CN115850135A - 含硫Janus型可离子化脂质体及其用途 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种含硫Janus型可离子化脂质体及其用途，所述脂质体包含式(I)所示的脂质分子。所述脂质分子可以实现对核酸的药物的高效装载和保护，同时硫元素具有一定的还原性，有助于降低活性氧(ROS)水平，减轻炎症，更快地释放核酸。所述脂质分子可以应用于制备核酸疫苗。

Description

含硫Janus型可离子化脂质体及其用途

技术领域

本发明属于医药生物领域，具体涉及一种可用于递送mRNA的含硫Janus型可离子化脂质体脂质体及其制备方法及用途。

背景技术

Janus粒子指的是具有两种不同化学性质的粒子。两面性使这种粒子能形成特殊结构，具备比单一性质的纳米粒子更多的应用前景。Janus粒子可以根据颗粒的表面性质分为具有亲水和疏水分区的双亲Janus粒子及带正、负电荷分区的Janus粒子。其中，双亲性Janus粒子的性质与表面活性剂分子相似。他的一面亲水，一面疏水，在油水界面吸附能力显著大于同尺寸的均一表面纳米粒子，可以用作抗癌药物封装和药物靶向输送等。

mRNA疫苗除了被用于病毒性肺炎的预防，mRNA疗法在许多领域也具有巨大潜力。mRNA疗法的原理是向靶细胞导入外源mRNA，使靶细胞自行合成目标蛋白。mRNA疗法设计制备简便、安全性较高，与传统基因疗法相比，mRNA的表达由于无插入基因组的风险而较为安全，与以蛋白质为靶点的传统靶向药物相比，mRNA疗法研发周期短、候选靶点丰富。更重要的是，mRNA药物不局限于分裂细胞，没有整合宿主基因组的风险，且会在体内自动降解。目前mRNA疗法凭借其高效、安全、丰富的治疗特点已广泛应用于罕见病、肿瘤、感染性疾病等多种疾病的治疗。mRNA平台的挑战是其固有的免疫原性、对酶降解的易感性和较少的细胞对裸mRNA的摄取。将mRNA用递送系统包载运输既保护了mRNA免受酶降解，又促进细胞摄取。事实上，合适的mRNA递送载体一直是制约mRNA疫苗和mRNA疗法发展的一大瓶颈，一个合适的mRNA递送载体可实现对mRNA的高效包载，并在体内实现良好的表达效果。目前常用的几种mRNA递送载体主要包括聚合物材料和脂质纳米粒(lipid nanopar ticles，LNPs)。早期人们采用聚合物材料来进行核酸的递送，如聚乙烯亚胺(PEI)、聚氨基酯(PBAE)等，但因为其毒性和难以降解而应用受限。LNPs主要通过磷脂材料与其他辅助磷脂完成颗粒的构建，通过RNA所带的负电与可离子化磷脂的正电相互作用(Gupta K C，Ono E，Xux.Biochemistry，1996，35(4)∶1223-1231.)，可实现较高的包载效果(图1)，并且在体内由低密度脂蛋白介导的胞吞机制可使纳米粒子成功被细胞摄取，实现良好的细胞摄取效果。在胞内经由内涵体途径将mRNA成功释放，转运到细胞质中进行表达，产生相应的蛋白表达。同时良好的体内安全性也使其更具竞争力，在多种传染性疾病的预防及治疗方面展现出了较好的效果。含有阳离子/可离子化脂质、胆固醇、脂质PEG和结构脂质(例如DSPC)的配制脂质纳米粒(1ipid nanoparticle，LNP)是目前最有效的siRNA递送系统。

虽然研究者已经证明了使用阳离子脂质进行生物活性剂的细胞递送具有很多优点(WO2015095340A1)，但本领域内仍然需要适合于常规治疗用途的改进的mRNA递送脂质体，需要具有更多功能、更快释放RNA的脂质体，以改善生物活性剂向特定器官和肿瘤的递送效果。基于Janus结构的递送脂质体具有很好的潜在应用价值。

发明内容

本发明的目的在于提供一种用于递送mRNA的含有硫元素的可离子化脂质分子，以实现对核酸的药物的高效装载和保护，同时硫元素具有一定的还原性，有助于降低活性氧(reactive oxygen species，ROS)水平，减轻炎症，更快地释放mRNA。

本发明的一方面，提供一种式(I)所示的脂质分子，

其中，A¹和A²各自独立地选自-C_1-20烷基-NR^aR^b、-C_1-20烷氧基-NR^aR^b、-NR^aR^b-C_1-20烷基-NR^aR^b、-(NH-C_1-3烷基)n-NH₂、-NR^aR^b-(C_1-3烷基-NH)n-NR^aR^b、-C_1-20烷氧基-O-NR^aR^b、4至10元杂环烷基、-NR^aR^b-4至10元杂环烷基、-O-C_1-20烷基-4至10元杂环烷基、-C(O)-C_1-20烷基-4至10元杂环烷基、4至10元杂环烷基-4至10元杂环烷基，所述-C_1-20烷基、-C_1-20烷氧基、4至10元杂环烷基任选地被1、2、3或4个独立地选自卤素、甲基、乙基、丙基、异丙基、氨基、-N(CH₃)₂、羟基、羧基的取代基取代；其中，n为1、2或3，条件是，A¹和A²至少有一个含有N原子。

在一实施方式中，A¹和A²独立地选自-C_1-10烷基-NR^aR^b、-C_1-10烷氧基-NR^aR^b、-NR^aR^b-C_1-10烷基-NR^aR^b、-NR^aR^b-(C_1-3烷基-NH)n-NR^aR^b、-C_1-10烷氧基-O-NR^aR^b、4至10元杂环烷基、-NR^aR^b-4至10元杂环烷基、-O-C_1-6烷基-4至10元杂环烷基、-C(O)-C_1-6烷基-4至10元杂环烷基、4至10元杂环烷基-4至10元杂环烷基，所述C_1-3烷基、-C_1-10烷基、-C_1-10烷氧基、4至10元杂环烷基任选地被1、2、3或4个独立地选自卤素、甲基、乙基、丙基、异丙基、氨基、N(CH₃)₂、羟基、羧基的取代基取代；其中，n为1、2、或3，条件是，A¹和A²至少有一个含有N原子。

在一实施方式中，R¹和R²各自独立地选自氢、-C_1-20烷基、-C_1-20烯基、-C_1-20炔基、-C(O)-C_1-20烯基、-C_1-10烷氧基-C(O)-C_1-10烷基、-C_1-10烷基-C(O)-C_1-10烷氧基、-C_1-10烷基-C(O)-O-CR^aR^b、-C_1-10烷基-C(O)-C_1-20烯基、-C_1-10烯基-CR^aR^b、-C_1-10烷基-NR^c-C_1-10烷基-NR^dR^e、-C_1-10烷基-5或6元杂环烷基-C_1-3烷基NR^cR^d、胆固醇；所述-C_1-10烷基、-C_1-10烷氧基、-C_1-20烷基、-C_1-20烯基、-C_1-20炔基、5或6元杂环烷基任选地被1、2或3个独立地选自卤素、甲基、乙基、丙基、异丙基、氨基、羟基、羧基的取代基取代。

L¹、L²、L³、L⁴、B¹和B²各自独立地选自含有C_1-20烷基、酯基、酰胺基、脂肪烃基、醚基、酮羰基或亚胺基的二价连接基团。

其中，R^a、R^b各自独立地为氢、C_1-16烷基、C_1-8烷氧基；R^c、R^d、R^e各自独立地选自-C_1-10烷基、-C_1-10烷基-C(O)-C_1-10烷基、-C_1-18烯基，所述杂环烷基具有至少一个选自N、O和S的杂原子作为环原子。

