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CN115552022A - 由心肌细胞表达的微rna控制的基因载体 - Google Patents

由心肌细胞表达的微rna控制的基因载体 Download PDF

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CN115552022A
CN115552022A CN202180032386.2A CN202180032386A CN115552022A CN 115552022 A CN115552022 A CN 115552022A CN 202180032386 A CN202180032386 A CN 202180032386A CN 115552022 A CN115552022 A CN 115552022A
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Tenaya Therapeutics Inc
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Abstract

本公开提供了载体及其使用方法，用于使用微RNA结合位点对转基因(例如，心肌细胞重编程因子)的表达进行细胞类型特异性抑制。

Description

由心肌细胞表达的微RNA控制的基因载体
相关申请的交叉引用
本申请要求于2020年3月2日提交的美国临时专利申请第62/984,183号的优先权，其内容通过引用整体并入本文。
参考序列表
本申请通过EFS-Web以电子方式提交，并且包括以电子方式提交的.txt格式的序列表。txt文件含有在2021年2月25日创建的标题为“TENA_017_01WO_SeqList_ST25.txt”和大小为230千字节的序列表。含有在该.txt文件中的序列表是说明书的一部分并且通过引用整体并入本文。
技术领域
本公开一般涉及基因治疗载体。
背景技术
直接心脏重编程已经成为一种创建新心肌细胞的策略，从而导致被诊断患有心肌病、心力衰竭或其它心脏病变或处于其风险中的患者的心脏功能得到改进。已经显示遗传和化学重编程因子的各种组合促使其它细胞(如成纤维细胞)重编程为心脏细胞(cardiaccell)(特别是心肌细胞(cardiomyocyte))。例如，三种心脏发育转录因子-GATA4、MEF2C和TBX5(GMT)的组合可用于将真皮或心脏成纤维细胞重编程为小鼠中诱导心肌细胞(iCM)样细胞。当GATA4、MEF2C、TBX5、MESP1和MYOCD(GMTMM)作为因子的混合物一起表达时，会将细胞形态从纺锤状改变为棒状，并使细胞表现出自发的Ca2+振荡。已经显示HAND2、NKX2.5、微RNA miR-1和miR-133、JAK或TGF-β增强此类重编程。在人类中，用ETS2和MESP1补充GMT诱导心脏特异性基因表达和肌节形成。本领域已经描述了用于直接重编程的因子的其它组合，如Srivastava和DeWitt在《细胞(Cell)》166:1386-96(2016)中综述的。
然而，本领域仍然需要可替代的和改进的重编程方法以及实施这些方法的方式，如载体或载体系统。本公开解决了这种未满足的需要。
发明内容
本发明总体上涉及用于转基因(例如心肌细胞重编程因子)表达的细胞类型特异性抑制的载体及其使用方法。本公开提供了包含微RNA结合位点的载体，该微RNA结合位点被配置成与在心脏成纤维细胞中相比，促进转基因(例如，心肌细胞重编程因子)在心肌细胞和心肌细胞祖细胞中表达的特异性抑制。在一些实施例中，通过用有效量的诱导心脏成纤维细胞重编程为心肌细胞的组合物处理心脏成纤维细胞，以及测量心脏成纤维细胞中一种或多种微RNA的表达，来选择在诱导心肌细胞中特异性表达的微RNA，以鉴定在编程过程中和任选地在重编程过程后期表达的微RNA。在一些实施例中，所选择的微RNA仅在预定时间之后在心脏成纤维细胞中表达。在一些实施例中，表达的组织和细胞类型特异性抑制允许在靶细胞类型(例如，心脏成纤维细胞)中表达，而在非靶细胞类型(例如，心肌细胞)中抑制表达。在一些实施例中，微RNA结合位点允许在靶细胞中表达足够长的时间以引起靶细胞向非靶细胞的有效转化。
附图说明
图1显示了根据实施例的载体图谱。
图2A显示了在用AAV以MOI 160k转导iPSC-CM之后四天，通过流式细胞计量分析评估的GFP转基因表达的抑制。
图2B显示了在用AAV以MOI 160k转导hCF之后四天，通过流式细胞计量分析评估的GFP转基因表达抑制的缺乏。
图3显示了用AAV以MOI 500k转导iPSC-CM之后四天，通过流式细胞计量分析评估的GFP转基因表达的抑制。
图4显示了与人类iPSC-CM中的水平相比，在用
Figure BDA0003920830640000021
重编程混合物处理之后通过qPCR测定的微RNA表达水平。
图5A显示了用AAV(MOI 500k)转导之后四天iPSC-CM的流式细胞计量分析。
图5B显示了用AAV(MOI 160k)转导之后两天hCF的流式细胞计量分析。
图5C显示了用AAV以MOI 640k重编程三周之后的免疫荧光分析。
图6A显示了通过在整个研究过程中射血分数％的动态超声心动图数据，具有miR-208靶向盒的
Figure BDA0003920830640000022
对抗心肌梗塞是有效的。
图6B显示了注射后八周体内研究结束时的超声心动图数据，表明所有组相对于编码GFP的阴性对照(n＝10至13只小鼠/组)显著增加。
图6C显示了基于三色染色的纤维化分析，其中肌肉染成红色并且纤维化组织染成蓝色。所有组中纤维化的心脏横截面％的量化表明所有治疗组中的显著减少(n＝6至8个心脏/组，五个切片/心脏)。
图6D显示了来自阴性对照和AAV5z:
Figure BDA0003920830640000023
的代表性三色染色的心脏横截面。
图7显示了注射后长达九周的经治疗和未经治疗的缺血性损伤猪的射血分数百分比变化图。
图8显示了用AAV(MOI 500k)转导之后四天iPSC-CM的流式细胞计量分析。
图9显示了注射后四周缺血性损伤的大鼠研究中的射血分数百分比图。
具体实施方式
本发明人已经认识到，在基因治疗载体中包括所选择的微RNA结合位点可用于增加载体的细胞类型特异性。本公开的载体采用在心肌细胞或心肌细胞祖细胞中表达的微RNA的结合位点以抑制那些细胞类型中转基因的表达。这些载体可以增加体内基因治疗的功效和/或安全性。在一些实施例中，表达在其它细胞类型(例如骨骼肌)中被抑制，而在靶细胞类型中被允许和/或维持。在一些实施例中，靶细胞类型是心脏成纤维细胞。在一些实施例中，靶细胞类型是能够被重编程为心肌细胞的细胞(例如，用于体内细胞重编程)。在一些实施例中，靶细胞类型是由于基因中的功能缺失突变而具有功能缺陷的细胞(例如，用于基因替换治疗)。本公开的载体的一些实施例采用用于在重编程过程晚期表达的微RNA的微RNA结合位点。在此类实施例中，微RNA结合位点的选择允许从载体表达心肌细胞重编程因子而不过早抑制表达。
本公开进一步提供了用于从非心肌细胞生成心肌细胞的组合物和方法，例如通过将细胞直接重编程为心肌细胞。当所选择的微RNA用MYOCD和ASCL1，或单独用MYOCD表达时，所选择的具有有限或没有能力将细胞重编程为心肌细胞的微RNA的能力增加。另外，MYOCD、ASCL1或MYOCD和ASCL1将细胞重编程为心肌细胞的能力通过所选择的微RNA的表达而增加。因此，本公开提供了能够表达MYOCD和微RNA，或表达MYOCD、ASCL1和微RNA的组合物及其使用方法。有利地，与这些因子单独的表达相比，将分化的细胞(例如成纤维细胞)重编程为心肌细胞得到了增强。
本公开提供了组合物，如载体，其包含共同编码微RNA、MYOCD蛋白和任选的ASCL1蛋白的一种或多种多核苷酸。当使用单一载体时，编码多核苷酸可以以任何5'至3'顺序提供在载体中并且在载体内的相同或不同的多核苷酸链上。本公开进一步提供了由多于一种载体组成的载体系统。一些载体是多顺反子载体-例如2A-连接的多顺反子载体，例如但不限于包含MYOCD-2A-ASCL1或ASCL1-2A-MYOCD多核苷酸的载体。
载体包括病毒和非病毒载体，例如但不限于脂质纳米颗粒、转座子、腺相关病毒(AAV)载体、腺病毒、逆转录病毒、整合慢病毒载体(LVV)和非整合LVV。多核苷酸中的每一个任选地与对应基因的天然人类多核苷酸序列共享序列同一性，或具有编码与对应天然人类蛋白质相同或共享序列同一性的蛋白质的异源序列。在一些实施例中，由MYOCD多核苷酸编码的MYOCD蛋白是工程改造的心肌蛋白。例如，MYOCD可被工程改造成包括减小其大小但保留其功能的内部缺失。
本公开进一步提供了使用前述载体和载体系统的方法。使用方法包括在分化的细胞中诱导心肌细胞表型的方法(体内或体外)和治疗患有心脏病状或有心脏病状风险的受试者的心脏疾病的方法。本公开进一步提供了包含载体和载体系统的试剂盒，其具有用于治疗心脏病状的说明书。
本公开提供了涉及通过重编程其它细胞类型生成iCM细胞(体内、体外或离体)的方法和组合物。特别地，本发明人已经发现分化的细胞，例如成纤维细胞，可以通过微RNA和MYOCD和/或ASCL1的表达重编程为心肌细胞。
微RNA(“miRNA”)是小的非编码RNA分子，其通过与信使RNA(mRNA)分子内的互补序列进行碱基配对在RNA沉默和基因表达的转录后调控中起作用。在标准命名系统下，前缀“miR”后面是破折号和数字。“miR-”是指miRNA的成熟形式；“mir-”是指初级mRNA(pri-miRNA)或前体miRNA(pre-miRNA)；并且“MIR”是指编码它们的基因，具有几乎相同序列的miRNA用另外的小写字母注释。物种来源用三个字母前缀命名，例如“hsa-”表示人类。导致相同成熟miRNA但位于基因组中不同位置的miRNA基因用另外的破折号后缀表示，例如miR-194-1和mir-194-2。天然人类miRNA通常被转录为>100个核苷酸的pri-miRNA，其被加工以形成pre-miRNA，其被进一步加工以形成成熟miRNA。
