CN1155715C

CN1155715C - 植物转化的改良方法

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Publication number: CN1155715C
Application number: CNB988004763A
Authority: CN
Inventors: K��¹��; K·德哈瑞恩
Original assignee: Plant Genetic Systems NV
Current assignee: Bayer CropScience NV
Priority date: 1997-02-20
Filing date: 1998-02-20
Publication date: 2004-06-30
Anticipated expiration: 2018-02-20
Also published as: CA2252612A1; AU727570B2; EP0900279A1; AU6002798A; EP0900279B1; DK0900279T3; DE69826596T2; CN1222939A; PT900279E; JP4199312B2; WO1998037212A1; US6372963B1; US6140553A; ES2229472T3; BR9805900B1; BR9805900A; ATE278026T1; CA2252612C; JP2000509612A; DE69826596D1

Abstract

将DNA片段整合进单子叶植物细胞基因组中的方法，该过程包括的步骤有：1)与DNA片段接触之前，在含有植物酚类化合物的培养基上培养未转化单子叶植物细胞的培养物一段时间，其时间足以刺激细胞分裂并增强外源DNA的整合能力；并且2)在所述DNA片段被未转化细胞吸收且稳定整合进未转化细胞基因组中的条件下，使未转化细胞与DNA片段相接触，产生转化细胞。

Description

植物转化的改良方法

发明背景

(i)发明领域

本发明涉及植物细胞、特别是单叶子植物细胞、更具体为玉米、水稻、小麦和大麦细胞的组织培养以及获得遗传转化植物细胞和植物的改良方法。

(ii)相关技术描述

在过去的几年中已发展起许多植物的遗传转化技术。这些方法的最终目的是获得转基因植物，其所有细胞都含有包含稳定整合到其基因组、尤其是核基因组中的目的基因的外源DNA(所谓的转基因)。

转化是一个复杂的过程，它总是包括使起始细胞与通常含有一个或多个外源目的基因的DNA接触。细胞与DNA的接触在有利于细胞吸收包括目的基因的DNA并将其整合入细胞基因组中的条件下进行。

用于转化的起始细胞通常是离体培养过一段时间的细胞。细胞与DNA接触之后，转化细胞一般需离体培养特定时期以便于从非转化细胞中分离转化细胞，并从转化细胞再生转化植株。

不同的植物转化方法已有所描述，并可划分为DNA直接转化法(例如电穿孔、PEG介导的DNA吸收、生物发射(biolistics))或农杆菌介导的DNA转移。Vasil(1994)和Christou(1994)综述了适合的禾谷类植物转化方法。农杆菌介导的DNA转移是DNA转移到植物细胞的最有效方式之一，且需要不同转化方法中所需的大概最少的技术硬件。此外在定量上，从农杆菌介导的DNA转移获得的转化植物的优越性在于，包含有较少数目的插入染色体上不同位置的转基因，并且较少发生转基因畸变。农杆菌介导的植物DNA转化基于某些农杆菌菌株具有使其Ti质粒的一部分(即T-DNA)导入植物细胞并将该T-DNA整合进细胞核基因组的能力。发现转移和整合的Ti质粒的部分已由特定DNA序列-即所谓的T-DNA左边界序列和右边界序列所标示，并且位于这些边界序列之间的天然T-DNA序列能够被外源DNA所取代(欧洲专利公告“EP”116718；Deblaere等，1987)。

农杆菌介导的单子叶植物转化已被多次报道(参见下文)。但是所报道方法的应用局限于特定的种或基因型，或需要使用特殊织组或特定农杆菌菌株。对于大多数报道的方法，转化率仍可大大提高。

Hooykaas-Van Solgteren等(1984)描述了对两个用致瘤型农杆菌菌株感染的单子叶种吊兰(Chlorophytum capense)和水仙属栽培品种‘Paperwhite’中Ti质粒基因表达的检测。

Hemalsteens等(1984)和Bytebier等(1987)描述用天然的根癌农杆菌分离菌，以及用包含非致癌型T-DNA的根癌农杆菌菌株对石刁柏(Asparagus officinalis)的转化。

美国专利5,164,310号描述通过用根癌农杆菌接种切离的或培养的植物茎尖而转化植物(包括玉米和小麦)的方法。

美国专利5,187,073号和5,177,010号描述了在幼苗含有快速分裂细胞的区域制造创伤并用Vir⁺根癌农杆菌接种伤口的产生转化禾本科(玉米)的方法。

PCT专利公开WO 92/09696描述利用单子叶植物(如玉米和水稻)的致密型胚发生愈伤组织(玉米中的I型愈伤组织)和未成熟幼胚(机械性致伤或酶消化性致伤)作为转化过程的起始材料。

EP 0604662 Al描述用含有所需基因的农杆菌属细菌在脱分化下或脱分化后的单子叶植物培养组织进行转化。EP 0672752 Al描述用农杆菌转化单子叶植物未脱分化的未成熟胚盾片(scutulum)。两个专利均描述利用的农杆菌菌种除具有Ti质粒或Ri质粒之外，还具有包含来源于Ti质粒pTiBo542毒性区的DNA片段。

Raineri等(1990)描述用农杆菌介导的基因转移系统，对盾片区受创伤的两种水稻栽培品种的胚来源培养物进行转化。

Chan等(1993)描述在含有番茄悬浮培养细胞的培养基上，用农杆菌菌株接种，对在存在2，4-二氯苯氧乙酸(2，4-D)的条件下已培养2天的水稻未成熟胚进行转化。

Mooney等(1991)描述通过农杆菌介导将卡那霉素抗性基因导入酶处理的小麦胚中的方法。

已有报道，在共培养之前通过细菌与乙酰丁香酮温育，诱导农杆菌菌株的Ti质粒或辅助质粒的vir基因以增强转化，并在植物细胞与细菌共培养期间添加乙酰丁香酮(Van Wordragen和Dons，1992；Jacq等1993；James等，1993)。

Guivarc’h等(1993)描述通过用乙酰丁香酮短暂预处理胡萝卜根圆盘10分钟，进行瞬时农杆菌介导转化胡萝卜根圆盘的改进。

本发明概述和目的

提供了将DNA片段整合进单子叶植物、尤其是玉米、水稻、小麦或大麦细胞基因组中的方法，包括以下步骤：

1)与DNA片段接触之前，在含有植物酚类化合物的培养基上，特别是在含有选自乙酰丁香酮、α-羟基-乙酰丁香酮、芥子酸、丁香酸、阿魏酸、儿茶酚、对羟基苯甲酸、β-resorcglic acid、原儿茶酸、焦性没食子酸(pyrrogallic acid)、没食子酸及香草醛的植物酚类化合物的培养基上，培育未转化单子叶植物细胞的培养物，其培养时间足以刺激细胞分裂并增强外源DNA的整合能力，时间最好为大约1至10天，特别是大约4至5天；并且

2)在所述DNA片段可被未转化细胞吸收且稳定整合进未转化细胞基因组中的条件下，尤其是通过电穿孔、用聚乙二醇的直接基因转移、用DNA包裹微粒的轰击或用含有所述DNA片段的农杆菌菌株共培养，使未转化细胞与DNA片段相接触，产生转化细胞。

可选地使转化细胞再生成转基因单子叶植物。

还提供了将DNA片段整合进玉米植株细胞基因组中的方法，包括以下步骤：

在与所述DNA片段相接触之前，将I型愈伤组织、最好是已切成片段的I型愈伤组织、特别是最大长度为0.5-5mm的片段与植物酚类化合物温育一段时间，其时间足以刺激所述细胞分裂并增强外源DNA整合的能力，最好约1至10天，特别是约4至5天，其中所述植物酚类化合物尤其是选自乙酰丁香酮、α-羟基-乙酰丁香酮、芥子酸、丁香酸、阿魏酸、儿茶酚、对羟基苯甲酸、β-resorcylic acid、原儿茶酸、焦性没食子酸、没食子酸及香草醛的植物酚类化合物；或者

