CN100494385C - 一种转基因莱茵衣藻生物反应器的构建方法 - Google Patents
一种转基因莱茵衣藻生物反应器的构建方法 Download PDFInfo
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Abstract
本发明涉及一种转基因莱茵衣藻生物反应器的构建方法。利用莱茵衣藻作为转基因受体生物，通过构建含有筛选标记基因表达框架的外源基因高效表达载体构建，利用“珠磨法”、基因抢法、或电击穿孔等方法，将来源于不同生物体(包括动物、植物和微生物等)的目的基因导入莱茵衣藻体内，并根据需要整合到细胞核基因组、或叶绿体基因组中，采用一系列基因表达调控技术，构建转基因莱茵衣藻高效生物反应器。该方法构建的转基因菜茵衣藻生物反应器生长速度快、繁殖周期短、产物易分离、光合自养和可集约化大规模培养等特性，实现快速、廉价生产各种药用蛋白质、工业原料、可食性疫苗、具有生物学活性的次生代谢产物等。
Description
技术领域
本发明属于生物技术领域，涉及一种转基因生物反应器的构建方法，具体是利用莱茵衣藻构建转基因藻类生物反应器，可实现快速、廉价生产各种药用蛋白质、可食性疫苗、具有生物学活性的次生代谢产物、工业原料等。
背景技术
DNA重组技术是二十世纪七十年代在大肠杆菌表达系统中发展起来的。随着现代分子生物学技术的不断发展完善，外源基因的高效表达已经成为基因工程制药、基因诊断与治疗、现代农业和工业原材料生产的重要生物技术手段。研究开发出适应不同技术需求的各种外源基因高效表达系统已经成为现代生物技术的热点问题。
目前比较成熟的几个外源基因表达系统虽然都有其各自的优势，但仍然存在各种不足：大肠杆菌表达系统虽然表达量大，但产物大多以包涵体形式存在，且不能进行糖基化修饰；酵母表达系统解决了真核基因的产物糖基化问题，但也存在甲醛诱导物的毒性、产物乙醇累积及发酵底物的高成本等问题；高等植物表达系统能利用植物光合作用产物作为生产外源蛋白的底物，但其生产周期长，占地空间大。于是人们想到利用藻类作为外源基因表达系统来表达外源蛋白。因为藻类既能象高等植物一样进行光合作用，解决发酵底物问题，又能象细菌一样进行集约化生产。目前比较成熟的藻类外源基因表达系统是蓝藻表达系统，但蓝藻属于原核生物，同细菌一样不能进行真核基因表达产物的糖基化修饰，同时蓝藻细胞壁较厚使表达产物难于分离，胞外多糖丰富，纯培养较困难等。人们开始利用单细胞真核藻类来作为外源基因表达系统，例如中国专利“转基因小球藻的高效生物反应器”(专利号：ZL97112189.3)，以及中国专利“转基因盐藻生物反应器”(专利号：ZL00131217.0)。这些真核藻类表达系统实现了真核基因表达产物的糖基化修饰，但仍存在以下需改进之处：(1)表达系统不稳定，表达水平达不到商业化应用的需求；(2)藻类遗传背景不够清楚，达不到外源基因定点整合的要求；(3)藻类细胞内无足够表达产物储藏场所，高表达会严重影响藻类生长。
莱茵衣藻(Chlamydomonas reinhardtii)属于绿藻门团藻目衣藻科，是一种单细胞真核鞭毛藻类，是研究多种生命活动(如光合作用、鞭毛组装、趋光性和生理节律等)的模式生物，与酵母细胞有许多共同的特征，素有“光合酵母”之称。莱茵衣藻的细胞呈卵形，有细胞壁、细胞质和细胞核；细胞质里有一个大型杯状叶绿体，占整个细胞体积的40-60％。细胞前部偏在一侧的地方有一个红色的眼点，眼点对光线的强弱很敏感。莱茵衣藻细胞的前端有两根鞭毛，能够摆动，因此可以在水中自由游动。莱茵衣藻的全身都能够吸收溶解在水中的二氧化碳和无机盐，并且能够依靠眼点的感光和鞭毛的摆动，游到光照和其他条件都适宜的地方，进行光合作用，维持自己的生活。它具有无性生殖、有性生殖两种方式，有光能自养、异养及光能异养3种不同的营养生长方式，其生长速度快且光合效率高。
在20世纪80年代中后期，关于衣藻同源基因的转化、表达和调控有大量报道，但外源基因表达没有成功。直到90年代初期才出现关于莱茵衣藻外源基因遗传转化与表达的报道(Hall et al，Expression of a foreign gene in Chlamydomonas reinhardtii，Gene，124(1993)75-81)，多为利用报告基因和筛选基因进行转基因研究，表达量很低且不稳定。在90年代中后期出现了外源筛选基因在衣藻中的稳定表达(Stevens et al，Thebacterial phleomycin resistance gene ble as a dominant selectable marker inChlamydomonas.Mol Gen Genet 251(1996)23-30)，这为外源基因在莱茵衣藻中的表达提供了基础。国内也出现了利用莱茵衣藻表达外源基因的报道(zhang et al，NS_3-CChimeric Antigen Gene of Hepatitis C Virus was Introduced Site-specifically into ChloroplastGenome of Chlamydomonas reinhardtii，Hereditas，1999，21(6)1-6；wang et al，Expression and molecular analysis of phbB gene in Chlamydomonas reinhardtii，Chinese Science Bulletin，2004，49(16)1713-1717)，但表达水平有待提高，没有建立完整的外源基因高效表达系统。本发明建立了一套利用转基因莱茵衣藻进行目的产物生产的转基因生物反应器技术体系。