miRNA可以通过将编码pre-miRNA的序列可操作地连接到在宿主细胞中有活性的启动子而从载体例如病毒载体中表达。例如，细胞生物实验室的pMX逆转录病毒表达载体被设计成克隆和表达单独的pri-miRNA，同时保留推定的发夹结构以确保与内源性加工机制和调控配偶体的生物学相关的相互作用，从而导致适当切割的微RNA。pri-miRNA可以在每个5'或3'侧包含pre-miRNA加上其自身约150bp的侧翼序列，或可以根据本领域已知的方法使用不同的侧翼序列产生相同的成熟miRNA。示范性感兴趣微RNA包括miR-133a-2、miR-133a-1、miR-19b-2、miR-19b-1、miR-326、miR-1-1、miR-1298、miR-133b、miR-1-2、miR-92a-2、miR-20b、miR-20a、miR-141、miR-155、miR-17、hsa-let-7c、miR-202、miR-200a、miR-206、miR-509-1、miR-509-2、miR-124-3、miR-124-2、miR-378a、miR-378e、miR-378h、miR-378i、miR-137、miR-671、miR-24-1、miR-182、miR-302d、miR-96、miR-30c-2和miR-146b。表1提供了用于表达成熟miRNA的pri-miRNA序列，其中成熟miRNA序列用大写字母表示。
表1
Figure BDA0003920830640000051
Figure BDA0003920830640000061
心肌蛋白(MYOCD)是血清反应因子的平滑肌和心肌特异性转录辅激活因子。当在非肌肉细胞中异位表达时，MYOCD可通过与血清反应因子结合诱导平滑肌分化。Du等人,“MYOCD是调控平滑肌细胞分化的转录程序中的关键血清应答因子辅因子(MYOCD is acritical serum response factor cofactor in the transcriptional programregulating smooth muscle cell differentiation.)”,《分子和细胞生物学(Mol.Cell.Biol.)》23:2425-37(2003)。
已知Achaete-scute家族bHLH转录因子1(ASCL1)主要在神经系统、神经元和神经内分泌发育中的作用。在细胞重编程的背景下，ASCL1是本领域已知的与非神经元细胞转化成功能性神经元相关的因子。实际上，ASCL1结合其它重编程因子的表达已在本领域中用于将人类诱导多能干细胞(hiPSC)从心肌细胞表型转化成神经元(Tuj1+cTnT-)或神经元样表型(Tuj1+cTnT+)-重编程心肌细胞的相反效果。相反，本公开提供了使用ASCL1从成纤维细胞生成iCM细胞的组合物和方法。
I.定义
如本文所用，术语“功能性心肌细胞”是指能发送或接收电信号的分化的心肌细胞。在一些实施例中，如果心肌细胞表现出电生理特性例如动作电位和/或Ca2+瞬变，则该心肌细胞被称为是功能性心肌细胞。
如本文所用，“分化的非心肌细胞”可指不能分化成成年生物体的所有细胞类型(即，不是多能细胞)并且具有除心脏谱系以外的细胞谱系(例如，神经元谱系或结缔组织谱系)的细胞。分化的细胞包括但不限于多能细胞、寡能细胞、单能细胞、祖细胞和终末分化细胞。在特定的实施例中，相对于效力较强的细胞，效力较弱的细胞被认为是“分化的”。
如本文所用，当提及载体的组分时“蛋白质编码基因”意指编码蛋白质的多核苷酸，除与载体功能相关的基因以外。例如，术语蛋白质编码基因将涵盖编码具有重编程活性的人类蛋白质或其功能性变体的多核苷酸。关于载体的短语“不包含其它蛋白编码基因的载体”意指载体包含编码列出的感兴趣蛋白质的多核苷酸，但不包含编码具有重编程活性的另一蛋白的多核苷酸，例如本领域已知的促进多能性或心肌细胞表型的其它蛋白。短语“不包含其它蛋白质编码基因的载体”不排除编码载体功能所需的蛋白质的多核苷酸，其可以任选地存在，也不排除不编码蛋白质的多核苷酸。此类载体将包括非编码多核苷酸序列并且可以包括编码RNA分子(例如微RNA)的多核苷酸。相反地，当仅列出某些蛋白编码基因时，其暗示可能另外存在其它蛋白编码基因，例如编码进一步促进重编程的蛋白质的蛋白质编码基因。
“体细胞”是形成生物体主体的细胞。体细胞包括构成生物体中的器官、皮肤、血液、骨和结缔组织的细胞，但不包括生殖细胞。
术语“心脏病变”或“心功能障碍”可互换使用，并且是指心脏泵送功能的任何损害。这包括，例如，收缩能力受损、舒张能力受损(有时称为舒张功能障碍)、心脏瓣膜功能异常或不正常、心肌疾病(有时称为心肌病)、例如心绞痛、心肌缺血和/或以心肌供血不足为特征的梗塞的疾病、例如淀粉样变性和血色素沉着病的浸润性疾病、整体或区域肥大(例如可能发生在某些类型的心肌病或系统性高血压中)以及心腔之间的异常连通。
如本文所用，术语“心肌病”是指心肌(myocardium/heart muscle)的任何疾病或功能障碍，其中心脏异常增大、增厚和/或硬化结果，心肌泵血的能力通常会减弱。疾病或病症的病因可以是例如炎性的、代谢性的、毒性的、浸润性的、纤维形成性的、血液学的、遗传的或来源未知的。有两种一般类型的心肌病：缺血性(由缺氧引起)和非缺血性。
如本文所用，术语“感兴趣基因”是指重编程因子或编码重编程因子的核酸。例如，当重编程因子是蛋白质时，感兴趣基因是(从上下文明显看出)蛋白质或对应的蛋白质编码的多核苷酸序列。感兴趣基因的引入、施用或其它用途应理解为指增加基因、基因产物或基因产物的功能性变体的表达或增加活性的任何方式。因此，在一些实施例中，本公开提供了生成iCM细胞的方法，其包含将感兴趣多核苷酸(例如ASCL1和/或MYOCD)作为核酸(例如脱氧核糖核苷酸(DNA)或核糖核苷酸(RNA))引入靶细胞作为多核苷酸(例如脱氧核糖核苷酸(DNA)或核糖核苷酸(RNA))。可以用本领域已知的各种方式中的任一种将多核苷酸引入细胞，包括但不限于病毒、非病毒载体，通过使细胞与裸多核苷酸或与转染剂复合的多核苷酸接触，或通过电穿孔。使用感兴趣基因作为核酸还可以包括间接改变感兴趣基因的表达或活性，如编码内源基因的基因座的基因编辑、转录或调控因子的表达、用感兴趣基因的小分子激活剂接触细胞、或使用基因编辑方法，包括基于DNA或RNA的方法，以改变感兴趣基因作为核酸的表达或活性。在一些实施例中，本公开的方法包括通过编辑调控区域(例如增强子或启动子)，改变剪接位点，去除或插入微RNA识别位点，施用antagomir以抑制微RNA，施用微RNA模拟物或任何其它调节感兴趣基因的表达或活性的各种方式来去抑制感兴趣基因的转录。
如本文所用，“微RNA”是指成熟的微RNA。编码微RNA的多核苷酸通常是指在宿主细胞中表达导致成熟微RNA在该细胞中形成的任何多核苷酸。编码微RNA的多核苷酸可以与对应的pre-RNA共享100％的序列同一性。在一些情况下，编码成熟微RNA序列的茎之间的环中的一个或多个取代是耐受的。尽管双链体的任一条链可能潜在地充当功能性miRNA，但通常仅一条链并入RNA诱导沉默复合物(RISC)中，其中miRNA与其mRNA靶标相互作用。例如在Lawrie编写的(2013)《药物中的微RNA(MicroRNAs in Medicine.)》中提供了使用微RNA的常规技术。
如本文所用，术语“受试者”或“患者”是指任何动物，例如家养动物、动物园动物或人类。“受试者”或“患者”可以是哺乳动物，例如狗、猫、马、家畜、动物园动物或人类。受试者或患者也可以是任何家养动物，例如鸟、宠物或农场动物。“受试者”和“患者”的具体实例包括但不限于患有心脏疾病或病症的个体和患有心脏病症相关特征或症状的个体。
除非另有说明，否则本公开的实践将采用组织培养、免疫学、分子生物学、细胞生物学和重组DNA的常规技术，这些技术在本领域的技术范围内。
除非上下文另有说明，否则本文所述的本发明的各种特征特别旨在以任何组合形式使用此外，本公开还考虑在一些实施例中，可以排除或省略本文阐述的任何特征或特征的组合。为了说明，如果说明书说明复合物包含组分A、B和C，则其具体意在A、B或C中的任一个或其组合可被单独地或以任何组合省略和放弃。
所有数字名称，例如pH、温度、时间、浓度和分子量，包括范围，是近似值，其变化(+)或(-)的增量为1.0或0.1，或可替代地变化+/-15％、可替代地10％、可替代地5％、可替代地2％，视情况而定。应当理解，尽管并不总是明确指出，但是所有数字名称前面都有术语“约”。应当理解，此类范围形式是为了方便和简洁而使用的，并且应当灵活地理解为包括明确指定为范围界限的数值，而且还包括包含在该范围内的所有单个数值或子范围，如同明确指定了每个数值和子范围。例如，在约1至约200范围内的比率应理解为包括明确列举的约1和约200的界限，但也包括单独的比率例如约2、约3和约4，以及子范围例如约10至约50、约20至约100等。还应当理解，尽管不总是明确说明，但本文所述的试剂仅是示范性的，并且其等同物是本领域已知的。
如在本文和所附权利要求中使用的，单数形式“一个(a、an和the)”包括复数指示物，除非上下文另有明确规定。因此，例如，提及“心肌细胞”包括多个心肌细胞。
此外，如本文所用，“和/或”是指并涵盖相关联列出的项目中的一个或多个的任何和所有可能组合，以及当在替代方案(“或”)中解释时缺少组合。
