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CN115807021A - 一种莱茵衣藻人工叶绿体基因组合成组装与功能测试的方法 - Google Patents

一种莱茵衣藻人工叶绿体基因组合成组装与功能测试的方法 Download PDF

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CN115807021A
CN115807021A CN202210917993.3A CN202210917993A CN115807021A CN 115807021 A CN115807021 A CN 115807021A CN 202210917993 A CN202210917993 A CN 202210917993A CN 115807021 A CN115807021 A CN 115807021A
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chlamydomonas reinhardtii
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genome
fragment
artificial
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胡章立
王潮岗
郭春立
张桂英
贾彬
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Shenzhen University
Original Assignee
Shenzhen University
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Abstract

本发明提供了一种莱茵衣藻人工叶绿体基因组合成组装与功能测试的方法。首次对莱茵衣藻叶绿体基因组进行理性设计，提出全人工合成莱茵衣藻叶绿体基因组。利用全化学合成的叶绿体基因组片段，在酵母‑细菌系统中，实现叶绿体基因组的全化学从头合成及组装。然后将全化学合成的叶绿体基因组转化衣藻细胞，替换叶绿体原有基因组，发挥正常功能并进行了验证，实现了全化学合成叶绿体基因组的生物学功能。本发明展示莱茵衣藻叶绿体基因组是一个开展合成生物学操作的高效平台，其基因组的从头设计、全化学合成、体外组装及鉴定，为光合生物光合作用系统的理性设计与改造重构，提高作物的光合效率，解决粮食安全等农业危机提供了新的解决方案。

Description

一种莱茵衣藻人工叶绿体基因组合成组装与功能测试的方法
技术领域
本发明涉及合成生物学领域，尤其涉及一种莱茵衣藻人工叶绿体基因组合成组装与功能测试的方法。
背景技术
莱茵衣藻(Chlamydomonas reinhardtii)是一种单细胞真核藻类模式生物，包括细胞核基因组、线粒体基因组、叶绿体基因组三套遗传系统，常被用于研究光合作用的机制。随着莱茵衣藻基因组遗传转化技术的建立，莱茵衣藻也广泛用作细胞工厂生产重组蛋白包括疫苗、抗体、药物等等。作为微藻中的一类，莱茵衣藻因碳水化合物和脂质含量高的优势广泛用于生物柴油的生产，应用前景广阔。然而，莱茵衣藻的遗传操作体系尚未完全成熟，根据已有的研究结果，从重组蛋白的生产角度来说，细胞核遗传体系中由于存在位置效应和基因沉默现象会导致重组蛋白的产量较低，从而限制了核遗传体系的应用。相对细胞核来说，叶绿体基因组具有原核性且相对简单，使得叶绿体成为重组蛋白生产的主要研究目标。莱茵衣藻人工叶绿体基因组长205kb，以闭合环状方式存在，共含有99个基因，主要包括参与光合作用的相关基因、转录相关基因、tRNA及rRNA编码基因等。除了两个约22kb的大片段重复序列外，仍有超过20％的短重复序列分散分布于基因间区域，此外叶绿体基因组序列中AT含量高达65％。
常规遗传工程技术仅限于允许对现有的序列进行修饰。因此如果具备对遗传内容进行显著变更和排列的能力，超过常规技术能力所及，将会是非常有意义的。因此，存在对合成基因组的需求。合成基因组学是通过一系列的技术手段从头化学全合成整个基因组或者大部分基因组。酵母丙氨酸tRNA基因以及脊髓灰质炎病毒、
Figure SMS_1
噬菌体、T7噬菌体、类SARS冠状病毒和西尼罗河热病毒等基因组序列先后实现了人工改造与合成，其中最具代表性的工作为蕈状支原体基因组的合成与最小化、大肠杆菌基因组的重编码和酿酒酵母染色体的人工合成。质体基因组的从头化学合成仅限于化学合成片段在枯草芽孢杆菌中完整组装水稻叶绿体基因组，但并未对合成水稻叶绿体基因组进行功能分析。2012年，通过莱茵衣藻叶绿体基因组BAC文库的大片段，在酵母中组装了莱茵衣藻叶绿体基因组，实现了对衣藻叶绿体基因组内多个位点的同步改造。
然而，到目前为止，还没有实现叶绿体基因组的从头设计、体外组装和在藻细胞内实现合成叶绿体基因组的功能化。因此，现有技术还有待改进。
发明内容
鉴于上述现有技术的不足，本发明提供了一种莱茵衣藻人工叶绿体基因组合成组装与功能测试的方法，利用全化学合成的人工叶绿体基因组片段，在酵母-细菌系统中，实现叶绿体基因组的全化学从头合成及组装，为光合生物光合作用系统的理性设计与改造重构，提高作物的光合效率，解决粮食安全等农业危机提供了新的解决方案。
本发明的技术方案如下：
一种莱茵衣藻人工叶绿体基因组合成组装与功能测试的方法，其中，所述方法包括莱茵衣藻人工叶绿体基因组的重新设计、全化学合成、组装及功能验证；其中，通过对野生型莱茵衣藻叶绿体基因组核苷酸序列进行设计改造，加入BAC载体骨架、链霉素抗性基因aadA、巴龙霉素抗性基因aphVIII以及HA标签，获得所述莱茵衣藻人工叶绿体基因组的核苷酸序列。
所述的莱茵衣藻人工叶绿体基因组合成组装与功能测试的方法，其中，所述莱茵衣藻人工叶绿体基因组的核苷酸序列全长221,372bp。
所述的莱茵衣藻人工叶绿体基因组合成组装与功能测试的方法，其中，所述莱茵衣藻人工叶绿体基因组重新设计时，分成44个初级片段，每个初级片段的两端有120bp的同源重组序列。
所述的莱茵衣藻人工叶绿体基因组合成组装与功能测试的方法，其中，所述初级片段全部通过化学方法合成。