发明内容
本发明的目的在于提供一种转基因莱茵衣藻生物反应器的构建方法，包括转基因受体莱茵衣藻品系、含有筛选标记表达框架的外源基因高效表达载体构建、外源基因的遗传转化、转基因藻的筛选与鉴定和外源基因表达调控方法。通过该方法构建转基因莱茵衣藻高效生物反应器，实现快速、廉价生产各种药用蛋白质、工业原料、可食性疫苗、具有生物学活性的次生代谢产物等。
本发明方法包括以下几个方面的内容：
1.转基因受体藻的筛选与培养
选择转基因受体藻可选用细胞壁缺陷的莱茵衣藻CC-849作为受体藻，但本发明不限于该品系。采用Tris-acetate-phosphate(TAP)培养基，在通气和光照～90μE/m2.s的条件下培养。转基因藻培养依生产规模采用不同规模的光合生物培养系统，大规模生产可采用跑道式藻类培养系统。
2.外源基因莱茵衣藻表达载体的构建
外源基因高效表达载体包括莱茵衣藻强启动子(RBCS2启动子，atpA启动子，HSP70A-RBCS2合成启动子等)、目的基因(MT-like等)、终止子(RBCS2终止子，rbcL3′终止子等)、特定的筛选标记基因(ble，aadA等)。
(1)外源基因莱茵衣藻细胞核表达载体的构建：首先将载体pSP105上克隆有RBCS2的5′启动子序列和它的3′终止子序列，中间携带有PmaCI、BamHI、XbaI和SalI限制性内切酶位点，利用相应的酶切位点插入外源基因构成RBCS2的5′启动子、目的基因和RBCS2终止子的表达盒，通过EcoRV酶切位点将该表达盒插入pSP124载体上(pSP124上含有RBCS2启动子-ble-RBCS2终止子组成的ble基因的表达盒，编码13.5KD的腐草霉素结合蛋白)，构建含RBCS启动子的外源基因莱茵衣藻细胞核表达载体。
载体pCB740上有Hsp70A-RBCS2合成启动子，以pCB740质粒为模板，设计上下引物：
上游引物：PrHp1(5’CGCAAGCTTCAGGAATTCGCTGAGGCTTGACATGAT3′)
HindIII
下游引物：PrHD2(5′CGACTGCAGCGTCACGTGGCTAGCTCTCTTGTAAA3′)
PmaC I
通过PCR从质粒pCB740上扩增出含HSP70A-RBCS2启动子片段，经电泳分离后从凝胶中回收，采用T-A克隆策略将其克隆到的pMD18-T载体上，得到的转化子命名为HRT，通过PmaC I和HindIII从重组质粒HRT上分离出HSP70A-RBCS2启动子片段，将pSP105用PmaC I和HindIII双酶切，经电泳分离后从凝胶中回收切除了RBCS2启动子/740bp的pSP105质粒片段/pSP105-1P，通过T4 DNA连接酶将HSP70A-RBCS2启动子连接到pSP105-1P，得到新的莱茵衣藻表达载体pH105，利用相应的酶切位点插入外源基因构成含HSP70A-RBCS2启动子、目的基因和RBCS2终止子的表达盒，通过EcoRV酶切位点将该表达盒插入pSP124载体上，构建含HSP70A-RBCS2启动子的外源基因莱茵衣藻细胞核表达载体。
(2)外源目的基因莱茵衣藻叶绿体表达载体的构建：首先是利用同源重组片段衣藻叶绿体的psbA基因外显子5和23S rRNA3′端序列将外源基因定点整合到受体细胞叶绿体基因组psbA基因外显子5和23S rRNA3′端序列之间，利用莱茵衣藻叶绿体rbcL基因的5′启动子、rbcL基因的3’终止子驱动外源基因在莱茵衣藻的表达，筛选标记为aadA基因(赋予藻细胞链霉素、壮观霉素抗性)。质粒p53rGFPct上携带有衣藻叶绿体的rbcL5′启动子和rbcL3′终止子序列，通过NdeI和XbaI可以切下GFPct基因，并插入外源目的基因，rbcL5′启动子和rbcL3′终止子序列可以在衣藻叶绿体中表达插入的外源基因，构成rbcL启动子-目的基因-rbcL终止子的外源基因表达盒。载体p322上携带有衣藻叶绿体psbA基因外显子5和23S rRNA的3′端的序列，外源基因表达盒插入叶绿体DNA的psbA基因外显子5和23S rRNA之间的位置构成p322-1；p423质粒上携带有筛选标记aadA基因的表达盒(atpA5′启动子-aadA-rbcL3′终止子)，通过EcoRl和Sacl双酶切p423，获得1.9kb的aadA基因表达盒，连入p322-1的EcoRI和Sacl位点，得到外源基因莱茵衣藻叶绿体表达载体。
3.本发明所述的将外源目的基因导入莱茵衣藻的遗传转化方法包括：
(1)珠磨法：莱茵衣藻CC-849在TAP培养液中培养至对数期，细胞数约为1-2×106cells/mL，室温(20-25℃)离心收集，用TAP培养液重悬，调整细胞浓度至2×108cells/mL；吸取300μL悬浮液到5mL的两个试管里(内含已灭菌的石英砂)，将目的DNA酶切成线状，取1μg-2μg加入试管，CC-849/石英砂/外源DNA混合物快速振荡15秒后；把混合液转移到25mL的带螺旋帽的离心管中，加入10mL灭菌TAP培养液，在22℃温度下60rpm振荡摇床过夜培养(光照条件为90μE/m2/s)；室温(20-25℃)离心收集细胞，去上清，用0.5mL TAP重悬，加入3.5mL 0.5％ TAP培养基，混匀后倒在TAP平板上(含10μg/mL的Zeomycin)，22℃光照培养箱里培养7-15天，平板上长出绿色的单克隆藻落。