在一实施方式中，L¹、L²、L³、L⁴、B¹和B²是相同地。

本发明中，R¹和R²不同时为氢。式(I)所示的脂质分子，

其中，A¹和A²独立地选自胺类结构，所述胺类结构包括伯胺、仲胺和叔胺。

L¹、L²、L³、L⁴、B¹和B²各自独立地选自单键或含有C_1-20烷基、酯基、酰胺基、脂肪烃基、醚基、酮羰基或亚胺基的二价连接基团。

R¹和R²各自独立地选自氢、C_1-20脂肪烃基、或者含有脂肪烃基的酰胺、酯、缩酮、半缩酮、缩醛和半缩醛；R¹和R²不同时为氢。

本发明在脂质分子的骨架上引入了硫元素，用于发挥一定的抗氧化性，帮助减轻炎症反应。通过可离子化脂质分子在酸性条件下发生质子化，增强与mRNA之间的静电相互作用，从而实现对mRNA的高效地稳定地包载，用于递送mRNA以实现治疗。同时，该脂质分子的骨架具有较多的支链，有利于引入更多的疏水基团以及质子化位点，从而在脂质分子的疏水性和质子化能力方面提供更丰富的可调节性。

在一实施方式中，所述A¹和A²可选择的胺类结构包括但不限于以下代表性结构：

在一实施方案中，A¹和A²各自独立地选自下组：

在一优选的实施方式中，所述A¹和A²可独立地选自以下结构：

更优选地，选自以下结构：

在一实施方式中，L¹、L²、L³、L⁴、B¹和B²为连接基团，其各自独立地选自包含C_1-20的脂肪烃基二价连接基。

在一优选的实施方式中，L¹、L²、L³、L⁴、B¹和B²各自独立地选自包括但不限于以下代表性结构：含C_1-20烷基、二硫键、乙烯醚键、酯基、硫酯基、硫代酯基、二硫代酯基、碳酸酯基、硫代碳酸酯基、二硫代碳酸酯基、三硫代碳酸酯基、氨基甲酸酯基、硫代氨基甲酸酯基、二硫代氨基甲酸酯基、缩醛、环缩醛、缩硫醛、氮杂缩醛、氮杂环缩醛、氮硫杂缩醛、二硫代缩醛、半缩醛、硫代半缩醛、氮杂半缩醛、缩酮、缩硫酮、氮杂缩酮、氮杂环缩酮、氮硫杂缩酮、亚胺键、腙键、酰腙键、肟键、硫肟醚基、半卡巴腙键、硫代半卡巴腙键、肼基、酰肼基、硫代碳酰肼基、偶氮羰酰肼基、硫代偶氮羰酰肼基、肼基甲酸酯基、肼基硫代甲酸酯基、卡巴肼、硫代卡巴肼、偶氮基、异脲基、异硫脲基、脲基甲酸酯基、硫脲基甲酸酯基、胍基、脒基、氨基胍基、氨基脒基、亚氨酸基、亚氨酸硫酯基、磺酸酯基、亚磺酸酯基、磺酰肼基、磺酰脲基、马来酰亚胺、原酸酯基、磷酸酯基、亚磷酸酯基、次磷酸酯基、膦酸酯基、磷硅烷酯基、硅烷酯基、碳酰胺、硫代酰胺、磺酰胺基、聚酰胺、磷酰胺、亚磷酰胺、焦磷酰胺、环磷酰胺、异环磷酰胺、硫代磷酰胺、乌头酰基、多肽片段、核苷酸及其衍生物骨架、脱氧核苷酸及其衍生物骨架中任一种的二价连接基、任两种或任两种以上二价连接基的组合。

在一优选的实施方式中，L¹、L²、L³、L⁴、B¹和B²为连接基团，其独立地选自包含C_1-10的脂肪烃基二价连接基。

在一更优选的实施方式中，L¹、L²、L³、L⁴、B¹和B²各自独立地选自以下结构：脂肪烃基、二硫键、乙烯醚键、酯基、硫酯基、硫代酯基、碳酸酯基、硫代碳酸酯基、氨基甲酸酯基、硫代氨基甲酸酯基、缩醛、环缩醛、缩硫醛、氮杂缩醛、氮杂环缩醛、氮硫杂缩醛、二硫代缩醛、半缩醛、硫代半缩醛、氮杂半缩醛、缩酮、缩硫酮、氮杂缩酮、氮杂环缩酮、氮硫杂缩酮、亚胺键、腙键、酰腙键、马来酰亚胺、磷酸酯基、亚磷酸酯基、次磷酸酯基、膦酸酯基、硅烷酯基、碳酰胺、磷酰胺、亚磷酰胺、焦磷酰胺、多肽片段、核苷酸及其衍生物骨架、脱氧核苷酸及其衍生物骨架中任一种二价连接基、任两种或任两种以上二价连接基的组合；

在一优选的实施方式中，所述L¹、L²、L³、L⁴、B¹和B²各自独立地选自包含C_1-6的脂肪烃基二价连接基。

在一更优选的实施方式中，L¹、L²、L³、L⁴、B¹和B²各自独立地选自以下结构：脂肪烃基、二硫键、乙烯醚键、酯基、碳酸酯基、氨基甲酸酯基、缩醛、半缩醛、缩酮、缩硫酮、亚胺键、腙键、酰腙键、马来酰亚胺、磷酸酯基、亚磷酸酯基、碳酰胺、磷酰胺、多肽片段中任一种二价连接基、任两种或任两种以上二价连接基的组合。

在一实施方式中，A¹和A²独立地选自-NR^aR^b、-C_1-10烷基-NR^aR^b、-(NH-C_1-3烷基)n-NH₂，R^a、R^b为-C_1-10烷基；n为选自1-6的整数。

在一实施方式中，L¹、L²、L³、L⁴、B¹和B²各自独立地选自-C_1-10烷基-、-C_1-10烷氧基-、-C_1-10烷基-C(O)、-C_1-10烷氧基-C(O)中任一种的二价连接基、任两种或任两种以上二价连接基的组合。

在一实施方式中，R¹和R²各自独立地选自-C_1-20烷基、-C_1-20烯基、-C_1-20炔基、-C(O)-C_1-20烯基。

在一实施方式中，A¹和A²独立地选自-C_1-10烷基-NR^aR^b、-(NH-C_1-3烷基)n-NH₂，R^a、R^b为C_1-10烷基；

在一实施方式中，L¹、L²、L³、L⁴、B¹和B²各自独立地选自-C_1-10烷基-、-C_1-10烷氧基-、-C_1-10烷基-C(O)、-C_1-10烷氧基-C(O)。

在一实施方式中，R¹和R²各自独立地选自-C_1-20烷基、-C_1-20烯基、-C(O)-C_1-20烯基。在一实施方式中，A¹和A²独立地选自-C_1-10烷基-NR^aR^b，R^a、R^b为C_1-10烷基；L¹、L²、L³、L⁴、B¹和B²各自独立地选自-C_1-10烷基-；R¹和R²各自独立地选自-C_1-20烷基、-C_1-20烯基、-C(O)-C_1-20烯基。在一实施方式中，B¹和B²各自独立地选自含有羰基的二价连接基团；优选地，B¹和B²各自独立地选自-(CH₂)_0-6C(O)(CH₂)_0-6-；更优选地，B¹和B²为C(O)。

在一实施方式中，L²和L⁴各自独立地选自单键或含有C_1-6烷基的二价连接基团；优选地，L²和L⁴为单键。

在一实施方式中，所述R¹和R²可选择的C_1-20脂肪烃基结构包括但不限于以下代表性结构(其中碳-碳双键和碳-碳三键的位置包括但不限于脂肪烃末端)：

在一实施方式中，所述R¹和R²可选择的C_1-20脂肪烃基包括但不限于以下结构：

在一优选的实施方式中，所述R¹和R²可选择的C_1-20脂肪烃基结构包括：

更优选地，所述R¹和R²可选择的C_1-20脂肪烃基结构包括：

式(II)所示的脂质分子：

其中，A¹、A²、L¹、L³各自定义同式(I)化合物；R³为-R³¹R³²，R⁴为-R⁴¹R⁴²。

在一实施方式中，R³¹、R³²、R⁴¹、R⁴²各自独立地选自-C_1-19烷基、-C_1-19烯基、-C_1-19炔基或

其中，x选自1-6的整数；条件是R³¹、R³²、R⁴¹、R⁴²不同时为氢。

在一实施方式中，R³¹、R³²、R⁴¹、R⁴²各自独立地选自-C_7-19烷基、-C_7-19烯基、-C_7-19炔基或

其中，X选自1-6的整数。

在一实施方式中，R³¹、R³²、R⁴¹、R⁴²各自独立地选自-(CH₂)_m1CH₃、-(CH₂)_m2CH＝CH(CH₂)_n1CH₃、-(CH₂)_m3CH≡CH(CH₂)_n2CH₃、或

