CN115746144A - 抗tigit-pd1双特异性抗体及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种抗TIGIT‑PD1双特异性抗体及其应用，该双特异性抗体包括抗PD1的免疫球蛋白抗体lgG和抗TIGIT的单链抗体scFv，其中，所述的单链抗体scFv包括可变区VH和可变区VL，所述可变区VH中互补决定区CDR‑H1～CDR‑H3的氨基酸序列为SEQ IDNO.5‑7；所述可变区VL中互补决定区CDR‑L1～CDR‑L3的氨基酸序列为SEQ ID NO.8‑10。该双特异性抗体具有全新的双抗序列和双抗活性，从而具有更加优异的肿瘤治疗效果。

Description

抗TIGIT-PD1双特异性抗体及其应用

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种抗TIGIT-PD1双特异性抗体及其应用。

背景技术

TIGIT(T cell Ig and ITIM domain,也称为WUCAM，Vstm3，VSIG9)是脊髓灰质炎病毒受体(PVR)/Nectin家族的成员。它由细胞外免疫球蛋白可变区(IgV)结构域，1型跨膜结构域和具有经典免疫受体酪氨酸抑制基序(ITIM)和免疫球蛋白酪氨酸尾(ITT)基序的细胞内结构域组成。TIGIT在淋巴细胞中表达，是一种在肿瘤浸润淋巴细胞中高表达的共抑制受体，特别是在效应和调节性CD4+T细胞，滤泡辅助CD4+T细胞，效应CD8+T细胞和自然杀伤(NK)细胞中高表达。CD155(也叫PVR、Necl5或Tage4)是TIGIT的高亲和力配体。肿瘤表面高表达的CD155一旦与NK和T细胞表面的TIGIT结合，它们对肿瘤细胞的杀伤作用就会被抑制。TIGIT和PVR广泛表达在不同类型的实体瘤中，说明TIGIT-PVR信号通路可能是一种主要的肿瘤免疫逃逸机制，是继PD-1/PD-L1之后的新型免疫检查点。

人程序性细胞死亡受体-1(PD-1)是由288个氨基酸组成的I型膜蛋白，PD-L1是PD-1的配体，PD-1与PD-L1结合后可提供抑制性信号，诱导T细胞凋亡，抑制T细胞的活化和增殖。换言之，PD-1单抗能够帮助体内的免疫细胞(T细胞)识别并杀死肿瘤细胞，起到抗癌的作用。

双特异性抗体(bispecific monoclonal antibody,BsAb)是一种人工制作出来的可以同时结合两种不同抗原或抗原表位的特殊抗体。双特异性抗体的主要作用机制包括：介导免疫细胞杀伤、双靶点信号阻断和促进蛋白形成功能性复合体。这使得双特异性抗体相较于传统的单克隆抗体具有独特的优势。

本发明致力于阐明一种抗TIGIT-PD1双特异性抗体，其具有全新的双抗序列和双抗活性，具有更加优异的肿瘤治疗效果。

发明内容

有鉴于此，本发明有必要提供一种具有全新序列的能够与TIGIT和PD1特异性结合的双特异性抗体，并进一步提供了该双特异性抗体的应用。

为了实现上述目的，本发明采用以下技术方案：

本发明提供了一种抗TIGIT-PD1双特异性抗体，所述双特异性抗体包括抗PD1的免疫球蛋白抗体lgG和抗TIGIT的单链抗体scFv，其中，所述的单链抗体scFv包括可变区VH和可变区VL，可变区VH通过肽接头L1与可变区VL连接，每个单链抗体scFv的羧基端通过肽接头L2与免疫球蛋白抗体lgG重链的氨基端连接；

所述可变区VH包括互补决定区CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3，其中，CDR-H1的氨基酸序列为SEQ ID NO.5，CDR-H2的氨基酸序列为SEQ ID NO.6，CDR-H3的氨基酸序列为SEQ IDNO.7；

所述可变区VL包括互补决定区CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3，其中，CDR-L1的氨基酸序列为SEQ ID NO.8，CDR-L2的氨基酸序列为SEQ ID NO.9，CDR-L3的氨基酸序列为SEQ IDNO.10。