所述的莱茵衣藻人工叶绿体基因组合成组装与功能测试的方法，其中，所述BAC载体骨架长度为11,060bp，插入位点于野生型莱茵衣藻叶绿体基因组的205,535bp处；所述链霉素抗性基因aadA长度为1,630bp，插入位点于野生型莱茵衣藻叶绿体基因组的173,174bp-173,175bp之间；所述链霉素抗性基因aadA长度为2,287bp，插入位点于野生型莱茵衣藻叶绿体基因组的71,064bp-71,065bp之间；3×HA-1标签位于atpI后面，插入位点于野生型莱茵衣藻叶绿体基因组的170,786bp-170,787bp之间；3×HA-2标签位于rps4后面，插入位点于野生型莱茵衣藻叶绿体基因组的33,292bp-33293bp之间。
所述的莱茵衣藻人工叶绿体基因组合成组装与功能测试的方法，其中，所述莱茵衣藻人工叶绿体基因组的合成组装包括如下步骤：
6.1将重新设计的莱茵衣藻人工叶绿体基因组的44个初级片段分别连接在pUC18载体上；
6.2将BAC载体片段、筛选标记片段、7-35桥接片段、seg44片段、片段seg35-seg43、seg1片段以及片段seg3-seg7共转化酵母BY4741，利用筛选培养基SC-URA筛选后得到包含中间质粒1的酵母菌株-1；
6.3将pRS415载体片段和片段seg7-seg21共转化酵母BY4742，利用筛选培养基SC-LEU进行筛选，并将筛选得到的酵母菌株利用kanMX片段替换基因组上的Met基因进行Met敲除，利用SC-LEU+G418培养基进行筛选获得包含中间质粒2的酵母菌株-2；
6.4将pRS411载体片段和片段seg22-seg35共转化酵母BY4741，用筛选培养基SC-MET筛选得到包含中间质粒3的酵母菌株-3；
6.5将所述酵母菌株-2和酵母菌株-3进行杂交，通过SC-LEU-MET平板进行筛选；随后进行产孢和分孢，利用SC-LEU、SC-MET平板进行筛选；再与SZU-JDY19酵母、SZU-JDY20酵母杂交；之后与含有中间质粒1的酵母菌株-1进行杂交，利用SC-LEU-MET-URA平板进行筛选；对筛选得到的菌株进行SZU-ZLP012质粒的转化，并用SC-URA-LEU-MET-HIS平板进行筛选；
6.6利用半乳糖诱导SZU-ZLP012质粒中的I-SceI基因表达，I-SceI位点切割使3个中间质粒线性化，之后通过酵母细胞中的同源重组，获得含有完整莱茵衣藻人工叶绿体基因组的酵母菌株。
所述的莱茵衣藻人工叶绿体基因组合成组装与功能测试的方法，其中，所述中间质粒1的核苷酸序列全长为92,477bp，包含了野生型莱茵衣藻叶绿体基因组的1-33,292bp和159,554bp-205,535bp的核苷酸序列，所述野生型莱茵衣藻叶绿体基因组的205,535bp处添加了BAC骨架序列；所述中间质粒2的核苷酸序列全长81,426bp，包含了野生型莱茵衣藻叶绿体基因组的28,513bp-102,566bp的核苷酸序列，基因组核苷酸序列首尾接口处连接了pRS406载体序列；所述中间质粒3的核苷酸序列全长72,377bp，包含了野生型叶绿体基因组的97,668bp-164,450bp的核苷酸序列，基因组核苷酸序列首尾接口处连接了pRS411载体序列。
所述的莱茵衣藻人工叶绿体基因组合成组装与功能测试的方法，其中，所述莱茵衣藻人工叶绿体基因组的功能测试包括如下步骤：
8.1将所述莱茵衣藻人工叶绿体基因组通过基因枪法转入莱茵衣藻CC5168的叶绿体，通过链霉素筛选、PCR和Southern Blot筛选获得阳性转化子；
8.2将所述阳性转化子利用梯度链霉素抗性浓度进行同质化筛选；
8.3对所述阳性转化子进行Western Blot实验，验证蛋白表达；对所述阳性转化子的生长曲线和修复突变株的光合作用进行检测。
所述的莱茵衣藻人工叶绿体基因组合成组装与功能测试的方法，其中，对所述阳性转化子进行鉴定以及阳性筛选的检测片段分别为aphVIII、BAC-seg44以及BAC-seg1。
所述的莱茵衣藻人工叶绿体基因组合成组装与功能测试的方法，其中，对所述阳性转化子进行Southern Blot验证用的探针采用aph VIII-F1/R1以及psaA-F/R引物扩增得到；其中，所述aph VIII-F1/R1核苷酸序列如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示，所述psaA-F/R核苷酸序列如SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4所示。
有益效果：本发明提供了一种莱茵衣藻人工叶绿体基因组合成组装与功能测试的方法。本发明首次对莱茵衣藻叶绿体基因组进行理性设计，提出全人工合成莱茵衣藻叶绿体基因组。采用合成生物学的方法，所有核酸片段全部是由化学合成的核酸序列构建而来的。利用全化学合成的叶绿体基因组片段，在酵母-细菌系统中，实现叶绿体基因组的全化学从头合成及组装。然后将全化学合成的叶绿体基因组转化衣藻细胞，通过多种技术手段，替换叶绿体原基因组，发挥正常功能并进行了验证，实现了全化学合成叶绿体基因组的生物学功能。该方法可广泛应用于莱茵衣藻叶绿体基因组的基因编辑和抗体药物等生产中，具有巨大的商业优势和广阔的市场前景。同时，本发明展示莱茵衣藻叶绿体基因组是一个开展合成生物学操作的高效平台，其基因组的从头设计、全化学合成、体外组装及鉴定，为光合生物光合作用系统的理性设计与改造重构，提高作物的光合效率，解决粮食安全等农业危机提供了新的解决方案。
附图说明
图1为本发明实施例提供的莱茵衣藻人工叶绿体基因组的图谱。
图2为本发明实施例提供的中间质粒1的图谱。
图3为本发明实施例提供的中间质粒2的图谱。
图4为本发明实施例提供的中间质粒3的图谱。
图5为本发明实施例提供的中间质粒1的Junction PCR结果示意图。
图6为本发明实施例提供的中间质粒2的Junction PCR结果示意图。
图7为本发明实施例提供的中间质粒3的Junction PCR结果示意图。
图8为本发明实施例提供的含有中间质粒1、中间质粒2和中间质粒3的酵母杂交过程示意图。
图9为本发明实施例提供的莱茵衣藻人工叶绿体基因组全Junction PCR验证结果示意图。