(2)基因枪法：莱茵衣藻在TAP培养液中培养至对数期，细胞数约为1-2×106细胞/mL，室温(20-25℃)离心收集，用TAP液体培养基重悬，调整细胞浓度至2×108细胞/mL。吸取300μL悬浮液涂布于TAP固体平板培养基，22℃光照培养箱(光照条件为90μE/m2/s)中培养1-2天以形成细胞层。在无菌条件下用基因枪(Bio-Rad)轰击。具体步骤如下：取50μL金粉悬浮液(60μg/mL)，加入2μg含有外源基因的环状质粒和50μL2M CaCl2和20μL 0.1M亚精胺，通过涡轮振荡器振荡1-3分钟以混合，8,000rpm离心10秒，弃上清，用无水乙醇清洗，振荡，再8,000rpm离心10秒，弃上清，共5次，最后用60μL无水乙醇重悬沉淀。每次轰击取10μL，轰击参数如下：真空度25inches·Hg，轰击距离9cm，每皿轰击3次，22℃光照培养箱恢复培养12小时，然后转移到筛选平板上继续培养(22℃，90μE/m2/s)1-2周，至绿色单克隆长出。
(3)电激穿孔法：莱茵衣藻CC-849在TAP培养液中培养至对数期，细胞数约为1-2×106细胞/mL，室温(20-25℃)离心收集，用电激缓冲液(10mM Tris-HCl，pH 7.5，10mMCaCl2，0.4M甘露醇，0.4M山梨醇)重悬，调整细胞浓度至2×108细胞/mL。加入终浓度为4μg/mL的含外源基因的质粒及25μg/mL的鲑精DNA，混匀后置冰上，吸取0.4mL于电转杯中待用。电转仪(Eppendorf)电激时电压为1KV/cm，持续时间2秒，然后冰上放置10分钟，补充10mL TAP液体培养基22℃光照培养箱恢复培养12-18小时，然后转移到筛选平板上继续培养(22℃，90μE/m2/s)1-2周，至绿色单克隆长出。
4.本发明所述的外源目的基因导入莱茵衣藻的整合位置为细胞核基因组或者叶绿体基因组。通过构建整合到细胞核基因组的表达载体或整合到叶绿体基因组的表达载体来实现整合位点的控制。
5.本发明所述的转基因藻筛选与鉴定包括(1)用含有筛选抗生素平板的筛选单克隆藻落，通过连续继代培养15-20代后，进行进一步的分子检测。(2)分子鉴定包括PCR-Southern blot检测、RT-PCR-Southern blot检测和Westernblot检测。
6.本发明所述的目的基因表达调控技术包括强启动子的筛选、外源基因改造等。
7.利用本发明所述的方法，建立了构建一种生产类金属硫蛋白的转MT-l ike基因莱茵衣藻生物反应器的方法。
本发明方法构件的转基因莱茵衣藻生物反应器，相比于现有的转基因生物反应器，具有以下优点：(1)基因组序列已测序完成(见Chlamydomonas Center，www.chlamy.org)，遗传背景清楚，便于外源基因的定点整合；(2)细胞内有一个大型杯状叶绿体，占整个细胞体积的40-60％，同质化容易；(3)具有无性生殖、有性生殖两种方式，克服了植物组织培养困难，可在短时间内获得大量转基因后代；(4)有光能自养、异养及光能异养3种不同的营养生长方式；(5)易于同步化培养；(6)生物安全性高，转化的外源基因不会象高等植物那样通过花粉传播给后代，避免了外源基因的环境扩散；(7)其生长速度快且光合效率高。
与细菌、酵母等需要发酵底物的转基因生物反应器相比较，本发明构建的一种转基因莱茵衣藻生物反应器能利用光能将环境中的二氧化碳和水合成目标产物生产的底物，大大降低了生产成本。
与高等植物转基因生物反应器相比较，本发明构建的一种转基因莱茵衣藻生物反应器生长速率快，能象细菌那样进行集约化大规模培养，克服了高等植物生长周期长、占地面积大的问题。
与螺旋藻等原核转基因生物反应器相比较，本发明构建的转基因莱茵衣藻生物反应器是单细胞真核藻类，能表达来自高等动物和植物的真核基因，克服了转基因蓝藻表达真核基因时的糖基化修饰问题。
与小球藻转基因生物反应器相比较，本发明构建的转基因莱茵衣藻生物反应器的细胞较大，采用细胞壁缺陷的受体品系，遗传转化操作方便，且细胞壁易破，表达产物易于分离。
与转基因盐藻生物反应器相比较，本发明构建的转基因莱茵衣藻生物反应器细胞生长快，培养方便，不必在高盐的极端环境中生长。
正因为具有以上的优点，本发明所述的转基因莱茵衣藻生物反应器是目前很好的真核生物转基因生物反应系统，具有非常广阔的应用前景，例如可用于名贵医药、可食性疫苗、保健食品等的生产。
附图说明
图1是pSP105结构示意图，该载体包含包含5′RBCS2启动子(780bp)和3′RBCS2终止子，中间有PmaCI、SalI、BamHI和XbaI等位点。
图2是pH105载体的构建过程，以来自pCB740质粒的Hsp70A-RBCS2合成启动子取代pSP105上的5′RBCS2启动子，得到pH105载体。
图3是MT-like基因衣藻叶绿体表达载体p322A-MT构建图，含有aadA表达盒(atpA5′启动子-aadA-rbcL3′终止子)和MT-like基因表达盒【rbcL5′启动子-(MT-like基因)-rbcL3′终止子】，同源重组片段衣藻叶绿体DNA的psbA基因外显子5和23S rRNA的3′端的序列。
图4是MT-like基因衣藻核表达载体pSP105MT-124构建图，含有ble基因表达盒(RBCS2启动子-ble-RBCS2终止子)和MT-like基因表达盒【RBCS2启动子-(MT-like基因)-RBCS2终止子】。
图5是MT-like-M基因衣藻核表达载体pH105MT-124构建图，含有ble基因表达盒(RBCS2启动子-ble-RBCS2终止子)和MT-like基因表达盒【RBCS2启动子-(MT-like-M基因)-RBCS2终止子】。