“施用(administration/administering等)”当与本发明的组合物结合使用时，是指直接施用，其可以是体外施用于非心肌细胞，体内施用于非心肌细胞，由医学专业人员施用于受试者或由受试者自我施用和/或间接施用，其可以是开出本发明的组合物的处方的行为。当在本文中关于细胞使用时，它是指将组合物引入细胞。通常，施用有效量，该量可由本领域技术人员确定。可以使用任何施用方法。可通过例如将小分子添加到细胞培养基或体内注射到心脏损伤部位来将小分子施用于细胞。可通过例如血管内注射、心肌内递送等来实现对受试者的施用。
如本文所用，术语“心脏细胞”是指存在于心脏中的任何细胞，其提供心脏功能(例如心脏收缩或血液供应)或以其它方式用于维持心脏结构。如本文所用，心脏细胞涵盖存在于心脏的心外膜、心肌或心内膜中的细胞。心脏细胞还包括，例如，心肌细胞(cardiacmuscle cell/cardiomyocyte)和心血管细胞，例如冠状动脉或静脉的细胞。心脏细胞的其它非限制性实例包括上皮细胞、内皮细胞、成纤维细胞、心脏干细胞或祖细胞、心脏传导细胞和心脏起搏细胞，其构成心肌、血管和心肌细胞支持结构。心脏细胞可衍生自干细胞，包括例如胚胎干细胞或诱导多能干细胞。
如本文所用，术语“心肌细胞(cardiomyocyte/cardiomyocytes)”是指在哺乳动物心脏中天然发现的含有肌节的横纹肌细胞，与骨骼肌细胞相反。心肌细胞的特征在于特定分子的表达，例如肌球蛋白重链、肌球蛋白轻链、心脏α-辅肌动蛋白等蛋白质。如本文所用，术语“心肌细胞”是包含任何心肌细胞亚群或心肌细胞亚型，例如心房、心室和起搏器心肌细胞的涵盖性术语。
术语“心肌细胞样细胞”意在意指与心肌细胞共享特征，但可能不共享所有特征的细胞。例如，心肌细胞样细胞可能在某些心脏基因的表达上不同于心肌细胞。
术语“培养”或“细胞培养”意指在人工、体外环境中维持细胞。如本文所用，“细胞培养系统”是指细胞群体可以作为单层或在悬浮液中生长的培养条件。如本文所用，“培养基”是指用于培养、生长或增殖细胞的营养液。培养基可通过功能性特性表征，例如但不限于将细胞维持在特定状态(例如多能状态、静止状态等)或成熟细胞的能力，例如在一些实施例中，促进祖细胞分化成特定谱系的细胞(例如心肌细胞)的能力。
如本文所用，术语“表达(expression/express)”是指多核苷酸转录成mRNA的过程和/或转录的mRNA随后翻译成肽、多肽或蛋白质的过程。如果多核苷酸衍生自基因组DNA，则表达可包括在真核细胞中剪接mRNA。基因的表达水平可以通过测量细胞或组织样品中mRNA或蛋白质的量来确定。
如本文所用，“表达盒”是包含一种或多种编码蛋白质或核酸的多核苷酸的DNA多核苷酸，其被配置成在宿主细胞中表达多核苷酸。通常，多核苷酸的表达受某些调控元件的控制，包括组成型或诱导型启动子、组织特异性调控元件和增强子。此类多核苷酸被称为是“可操作地(operably/operatively)连接到”调控元件(例如，启动子)。
术语“诱导心肌细胞”或缩写“iCM”是指已经转化成心肌细胞(和/或心肌细胞样细胞)的非心肌细胞(及其后代)。本公开的方法可以与现在已知或以后发现的用于生成诱导心肌细胞的任何方法结合使用，例如，以增强其它技术。
如本文所用，术语“非心肌细胞”是指细胞制剂中不满足如本文所定义和使用的“心肌细胞”标准的任何细胞或细胞群。非心肌细胞的非限制性实例包括体细胞、心脏成纤维细胞、非心脏成纤维细胞、心脏祖细胞和干细胞。
本文采用的短语“药学上可接受的”是指在合理的医学判断范围内适用于与人类和动物的组织接触而没有过度毒性、刺激、过敏反应或其它问题或并发症，与合理的益处/风险比相称的那些化合物、材料、组合物和/或剂型。
如本文在损伤心脏组织的上下文中使用的术语“再生(regenerate/regeneration)”等应被赋予其普通含义，并且还应当指在已损伤的心脏或心脏组织中生长和/或发育新的心脏组织的过程，例如由于局部缺血、梗塞、再灌注或其它疾病而受损。在一些实施例中，心脏组织再生包含心肌细胞的生成。
如本文所用，术语“重编程”或“转分化”是指从不同类型的细胞(例如成纤维细胞)生成某种谱系的细胞(例如心肌细胞)，而没有将细胞去分化为展现多能干细胞特征的细胞的中间过程。如本文所用，“重编程”包括转分化、去分化等。
如本文所用，“重编程活性”是指具有重编程活性的蛋白质或多核苷酸单独或与具有重编程活性的其它蛋白质或多核苷酸组合引入细胞或由细胞表达时诱导或促进细胞重编程为心肌细胞或心肌细胞样细胞的能力。例如，如果第一蛋白质在没有其它因子的细胞中的表达诱导或促进细胞重编程，则第一蛋白质具有重编程活性；但第一蛋白也具有重编程活性，如本文所用的术语，如果第一蛋白与第二蛋白组合促进重编程-即，当第一蛋白和第二蛋白一起表达时。
如本文所用，术语“重编程效率”是指样品中成功重编程为心肌细胞的细胞数量相对于样品中的细胞总数。
如本文所用，术语“重编程因子”包括被引入用于在细胞中表达以帮助细胞重编程为诱导心肌细胞的因子。重编程因子包括蛋白质和核酸(例如，RNA如微RNA、siRNA或shRNA)。
术语“干细胞”是指具有自我更新和生成分化后代能力的细胞。术语“多能干细胞”是指可产生所有三个胚层(内胚层、中胚层和外胚层)的细胞，但不具有产生完整生物体的能力的干细胞。
“治疗(Treatment、treating和treat)”被定义为用药剂作用于疾病、病症或病状以减少或改善疾病、病症、病状和/或其症状的有害或任何其它不希望的效果。
如本文所用，术语“有效量”等是指足以诱导所需生理结果(例如细胞重编程或疾病治疗)的量。有效量可以以一次或多次施用、应用或给药。此类递送取决于许多变量，包括使用单个剂量单位的时间段、组合物的生物利用度、施用途径等。然而，应当理解，用于任何特定受试者的组合物的具体量(例如重编程因子)取决于多种因素，包括所采用的特定药剂的活性、受试者的年龄、体重、一般健康，性别和饮食、施用时间、排泄速率、组合物组合、所治疗的特定疾病的严重程度和施用形式。
如本文所用，关于多肽或核酸序列的术语“其等同物”是指不同于参考多肽或核酸序列，但保留基本特性(例如，生物活性)的多肽或核酸。多核苷酸的典型变体在核苷酸序列上不同于另一参考多核苷酸。变体的核苷酸序列的变化可能会或可能不会改变由参考多核苷酸编码的多肽的氨基酸序列。核苷酸变化可能导致参考序列编码的多肽中的氨基酸取代、缺失、添加、融合和截短。通常，差异是有限的，使得参考多肽和变体的序列总体上非常类似，并且在许多区域中是相同的。
术语“分离的”意指从通常在自然界中结合的细胞、组织、多核苷酸、肽、多肽、蛋白质、抗体或其片段的成分、细胞和其它成分中分开的。例如，分离的细胞是从不同表型或基因型的组织或细胞中分开的细胞。如本领域技术人员显而易见的，非天然存在的多核苷酸、肽、多肽、蛋白质或细胞不需要“分离”来将其与其天然存在的对应物区分开。
如本文所用，术语“核酸”和“多核苷酸”可互换使用并且是指任何长度的核苷酸(脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸或其类似物)的聚合形式。多核苷酸的非限制性实例包括线性和环状核酸、信使RNA(mRNA)、cDNA、重组多核苷酸、载体、探针和引物。
术语“多肽”、“肽”和“蛋白质”在本文中可互换使用，并且是指任何长度的氨基酸的聚合形式，其可以包括遗传编码和非遗传编码的氨基酸、化学或生物化学修饰或衍生的氨基酸，以及具有修饰的肽骨架的多肽。该术语包括融合蛋白，包括但不限于具有异源氨基酸序列的融合蛋白、具有异源和同源前导序列、具有或不具有N-末端甲硫氨酸残基的融合蛋白、免疫标记蛋白等。
如本文所用，在基因名称之前的词语“多核苷酸”(例如“MYOCD多核苷酸”)是指编码相应蛋白质(例如“MYOCD蛋白质”)的多核苷酸序列。
如本文所用，在基因名称之前的词语“蛋白质”(例如，“MYOCD蛋白质”)是指天然蛋白质或其功能性变体。“天然蛋白质”是由生物体的基因的基因组拷贝编码的蛋白质，优选载体所针对的生物体(例如人类、啮齿动物、灵长类动物或兽医感兴趣动物)，在基因的任何功能性同种型或功能性等位基因变体中。
如本文所用，蛋白质的“功能性变体”是具有任何数量氨基酸取代的变体，其保留了蛋白质的功能属性，包括例如蛋白质与其它因子组合诱导细胞重编程为心肌细胞的能力。功能性变体可以通过计算来鉴定，例如仅具有保守取代的变体，或使用体外或体内测定进行实验。
如本文所用，术语“祖细胞”是指致力于分化成特定类型的细胞或形成特定类型的组织的细胞。祖细胞，如干细胞，可进一步分化成一种或多种细胞，但比干细胞更成熟，使得其具有更有限/受限的分化能力。
术语“载体”是指在体外或体内包含待递送至宿主细胞的多核苷酸或蛋白质的大分子或分子复合物。
如本文所用，术语“病毒载体”是指包括病毒衍生的核酸元件的核酸分子，该病毒衍生的核酸元件通常促进核酸分子的转移或整合到细胞基因组中或介导核酸转移的病毒颗粒中。病毒颗粒通常包括各种病毒组分，有时除了核酸之外还包括细胞组分。
术语“遗传修饰”是指在引入新核酸(即细胞外源性核酸)后在细胞中诱导永久或瞬时遗传改变。遗传改变可通过将新核酸掺入心肌细胞的基因组中，或通过将新核酸瞬时或稳定维持为染色体外元件来实现。当细胞是真核细胞时，通过将核酸引入细胞的基因组来实现永久的遗传改变。合适的遗传修饰方法包括病毒感染、转染、缀合、原生质体融合、电穿孔、粒子枪技术、磷酸钙沉淀、直接显微注射等。
术语“干细胞”是指具有自我更新和生成分化后代能力的细胞。术语“多能干细胞”是指可产生所有三个胚层(内胚层、中胚层和外胚层)的细胞，但不具有产生完整生物体的能力的干细胞。在一些实施例中，用于诱导心肌细胞表型的组合物可用于细胞群以诱导重编程。在其它实施例中，组合物诱导心肌细胞表型。
术语“诱导多能干细胞”应被赋予其普通含义，并且还应指已被重编程以表现出多能性的至少一种特征的分化的哺乳动物体细胞(例如，成体体细胞、如皮肤)。参见，例如，Takahashi等人,(2007)《细胞》131(5):861-872，Kim等人,(2011)《美国国家科学院院刊(Proc.Natl.Acad.Sci.)》108(19):7838-7843,Sell(2013)《干细胞手册(Stem CellsHandbook)》。