图10为本发明实施例提供的莱茵衣藻人工叶绿体基因组转化子阳性筛选结果示意图。
图11为本发明实施例提供的Southern Blot实验结果示意图。
图12本发明实施例提供的不同链霉素浓度的TAP培养基上转化子的培养结果示意图。
图13本发明实施例提供的Western Blot实验结果示意图。
图14本发明实施例提供的CC5168合成叶绿体藻株的生长状态结果示意图。
图15本发明实施例提供的CC5168转化子光合效率结果示意图。
图16本发明实施例提供的CC5168合成型叶绿体藻株光下恢复正常生长的结果示意图。
具体实施方式
本发明提供一种莱茵衣藻人工叶绿体基因组合成组装与功能测试的方法，为使本发明的目的、技术方案及效果更加清楚、明确，以下对本发明进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
本发明实施例提供一种莱茵衣藻人工叶绿体基因组合成组装与功能测试的方法，所述方法包括莱茵衣藻人工叶绿体基因组的重新设计、全化学合成、组装及功能验证。本发明实施例采用合成生物学的方法，利用全化学合成的叶绿体基因组片段，在酵母-细菌系统中，实现叶绿体基因组的全化学从头合成及组装。然后将全化学合成的叶绿体基因组转化衣藻细胞，通过多种技术手段，替换叶绿体原基因组，实现全化学合成叶绿体基因组的生物学功能。
在一些实施方式中，通过对野生型莱茵衣藻叶绿体基因组核苷酸序列进行设计改造，加入BAC载体骨架、链霉素抗性基因aadA、巴龙霉素抗性基因aphVIII以及HA标签，获得所述莱茵衣藻人工叶绿体基因组的核苷酸序列。最终设计得到的莱茵衣藻人工叶绿体基因组如图1所示。
在一些实施方式中，所述莱茵衣藻人工叶绿体基因组核苷酸序列共有221.372bp碱基。
在一些实施方式中，所述野生型莱茵衣藻叶绿体基因组核苷酸序列全长205,535bp，NCBI序列号为NC_005353.1。
在一些实施方式中，所述莱茵衣藻人工叶绿体基因组重新设计时，分成44个初级片段，每个初级片段的两端有120bp的同源重组序列。所述44个初级片段的分布如图1所示。
在一些实施方式中，所述初级片段全部通过化学方法合成。所有的初级片段均连接到pUC18载体，同时也可以通过限制性内切酶Not I对载体进行酶切获得初级片段。
在一些实施方式中，所述莱茵衣藻人工叶绿体基因组加入了BAC载体骨架、aphVIII、aadA抗性筛选标记以及HA标签。
在一些实施方式中，所述BAC载体骨架长度为11,060bp，插入位点于野生型莱茵衣藻叶绿体基因组的205,535bp处；所述链霉素抗性基因aadA长度为1,630bp，插入位点于野生型莱茵衣藻叶绿体基因组的173,174bp-173,175bp之间；所述链霉素抗性基因aadA长度为2,287bp，插入位点于野生型莱茵衣藻叶绿体基因组的71,064bp-71,065bp之间；3×HA-1标签位于atpI后面，插入位点于野生型莱茵衣藻叶绿体基因组的170,786bp-170,787bp之间；3×HA-2标签位于rps4后面，插入位点于野生型莱茵衣藻叶绿体基因组的33,292bp-33293bp之间。
在一些实施方式中，所述莱茵衣藻人工叶绿体基因组的合成组装包括如下步骤：
S01、将重新设计的莱茵衣藻人工叶绿体基因组的44个初级片段分别连接在pUC18载体上；
S02、将BAC载体片段、筛选标记片段、7-35桥接片段、seg44片段、片段seg35-seg43、seg1片段以及片段seg3-seg7共转化酵母BY4741，利用筛选培养基SC-URA筛选后得到包含中间质粒1的酵母菌株-1；
S03、将pRS415载体片段和片段seg7-seg21共转化酵母BY4742，利用筛选培养基SC-LEU进行筛选，并将筛选得到的酵母菌株利用kanMX片段替换基因组上的Met基因进行Met敲除，利用SC-LEU+G418培养基进行筛选获得包含中间质粒2的酵母菌株-2；
S04、将pRS411载体片段和片段seg22-seg35共转化酵母BY4741，用筛选培养基SC-MET筛选得到包含中间质粒3的酵母菌株-3；
S05、将所述酵母菌株-2和酵母菌株-3进行杂交，通过SC-LEU-MET平板进行筛选；随后进行产孢和分孢，利用SC-LEU、SC-MET平板进行筛选；再与SZU-JDY19(已进行生物保藏，保藏信息如下：保藏单位名称：CCTCC-中国典型培养物保藏中心；保藏单位地址：中国武汉武汉大学；保藏日期：2022-07-05；保藏编号：CCTCC NO:M 20221034；分类命名：Saccharomyces cerevisiae SZUJDY19)和SZU-JDY20(已进行生物保藏，保藏信息如下：保藏单位名称：CCTCC-中国典型培养物保藏中心；保藏单位地址：中国武汉武汉大学；保藏日期：2022-07-05；保藏编号：CCTCC NO:M 20221033；分类命名：Saccharomyces cerevisiaeSZUJDY20)杂交；之后与含有中间质粒1的酵母菌株-1进行杂交，利用SC-LEU-MET-URA平板进行筛选；对筛选得到的菌株进行SZU-ZLP012质粒(已进行生物保藏，保藏信息如下：保藏单位名称：CCTCC-中国典型培养物保藏中心；保藏单位地址：中国武汉武汉大学；保藏日期：2022-07-05；保藏编号：CCTCC NO:M 20221031；分类命名：Escherichia coli SZUZLP012)的转化，并用SC-URA-LEU-MET-HIS平板进行筛选；
S06、利用半乳糖诱导SZU-ZLP012质粒中的I-SceI基因表达，I-SceI位点切割使3个中间质粒线性化，之后通过酵母细胞中的同源重组，获得含有完整莱茵衣藻人工叶绿体基因组的酵母菌株(已进行生物保藏，保藏信息如下：保藏单位名称：CCTCC-中国典型培养物保藏中心；保藏单位地址：中国武汉武汉大学；保藏日期：2022-07-05；保藏编号：CCTCCNO:M 20221035；分类命名：Escherichia coli HWY258)。
在一些实施方式中，所述中间质粒1的核苷酸序列全长为92,477bp，包含了野生型莱茵衣藻叶绿体基因组的1-33,292bp和159,554bp-205,535bp的核苷酸序列，其图谱如图2所示。所述野生型莱茵衣藻叶绿体基因组的205,535bp处添加了BAC骨架序列，所述BAC骨架序列如SEQ ID NO.5所示。