在与D所述NA片段接触之前，在将I型愈伤组织切成片段、尤其是切成最大长度为0.5-5mm的片段之前，将所述I型愈伤组织在含有植物酚类化合物的培养基上温育一段足以刺激细胞分裂并增强外源DNA整合能力的时间；并且

2)在所述DNA片段可被未转化细胞吸收并稳定整合进未转化细胞基因组的条件下，尤其是通过电穿孔、用聚己二醇的直接基因转移、用DNA包裹微粒的轰击或用含有所述DNA片段的农杆菌菌株共培养，使DNA片段与未转化细胞相接触，产生转化细胞。

也提供了在存在植物酚类化合物时提高单子叶植物稳定转化频率的方法，其中所述的植物酚类化合物包含于在外源DNA与培养组织相接触之前植物细胞培养的培养基中。

还提供了含有至少两种植物酚类化合物的植物培养基组成。

最佳实施方案详述

本发明基于以下的最初观察，即在含有如乙酰丁香酮的植物酚类化合物的培养基上，培养植物愈伤组织、特别是玉米愈伤组织、更特别是精细切割的玉米I型愈伤组织碎片大约5天，极大地刺激了细胞分裂，产生通过农杆菌介导的转化将转移入细胞的外源基因整合进基因组的能力增强的可育愈伤组织，正如在标准条件下回收的转化细胞及转化植株的数目所反映的。

本处所用的“未转化细胞”指未与应用本发明方法时使用的特定DNA片段相接触的细胞。很明显，这种细胞也可以来源于先前用不同或相同DNA片段转化过的转基因植物或其组织。

本处所用的“转化效率”或“转化频率”可通过标准实验条件下(即就与外源DNA相接触的细胞量、传递的DNA量、DNA传递的类型和条件、一般的培养条件等角度看，属于标准或者正常)回收的转化细胞(或从各个转化细胞生长的转基因生物)的数目来计算。例如，用愈伤组织片段作为转化的起始材料时，可以每100个被转化愈伤组织碎片中所获得的转基因植物品系数目表示转化率。运用本发明方法可获得大约1％或更高的转化频率。

本处所用的转基因“植物品系”包括在再生过程中获得的源自一个培养细胞单位(如一个转化愈伤组织片)的一组转基因植物。通常，来自一个植物品系的植物具有遗传一致性，且源自一次转化事件，因而含有整合在相同的基因组位置处的相同转基因。但是，此处所定义的来自一个植物品系的各个植株可以源自单独的转化事件，尤其是用农杆菌介导的DNA转移时，因此可以互不相同。采用每100个起始愈伤组织片的植物品系数目来表示转化频率时，实际转化频率(转化事件/100个起始愈伤组织片)有可能更高。

适合本发明的“植物酚类化合物”或“植物酚类”指那些能够诱导阳性趋化反应的分离的取代酚类分子，特别是那些能够诱导含Ti质粒的农杆菌菌种、特别是含Ti质粒的根癌农杆菌中vir基因表达增强的取代酚类分子。Ashby等(1988)已描述了对植物酚类化合物趋化性反应的测量方法，而诱导vir基因表达的测量方法也已公知(Stachel等，1985；Bolton等，1986)。

人们认为，通过在含植物酚类化合物的培养基上培养植物组织而对转化频率产生的良好转化效果，大部分应归功于细胞分裂的诱导及将外源DNA导入植物细胞基因组的能力的提高。众所周知，大多数单子叶植物，尤其是禾谷类，受伤时不能以在大多数双子叶植物中所观察到的类似方式反应(Potrykus，1991)。人们认为外源提供植物酚类化合物可以触发类创伤反应，尤其是应用于单子叶植物时。在采用农杆菌介导的DNA转移时，通过预处理的植物组织吸收残余浓度的植物酚类化合物而进行的vir基因诱导也可以影响转化率，但据认为这种效应较不重要。事实上，在采用直接DNA转移法时也观察到同样的转化增强。

优选的植物酚类化合物是那些发现于植物细胞的创伤渗出液中的酚类化合物。最出名的植物酚类化合物之一是乙酰丁香酮，它存在于不同植物的许多创伤或完整细胞中，尽管其浓度不同。但是乙酰丁香酮(3，5-二甲氧基-4-羟基苯乙酮)并非唯一能够诱导vir基因表达的植物酚。其它例子有α-羟基-乙酰丁香酮、芥子酸(3，5-二甲氧基-4-羟基肉桂酸)、丁香酸(4-羟基-3，5-二甲氧基苯甲酸)、阿魏酸(4-羟基-3-甲氧基肉桂酸)、儿茶酚(1，2-二羟基苯)、对羟基苯甲酸(4-羟基苯甲酸)、β-resorcylic acid(2，4-二羟基苯甲酸)、原儿茶酸(3，4-二羟基苯甲酸)、焦性没食子酸(2，3，4-三羟基苯甲酸)、没食子酸(3，4，5-三羟基苯甲酸)以及香草醛(3-甲氧基-4-羟基苯甲醛)，这些酚类化合物是已知或期望能够在培养基中以同样的结果来替代乙酰丁香酮。在本文中所提及的分子量指植物酚类化合物。

可将植物酚类化合物单独或与其它植物酚类化合物一起加到植物培养基中。特别推荐的植物酚类化合物的组合物至少包括乙酰丁香酮和对羟基苯甲酸，但也预期其它两种或多种植物酚类化合物的组合能够协同作用增强转化频率。

此外，某些复合物，如渗透保护剂(osmoprotectant)(例如最好是浓度约为700mg/L的L-脯氨酸或甜菜碱)、植物激素(尤其是NAA)、冠瘿碱或糖，预期与植物酚类化合物组合加入时协同作用。

虽然本发明对于植物细胞、特别是玉米细胞的改良的农杆菌介导转化特别有用，但已经用植物酚类预处理的植物细胞培养物，特别是单子叶植物的培养物，可以用来采用如PEG介导的DNA转移、微粒轰击或电穿孔的直接DNA转移法获得较高的转化效率。因此本发明基本上通过在限定时期内在培养细胞的培养基中包含一种植物酚类化合物(如乙酰丁香酮)，提供对植物细胞、尤其是单子叶植物细胞、更特别是玉米细胞的现有遗传转化方法进行的改良。特别是，在或者通过电穿孔、PEG介导的DNA转移或微粒轰击，或最好通过农杆菌介导的DNA转移而直接导入细胞的外源DNA与细胞相接触的时刻之前，在含有乙酰丁香酮(100-200μM)的培养基上培养所述植物细胞或植物组织5天。

在最佳实施方案中，本发明方法可用于提高植物细胞、特别是玉米细胞农杆菌介导DNA转移的转化频率。

在植物细胞、特别是单子叶植物细胞遗传转化的许多传统方法中，用培养的细胞、组织或外植体作为起始材料，在能够促进外源DNA吸收入细胞基因组的条件下，将这种培养物中的细胞与含有至少一个目的基因(即转基因)的外源DNA相接触。适用于植物细胞、组织、器官或外植体培养的培养基通常为本领域技术人员所知。优选的植物培养基是那些化学组成已知的特定培养基。