其中，m1选自1-19的整数；m2、m3、n1、n2各自独立地选自1-16的整数。

在一实施方式中，L₅选自单键、-O-、-C(O)-或-NH-；更优选地，L为-C(O)-。

在一实施方式中，-L¹-或-L³-选自-(CH₂)_m4-、-(CH₂)_m4C(O)-、-(CH₂)_m4C(O)O(CH₂)_m5-或-(CH₂)_m4OC(O)(CH₂)_m5-，其中，m4、m5各自独立地选自1-6的整数；优选地，m4、m5各自独立地选自1-3的整数。

在一实施方式中，-L¹-A¹、-L³-A²选自

以下化合物：

本发明的另一方面，提供一种上述脂质分子的制备方法，包括以下步骤：

其中，A¹和A²、L¹、L²、L³、L⁴、R¹和R²的定义同上，B¹和B²为羰基。

具体地，(A1)通过含R¹的脂肪酸、含R²的脂肪酸与二氯亚砜在溶剂1中在碱1的作用下以一定温度反应一定时间得到脂肪酰氯，其中，R¹和R²的定义同上。

(A2)步骤(A1)中所得到的脂肪酰氯与二溴新戊二醇在碱2的作用下在溶剂2中以一定温度反应一定时间，得到对应的脂肪酸二溴新戊二酯。

(A3)步骤(A2)得到的脂肪酸二溴新戊二酯在碱3的作用下与含硫的胺类结构在溶剂3中以一定温度反应一定时间，得到含有硫元素的可离子化脂质分子。所述含硫的胺类结构为包括如A¹和A²、L¹、L²、L³、L⁴所定义的基团与硫原子所构成的化学结构。

可以理解地，步骤(Al)为使用二氯亚砜与不同脂肪酸反应得到对应的脂肪酸酰氯的反应，该反应是普适的，其反应活性及反应过程几乎不受脂肪烃基的影响，反应均可高效进行：

步骤(A2)为步骤(A1)得到的脂肪酰氯与二溴新戊二醇的反应，其发生在酰氯与羟基之间，同样几乎不受脂肪烃基的种类影响，可高效获得对应的脂肪酸二溴新戊二酯。

上述制备方法具有普适性，适合于不同的烷基链，可以得到不同疏水性的脂肪酸二溴新戊二酯。

本发明的另一方面，提供式(II)所示脂质分子的制备方法，包括以下步骤：

其中，R³和R⁴的定义同式(II)化合物；SH-R⁵为SH-L¹-A¹或可进一步反应得到式(II)化合物的含有硫原子和胺的化学结构，其中，L¹和A¹的定义同式(II)化合物。溶剂1、溶剂2、溶剂3各自独立地选自二氯甲烷、甲苯、N，N-二甲基甲酰胺、二甲基亚砜或四氢呋喃；碱1、碱2、碱3各自独立地选自吡啶、N，N-二甲基甲酰胺、4-二甲氨基吡啶、三乙胺、二乙胺、异丙胺、碳酸钾、碳酸钠、氢氧化钠或氢氧化钾。

在一实施方式中，步骤(A1)和(A1)’的反应温度为25-120℃，反应时间为1-24h；步骤(A2)和(A2)’的反应温度为0-60℃，反应时间为1-48h；步骤(A3)的反应温度为0-100℃，反应时间为1-48h。

在一实施方式中，溶剂1选自二氯甲烷、甲苯、N，N-二甲基甲酰胺、二甲基亚砜或四氢呋喃；优选地，选自二氯甲烷、甲苯或N，N-二甲基甲酰胺；更优选地，选自二氯甲烷或甲苯。

在一实施方式中，碱1选自吡啶、N，N-二甲基甲酰胺、4-二甲氨基吡啶、三乙胺、二乙胺、异丙胺、碳酸钾、碳酸钠、氢氧化钠或氢氧化钾；优选地，选自吡啶、N，N-二甲基甲酰胺、4-二甲氨基吡啶、三乙胺、二乙胺或异丙胺；更优选地，选自吡啶，N，N-二甲基甲酰胺、三乙胺或异丙胺。

在一实施方式中，步骤(A1)和(A1)’的反应温度为25-120℃：优选地，为25-80℃：更优选地，为25-60℃。

在一实施方式中，步骤(A1)和(A1)’的反应时间为1-24h；优选地，为2-12h；更优选地，为4-6h。

在一实施方式中，溶剂2选自二氯甲烷、甲苯、N，N-二甲基甲酰胺、二甲基亚砜或四氢呋喃；优选地，选自二氯甲烷、四氢呋喃或N，N-二甲基甲酰胺；更优选地，选自二氯甲烷或N，N-二甲基甲酰胺。

在一实施方式中，碱2选自吡啶、N，N-二甲基甲酰胺、4-二甲氨基吡啶、三乙胺、二乙胺、异丙胺、碳酸钾、碳酸钠、氢氧化钠或氢氧化钾；优选地，选自吡啶、N，N-二甲基甲酰胺、4-二甲氨基吡啶、三乙胺、二乙胺或异丙胺：更优选地，选自吡啶、N，N-二甲基甲酰胺、三乙胺或异丙胺。

在一实施方式中，步骤(A2)和(A2)’中的反应温度为0-60℃；优选地，为0-40℃；更优选地，为0-25℃。

在一实施方式中，步骤(A2)和(A2)’的反应时间为1-48h；优选地，为6-24h；更优选地，为6-12h。

在一实施方式中，溶剂3选自二氯甲烷、甲苯、N,N-二甲基甲酰胺、二甲基亚砜或四氢呋喃；优选地，选自二氯甲烷、四氢呋喃、二甲基亚砜或N，N-二甲基甲酰胺；更优选地，选自四氢呋喃或N，N-二-甲基甲酰胺。

在一实施方式中，碱3选自吡啶、N，N-二甲基甲酰胺、4-二甲氨基吡啶、三乙胺、二乙胺、异丙胺、碳酸钾、碳酸钠、氢氧化钠或氢氧化钾；优选地，选自吡啶、三乙胺、二乙胺、异丙胺、碳酸钾、碳酸钠、氢氧化钠或氢氧化钾；更优选地，选自碳酸钾或碳酸钠。

在一实施方式中，步骤(A3)的反应温度为0-100℃；优选地，为25-80℃；更优选地，为25-60℃。

在一实施方式中，步骤(A3)的反应时间为1-48h；优选地，为6-24h；更优选地，为6-12h。

在一实施方式中，式(I)所示的脂质分子为式(IA)所示脂质分子，其通过包括以下步骤的方法制备得到：

将油酸溶于甲苯中，加入二氯亚砜和N，N-二甲基甲酰胺，60℃反应6h，除去甲苯和二氯亚砜，得到油酰氯；

油酰氯和二溴新戊二醇溶解于二氯甲烷中，加入三乙胺，过夜反应，洗涤、干燥、浓缩、分离纯化后得到油酸二溴新戊二酯；

油酸二溴新戊二酯溶于四氢呋喃，加入碳酸钾，在四氢呋喃中与2-二乙氨基乙硫醇反应，分离纯化后得到式(IA)所示脂质分子。

本发明的另一方面，提供一种包含上述的脂质分子的脂质体，以质量百分含量计，其包含10％-70％脂质分子、1％-20％-二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇(DSPE-PEG)、5％-50％胆固醇以及1％-30％二硬脂酰基磷脂酰胆碱(DSPC)。

在一实施方式中，所述脂质体包含30％-60％脂质分子、5％-15％DSPE-PEG、20％-40％胆固醇以及5％-15％DSPC。

在一优选的实施方式中，所述脂质体包含50％脂质分子、10％DSPE-PEG、30％胆固醇以及10％DSPC。

本发明的另一方面，提供一种核酸药物组合物，其包含上述脂质体和核酸药物。

在一实施方式中，所述核酸药物选自mRNA、siRNA以及microRNA。

在一优选的实施方式中，所述核酸药物为mRNA。

本发明的另一方面，提供一种上述核酸药物组合物的制备方法，其包括以下步骤：

(B1)将脂质分子、二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇、胆固醇、二硬脂酰基磷脂酰胆碱按比例混合，用溶剂4溶解得到有机相脂质体溶液；