进一步方案，所述单链抗体scFv是鼠源抗体或人源化抗体；

优选地，所述单链抗体scFv是鼠源抗体，其中，所述单链抗体scFv的重链氨基酸序列为SEQ ID NO.1，其轻链氨基酸序列为SEQ ID NO.3。

优选地，所述单链抗体scFv是人源化抗体，其中，所述单链抗体scFv包含以下方案之一的氨基酸序列组合方式：SEQ ID NO.11和SEQ ID NO.13的组合(VH1/VL1)、SEQ IDNO.11和SEQ ID NO.14的组合(VH1/VL2)、SEQ ID NO.12和SEQ ID NO.13的组合(VH2/VL1)、SEQ ID NO.12和SEQ ID NO.14的组合(VH2/VL2)。

进一步方案，所述免疫球蛋白抗体lgG的恒定区来自人抗体；

进一步方案，所述免疫球蛋白抗体lgG的重链恒定区序列为人lgG1的重链恒定区，其轻链恒定区序列为人lgG1的轻链恒定区。

进一步方案，所述双特异性抗体的重链氨基酸序列为SEQ ID NO.15，其轻链氨基酸序列为SEQ ID NO.17。

本发明进一步提供了一种核苷酸分子，其编码如前所述的双特异性抗体。

本发明进一步提供了一种表达载体，其含有如前所述的核苷酸分子。

本发明进一步提供了一种宿主细胞，其含有如前所述的表达载体。

本发明进一步提供了一种药物组合物，其含有如前所述的双特异性抗体和任意一种以上药学上可接受的辅料。

本发明同时提供了如前所述的药物组合物在制备药物中的应用，所述药物用于预防和/或治疗肿瘤。

本发明的有益效果如下：

该抗TIGIT-PD1双特异性抗体具有全新的双抗序列，一方面，该双特异性抗体能够与高表达的TIGIT抗原的肿瘤细胞结合，抑制肿瘤增殖；另一方面，其能够阻断PD-1与PD-L1的信号通路，PD-L1在肿瘤细胞上表达，而T细胞上表达PD-1，由于PD-1与PD-L1结合能够抑制T细胞的增殖活化，通过阻断PD-1与PD-L1的信号通路，能够恢复T细胞的免疫杀伤功能。该双特异性抗体能够同时结合TIGIT和PD1抗原，阻断信号通路，激活T细胞，具有更优异的双抗活性，能够更好的抑制肿瘤细胞。

此外，该双特异性抗体由抗PD1抗体的lgG分子和抗TIGIT抗体的scFv形式的结构域组成，这样的双抗结构可以在保留lgG分子自身的亲和力的同时有效提高整个融合蛋白质的稳定性。并且基于lgG分子的双抗制备，能够有效减少因为分子构造过度变更带来的稳定和免疫源性上的不确定性，具有显著的优势。

附图说明

图1为实施例1中8A4杂交瘤抗体纯化结果；

图2为实施例1中8A4杂交瘤抗体与TIGIT-His抗原结合活性的测试结果；

图3为实施例1中8A4杂交瘤抗体与PVR-hFc配体竞争活性的测试结果；

图4为实施例1中H006-8A4人源化抗体纯化结果；

图5为实施例1中H006-8A4人源化抗体与TIGIT-His抗原结合活性的测试结果；

图6为实施例1中FACS检测H006-8A4人源化抗体293F-TIGIT细胞结合活性结果；

图7为实施例1中ELISA法检测H006-8A4人源化抗体与PVR-mFc的竞争活性结果；

图8为实施例1中FACS法检测H006-8A4人源化抗体与PVR-mFc的竞争活性结果；

图9为实施例1中H006-8A4系列人源化抗体热稳定性检测荧光信号；

图10为实施例1中H006-8A4人源化抗体诱导细胞上清中IFN-γ分泌情况；

图11为实施例2中8A4抗体在Hepa1-6细胞小鼠移植瘤模型中的药效；

图12为实施例4中抗TIGIT-PD1双特异性抗体的纯化结果；

图13为实施例5中ELISA测定PD1/TIGIT双抗与TIGIT-His及PD-1-His结合活性结果；

图14为实施例5中ELISA测定PD1/TIGIT双抗与PD-L1-mFc的竞争活性的测试结果。

具体实施方式

下面详细描述本发明的实施例，下面描述的实施例是示例性的，仅用于解释本发明，而不能理解为对本发明的限制。

除非另有定义，本文所使用的所有的技术和科学术语与属于本发明的技术领域的技术人员通常理解的含义相同。本文中在本发明的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施方式的目的，不是旨在于限制本发明。