除非另有说明，在整个说明书中使用的缩写具有以下含义：AHCF，成年人心脏成纤维细胞，APCF，成年猪心脏成纤维细胞，a-MHC-GFP，α-肌球蛋白重链绿色荧光蛋白；CF，心脏成纤维细胞；cm，厘米；CO，心输出量；EF，射血分数；FΑCS，荧光激活细胞分选；GFP，绿色荧光蛋白；GMT，Gata4、Mef2c和Tbx5；GMTc，Gata4、Mef2c、Tbx5、TGF-βi、WNTi；GO，基因本体；HCF，人类心脏成纤维细胞；iCM，诱导心肌细胞；kg，千克；μg，微克；μl，微升；mg，毫克；ml，毫升；MI，心肌梗塞；msec，毫秒；min，分钟；MyAMT，心肌蛋白、Ascl1、Mef2c和Tbx5；MyA，心肌蛋白和Ascl1；MyMT，心肌蛋白、Mef2c和Tbx5；MyMTc，心肌蛋白、Mef2c、Tbx5、TGF-βi、WNTi；MRI，磁共振成像；PBS：磷酸盐缓冲盐水；PBST：磷酸盐缓冲盐水、triton；PFA，多聚甲醛；qPCR，定量聚合酶链反应；qRT-PCR，定量逆转录聚合酶链反应；RNA，核糖核酸；RNA-seq，RNA测序；RT-PCR，逆转录聚合酶链反应；sec，秒；SV，每搏输出量；TGF-β，转化生长因子β；TGF-βi，转化生长因子β抑制剂；WNT，wingless-Int；WNTi，wingless-Int抑制剂；YFP，黄色荧光蛋白；4F，Gata4、Mef2c、TBX5和心肌蛋白；4Fc，Gata4、Mef2c、TBX5和心肌蛋白+TGF-βi和WNTi；7F，Gata4、Mef2c和Tbx5、Esrrg、心肌蛋白、Zfpm2和Mesp1；7Fc、Gata4、Mef2c和Tbx5、Esrrg、心肌蛋白、Zfpm2和Mesp1+TGF-βi和WNTi。
仅为方便读者阅读，将本公开的详细描述分为多个部分，并且任何部分中的公开内容可以与另一部分中的内容组合。除非另外规定，否则本文中所用的所有技术及科学术语具有与本发明所属领域的一般技术者通常所理解相同的含义。尽管在本发明的实践或测试中也可以使用与本文所述的那些类似或等同的任何方法和材料，但现在描述优选的方法和材料。本文提及的所有出版物均通过引用并入本文以公开和描述与所引用的出版物相关的方法和/或材料。
II.转基因和微RNA结合位点
本公开的载体可被设计成用于将一种或多种转基因递送至细胞，包括但不限于BMPR2、COL1A1、COL1A2、COL3A1、ELN、FGF1、FGF4、GGF2、HGF、OPRL1、PCSK9、RXFP1、SDF1、TGFBR2、TIMP3、TIMP4、VEGFA和/或其它转基因。即，载体可包含编码BMPR2、COL1A1、COL1A2、COL3A1、ELN、FGF1、FGF4、GGF2、HGF、OPRL1、PCSK9、RXFP1、SDF1、TGFBR2、TIMP3、TIMP4、VEGFA和/或其它中的一种或多种的多核苷酸序列。本公开的载体不限于任何特定的转基因组。转基因可以是蛋白质编码的、DNA编码的或RNA编码的。一种或多种转基因可包括基因编辑系统，例如CRISPR-Cas系统。
重编程因子
在一些实施例中，一种或多种转基因包含一种或多种重编程因子(例如心肌细胞重编程因子)。载体可用于递送实现所选择的期望细胞重编程所需的所有因子，或此类重编程因子组的所选择的成员。例如，可以共同施用多个载体，其中仅一个载体包含所选择的微RNA结合位点。当需要多种因子的表达以共同产生期望的效果时，当该组因子中只有某些成员受微RNA结合位点控制时，或当所有成员受微RNA结合位点控制时，可以看到相同或类似的功效和/或安全性益处。
在一些实施例中，本公开提供了能够调节一种或多种基因(例如多核苷酸或感兴趣蛋白质)的表达的重编程因子及其组合物。本发明人已经出人意料地发现，可以使用一种或多种重编程因子将分化的细胞重编程为iCM细胞，该重编程因子调节一种或多种基因例如多核苷酸或感兴趣蛋白质，例如ASCL1、和/或MYOCD的表达；和任选地编码微RNA的多核苷酸，其中一种或多种前述多核苷酸包含通过微RNA结合位点选择的多核苷酸。在一些实施例中，一种或多种重编程因子作为编码一种或多种转基因的多核苷酸(例如RNA、mRNA或DNA多核苷酸)提供。在一些实施例中，一种或多种重编程因子作为蛋白质提供。在一些实施例中，编码微RNA的多核苷酸与对应的前体微RNA共享完全的同一性。
在一些实施例中，本文提供的一种或多种重编程因子调节(例如，增加或减少)一种或多种感兴趣蛋白质的表达。在一些实施例中，已知一种或多种靶蛋白参与心肌细胞分化、增殖和/或功能。在一些实施例中，一种或多种靶多核苷酸或蛋白质是MYOCD/MYOCD和/或ASCL1/ASCL1。表2提供了可用于本公开组合物和方法的说明性基因序列。当已知给定感兴趣的基因的多于一种同种型时，应理解本公开的实施例包括包含每种感兴趣基因的可替代的同种型的组合物和方法。本公开的组合物和方法不限于所公开的顺序，其作为实例和说明提供并且是非限制性的。
在一些实施例中，本公开提供了调节选自ASCL1、MYOCD、MEF2C和TBX5的一种或多种感兴趣基因的表达的重编程因子。在一些实施例中，本文公开的重编程因子调节选自ASCL1、MYOCD、MEF2C、AND TBX5、CCNB1、CCND1、CDK1、CDK4、AURKB、OCT4、BAF60C、ESRRG、GATA4、GATA6、HAND2、IRX4、ISLL、MESP1、MESP2、NKX2.5、SRF、TBX20、ZFPM2和MIR-133的一种或多种感兴趣基因的表达。
在一些实施例中，本文公开的重编程因子调节选自GATA4、MEF2C和TBX5(即GMT)的一种或多种感兴趣基因的表达。在一些实施例中，本文公开的重编程因子调节选自MYOCD、MEF2C和TBX5(即，MyMT)的一种或多种感兴趣基因的表达。在一些实施例中，本文公开的重编程因子调节选自MYOCD、ASCL1、MEF2C和TBX5(即，MyAMT)的一种或多种感兴趣基因的表达。在一些实施例中，本文公开的重编程因子调节选自MYOCD和ASCL1(即，MyA)的一种或多种感兴趣基因的表达。在一些实施例中，本文公开的重编程因子调节选自GATA4、MEF2C、TBX5和MYOCD(即4F)的一种或多种感兴趣基因的表达。在其它实施例中，本文公开的重编程因子调节选自GATA4、MEF2C、TBX5、ESRRG、MYOCD、ZFPM2和MESP1(即7F)的一种或多种感兴趣基因的表达。
在一些实施例中，本公开提供了调节选自ASCL1、MYOCD、MEF2C、TBX5、DLX3、DLX6、GATA2和GATA5的一种或多种感兴趣基因的表达的重编程因子。
表2：代表性序列
蛋白质 核苷酸(可读框)
ASCL1 SEQ ID NO：1 SEQ ID NO：2
DLX3 SEQ ID NO：43 SEQ ID NO：44
DLX6 SEQ ID NO：45 SEQ ID NO：46
ESRRG SEQ ID NO：47 SEQ ID NO：48
GATA2 SEQ ID NO：49 SEQ ID NO：50
GATA4 SEQ ID NO：51 SEQ ID NO：52
MESP1 SEQ ID NO：53 SEQ ID NO：54
MYF6 SEQ ID NO：55 SEQ ID NO：56
MYOCD SEQ ID NO：3 SEQ ID NO：4
MEF2C SEQ ID NO：5 SEQ ID NO：6
TBX5 SEQ ID NO：7 SEQ ID NO：8
工程改造的心肌蛋白(MYOCD)
在另一方面，本公开涉及MYOCD的工程改造的变体，例如由较小可读框表达的工程化MYOCD，如美国临时专利申请第62/788,479号中所述。申请人已发现包含内部缺失的MYOCD保留了MYOCD蛋白的表达和功能，并且包含内部缺失的MYOCD可单独使用或与其它重编程因子组合使用(例如用于从成纤维细胞产生心肌细胞)。在本公开的一些实施例中，工程改造的MYOCD蛋白在对应于天然MYOCD(SEQ ID NO：3)的氨基酸414至764的区域中包含至少50个氨基酸的缺失。在一些实施例中，工程改造的MYOCD选自一种或三种具有内部缺失的MYOCD变体：缺失414至763位残基的MyΔ1(SEQ ID NO：14)；缺失439至763位残基的MyΔ2(SEQ ID NO：15)；并且优选缺失560至763位残基的MyΔ3(SEQ ID NO：16)。
在一些实施例中，MYOCD多核苷酸是工程改造的MYOCD多核苷酸。“MYOCD”或“心肌蛋白”指工程改造的MYOCD蛋白或优选天然MYOCD。在一些实施例中，工程改造的MYOCD多核苷酸编码工程改造的MYOCD蛋白，其具有至多500、550、600、650、700、750、800、850或其间任何数量的氨基酸的长度。在一些实施例中，工程改造的MYOCD蛋白包含SRF相互作用结构域、SAP结构域和TAD结构域。在一些实施例中，工程改造的MYOCD蛋白进一步包含Mef2C相互作用结构域。在一些实施例中，工程改造的MYOCD多核苷酸编码工程改造的MYOCD蛋白，其在对应于天然心肌蛋白(SEQ ID NO：3)的氨基酸414至764的区域中缺失至少10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190、200、210、220、230、240、250、260、270、280、290、300、310、320、330、340或350个氨基酸。表3提供了心肌蛋白工程改造中使用的各种序列。在一些实施例中，MYOCD的约四个N-末端残基被省略或改变，因为MYOCD的物种间保守性从残基5开始。在一些实施例中，来自MYOCD的N末端的另外的残基被省略或改变。
