CN115715774A - 8-异戊烯基-4’-甲氧基黄酮醇类化合物的用途 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种8‑异戊烯基‑4’‑甲氧基黄酮醇类化合物的用途，所述用途是指以8‑异戊烯基‑4’‑甲氧基黄酮醇类化合物作为活性成分用于制备预防或/和治疗色素脱失性疾病的药物或化妆品。本发明的研究结果表明：本发明所述的8‑异戊烯基‑4’‑甲氧基黄酮醇类化合物能显著提高小鼠B16F10细胞黑素的生成能力和酪氨酸酶的活性；尤其是，其中的化合物B能够明显促进C57BL/6小鼠毛发中的黑素生成能力；因此，本发明所述的8‑异戊烯基‑4’‑甲氧基黄酮醇类化合物可望作为活性成分用于制备预防或/和治疗色素脱失性疾病的药物制剂或化妆品，对色素脱失性疾病的预防和治疗具有重要价值。

Description

8-异戊烯基-4’-甲氧基黄酮醇类化合物的用途

技术领域

本发明是涉及8-异戊烯基-4’-甲氧基黄酮醇类化合物的用途，具体说，是涉及8-异戊烯基-4’-甲氧基黄酮醇类化合物在预防或/和治疗色素脱失性疾病中的用途。

背景技术

色素脱失症是以其表征命名的一种皮肤疾病。色素脱失性疾病是指皮肤、粘膜处出现比正常肤色浅的斑片，主要是由于皮肤色素减退或色素脱失素所造成的。色素的生成、转移与降解过程中，任何一个环节发生障碍均可影响其代谢，导致皮肤颜色变化，患处呈乳白色、周边有色素沉着带，无自觉症状。色素缺失性白斑可发生于全身任何部位，但以面部、颈部、手背等暴露部位及外生殖器等皱褶处皮肤多见。多数为局限性，孤立存在，也可呈对称分布，或沿神经呈带状分布，还可以泛发全身，只剩少数正常皮肤。根据其色素脱失的范围大小可分为全身性的皮肤色素脱失，如白癜风、结节性硬化症、斑驳病、伊藤色素减退症等；非全身性的皮肤色素脱失，包括眼皮肤白化病综合症、苯丙酮尿症。此类疾病治疗困难，疗程较长，治愈率较低。

其中，白癜风作为色素脱失性疾病中一种最具代表性的疾病，备受关注。据报道，白癜风全球患病率为0.06％-2.28％([J].International Journal of Dermatology，2012，51(10))，我国的人群患病率约为0.1％-2.7％([M].中国临床皮肤病学，2009：1268-1270)。虽然白癜风不会伴有瘙痒或疼痛等令人不安的感觉，但其造成的诸多社会自尊和交往等方面的负面影响不容忽视，甚至会产生焦虑、抑郁等精神性问题。

至今，白癜风的发病机制还未完全阐释清楚，主要认为其与遗传、免疫、神经精神、代谢产物损伤、微量元素缺乏等有关([J].Qatar Medical Journal，2013，2013(2))。临床上，西医主要通过使用糖皮质激素、钙调神经磷酸酶抑制剂、维生素D等化学药品和通过光学治疗、外科手术等物理疗法来治疗白癜风([J].中国中医药现代远程教育，2020，18(21):134-136)。

中医对白癜风的认识已有数千年历史，白癜风属中医“白驳风”、“白癜”、“斑驳”范畴，中医学认为，白癜风是由内因与外因相互作用而引发，内因责于脏腑功能失调，外因为风、寒、湿等六淫邪气，内外合邪致气血不和，脉络瘀阻，肌肤腠理失养而发病，治疗原则为祛风除湿、疏肝补肾、活血化瘀(王家悦,张丰川,蔡玲玲,郭丽媛,王莹,李元文.张丰川教授治疗白癜风的辨证思路及临床经验总结([J].世界中医药，2020，15(22):3471-3474)。