本发明第一方面提供了一种抗TIGIT-PD1双特异性抗体，TIGIT-PD1双特异性抗体的理论基础为效应T细胞是杀伤肿瘤的主力军，主要由干细胞样记忆T细胞生成，而干细胞样记忆T细胞表达PD-1和TIGIT，并不表达其他负性调节子(如Tim-3)，这就使得TIGIT-PD1双特异性抗体能“激活”干细胞样记忆T细胞，产生源源不断的效应T细胞。

本文中双特异性抗体能够与TIGIT和PD-1特异结合，该双特异性抗体包括抗PD1的免疫球蛋白抗体lgG和抗TIGIT的单链抗体scFv，具体的说，两个相同的单链抗体scFv和免疫球蛋白抗体lgG连接。其中，每个所述的单链抗体scFv包括可变区VH和可变区VL，可变区VH通过肽结构L1与可变区VL连接，每个单链抗体scFv的羧基端通过肽接头L2与lgG重链的氨基酸连接。

本文中所述的“双特异性抗体”指的是具有两个不同的抗原结合位点，从而能够通过结合TIGIT和PD-1的双特异性抗体，其含有两个抗TIGIT的单链抗体scFv以及与之连接的抗PD1的免疫球蛋白抗体lgG，每个单链抗体scFv的C端(即羧基端)通过肽接头L2与免疫球蛋白抗体lgG的重链的N端连接，从而形成双特异性抗体的重链融合蛋白，其中，每个单链抗体scFv的可变区VH通过肽接头L1与其可变区VL连接。可以理解的是，本文中所述的肽接头L1、肽接头L2可以采用本领域中常见的连接片段，这样的连接片段可以为(GGGGS)n，其中n为正整数，具体可根据实际需要进行选择，优选地，n为2、3、4、5等。

本文中采用的这种lgG-scFv形式的双特异性抗体由抗PD1的lgG分子和抗TIGIT的scFv形式组成，这样的双抗结构可以在保留lgG分子自身的亲和力的同时有效提高整个融合蛋白质的稳定性。并且基于lgG分子的双抗制备，能够有效减少因为分子构造过度变更带来的稳定和免疫源性上的不确定性，具有显著的优势。

进一步方案，本领域所熟知的，抗体的结合区域一般均包括一条重链可变区和一条轻链可变区，每一个可变区均包括三个互补决定区CDR结构域。本文中将抗体的重链和轻链的CDR结构域分别称为CDR-H和CDR-L。

在本发明中，单链抗体scFv的可变区VH包括互补决定区CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3，其中，CDR-H1的氨基酸序列为SEQ ID NO.5，CDR-H2的氨基酸序列为SEQ ID NO.6，CDR-H3的氨基酸序列为SEQ ID NO.7；

单链抗体scFv的可变区VL包括互补决定区CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3，其中，CDR-L1的氨基酸序列为SEQ ID NO.8，CDR-L2的氨基酸序列为SEQ ID NO.9，CDR-L3的氨基酸序列为SEQ ID NO.10。

进一步方案，本文中所述的单链抗体scFv可以是鼠源抗体，也是可以是人源化抗体。

在本发明的其中一个典型的实施例中，所述单链抗体scFv是鼠源抗体，其中，所述单链抗体scFv的重链氨基酸序列为SEQ ID NO.1，编码该重链的核苷酸序列为SEQ IDNO.2；其轻链氨基酸序列为SEQ ID NO.3，编码该轻链的核苷酸序列为SEQ ID NO.4。

在本发明的另一个典型的实施例中，所述单链抗体scFv是人源化抗体，其中，所述单链抗体scFv包含以下方案之一的氨基酸序列组合方式：SEQ ID NO.11和SEQ ID NO.13的组合(VH1/VL1)、SEQ ID NO.11和SEQ ID NO.14的组合(VH1/VL2)、SEQ ID NO.12和SEQ IDNO.13的组合(VH2/VL1)、SEQ ID NO.12和SEQ ID NO.14的组合(VH2/VL2)。