在本发明的一个实施方案中，在细胞与外源DNA接触之前，最好将植物酚类化合物、尤其是将乙酰丁香酮加到培养基中大约4至5天或6天，至少约5天则最佳。我们认为在含有如乙酰丁香酮的植物酚类化合物的培养基中温育培养细胞的确切时段并不重要，但可能不应超过两周。1-10天、特别是3-7天似乎是理想时段，在接触时间之前培养大约4至5天或6天获得了最好结果。一般认为在接触时间之前约5天是植物酚类化合物加入培养基的有益时段。

应该指出，培养组织在含有植物酚类的培养基(特别是当组培培养基中含有没食子酸时)上进行培养之后，表现出褐变甚至有限坏死。然而，采用这些培养的细胞、组织或外植体能够获得更高的转化频率。

培养基中植物酚类化合物的浓度也被认为对整合型转化能力的发展有影响，这种变化取决于细胞性质(物种、组织外植体、一般培养条件等)。但是在特定浓度范围内影响微小，尤其当培养细胞的培养未超过7天时。培养基中植物酚类化合物的最佳浓度范围可能随物种(即组织、细胞或细胞培养物的来源)或所用组织类型而有所变动，但预计大约100μM-200μM对于许多应用(如用于玉米来源的材料)而言是适宜的浓度。最佳浓度也取决于所采用的特定植物酚类化合物的性质，尤其是取决于其促细胞分离的强度。

例如已发现乙酰丁香酮的最佳浓度大约为200μM，但是可用低至约25μM的浓度获得好的转化率效果。同样地，预期高至约400μM的较高浓度将产生同样效果。

可将类似浓度应用于其它植物酚类化合物，同时根据本发明能够通过实验容易地建立起最佳浓度。

如上所述，植物转化方法通常包括在培养组织与外源DNA相接触之前对细胞、细胞培养物、组织或外植体进行培养。已将几种组织描述为转化方法的起始材料，包括但不限于干种籽、未成熟胚、未成熟花序、花药、小孢子、盾片、茎节、幼叶基、胚轴外植体、根(特别是根尖)、致密胚生成愈伤组织(如玉米中的I型愈伤组织)、疏松胚性愈伤组织(如玉米中的II型愈伤组织)、悬浮培养物、悬浮细胞团的培养物，体细胞胚以及茎尖。预期在与外源DNA接触之前，在培养这些组织、细胞、细胞培养物或外植体的培养基中包含植物酚类化合物、特别是乙酰丁香酮，将提高转化效率，特别是采用农杆菌介导的转化时。

很显然，每当用到“在(植物)培养基上进行培养”时，所述培养基或是液态或是固态。本发明框架中的植物培养基包含至少一种植物酚类化合物。

不用说，如先有技术领域中的广泛报道的，当将再生转基因植物、特别是表型正常的植物作为转化方法的最终目的时，起始材料应该能够再生。

在特别优选的实施方案中，通过在含有植物酚类、最好是乙酰丁香酮的培养基上培养致密的再生型愈伤组织(例如玉米I型愈伤组织)，产生转化感受态植物细胞，最好是农杆菌转化感受态植物细胞。为此，将致密愈伤组织割成更小片段。所得到的愈伤组织应当全部或至少一部分含有可再生(如胚生成)扇形体(sector)或愈伤组织部分。该愈伤组织片段平均最大长度也最好为0.5至5mm，特别是为1至2mm，更特别为1.25至1.75mm，并最小长度最好约为0.1mm。不过使用大至约1cm的较大I型愈伤组织片段也便利。在含植物酚类化合物的培养基上培养之后，可将愈伤组织与外源DNA、最好是与含外源DNA的农杆菌相接触，而不用再经创伤或用酶预处理。

或者，可在含植物酚类化合物的培养基上培养未经创伤(即切割)的致密愈伤组织，然后在接触步骤之前将其创伤，即切割成较小片段，特别是具有以上所述大小的片段。

在另一实施方案中，通过在含有植物酚类(最好是乙酰丁香酮)的培养基上培养未成熟胚，最好是玉米未成熟胚，产生转化感受态细胞，特别是农杆菌转化感受态细胞。在这方面，对于如玉米的植物，最好是其未成熟胚的最大长度为约0.5至2mm，最好为0.5至1.5mm，虽然长度为0.5至1mm的较小胚也可用。在含植物酚类的培养基上培养之后，未成熟胚可与外源DNA接触，最好是与含外源DNA的农杆菌相接触，不用进一步产生创伤成用酶预处理。

已经发现运用本发明，不同基因型的玉米适合于农杆菌介导的DNA转移，特别是玉米PHH[(Pa91×H99)×H99]、Pa91 HE89或PHP[(Pa91×H99)×Pa91]。因此预期本发明能够不受基因型限制而应用于特别是玉米的转化。

按照本发明预培养植物细胞，特别是玉米细胞，可提高农杆菌介导DNA转移的转化效率，并预计这种效果与所用的农杆菌宿主的染色体背景、Ti质粒类型、辅助质粒或T-DNA载体无关。因此本发明扩大了可有效使用的农杆菌菌株的范围。

特别优选的细菌染色体背景由根癌农杆菌C58C1(Van Larebeke等，1974)、A136(Watson等，1975)或LBA4011(Klapwijk等，1980)提供。

在一个最佳实施方案中，用于转化用植物酚类化合物预培养的植物组织的农杆菌菌株含有L，L-succinamopine型Ti质粒，最好是解除武装的Ti质粒，如pEHA101。

在另一个最佳实施方案中，用于转化用植物酚类化合物预培养的植物组织的农杆菌菌株含有冠樱碱型Ti质粒，最好是解除武装的Ti质粒，诸如pAL4404。一般而言，使用冠樱碱型Ti质粒或辅助质粒时，最好是virF基因缺失或失活(Jarschow等，1991)。

本发明方法还可与特定农杆菌菌株组合使用，进一步提高转化效率，例如由于存在突变型或嵌合型virA基因或virG基因而使vir基因的表达和/或诱导有所改变的农杆菌菌株(如Hansen等，1994；Chem和Winans 1991；Scheeren-Groot等，1994)。

在另一个实施方案中，包含最好是连接在多考贝质粒上的额外virG基因考贝、特别是来自pTiBo542的所谓超级virG基因的农杆菌菌株可用来进一步提高转化效率。

在本发明的再一个实施方案中，所用的农杆菌菌株包含额外的virB11基因考贝，特别是在农杆菌中表达的来自pTiBo542的virB11基因。这可最好通过提供含有virB11编码区的嵌合基因完成，其中所述编码区操作性地连接在能够在农杆菌中表达的启动子(例如经分离的virB启动子)上，而没有virB操纵子的间插编码区。

正如本领域技术人员所知，要与植物细胞、特别是与玉米细胞共培养的农杆菌细胞，可以或者与乙酰丁香酮或另一植物酚类化合物预培养，或从它们的培养基中分离之后直接使用。Vernade等(1988)描述了对根癌农杆菌特别适宜的诱导条件。

本发明方法原理上可用于用任何外源DNA转化植物细胞，特别是玉米细胞。所述外源DNA通常含有至少一个目的基因，它包括1)启动子区，具有能够指导真核细胞(如被转化的植物物种)中DNA转录为RNA的启动子，以及2)编码RNA(如反义RNA或核酶)或蛋白质的编码区。多数情况下目的基因还将包括3)含有多腺苷酸化信号的真核基因的3’端非翻译区。可选择启动子来指导真核生物所选组织中的表达。例如，已知可选择性地指导在植物雄蕊细胞(如绒毡层)中表达的启动子，并已将这样的启动子用于产生雄性不育植物和其它对产生杂种有用的植物(EP 344029；EP 412911；WO 9213956；WO9213957；Mariani等，1990；Mariani等，1992)。