临床上常用于治疗白癜风的中药主要包括：补骨脂、制首乌、墨旱莲、女贞子、熟地黄、枸杞子、当归、川芎、丹参、赤芍、红花、淫羊藿等，主要以辛温为主，甘味居多；归经主要归肝肾经，肺胃次之。通过调节免疫、改善氧化应激损伤、改善黑素细胞功能、调节肠道菌群微环境等途径发挥作用([J].皮肤性病诊疗学杂志，2015，22(06):443-445和[J/OL].中国实验方剂学杂志:1-10[2021-06-19])。

但通过查阅文献发现，至今未见8-异戊烯基-4’-甲氧基黄酮醇类化合物在色素脱失性疾病中的用途报道。

发明内容

针对现有技术存在的上述问题，本发明的目的是提供8-异戊烯基-4’-甲氧基黄酮醇类化合物在预防或/和治疗色素脱失性疾病中的用途，为色素脱失性疾病的治疗提供一种新途径。

本发明所述的8-异戊烯基-4’-甲氧基黄酮醇类化合物的用途，是指以8-异戊烯基-4’-甲氧基黄酮醇类化合物作为活性成分用于制备预防或/和治疗色素脱失性疾病的药物或化妆品。

本发明所述的8-异戊烯基-4’-甲氧基黄酮醇类化合物，具有式Ⅰ所示的化学结构通式：

式中的R1和R2各自独立选自氢、单糖基、低聚糖基、单糖衍生物基或低聚糖衍生物基。

一种优选方案，所述的单糖基选自鼠李糖基、葡萄糖基、核糖基中的任意一种；所述的低聚糖基是由鼠李糖基、葡萄糖基、核糖基中的任意2种或3种单糖基组成。

进一步优选方案，本发明所述的8-异戊烯基-4’-甲氧基黄酮醇类化合物是选自如下化合物中的任意一种或几种的组合：

本发明所述的色素脱失性疾病包括但不限于：白癜风、斑驳病、白化病综合症、苯丙酮尿症、灰发症。

本发明所述的药物可采用各种给药途径给予患者，包括但不限于口服、透皮、肌肉、皮下和静脉注射。

本发明所述药物的剂型包括但不限于：片剂、胶囊剂、口服液、口含剂、颗粒剂、冲剂、丸剂、散剂、膏剂、丹剂、混悬剂、粉剂、溶液剂、注射剂、栓剂、软膏剂、硬膏剂、霜剂、喷雾剂、滴剂、贴剂等。

本发明所述药物中，除了含有主要活性成分之外，还可含有少量的且不影响有效成分的次要成分和/或药学上可接受的载体以及各种制剂所必要的辅料等。

本发明所述的化妆品包括用于使毛发变黑的护发品和用于使皮肤白斑变黑的护肤品。

与现有技术相比，本发明具有如下显著性有益效果：

本发明的研究结果表明：本发明所述的8-异戊烯基-4’-甲氧基黄酮醇类化合物能显著提高小鼠B16F10细胞黑素的生成能力和酪氨酸酶的活性；尤其是，其中的化合物B能够明显促进C57BL/6小鼠毛发中的黑素生成能力；因此，本发明所述的8-异戊烯基-4’-甲氧基黄酮醇类化合物可望作为活性成分用于制备预防或/和治疗色素脱失性疾病的药物制剂或化妆品，对色素脱失性疾病的预防和治疗具有重要价值。

附图说明

图1a至图1f是分别体现不同浓度的8-异戊烯基-4’-甲氧基黄酮醇类化合物在分别作用48小时和72小时下，对B16F10细胞的毒性影响；其中：图1a是化合物A；图1b是化合物B；图1c是化合物C；图1d是化合物D；图1e是化合物E；图1f是化合物F；

图2a是体现不同浓度的8-异戊烯基-4’-甲氧基黄酮醇类化合物对B16F10细胞中黑素含量的影响，图2b是体现不同浓度的8-异戊烯基-4’-甲氧基黄酮醇类化合物对B16F10细胞中酪氨酸酶活性的影响；图中的“A”是代表化合物A，图中的“B”是代表化合物B，图中的“C”是代表化合物C，图中的“D”是代表化合物D，图中的“E”是代表化合物E，图中的“F”是代表化合物F；