进一步方案，所述免疫球蛋白抗体lgG的恒定区来自人抗体。

所述免疫球蛋白抗体lgG的重链恒定区序列为人lgG1或人lgG4的重链恒定区，其轻链恒定区序列为人lgG1或人lgG4的轻链恒定区；优选地，所述免疫球蛋白抗体lgG的重链恒定区序列为人lgG1的重链恒定区，其轻链恒定区序列为人lgG1的轻链恒定区。

在本发明的一个典型的实施例中，所述双特异性抗体的重链氨基酸序列为SEQ IDNO.15，其轻链氨基酸序列为SEQ ID NO.17。

本发明第二方面提供了一种核苷酸分子，其编码如本发明第一方面所述的双特异性抗体。可以理解的是，所述核苷酸分子的制备可以采用本领域中常规的制备方法，比如PCR方法或者人工序列合成等，这里不再具体阐述。

本发明第三方面提供了一种表达载体，其含有如本发明第二方面所述的核苷酸分子。所述的表达载体可以采用本领域中常规的载体种类，这里不再具体阐述，优选的，所述的表达载体为质粒。

本发明第四方面提供了一种宿主细胞，其含有如本发明第三方面所述的表达载体。可以理解的是，所述的宿主细胞可以采用本领域中的常规选择，只要能够满足使得本发明第三方面所述的表达载体稳定自行复制，同时携带的核苷酸分子能够被有效表达即可。具体可以是真核表达细胞或原核表达细胞，具体的宿主细胞及其转化方法等均为本领域中的常规手段，这不再具体阐述。

本发明第五方面提供了一种药物组合物，其含有如本发明第一方面所述的双特异性抗体和任意一种以上药学上可接受的辅料。其中，可以理解的是，该药物组合物中双特异性抗体以治疗有效量为基准，具体的说，这里的有效量指的是包含足以预防或治疗医学病症的症状或疾病的量。在用于特定患者或医学受试者以后，可以产生以下变化：待治疗的病症、患者/受试者的总体健康情况得到改善。有效量还可以是至避免显著副作用或毒性作用的最大剂量以下的剂量方案。所述的药学上可接受的辅料包括载体、赋形剂、稀释剂等，具体的种类可根据药物组合物的制剂种类进行调整，故这里不再具体阐述。

本发明第六方面提供了如本发明第五方面所述的药物组合物在制备药物中的应用，所述药物用于预防和/或治疗肿瘤。本文中所述的预防和/或治疗肿瘤，主要是具有预防和/或治疗肿瘤的效果，具体的包括伴随肿瘤相关症状发展的延迟和/或这些症状严重程度的降低，还包括已存在的肿瘤伴随症状的减轻并防止其他症状的出现，还包括减少或防止肿瘤的转移等。

本文中所述的药物所能够预防和/或治疗的肿瘤具体包括但不限于肝癌、胃癌、肺癌、结直肠癌等。

下面通过具体实施例对本发明进行说明，需要说明的是，下面的具体实施例仅仅是用于说明的目的，而不以任何方式限制本发明的范围，可以理解的是，以下实施例中不包括对传统方法的详细描述，这些传统方法对于本领域技术人员来说是中所周知的，并且在很多现有出版物中均有相关记载。

以下实施例中使用的试剂、实验材料及其来源具体说明如下：

实验试剂：

TIGIT mFc：购自义翘神州，货号10917-H38H；

TIGIT-His：购自义翘神州，货号10917-H08H；

PVR-hFc：购自义翘神州，货号10109-H02H；

PVR-mFc：Lsbio LS-G138916；

PD1-His：购自义翘神州，货号10377-H08H-B；

PD-L1-mFc：购自义翘神州，货号10084-H05H；

实验材料：

Bal B/C小鼠：购自上海西普尔-必凯实验动物有限公司；

293F-TIGIT细胞：使用慢病毒感染实验室制备；

CD杂交瘤培养基Green features，货号:11279023；

C57L/J小鼠：购自上海西普尔-必凯实验动物有限公司。

需要说明的是，以下实施例着重阐述了抗TIGIT的单链抗体scFv的制备，而抗PD-1的免疫球蛋白抗体lgG采用本领域中已知的技术制备即可，具体方法可参见公开号为CN105175544A的中国专利申请中公开的，本文中采用的抗PD-1的免疫球蛋白抗体lgG即为公开号为CN105175544A的中国专利申请中公开的抗PD-1人源化单克隆抗体AbB8。