表3：MYOCD工程改造中使用的序列
蛋白质 SEQ ID NO.
天然MYOCD SEQ ID NO：3
MYOCD 5-413 SEQ ID NO：10
MYOCD 764-986 SEQ ID NO：11
MYOCD 5-438 SEQ ID NO：12
MYOCD 1-559 SEQ ID NO：13
MYOCD 1-413,764-986(MyΔ1) SEQ ID NO：14
MYOCD 1-438,764-986(MyΔ2) SEQ ID NO：15
MYOCD 1-559,764-986(MyΔ3) SEQ ID NO：16
Mef2c相互作用结构域(5至120) SEQ ID NO：17
SRF结构域(210至320) SEQ ID NO：18
SAP结构域(360至413) SEQ ID NO：19
LZ结构域(510至550) SEQ ID NO：20
TAD结构域(764至986) SEQ ID NO：11
在一些实施例中，工程改造的心肌蛋白包含Mef2c相互作用结构域、SRF结构域、SAP结构域、LZ结构域和TAD结构域中的一种或多种。在一些实施例中，工程改造的心肌蛋白包含Mef2c相互作用结构域、SRF结构域、SAP结构域、LZ结构域和TAD结构域。在一些实施例中，工程改造的心肌蛋白包含Mef2c相互作用结构域、SRF结构域、SAP结构域和TAD结构域。在一些实施例中，工程改造的心肌蛋白包含SRF结构域、SAP结构域、LZ结构域和TAD结构域。在一些实施例中，工程改造的心肌蛋白包含SRF结构域、SAP结构域和TAD结构域。
在一些实施例中，工程改造的MYOCD作为编码工程改造的MYOCD和任选的一种或多种其它感兴趣蛋白质的多核苷酸提供。在一些实施例中，多核苷酸是RNA、DNA或mRNA多核苷酸。在一些实施例中，MYOCD多核苷酸与MYOCD的任何同种型共享同一性。在一些实施例中，MYOCD多核苷酸编码与选自MyΔ1(SEQ ID NO：14)、MyΔ2(SEQ ID NO：15)和MyΔ3(SEQ IDNO：16)的序列至少70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的工程改造的MYOCD蛋白。在一些实施例中，工程改造的MYOCD蛋白包含Mef2c相互作用结构域、SRF结构域、SAP结构域、LZ结构域和TAD结构域中的至少2、3、4、5个。在一些实施例中，Mef2c相互作用结构域与SEQ IDNO：17至少70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同。在一些实施例中，SRF结构域与SEQ ID NO：18至少70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同。在一些实施例中，SAP结构域与SEQID NO：19至少70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同。在一些实施例中，LZ结构域与SEQ ID NO：20至少70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同。在一些实施例中，TAD结构域与SEQ ID NO：11至少70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同。
在一些实施例中，工程改造的MYOCD蛋白包含通过接头连接的两个或更多个天然MYOCD片段。通常，接头是指肽键或多肽序列。在一些实施例中，使用其它接头，例如本领域已知的用于肽化学的各种化学接头中的任一种。提及“肽键”意指将两个序列连接在一起以生成没有任何插入氨基酸残基的复合序列。例如，MyΔ3(SEQ ID NO：16)包含通过肽键与MYOCD 764-986(SEQ ID NO：11)连接的MYOCD 1-559(SEQ ID NO：13)。在一些实施例中，接头是本领域中用作接头的各种多肽中的任一种；例如，但不限于甘氨酸-丝氨酸接头例如G、GG、GGG、GSS、GGS、GGSGGS(SEQ ID NO：30)、GSSGGS(SEQ ID NO：31)、GGSGSS(SEQ ID NO：32)、GGSGGSGGS(SEQ ID NO：33)、GGSGGSGGSGGS(SEQ ID NO：34)。在一些实施例中，接头是除MYOCD以外的蛋白质的结构域。
在整个公开内容中，多核苷酸的表达可以指本领域已知的增加感兴趣基因表达的任何方式。在一些实施例中，感兴趣基因在信使RNA(mRNA)中编码。mRNA可以是合成的或天然存在的。在一些实施例中，以本领域已知的各种方式对mRNA进行化学修饰。例如，可以使用修饰的RNA，如Warren,L.等人在《细胞-干细胞(Cell Stem Cell)》7:618–30(2010)；WO2014081507A1；WO2012019168；WO2012045082；WO2012045075；WO2013052523；WO2013090648；US9572896B2中所描述的。在一些实施例中，通过将多核苷酸递送至细胞来增加感兴趣基因的表达。在一些实施例中，编码感兴趣基因的多核苷酸通过病毒或非病毒载体递送。在一些实施例中，感兴趣基因在DNA多核苷酸中编码，任选地通过本领域已知的任何病毒或非病毒方法递送。在一些实施例中，本公开提供了包含使细胞与包含编码感兴趣基因的DNA或mRNA的脂质纳米颗粒接触的方法。在一些实施例中，本公开的方法包含使细胞与包含编码感兴趣基因的DNA或RNA(例如，DNA基因组、负义RNA基因组、正义RNA基因组或双链RNA基因组)的病毒接触。在一些实施例中，病毒选自逆转录病毒、腺病毒、AAV、非整合慢病毒载体(LVV)和整合LVV。在一些实施例中，用质粒转染细胞。在一些实施例中，质粒包含编码重编程因子的多核苷酸。在一些实施例中，质粒包含包含重编程因子的转座子。
在一些实施例中，重编程因子作为编码一种或多种感兴趣蛋白质的多核苷酸提供。在一些实施例中，多核苷酸是RNA、DNA或mRNA多核苷酸。在一些实施例中，多核苷酸包含在至少100、200、300、400或500个核苷酸上与人类ASCL1(SEQ ID NO：2)的核苷酸序列包含至少70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的核酸序列。在一些实施例中，ASCL1多核苷酸与ASCL1的任何同种型共享同一性。在一些实施例中，ASCL1多核苷酸编码与人类ASCL1的序列(SEQ ID NO：1)至少70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的ASCL1蛋白。
在一些实施例中，本公开的组合物和方法提供了包含MYOCD多核苷酸的iCM细胞或重组病毒或非病毒载体或包含施用MYOCD多核苷酸的方法。在一些实施例中，MYOCD多核苷酸编码与人类MYOCD(SEQ ID NO：3)的序列至少70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的MYOCD蛋白。在一些实施例中，MYOCD多核苷酸在至少100、200、300、400或500个核苷酸上与人类MYOCD(SEQ ID NO：4)的核苷酸序列共享至少70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的同一性。在一些实施例中，MYOCD多核苷酸与MYOCD的任何同种型共享同一性。
在一些实施例中，工程改造的MYOCD蛋白作为编码工程改造的MYOCD蛋白的多核苷酸提供。
在一些实施例中，MYOCD多核苷酸编码与工程改造的MYOCD(例如SEQ ID NO：14)的序列至少70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的MYOCD蛋白。
在一些实施例中，MYOCD多核苷酸编码与工程改造的MYOCD(例如SEQ ID NO：15)的序列至少70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的MYOCD蛋白。
在一些实施例中，MYOCD多核苷酸编码与工程改造的MYOCD(例如SEQ ID NO：16)的序列至少70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的MYOCD蛋白。
在一些实施例中，编码感兴趣蛋白质的多核苷酸是合成的mRNA。合成的mRNA提供了制备感兴趣蛋白质的遗传信息，并且可以被化学修饰以避免引发免疫应答。Zangi等人,(2013)《自然生物技术(Nature Biotech)》31:898-907。由于mRNA不整合到宿主细胞基因组中，合成的mRNA作用一段时间，并且然后随着细胞分裂而消失。在一些实施例中，用例如假尿苷和/或5-甲基-胞苷修饰合成的mRNA，以降低对单链RNA的先天抗病毒反应。
在一些实施例中，编码一种或多种感兴趣蛋白质的多核苷酸可以是密码子优化的或以其它方式改变的，只要所编码基因的功能活性得以保留。在一些实施例中，多核苷酸编码一种或多种感兴趣基因的修饰或变体，包括截短、插入、缺失或片段，只要所编码基因的功能活性得以保留。
在一些实施例中，编码一种或多种感兴趣蛋白质的多核苷酸包含在表达盒中。在一些实施例中，表达盒包含编码一种或多种感兴趣蛋白质的一种或多种多核苷酸。例如，在一些实施例中，表达盒包含编码2、3、4、5、6、7、8、9或10个感兴趣基因的2、3、4、5、6、7、8、9或10个多核苷酸。