(B2)将核酸药物用一定pH一定浓度的缓冲溶液溶解得到水相核酸药物溶液；

(B3)将步骤(B1)得到的有机相脂质体溶液和步骤(B2)得到的水相核酸药物溶液混合，均质后超滤得到所述核酸药物组合物。

在一实施方式中，所述溶剂4选自甲醇、乙醇、四氢呋喃、丙酮、二甲基亚砜或N，N-二甲基甲酰胺；优选地，选自乙醇、四氢呋喃或丙酮；更优选地，为乙醇。

在一实施方式中，步骤(B2)所述缓冲溶液为醋酸/醋酸钠溶液或柠檬酸/柠檬酸钠溶液；优选地，为柠檬酸/柠檬酸钠溶液。

在一实施方式中，步骤(B2)中缓冲溶液的pH为3-9；优选地，为4-6；更优选地，为5。

在一实施方式中，步骤(B2)中缓冲溶液的浓度为1mM-1M；优选地，为20mM-500mM；更优选地，为100mM。

在一实施方式中，步骤(B3)中的混合是通过将步骤(B2)得到的水相核酸药物溶液滴入有机相脂质体溶液中。

在一实施方式中，步骤(B3)中脂质体与核酸药物的质量比为5∶1-50∶1；优选地，为10∶1-30∶1；更优选地，为16∶1。

在一优选的实施方式中，所述核酸药物为mRNA，所述脂质分子与mRNA为的质量比为16∶1。

在一实施方式中，步骤(B3)中有机相脂质体与水相核酸药物的体积比为步骤(B3)中有机溶液与水溶液的体积比为1∶1-1∶10；优选地，1∶1-1∶5；更优选地，为1∶3。

本发明的另一方面，提供一种上述脂质分子、上述制备方法制备得到的脂质分子、脂质体、核酸药物组合物或药物组合物在制备药物递送系统中的应用。

本发明的另一方面，提供一种上述脂质分子、上述制备方法制备得到的脂质分子、脂质体、核酸药物组合物或药物组合物在制备核酸疫苗中的应用。

在一实施方式中，所述核酸疫苗用于治疗癌症或者传染性疾病。

在一优选的实施方式中，所述癌症为肾癌。

在一优选地实施方式中，所述核酸为RNA。

与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：

1.硫元素具有一定的还原性，有助于降低ROS水平，减轻炎症，更快地释放mRNA。

2.含该脂质分子的脂质体与mRNA结合紧密，能够实现对mRNA的高效包载和稳定保护。

3.该脂质体适合于不同核酸分子量长度以及不同核酸序列的mRNA递送，具有普适性。

4.该脂质分子含有可电离的胺结构，可在酸性条件下发生质子化，并形成可离子化脂质体，有助于溶酶体逃逸，有利于mRNA的释放，提高细胞递送效率，增加目的蛋白表达。

5.本发明技术合成简单，原料价格低廉，适合大规模生产，形成的LNPs稳定性较高、生物相容性好。

附图说明

图1示出了LNPs的结构组成。

图2示出了实施例1制备的二溴新戊二酯的分子的¹H NMR谱图。

图3示出了实施例1制备的二溴新戊二酯的分子的¹³C NMR谱图。

图4示出了实施例1制备的含硫可离子化脂质分子(S1)的¹H NMR谱图。

图5示出了实施例1制备的含硫可离子化脂质分子(S1)的¹³C NMR谱图。

图6示出了含硫可离子化脂质分子的ESI-TOFMS谱图。

图7示出了实施例2制备的LNPs@mRNA的DLS测试结果。

图8示出了实施例2制备的LNPs@mRNA的TEM照片。

图9示出了实施例3中LNPs@mRNA的细胞内表达实验结果。

图10示出了实施例4中可离子化脂质分子S1的细胞毒性实验结果。

图11示出了实施例5中LNPs@mRNA的转染实验结果。

图12示出了实施例6中LNPs@mRNA的肝功能指标检测结果。

图13示出了实施例6中LNPs@mRNA的组织切片结果。

具体实施方式

I.定义

在本发明中，除非另有说明，否则本文中使用的科学和技术名词具有本领域技术人员所通常理解的含义。并且，本文中所用的相关术语和实验室操作步骤均为相应领域内广泛使用的术语和常规步骤。同时，为了更好地理解本发明，下面提供相关术语的定义和解释。

除非另有其它明确表示，否则在整个说明书和权利要求书中，术语“包括”或其变换如“包含”或“包括有”等等将被理解为包括所陈述的元件或组成部分，而并未排除其它元件或其它组成部分。

本发明化合物可以是不对称的，例如，具有一个或多个立体异构体。除非另有说明，所有立体异构体都包括，如对映异构体和非对映异构体。本发明的含有不对称碳原子的化合物可以以光学活性纯的形式或外消旋形式被分离出来。光学活性纯的形式可以从外消旋混合物拆分，或通过使用手性原料或手性试剂合成。外消旋体、非对映异构体、对映异构体都包括在本发明的范围之内。

在本发明中，

以及

是指取代基键合的位置。

术语“任选”或“任选地”是指随后描述的事件或情况可能发生或可能不发生，该描述包括发生所述事件或情况和不发生所述事件或情况。

本文中的数字范围，是指给定范围中的各个整数。例如，“C₁-C₆”是指该基团可具有1个碳原子、2个碳原子、3个碳原子、4个碳原子、5个碳原子或6个碳原子；“C₃-C₆”是指该基团可具有3个碳原子、4个碳原子、5个碳原子或6个碳原子。

术语“疏水性脂肪烃基”是指对水无亲和力，不溶于水或溶解度极小的基团。

术语“被取代的”是指特定原子或基团上的任意一个或多个氢原子被取代基取代，只要特定原子或基团的价态是正常的并且取代后的化合物是稳定的。当取代基为酮基(即＝O)时，意味着两个氢原子被取代。除非另有规定，取代基的种类和数目在化学上可以实现的基础上可以是任意的。

当任何变量(例如R_n)在化合物的组成或结构中出现一次以上时，其在每一种情况下的定义都是独立的。因此，例如，如果一个基团被1-5个R所取代，则所述基团可以任选地至多被5个R所取代，并且每种情况下的R都有独立的选项。此外，取代基和/或其变体的组合只有在这样的组合会产生稳定的化合物的情况下才是被允许的。

术语“脂肪烃基”包括饱和或不饱和，直链或支链的链状或环状烃基，不含杂原子的和含有杂原子的脂肪烃基；所述杂原子指的是氮原子、氧原子、氟原子、磷原子、硫原子、和硒原子。所述脂肪烃基的类型可选自烷基、烯基、炔基等。如术语“C_1-6脂肪烃基”包括：甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、异丁基、叔丁基、正戊基、异戊基、新戊基、正己基、乙烯基、1-丙烯基、2-丙烯基、1-甲基乙烯基、1-丁烯基、1-乙基乙烯基、1-甲基-2-丙烯基、2-丁烯基、3-丁烯基、2-甲基-1-丙烯基、2-甲基-2-丙烯基、1-戊烯基、1-己烯基、乙炔基，1-丙炔基，2-丙炔基，1-丁炔基，1-甲基-2-丙炔基，3-丁炔基，1-戊炔基、1-己炔基、环丙基、环丁基、环戊基和环己基等。

术语“烷基”指饱和脂肪族烃基团，包括直链的或支链的饱和烃基，所述烃基具有所示出的碳原子数。如术语“C_1-6烷基”包括C₁烷基、C₂烷基、C₃烷基、C₄烷基、C₅烷基、C₆烷基，实例包括，但不限于，甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、异丁基、叔丁基、正戊基、2-戊基、3-戊基、正己基、2-己基、3-己基等。其可以是二价的，例如亚甲基、亚乙基。