图3a是体现各试验组对C57BL/6小鼠的作用时间与体重之间的关系；

图3b是体现各试验组对C57BL/6小鼠背部毛发的影响；

图3c是体现各试验组对酪氨酸酶活性的影响。

具体实施方式

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件或按照制造厂商所建议的条件。

实施例中所用的8-异戊烯基-4’-甲氧基黄酮醇类化合物(化合物A至化合物F)均购自上海诗丹德标准技术服务有限公司，纯度均高于95％。

实施例1检测各种8-异戊烯基-4’-甲氧基黄酮醇类化合物对小鼠B16F10细胞的毒性

使用B16F10细胞，加入8-异戊烯基-4’-甲氧基黄酮醇类化合物(如：化合物A至化合物F)，经各种药物干预后，加入MTT试剂，分别检测B16F10细胞的存活数目，进行标准化计算，所有数据均采用mean±SEM表示，n≥3，*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001。

(1)B16F10细胞培养

从液氮罐中取出冻有B16F10细胞的冻存管，迅速放入37℃水浴中，并不停摇动，在1min内使其完全融化。将融化的细胞悬液加入含5mL DMEM培养基的离心管中，于室温下1000r·min^-1离心5min，然后弃去上层液，加入1mL高糖DMEM培养基重悬，转移至大皿中，再加入含10％FBS的DMEM培养基，吹匀，于37℃、5％CO₂培养细胞至贴壁后更换培养基继续培养，当细胞长至80％时传代，所有实验用细胞保持在3～20代内。

(2)铺板

计数B16F10细胞，以1×10⁴/孔的细胞密度接种于用含10％FBS的DMEM 96孔板中，于37℃、5％CO₂培养箱中培养过夜。

(3)给药

细胞贴壁后，改换2.5％FBS的DMEM进行培养，分别加入不同浓度的化合物A至化合物F，并设置空白对照组，且分别作用时间为48小时和72小时。

(4)测定细胞存活率

药效时间到后，每孔中加入100μL浓度为5mg/mL的MTT试剂，反应4小时后，置于570nm下测定每孔吸光度值，并进行计算。

(5)数据分析

利用PRISM软件进行作图及数据分析，不同干预组的差异性比较采用ANOVA分析，p<0.05认为组间差异具有统计学意义。

(6)实验结果

图1a至图1f分别体现了不同浓度的化合物A至化合物F在分别作用48小时和72小时下，对B16F10细胞的毒性；由图1a至图1f所示结果可见：在化合物A浓度≤100μM(详见图1a所示)，化合物B浓度≤100μM(详见图1b所示)，化合物C浓度≤100μM(详见图1c所示)，化合物D浓度≤20μM(详见图1d所示)，化合物E浓度≤6.3μM(详见图1e所示)，化合物F浓度≤2.5μM(详见图1f所示)时，它们均未对B16F10细胞产生明显的毒性。

实施例2考察不同浓度的8-异戊烯基-4’-甲氧基黄酮醇类化合物对小鼠B16F10细胞中黑素的调控效应

使用B16F10细胞，加入不同浓度的8-异戊烯基-4’-甲氧基黄酮醇类化合物，经药物干预72h后，测定细胞中黑素含量和酪氨酸酶活性。所有数据均采用mean±SEM表示，n≥3，*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001。

(1)B16F10细胞培养

从液氮罐中取出冻有B16F10细胞的冻存管，迅速放入37℃水浴中，并不停摇动，在1min内使其完全融化。将融化的细胞悬液加入含5mL DMEM培养基的离心管中，于室温下1000r·min^-1离心5min，弃去上层液，加入1mL高糖DMEM培养基重悬，转移至大皿中，再加入含10％FBS的DMEM培养基，吹匀，于37℃、5％CO₂培养细胞至贴壁后更换培养基继续培养，当细胞长至80％时传代，所有实验用细胞保持在3～20代内。

(2)铺板

计数B16F10细胞，以5×10⁵/孔的细胞密度接种于用含10％FBS的DMEM小皿中，于37℃、5％CO₂培养箱中培养过夜。

(3)给药

细胞贴壁后，改换2.5％FBS的DMEM进行培养，分别加入不同浓度的化合物A至化合物F，并分别作用72小时；设置IBMX作为阳性对照药；

(4)测定细胞中蛋白含量

从培养箱中取出给药72h后的细胞，用PBS(pH 7.2)洗3遍；每孔加细胞裂解液300μL，收集细胞；收集的细胞于4℃裂解20min后，再于4℃、14000r·min^-1下离心15min，然后收集上清进行蛋白含量测定：