应当理解，当两种或更多种感兴趣蛋白质在细胞中表达时，可以使用一种或多种多核苷酸或表达盒。例如，可以使用多顺反子表达盒，其中一个表达盒可以包含表达多种蛋白质的多种多核苷酸。在一些实施例中，多顺反子表达盒在单个可读框中包含两个或更多个多核苷酸，多核苷酸通过口疮病毒属口蹄疫病毒(FMDV)多蛋白的2A区域连接在一起，如在Donnelly等人的《普通病毒学杂志(J.Gen.Virol.)》82:1013-15(2001)中描述的及其在本领域中已知的改进。2A区域产生从一个密码子到下一个密码子的核糖体“跳跃”而不形成肽键。在一些实施例中，多核苷酸包含内部切割位点，使得通过翻译后切割产生两种或更多种肽。
在一些实施例中，本公开的多顺反子载体包含编码通过接头连接的多种多肽的多核苷酸序列，该接头包含能够诱导核糖体跳跃或自我切割的肽。在一些实施例中，接头包含2A肽。如本文所用，术语“2A肽”是指被配置成从单个可读框产生两种或更多种蛋白质的一类核糖体跳跃或自切割肽。2A肽是18至22个残基长的病毒寡肽，其在真核细胞翻译期间介导多肽的“切割”。“2A肽”可指具有各种氨基酸序列的肽。在本公开中，应当理解，当慢病毒载体包含两个或更多个2A肽时，2A肽可以彼此相同或不同。设计和使用2A肽的详细方法由Szymczak-Workman等人在“2A肽连接的多顺反子载体的设计和构建(Design andConstruction of 2A Peptide-Linked Multicistronic Vectors)”《冷泉港实验方案(Cold Spring Harb.Protoc.)》2012年2月1日；2012(2):199-204中提供。在文献中，2A肽通常被称为自切割肽，但机理研究已经表明，观察到的“自切割”实际上是核糖体跳过2A肽C末端的甘氨酰-脯氨酰肽键形成的结果。Donnelly等人,《普通病毒学杂志》2001年5月；82(第5部分):1027-41。本发明不受理论约束或限于对2A肽功能的任何特定机理理解。
示范性2A肽包括但不限于表4中列出的那些。
表4：示范性2A肽
Figure BDA0003920830640000211
Figure BDA0003920830640000221
任选地，接头中的一个或多个进一步包含编码残基Gly-Ser-Gly的序列，其在一些实施例中位于2A肽的N-末端。2A肽的N-末端意指编码残基的序列在编码2A肽的序列的上游。通常，Gly-Ser-Gly基序将紧邻2A肽的N-末端，或在基序和2A肽之间插入1至10个其它氨基酸残基。在一些实施例中，编码该基序的多核苷酸序列是GGA AGC GGA。与任何编码肽的多核苷酸一样，可以改变核苷酸序列而不改变编码的肽序列。氨基酸残基的取代在本领域技术人员的技能范围内，并且应当理解，术语2A肽是指前述的变体，其保留了所需的跳跃/自我切割活性，但任选地相对于参考2A肽序列具有1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或更多个取代。Kim等人在《公共科学图书馆·综合(PLOS ONE)》6(4):e18556中描述了示范性2A肽。在一些实施例中，在同一构建体中使用两种或更多种不同的2A肽。据报道，不同的2A肽导致表达的提高。参见Liu等人,《科学报告(Sci Rep.)》2017；7:2193。
在一些实施例中，本公开提供了表达盒，其以5'至3'的顺序包含启动子、编码MYOCD-2A-ASCL1的多核苷酸和多腺苷酸化序列。在一些实施例中，表达盒包含与SEQ IDNO：35至少70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的多核苷酸。在一些实施例中，本公开提供了包含表达盒的重组AAV(rAAV)、包含表达盒的转移质粒或包含表达盒的rAAV颗粒。在一些实施例中，rAAV包含与SEQ ID NO：35至少70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的多核苷酸。在一些实施例中，本公开提供了包含表达盒的重组慢病毒(rLV)、包含表达盒的转移质粒或包含表达盒的rLV颗粒。在一些实施例中，rLV包含与SEQ ID NO：35至少70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的多核苷酸。
在一些实施例中，本公开提供了表达盒，其以5'至3'的顺序包含启动子、编码MyΔ3-2A-ASCL1的多核苷酸和多腺苷酸化序列。在一些实施例中，表达盒包含与SEQ ID NO：37至少70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的多核苷酸。在一些实施例中，本公开提供了包含表达盒的rAAV、包含表达盒的转移质粒或包含表达盒的rAAV颗粒。在一些实施例中，rAAV包含与SEQ ID NO：37至少70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的多核苷酸。在一些实施例中，本公开提供了包含表达盒的rLV、包含表达盒的转移质粒或包含表达盒的rLV颗粒。在一些实施例中，rLV包含与SEQ ID NO：37至少70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的多核苷酸。
在一些实施例中，本公开提供了表达盒，其以5'至3'的顺序包含启动子、编码ASCL1-2A-MYOCD的多核苷酸和多腺苷酸化序列。在一些实施例中，表达盒包含与SEQ IDNO：39至少70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的多核苷酸。在一些实施例中，本公开提供了包含表达盒的rAAV、包含表达盒的转移质粒或包含表达盒的rAAV颗粒。在一些实施例中，rAAV包含与SEQ ID NO：39至少70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的多核苷酸。在一些实施例中，本公开提供了包含表达盒的rLV、包含表达盒的转移质粒或包含表达盒的rLV颗粒。在一些实施例中，rLV包含与SEQ ID NO：39至少70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的多核苷酸。
在一些实施例中，本公开提供了表达盒，其以5'至3'的顺序包含启动子、编码ASCL1-2A-MyΔ3的多核苷酸和多腺苷酸化序列。在一些实施例中，表达盒包含与SEQ IDNO：41至少70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的多核苷酸。在一些实施例中，本公开提供了包含表达盒的rAAV、包含表达盒的转移质粒或包含表达盒的rAAV颗粒。在一些实施例中，rAAV包含与SEQ ID NO：41至少70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的多核苷酸。在一些实施例中，本公开提供了包含表达盒的rLV、包含表达盒的转移质粒或包含表达盒的rLV颗粒。在一些实施例中，rLV包含与SEQ ID NO：41至少70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的多核苷酸。
在一些实施例中，本公开提供了表达盒，其包含编码与SEQ ID NO：57-64中的任一者(例如MYOCD-2A-ASCL1，MyΔ3-2A-ASCL1，ASCL1-2A-MYOCD和ASCL1-2A-MyΔ3中的任一者)具有至少70％，71％，72％，73％，74％，75％，76％，77％，78％，79％，80％，81％，82％，83％，84％，85％，86％，87％，88％，89％，90％，91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％，99％或100％同一性的蛋白质序列的多核苷酸。
在一些实施例中，一种或多种重编程因子包含一种或多种微RNA。可用作重编程因子的微RNA包括miR-133a-2、miR-133a-1、miR-19b-2、miR-19b-1、miR-326、miR-1-1、miR-1298、miR-133b、miR-1-2、miR-92a-2、miR-20b、miR-20a、miR-141、miR-155、miR-17、hsa-let-7c、miR-202、miR-200a、miR-206、miR-509-1、miR-509-2、miR-124-3、miR-124-2、miR-378a、miR-378e、miR-378h、miR-378i、miR-137、miR-671、miR-24-1、miR-182、miR-302d、miR-96、miR-30c-2和miR-146b。
在一些实施例中，微RNA选自由miR-19b-1、miR-19b-2、miR-137、miR-133a-2、miR-671、miR-24-1、miR-182、miR-302d、miR-96、miR-30c-2、miR-146b和miR-133a-2组成的组。
在一些实施例中，微RNA选自由miR-133a-2、miR-133a-1、miR-19b-2、miR-19b-1、miR-326、miR-1-1、miR-1298、miR-133b、miR-1-2、miR-92a-2、miR-20b、miR-20a、miR-141、miR-155、miR-17、hsa-let-7c、miR-202、miR-200a、miR-206、miR-509-1、miR-509-2、miR-124-3、miR-124-2、miR-378a、miR-378e、miR-378h、miR-378i、miR-137、miR-671、miR-24-1、miR-182、miR-302d、miR-96、miR-30c-2和miR-146b组成的组。