本发明方法中所使用的外源DNA最好还含有选择标记基因，它的表达允许从非转化细胞(或生物)中筛选转化细胞(或生物)。这种选择标记基因通常编码使细胞对抗生素或其它通常对细胞有毒的化学化合物形成抗性的蛋白。因此，植物中的选择标记基因也可以编码对除草剂形成抗性的蛋白，所述除草剂例如为含有谷酰胺合成酶抑制剂(如膦丝菌素)作为活性成份的除草剂。这种基因的例子有编码如sfr基因或sfrv基因的膦丝菌素乙酰转移酶的基因(EP 242236；EP 242246；DeBlock等，1987)。

因此本发明提供一个快速、有效并且可育的方法，用于提高植物细胞DNA转移、特别是农杆菌介导的效率，所述植物细胞特别是单叶植物细胞，更特别是玉米细胞，但也可以是水稻、小麦或大麦细胞。此外，与直接基因转移法相比，农杆菌介导转化法可产生数目较多的转基因植物，特别是玉米，其中所述植物具有在其细胞基因组中整合了有限数目的转基因考贝，特别是一个转基因考贝。另外，通过农杆菌介导转化所获得的转基因植物，特别是转基因玉米，其基因组中整合有一个以上的转基因考贝，可频繁地产生子代植株，其中所述转基因的不同考贝是单独遗传的，可允许后代植株中不同转基因考贝分离。因此，预期用本发明的转化方法所获得的转基因植物群体中比从直接基因转移法所获的转基因植物群体中发现更大比例的具有所需特征的“原种”转基因植物。虽然本发明特别适用于单子叶植物，但预期用双子叶植物的培养细胞作为本发明方法的起始材料也将获得相同的结果。

以下的实施例详细描述本发明方法。除非在实施例中有所指明，所有的重组DNA方法均按以下书中描述的标准方案进行：Sambrook等(1989)的分子克隆：实验室手册，第二版，冷泉港实验室出版(纽约)以及Ausnbel等(1994)分子生物学现行方法(美国)的第一卷和第二卷。植物分子操作的标准材料和方法描述于BIOS科学出版有限公司(UK)和Blackwecl科学出版社(UK)联合出版的R.D.D.Croy的PlantMolecular Biology Labfax(1993)。

在实施例及本发明描述中，引用了以下序列表中的序列：

SEQ ID No.1 pGVS71中T-DNA的核苷酸序列

SEQ ID No.2 含adhl内含子的bar基因编码区的核苷酸序列

SEQ ID No.3 pGVS8中T-DNA的核苷酸序列

SEQ ID No.4 寡核苷酸VG40的核苷酸序列

SEQ ID No.5 寡核苷酸VG41的核苷酸序列

实验：实施例中所用的培养基、质粒及细菌菌株

1.1.培养基

在所有实施例中，采用以下植物组培培养基：

-MahiVII：补充有100mg/L酪蛋白水解物、6mM L-脯氨酸、0.5g/L2-(N-吗啉代)乙磺酸(MES)、0.2M甘露醇、2％蔗糖、1mg/L2，4-二氯苯氧乙酸(2，4-D)、2.5g/L脱乙酰吉兰糖胶的N6培养基(chu等，1975)，调pH值为5.8。

-LSIDhy1.5VII：补充有0.5mg/L尼克酸、0.5mg/L盐酸吡哆醇、1mg/L盐酸硫胺素、100mg/L肌醇、6mM L-脯氨酸、0.5g/LMES、20g/L蔗糖、10g/L葡萄糖、1.5mg/L 2，4-D、2.5g/L脱乙酰吉兰糖胶的MS盐(Murashige和Skoog，1968)，调pH值为5.2。

-LSI：MS盐，补充有如LSIDhy1.5VII中的维生素、1g/L酪蛋白氨基酸、0.2M蔗糖、0.2M葡萄糖、1.5mg/L2，4-D、2.5g/L脱乙酰吉兰糖胶，调pH值为5.2。

-Ahx1.5VIIp500ino1000ppT 10：MS盐，补有1000mg/L肌醇、0.5g/L MES、30g/L蔗糖、10g/L葡萄糖、1.5mg/L 2，4-D、2.5g/L Phytagel、10mg/L glufosinate-ammonium、500mg/L羧苄青霉素，调pH值为5.8。

-Mh1VIIp500ppT5：补充有0.5g/L MES、20g/L蔗糖、1mg/L2，4-D、5mg/L glufosinate-ammonium、500mg/L羧苄青霉素的N6培养基，调pH值为5.8。

-A37VIIp500ppT2：补充有0.5g/L MES、30g/L蔗糖、5mg/L玉米素、2.5g/L phytagel、2mg/L glufosinate-ammonium、500mg/L羧苄青霉素的MS培养基，调pH值为5.8。

-LSIIDhy1.5XI：与LSIDhy 1.5 VII培养基一致，但其中的6mML-脯氨酸被1g/L酪蛋白氨基酸所取代，且2.5g/L脱乙酰吉兰糖胶被0.5％琼脂BRL Utlra Pure取代。

-A6％VIIp500ppT2：补充有0.5g/L MES、60g/L蔗糖、2.5g/Lphytagel、2mg/L glufosinate-ammonium、500mg/L羧苄青霉素的MS培养基，调pH值为5.8。

1.2.T-DNA载体：

在所有实施例中，采用以下T-DNA载体：

-pGSV71：是来自pGSC1700(Cornelissen和Vandewiele，1989)的T-DNA载体，不同之处是缺少β-内酰胺酶基并含有特征为SEQ IDNo.1序列的T-DNA。pGVS71含有操作性连接到CaMV35S启动子和胭脂碱合酶基因3’末端的选择性嵌合bar标记基因。

-pTCO114：是与pGSV71相似的T-DNA载体，所含有的T-DNA的bar基因序列(来自SEQ ID No.1的核苷酸位置1437至核苷酸位置1988的核苷酸序列)已被包含来自玉米adh1基因内含子的bar基因序列(来自SEQ IN NO.2)所置换。

-pTCO121：是载有源自pTiBo542的额外virG基因的T-DNA，所述virG基因包含在源自pTiBo542的约1.3kb的BglII-SphI片段上。该T-DNA基本上与pTCO114的相同。通过以下方法构建该载体：

从pCNL2(Liu等，1992)纯化约1.3kb的BglII-SphI片段。该片段含有virB操纵子的3’末端、完整的virG基因以及来自pTiBo542的virC操纵子3’末端。用T4聚合酶将该片段处理成平端，并与XbaI线性化和克列诺(Klenow)处理的pGSV8相连接，产生pGSV15。pGSV8是源自pGSC1700(Cornelissen和Vandewiele，1989)的T-DNA载体，不同之处在于缺少β-内酰胺酶基并含有特征为SEQ ID No.3序列的T-DNA。在下一个步骤中，将载有嵌合选择性bar标记的T-DNA导入pGSV15中。为此，用来自pTCO114的含有T-DNA(右边界除外)的约4kb EcoRI-BstEII片段取代pGSV15(EcoRI位点在pGSV15的T-DNA中)的约1.2kbEcoRI-BI-BstEII片段，产生pTCO121。

-pVE200：该T-DNA载体载有与pTCO121相同的T-DNA和类似的包含virB操纵子3’末端(包括virB开放阅读框)的pTiBo542片段、完整的virG基因和virC操纵子3’末端，但是其中virB操纵子的3’末端被经PCR扩增的virB启动子片段操作性地连接(即在其之前)。以以下方式构建该载体：