取BCA试剂盒中试剂A和试剂B按50:1的体积比配制成BCA工作液备用；取标准蛋白液(0.5mg/mL)与PBS(pH 7.2)按照0:20、1:19、2:18、4:16、8:12、12:8、16:4、20:0的比例加入96孔板中；再加适当体积样品到96孔板中，用PBS(pH 7.2)稀释至总体积为20μL，并每孔加入200μL BCA工作液后，于37℃孵育30min；于562nm处测定OD值，计算蛋白浓度。

(5)测定细胞中黑素含量

加入不同浓度的药物后培养72h，用PBS清洗细胞2遍，收集细胞加300μL非变性裂解液(含1nM PMSF)，于4℃裂解20min后，再于4℃、14000r·min^-1下离心15min，然后取上清液进行黑素含量测定：

向下层黑素沉淀中加入200μL的NaOH(含10％DMSO)，然后置于80℃恒温箱中煮2h，再于14000r·min^-1下离心10min；取约100μL于96孔板中测定在470nm波长下的OD值，并计算黑素的含量。

(6)测定细胞中酪氨酸酶的活性

加入不同浓度的药物培养72h，用PBS洗2遍，收集细胞于EP管中，每管加入300μL非变性裂解液(含1nM PMSF)，于4℃裂解20min后，再于4℃、14000r·min^-1下离心15min，取上清用BCA法进行酪氨酸酶的活性测定：

取含20μg蛋白的体积样品加入96孔板，用PBS(pH 6.8)定容至100μL，再加入0.01％g/mL L-DOPA 100μL，于37℃避光孵育60min，然后于波长475nm处测定OD值，并计算酪氨酸酶的相对活性。

(7)数据分析

利用PRISM软件进行作图及数据分析，不同干预组的差异性比较采用ANOVA分析，p<0.05认为组间差异具有统计学意义。

(8)实验结果

图2a是体现不同浓度的8-异戊烯基-4’-甲氧基黄酮醇类化合物对B16F10细胞中黑素含量的影响，图2b是体现不同浓度的8-异戊烯基-4’-甲氧基黄酮醇类化合物对B16F10细胞中酪氨酸酶活性的影响；由图2a和图2b所示结果可见：在B16F10细胞中，不同浓度的8-异戊烯基-4’-甲氧基黄酮醇类化合物可不同程度地促进B16F10细胞中黑素含量的生成并能提高酪氨酸酶的活性，且呈现出一定的浓度梯度性。

实施例3考察化合物B对氢醌诱导的C57BL/6小鼠白癜风模型的作用效果

C57BL/6小鼠由上海中医药大学动物实验中心购置于北京维通利华实验动物技术有限公司，饲养于上海中医药大学动物实验中心二楼SPF级屏障系统实验室，提供灭菌饲料及饮水，控制环境温度为(22±2)℃，12h明/暗周期(7:00/19:00)。