在一些实施例中，微RNA选自由miR-133a-2、miR-133a-1、miR-19b-2、miR-19b-1、miR-326、miR-1-1、miR-1298、miR-133b、miR-1-2、miR-92a-2、miR-20b、miR-20a、miR-141、miR-155、miR-17、hsa-let-7c、miR-202、miR-200a、miR-206、miR-509-1、miR-509-2、miR-124-3、miR-124-2、miR-378a、miR-378e、miR-378h和miR-378i组成的组。
在一些实施例中，微RNA选自由miR-133a-2、miR-133a-1、miR-19b-2、miR-19b-1、miR-326、miR-1-1、miR-1298、miR-133b、miR-1-2、miR-92a-2、miR-20b、miR-20a、miR-141、miR-155、miR-17、hsa-let-7c、miR-202、miR-200a、miR-206、miR-509-1、miR-509-2、miR-124-3、miR-124-2、miR-378a、miR-378e、miR-378h、miR-378i、miR-137、miR-671、miR-24-1、miR-182、miR-302d、miR-96、miR-30c-2和miR-146b组成的组。
在一些实施例中，两种微RNA与MYOCD和/或ASCL1组合以诱导分化的细胞(例如成纤维细胞)重编程为心肌细胞。微RNA的可能组合包括在5'位置的miR-133a-2、miR-133-a1、miR-19b-2、miR-19b-1、miR-326、miR-1-1、miR-1298、miR-133-b、miR-1-2、miR-20-b和miR-20-a中的任一个，接着在3'位置的miR-133a-2、miR-133-a1、miR-19b-2、miR-19b-1、miR-326、miR-1-1、miR-1298、miR-133-b、miR-1-2、miR-20-b和miR-20-a中的任一个。在一些实施例中，组合多个miRNA，例如至少3、4或5个miRNA。可以使用相同miRNA的多个拷贝，例如相同微RNA的1、2、3、4、5或更多个拷贝。
感兴趣微RNA可通过任何方式提供，包括但不限于作为shRNA、siRNA或微RNA模拟物(任选地包括修饰例如硫代磷酸酯骨架、锁定核酸和胆固醇修饰)。在一些实施例中，感兴趣微RNA由编码微RNA的多核苷酸作为pre-miRNA表达。编码微RNA的多核苷酸通常可操作地连接到启动子。微RNA可以在其自身的转录物上或在与一种或多种其它因子(例如，编码感兴趣蛋白质的多核苷酸)共享的转录物上表达。在一些实施例中，MYOCD多核苷酸和/或ASCL1多核苷酸与编码微RNA的多核苷酸一起排列在载体中，使得微RNA和MYOCD和/或ASCL1从同一转录物表达。在一些实施例中，pre-miRNA序列在蛋白质编码序列(例如MYOCD、ASCL1、MYOCD-2A-ASCL1或ASCL1-2A-MYOCD)的5'。在一些实施例中，pre-miRNA序列在蛋白质编码序列(例如MYOCD、ASCL1、MYOCD-2A-ASCL1或ASCL1-2A-MYOCD)的3'。编码微RNA的多核苷酸可插入5'或3'非翻译区域(UTR)。编码微RNA的多核苷酸可插入内含子中。
表1提供了可用于本公开的组合物和方法的说明性pri-miRNA序列。在一些实施例中，pri-miRNA的茎或环中的1、2、3、4或更多个取代和/或插入是耐受的。在一些实施例中，多核苷酸包含与天然微RNA(例如天然人类微RNA)至少95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的序列。在一些实施例中，多核苷酸包含与SEQ ID NO：65至99中的任一者至少95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的序列。在一些实施例中，多核苷酸包含与SEQ ID NO：100至134中的任一者至少95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的序列。
在一些实施例中，多核苷酸包含与hsa-pri-miR-133a-2、hsa-pri-miR-133a-1、hsa-pri-miR-19b-2、hsa-pri-miR-19b-1、hsa-pri-miR-326、hsa-pri-miR-1-1、hsa-pri-miR-1298、hsa-pri-miR-133b、hsa-pri-miR-1-2、hsa-pri-miR-92a-2、hsa-pri-miR-20b、hsa-pri-miR-20a、hsa-pri-miR-141、hsa-pri-miR-155、hsa-pri-miR-17、hsa-pri-let-7c、hsa-pri-miR-202、hsa-pri-miR-200a、hsa-pri-miR-206、hsa-pri-miR-509-1、hsa-pri-miR-509-2、hsa-pri-miR-124-3、hsa-pri-miR-124-2、hsa-pri-miR-378a、hsa-pri-miR-378e、hsa-pri-miR-378h、hsa-pri-miR-378i、hsa-pri-miR-137、hsa-pri-miR-671、hsa-pri-miR-24-1、hsa-pri-miR-182、hsa-pri-miR-302d、hsa-pri-miR-96、hsa-pri-miR-30c-2和hsa-pri-miR-146b中的任一者至少95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的序列。
在一些实施例中，多核苷酸包含与hsa-MIR-133a-2、hsa-MIR-133a-1、hsa-MIR-19b-2、hsa-MIR-19b-1、hsa-MIR-326、hsa-MIR-1-1、hsa-MIR-1298、hsa-MIR-133b、hsa-MIR-1-2、hsa-MIR-92a-2、hsa-MIR-20b、hsa-MIR-20a、hsa-MIR-141、hsa-MIR-155、hsa-MIR-17、hsa-let-7c、hsa-MIR-202、hsa-MIR-200a、hsa-MIR-206、hsa-MIR-509-1、hsa-MIR-509-2、hsa-MIR-124-3、hsa-MIR-124-2、hsa-MIR-378a、hsa-MIR-378e、hsa-MIR-378h、hsa-MIR-378i、hsa-MIR-137、hsa-MIR-671、hsa-MIR-24-1、hsa-MIR-182、hsa-MIR-302d、hsa-MIR-96、hsa-MIR-30c-2和hsa-MIR-146b中的任一者至少95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的序列。
微RNA结合位点
在一方面，本公开提供了一种载体，其包含多核苷酸，该多核苷酸包含编码一种或多种转基因的多核苷酸序列和微RNA的微RNA结合位点，其中该微RNA结合位点可操作地连接到编码一种或多种转基因的多核苷酸序列，并且其中与心脏成纤维细胞相比，微RNA在心肌细胞或心肌细胞祖细胞中表达水平较高。通过将微RNA结合位点插入编码一种或多种转基因的mRNA转录物的编码序列中，微RNA结合位点可以可操作地连接到多核苷酸。插入位点可以在编码或非编码区域中。编码区域中的插入可以通过选择与编码的蛋白质耐受的位置(例如环)并确保使用框内插入来插入结合位点来产生。结合位点可以插入3'非翻译区域(3'UTR)，即在最后一个转基因的末端和多腺苷酸化位点之间。结合位点也可插入一对转基因之间或5'UTR中。
微RNA结合位点还可以通过基因调控回路间接偶联到一个或多个转基因。例如，微RNA结合位点可以可操作地连接到转录增强子、翻译增强子或辅因子。在一些实施例中，载体编码多种mRNA转录物。微RNA结合位点可以在一些或所有这些转录物中提供。例如，微RNA结合位点可以可操作地连接到编码编码ASCL1的mRNA转录物的多核苷酸、编码编码心肌蛋白的mRNA转录物的多核苷酸或两者。
在一些实施例中，与心脏成纤维细胞相比，微RNA结合位点促进心肌细胞或心肌细胞祖细胞中一种或多种转基因的表达的特异性抑制。
在一些实施例中，与微RNA在心肌细胞中的表达水平和/或微RNA在用心肌细胞重编程因子处理超过约7天、超过约一周、超过约两周、超过约三周或超过约四周的心脏成纤维细胞中的表达水平相比，微RNA在心脏成纤维细胞中以较低水平表达和/或在用心肌细胞重编程因子处理约7天或更少、约一周或更少、约两周或更少、约三周或更少、或约四周或更少的心脏成纤维细胞中以较低水平表达。
在一些实施例中，微RNA是miR-208。在一些实施例中，微RNA是miR-1。在一些实施例中，微RNA是miR-133。在一些实施例中，微RNA是miR-208a。在一些实施例中，微RNA是miR-208b。
一些实施例中，微RNA是miR-208b-3p。在一些实施例中，微RNA结合位点与ACAAACCTTTTGTTCGTCTTAT(SEQ ID NO：135)共享>70％的同一性，并且在包含序列CGTCTTA的加下划线的种子区域中没有错配。在一些实施例中，微RNA结合位点是AAAATATATGTAATCGTCTTAA(SEQ ID NO：136)。
在一些实施例中，微RNA结合位点是ACAAACCTTTTGTTCGTCTTAT(SEQ ID NO：135)。在一些实施例中，微RNA结合位点是TGAAACCTTTTGTTCGTCTTAT(SEQ ID NO：137)。在一些实施例中，多核苷酸包含至少两个用于微RNA的微RNA结合位点。在一些实施例中，多核苷酸包含至少三个用于微RNA的微RNA结合位点。