-用引物VG40(SEQ ID No.4)和VG41(SEQ ID No.5)并以来自A348(pSM30)(Stachel和Nester，1986)的总DNA为模板，按标准的聚合酶链式反应扩增virB启动子片段。得到的约390bp片段(基本上相应于EMBL检索J03216号中从核苷酸475至核苷酸764的序列)含有如Das等(1986)所描述的virB启动子，将其用XbaI和NheI消化，并与经XbaI线性化的pCNL2(Lin等，1992)相连接，产生pVE194。在pVE194中，virB操纵子的3’末端受virB启动子的转录调控。

-然后将在virB启动子控制下的含有pTiBo542的virB操纵子3’末端与pTiBo542的virG基因的DNA片段，通过pVE194的约1.6kb XbaI-BglII片段、pVE194的约1.3kb BglII-SphI片段和pGSV8包含T-DNA的约7.2kb XbaI-SphI片段之间的三种方式的连接，导入T-DNA载体中。获得的质粒命名为pTVE197。

-通过连接以下三个片段，将pTCO114的选择标记基因导入pTVE197：

i)pTVE197的约5.3kb BanII-BstEII片段，含有virB的3’末端和virG基基；

ii)pTVE197的约3.7kb BanII-EcoRI片段，含有T-DNA右边界；

iii)pTCO114的约4kb EcoRI-BstEII片段，含有嵌合的选择性bar基因和T-DNA左边界；

产生T-DNA载体pVE200。

1.3.根癌农杆菌菌株：

将T-DNA载体pGSV71、pTCO114、pTCO121和pVE200通过三亲交配法(Ditta等，1980)导入含有辅助Ti质粒pAL4404或EHA101、包括辅助质粒pEHA101的农杆菌菌株LBA4404中，筛选对链霉素(300μg/ml)和壮观霉素(100μg/ml)的抗性。

在所有实施例中采用下列菌株：

菌株A3593：包含pGSV71的LBA4404

菌株A3532：包含pTCO121的LBA4404

菌株A3638：包含pVE200的LBA4404

菌株A3460：包含pTCO114的EHA101

菌株A3533：包含pTCO121的EHA101

菌株A3637：包含pVE200的EHA101

实施例

实施例1.乙酰丁香酮预处理的玉米I型愈伤组织的农杆菌介导的转化

基本上按WO 92/09696中的描述获得I型愈伤组织片段。从玉米品系(Pa91×H99)×H99(PHH品系)授粉后9-12天的种子上切取未成熟胚，表面消毒后置于MahilVII培养基上诱导I型愈伤组织。在相同培养基上每隔一个月传代培养I型愈伤组织约两个月至六个月。然后，将I型愈伤组织精细切割成平均长度约为1.5mm的片段，并在补充有100-200μM乙酰丁香酮的LSIDhy1.5VII培养基上培养所获得的片段5天。收集预诱导愈伤组织片并不经进一步创伤而浸入适合的农杆菌菌株悬浮液中约3分钟至约20分钟。通过以下途径获得该细菌悬液：细菌在MG培养基[补充有2g/L葡萄糖的基本A培养基(Jeffrey Miller，1972)或AB培养基(Chilton等，1974)上生长3天至6天。收获细菌，在补充有100-200μM乙酰丁香酮的LSI液体培养基中，以大约5×10⁹细胞/ml的浓度重悬浮。

在细菌悬液中浸过之后，在补充有100-200μM乙酰丁香酮的LSIIDhy1.5XI培养基上，于约25℃共培养愈伤组织片段3天至6天(LBA-型菌株为3天，EHA-型菌株为6天)。

共培养之后，将组织转至Ahx1.5VIIp500ino1000ppT10中培养3周至4周。将正在增殖的膦丝菌素(PPT)抗性愈伤组织切下，在MhVIIp500ppT5上传代培养至少两次，隔3周传代培养一次。将胚生成ppT抗性愈伤组织置于再生培养基(A37VIIp500ppT2)上，并在相同培养基上每隔10天至14天传代培养胚生成组织。将小植株转至含有供再一进生长的A6％VIIp500ppT2培养基的玻璃容器中，并将发育中的苗转入补充有1.5％蔗糖的半固体MS培养基中，使其进一步长大和生根。检测植株的膦丝菌素乙酰转移酶(PAT)活性，将PAT阳性植株转至温室。通过Southern杂交检测PAT阳性植株中是否存在所述转基因。

表1.用或不用乙酰丁香酮预处理，玉米PHH品系I型愈伤组织农

杆菌介导转化的平均转化效率总结

农杆菌菌株	不用预处理的大致平均转化频率(％)	预处理的大致平均转化频率(％)
农杆菌菌株	不用预处理的大致平均转化频率(％)	预处理的大致平均转化频率(％)	A3460	＜0.1	0.3
A3533	＜0.1	0.8	A3460	＜0.1	0.3
A3533	＜0.1	0.8	A3638	＜0.1	0.9
A3637	＜0.1	0.8	A3638	＜0.1	0.9

在对照试验中，I型愈伤组织片段未经过在含乙酰丁香酮的培养基上培养以及如实验部分所描述的与农杆菌菌株共培养而进行预处理，虽然在每一例中都获得了PAT阳性植株，但其平均转化率从未超过0.1％(见表1)。

乙酰丁香酮的预处理使通过与农杆菌菌株共培养的I型愈伤组织的转化效率至少提高3倍。用乙酰丁香酮预处理的约1700个愈伤组织片段与菌株A3460共培养，产生5个PAT阳性品系(平均转化频率约为0.3％；见表1)。

约4000个预处理的愈伤组织片段(对每个实验系列而言)，与农杆菌菌株A3638、A3533和A3637共培养后，分别产生37、30和33个PAT阳性植株品系(平均转化频率约为1％)。因此在这些试验中，转化频率提高了至少约7倍至10倍。

通过用乙酰丁香酮预处理获得的玉米植株品系(Pa91×H99)×Pa91(PHP)和Pa91的I型愈伤组织的共培养，也获得了转化率增高。

实施例2.存在附加的嵌合virBII基因提高农杆菌介导转化效率

按实施例1的描述获得I型愈伤组织片段，并在补充有100μM乙酰丁香酮的LSIDhy1.5VII培养基上培养5天，然后与农杆菌菌株A3532和A3638共培养。甚至用乙酰丁香酮预处理，从菌株A3532仅获得了1个PAT阳性植株(转化频率＜0.1％)。但是，T-DNA载体上位于virBII开放阅读框之前的功能性virB启动子的存在，使转化效率(见表1)提高了至少几乎10倍。

实施例3.用不同植物酚类化合物预处理的玉米I型愈伤组织的农杆菌介导转化

按实施例1的描述获得I型愈伤组织片段，并在补充有100μM表II中植物酚类化合物的LSIDhy1.5VII培养基上培养5天。大约200个预诱导的愈伤组织片段与农杆菌菌株A3637(或A3638)共培养。所获得的PAT阳性品数目和转化频率总结于表II。

表II.不同植物酚类化合物对农杆菌介导的转化频率的影响

植物酚类化合物	PAT-阳性品系数	转化频率(％)
植物酚类化合物	PAT-阳性品系数	转化频率(％)	没食子酸	3	1.5
香草醛	4	2	没食子酸	3	1.5
香草醛	4	2	儿茶酚	1	0.5
3，4-二羟基苯甲酸	2	1	儿茶酚	1	0.5
3，4-二羟基苯甲酸	2	1	对羟基苯甲酸	2	1
乙酰丁香酮	2	1	对羟基苯甲酸	2	1
乙酰丁香酮	2	1	2，4-二羟基苯甲酸	1	0.5