图6是MT-like基因衣藻叶绿体表达载体p322A-MT-M构建图，含有aadA表达盒【atpA5′启动子-aadA-rbcL3′终止子】和MT-like-M基因表达盒【rbcL5′启动子-(MT-like-M基因)-rbcL3′终止子】，同源重组片段衣藻叶绿体DNA的psbA基因外显子5和23SrRNA的3′端的序列。
具体实施方式
实施例1：莱茵衣藻品系的选择与培养
本实施例选用莱茵衣藻Chlamydomonas reinhardtii cc-849(购自美国Duke大学衣藻遗传中心，Duke University，Durham，NC27708USA)作为转基因操作的受体，该藻株为细胞壁缺陷型的莱茵衣藻品系，但本专利涉及所有用于转基因操作的其它莱茵衣藻品系。
莱茵衣藻培养时使用的培养基为TAP培养基，1L培养基的组份如下：Tris 2.42g，4倍Beijerinck salts(每升含16g NH4Cl，2g CaCl2·2H2O，4gMgSO4·7H2O)25mL，1M(K)PO4(pH7.0)缓冲液1mL，微量元素混合液(每升含11.4gH3BO3，22g ZnS O4·7H2O，5.06g MnC l2·4H2O，4.99g FeSO4·7H2O，1.61g CoCl2·6H2O 1.57g CuS O4·5H2O 1.1g(NH4)6Mo7O24·4H2O，50g Na2EDTA)1mL，冰醋酸1mL，H2O 975mL，pH 7.0。
莱茵衣藻培养条件如下：温度22-25℃，光照90μE/m2/s的条件下连续光照培养，通气量可调整(0.5L/min左右)，藻细胞浓度达到1×108-109细胞/mL时离心收集。
实施例2：外源目的基因莱茵衣藻高效表达载体的构建
1.外源目的基因莱茵衣藻核表达载体的构建
载体pSP105(Stevens，D.R.，等The bacterial phleomycin resistance genebleas a dominantselectable marker in Chlamydomonas.1996，Mol.Gen.Genet.251，23-30.)上克隆有RBCS2的5′启动子序列和它的3′终止子序列，中间携带有PmaCI、BamHI、XbaI和SalI等限制性内切酶位点，可以插入外源基因并在衣藻核基因组中表达外源基因(见图1)。载体pCB740(Schroda M.，等Sequence elements within an HSP70 promoter counteract transcriptionaltransgene silencing in Chlamydomona.Plant J，2002，31(4)：445-455)上克隆有Hsp70A-RBCS2合成启动子。载体pSP124(Victoria Lumbreras，等Efficientforeign gene expression inChlamydomonas reinhardtii mediated by an endogenous intron.Plant J，1998，14(4)：441-447)上含有ble基因的表达盒(RBCS2启动子-ble-RBCS2终止子)，编码13.5KD的腐草霉素结合蛋白，它产生的抗体使衣藻具有腐草霉素和Zeomycin抗性，作为衣藻转化时的筛选标记。
以pCB740质粒为模板，设计两条引物：
上游引物：PrHp1(5′CGCAAGCTTCAGGAATTCGCTGAGGCTTGACATGAT3′)
HindIII
下游引物：PrHp2(5′CGACTGCAGCGTCACGTGGCTAGCTCTCTTGTAAA3′)
PmaC I
通过PCR(程序是94℃变性3min；94℃ 1min，60℃ 1min，72℃ 1min，30个循环；72℃延伸10min)从质粒pCB740上扩增出含HSP70A-RBCS2启动子片段(约498bp)，经电泳分离后从凝胶中回收，采用T-A克隆策略将其克隆到的pMD18-T载体(大连宝生物工程有限公司，辽宁省大连经济开发区东北二街19号)上，得到的转化子命名为HRT，通过PmaC I和HindIII(大连宝生物工程有限公司)从重组质粒HRT上分离出HSP70A-RBCS2启动子片段(约498bp)。将pSP105用PmaC I和HindIII双酶切，经电泳分离后从凝胶中回收切除了RBCS2启动子(740bp)的pSP105质粒片段(pSP105-1P)，通过T4DNA连接酶(大连宝生物工程有限公司)将HSP70A-RBCS2启动子连接到pSP105-1P，得到新的莱茵衣藻表达载体，命名为pH105(见图2)。
2.外源目的基因莱茵衣藻叶绿体表达载体的构建
本实施例选择来自紫羊茅植物(Festuca rubracv.Merlin)的类金属硫蛋白(Metallothionein-like，MT-like)基因莱茵衣藻叶绿体表达载体为例。
利用同源重组片段衣藻叶绿体的psbA基因外显子5和23S rRNA3′端序列将外源基因定点整合到受体细胞叶绿体基因组psbA基因外显子5和23S rRNA3′端序列之间。利用莱茵衣藻叶绿体rbcL基因的5′启动子、rbcL基因的3’终止子驱动外源基因在莱茵衣藻的表达。筛选标记为aadA基因，赋予藻细胞链霉素、壮观霉素抗性。质粒p53rGFPct(Franklin，S.E.，等Development of a GFP reporter gene for Chlamydomonas reinhardtii chloroplast.Plant J 2002，30：733-744)上携带有衣藻叶绿体的rbcL5′启动子和rbcL3′终止子序列，通过NdeI和XbaI可以切下GFPct基因，并插入外源目的基因，rbcL5′启动子和rbcL3′终止子序列可以在衣藻叶绿体中表达插入的外源基因。载体p322(购自美国Duke大学衣藻遗传中心，DukeUniversity，Durham，NC 27708 USA)上携带有衣藻叶绿体psbA基因外显子5和23S rRNA的3′端的序列，方便外源基因表达盒插入叶绿体DNA的psbA基因外显子5和23S rRNA之间的位置；p423(购自美国Duke大学衣藻遗传中心，Duke University，Durham，NC 27708USA)质粒上携带有aadA基因的表达盒(atpA5′启动子-aadA-rbcL3′终止子)，aadA基因可使藻细胞具有壮观霉素和链霉素抗性，成为莱茵衣藻叶绿体遗传转化的筛选标记。