实施例1抗TIGIT的单链抗体scFv的制备

1、抗TIGIT鼠源抗体的构建

小鼠免疫

(1)初次免疫：选用2只Bal B/C小鼠(8周龄雌性)编号为54号和55号，用TIGIT mFc抗原与弗氏完全佐剂1：1混合后免疫小鼠，采用4-5点皮下注射，使小鼠体内产生能分泌特异性靶蛋白抗体的B细胞；测量小鼠血清效价，满足条件效价大于8K后加强免疫一次，本实施例中血清ELISA效价为1:810000；

(2)加强免疫：于初次免疫30天后，对54号和55号小鼠采用同初次免疫相同的方式进行加强免疫，结果显示2只小鼠全部满足效价(大于阴性对照2倍且大于0.25的OD450值对应的稀释度值即为该抗体的效价，效价大于等于8K即满足要求)，3天后处死小鼠，取小鼠脾脏，经碾磨后获得脾细胞群。

杂交瘤融合

(1)细胞融合

取处死后的54号和55号小鼠的脾细胞，根据SP2/0骨髓瘤细胞:脾细胞＝1:5的原则按照细胞融合标准操作规程进行免疫小鼠细胞融合，融合好标记为H006融合细胞板。

(2)融合筛选

融合细胞经过ELISA法检测，使用TIGIT-his进行包被，挑选与TIGIT-his结合较强，与PVR-hFc配体竞争较强(即OD值大于2的孔)的31个孔进行亚克隆。

(3)亚克隆

通过检测亚克隆细胞，对阳性细胞克隆化，进一步纯化细胞。经过2个周期的亚克隆，ELISA法检测与TIGIT-his结合较强(OD450＝1.520)及与PVR-hFc竞争较强(OD450＝0.207)的克隆号标记为8A4克隆进行建株及检测。

鼠源抗体纯化

杂交瘤细胞经扩培，收取细胞上清液，使用proteinA磁珠捕获抗体，使用0.1M、pH3.0甘氨酸洗脱，使用PBS置换洗脱缓冲液，使用超滤管超滤获得最终的高纯度抗体，结果如图1中所示的，实验结果显示：已纯化鼠源抗体纯度大于90％。

杂交瘤抗体活性检测

(1)ELISA法检测8A4鼠源抗体与Tigit-his结合活性

通过ELISA法，将测板包被0.5μg/ml的TIGIT-his，设置一个样品浓度梯度1:3，浓度梯度为0.00001-9μg/mL，测定结合活性OD值来检测8A4鼠源抗体与目标抗原TIGIT-his结合亲和力强弱。测试结果如图2中所示的，结果显示，该8A4鼠源抗体与抗原结合较强(EC50＝0.09276)，曲线上下平台清晰，窗口大，活性较好。

(2)ELISA法检测8A4鼠源抗体与PVR-hFc竞争活性

将待测板包被2.0μg/ml的TIGIT-his，设置一个样品浓度梯度1:3，浓度梯度为0.00001-9μg/mL，测定OD值来检测8A4鼠源抗体与3.0μg/ml的PVR-hFc配体的竞争活性。测试结果如图3中所示的，结果显示，该8A4鼠源抗体OD值明显趋势，曲线上下平台清晰，具有较强竞争活性(IC50＝0.08234)。

2、抗TIGIT鼠源抗体人源化

杂交瘤抗体测序

于37℃，5％二氧化碳中培养杂交瘤细胞，培养基为CD杂交瘤培养基，从中得到小量纯化的高纯度RNA，逆转录为cDNA作为模板后使用特异性PCR引物对目的片段进行体外扩增。将阳性PCR产物连接T载体进行质粒的重组和转化，通过蓝白斑筛选以及PCR验证，选取阳性克隆培养并送测序，对测序结果进行分析并将正确的序列订出，完成抗体的测序。

抗TIGIT鼠源抗体的重链氨基酸序列为SEQ ID NO.1，编码该重链的核苷酸序列为SEQ ID NO.2；其中，重链可变区的CDR-H1、CDR-H2、CDR-H3的氨基酸序列分别为SEQ IDNO.5-7。