实施例4.用乙酰丁香酮预处理玉米I型愈伤组织，可提高电穿孔转化频率

将得自I型愈伤组织并在如实施例1所描述在含100μM乙酰丁香酮的培养基上预培养5天的精细切割的愈伤组织碎片，不经进一步创伤而如WO 92/09696所描述的进行电穿孔。简单地说，将50个愈伤组织碎片重悬浮于100μl EPM-KCl缓冲液中，并于室温预质壁分离3小时。然后在EPM+KCl缓冲液中漂洗愈伤组织碎片，并转至电穿孔杯(electrocuvette)里的EPM+KCl缓冲液中。加入质粒DNA(10μg PDE110)，并于室温与愈伤组织片段一起温育约1小时。在标准条件(1个脉冲，起始场强为来自900μF电容的375V/cm)下进行电穿孔。从未将愈伤组织置于冰上。筛选膦丝菌素(phosphinotrin)抗性愈伤组织并按描述(WO 92/09696)使植株再生。按描述(WO 92/09696)测定膦丝菌素(phosphinotrin)乙酰转移酶活性。

大约5640个未经乙酰丁香酮预处理的愈伤组织碎片经过对照电穿孔获得13个PAT阳性植株(约0.23％)，而大约530个用乙酰丁香酮预处理的愈伤组织片段经过电穿孔获得4个PAT阳性植株(约0.75％)。因此精细切割的I型愈伤组织碎片经过在含100μM乙酰丁香酮的培养基上培养5天的预处理后，转化频率提高了约3倍。

实施例5.植物酚类组合物进一步提高转化频率

按实施例1的描述获得I型愈伤组织片段，并在补充有200μM乙酰丁香酮或100μM乙酰丁香酮和100μM对羟基苯甲酸的组合物的LSIDhy1.5VII培养基上培养5天。约250个愈伤组织片与农杆菌菌株A3533共培养。在乙酰丁香酮上预诱导之后，在含PPT的培养基上获得2个苗再生品系(包括1个PAT阳性品系)(频率约为1％)；而在乙酰丁香酮外加对羟基苯甲酸上预诱导后，在含PPT的培养基上获得7个苗再生品系(包括5个PAT阳性品系)(频率约为3％)。

实施例6.对实施例1-5中经农杆菌介导转化获得的转基因玉米植株的分析

通过Southern杂交分析先前实施例的转基因玉米植株。

首先，证实是否所有从单个转基因愈伤组织系再生的转基因植株都是相同的或它们是否来自独立的转化事件。通过Southern分析得自24个独立转基因愈伤组织系的所有再生植株，鉴定了37个不同类型的T-DNA整合。换句话说，这24个植株系(如说明书中所定义)代表至少37个独立的转化事件。因此，以每100个转化愈伤组织片中所获得的转基因植株系数目为表示的转化率，低估了实际的转化频率。

接着，通过Southern杂交分析了不同0玉米品系中转基因的考贝数。所分析的大多数转化系(T0)显示相当简单的T-DNA整合模式(少于4个考贝)。大约1/3的所分析转基因系(56/148)具有单考贝的T-DNA整合。只有有限数目的品系(＜10％)具有较复杂的T-DNA整合模式(＞4考贝)。

还分析了先前实施例中转基因玉米植株后代中转基因的分离模式。在从57个独立转基因愈伤组织系再生的113株植物中，用Basta除草剂喷洒法监测其PAT活性的分离。在再生自32个独立转基因愈伤组织系的74株植物后代中，观察到了1∶1的PAT活性分离，表明在T0代植物中除草剂抗性转基因是以1个或多个紧密相连的考贝存在的。在再生自18个独立转基因愈伤组织系的31个植物后代中，所有植株均可耐受Basta除草剂的喷洒，或耐受型的植株明显多于敏感型植株，表明在T0植株中存在二个或更多的非连锁考贝。最后，在再生自7个独立转基因愈伤组织系的14个植物后代中，未观察到耐受植株，或敏感型植株明显多于耐受型植株。后面这些植株没有进行进一步分析。

对53个独立转化玉米植株(T0)中每一个的2个Basta除草剂抗性T1后代所进行的Southern分析，揭示在约70％的受分析情况(35/53)中，两个后代植株均具有与T0亲本植株品系相一致的T-DNA整合模式。在约18％的例子(10/53)中观察到了分离。

参考文献Ashby et al.(1988)J.Bacteriol.170：4181-4187Ausubel et al.(1994) Current Protocols in Mo/ecular Biology，Current Protocols，USA.Bolton et al.(1986) Science 232：983-985；Bytebier et al.(1987)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 84：5345-5349Chan et al.(1993)Plant Mol.Biol.22：491-506Chen and Winans (1991)J.Bacteriol.173：1139-1144Chilton et al.(1974)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 71：3672-3676Chu et al.(1975)Sci.Sin.Peking，18，659-668Christou(1994)Agro-Food Industry Hi-Tech 17-27Cornelissen and Vandewiele(1989)Nucl.Acids Res.17：833-.R.D.D.Croy(1993) Plant Molecular Biology Labfax BIOS Scientific Publications Ltd

(UK)and Blackwell Scientific Publications，UK.Das et al.(1986)Nucl.Acids Res.14：1355-1364Deblaere et al.(1987)Meth.Enzymol.153：277-293De Block et al.(1987)EMBO J.6：2513-2518).Ditta et al.(1980)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 77：7347-7351Guivarc′h et al.(1993)Protoplasma 174：10-18Hansen et al.(1994)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 91：7603-7607Hernalsteens et al.(1984)EMBO J.Hooykaas-Van Slogteren et al.(1984)Nature 311：763-764Jacq et al.(1993)Plant Cell Reports 12：621-624James et al.(1993)Plant Cell Reports 12：559-563)Jarchow et al.(1991)，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 88：10426-10430Klapwijk et al.(1980)J.Bacteriol.，141，128-136Liu et al.(1992)Plant Mol.Biol.20：1071-1087Mariani et al.(1990)Nature 347：737-741Mariani et al.(1992)Nature 357：384-387Miller(1972)“Experiments in Molecular Genetics”Cold Spring Harbor Lab.，Cold

Spring Harbor，New YorkMooney et al.(1991)Plant Cell，Tissue，Organ Culture 25：209-218Murashige and.Skoog(1968)Physiol.Plant.15，473-497Potrykus(1991)Annu.Rev.Plant Physiol.Plant Mol.Biol.42，205-225Raineri et al.(1990)Bio/technology 8：33-38Sambrook et al.(1989)Molecular Cloning：A Laboratory Manual，Second Edition，

Cold Spring Harbor Laboratory Press，NYScheeren-Groot et al.(1994)J.Bacteriol 176：6418-6426Stachel et al.(1985)Nature 318：624-629Stachel and Nester(1986)EMBO J.5：1445-1454Van Laerebeke et al.(1974)Nature 252，169-170Van Wordragen and Dons(1992)Plant Mol.Biol.Rep.10：12-36Vasil(1994)Plant Mol.Biol.25：925-937Vernade et al.(1988)J. Bacteriol.170：5822-5829Watson et al.(1975)J.Bacteriol 123，255-264

序列表

(1)一般资料

(i)申请人：

(A)姓名：Plant Genetic Systems N.V.

