CN115725597A

CN115725597A - 一种水稻粒宽粒重调控基因dwg1及其应用

Info

Publication number: CN115725597A
Application number: CN202210784482.9A
Authority: CN
Inventors: 梁越洋; 李玲锋; 李平; 李双成; 金京花; 王世全; 邓其明; 朱军; 邹挺; 刘怀年
Original assignee: Sichuan Agricultural University
Current assignee: Sichuan Agricultural University
Priority date: 2022-07-05
Filing date: 2022-07-05
Publication date: 2023-03-03

Abstract

本发明公开了一种水稻粒宽粒重调控基因DWG1及其应用，属于植物基因工程领域，编码该基因DWG1的核苷酸序列如SEQ ID NO：1如示，编码其蛋白质的氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示。本发明还公开了DWG1基因重组在表达载体并转化水稻后，过量表达DWG1能够增加水稻粒宽粒重和提高水稻产量上的应用，对水稻产量和品质协同改良具有重要意义。

Description

一种水稻粒宽粒重调控基因DWG1及其应用

技术领域

本发明涉及植物基因工程领域，具体涉及一种水稻粒宽粒重调控基因DWG1及其应用。

背景技术

粒重、有效穗数、穗粒数、结实率是构成水稻产量的四大要素，粒重由粒型和籽粒充实度决定，其受环境影响较小，是水稻产量最稳定的构成要素。水稻粒型是一个复合性状，主要包括粒长、粒宽、长宽比、粒厚，这些形态学性状是水稻粒重的重要组成部分，并直接影响水稻产量。

水稻粒型属于数量性状，受到复杂的遗传网络调控。目前认为，水稻粒型主要由颖壳细胞数量和细胞大小决定，受细胞增殖和细胞扩张途径共同调控。目前研究表明，水稻粒型调控基因主要参与G蛋白信号、泛素-蛋白酶体、丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)信号、植物激素信号、转录因子调控等分子途径调控颖壳细胞增殖和细胞扩张。

近年来，粒型基因的克隆和功能解析为水稻分子设计育种提供了重要的基因资源。随着水稻分子育种技术快速发展，一部分已克隆的优势粒型等位基因已经成功应用到了水稻的品种改良。尽管目前水稻中已克隆了一定数量的粒型基因，但是真正在育种上广泛应用的基因仍然很少，粒型调控的分子机制仍然不清楚。因此，继续挖掘新的粒型基因和解析新的调控机制，对水稻产量和品质协同改良具有重要意义。

发明内容

本发明的目的是提供一种水稻粒宽粒重调控基因DWG1及其应用，对水稻产量和品质协同改良具有重要意义。

为了达到上述目的，本发明提供了一种水稻粒宽粒重调控基因DWG1，该基因DWG1的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示，或与序列SEQ ID NO：1存在至少90％的同源性。

优选地，上述水稻粒宽粒重调控基因DWG1的核苷酸序列还包括在如SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列中添加、取代，插入或缺失一个或多个核苷酸而生成的核苷酸序列。

本发明还提供了一种水稻粒宽粒重调控基因DWG1编码的蛋白质，该蛋白质的氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示。

优选地，上述水稻粒宽粒重调控基因DWG1编码的蛋白质的氨基酸序列还包括在如SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列中添加、取代、插入或缺失一个或多个氨基酸而生成的氨基酸序列。

本发明还提供了一种含有上述核苷酸序列的重组载体。

本发明还提供了一种含有上述基因工程载体的重组工程菌。

本发明还提供了一种如上述的重组载体或重组工程菌在水稻育种中的应用。

优选地，上述的应用包含制备转基因水稻品系。

本发明的水稻粒宽粒重调控基因DWG1及其应用，利用CRISPR/Cas9编辑系统，明确揭示了DWG1是一种水稻粒宽粒重的调控基因，解决了水稻粒宽粒重可调控和水稻优良育种等问题，具有以下优点：

本发明提供了一种新的水稻粒宽和粒重的调控基因DWG1。本发明利用CRISPR/Cas9系统编辑DWG1，获得DWG1-KO突变体，表现为粒宽和粒重显著降低，过量表达DWG1显著增加粒宽和粒重，明确了该基因在调控水稻粒型和粒重方面的生物学功能，能应用于水稻的粒型和粒重改良，提高水稻产量，具有重要的育种利用价值，同时为研究水稻粒型和粒重调控机制提供了新的思路。

