。
(7)加酶：加酶标试剂50μL/孔，空白孔不加。
(8)重复操作(4)和(6)
(10)显色：先加50μL显色剂A，再加50μL显色剂B，混匀后置于37℃避光显色10min。
(11)终止：加终止液50μL终止反应(蓝转黄)
(12)测定：以空白孔调零，450nm波长依序测量各孔的吸光度(OD值)。测定应在加终止液后15min以内进行。
(13)计算：绘出标准曲线，得出直线回归方程式，将样品的OD值带入方程式，计算出样品浓度(并乘以稀释倍数)。
注意：封板膜只限一次性使用，以避免交叉污染；空白对照孔不需加入样品和酶标试剂，其余操作相同；加样时对准孔板底部，不要触及孔壁。
2.3.2 豚鼠血清中IL-4的检测
取出豚鼠首次免疫的第0、14、28、42、49天时采集制备的血清，用R&D公司生产的豚鼠白介素-4(IL-4)酶联免疫分析试剂盒对豚鼠血清中的IL-4水平进行定量检测，其实验原理、操作方法、注意事项等均与豚鼠干扰素γ(IFN-γ)一致。其中标准品的浓度分别为48pg/ml、24pg/ml、12pg/ml、6pg/ml、3pg/ml、1.5pg/ml。
2.4 结果
2.4.1 免疫豚鼠的中和抗体滴度
对豚鼠首次免疫的第42天采集的TF-TAT-GP5(V)蛋白组和TF-GP5(V)蛋白组的血清测定中和抗体水平，具体的血清中和抗体检测结果如表4所示，结果显示：TF-TAT-GP5(V)蛋白及TF-GP5(V)蛋白首次免疫后第42天均有低滴度的中和抗体产生。其中，TF-TAT-GP5(V)蛋白的最高滴度可达到1∶16，高于TF-GP5(V)蛋白的最高滴度(1∶8)。表明两种重组蛋白都具有一定的抗病毒活性，但TF-TAT-GP5(V)产生的平均中和抗体滴度更高，较TF-GP5(V)蛋白组差异显著(P＜0.05)。
表4 TF-TAT-GP5(V)和TF-GP5(V)免疫组豚鼠血清中和抗体检测结果
2.4.2 免疫豚鼠血清中的细胞因子水平的检测
分别在豚鼠首次免疫的第0、14、28、42、49天心脏采血，制备血清。将收集的血清用R&D公司生产的豚鼠细胞因子IFN-γ及IL-4的ELISA试剂盒检测豚鼠血清中细胞因子的高低，从而判断重组蛋白TF-TAT-GP5(V)和TF-GP5(V)免疫后诱导小鼠体内淋巴细胞免疫能力的强弱。
2.4.2.1 豚鼠血清中的IFN-γ水平
取出豚鼠首次免疫的第0、14、28、42、49天时采集制备的血清，用R&D公司生产的豚鼠IFN-γ酶联免疫分析试剂盒检测豚鼠血清中的IFN-γ水平。
请参与图14，豚鼠血清IFN-γ水平的检测结果为：首次免疫后第28天时，TF-TAT-GP5(V)蛋白组、TF-GP5(V)蛋白组和PRRS弱毒苗组诱导机体产生的IFN-γ水平均高于空白对照及生理盐水对照组，其中TF-GP5(V)蛋白和PRRS弱毒苗组较两个对照组的差异显著(P＜0.05)；第42天时，TF-TAT-GP5(V)蛋白及PRRS弱毒苗诱导的IFN-γ水平均达到峰值，且显著高于两个对照组(P＜0.05)，其中TF-TAT-GP5(V)蛋白组水平略高于PRRS弱毒苗组，但差异不显著(P＞0.05)；TF-GP5(V)组水平高于GP5(V)组，且差异显著(P＜0.05)。第49天时，TF-TAT-GP5(V)蛋白及PRRS弱毒苗组诱导的IFN-γ水平开始下降，但依旧显著高于对照组(P＜0.05)。以上结果表明，所表达的重组蛋白TF-TAT-GP5(V)以及TF-GP5(V)均能有效刺激机体的T淋巴细胞分泌IFN-γ，增强以Th1为主的细胞介导的免疫反应。其中，TF-GP5(V)蛋白组能在28天时产生最强的诱导水平，但明显低于TF-TAT-GP5(V)蛋白诱导产生的IFN-γ的峰值，差异显著(P＜0.05)；且第42天时，TF-GP5(V)组水平显著高于GP5(V)组(P＜0.05)，说明TF-TAT-GP5(V)蛋白较TF-GP5(V)蛋白能够更有效地刺激机体的T淋巴细胞分泌IFN-γ，TAT起到了协助TF-GP5(V)有效地引起Th1为主的细胞介导的免疫反应的作用。