(B)街道：Jozef Plateatraat 22

(C)城市：Gent

(E)国家：比利时

(F)邮政编码(ZIP)：B-9000

(G)电话：32 9 235 84 54

(H)传真：32 9 223 19 23

(ii)发明名称：植物转化的改良方法

(iii)序列数：5

(iv)计算机可读形式

(A)媒体类型：软盘

(B)计算机：IBM PC兼容机

(C)操作系统：PC-DOS/MS-DOS

(D)软件：PatentIn Release#1.0，版本1.30

(2)SEQ ID NO：1的信息：

(i)顺序特征：

(A)长度：2345个碱基对

(B)类型：核酸

(C)链型：双链

(D)拓扑学：线性

(ii)分子类型：其它核酸

(A)说明：/desc＝“pGSV71的T-DNA”

(ix)特征：

(A)名称/关键词：-

(B)位置：1…25

(D)其它信息：/标记＝RB

/注释＝“T-DNA右边界”

(ix)特征：

(A)名称/关键词：-

(B)位置：53…1436

(D)其它信息：/注释＝“CaMV35S P3启动子”

(ix)特征：

(A)名称/关键词：-

(B)位置：53…1436

(D)其它信息：/产物＝“膦丝菌素(phosphintrin)乙酰转移

酶”

/标记＝bar

/注释＝“磷酸乙酰转移酶编码区”

(ix)特征：

(A)名称/关键词：-

(B)位置：2007…2266

(D)其它信息：/标记＝3’nos

/注释＝“含农杆菌T-DNA胭脂碱合酶多腺苷酸化

信号的3’非翻译区”

(ix)特征：

(A)名称/关键词：-

(B)位置：2321…2245

(D)其它信息：/标记＝LB

/注释＝“T-DNA左边界”

(xi)顺序描述：SEQ ID NO：1：

AATTACAACG GTATATATCC TGCCAGTACT CGGCCGTCGA CCGCGGTACC CGGAATTCCA 60

ATCCCACCAA AACCTGAACC TAGCAGTTCA GTTGCTCCTC TCAGAGACGA ATCGGGTATT 120

CAACACCCTC ATACCAACTA CTACGTCGTG TATAACGGAC CTCATGCCGG TATATACGAT 180

GACTGGGGTT GTACAAAGGC AGCAACAAAC GGTGTTCCCG GAGTTGCGCA TAAGAAGTTT 240

GCCACTATTA CAGAGGCAAG AGCAGCAGCT GACGCGTATA CAACAAGTCA GCAAACAGAT 300

AGGTTGAACT TCATCCCCAA AGGAGAAGCT CAACTCAAGC CCAAGAGCTT TGCGAAGGCC 360

CTAACAAGCC CACCAAAGCA AAAAGCCCAC TGCTCACGCT AGGAACCAAA AGGCCCAGCA 420

GTGATCCAGC CCCAAAAGAG ATCTCCTTTG CCCCGGAGAT TACAATGGAC GATTTCCTCT 480

ATCTTTACGA CTTAGGAAGG AAGTTCGAAG GTGAAGGTGA CGACACTATG TTCACCACTG 540

ATAATGAGAA GGTTAGCCTC TTCAATTTCA GAAAGAATGC TGACCCACAG ATGGTTAGAG 600

AGGCCTACGC AGCAGGTCTC ATCAAGACGA TCTACCCGAG TAACAATCTC CAGGAGATCA 660

AATACCTTCC CAAGAAGGTT AAAGATGCAG TCAAAAGATT CAGGACTAAT TGCATCAAGA 720

ACACAGAGAA AGACATATTT CTCAAGATCA GAAGTACTAT TCCAGTATGG ACGATTCAAG 780

GCTTGCTTCA TAAACCAAGG CAAGTAATAG AGATTGGAGT CTCTAAAAAG GTAGTTCCTA 840

CTGAATCTAA GGCCATGCAT GGAGTCTAAG ATTCAAATCG AGGATCTAAC AGAACTCGCC 900

GTGAAGACTG GCGAACAGTT CATACAGAGT CTTTTACGAC TCAATGACAA GAAGAAAATC 960

TTCGTCAACA TGGTGGAGCA CGACACTCTG GTCTACTCCA AAAATGTCAA AGATACAGTC 1020

TCAGAAGACC AAAGGGCTAT TGAGACTTTT CAACAAAGGA TAATTTCGGG AAACCTCCTC 1080

GGATTCCATT GCCCAGCTAT CTGTCACTTC ATCGAAAGGA CAGTAGAAAA GGAAGGTGGC 1140

TCCTACAAAT GCCATCATTG CGATAAAGGA AAGGCTATCA TTCAAGATGC CTCTGCCGAC 1200

AGTGGTCCCA AAGATGGACC CCCACCCACG AGGAGCATCG TGGAAAAAGA AGACGTTCCA 1260

ACCACGTCTT CAAAGCAAGT GGATTGATGT GACATCTCCA CTGACGTAAG GGATGACGCA 1320

CAATCCCACT ATCCTTCGCA AGACCCTTCC TCTATATAAG GAAGTTCATT TCATTTGGAG 1380

AGGACACGCT GAAATCACCA GTCTCTCTCT ATAAATCTAT CTCTCTCTCT ATAACCATGG 1440

ACCCAGAACG ACGCCCGGCC GACATCCGCC GTGCCACCGA GGCGGACATG CCGGCGGTCT 1500

GCACCATCGT CAACCACTAC ATCGAGACAA GCACGGTCAA CTTCCGTACC GAGCCGCAGG 1560

AACCGCAGGA GTGGACGGAC GACCTCGTCC GTCTGCGGGA GCGCTATCCC TGGCTCGTCG 1620

CCGAGGTGGA CGGCGAGGTC GCCGGCATCG CCTACGCGGG CCCCTGGAAG GCACGCAACG 1680

CCTACGACTG GACGGCCGAG TCGACCGTGT ACGTCTCCCC CCGCCACCAG CGGACGGGAC 1740

TGGGCTCCAC GCTCTACACC CACCTGCTGA AGTCCCTGGA GGCACAGGGC TTCAAGAGCG 1800

TGGTCGCTGT CATCGGGCTG CCCAACGACC CGAGCGTGCG CATGCACGAG GCGCTCGGAT 1860

ATGCCCCCCG CGGCATGCTG CGGGCGGCCG GCTTCAAGCA CGGGAACTGG CATGACGTGG 1920

GTTTCTGGCA GCTGGACTTC AGCCTGCCGG TACCGCCCCG TCCGGTCCTG CCCGTCACCG 1980

AGATCTGATC TCACGCGTCT AGGATCCGAA GCAGATCGTT CAAACATTTG GCAATAAAGT 2040

TTCTTAAGAT TGAATCCTGT TGCCGGTCTT GCGATGATTA TCATATAATT TCTGTTGAAT 2100

TACGTTAAGC ATGTAATAAT TAACATGTAA TGCATGACGT TATTTATGAG ATGGGTTTTT 2160

ATGATTAGAG TCCCGCAATT ATACATTTAA TACGCGATAG AAAACAAAAT ATAGCGCGCA 2220

AACTAGGATA AATTATCGCG CGCGGTGTCA TCTATGTTAC TAGATCGGGA AGATCCTCTA 2280

GAGTCGACCT GCAGGCATGC AAGCTTAGAT CCATGGAGCC ATTTACAATT GAATATATCC 2340

TGCCG 2345

(2)SEQ ID NO：2的信息：

(i)顺序特征：

(A)长度：1086个碱基对

(B)类型：核酸

(C)链型：双链

(D)拓扑学：线性

(ii)分子类型：其它核酸

(A)说明：/desc＝“包含adh1内含子的bar基因编码区”

(ix)特征：

(A)名称/关键词：CDS

(B)位置：1…233

(D)其它信息：/产物＝“膦丝菌素乙酰转移酶(N端一半)

(ix)特征：

(A)名称/关键词：内含子

(B)位置：234…769

(D)其它信息：/标准名称＝“adh1内含子”

(ix)特征：

(A)名称/关键词：CDS

(B)位置：770…1086

(D)其它信息：/产物＝“膦丝菌素(phosphintrin)乙酰转移

酶(C端一半)”