抗TIGIT鼠源抗体的轻链氨基酸序列为SEQ ID NO.3，编码该轻链的核苷酸序列为SEQ ID NO.4；其中，轻链可变区的CDR-L1、CDR-L2、CDR-L3的氨基酸序列分别为SEQ IDNO.8-10。

抗体人源化

利用3D建模的方法，包括使用alphafoldII预测抗体的可变区的结构，经数据库比对，将原始鼠源序列突变成人源序列。

本实施例中将8A4抗体原始序列设计为如下的多个人源化抗体序列：

H006_8A4_huVH1：其氨基酸序列为SEQ ID NO.11；

H006_8A4_huVH2：其氨基酸序列为SEQ ID NO.12；

H006_8A4_huVL1：其氨基酸序列为SEQ ID NO.13；

H006_8A4_huVL2：其氨基酸序列为SEQ ID NO.14。

并将设计的序列组合成人源化抗体，具体的形式有以下几种：

huVL1-huVH1(VH1/VL1)；

huVL2-huVH1(VH1/VL2)；

huVL1-huVH2(VH2/VL1)；

huVL2-huVH2(VH2/VL2)。

将上述人源化抗体于Expi 293哺乳动物表达系统中顺时转染，培养7-10天后，离心取上清，进行抗体的表达。

人源化抗体的纯化

于Expi 293细胞表达的上述人源化抗体，收取细胞上清液，使用proteinA磁珠捕获抗体，使用0.1M、pH3.0甘氨酸洗脱，使用PBS置换洗脱缓冲液，使用超滤管超滤获得最终的高纯度抗体，结果图4中所示的，实验结果显示：已纯化人源化抗体纯度大于90％。

2、人源抗体活性检测

(1)ELISA法检测H006-8A4人源化抗体与TIGIT-his的结合活性

通过ELISA法，将检测板包被0.5μg/ml的TIGIT-his，设置一个样品浓度梯度1:3，浓度梯度为0.00001-9μg/mL，测定结合活性OD值来检测H006-8A4系列人源化抗体与目标抗原结合亲和力强弱。结果如图5中所示的，数据显示，与阳性抗体对比，该H006-8A4系列人源化抗体与抗原结合较强，曲线上下平台清晰，窗口大，活性较好。

(2)FACS法检测H006-8A4人源化抗体与293F-TIGIT细胞的结合活性

通过FACS法，将293F-TIGIT细胞(实验室自制)均匀地铺设到96孔细胞板中，设置所有样品浓度梯度设置一个样品浓度梯度1:3稀释，浓度梯度为0.00001-9μg/mL，与细胞进行结合，再加入每孔3μg/ml的Alex488标记羊抗鼠二抗/Alex488标记羊抗人二抗，结合后测定结合活性OD值来检测H006-8A4系列人源化抗体与293F-TIGIT细胞结合力强弱。结果如图6中所示的，数据显示该H006-8A4系列抗体与293F-TIGIT细胞结合力均比较强。

(3)ELISA法检测H006-8A4人源化抗体与PVR-mFc的竞争活性

将待测板包被2.0μg/ml的TIGIT-his，设置一个样品浓度梯度1:3稀释，浓度梯度为0.00001-9μg/mL，测定OD值来检测H006-8A4系列人源化抗体与9.0μg/ml的PVR-mFc配体的竞争活性。结果如图7中所示的，数据显示，该抗体OD值明显趋势，曲线上下平台清晰，具有较强竞争活性。

(4)FACS法检测H006-8A4人源化抗体与PVR-mFc的竞争活性

通过FACS法，将293F-TIGIT细胞均匀地铺设到96孔细胞板中，设置PVR-mFc恒定浓度3μg/ml，以及待测样品浓度梯度，一起与细胞进行结合，再加入每孔3μg/ml的Alex488标记羊抗鼠二抗，结合后测定竞争活性OD值来检测H006-8A4人源化抗体与PVR-mFc竞争力强弱。结果如图8中所示的，数据显示，该H006-8A4系列抗体竞争力均比较强。