根据来自紫羊茅植物的类金属硫蛋白基因序列(Mi Ma，Wing-Keung Tsang，Pui-SangLau and Yuk-Shan Wong.1997.Cloning and Sequencing of the Metallothionein-like cDNA(Accession No.U96646)From Festuca rubra cv.Merlin(PGR97-098).Plant Physiol.114：1136)，由上海生工生物技术服务有限公司(上海市漕宝路500号)人工合成带有Nde I和XbaI酶切位点的类金属硫蛋白基因片段，具体序列如下：
1 cgccatatgc agatgtcttg cagctgcgga tcaagctgtg gctgcggctc aaactgcaag
Nde I
61 tgcgggaaga tgtaccctga cctggacgag caggccagca ccaccaccca ggccgtggtc
121 gtcgtcggcg tggctcatga gaacaaggct ggacagtttg agatggcctc cggcgagggc
181 tgcaaatgcg gcgccaactg caagtgtgac ccctgcaact gctaacgtg tctagact
XbaI
通过Eco RI和Sacl双酶切p423，获得1.9kb的aadA基因表达盒(atpA5′启动子-aadA-rbcL3′终止子)，连入p322的EcoRI和Sacl位点，得到p322A。将MT-like基因插入p53rGFPct的Nde I和XbaI位点，得到MT-like基因表达盒(rbcL5′启动子-MT-like基因-rbcL 3′终止子)，获得p53MT质粒。通过BamHI从p53MT质粒切下MT-llike基因表达盒，插入p322A的BamHI位点，得到类金属硫蛋白(Metallothionein-like，MT-like)基因莱茵衣藻叶绿体表达载体p322A-MT(见图3)。
实施例3：转基因莱茵衣藻生物反应器的构建(整合到莱茵衣藻核基因组)
本实施例选择来自紫羊茅植物(Festuca rubra cv.Merlin)的类金属硫蛋白(Metallothionein-like，MT-like)基因来构建生产类金属硫蛋白的转MT-l ike基因莱茵衣藻生物反应器。
MT-like基因衣藻核表达载体的构建
根据来自紫羊茅植物的类金属硫蛋白基因序列(Mi Ma，Wing-Keung Tsang，Pui-SangLau and Yuk-Shan Wong.1997.Cloning and Sequencing of the Metallothionein-like cDNA(Accession No.U96646)From Festuca rubra cv.Merlin(PGR97-098).Plant Physiol.114：1136)，由上海生工生物技术服务有限公司(上海市漕宝路500号)人工合成带有PmaC I和SalI酶切位点的类金属硫蛋白基因片段，具体序列如下：
1cgccacgtgc agatgtcttg cagctgcgga tcaagctgtg gctgcggctc aaactgcaag
PmaC I
61 tgcgggaaga tgtaccctga cctggacgag caggccagca ccaccaccca ggccgtggtc
121 gtcgtcggcg tggctcatga gaacaaggct ggacagtttg agatggcctc cggcgagggc
181 tgcaaatgcg gcgccaactg caagtgtgac ccctgcaact gctaacgtg gtcgacct
SalI
将该基因片段用PmaC I和SalI双酶切后，连接到pSP105和pH105的多克隆位点，分别获得中间载体pSP 105MT和pH105MT，用EcoRI分别酶切pSP105MT和pH105MT后，分别得到包含RBCS2启动子、MT-like基因、RBCS2终止子的表达框架(pSP105MT-1P)和包含HSP70A-RBCS2启动子、MT-like基因、RBCS2终止子的表达框架(pH105MT-1P)，将pSP105MT-1P和pH105MT-1P插入到带有选择标记基因ble的pSP124S载体(VictoriaLumbreras，David R.Stevens and Saul Purton，1998.Efficient foreign gene expression inChlamydomonas reinhardtii mediated by an endogenous intron)的EcoRI位点，构成可以进行莱茵衣藻遗传转化的转化载体pSP105MT-124(见图4)和pH105MT-124(见图5)。