“烯基”是指具有2至20个碳原子、一个或多个碳碳双键并且无三键的直链或支链烃基的基团(“C₂-C₂₀烯基”)。在一些实施方案中，烯基具有2至10个碳原子(“C₂-C₁₀烯基”)。在一些实施方案中，烯基具有2至8个碳原子(“C₂-C₈烯基”)。在一些实施方案中，烯基具有2至6个碳原子(“C₂-C₆烯基”)。在一些实施方案中，烯基具有2至5个碳原子(“C₂-C₅烯基”)。在一些实施方案中，烯基具有2至4个碳原子(“C₂-C₄烯基”)。在一些实施方案中，烯基具有2至3个碳原子(“C₂-C₃烯基”)。在一些实施方案中，烯基具有2个碳原子(“C₂烯基”)。所述一个或多个碳碳双键可在内部(例如在2-丁烯基中)或在末端(例如在1-丁烯基中)。C₂-C₄烯基的实例包括乙烯基(C₂)、1-丙烯基(C₃)、2-丙烯基(C₃)、1-丁烯基(C₄)、2-丁烯基(C₄)、丁二烯基(C₄)等。C₂-C₆烯基的实例包括上述C_2-4烯基以及戊烯基(C₅)、戊二烯基(C₅)、己烯基(C₆)等。烯基的其他实例包括庚烯基(C₇)、辛烯基(C₈)、辛三烯基(C₈)等。烯基的每个情形可独立地任选地被取代，即未被取代(“未被取代的烯基”)或被一个或多个取代基(例如1至5个取代基、1至3个取代基或1个取代基)取代(“被取代的烯基”)。在某些实施方案中，烯基是未被取代的C2-10烯基。在某些实施方案中，烯基是被取代的C_2-6烯基。

术语“取代的”或“取代”是指特定原子或基团上的任意一个或多个氢原子被取代基取代，只要特定原子或基团的价态是正常的并且取代后的化合物是稳定的。当取代基为酮基(即＝O)时，意味着两个氢原子被取代。除非另有规定，取代基的种类和数目在化学上可以实现的基础上可以是任意的。取代基可以选自以下的一个、两个或更多个取代基取代：氘、卤素基团、氰基、硝基、-C(＝O)R、-C(＝O)OR’、-OC(＝O)R”、酰亚胺基、酰胺基、羟基、经取代或未经取代的胺基、经取代或未经取代的烷基、经取代或未经取代的环烷基、经取代或未经取代的卤代烷基、经取代或未经取代的烷氧基、经取代或未经取代的烯基、经取代或未经取代的炔基、经取代或未经取代的芳基、经取代或未经取代的芳氧基、经取代或未经取代的杂芳基等，但不限于此。

术语“酮羰基”或“羰基”指的是

术语“酯基”指-C(O)O(烷基)，其中烷基如上所定义。

术语“药物组合物”意指包含本发明所述化合物或其药学上可接受的盐，以及依施用方式和剂型的性质而定的至少一种选自以下药学上可接受的成分的组合物，包括但不限于：载体、稀释剂、佐剂、赋形剂、防腐剂、填充剂、崩解剂、润湿剂、乳化剂、悬浮剂、甜味剂、矫味剂、香味剂、抗菌剂、抗真菌剂、润滑剂、分散剂、温敏材料、温度调节剂、黏附剂、稳定剂、助悬剂等。

本发明的药物或药物组合物可以经肠胃外递送，即，通过静脉内(i.v.)、脑室内(i.c.v.)、皮下(s.c.)、腹膜内(i.p.)、肌内(i.m.)、皮下(s.d.)或皮内(i.d.)施用，通过直接注射，经例如快速浓注或连续输液。用于注射的配制剂可以单位剂型呈现，例如在具有添加的保藏剂的安瓿瓶或多-剂量容器中。所述组合物可以采用赋形剂(excipient)的形状，在油或水性载体中的混悬液、溶液或乳液的形式，并可以包含配制试剂如防沉降剂、稳定剂和/或分散剂。备选地，所述活性成分可以以粉末形式在使用前用适宜的载体(例如无菌无热原水)重构。

术语“炎性疾病”包括所述自身免疫、过敏性病症和炎性病症，例如选自关节炎，强直性脊柱炎，炎性肠病，溃疡性结肠炎，胃炎，胰腺炎，克罗恩氏病，乳糜泻，多发性硬化，全身性红斑狼疮，类风湿性关节炎，风湿热，痛风，器官或移植排斥，急性或慢性移植物抗宿主病，慢性同种异体移植物排斥，贝切特氏病，葡萄膜炎，牛皮癣，皮炎，特异性皮炎，皮肌炎，重症肌无力，格雷夫氏病，桥本甲状腺炎，斯耶格伦综合征，和起泡病症(例如寻常天疱疮)，抗体介导的脉管炎综合征，包括ANCA-相关的血管炎，紫癜，和免疫复合血管炎(癌症或感染一期或二期)。所述过敏性病症可尤其选自接触性皮炎，乳糜泻，哮喘，对屋尘螨的超敏性，花粉和相关的过敏原，铍中毒。所述呼吸病症可尤其选自哮喘，支气管炎，慢性阻塞性肺病(COPD)，囊性纤维化，肺水肿，肺栓塞，肺炎，肺肉瘤病，硅肺病，肺纤维化，呼吸衰竭，急性呼吸窘迫综合征，原发性肺动脉高压和肺气肿等。

术语“病毒感染”包括但不限于逆转录病毒感染、肝炎病毒感染、COVID-19新冠病毒感染，寨卡病毒感染，登革病毒感染等。

缩写：

CDI：N-N′-羰基二咪唑；

II.具体实施方式

实施例

实施例1：化合物S1的制备

步骤一：将油酸溶在甲苯中与二氯亚砜在60℃反应6h，随后真空除去溶剂和二氯亚砜，得到化合物a油酰氯。

步骤二：将油酰氯和二溴新戊二醇溶解在二氯甲烷中，加入三乙胺，过夜反应。得到的反应液经洗涤、干燥和浓缩后用色谱柱分离纯化，所得化合物b油酸二溴新戊二酯进行¹H NMR(图2，测试条件：CDCl₃，400M，298.15K)、¹³CNMR(图3，测试条件：CDCl₃，400M，298.15K)表征。

步骤三：将制备得到的油酸二溴新戊二酯在四氢呋喃中与2-二乙氨基乙硫醇反应，经色谱柱分离纯化后得到化合物S1。所得产物进行¹H NMR(图4，测试条件：CDCl₃，400M，298.15K)、¹³C NMR(图5，测试条件：CDCl₃，400M，298.15K)以及ESI-TOF MS(图6)表征。

从图6可见，制备得到的含硫元素的可离子化脂质分子[M+2H]²⁺理论值为m/z＝448.4，测得m/z＝448.7。

实施例2：化合物S2的制备

步骤一：将实施例1步骤二所得化合物b油酸二溴新戊二脂溶解在吡啶中，加入2-巯基乙醇，60℃反应48h，停止反应自然恢复到室温，旋干溶剂，DCM/MeOH硅胶过柱得到化合物c。

步骤二：称取3-(二甲氨基)丙酸溶解在二氯甲烷里，分别加EDC和DMAP，搅拌均匀后加入化合物c室温搅拌过夜，旋干溶剂过柱子纯化得到产物S2。¹H NMR(500MHz，Chloroform-d)δ＝5.33(d，J＝3.5，4H)，4.26(t，J＝4.5，4H)，4.02(s，2H)，2.84-2.76(m，8H)，2.68(s，2H)，2.53(t，J＝6.6，4H)，2.36(d，J＝1.9，16H)，2.03(dq，J＝7.9，3.9，8H)，1.60-1.56(m，6H)，1.34-1.23(m，42H)，0.88(t，J＝5.2，6H).

实施例3：化合物S3的制备

步骤一：大的圆底烧瓶里用甲苯溶解油酸和2-己基正癸酸，室温搅拌条件下逐滴加入二氯亚砜，升温60℃搅拌6h，待反应结束，停止加热除去溶剂和二氯亚砜，得到两种酰氯化合物a和化合物d。

步骤二：将上一步产物的两种酰氯化合物a和化合物d溶解在二氯甲烷溶液中，加入二溴新戊二醇和三乙胺，反应过夜，洗涤干燥，纯化得到化合物e。

步骤三：把化合物e溶解在吡啶中，加入2-巯基乙醇，60℃反应过夜，停止反应自然恢复到室温，旋干溶剂，DCM/MeOH硅胶过柱得到化合物f。

步骤四：称取3-(二甲氨基)丙酸溶解在二氯甲烷里，分别加EDC和DMAP，搅拌均匀后加入化合物f，室温搅拌过夜，停止反应，旋干溶剂过柱子纯化得到化合物S3。¹H NMR(500MHz，Chloroform-d)δ＝5.34(dd，J＝14.6，11.6，2H)，4.32-4.23(m，6H)，4.19-3.98(m，6H)，2.84-2.72(m，10H)，2.59-2.50(m，3H)，2.36(t，J＝8.5，6H)，2.11-1.98(m，6H)，1.72-1.62(m，12H)，1.34-1.23(m，40H)，0.88(t，J＝5.8，9H).