小鼠适应性饲养7天后，随机分为4组，正常组、氢醌组、化合物B低剂量组和化合物B高剂量组，每组8只。

(1)配药

称取适量氢醌、化合物B药品和乳膏基质混合、搅拌使其充分溶解，配制成浓度为4

％的氢醌乳膏，0.1％的化合物B乳膏(低剂量)，0.5％化合物B乳膏(高剂量)以及100

％乳膏基质，均于4℃保存备用。

(2)脱毛、给药

按0.1mL：100g比例，对C57BL/6小鼠腹腔注射20％乌拉坦使其麻醉；

将松香、石蜡按1：1比例溶解，待冷却至50～60℃时，涂抹于纱布并粘贴于小鼠背部。冷却至坚硬状态，撕去小鼠背部纱布，使其毛发充分脱落；

每日上午，使用4％氢醌乳膏涂抹氢醌组小鼠背部，空白组小鼠不做任何涂抹处理；

每日下午，0.1％化合物B乳膏涂抹低剂量组小鼠背部，0.5％化合物B乳膏涂抹高剂量组小鼠背部，均涂抹至均匀覆盖；空白组和氢醌组不需要涂抹；

连续给药50天，每3日称量体重一次。

(3)拍照、取材

拍照、记录观察各组小鼠背部毛发颜色变化。

处死小鼠，使用脱毛器将其背部毛发剃除，剪取其背部皮肤，放置于多聚甲醛浸泡、固定。

(4)测定细胞中酪氨酸酶的活性

取小鼠皮肤组织，加适量蛋白裂解液，充分研磨组织；离心，吸取上清，参照实施例2进行酪氨酸酶的活性测定。

(5)数据分析

利用PRISM软件进行作图及数据分析，不同干预组的差异性比较采用ANOVA分析，p<0.05认为组间差异具有统计学意义。

(6)实验结果

图3a是体现各试验组对C57BL/6小鼠的作用时间与体重之间的关系，由图3a可见：氢醌组、化合物B的低剂量组和高剂量组均未对小鼠体重产生较大影响，表明它们均无明显毒性；

图3b是体现各试验组对C57BL/6小鼠背部毛发的影响，由图3b可见：实验前，所有组进行脱毛，毛囊周期同步化；实验后，经过50天氢醌处理和给药即大约三个毛囊周期，空白组小鼠毛发生长正常即毛发浓密乌黑；氢醌组明显降低了毛发色素的生成即小鼠背部白癜风样灰发形成，化合物B的低剂量组和高剂量组均能有效促进C57BL/6小鼠毛发颜色变黑，明显缓解了白癜风样症状；

图3c是体现各试验组对酪氨酸酶活性的影响，由图3c可见：氢醌组明显抑制了酪氨酸酶的活性，而化合物B的低剂量组和高剂量组均能有效促进酪氨酸酶的活性。

由上所述可见：本发明所述的8-异戊烯基-4’-甲氧基黄酮醇类化合物能显著提高小鼠B16F10细胞黑素的生成能力和酪氨酸酶的活性；尤其是，其中的化合物B能够明显促进C57BL/6小鼠毛发中的黑素生成能力；因此，本发明所述的8-异戊烯基-4’-甲氧基黄酮醇类化合物可望作为活性成分用于制备预防或/和治疗色素脱失性疾病的药物制剂或化妆品，对色素脱失性疾病的预防和治疗具有重要价值。

最后有必要在此说明的是：以上实施例只用于对本发明的技术方案作进一步详细地说明，不能理解为对本发明保护范围的限制，本领域的技术人员根据本发明的上述内容作出的一些非本质的改进和调整均属于本发明的保护范围。

Claims (6)

1.一种8-异戊烯基-4’-甲氧基黄酮醇类化合物的用途，其特征在于：所述用途是指以8-异戊烯基-4’-甲氧基黄酮醇类化合物作为活性成分用于制备预防或/和治疗色素脱失性疾病的药物或化妆品。

2.根据权利要求1所述的用途，其特征在于：所述的8-异戊烯基-4’-甲氧基黄酮醇类化合物具有式Ⅰ所示的化学结构通式：

式中的R1和R2各自独立选自氢、单糖基、低聚糖基、单糖衍生物基或低聚糖衍生物基。

3.根据权利要求2所述的用途，其特征在于：所述的单糖基选自鼠李糖基、葡萄糖基、核糖基中的任意一种；所述的低聚糖基是由鼠李糖基、葡萄糖基、核糖基中的任意2种或3种单糖基组成。

4.根据权利要求1所述的用途，其特征在于，所述的8-异戊烯基-4’-甲氧基黄酮醇类化合物是选自如下化合物中的任意一种或几种的组合：

5.根据权利要求1所述的用途，其特征在于：所述的色素脱失性疾病包括白癜风、斑驳病、白化病综合症、苯丙酮尿症、灰发症中的至少一种。

6.根据权利要求1所述的用途，其特征在于：所述的化妆品是用于使毛发变黑的护发品或用于使皮肤白斑变黑的护肤品。

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