在一些实施方式中，所述中间质粒2的核苷酸序列全长81,426bp，包含了野生型莱茵衣藻叶绿体基因组的28,513bp-102,566bp的核苷酸序列，基因组核苷酸序列首尾接口处pRS406载体序列，其图谱如图3所示；所述pRS406载体序列如SEQ ID NO.6所示。
在一些实施方式中，所述中间质粒3的核苷酸序列全长72,377bp，包含了野生型叶绿体基因组的97,668bp-164,450bp的核苷酸序列，基因组核苷酸序列首尾接口处连接了pRS411载体序列，其图谱如图4所示；所述pRS411载体序列如SEQ ID NO.7所示。
在一些具体的实施方式中，步骤S03中，将筛选得到的酵母菌株利用kanMX片段替换基因组上的Met基因进行Met敲除；以pFA6-kanMX4(商业化质粒，购于上海雅吉生物科技有限公司，货号：YC-14391RJ)为模板用引物Met17F/R进行PCR扩增得到kanMX片段，所述pFA6-kanMX4购于商业公司；将kanMX的PCR片段转化到含有中间质粒2的酵母中，筛选培养及SC-LEU+G418进行筛选；将转化的板子影印到G418的平板上，挑在两种平板上都能长的单克隆，即筛选获得酵母菌株-2。
具体的，所述kanMX片段序列如SEQ ID NO.8所示；引物Met17-F和Met17-R的序列如SEQ ID NO.9和SEQ ID NO.10所示。
具体的，ZLP012质粒带有I-SceI核酸内切酶和HIS3营养缺陷筛选标记基因。利用半乳糖诱导I-SceI的表达，chunk1(中间质粒1)、chunk2(中间质粒2)和chunk3(中间质粒3)因I-SceI位点切割使酵母中的三个中间质粒线性化。
本发明实施例在组装莱茵衣藻人工叶绿体基因组时，首先通过PCR扩增载体片段，使载体片段携带与两端片段的同源序列；之后将载体片段和相应的片段共转化酵母细胞；再通过合适的营养缺陷型SC筛选培养基筛选获得转化子，提取酵母转化子的基因组，通过Junction PCR筛选获得组装正确的chunk1、chunk2和chunk3。每个中间质粒加入I-SceI核酸内切酶识别位点，在所有次级片段导入酵母后，通过在细胞中诱导I-SceI内切酶的表达，将中间质粒线性化，利用同源重组机制将三个次级片段组装成最终的人工合成型叶绿体基因组。
在一些实施方式中，所述莱茵衣藻人工叶绿体基因组的功能测试包括如下步骤：
S100、将所述莱茵衣藻人工叶绿体基因组通过基因枪法转入莱茵衣藻CC5168的叶绿体，通过链霉素筛选、PCR和Southern Blot筛选获得阳性转化子；
S200、将所述阳性转化子利用梯度链霉素抗性浓度进行同质化筛选；
S300、对所述阳性转化子进行Western Blot实验，验证蛋白表达；对所述阳性转化子的生长曲线和修复突变株的光合作用进行检测。
具体的，链霉素筛选培养基浓度为150μg/mL。所述同质化的梯度链霉素浓度为150μg/mL、300μg/mL、400μg/mL、500μg/mL、600μg/mL、700μg/mL、800μg/mL、900μg/mL和1000μg/mL。
对莱茵衣藻人工叶绿体基因组的功能分析时，首先提取酵母质粒，采用电击法将质粒转入大肠杆菌EPI300，提取大肠杆菌质粒，通过基因枪转化的方法将合成型叶绿体基因组转入光缺陷型莱茵衣藻CC5168(ΔpsbH)，通过抗生素筛选和HS培养基筛选获得转化子。对转化子进行进行PCR和Southern Blot阳性筛选。最后对阳性转化子Western Blot验证，同时进行转化子的生长曲线和光缺陷型藻株光合作用修复的检测。
在一些实施方式中，对所述阳性转化子进行鉴定以及阳性筛选的检测片段分别为aphVIII、BAC-seg44以及BAC-seg1，检测引物分别为aphVIII-F/R、BAC44-F/R以及BAC1-F/R；所述aphVIII-F/R核苷酸序列如SEQ ID NO.11和SEQ ID NO.12所示，所述BAC44-F/R核苷酸序列如SEQ ID NO.13和SEQ ID NO.14所示，所述BAC1-F/R核苷酸序列如SEQ ID NO.15和SEQ ID NO.16所示。
在一些实施方式中，对所述阳性转化子进行Southern Blot验证所采用的探针通过aph VIII-F1/R1以及psaA-F/R引物扩增得到；所述aph VIII-F1/R1核苷酸序列如SEQ IDNO.1和SEQ ID NO.2所示，所述psaA-F/R核苷酸序列如SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4所示。
本发明实施例为合成基因组的设计、合成、装配及表达提供了实施方式与方法。包括用于以下各项的方法：基因组的合理设计；小核酸片段的制备以及将它们组装成包含基因组组分的表达盒；表达盒序列中错误的纠正；将表达盒组装成合成基因组(例如，通过体外重组的方法)；将合成基因组利用叶绿体转入进莱茵衣藻叶绿体和阳性转化藻株的筛选及验证。本发明包含合成基因组的理性设计，构建合成基因组的方法，包括制备和组装基因组核酸组分，其中所有基因组是由已经化学合成的核酸组分构建而成。在一个具体的实施方式中，一个完整的合成基因组全部由已经化学合成的核酸组分或化学合成的核酸组分的拷贝构建而成。更进一步地，合成基因组可以是合成的细胞器基因组。
本发明采用合成生物学的方法，利用全化学合成的叶绿体基因组片段，在酵母-细菌系统中，实现叶绿体基因组的全化学从头合成及组装。然后将全化学合成的叶绿体基因组转化衣藻细胞，通过多种技术手段，替换叶绿体原基因组，实现全化学合成叶绿体基因组的生物学功能。本发明展示莱茵衣藻叶绿体基因组是一个开展合成生物学操作的高效平台，其基因组的从头设计、全化学合成、体外组装及鉴定，为光合生物光合作用系统的理性设计与改造重构，提高作物的光合效率，解决粮食安全等农业危机提供了新的解决方案。
下面通过具体实施例对本发明一种莱茵衣藻人工叶绿体基因组合成组装与功能测试的方法做进一步的解释说明：
实施例1莱茵衣藻人工叶绿体基因组的设计