2.4.2.2 豚鼠血清中的IL-4水平
请参阅图15，取出豚鼠首次免疫的第0、14、28、42、49天时采集制备的血清，用R&D公司生产的豚鼠IL-4酶联免疫分析试剂盒检测豚鼠血清中的IL-4水平，结果为：同空白对照组和生理盐水对照组相比，首次免疫后第28天时，TF-TAT-GP5(V)蛋白组、TF-GP5(V)蛋白组和PRRS弱毒苗组均能产生较高水平的IFN-γ，其中TF-GP5(V)蛋白和PRRS弱毒苗组较两个对照组的差异显著(P＜0.05)；第42天时，这3组诱导的IFN-γ水平均达到峰值，且显著高于两个对照组(P＜0.05)，其中TF-TAT-GP5(V)蛋白组水平高于TF-GP5(V)蛋白组，但低于PRRS弱毒苗组，无显著差异(P＞0.05)；第49天时，TF-TAT-GP5(V)蛋白诱导的IL-4水平开始下降，虽高于对照组但差异不显著(P＞0.05)。以上结果表明，所表达的重组蛋白TF-TAT-GP5(V)以及TF-GP5(V)均能有效刺激机体的T淋巴细胞分泌IL-4，增强以Th2为主的细胞介导的免疫反应。其中，TF-GP5(V)蛋白组能在42天时产生最强的诱导水平，但总的水平低于TF-TAT-GP5(V)蛋白诱导产生的IL-4最高水平，差异不显著(P＞0.05)，表明TAT在协助TF-GP5(V)增强以Th2为主的细胞介导的免疫反应方面的作用并不显著。
综上所述，本发明选用pCold TF DNA高效可溶性表达了PRRSV变异株GP5蛋白及TAT-GP5融合蛋白，保证了重组蛋白的生物学功能，解决了现有的技术难以表达出完整的GP5蛋白的问题；豚鼠免疫接种试验表明，TAT-GP5融合蛋白能够显著提高机体体液免疫和细胞免疫水平，即融合了TAT，提高了重组蛋白的免疫原性。
对于本领域技术人员而言，显然本发明不限于上述示范性实施例的细节，而且在不背离本发明的精神或基本特征的情况下，能够以其他的具体形式实现本发明。因此，无论从哪一点来看，均应将实施例看作是示范性的，而且是非限制性的，本发明的范围由所附权利要求而不是上述说明限定，因此旨在将落在权利要求的等同要件的含义和范围内的所有变化囊括在本发明内。
此外，应当理解，虽然本说明书按照实施方式加以描述，但并非每个实施方式仅包含一个独立的技术方案，说明书的这种叙述方式仅仅是为清楚起见，本领域技术人员应当将说明书作为一个整体，各实施例中的技术方案也可以经适当组合，形成本领域技术人员可以理解的其他实施方式。
Claims (5)
1.一种新的猪繁殖与呼吸综合征病毒变异株GP5重组蛋白，其特征在于，为可溶性表达PRRSV GP5完整蛋白或者可溶性表达融合TAT的PRRSV GP5蛋白，所述可溶性表达PRRSVGP5完整蛋白的核苷酸序列为：ACCGCGTGCTGTTGCTCGCGATTGCTTTCTTTGTGGTGTATCGTGCTGTGCTATCTTGCTGTGCTCGTCAACGCCAGCAACAACAACAGCTCTCATATTCAGTTGATTTATAACTTAACGCTATGTGAGCTGAATGGCACAGATTGGCTGGCACAAAAATTTGACTGGGCAGTGGAGACTTTTGTCATCTTCCCCGCGTTGACTCACATTGTTTCCTATGGGGCACTCACCACCAGCCATTTCCTTGACACAGTTGGTCTGGCCACTGTGTCCACCGCCGGATATTATCACGGGCGGTATGTCTTGAGTAGCATTTACGCAGTCTGTGCTCTGGCTGCGCTGATTTGCTTTGTCATTAGGCTTGCGAAGAACTGCATGTCCTGGCGCTACTCTTGTACCAGATATACCAACTTCCTTCTGGACACTAAGGGCAGACTTTATCGTTGGCGGTCGCCCGTCATTGTGGAGAAAAGGGGTAAGGTTGAGGTCGAAGGTCACCTGATCGACCTCAAGAGAGTTGTGCTTGATGGTTCCGCGGCAACCCCTTTAACCAGAGTTTCAGCGGAA如SEQ ID NO：1所示，其中，斜体部分为引物区域；所述可溶性表达融合TAT的PRRSV GP5蛋白的核苷酸序列为：ACCGCGTGCTGTTGCTCGCGATTGCTTTCTTTGTGGTGTATCGTGCTGTGCTATCTTGCTGTGCTCGTCAACGCCAGCAACAACAACAGCTCTCATATTCAGTTGATTTATAACTTAACGCTATGTGAGCTGAATGGCACAGATTGGCTGGCACAAAAATTTGACTGGGCAGTGGAGACTTTTGTCATCTTCCCCGCGTTGACTCACATTGTTTCCTATGGGGCACTCACCACCAGCCATTTCCTTGACACAGTTGGTCTGGCCACTGTGTCCACCGCCGGATATTATCACGGGCGGTATGTCTTGAGTAGCATTTACGCAGTCTGTGCTCTGGCTGCGCTGATTTGCTTTGTCATTAGGCTTGCGAAGAACTGCATGTCCTGGCGCTACTCTTGTACCAGATATACCAACTTCCTTCTGGACACTAAGGGCAGACTTTATCGTTGGCGGTCGCCCGTCATTGTGGAGAAAAGGGGTAAGGTTGAGGTCGAAGGTCACCTGATCGACCTCAAGAGAGTTGTGCTTGATGGTTCCGCGGCAACCCCTTTAACCAGAGTTTCAGCGGAA如SEQ ID NO：2所示，其中，斜体部分为引物区域，粗体部分为TAT序列。
2.一种如权利要求1所述的新的猪繁殖与呼吸综合征病毒变异株GP5重组蛋白的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)目的基因的克隆，包括以下步骤：
11)引物的设计与合成：根据美洲型PRRSV变异株LX13(2)核苷酸序列，设计扩增TAT-ORF5(V)及ORF5(V)基因的两对特异性引物TAT-ORF5(V)-P1、TAT-ORF5(V)-P2和ORF5(V)-P1、ORF5(V)-P2，引物TAT-ORF5(V)-P1的核苷酸序列为5’-GGGGTACCGGCAGGAAGAAGCGGAGACAGCGACGAAGACCTCCTCAATGCATGTTGGGGAAGTGCTTG-3’，如SEQ ID NO：3所示，引物TAT-ORF5(V)-P2的核苷酸序列为5’-GGAATTCCTAGAGACGACCCCATAG-3’，如SEQ ID NO：4所示，引物ORF5(V)-P1的核苷酸序列为5’-GGGGTACCATGTTGGGGAAGTGCTTG-3’，如SEQ ID NO：5所示，引物ORF5(V)-P2的核苷酸序列为5’-GGAATTCCTAGAGACGACCCCATAG-3’，如SEQ ID NO：6所示；其中，粗体部分为TAT序列，并在引物的上、下游5’端分别引入EcoR I和Kpn I酶切位点；在引物合成后，用ddH2O稀释为终浓度为20pmol/μL，置-20℃保存；