附图说明

图1为本发明中水稻基因DWG1的基因定位结果图。

图2为本发明中DWG1基因的敲除载体谱图。

图3为本发明中DWG1基因的过表达载体谱图。

图4为本发明中DWG1基因敲除前后的水稻粒宽粒重表型对比结果图。

图5为本发明中DWG1基因过表达前后的水稻粒宽粒重表型对比结果图。

具体实施方式

下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

说明：R600为一种常规的水稻品种；

实施例中所用到的方法均为常规方法，所用到的试剂未见明确指出的均为常规试剂。

实验例1水稻DWG1突变体的获得

突变体DWG1由水稻R600经甲基磺酸乙酯(EMS)诱变获得，经连续多代自交其表型稳定。突变体DWG1表型上与野生型相比粒宽和粒重显著变小。

实验例2水稻基因DWG1的遗传分析

通过DWG1与R600杂交，获得的F₁表型与R600一样，由此推测突变表型受一对隐性基因控制。F₂群体中突变表型出现分离，突变表型单株与野生型单株符合1：3的分离比，说明该突变性状受单隐性基因控制。

实验例3水稻基因DWG1的定位

如图1如示，基于Mutmap结合共分离验证的基因定位方法，将DWG1基因定位于第4染色体，候选基因座号为LOC_Os04g54440，该基因编码区发生了G761A的突变，因此将其列为DWG1候选基因。

实验例4DWG1基因的水稻敲除及过表达载体构建和遗传转化

1、DWG1敲除载体构建

利用水稻信息门户网站(Rice Information GateWay)的CRISPR设计工具(http://rice.hzau.edu.cn/cgi-bin/rice2/CRISPR_rice)设计CRISPR/Cas9系统敲除DWG1(LOC_Os04g54440)的gRNA靶序列，序列如SEQ ID NO：3所示：CTTGAACACCCGCTGCATTTGG(下划线部分的TGG为PAM序列)。然后设计对应的sgRNA Oligo，其中寡核苷酸靶点序列如下所示，

sgRNA序列如下(5’-3’)：

UP Oligo(SEQ ID NO：4)：CACCGCTTCTGCTGGGTTTCAGGTTGG；

Low Oligo(SEQ ID NO：5)：AAACCCAAATGCAGCGGGTGTTCAAG。

将合成的Oligo加水溶解至10μM，按照CRISPR/Cas载体构建试剂盒(百格)进行载体构建。首先制备Oligo二聚体，体系如下：

BufferAneal 18μL，UP Oligo 1μL，Low Oligo 1μL，Total 20μL；95℃加热3分钟，然后以约0.2℃/秒缓慢降至20℃。

然后将上述产物连入CRISPR/Cas9载体BGK03(百格)，体系如下：H₂O 6μL，CRISPR/Cas Vector 2μL，Oligo二聚体1μL，Enzyme Mix 1μL。

取5μL反应液加到至少50μL的感受态细胞中，混匀后冰浴静置30分钟(期间切勿晃动，严格保持静置)；轻轻取出，42℃热激60秒，立即置于冰上2分钟；加入500μL SOB/LB，37℃200rpm培养1小时；取适量菌液涂布于含有卡那霉素的LB平板上，37℃倒置过夜培养。挑单克隆进行PCR鉴定，对于测序正确的单克隆，扩摇菌液，用试剂盒(美基生物)提取质粒，得到DWG1的敲除载体BGK03-DWG1，图谱如图2所示。

2、DWG1过量表达载体构建

1)取水稻日本晴的种子，种植在含有水稻完全营养液的培养盒中，在光照培养箱中生长15天，培养条件光照黑暗各12小时，白天28℃，晚上23℃。取幼苗地上部分，按照福际植物总RNA提取试剂盒的方法提取RNA。

2)按照南京诺维赞公司HiScript III 1st Strand cDNA Synthesis Kit(+gDNAwiper)试剂盒将RNA反转录成cDNA。

3)用设计好的包含酶切位点和同源臂序列的DWG1引物，以cDNA为模板，进行PCR扩增，引物序列如下(5′-3′)：

pDWG1-F(SEQ ID NO：6)：

GGGGATCCTCTAGAGTCGACATGGCTCCGAAGAAGCGAA；

pDWG1-R(SEQ ID NO：7)：

ACGACGGCCAGTGCCAAGCTTCAAAATCCACCCTGAAAACCA。

PCR反应体系如下：

cDNA 4μL、pDWG1-F和pDWG1-R引物各2μL、buffer 25μL、DNTPs1μL、高保真酶1μL和ddH₂O 15μL。

PCR反应程序如下：

预变性95℃，3min；95℃，15sec；58℃，20sec；72℃，1min 35个循环，终延伸72℃，5min。

4)PCR产物回收和产物连接

琼脂糖凝胶回收试剂盒(购自美基生物)回收PCR产物，回收片段与酶切后的载体进行连接。

5)载体酶切

利用SalⅠ和HindⅢ(赛默飞)对载体pCAMBIA1300双酶切，50μL反应体系；酶各2μL，Buffer 5μL，质粒10μL，ddH₂O 31μL，37℃孵育1.5h后回收酶切产物，回收方法与4)同。