实施例4：化合物S4的制备

步骤一：大的圆底烧瓶里用甲苯溶解十八烷酸，室温搅拌条件下逐滴加入二氯亚砜，加热60℃搅拌6h，待反应结束，停止加热除去溶剂和二氯亚砜，得到化合物g十八酰氯。

步骤二：将化合物g溶解在二氯甲烷溶液中，分别加入二溴新戊二醇，三乙胺，反应过夜，洗涤干燥纯化得到化合物h。

步骤三：化合物h溶解在吡啶中，加入2-巯基乙醇，60℃反应48h，停止反应自然恢复到室温，旋干溶剂，DCM/MeOH硅胶过柱得到化合物i。

步骤四：将化合物i和CDI溶解在DMSO中，室温反应过夜，反应结束将反应液倒进盛有丙酮的大烧杯中反复洗涤三次除去多余CDI和未反应完的原料，抽滤得到化合物j。

步骤五：化合物j溶解在二氯甲烷中，加入N-(2-氨基乙基)-1，2-乙二胺，室温反应过夜，反应结束旋干过柱，得到化合物S4。¹H NMR(500MHz，Chloroform-d)δ＝5.43(t，J＝5.5，2H)，4.29(t，J＝4.5，4H)，4.20(s，2H)，3.27-3.21(m，4H)，2.90-2.84(m，4H)，2.80(d，J＝4.7，4H)，2.80-2.74(m，7H)，2.74-2.70(m，5H)，2.68(s，2H)，2.36(t，J＝8.5，4H)，2.12(p，J＝4.8，2H)，1.65-1.55(m，6H)，1.34-1.22(m，58H)，0.89(t，J＝5.5，6H).

实施例5：化合物S5的制备

步骤一：将实施例4步骤二所得化合物h十八烷酸二溴新戊二脂溶解在吡啶中，加入3-巯基丙酸丁酯，60℃反应48h，停止反应自然恢复到室温，旋干溶剂，DCM/MeOH硅胶过柱得到化合物k。

步骤二：将化合物k溶解在甲醇溶液，加1M的氢氧化钠溶液室温(或者冰水浴降温)反应，控制反应时间停止反应，将溶液倒进乙酸乙酯萃取，纯化得到化合物1。

步骤三：称取N，N-二甲基乙醇胺溶解在二氯甲烷里，分别加EDC和DMAP，搅拌均匀后加入l，室温搅拌48h，停止搅拌恢复室温，旋干溶剂过柱子纯化得到化合物S5。¹H NMR(500MHz，Chloroform-d)δ＝4.36(t，J＝6.7，4H)，4.01(s，4H)，3.26(t，J＝6.7，4H)，2.84(t，J＝6.1，6H)，2.68(s，6H)，2.59(t，J＝5.9，8H)，2.32(t，J＝8.5，4H)，1.64-1.60(m，6H)，1.34-1.24(m，58H)，0.88(t，J＝5.2，6H).

实施例6：化合物S6的制备

步骤一：称取N-(2-氨基乙基)-1，2-乙二胺溶解在二氯甲烷里，分别加EDC和DMAP，搅拌均匀后加入实施例5步骤二所得化合物1，室温搅拌48h，停止搅拌，旋干溶剂过柱子纯化得到化合物S6。¹H NMR(500MHz，Chloroform-d)δ＝6.85(t，J＝5.0，2H)，4.19(s，2H)，3.33(q，J＝4.7，8H)，2.86(q，J＝4.6，4H)，2.85-2.74(m，12H)，2.67(s，2H)，2.45(t，J＝5.3，6H)，2.38(t，J＝8.5，6H)，2.03(dt，J＝9.7，4.7，4H)，1.65-1.55(m，2H)，1.34-1.22(m，58H)，0.88(t，J＝5.2，6H).

实施例7：化合物S7的制备

步骤一：将实施例3步骤二所得化合物e溶解在吡啶中，加入2-二乙氨基乙硫醇，60℃反应48h，停止反应自然恢复到室温，旋干溶剂，DCM/MeOH硅胶过柱得到化合物S7。¹H NMR(500MHz，Chlorofonn-d)δ＝5.34(s，2H)，4.12-3.98(m，2H)，2.78(d，J＝13.8，1H)，2.74-2.68(m，6H)，2.63(s，4H)，2.61(d，J＝6.9，6H)，2.53(d，J＝13.8，1H)，2.37(t，J＝8.5，2H)，2.05-2.01(m，7H)，1.72(dq，J＝13.3，8.3，2H)，1.69-1.59(m，2H)，1.48-1.33(m，4H)，1.35-1.22(m，40H)，1.16-1.08(m，12H)，0.87(t，J＝5.6，9H).

实施例8：化合物S8的制备

步骤一：将实施例4步骤四所得化合物j溶解在二氯甲烷中，加入N，N-双(2-羟乙基)乙二胺，室温反应过夜，反应结束旋干过柱，得到化合物S8。¹H NMR(500MHz，Chloroform-d)δ＝6.34(s，2H)，5.33(t，J＝5.0，4H)，4.27(t，J＝4.5，4H)，4.20(s，2H)，3.76-3.69(m，4H)，3.64(q，J＝5.9，8H)，3.28(q，J-5.3，4H)，2.79(t，J＝4.5，4H)，2.76-2.66(m，14H)，2.36(t，J＝8.5，4H)，1.65-1.55(m，2H)，1.26(dd，J＝4.0，1.4，58H)，0.88(t，J＝5.3，6H).

实施例9：化合物S9的制备

步骤一：称取N，N-双(2-羟乙基)乙二胺溶解在二氯甲烷里，分别加EDC和DMAP，搅拌均匀后加入实施例5步骤二所得化合物1，室温搅拌48h，停止搅拌恢复室温，旋干溶剂过柱子纯化得到化合物S9。¹H NMR(500MHz，Chloroform-d)δ＝6.94(s，2H)，5.33(t，J＝4.5，4H)，4.20(s，2H)，3.77-3.71(m，4H)，3.64(q，J＝5.9，8H)，3.34-3.27(m，4H)，2.73(td，J＝5.5，1.8，16H)，2.67(s，2H)，2.45(t，J＝5.2，4H)，2.36(t，J＝8.5，4H)，1.65-1.55(m，2H)，1.33-1.24(m，58H)，0.88(t，J＝5.6，6H).

实施例10：化合物S10的制备

步骤一：大的圆底烧瓶里用甲苯溶解油酸和9-十八炔酸，室温搅拌条件下逐滴加入二氯亚砜，升温60℃搅拌6h，待反应结束，停止加热除去溶剂和二氯亚砜，得到两种酰氯化合物a和化合物m。

步骤二：将上一步产物的两种酰氯化合物a和化合物m溶解在二氯甲烷溶液中，加入二溴新戊二醇和三乙胺，反应过夜，洗涤干燥，纯化得到化合物n。

步骤三：化合物n溶解在吡啶中，加入2-巯基乙醇，60℃反应48h，停止反应自然恢复到室温，旋干溶剂，DCM/MeOH硅胶过柱得到化合物o。

步骤四：称取3-(二甲氨基)丙酸溶解在二氯甲烷里，分别加EDC和DMAP，搅拌均匀后加入化合物o，室温搅拌过夜，停止搅拌，旋干溶剂过柱子纯化得到化合物S10。¹H NMR(500MHz，Chlorotorm-d)δ＝5.33(s，2H)，4.26(t，J＝4.4，4H)，4.20(s，3H)，2.84-2.72(m，9H)，2.59-2.50(m，6H)，2.37(s，12H)，2.36(t，J＝8.5，4H)，2.02(dq，J＝7.8，3.8，4H)，1.64-1.56(m，4H)，1.49-1.42(m，4H)，1138-1.23(m，42H)，0.88(t，J＝5.3，6H).