莱茵衣藻遗传转化
本实施例以珠磨法转化莱茵衣藻CC-849，具体步骤如下：
(1)莱茵衣藻CC-849在TAP培养液中培养至对数期，细胞数约为1-2×106cells/mL，室温离心收集，用TAP培养液重悬，调整细胞浓度至2×108cells/mL。
(2)吸取300μL悬浮液到5mL的两个试管里(内含已灭菌的石英砂)，将目的DNA(pSP105MT-124或pH105MT-124)酶切成线状，取1μg-2μg加入试管，CC-849/石英砂/外源DNA混合物快速振荡15秒。
(3)把混合液转移到25mL的带螺旋帽的离心管中，加入10mL灭菌TAP培养液，在22℃温度下60rpm振荡摇床过夜培养(光照条件为90μE/m2/s)。
(4)室温离心收集细胞，去上清，用0.5mL TAP重悬，加入3.5mL 0.5％ TAP培养基，混匀后倒在TAP平板上(含10μg/mL的Zeomycin)，22℃光照培养箱里培养7-15天，平板上长出绿色的单克隆藻落。
转基因莱茵衣藻的筛选与鉴定
上述筛选平板培养基中含有10μg/mL的Zeomycin，如果藻细胞能在筛选平板上长出单克隆藻落，说明转化载体上的标记基因b le已经整合到基因组中。要确定该藻落为转目的基因衣藻，首先通过连续继代培养15-20代后，进行进一步的分子检测。具体方法如下(以转MT-like基因莱茵衣藻为例)：
(1)以转基因衣藻的总DNA为模板，按MT-like基因序列设计一对引物，通过PCR扩增出MT-like基因片段，以地高辛标记的完整的MT-like基因为探针，进行PCR-Southern blot检测，结果显示扩增片段可与探针杂交，转基因衣藻出现和阳性对照一致的杂交印迹反应，而对照组没有印迹。这表明含MT-like基因已经整合到莱茵衣藻的基因组中。
(2)提取转基因衣藻总RNA，以反转录合成的cDNA第一链为模板，按MT-like基因序列设计一对引物，通过RT-PCR扩增出MT-like基因片段，以地高辛标记的完整的MT-like基因为探针，进行RT-PCR-Southern blot检测，若转基因衣藻出现和阳性对照一致的杂交印迹反应，而对照组没有印迹，表明整合进衣藻基因组中的MT-like基因在衣藻细胞中具有转录活性，可在mRNA水平进行有效转录。
(3)提取转基因藻的总蛋白，用MT-like蛋白作标准样品，通过HPLC分析比较转基因藻；同时，转基因藻的总蛋白与目的产物单克隆抗体进行Western blot分析，在转基因藻中检测到MT-like蛋白，而对照样品则不能检测到该蛋白。说明导入到衣藻中的MT-like已经表达，并翻译出目的产物。
通过上面的鉴定，确认转基因莱茵衣藻生物反应器已经构建完成，利用RBCS2启动子获得转基因藻Tr-RBCS2；利用HSP70A-RBCS2启动子获得转基因藻Tr-HSP70A-RBCS2。目标产物的分离技术
目标产物的分离方法依产物的特性不同可以采取不同的分离途经。本发明专利涉及从转基因衣藻中分离目标产物的各类方法，包括有机萃取、相分配、柱层析、电泳和超滤等。本实施例采用亲和层析法，具体步骤如下(以转MT-like基因莱茵衣藻为例)：
转基因藻细胞经光诱导和热激处理，离心(4000g)收集，每克莱茵衣藻加入3mL pH8.0的Tris-HCl缓冲液和2mL乙醇-氯仿溶液(1:1)，80℃水浴变性10分钟，破碎采用超声波破碎法，超声波强度200kw/m2，处理时间为15分钟，离心(4000g)15分种，取上清液为初提液。
将初提液上样到用洗脱液(0.01M的NH4HCO3 pH 8.5)平衡过的Sephadex G-50层析柱，经洗脱液在4℃条件下洗脱，收集并脱盐处理获得纯化的MT-like蛋白。
比较转基因藻Tr-RBCS2和转基因藻Tr-HSP70A-RBCS2的MT-like蛋白含量，转基因藻Tr-HSP70A-RBCS2的表达量高出20倍。
实施例4：转基因莱茵衣藻生物反应器的构建(整合到莱茵衣藻叶绿体DNA)
外源基因改造
本发明为了使外源基因在莱茵衣藻中高效表达，在不影响外源基因表达产物结构和功能特性的基础上对外源基因进行适当的改造，改造方法包括在基因中插入具有增强子作用的衣藻内含子、将外源基因密码子换成衣藻优先密码子等。
本实施例中，使用衣藻优先密码子(见http://www.chlamy.org/的衣藻密码子表)对紫羊茅植物MT-like基因(下图第一行)进行改造，得到MT-like-M(下图第二行)，结果如下：
1 atgtcttgca gctgcggatc aagctgtggc tgcggctcaa actgcaagtg cgggaagatg
1 atg
tgca gctgc
agc
ggc tgcggc
a actgcaagtgcaagatg
61 taccctgacc tggacgagca ggccagcacc accacccagg ccgtggtcgt cgtcggcgtg
61 tac
gacc tggacgagca ggccagcacc accacccagg ccgtggtcgt cgtcggcgtg
121 gctcatgaga acaaggctgg acagtttgag atggcctccg gcgagggctg caaatgcggc
121
gaga acaaggct
cag
gag atggcctccg gcgagggctgc
tgcggc
181 gccaactgca agtgtgaccc ctgcaactgc taa
181gccaactgca ag
gaccc ctgcaactgc taa
MT-like基因表达载体的构建(叶绿体基因组表达系统)