从NCBI下载野生型莱茵衣藻叶绿体基因组序列(NC_005353.1)，在野生型叶绿体基因组序列的基础上对其进行设计，包括插入HA标签用于检测目标蛋白的表达、插入5'-atpA-aadA-rbcL-3'和5'atpA-aphVIII-rbcL-3'两个抗性基因表达框用于后续筛选，所述5’atpA-aphVIII-3’rbcL抗性筛选标记长度为2,287bp，位于野生型莱茵衣藻叶绿体基因组的71,064bp-71,065bp处，所述aadA抗性筛选标记长度为1,630bp，位于野生型莱茵衣藻叶绿体基因组173,174bp-173,175bp处，3×HA-1标签位于atpI后面，170,786bp-170,787bp之间，3×HA-2标签位于rps4后面，33,292bp-33293bp之间。经过重新设计，得到了全长221,372bp莱茵衣藻人工叶绿体基因组序列，如图1所示。
实施例2莱茵衣藻人工叶绿体基因组的组装
所有初级片段委托商业公司合成。所有初级片段连接到pUC18载体，可以通过限制性内切酶Not I获得初级片段，以上序列均经过测序和酶切确认。
1、中间质粒1的组装
在BY4741背景菌株(商业化菌株，购于辉诺生物医药科技有限公司，货号：A226)进行组装，共21个片段，包括17个叶绿体基因组合成片段(包含了野生型叶绿体基因组的0-33,292bp和159,554bp-205,535bp的核苷酸序列)、2个BAC片段、URA3筛选基因和7-35桥接片段。其中BAC作为中间质粒1的载体，URA3基因提供营养缺陷型筛选标记，7-35桥接片段用于在片段7和片段35之间插入I-SceI酶切位点。最终得到的中间质粒1的图谱如图2所示。具体组装过程如下：
1)片段准备：通过Not I酶切的方法得到合成片段1～7和35～44，pRS416(商业化质粒，购于ACD，货号：518681-C2)质粒为模板，引物vecF+vecR PCR扩增获得带有片段a和片段d同源序列的pRS416载体片段。将pRS416扩增片段，seg-a，seg-b1，seg-b2，seg-c和seg-d片段共转化进入BY4741酵母(商业化菌株，购于辉诺生物医药科技有限公司，货号：A226)，SC-URA筛选培养基进行筛选获得片段2。以pJS356(pJS356 Cloned pTERM+415，DNA)为模版，BAC F/1R和BAC 2F/2R为引物，PCR扩增获得BAC载体片段，以pRS406(可公开获取的质粒，参见Sikorski and Hieter,1989)(pRS406-ura3，DNA)为模板，URA3 F和URA3 R为引物，PCR扩增获得筛选标记片段。7-35JF/JR Primer anealing获得7-35Junction片段，44-V L/R PCR获得片段seg44。
2)酵母转化：将载体片段和seg35-seg43，seg1，seg3-seg7，共转化酵母BY4741，利用筛选培养基SC-URA筛选获得转化子。
3)鉴定：将酵母转化子用牙签挑至灭菌的ddH2O，涡旋混匀后，98℃，3min，4℃，2min，4个循环。6000rpm离心5min。以上清为模板，引物为6F/R和41F/R进行PCR扩增，转化子阳性初筛。提取初筛为阳性的酵母菌基因组，用BAC2/V-R，1F/1R至6F/6R，7F/7-35JR，35F/35R至43F/43R和44F/BAC1共18对引物进行Junction PCR验证，验证结果如图5所示，结果表明中间质粒1在BY4741细胞中组装成功。中间质粒1的图谱如图2所示。
2、中间质粒2的组装
1)片段准备：通过Not I酶切的方法得到合成片段seg7-seg21，以pRS415(可公开获取的质粒，参见Sikorski and Hieter，1989)(-Leu)为模板，扩增与seg7和seg22带有同源片段的pRS415载体片段。
2)酵母转化：将载体片段和片段seg7-seg21共转化酵母BY4742(商业化菌株，购于ZOMANBIO，货号：ZK280)，利用筛选培养基SC-LEU筛选获得转化子。
3)阳性鉴定：阳性鉴定过程同中间质粒2，转化子阳性初筛引物为7F/34F和18F/R。用7F/34F和8F/8R至20F/20R共14对引物进行Junction PCR验证，验证结果如图6所示，研究结果表明中间质粒2在酵母BY4742中成功组装。中间质粒2的图谱如图3所示。
4)以pFA6-kanMX4(商业化质粒，购于上海雅吉生物科技有限公司，货号：YC-14391RJ)为模板用引物Met17F/R进行PCR扩增得到kanMX片段。将kanMXPCR片段转化到含有中间质粒2的酵母中，筛选培养及SC-LEU+G418进行筛选；将转化的板子影印到G418的板子上，挑在两种板子上都能长的单克隆。筛选获得酵母菌株-2；
3、中间质粒3的组装
1)片段准备：通过Not I酶切的方法得到合成片段seg22-seg35，以pRS411(-Met)(可公开获取的质粒，参见Sikorski and Hieter，1989)为模板，用引物pRS411V F+VR PCR扩增获得获得与seg22和seg35带有同源序列的片段。
2)酵母转化：将载体片段和片段seg22-seg35共转化酵母BY4741，用筛选培养基SC-MET筛选获得转化子。
3)阳性鉴定：酵母转化子筛选过程同中间质粒3。转化子阳性初筛初步筛选引物为26F/R和34F/R，对初步筛选阳性的菌株用22F/R至29F/R，8F/R至11F/R和34F/R共13对引物进行Junction PCR验证，验证结果如图7所示，研究结果表明中间质粒chunk3在酵母BY4741中成功组装。中间质粒3的图谱如图4所示。
4、完整合成型叶绿体基因组的组装
1)同时含有中间质粒2和中间质粒3的酵母菌株单倍体获得
通过SC-LEU-MET平板筛选同时含有中间质粒2(LEU2)和中间质粒3(MET17)的二倍体酵母菌株。随机从SC-LEU-MET平板上挑选二倍体酵母菌株(#1，#2)进行产孢和分孢过程得到单倍体酵母(如图8A)。将YPD平板分别影印到SC-LEU、SC-MET和SC-URA平板上，SC-LEU和SC-MET用于筛选同时含有中间质粒2和中间质粒3的单倍体酵母菌，SC-URA平板用于确保得到的单倍体不会在SC-URA平板上生长以进行后续三个中间质粒的杂交，得到了同时含有中间质粒2和中间质粒3的单倍体酵母菌(如图8B)。