3、人源抗体热稳定性实验

利用Protein Thermal Shift^TM染料试剂盒，通过实时荧光定量PCR方法检测荧光信号强度，监测蛋白质的热稳定性，结果参见表1和图9。H006-8A4系列人源化抗体的Tm值均低于母本，其中H006-8A4-huVH1/L1、H006-8A4-huVH2/L1、H006-8A4-huVH2/L2与母本热稳定性相近，略低于母本；H006-8A4-huVH1/L2热稳定性显著低于母本。

表1 H006-8A4系列人源抗体Tm值

蛋白名称	Tm值1	Tm值2	平均
				H006-8A4-Hwt/Lwt	92.14	92.07	92.11
H006-8A4-huVH1/L1	89.1	88.95	89.03
				H006-8A4-huVH1/L2	70.27	70.33	70.30
H006-8A4-huVH2/L1	88.22	88.17	88.20
				H006-8A4-huVH2/L2	88.26	88.22	88.24

4、人源化抗体MLR实验

设置所有样品浓度梯度，与诱导分化完全的细胞进行孵育，用ELISA试剂盒测定OD值，检测细胞上清液中IFN-γ的分泌情况。测试结果见图10，数据显示，H006-8A4-huVH1/VL2以及H006-8A4-huVH2/VL2两组抗体对细胞分泌IFN-γ有促进作用。

实施例2 H006-8A4-huVH2/VL2抗体在Hepa1-6鼠肝癌皮下移植瘤模型中药效学评价

建立Hepa1-6皮下移植瘤模型，皮下接种500万肿瘤细胞，同时注射100μl BD基质胶，待肿瘤体积生长至～120mm³时，将小鼠随机分成4组，每组8只，分组后平均肿瘤体积为119mm³。每只老鼠给药100μg，4天一次，对照组为生理盐水，实验组为抗体等；

对照组与各实验组的肿瘤生长曲线如图11所示：分组后第21天，即实验终点时，Group-1(Vehicle)对照组平均肿瘤体积为2118.7mm³；Group-2(8A4)平均肿瘤体积分别为1410.9mm³，肿瘤体积抑制率TGI_TV(％)为35.4％；Group-3(PD-1antibody)平均肿瘤体积为1027.1mm³，肿瘤体积抑制率TGI_TV(％)为60.5％；Group-4(8A4+PD-1antibody)平均肿瘤体积为519.5mm³，肿瘤体积抑制率TGI_TV(％)为80.0％。

以上结果说明，本实施例中H006-8A4-huVH2/VL2抗体的肿瘤抑制效果强，抗体活性好。

实施例3抗TIGIT-PD1双特异性抗体序列

本实施例中采用了将抗TIGIT的单链抗体scFv和抗PD-1的免疫球蛋白抗体lgG串联的方式构建了抗TIGIT-PD1双特异性抗体，具体形式为scFv-L2-lgG，其中，单链抗体scFv采用VL-L1-VH的分子形式，将人源化抗体序列的重链可变区VH2(SEQ ID NO.12)和轻链可变区VL2(SEQ ID NO.14)通过肽接头L1(GGGGSGGGGSGGGGSGGGGS)连接起来，得到抗TIGIT的单链抗体scFv。再利用肽接头L2(GGGGSGGGGSGGGGS)将该单链抗体scFv和抗PD-1的免疫球蛋白抗体lgG的重链连接起来，得到抗TIGIT-PD1双特异性抗体的重链。

其中，抗TIGIT-PD1双特异性抗体的重链氨基酸序列为SEQ ID NO.15，轻链氨基酸序列为SEQ ID NO.17；编码该重链的核苷酸序列为SEQ ID NO.16，编码该轻链的核苷酸序列为SEQ ID NO.18。

实施例4抗TIGIT-PD1双特异性抗体的纯化

于Expi 293细胞表达实施例3中的双特异性抗体，收取细胞上清液，使用proteinA磁珠捕获抗体，使用0.1M、pH3.0甘氨酸洗脱，使用PBS置换洗脱缓冲液，使用超滤管超滤获得最终的高纯度抗体按照蛋白纯化标准操作规程进行抗体纯化，结果如图12中所示的，实验结果显示：已纯化抗体纯度大于90％。