按照MT-like基因序列和经过优先密码子改造后MT-like-M基因序列，由上海生工生物技术服务有限公司(上海市漕宝路500号)人工合成的类金属硫蛋白基因片段，其MT-like基因和MT-like-M基因叶绿体基因组表达系统的表达载体构建过程同实施例3，得到p322A-MT(见图3)和p322A-MT-M(见图6)。
莱茵衣藻遗传转化
(1)通过“基因枪法”对p322A-MT-M转化莱茵衣藻
莱茵衣藻CC-849在TAP培养液中培养至对数期，细胞数约为1-2×106细胞/mL，室温(20-25℃)离心收集，用TAP液体培养基重悬，调整细胞浓度至2×108细胞/mL。吸取300μL悬浮液涂布于TAP固体平板培养基，22℃光照培养箱(光照条件为90μE/m2/s)中培养1-2天以形成细胞层。在无菌条件下用基因枪(Bio-Rad)轰击。具体步骤如下：取50μL金粉悬浮液(60μg/mL)，加入2μg含有外源基因的环状质粒(p322A-MT-M)和50μL2M CaCl2和20μL 0.1M亚精胺，通过涡轮振荡器振荡1-3分钟以混合，8,000rpm离心10秒，弃上清，用无水乙醇清洗，振荡，再8，000rpm离心10秒，弃上清，共5次，最后用60μL无水乙醇重悬沉淀。每次轰击取10μL，轰击参数如下：真空度25inches·Hg，轰击距离9cm，每皿轰击3次，22℃光照培养箱恢复培养12小时，然后转移到筛选平板上继续培养(22℃，90μE/m2/s)1-2周，至绿色单克隆长出。
(2)通过“电激穿孔法”对p322A-MT转化莱茵衣藻
莱茵衣藻CC-849在TAP培养液中培养至对数期，细胞数约为1-2×106细胞/mL，室温(20-25℃)离心收集，用电激缓冲液(10mM Tris-HCl，pH 7.5，10mM CaCl2，0.4M甘露醇，0.4M山梨醇)重悬，调整细胞浓度至2×108细胞/mL。加入终浓度为4μg/mL的含外源基因的质粒(p322A-MT)及25μg/mL的鲑精DNA，混匀后置冰上，吸取0.4mL于电转杯中待用。电转仪(Eppendorf)电激时电压为1KV/cm，持续时间2秒，然后冰上放置10分钟，补充10mL TAP液体培养基22℃光照培养箱恢复培养12-18小时，然后转移到筛选平板上继续培养(22℃，90μE/m2/s)1-2周，至绿色单克隆长出。
转基因莱茵衣藻的筛选与鉴定
上述筛选平板培养基中含有100μg/mL的壮观霉素，如果藻细胞能在筛选平板上长出单克隆藻落，说明转化载体上的标记基因aadA已经整合到叶绿体基因组中。要确定该藻落为转目的基因衣藻，首先通过连续继代培养15-20代后，再进行分子检测。具体方法如下(以转MT-like基因莱茵衣藻为例)：
(1)以转基因衣藻的总DNA为模板，按MT-like基因序列设计一对引物，通过PCR扩增出MT-like基因片段，以地高辛标记的完整的MT-like基因为探针，进行PCR-Southern blot检测，结果显示扩增片段可与探针杂交，转基因衣藻出现和阳性对照一致的杂交印迹反应，而对照组没有印迹。这表明含MT-like基因已经整合到莱茵衣藻的基因组中。
(2)提取转基因衣藻总RNA，以反转录合成的cDNA第一链为模板，按MT-like基因序列设计一对引物，通过RT-PCR扩增出MT-like基因片段，以地高辛标记的完整的MT-like基因为探针，进行RT-PCR-Southern blot检测，若转基因衣藻出现和阳性对照一致的杂交印迹反应，而对照组没有印迹，表明整合进衣藻基因组中的MT-like基因在衣藻细胞中具有转录活性，可在mRNA水平进行有效转录。
(3)提取转基因藻的总蛋白，用MT-like蛋白作标准样品，通过HPLC分析比较转基因藻；同时，转基因藻的总蛋白与目的产物单克隆抗体进行Western blot分析，在转基因藻中检测到MT-like蛋白，而对照样品则不能检测到该蛋白。说明导入到衣藻中的MT-like已经表达，并翻译出目的产物。
通过上面的鉴定，确认转基因莱茵衣藻生物反应器(叶绿体基因组表达系统)已经构建完成，利用MT-like基因获得的转基因藻为Tr-MT-like；利用MT-like-M基因获得的转基因藻为Tr-MT-like-M。
目标产物的分离技术
目标产物的分离方法同实施例三，结果表明，在同样的诱导条件下，单位干重的转基因藻(Tr-MT-like-M)的表达量是转基因藻Tr-MT-like的12倍。
Claims (2)
1、一种转类金属硫蛋白MT-like基因莱茵衣藻生物反应器的构建方法，它包括下列步骤：
A、转基因受体藻的筛选与培养；
B、含筛选标记基因表达框架的外源基因莱茵衣藻表达载体构建；
C、外源基因的遗传转化；
D、外源基因表达调控，其包括外源基因的改造、强启动子的筛选、控制外源目的基因导入莱茵衣藻的融合位置为细胞核基因组或叶绿体基因组；
E、培养转MT-like基因的莱茵衣藻，并从中分离类金属硫蛋白；
所述的含筛选标记基因表达框架外源基因莱茵衣藻表达载体包括莱茵衣藻强启动子RBCS2启动子，HSP70A-RBCS2合成启动子、atpA启动子，目的基因MT-like、终止子RBCS2终止子，rbcL3′终止子、筛选标记基因ble，aadA，其构建过程包括：
(1)外源基因莱茵衣藻细胞核表达载体的构建：
A：首先将载体pSP105上克隆有RBCS2的5′启动子序列和它的3′终止子序列，中间携带有PmaCI、BamHI、XbaI和SalI限制性内切酶位点，利用相应的酶切位点插入外源基因构成RBCS2的5′启动子、目的基因和RBCS2终止子的表达盒，通过EcoRV酶切位点将该表达盒插入pSP124载体上，pSP124上含有ble基因的表达盒RBCS2启动子-ble-RBCS2终止子，编码13.5KD的腐草霉素结合蛋白，构建含RBCS2启动子的外源基因莱茵衣藻细胞核表达载体；