(xi)顺序描述：SEQ ID NO：2：

ATGGACCCAG AACGACGCCC GGCCGACATC CGCCGTGCCA CCGAGGCGGA CATGCCGGCG 60

GTCTGCACCA TCGTCAACCA CTACATCGAG ACAAGCACGG TCAACTTCCG TACCGAGCCG 120

CAGGAACCGC AGGAGTGGAC GGACGACCTC GTCCGTCTGC GGGAGCGCTA TCCCTGGCTC 180

GTCGCCGAGG TGGACGGCGA GGTCGCCGGC ATCGCCTACG CGGGCCCCTG GAAAGGTCCG 240

CCTTGTTTCT CCTCTGTCTC TTGATCTGAC TAATCTTGGT TTATGATTCG TTGAGTAATT 300

TTGGGGAAAG CTTCGTCCAC AGTTTTTTTT TCGATGAACA GTGCCGCAGT GGCGCTGATC 360

TTGTATGCTA TCCTGCAATC GTGGTGAACT TATGTCTTTT ATATCCTTCA CTACCATGAA 420

AAGACTAGTA ATCTTTCTCG ATGTAACATC GTCCAGCACT GCTATTACCG TGTGGTCCAT 480

CCGACAGTCT GGCTGAACAC ATCATACGAT ATTGAGCAAA GATCTATCTT CCCTGTTCTT 540

TAATGAAAGA CGTCATTTTC ATCAGTATGA TCTAAGAATG TTGCAACTTG CAAGGAGGCG 600

TTTCTTTCTT TGAATTTAAC TAACTCGTTG AGTGGCCCTG TTTCTCGGAC GTAAGGCCTT 660

TGCTGCTCCA CACATGTCCA TTCGAATTTT ACCGTGTTTA GCAAGGGCGA AAAGTTTGCA 720

TCTTGATGAT TTAGCTTGAC TATGCGATTG CTTTCCTGGA CCCGTGCAGC TAGGAACGCC 780

TACGACTGGA CGGCCGAGTC GACCGTGTAC GTCTCCCCCC GCCACCAGCG GACGGGACTG 840

GGCTCCACGC TCTACACCCA CCTGCTGAAG TCCCTGGAGG CACAGGGCTT CAAGAGCGTG 900

GTCGCTGTCA TCGGGCTGCC CAACGACCCG AGCGTGCGCA TGCACGAGGC GCTCGGATAT 960

GCCCCCCGCG GCATGCTGCG GGCGGCCGGC TTCAAGCACG GGAACTGGCA TGACGTGGGT 1020

TTCTGGCAGC TGGACTTCAG CCTGCCGGTA CCGCCCCGTC CGGTCCTGCC CGTCACCGAG 1080

ATCTGA 1086

(2)SEQ ID NO：3的信息：

(i)顺序特征：

(A)长度：108个碱基对

(B)类型：核酸

(C)链型：双链

(D)拓扑学：线性

(ii)分子类型：其它核酸

(A)说明：/desc＝“pGSV8的T-DNA”

(ix)特征：

(A)名称/关键词：-

(B)位置：1…25

(D)其它信息：/标记＝RB

/注释＝“T-DNA右边界”

(ix)特征：

(A)名称/关键词：-

(B)位置：26…83

(D)其它信息：/标记＝MCS

/注释＝“多克隆位点”

(ix)特征：

(A)名称/关键词：-

(B)位置：84…108

(D)其它信息：/标记＝LB

/注释＝“T-DNA左边界”

(xi)顺序描述：SEQ ID NO：3：

AATTACAACG GTATATATCC TGCCAGTACT CGGCCGTCGA CCGCGGTACC CGGAATTCCG 60

GGGAAGCTTA GATCCATGGA GCCATTTACA ATTGAATATA TCCTGCCG 108

(2)SEQ ID NO：4的信息：

(i)顺序特征：

(A)长度：29个碱基对

(B)类型：核酸

(C)链型：单链

(D)拓扑学：线性

(ii)分子类型：其它核酸

(A)说明/desc＝“寡核苷酸VG40”

(xi)顺序描述：SEQ ID NO：4：

GCCAAAAAGT TTGATCTAGA GCATTTTCG 29

(2)SEQ ID NO：5的信息：

(i)顺序特征：

(A)长度：33个碱基对

(B)类型：核酸

(C)链型：单链

(D)拓扑学：线性

(ii)分子类型：其它核酸

(A)说明：/desc＝“寡核苷酸VG41”

(xi)顺序描述：SEQ ID NO：5：

GCGACCCCGC TAGCTTAAAC AAAGCTTATC TCC 33

Claims

1.将DNA片段整合进单子叶植物细胞基因组中的方法，所述方法包括以下步骤：

1)在与DNA片段接触之前，在含有植物酚类化合物的培养基上培养未转化单子叶植物细胞的培养物大约1天至10天，其中所述植物细胞的培养物是致密胚生成愈伤组织；并且

2)在所述DNA片段被未转化细胞吸收且稳定整合进未转化细胞基因组中的条件下，通过电穿孔、用聚乙二醇的直接基因转移、用DNA包裹微粒的轰击或用含有所述DNA片段的农杆菌菌株共培养，使未转化细胞与DNA片段相接触，产生转化细胞。

2.权利要求1的方法，还包括从所述转化细胞再生转基因单子叶植物的步骤。

3.权利要求1的方法，其中所述植物酚类化合物选自乙酰丁香酮、α-羟基-乙酰丁香酮、芥子酸、丁香酸、阿魏酸、儿茶酚、对羟基苯甲酸、β-resorcylic acid、原儿茶酸、焦性没食子酸、没食子酸或香草醛。

4.权利要求3的方法，其中所述植物酚类化合物是乙酰丁香酮。

5.权利要求3的方法，其中所述植物酚类化合物是包含至少两种选自以下的酚类化合物的混合物：乙酰丁香酮、α-羟基-乙酰丁香酮、芥子酸、丁香酸、阿魏酸、儿茶酚、对羟基苯甲酸、β-resorcylic acid、原儿茶酸、焦性没食子酸、没食子酸和香草醛。

6.权利要求5的方法，其中所述混合物至少包括乙酰丁香酮和对羟基苯甲酸。

7.权利要求1的方法，其中所述单子叶植物是玉米、水稻、小麦或大麦。

8.权利要求1-6中任一项的方法，其中所述单子叶植物是玉米。

9.权利要求8的方法，其中未转化单子叶植物细胞的所述培养物是I型愈伤组织。

10.权利要求9的方法，其中所述I型愈伤组织在接触步骤前已被切割成片段。

11.权利要求9的方法，其中所述I型愈伤组织在培养步骤之后被切成片段。

12.权利要求10的方法，其中所述I型愈伤组织片段的最大长度为0.5-5mm。

13.权利要求1的方法，其中所述未转化细胞在与所述DNA片段接触之前，在含有所述植物酚类化合物的培养基上培养大约4天至5天。

14.权利要求12的方法，其中所述未转化细胞在与所述DNA片段接触之前，在含有所述植物酚类化合物的培养基上培养大约4天至5天。

15.权利要求1的方法，其中所述未转化细胞通过与包含所述DNA片段的农杆菌菌株共培养而与所述DNA片段相接触。

16.权利要求12的方法，其中所述未转化细胞通过与包含所述DNA片段的农杆菌菌株共培养而与所述DNA片段相接触。

17.权利要求15的方法，其中所述农杆菌菌株还含有额外的virG基因拷贝。

18.权利要求17的方法，其中所述virG基因来自pTiBo542。

19.权利要求15的方法，其中所述农杆菌菌株还包含与virB启动子操作性相连的virB11编码区的嵌合基因额外拷贝。