实施例5抗TIGIT-PD1双特异性抗体的活性检测

(1)ELISA法检测抗TIGIT-PD1双特异性抗体与TIGIT-his、PD1-his的结合活性：将检测板包被0.5μg/ml的TIGIT-his，设置一个样品浓度梯度1:3，浓度梯度为0.00001-9μg/mL；将酶标板置于多功能酶标仪上测450nm处的OD值。对数据采用Graphpad Prism软件进行四参数曲线拟合，得出EC50值，从而判断双抗与目标抗原结合力的强弱。测试结果参见图13，结果显示，TIGIT-PD1双特异性抗体与Tigit his抗原结合较强，曲线上下平台清晰，窗口大，活性较好；抗体与PD1-his抗原结合时，OD值较高，曲线上平台较高。

(2)ELISA法检测抗TIGIT-PD1双特异性抗体与PD-L1-mFc的竞争活性：将待测板包被2.0μg/ml的PD-1-his，设置一个样品浓度梯度1:3，浓度梯度为0.00001-9μg/mL，测定OD值来检测抗TIGIT-PD1双特异性抗体与0.3μg/ml的PD-L1-mFc的竞争活性。结果请参见图14，数据显示，OD值趋势明显，曲线有上下平台，具有明显竞争活性。

以上所述实施例的各技术特征可以进行任意的组合，为使描述简洁，未对上述实施例中的各个技术特征所有可能的组合都进行描述，然而，只要这些技术特征的组合不存在矛盾，都应当认为是本说明书记载的范围。

以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。

Claims (10)

1.一种抗TIGIT-PD1双特异性抗体，其特征在于，所述双特异性抗体包括抗PD1的免疫球蛋白抗体lgG和抗TIGIT的单链抗体scFv，其中，所述的单链抗体scFv包括可变区VH和可变区VL，可变区VH通过肽接头L1与可变区VL连接，每个单链抗体scFv的羧基端通过肽接头L2与免疫球蛋白抗体lgG重链的氨基端连接；

所述可变区VH包括互补决定区CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3，其中，CDR-H1的氨基酸序列为SEQ ID NO.5，CDR-H2的氨基酸序列为SEQ ID NO.6，CDR-H3的氨基酸序列为SEQ ID NO.7；

所述可变区VL包括互补决定区CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3，其中，CDR-L1的氨基酸序列为SEQ ID NO.8，CDR-L2的氨基酸序列为SEQ ID NO.9，CDR-L3的氨基酸序列为SEQ ID NO.10。

2.如权利要求1所述的抗TIGIT-PD1双特异性抗体，其特征在于，所述单链抗体scFv是鼠源抗体或人源化抗体；

优选地，所述单链抗体scFv是鼠源抗体，其中，所述单链抗体scFv的重链氨基酸序列为SEQ ID NO.1，其轻链氨基酸序列为SEQ ID NO.3。

优选地，所述单链抗体scFv是人源化抗体，其中，所述单链抗体scFv包含以下方案之一的氨基酸序列组合方式：SEQ ID NO.11和SEQ ID NO.13的组合(VH1/VL1)、SEQ ID NO.11和SEQ ID NO.14的组合(VH1/VL2)、SEQ ID NO.12和SEQ ID NO.13的组合(VH2/VL1)、SEQ IDNO.12和SEQ ID NO.14的组合(VH2/VL2)。

3.如权利要求1所述的抗TIGIT-PD1双特异性抗体，其特征在于，所述免疫球蛋白抗体lgG的恒定区来自人抗体。

4.如权利要求3所述的抗TIGIT-PD1双特异性抗体，其特征在于，所述免疫球蛋白抗体lgG的重链恒定区序列为人lgG1的重链恒定区，其轻链恒定区序列为人lgG1的轻链恒定区。

5.如权利要求1所述的抗TIGIT-PD1双特异性抗体，其特征在于，所述双特异性抗体的重链氨基酸序列为SEQ ID NO.15，其轻链氨基酸序列为SEQ ID NO.17。

6.一种核苷酸分子，其特征在于，其编码如权利要求1-5任一项所述的双特异性抗体。

7.一种表达载体，其特征在于，其含有如权利要求6所述的核苷酸分子。

8.一种宿主细胞，其特征在于，其含有如权利要求7所述的表达载体。

9.一种药物组合物，其特征在于，其含有如权利要求1-5任一项所述的双特异性抗体和任意一种以上药学上可接受的辅料。

10.如权利要求9所述的药物组合物在制备药物中的应用，其特征在于，所述药物用于预防和/或治疗肿瘤。

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