实施例11：化合物S11的制备

步骤一：大的圆底烧瓶里用甲苯溶解油酸和化合物p-1，室温搅拌条件下逐滴加入二氯亚砜，升温60℃搅拌6h，待反应结束，停止加热除去溶剂和二氯亚砜，得到两种酰氯化合物a和化合物p。

步骤二：将上一步产物的两种酰氯化合物a和化合物p溶解在二氯甲烷溶液中，加入二溴新戊二醇和三乙胺，反应过夜，洗涤干燥，纯化得到化合物q。

步骤三：将化合物q溶解在吡啶中，加入2-巯基乙醇，60℃反应48h，停止反应自然恢复到室温，旋干溶剂，DCM/MeOH硅胶过柱得到化合物r。

步骤四：称取3-(二甲氨基)丙酸溶解在二氯甲烷里，分别加EDC和DMAP，搅拌均匀后加入化合物r，室温搅拌过夜，停止搅拌，旋干溶剂过柱子纯化得到化合物S11。¹H NMR(500MHz，Chloroform-d)δ＝5.38-5.35(m，2H)，5.33-5.21(m，1H)，4.30-4.15(m，7H)，2.84-2.66(m，15H)，2.69-2.60(m，3H)，2.59-2.50(m，5H)，2.47-2.26(m，3H)，2.07-1.80(m，13H)，1.80-1.69(m，2H)，1.67-1.46(m，8H)，1.49-1.23(m，33H)，1.26-1.13(m，3H)，1.16-1.06(m，3H)，1.04-0.94(m，7H)，0.92(dd，J＝6.6，1.5，3H)，0.89(t，J＝6.3，3H)，0.81(dd，J＝6.7，3.0，5H)，0.67(s，2H).

实施例12：包载mRNA的LNPs的制备

将化合物S1、二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇(DSPE-PEG)、胆固醇以及二硬脂酰基磷脂酰胆碱(DSPC)按照质量比：50％：10％：30％：10％混合，用乙醇溶解。可编码EGFP的mRNA用pH为5.2的柠檬酸钠(100mM)缓冲溶液溶解。有机相溶液和水相溶液体积比为1∶3，所含脂质与mRNA质量按16∶1的比例混合，得到白色乳液。随后超滤除去乙醇，得到包载mRNA的脂质体纳米粒子(LNPs)，以下简称为LNPs@mRNA。

使用动态光散射(DLS)和透射电镜(TEM)对所获得的LNPs进行粒径分布表征以及形貌表征。DLS结果显示(图7)，LNPs@mRNA的水合粒径约为53nm。TEM结果显示(图8)，LNPs@mRNA呈球形，粒径约为55nm。

实施例13：LNPs@mRNA的细胞内表达实验

将人胚胎肾细胞(HEK293T)与实施例12制备得到的LNPs@mRNA共孵育24h，之后用DAPI对细胞核染色1分钟，PBS冲洗三次。使用荧光显微镜观察细胞的荧光强度。

结果显示(图9)，超过90％的细胞具有来自EGFP绿色荧光蛋白的荧光，可见超过90％的细胞均成功表达了绿色荧光蛋白，说明EGFP-mRNA对细胞进行了高效转染并表达，本发明制备的可离子化脂质体可高效递送mRNA并实现高效转染。

实施例14：可离子化脂质分子的细胞毒性实验

将HEK293T细胞与不同浓度的实施例1制备得到的S1化合物的溶液分别共培养24h和48h，去除培养基，PBS冲洗一次，在新的培养基里加入MTT，共培养6h，弃去培养基，然后PBS冲洗一次，加入DMSO，37℃孵箱静置4h，使用酶标仪检测各孔的吸光度。结果显示(图10)，S1分子在1-200μM的浓度下对细胞均未表现出明显毒性，说明该可离子化脂质分子具有良好的生物相容性。

实施例15：LNPs@mRNA的转染实验

以实施例12制备的LNPs@mRNA(S1组)为转染剂。在转染4h和12h后，统计不同时间节点的转染比率。使用商业转染剂lipo8000作对照，转染24h后用荧光显微镜统计两种转染方式处理的细胞的绿色荧光蛋白的发光强度。

结果显示(图11)，在转染4h后，LNPs@mRNA的转染比例达到44.1％，转染12h后，LNPs@mRNA的转染比例达到80.5％，分别转染4h、12h和24h后，LNPs@mRNA均表现出与商业染试剂lipo8000相当的转染能力。

实施例16：LNPs@mRNA的生物安全性分析

将BALB/c小鼠分为2组，分别经尾静脉注射PBS和LNPs@mRNA(S1组)，注射5天后取小鼠静脉血，离心取上清液，测定肝功能各项指标。对注射5天后的PBS和LNPs@mRNA组的小鼠的心脏、肝脏、脾脏、肺和肾脏进行H&E染色，观察其是否出现病变。

肝功能指标检测结果显示(图12)，S1组小鼠的各项肝肾功能均未出现明显变化，其指标均与PBS相当。组织切片实验结果显示(图13)，经LNPs@mRNA处理的小鼠的各主要器官均未出现明显的病变，其组织结构均与PBS组保持相同。说明LNPs@mRNA纳米粒子具有良好的生物安全性。

实施例17：化合物s1-S11构建的可离子化脂质体的性质及效率

根据实施例12所记载的方法，制备包含化合物S2-S11的包载mRNA的LNPs。根据实施例13-15记载的方法计算其包装效率，根据TEM结果统计LNPs的粒径，计算转染效率以及细胞毒性IC₅₀，并测定LNPs的Zeta电位。其结果与实施例12制备得到的脂质体的该些性质测试结果合并见下表1。

表1：各种可离子化脂质体构建的LNP递送系统的性质及效率

前述对本发明的具体示例性实施方案的描述是为了说明和例证的目的。这些描述并非想将本发明限定为所公开的精确形式，并且很显然，根据上述教导，可以进行很多改变和变化。对示例性实施例进行选择和描述的目的在于解释本发明的特定原理及其实际应用，从而使得本领域的技术人员能够实现并利用本发明的各种不同的示例性实施方案以及各种不同的选择和改变。本发明的范围意在由权利要求书及其等同形式所限定。

Claims (10)

1.式(I)所示的脂质分子，

其中，A¹和A²各自独立地选自-C_1-20烷基-NR^aR^b、-C_1-20烷氧基-NR^aR^b、-NR^aR^b-C_1-20烷基-NR^aR^b、-(NH-C_1-3烷基)n-NH₂、-NR^aR^b-(C_1-3烷基-NH)n-NR^aR^b、-C_1-20烷氧基-O-NR^aR^b、4至10元杂环烷基、-NR^aR^b-4至10元杂环烷基、-O-C_1-20烷基-4至10元杂环烷基、-C(O)-C_1-20烷基-4至10元杂环烷基、4至10元杂环烷基-4至10元杂环烷基，所述-C_1-20烷基、-C_1-20烷氧基、4至10元杂环烷基任选地被1、2、3或4个独立地选自卤素、甲基、乙基、丙基、异丙基、氨基、-N(CH₃)₂、羟基、羧基的取代基取代；其中，n为1、2或3，条件是，A¹和A²至少有一个含有N原子；

L¹、L²、L³、L⁴、B¹和B²各自独立地选自单键或含有C_1-20烷基、酯基、酰胺基、脂肪烃基、醚基、酮羰基或亚胺基的二价连接基团；

R¹和R²各自独立地选自氢、-C_1-20烷基、-C_1-20烯基、-C_1-20炔基、-C(O)-C_1-20烯基、-C_1-20烷氧基-C(O)-C_1-20烷基、-C_1-20烷基-C(O)-C_1-20烷氧基、-C_1-20烷基-C(O)-O-CR^aR^b、-C_1-20烷基-C(O)-C_1-20烯基、-C_1-20烯基-CR^aR^b、-C_1-20烷基-NR^c-C_1-20烷基-NR^dR^e、-C_1-20烷基-5或6元杂环烷基-C_1-20烷基-NR^cR^d、胆固醇；所述-C_1-20烷基、-C_1-20烷氧基、-C_1-20烯基、-C_1-20炔基、5或6元杂环烷基任选地被1、2或3个独立地选自卤素、甲基、乙基、丙基、异丙基、氨基、羟基、羧基的取代基取代，条件是，R¹和R²不同时为氢；