2)同时含有中间质粒1、中间质粒2和中间质粒3的酵母菌株的获得
为了后续能够与中间质粒1进行杂交，需要从中挑选交配型为alpha的单倍体酵母菌株。SZU-JDY19(MAT a thr4 Mal')(保藏号：CCTCC M 20221034)和SZU-JDY20(MAT alphathr4 Mal')(保藏号：CCTCC M 20221033)的交配型分别为a和alpha，与其进行杂交的单倍体菌株只有成功杂交成二倍体才能够在SD平板上生长。将上述YPD分孢的平板分别与SZU-JDY19和SZU-JDY20进行杂交，然后影印到SD平板上，成功筛选到了目的菌株，再分别与含有中间质粒1的酵母菌进行杂交，通过SC-LEU-MET-URA平板筛选获得了同时含有3个中间质粒的酵母菌株(如图8C)。
3)酵母菌株中三个中间质粒组装成完成的莱茵衣藻叶绿体基因组
三个中间质粒中两两各有一个同源片段，中间质粒1和中间质粒2上都含有片段7，中间质粒2和中间质粒3都有片段22，中间质粒3和中间质粒1都含有片段35，且在同源片段的一端都含有I-SceI切割位点。I-SceI是来源于酿酒酵母线粒体内含子编码的一种核酸内切酶，能够特异性识别约18bp的序列，并在识别位点产生一个双链断裂缺口进而激活酵母细胞的同源重组修复机制。进行SZU-ZLP012质粒(保藏号：CCTCC M20221031)的转化，用SC-URA-LEU-MET-HIS平板筛选；利用半乳糖诱导ZLP012质粒中的I-SceI基因表达，将中间质粒1、2、3进行线性化，借助酵母细胞的同源重组修复系统，实现以中间质粒1的BAC载体为载体的完整的叶绿体基因组的组装。提取酵母菌株的基因组，利用44个Junction引物进行PCR筛选，获得含有完整的合成型莱茵衣藻人工叶绿体基因组的菌株(保藏号：CCTCC M20221035)(如图9)。
实施例4莱茵衣藻人工叶绿体基因组的功能验证
1、叶绿体人工基因组转入莱茵衣藻叶绿体
1)金粉制备
称取30mg直径1um的金粉置于1.5mL离心管中，加入1mL70％乙醇，剧烈震荡洗涤5min，浸泡15min。4000rpm离心5s，吸弃上清。加入1mLddH2O，剧烈震荡涡旋1min，静置1min，4000rpm，5min，重复洗涤3次。想金粉沉淀加入50％甘油500μL，保存于4℃备用。
2)金粉包被
50％甘油保存的金粉充分震荡5min，取50μL金粉置于1.5mL离心管，一次加入5ug质粒、50uLCaCl2和20uL 0.1M亚精胺。充分涡旋震荡3min，静置1min，4000rpm离心5s。吸弃上清，加入足量70％乙醇漂洗，西弃上清，重复2次。漂洗后加入足量无水乙醇漂洗，吸弃上清。加入适量无水乙醇，快速涡旋5s，重悬沉淀。
3)基因枪转化
离心(3500×g，5min)收集培养至细胞浓度为2×106cell/mL受体藻细胞，用新鲜的TAP培养基重悬至1×108cell/mL，取250μL重悬藻细胞，平铺于90×15mm筛选平板的中央，室温黑暗干燥2小时。轰击DNA微粒的准备：取50μL金粉，依次加入5.0μL DNA(1.0μg/μL),50μL 2.5M CaCl2,和20μL 0.1mM spermidine，震荡混匀，离心，用70％酒精洗涤，最后用100μL无水乙醇重悬，每次取10μL进行轰击。基因枪为Biolistic PDS-1000/He ParticleDelivery System(BIO-RAD)，轰击参数如下：可裂膜1100psi，轰击距离9cm。轰击结束后，平板置于25℃黑暗培养24小时，后转入25℃，光周期比为16:8的培养箱中继续培养3-4周，直至绿色单克隆长出。
2、转化子的鉴定
长出绿色转化子后，超净台内将转化子用牙签划线至新的链霉素抗性(150μg/mL)培养皿，继续培养。挑取莱茵衣藻单克隆藻细胞至50μL chelex，震荡混匀后，98℃30min，立马置冰上冷却。震荡混匀，离心。以上清为模板，3×HA-1F/R及3×HA-2为引物PCR扩增进行转化子阳性初筛。随后用基因组提取试剂盒提取HA初筛为阳性的转化子的基因组，以基因组为模板，分别用aphVIII-F/R,BAC44-F/R和BAC1-F/R等引物进行PCR扩增，PCR产物进行1.2％琼脂糖凝胶电泳以进一步阳性鉴定，获得了同时含有HA标签、aphVIII和BAC序列的转化子，结果如图10所示，其中，A,aph VIII PCR鉴定；B,BAC-Seg1 PCR鉴定.C,BAC-seg44PCR鉴定.abc中泳道-没有模板作为阴性对照,泳道+为质粒作阳性对照,泳道CC125-K3,CC125-K6,CC125-M8,CC125-K2,CC125-N15,CC5168-2,CC5168-3和CC5168-4为转化子.Marker为DL2000 bp。
3、Southern Blot验证
设计aph VIII和psaA特异性扩增引物aph VIII-F1/R1和psaA-F/R，以chunk2为模板，PCR扩增获得aph VIII和psaA探针片段，利用DIG DNALabeling and Detection Kit分别标记aph VIII和psaA探针。野生型藻株CC5168(商业化菌株，购买自衣藻中心，美国)和转化子CC5168-3培养至对数期并离心收集藻细胞。选择Hind III和EcoR V分别对10～20μg基因组DNA在37℃条件下酶切消化6h，80V条件下电泳90min。10×SSC转移缓冲溶液中将基因组DNA过夜转移至带正电荷的尼龙膜，随后紫外交联(1500V,1.5min)进行固定。将固定的尼龙膜用28℃预热的DIG Easy Hyb Buffer在28℃条件下预杂交30min。倒掉预杂交液，加入新鲜28℃预热的DIG Easy Hyb Buffer(3.5mL/100cm2)，用aphVIII和psaA探针28℃条件下进行杂交验证，具体操作参照说明书。