B：载体pCB740上克隆有Hsp70A-RBCS2合成启动子，以pCB740质粒为模板，设计上下引物：
上游引物：PrHp1/5′CGCAAGCTTCAGGAATTCGCTGAGGCTTGACATGAT 3′
HindIII
下游引物：PrHp2/5′CGACTGCAGCGTCACGTGGCTAGCTCTCTTGTAAA 3′
PmaC I
通过PCR从质粒pCB740上扩增出含HSP70A-RBCS2启动子片段，经电泳分离后从凝胶中回收，采用T-A克隆策略将其克隆到的pMD18-T载体上，得到的转化子命名为HRT，通过PmaC I和HindIII从重组质粒HRT上分离出HSP70A-RBCS2启动子片段，将pSP105用PmaC I和HindIII双酶切，经电泳分离后从凝胶中回收切除了RBCS2启动子740bp的pSP105质粒片段pSP105-1P，通过T4 DNA连接酶将HSP70A-RBCS2启动子连接到pSP105-1P，得到莱茵衣藻表达载体pH105，利用相应的酶切位点插入外源基因构成HSP70A-RBCS2启动子、目的基因和RBCS2终止子的表达盒，通过EcoRV酶切位点将该表达盒插入pSP124载体上，构建含HSP70A-RBCS2启动子的外源基因莱茵衣藻细胞核表达载体；
(2)外源目的基因莱茵衣藻叶绿体表达载体的构建：
首先是利用同源重组片段衣藻叶绿体的psbA基因外显子5和23S rRNA3′端序列将外源基因定点整合到受体细胞叶绿体基因组psbA基因外显子5和23S rRNA3′端序列之间，利用莱茵衣藻叶绿体rbcL基因的5′启动子、rbcL基因的3’终止子驱动外源基因在莱茵衣藻的表达，筛选标记为aadA基因，质粒p53rGFPct上携带有衣藻叶绿体的rbcL5′启动子和rbcL3′终止子序列，通过NdeI和XbaI可以切下GFPct基因，并插入外源目的基因，rbcL5′启动子和rbcL3′终止子序列可以在衣藻叶绿体中表达插入的外源基因，构成rbcL5′启动子-目的基因-rbcL3′终止子的外源基因表达盒，载体p322上携带有衣藻叶绿体psbA基因外显子5和23S rRNA的3′端的序列，外源基因表达盒插入叶绿体DNA的psbA基因外显子5和23S rRNA之间的位置构成p322-1；p423质粒上携带有筛选标记aadA基因的表达盒atpA5′启动子-aadA-rbcL3′终止子，通过EcoRI和Sacl双酶切p423，获得1.9kb的aadA基因表达盒，连入p322-1的EcoRI和Sacl位点，得到外源基因莱茵衣藻叶绿体表达载体。
2、根据权利要求1所述的一种转基因莱茵衣藻生物反应器的构建方法，其特征在于：外源目的基因导入莱茵衣藻的遗传转化方法包括：
(1)珠磨法：莱茵衣藻CC-849在TAP培养液中培养至对数期，细胞数约为1-2×106cells/mL，室温离心收集，用TAP培养液重悬，调整细胞浓度至2×108cells/mL；吸取300μL悬浮液到5mL的两个试管里，将目的DNA酶切成线状，取1μg-2μg加入试管，CC-849、石英砂、外源DNA混合物快速振荡15秒后，把混合液转移到25mL的带螺旋帽的离心管中，加入10mL灭菌TAP培养液，在22℃温度下60rpm振荡摇床过夜培养，光照条件为90μE/m2/s；室温离心收集细胞，去上清，用0.5mL TAP重悬，加入3.5mL 0.5％ TAP培养基，混匀后倒在TAP筛选平板上，22℃光照培养箱里培养7-15天，平板上长出绿色的单克隆藻落；
(2)基因枪法：莱茵衣藻在TAP培养液中培养至对数期，细胞数约为1-2×106细胞/mL，室温离心收集，用TAP液体培养基重悬，调整细胞浓度至2×108细胞/mL，吸取300μL悬浮液涂布于TAP固体平板培养基，22℃光照培养箱中培养1-2天以形成细胞层，光照条件为90μE/m2/s，在无菌条件下用基因枪Bio-Rad轰击，取50μL金粉悬浮液60μg/mL，加入2μg含有外源基因的环状质粒和50μL 2M CaCl2和20μL 0.1M亚精胺，通过涡轮振荡器振荡1-3分钟以混合，8,000rpm离心10秒，弃上清，用无水乙醇清洗，振荡，再8,000rpm离心10秒，弃上清，共5次，最后用60μL无水乙醇重悬沉淀，每次轰击取10μL，轰击参数如下，真空度25inches·Hg，轰击距离9cm，每皿轰击3次，22℃光照培养箱恢复培养12小时，然后转移到筛选平板上继续培养1-2周，温度为22℃，光照为90μE/m2/s，至绿色单克隆长出；
(3)电激穿孔法：莱茵衣藻CC-849在TAP培养液中培养至对数期，细胞数约为1-2×106细胞/mL，室温离心收集，用电激缓冲液10mM Tris-HCl，pH7.5，10mM CaCl2，0.4M甘露醇，0.4M山梨醇重悬，调整细胞浓度至2×108细胞/mL，加入终浓度为4μg/mL的含外源基因的质粒及25μg/mL的鲑精DNA，混匀后置冰上，吸取0.4mL于电转杯中待用，电转仪Eppendorf电激时电压为1KV/cm，持续时间2秒，然后冰上放置10分钟，补充10mL TAP液体培养基22℃光照培养箱恢复培养12-18小时，然后转移到筛选平板上继续培养1-2周，温度为22℃，光照为90μE/m2/s，至绿色单克隆长出。
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