其中，R^a、R^b各自独立地为氢、C_1-20烷基、C_1-20烷氧基；R^c、R^d、R^e各自独立地选自-C_1-20烷基、-C_1-20烷基-C(O)-C_1-20烷基、-C_1-20烯基，所述杂环烷基具有至少一个选自N、O和S的杂原子作为环原子。

2.式(I)所示的脂质分子，

其中，A¹和A²独立地选自胺类结构，所述胺类结构包括伯胺、仲胺和叔胺；

L¹、L²、L³、L⁴、B¹和B²各自独立地选自单键或含有C_1-20烷基、酯基、酰胺基、脂肪烃基、醚基、酮羰基或亚胺基的二价连接基团；

R¹和R²各自独立地选自氢、C_1-20脂肪烃基、或者含有脂肪烃基的酰胺、酯、缩酮、半缩酮、缩醛和半缩醛；R¹和R²不同时为氢。

3.根据权利要求1或2所述的脂质分子，其特征在于，R¹和R²为疏水性的脂肪烃基，所述脂肪烃基是支化的或未支化的、不含杂原子的脂肪烃基或含有杂原子的脂肪烃基；

优选地，A¹和A²各自独立地选自下组：

更优选地，A¹和A²各自独立地选自下组：

优选地，L¹、L²、L³、L⁴、B¹和B²各自独立地选自含-C_1-20烷基、二硫键、乙烯醚键、酯基、硫酯基、硫代酯基、二硫代酯基、碳酸酯基、硫代碳酸酯基、二硫代碳酸酯基、三硫代碳酸酯基、氨基甲酸酯基、硫代氨基甲酸酯基、二硫代氨基甲酸酯基、缩醛、环缩醛、缩硫醛、氮杂缩醛、氮杂环缩醛、氮硫杂缩醛、二硫代缩醛、半缩醛、硫代半缩醛、氮杂半缩醛、缩酮、缩硫酮、氮杂缩酮、氮杂环缩酮、氮硫杂缩酮、亚胺键、腙键、酰腙键、肟键、硫肟醚基、半卡巴腙键、硫代半卡巴腙键、肼基、酰肼基、硫代碳酰肼基、偶氮羰酰肼基、硫代偶氮羰酰肼基、肼基甲酸酯基、肼基硫代甲酸酯基、卡巴肼、硫代卡巴肼、偶氮基、异脲基、异硫脲基、脲基甲酸酯基、硫脲基甲酸酯基、胍基、脒基、氨基胍基、氨基脒基、亚氨酸基、亚氨酸硫酯基、磺酸酯基、亚磺酸酯基、磺酰肼基、磺酰脲基、马来酰亚胺、原酸酯基、磷酸酯基、亚磷酸酯基、次磷酸酯基、膦酸酯基、磷硅烷酯基、硅烷酯基、碳酰胺、硫代酰胺、磺酰胺基、聚酰胺、磷酰胺、亚磷酰胺、焦磷酰胺、环磷酰胺、异环磷酰胺、硫代磷酰胺、乌头酰基、多肽片段、核苷酸及其衍生物骨架、脱氧核苷酸及其衍生物骨架中任一种的二价连接基、任两种或任两种以上二价连接基的组合；

优选地，R¹和R²各自独立地选自下组：

4.根据权利要求1-3任一项所述的脂质分子，其特征在于，A¹和A²独立地选自-NR^aR^b、-C_1-10烷基-NR^aR^b、-(NH-C_1-3烷基)n-NH₂，R^a、R^b为-C_1-10烷基；n为选自1-6的整数；

优选地，L¹、L²、L³、L⁴、B¹和B²各自独立地选自-C_1-10烷基-、-C_1-10烷氧基-、-C_1-10烷基-C(O)、-C_1-10烷氧基-C(O)中任一种的二价连接基、任两种或任两种以上二价连接基的组合；

优选地，R¹和R²各自独立地选自-C_1-20烷基、-C_1-20烯基、-C_1-20炔基、-C(O)-C_1-20烯基；

优选地，B¹和B²各自独立地选自含有羰基的二价连接基团；更优选地，B¹和B²各自独立地选自-(CH₂)_0-6C(O)(CH₂)_0-6-；更优选地，B¹和B²为C(O)；

优选地，L²和L⁴各自独立地选自单键或含有C_1-6烷基的二价连接基团；更优选地，L²和L⁴为单键。

5.式(II)所示的脂质分子：

其中，A¹、A²、L¹、L³各自定义同式(I)化合物；R³为-R³¹R³²，R⁴为-R⁴¹R⁴²；

优选地，R³¹、R³²、R⁴¹、R⁴²各自独立地选自-C_1-19烷基、-C_1-19烯基、-C_1-19炔基或

其中，X选自1-6的整数；条件是R³¹、R³²、R⁴¹、R⁴²不同时为氢；

优选地，R³¹、R³²、R⁴¹、R⁴²各自独立地选自-C_7-19烷基、-C_7-19烯基、-C_7-19炔基或

其中，X选自1-6的整数；

优选地，R³¹、R³²、R⁴¹、R⁴²各自独立地选自-(CH₂)_m1CH₃、-(CH₂)_m2CH＝CH(CH₂)_n1CH₃、-(CH₂)_m3CH≡CH(CH₂)_n2CH₃、或

其中，m1选自1-19的整数；m2、m3、n1、n2各自独立地选自1-16的整数；

优选地，L₅选自单键、-O-、-C(O)-或-NH-；更优选地，L为-C(O)-；

优选地，-L¹-或-L³-选自-(CH₂)_m4-、-(CH₂)_m4C(O)-、-(CH₂)_m4C(O)O(CH₂)_m5-或-(CH₂)_m4OC(O)(CH₂)_m5-，其中，m4、m5各自独立地选自1-6的整数；优选地，m4、m5各自独立地选自1-3的整数；

优选地，-L¹-A¹、-L³-A²选自

6.根据权利要求1-5任一项所述的脂质分子，其特征在于，所述化合物选自下组：

7.一种包含权利要求1-5任一项所述的脂质分子的脂质体，其特征在于，以质量百分含量计，其包含10％-70％脂质分子、1％-20％二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇、5％-50％胆固醇以及1％-30％二硬脂酰基磷脂酰胆碱。

8.一种核酸药物组合物，其特征在于，包含权利要求7所述的脂质体和核酸药物；优选地，所述核酸药物为RNA；优选地，所述RNA选自mRNA、siRNA以及microRNA。

9.权利要求8所述的核酸药物组合物的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

(B1)将脂质分子、二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇、胆固醇、二硬脂酰基磷脂酰胆碱按比例混合，用溶剂4溶解得到有机相脂质体溶液；

(B2)将核酸药物用一定pH一定浓度的缓冲溶液溶解得到水相核酸药物溶液；

(B3)将步骤(B1)得到的有机相脂质体溶液和步骤(B2)得到的水相核酸药物溶液混合，均质后超滤得到所述核酸药物组合物；

优选地，所述溶剂4选自甲醇、乙醇、四氢呋喃、丙酮、二甲基亚砜或N,N-二甲基甲酰胺；

优选地，步骤(B2)所述缓冲溶液为醋酸/醋酸钠溶液或柠檬酸/柠檬酸钠溶液，其pH为3-9，浓度为1mM-1M；

优选地，步骤(B3)中的混合是通过将步骤(B2)得到的水相核酸药物溶液滴入有机相脂质体溶液中；

优选地，步骤(B3)中有机相脂质体与水相核酸药物的体积比为1:1-1:10；

优选地，步骤(B3)中脂质体与核酸药物的质量比为5:1-50:1；更优选地，所述核酸药物为mRNA，所述脂质分子与mRNA的质量比为10:1-30:1；更优选地，为16:1。

10.权利要求1-6任一项所述的脂质分子、权利要求7所述的脂质体、权利要求8所述的核酸药物组合物和/或权利要求9所述的制备方法得到的药物组合物在制备药物递送系统或核酸疫苗中的应用；

优选地，在制备用于治疗癌症或者传染性疾病的核酸药物或者核酸疫苗中的应用；

优选地，所述核酸为RNA。

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