光缺陷型藻株CC5168和阳性转化藻株CC5168-3的基因组DNA经EcoR I酶解后分别与psaA探针杂交，结果如图11所示，其中泳道1表示psaA探针与EcoR I酶消化野生型CC125基因组的杂交结果；泳道2表示psaA探针与EcoR I酶消化CC125-N15基因组的杂交结果；泳道3表示aph VIII探针与Hind III酶消化CC125-N15基因组的杂交结果；泳道4表示aphVIII探针与EcoR I酶消化CC125-N15基因组的杂交结果。其中泳道1和泳道2进行对比，泳道3和泳道4进行比较。Marker为DL10000 bp。结果显示，莱茵衣藻CC5168的杂交条带约6,681bp，CC5168-3的杂交条带约9000bp，表明aph VIII表达盒存在于人工合成叶绿体基因组中。接着，阳性转化藻株CC5168-3的基因组分别经EcoR I和Hind III酶解，与aph VIII探针进行Southern Blot，杂交结果表明，aph VIII探针与EcoR I酶解的CC5168-3基因组DNA的杂交条带约为9,000bp，与psaA探针的杂交条带大小一致。同时，aph VIII探针与Hind III酶解的CC5168-3基因组DNA的杂交条带大约为5,000bp，表明aph VIII表达盒存在于人工合成叶绿体基因组的79,599bp-88,566bp之间(图11)，与设计时在人工合成叶绿体基因组中加入的aph VIII表达盒位置一致。所有转化子的RFLP-Southern Blot结果中均只出现一个条带，说明转化株已经完成同质化，人工全合成的叶绿体基因组已经完全取代了野生的叶绿体基因组。
4、转化子的同质化
将PCR鉴定出来的转化子转板到链霉素浓度为150μg/mL、300μg/mL、400μg/mL、500μg/mL、600μg/mL、700μg/mL、800μg/mL、900μg/mL和1000μg/mL的抗性平板上，光周期比为16:8的培养箱中继续培养，如图12所示)。结果表明，链霉素浓度300-900μg/mL时，藻细胞能够正常生长，而1000μg/mL的藻细胞形态发生了明显的变化。取300、600和900μg/mL藻细胞样品送商业公司进行测序。
5、Western Blot验证
光缺陷型藻株CC5168和转化子CC5168-3、CC5168-6培养至对数期并提取藻细胞总蛋白。最后蛋白样品悬浮在蛋白质样品缓冲液中(60mM Tris pH 6.8，2％(w/v)十二烷基硫酸钠，10％(v/v)甘油，0.01％(w/v)溴酚蓝)。蛋白质使用三甘氨酸SDS-PAGE进行分离。进行免疫检测前的凝胶在硝化纤维素膜上进行蛋白质印迹，使用HRP连接的小鼠抗链球菌单克隆抗体(1:5000，在TBS中包括5％(w/v)BSA和奶粉(阻断剂))或兔抗葡萄糖。随后是抗体(在封闭缓冲液中1:5000)通过HRP连接的山羊抗Rabbit IgG(1:10000)阻断缓冲液。使用Pierce ECL蛋白印迹底物和Fusion Fx7 CCD摄像机进行观察。
为了研究莱茵衣藻人工叶绿体基因组中蛋白的表达情况，在rps4(33.3Kd)和atpI(29.4Kd)蛋白添加了HA标签。提取莱茵衣藻CC5168及其转化CC5168-3、CC5168-6的总蛋白，与HA单克隆抗体进行蛋白杂交印记分析，结果如图13所示，其中对照组为光缺陷型CC5168和野生型CC125，CC5168-3和CC5168-6是CC5168的阳性转化藻株.CC125-N15是CC125合成型基因组的阳性转化藻株。实验结果显示，莱茵衣藻CC5168没有杂交印记，转化子CC5168-3、CC5168-6都能杂交到大小为33.3Kd的rps4蛋白和大小为29.4Kd的atpI蛋白(图13)，表明全化学合成的莱茵衣藻人工叶绿体基因组上的标记蛋白能够正常表达，全化学合成的基因组具有转录及翻译功能活性。
5、修复光突变株的光合作用能力分析
1)生长曲线
CC5168及阳性转化藻株CC5168-1、CC5168-2、CC5168-3、CC5168-4和CC5168-6接种至TAP液体培养基，于25℃，30μE/m2/s,16h光照，8h黑暗条件下。另外，CC5168接种至完全黑暗作对照，分别培养0d,1d,2d,3d,4d,5d,6d,7d,8d,9d,10d,11d,12d,13d,14d和15d。测量不同培养时间的OD750值，绘制生长曲线，如图14所示。转化子的生长状态与受体藻株一致，表明莱茵衣藻人工叶绿体基因组能够维持藻细胞正常生长。莱茵衣藻CC5168为psbH基因缺失突变株，不能进行光合作用，只能在完全黑暗的条件下缓慢生长，培养至11d细胞数量才达到3×104细胞/mL，而它的转化子可以在22℃，30μmol m-2s-1连续光照条件下生长，恢复了野生型的生长状态，表明合成的莱茵衣藻人工叶绿体基因组进入莱茵衣藻CC5168细胞后，修复了psbH的缺失突变，恢复了受体藻株的光合自养功能(图14)。
2)光合效率
将培养至对数期的藻细胞，接种到新鲜的TAP培养基中，初始细胞浓度为4×104个/mL，接种后每天取样用细胞计数器计算培养藻的浓度，直至生长至平台期为止。计数得到的细胞浓度为纵坐标，生长时间为横坐标，作图得到不同藻株的生长曲线。使用叶绿素荧光仪PhytoPAM(测量藻株的Fv/Fm，Fv/Fo和ΔF/Fm’，具体测量方法参照PhytoPAM使用说明书，结果如图15所示。
研究结果显示，在22℃，30μmol m-2s-1连续光照条件下，莱茵衣藻CC5168不能进行正常光合作用，其转化子CC5168-2、5168-3、5168-4和5168-6均可进行正常的光合作用，表明莱茵衣藻CC5168的光合作用能力得到恢复(图15,16)。
综上所述，本发明提供了一种莱茵衣藻人工叶绿体基因组合成组装与功能测试的方法。本发明首次对莱茵衣藻叶绿体基因组进行理性设计，提出全人工合成莱茵衣藻叶绿体基因组。采用合成生物学的方法，所有核酸片段全部是由化学合成的核酸序列构建而来的。利用全化学合成的叶绿体基因组片段，在酵母-细菌系统中，实现叶绿体基因组的全化学从头合成及组装。然后将全化学合成的叶绿体基因组转化衣藻细胞，通过多种技术手段，替换叶绿体原基因组，发挥正常功能并进行了验证，实现了全化学合成叶绿体基因组的生物学功能。该方法可广泛应用于莱茵衣藻叶绿体基因组的基因编辑和抗体药物等生产中，具有巨大的商业优势和广阔的市场前景。同时，本发明展示莱茵衣藻叶绿体基因组是一个开展合成生物学操作的高效平台，其基因组的从头设计、全化学合成、体外组装及鉴定，为光合生物光合作用系统的理性设计与改造重构，提高作物的光合效率，解决粮食安全等农业危机提供了新的解决方案。