12)TAT-ORF5(V)及ORF5(V)的扩增：以重组质粒pMD18-T-ORF5(V)为模板，用无菌ddH2O稀释20倍后，以引物TAT-ORF5(V)-P1/TAT-ORF5(V)-P2进行PCR扩增TAT-ORF5(V)；以引物ORF5(V)-P1/ORF5(V)-P2扩增ORF5(V)基因；PCR产物进行1％琼脂糖凝胶电泳，并利用MiniBESTDNA快速胶回收试剂盒回收PCR产物；
(2)重组原核表达载体pCold-TF-TAT-GP5(V)及pCold-TF-GP5(V)的构建及鉴定，包括以下步骤：
21)原核表达载体pCold TF DNA和目的基因的双酶切回收；
22)目的片段与表达载体的连接；
23)重组表达质粒pCold-TF-TAT-GP5(V)和pCold-TF-GP5(V)的鉴定；
(3)重组原核表达质粒pCold-TF-TAT-GP5(V)及pCold-TF-GP5(V)的诱导表达，包括以下步骤：
31)重组表达质粒转化BL21感受态细胞；
32)重组菌的IPTG诱导表达；
33)重组蛋白的可溶性分析；
(4)重组表达蛋白TF-TAT-GP5(V)及TF-GP5(V)的检测：对SDS-PAGE验证正确的蛋白进行Western-Blot鉴定；分别重新诱导BL21/pCold-TF-GP5、BL21/pCold-TF-TAT-GP5及BL21/pCold TF DNA对照，将菌液处理后进行SDS-PAGE电泳，待电泳结束后，将凝胶上的条带转印到固相载体膜上，并以鼠抗His标签单克隆抗体作为一抗，以HRP标记的羊抗鼠IgG作为二抗，进行Western-Blot鉴定；
(5)重组蛋白TF-TAT-GP5(V)及TF-GP5(V)的纯化，包括以下步骤：
51)重组蛋白的大量诱导表达；
52)重组蛋白的纯化回收。
3.根据权利要求2所述的新的猪繁殖与呼吸综合征病毒变异株GP5重组蛋白的制备方法，其特征在于，所述步骤32)包括以下步骤：挑取阳性克隆接种到6ml Amp+(50μg/ml)LB肉汤培养基，置于37℃，200rpm振荡培养过夜；按1∶100比例接种于6ml含有50μg/ml Amp的LB液体培养基中，37℃，220rpm剧烈振荡2-3h，当培养液的D600nm值为0.4-0.9时，立即将培养液移至15℃放置30min；添加异丙基硫代-β-D-半乳糖苷(IPTG)至终浓度为0.1-1.0mM，15℃条件下培养19-25h；培养结束后取1ml菌液，10000rpm离心5min，弃去上清，将菌体沉淀用30μL PBS重悬后，加入10μL 4×SDS上样缓冲液，混合均匀后煮沸10min，冷却至室温，取样进行SDS-PAGE电泳检测；并设空载体表达菌对照及未诱导的重组质粒表达菌对照。
4.根据权利要求3所述的新的猪繁殖与呼吸综合征病毒变异株GP5重组蛋白的制备方法，其特征在于，培养液的D600nm值为0.4-0.5；添加异丙基硫代-β-D-半乳糖苷(IPTG)至终浓度为0.1-1.0mM，15℃条件下培养24h。
5.根据权利要求1所述的新的猪繁殖与呼吸综合征病毒变异株GP5重组蛋白的应用，其特征在于，用于预防猪繁殖与呼吸综合征病毒变异株的感染，包括：(1)制备猪繁殖与呼吸综合征病毒疫苗；(2)制备预防或治疗猪繁殖与呼吸综合征的药物；(3)制备诊断或检测猪繁殖与呼吸综合征的产品。
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