6)载体和PCR产物的连接

利用同源重组的方法构建载体，重组酶购于南京诺维赞生物公司。体系20μL：PCR产物2μL，线性化载体1μL，重组酶2μL，Buffer4μL，ddH₂O11μL。37℃孵育30min。

7)重组载体的转化

将重组载体转入大肠杆菌DH5α感受态中，冰上孵育30min，42℃热击45sec，加入500μL无抗生素的液体LB，37℃孵育1h。5000rpm离心，留100μL液体重悬菌体，均匀涂布于卡纳抗性的LB平板上，将平板于37℃培养24h。

8)阳性克隆的鉴定

挑单克隆进行PCR鉴定，对于测序正确的单克隆，扩摇菌液，用试剂盒(美基生物)提取质粒，得到过表达载体35S-DWG1，图谱如图3所示。

3、水稻遗传转化

将上述的过表达载体35S-DWG1和敲除载体BGK03-DWG1通过冻融法导入农杆菌EHA105。挑取单菌落于YEP液体培养基(卡纳Km和利福平Rif各50mg/L)中，28℃振荡培养12～18h，然后取1～5mL菌液接到100mL YEP液体培养基(含乙酰丁香酮100μmol/L)中，振荡培养4h后测OD值稀至相应浓度(OD＝0.5)。将新鲜菌液于8000rpm、4℃、5min收集菌体，并重悬于三分之一体积的AAM培养基中。加入放有生长旺盛的胚性愈伤组织的灭菌三角瓶中浸泡25min，再吹干表面菌液，将愈伤组织转接于共培养基上，28℃暗培养2～3d。共培养愈伤组织经无菌水和含头孢羟氨苄Cef 500mg/L的无菌水漂洗后，在工作台上吹4h左右，转接于预培养基中28℃暗培养5～7d。将预培养的愈伤组织转接于含潮霉素Hyg和Cef的筛选培养基上继续培养3～4周，再将抗性愈伤组织转接于仅含Hyg的筛选培养基上，筛选1～2次。取抗性愈伤组织转接于分化培养基上，28℃光照分化。分化小苗转接于生根培养基，28℃光照培养3～4周，开放培养炼苗7d左右，最后移栽到大田。获得的再生植株移栽成活后用除草剂或潮霉素筛选转化植株；阳性植株提取叶片总DNA，经PCR进一步鉴定转化植株。调查转基因T1代植株的粒型，验证DWG1基因的功能。

实验例5DWG1功能分析

1、DWG1敲除转基因植株表型分析

利用CRISPER-Cas9系统在水稻ZH11背景下对DWG1进行基因编辑，通过PCR鉴定获得编辑成功的突变体KO-1和KO-2，其中KO-1编码区42位核苷酸后插入A，KO-2编码区40-47位核苷酸缺失，两种突变均造成了翻译提前终止。转基因T1代植株籽粒表型调查发现，DWG1敲除植株粒宽粒重显著降低，如图4所示，表明DWG1功能丧失降低水稻粒宽粒重。

2、DWG1过表达转基因植株表型分析

如实验例4中所述得到的过表达转基因株系OE1、OE2在水稻籽粒粒宽及千粒重显著高于野生型ZH11，如图5所示，表明DWG1可能正调控水稻粒宽和粒重。过量表达DWG1可增加水稻粒重，提高产量，具有重要的育种价值。

尽管本发明的内容已经通过上述优选实施例作了详细介绍，但应当认识到上述的描述不应被认为是对本发明的限制。在本领域技术人员阅读了上述内容后，对于本发明的多种修改和替代都将是显而易见的。因此，本发明的保护范围应由所附的权利要求来限定。

Claims

1.一种水稻粒宽粒重调控基因DWG1，其特征在于，该基因DWG1的核苷酸序列如SEQ IDNO：1所示，或与序列SEQ ID NO：1存在至少90％的同源性。

2.根据权利要求1所述的水稻粒宽粒重调控基因DWG1，其特征在于，所述基因的核苷酸序列包括在如SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列中添加、取代，插入或缺失一个或多个核苷酸而生成的核苷酸序列。

3.一种如权利要求1所述的水稻粒宽粒重调控基因DWG1编码的蛋白质，其特征在于，该蛋白质的氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示。

4.根据权利要求3所述的水稻粒宽粒重调控基因DWG1编码的蛋白质，其特征在于，所述的氨基酸序列还包括在如SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列中添加、取代、插入或缺失一个或多个氨基酸而生成的氨基酸序列。

5.含有如权利要求1或2中所述核苷酸序列的重组载体。

6.含有如权利要求5所述重组载体的重组工程菌。

7.如权利要求5所述的重组载体或权利要求6所述的重组工程菌在水稻育种中的应用。

8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，该应用包含制备转基因水稻品系。