应当理解的是，本发明的应用不限于上述的举例，对本领域普通技术人员来说，可以根据上述说明加以改进或变换，所有这些改进和变换都应属于本发明所附权利要求的保护范围。

Claims (10)

1.一种莱茵衣藻人工叶绿体基因组合成组装与功能测试的方法，其特征在于，所述方法包括莱茵衣藻人工叶绿体基因组的重新设计、全化学合成、组装及功能验证；其中，通过对野生型莱茵衣藻叶绿体基因组核苷酸序列进行设计改造，加入BAC载体骨架、链霉素抗性基因aadA、巴龙霉素抗性基因aphVIII以及HA标签，获得所述莱茵衣藻人工叶绿体基因组的核苷酸序列。
2.根据权利要求1所述的莱茵衣藻人工叶绿体基因组合成组装与功能测试的方法，其特征在于，所述莱茵衣藻人工叶绿体基因组的核苷酸序列全长221,372bp。
3.根据权利要求1所述的莱茵衣藻人工叶绿体基因组合成组装与功能测试的方法，其特征在于，所述莱茵衣藻人工叶绿体基因组重新设计时，分成44个初级片段，每个初级片段的两端有120bp的同源重组序列。
4.根据权利要求3所述的莱茵衣藻人工叶绿体基因组合成组装与功能测试的方法，其特征在于，所述初级片段全部通过化学方法合成。
5.根据权利要求1所述的莱茵衣藻人工叶绿体基因组合成组装与功能测试的方法，其特征在于，所述BAC载体骨架长度为11,060bp，插入位点于野生型莱茵衣藻叶绿体基因组的205,535bp处；所述链霉素抗性基因aadA长度为1,630bp，插入位点于野生型莱茵衣藻叶绿体基因组的173,174bp-173,175bp之间；所述链霉素抗性基因aadA长度为2,287bp，插入位点于野生型莱茵衣藻叶绿体基因组的71,064bp-71,065bp之间；3×HA-1标签位于atpI后面，插入位点于野生型莱茵衣藻叶绿体基因组的170,786bp-170,787bp之间；3×HA-2标签位于rps4后面，插入位点于野生型莱茵衣藻叶绿体基因组的33,292bp-33293bp之间。
6.根据权利要求1所述的莱茵衣藻人工叶绿体基因组合成组装与功能测试的方法，其特征在于，所述莱茵衣藻人工叶绿体基因组的合成组装包括如下步骤：
6.1将重新设计的莱茵衣藻人工叶绿体基因组的44个初级片段分别连接在pUC18载体上；
6.2将BAC载体片段、筛选标记片段、7-35桥接片段、seg44片段、片段seg35-seg43、seg1片段以及片段seg3-seg7共转化酵母BY4741，利用筛选培养基SC-URA筛选后得到包含中间质粒1的酵母菌株-1；
6.3将pRS415载体片段和片段seg7-seg21共转化酵母BY4742，利用筛选培养基SC-LEU进行筛选，并将筛选得到的酵母菌株利用kanMX片段替换基因组上的Met基因进行Met敲除，利用SC-LEU+G418培养基进行筛选获得包含中间质粒2的酵母菌株-2；
6.4将pRS411载体片段和片段seg22-seg35共转化酵母BY4741，用筛选培养基SC-MET筛选得到包含中间质粒3的酵母菌株-3；
6.5将所述酵母菌株-2和酵母菌株-3进行杂交，通过SC-LEU-MET平板进行筛选；随后进行产孢和分孢，利用SC-LEU、SC-MET平板进行筛选；再与SZU-JDY19酵母、SZU-JDY20酵母杂交；之后与含有中间质粒1的酵母菌株-1进行杂交，利用SC-LEU-MET-URA平板进行筛选；对筛选得到的菌株进行SZU-ZLP012质粒的转化，并用SC-URA-LEU-MET-HIS平板进行筛选；
6.6利用半乳糖诱导SZU-ZLP012质粒中的I-SceI基因表达，I-SceI位点切割使3个中间质粒线性化，之后通过酵母细胞中的同源重组，获得含有完整莱茵衣藻人工叶绿体基因组的酵母菌株。
7.根据权利要求6所述的莱茵衣藻人工叶绿体基因组合成组装与功能测试的方法，其特征在于，所述中间质粒1的核苷酸序列全长为92,477bp，包含了野生型莱茵衣藻叶绿体基因组的1-33,292bp和159,554bp-205,535bp的核苷酸序列，所述野生型莱茵衣藻叶绿体基因组的205,535bp处添加了BAC骨架序列；所述中间质粒2的核苷酸序列全长81,426bp，包含了野生型莱茵衣藻叶绿体基因组的28,513bp-102,566bp的核苷酸序列，基因组核苷酸序列首尾接口处连接了pRS406载体序列；所述中间质粒3的核苷酸序列全长72,377bp，包含了野生型叶绿体基因组的97,668bp-164,450bp的核苷酸序列，基因组核苷酸序列首尾接口处连接了pRS411载体序列。
8.根据权利要求1所述的莱茵衣藻人工叶绿体基因组合成组装与功能测试的方法，其特征在于，所述莱茵衣藻人工叶绿体基因组的功能测试包括如下步骤：
8.1将所述莱茵衣藻人工叶绿体基因组通过基因枪法转入莱茵衣藻CC5168的叶绿体，通过链霉素筛选、PCR和Southern Blot筛选获得阳性转化子；
8.2将所述阳性转化子利用梯度链霉素抗性浓度进行同质化筛选；
8.3对所述阳性转化子进行Western Blot实验，验证蛋白表达；对所述阳性转化子的生长曲线和修复突变株的光合作用进行检测。
9.根据权利要求8所述的莱茵衣藻人工叶绿体基因组合成组装与功能测试的方法，其特征在于，对所述阳性转化子进行鉴定以及阳性筛选的检测片段分别为aphVIII、BAC-seg44以及BAC-seg1。
10.根据权利要求8所述的莱茵衣藻人工叶绿体基因组合成组装与功能测试的方法，其特征在于，对所述阳性转化子进行Southern Blot验证用的探针采用aph VIII-F1/R1以及psaA-F/R引物扩增得到；其中，所述aph VIII-F1/R1核苷酸序列如SEQ ID NO.1和SEQ IDNO.2所示，所述psaA-F/R核苷酸序列如SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4所示。
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