在一些实施例中，多核苷酸包含至少四个用于微RNA的微RNA结合位点。在一些实施例中，多核苷酸包含至少五个用于微RNA的微RNA结合位点。在一些实施例中，多核苷酸包含至少六个用于微RNA的微RNA结合位点。在一些实施例中，多核苷酸包含至多六个用于微RNA的微RNA结合位点。在一些实施例中，多核苷酸包含一个、两个、三个、四个、五个或六个用于微RNA的微RNA结合位点。在一些实施例中，一种或多种转基因包含一种或多种心肌细胞重编程因子。在一些实施例中，一种或多种心肌细胞重编程因子包含MYOCD、ASCL1、GATA4、MEF2C、TBX5、miR-133和MESP1中的两种或更多种。在一些实施例中，一种或多种心肌细胞重编程因子包含MYOCD、ASCL1、GATA4、MEF2C、TBX5、miR-133和MESP1中的三种或更多种。在一些实施例中，一种或多种心肌细胞重编程因子包含MYOCD、ASCL1、GATA4、MEF2C、TBX5、miR-133和MESP1中的四种或更多种。在一些实施例中，一种或多种心肌细胞重编程因子包含MYOCD、ASCL1、GATA4、MEF2C、TBX5、miR-133和MESP1中的五种或更多种。在一些实施例中，一种或多种心肌细胞重编程因子包含MYOCD和ASCL1。在一些实施例中，多核苷酸序列编码MYOCD-2A-ASCL1蛋白。
本公开不限于编码心肌细胞重编程因子的载体。实际上，本文所述的载体可以递送不期望在所选择的非靶细胞中表达的其它基因。例如且不限于，载体可用于将基因治疗递送至除心肌细胞以外的细胞。靶细胞可以是心脏成纤维细胞或任何其它细胞类型。在一些实施例中，本公开的载体可用于转导除心脏以外的器官(例如肺、脑、肝、肌肉等)中的细胞。
在一些实施例中，MYOCD包含内部缺失。国际专利申请第PCT/US2019/049150号提供了说明性MYOCD基因，其通过引用整体并入本文。
在一些实施例中，多核苷酸以5'至3'的顺序包含启动子、编码MYOCD和ASCL1的序列、微RNA结合位点和多腺苷酸化序列。
在一些实施例中，多核苷酸包含编码miR-133的序列。
在一些实施例中，载体是病毒载体。在一些实施例中，病毒载体是腺相关病毒(AAV)载体、逆转录病毒载体、慢病毒载体、腺病毒载体、单纯疱疹病毒载体等。在一些实施例中，AAV载体是AAV9载体。在一些实施例中，AAV载体是AAV5载体。
在另一方面，本公开提供了一种将心脏成纤维细胞重编程为心肌细胞的方法，其包含a)通过用有效量的诱导心脏成纤维细胞重编程为心肌细胞的组合物处理心脏成纤维细胞并测量心脏成纤维细胞中一种或多种微RNA的表达来选择在诱导心肌细胞中特异性表达的微RNA，其中所选择的微RNA仅在预定时间之后在心脏成纤维细胞中表达；b)生成包含多核苷酸的载体，该多核苷酸包含一个或多个用于所选择的微RNA的微RNA结合位点，该所选择的微RNA可操作地连接到编码一种或多种心肌细胞重编程因子的多核苷酸；以及c)使心脏成纤维细胞与有效量的载体接触。
在一些实施例中，微RNA结合位点抑制一种或多种心肌细胞重编程因子在心肌细胞细胞中的表达。在一些实施例中，微RNA结合位点抑制一种或多种心肌细胞重编程因子在骨骼肌细胞中的表达。在一些实施例中，微RNA结合位点抑制一种或多种心肌细胞重编程因子在心肌细胞祖细胞中的表达。
在一些实施例中，微RNA是miR-208。在一些实施例中，微RNA是miR-1。在一些实施例中，微RNA是miR-133。在一些实施例中，微RNA是miR-208a。在一些实施例中，微RNA是miR-208b。
一些实施例中，微RNA是miR-208b-3p。在一些实施例中，微RNA结合位点与ACAAACCTTTTGTTCGTCTTAT(SEQ ID NO：135)共享>70％、>75％、>％80、>90％、>95％、>99％或>100％的同一性，并且在包含序列CGTCTTA的加下划线的种子区域中没有错配。在一些实施例中，微RNA结合位点是AAAATATATGTAATCGTCTTAA(SEQ ID NO：136)。在一些实施例中，微RNA结合位点是ACAAACCTTTTGTTCGTCTTAT(SEQ ID NO：135)。在一些实施例中，微RNA结合位点是TGAAACCTTTTGTTCGTCTTAT(SEQ ID NO：137)。在一些实施例中，多核苷酸包含至少两个用于微RNA的微RNA结合位点。
在一些实施例中，AAV载体包含与以下共享>70％、>75％、>％80、>90％、>95％、>99％或>100％同一性的3'UTR：
ACAAACCTTTTGTTCGTCTTATAAAACAAACCTTTTGTTCGTCTTATAAAACAAACCTTTTGTTCGTCTTATAAAACAAACCTTTTGTTCGTCTTAT(SEQ ID NO：138)。
在一些实施例中，AAV载体包含与以下共享>70％、>75％、>％80、>90％、>95％、>99％或>100％同一性的3'UTR：
ACAAACCTTTTGTTCGTCTTATAAAACAAACCTTTTGTTCGTCTTAT(SEQ ID NO：139)。
在一些实施例中，AAV载体包含与以下共享>70％、>75％、>％80、>90％、>95％、>99％或>100％同一性的3'UTR：
AAAATATATGTAATCGTCTTAAAAAAAATATATGTAATCGTCTTAAAAAAAATATATGTAATCGTCTTAAAAAAAATATATGTAATCGTCTTAA(SEQ ID NO：140)。
在一些实施例中，多核苷酸包含至少四个用于微RNA的微RNA结合位点。在一些实施例中，多核苷酸包含至多六个用于微RNA的微RNA结合位点。在一些实施例中，多核苷酸包含四个用于微RNA的微RNA结合位点。在另一方面，本公开提供将心脏成纤维细胞重编程为心肌细胞细胞的方法，其包含使心脏成纤维细胞与有效量的根据权利要求1至28中任一项所述的载体接触。
在一些实施例中，该方法诱导至少一种心肌细胞表型标记物在心脏成纤维细胞中的表达。在一些实施例中，微RNA结合位点是用于miR-1、miR-133、miR-208a、miR-208b和/或miR-208b-3p的微RNA结合位点。在一些实施例中，微RNA结合位点是用于miR-1的微RNA结合位点。在一些实施例中，微RNA结合位点是用于miR-133的微RNA结合位点。
在一些实施例中，微RNA结合位点是用于miR-208a的微RNA结合位点。在一些实施例中，微RNA结合位点是用于miR-208b的微RNA结合位点。在一些实施例中，微RNA结合位点是用于miR-208b-3p的微RNA结合位点。在一些实施例中，多核苷酸包含编码miR-133的序列。
在一些实施例中，心力衰竭是由心肌梗塞引起的。在一些实施例中，心力衰竭是射血分数降低的心力衰竭(HFrEF)。在一些实施例中，与施用之前的受试者相比，该方法增加了受试者中的射血分数。
在一些实施例中，与未经治疗的对照受试者相比，该方法增加了受试者的射血分数。在一些实施例中，该方法将受试者中的射血分数增加至至少约28％、29％、30％、31％或32％。在一些实施例中，在预定时间之后，任选地在施用AAV载体后八周评估射血分数。在一些实施例中，与施用之前的受试者相比，该方法减少了受试者中的疤痕组织形成。在一些实施例中，与未经治疗的对照受试者相比，该方法减少了受试者中的疤痕组织形成。在一些实施例中，该方法将受试者中的疤痕组织形成减少至至多约10％、11％、12％、13％、14％、15％、16％、17％、18％、19％或20％。在一些实施例中，在预定时间之后，任选地在施用AAV载体之后八周评估疤痕组织形成。
III.载体
在一些实施例中，采用将细胞重编程为心脏谱系的重编程因子可通过载体引入所选择的细胞或所选择的细胞群。在一些实施例中，载体是核酸载体，例如质粒(例如DNA质粒或RNA质粒)、转座子、粘粒、细菌或酵母人工染色体或病毒载体。在一些实施例中，载体是非核酸载体，例如纳米颗粒。在一些实施例中，本文所描述的载体包含肽，例如细胞穿透肽或细胞内化序列。细胞穿透肽是能够跨质膜转运的小肽。示范性细胞穿透肽包括但不限于触角足序列、TAT、HIV-Tat、穿透蛋白、Antp-3A(Antp突变体)、蟾蜍素II、运输蛋白、MAP(模型两亲肽)、K-FGF、Ku70、朊病毒、pVEC、Pep-1、SynB1、Pep-7、I-IN-1、BGSC(双胍盐-亚精胺-胆固醇)和BGTC(双胍盐-胆甾醇-胆固醇)。
重组遗传学领域的技术可以用于此类重组表达。公开了重组遗传学的一般方法的基础教材包括Sambrook等人的《分子克隆实验室手册(Molecular Cloning,A LaboratoryManual)》(第3版2001)；Kriegler的《基因转移和表达:实验室手册(Gene Transfer andExpression:ALaboratory Manual)》(1990)；和《分子生物学中的最新方案(CurrentProtocols in Molecular Biology)》(Ausubel等人1994年编辑))。在一些实施例中，载体不含有哺乳动物复制起点。在一些实施例中，表达载体不整合到基因组中和/或通过不含有哺乳动物复制起点的载体引入。
在一些情况下，除了一种或多种重编程因子之外，表达载体编码或包含促进鉴定或选择已经转染、转导或感染的细胞的标记基因。标记基因的实例包括但不限于编码荧光蛋白的基因，例如增强的绿色荧光蛋白、Ds-Red(DsRed：珊瑚红色荧光蛋白(RFP)；Bevis等人,(2002)《自然-生物技术》20(11):83-87)、黄色荧光蛋白、mCherry和蓝色荧光蛋白；以及编码赋予对选择剂抗性的蛋白质的基因，例如新霉素抗性基因、嘌呤霉素抗性基因、杀稻瘟菌素抗性基因等。
在一个实施例中，表达载体进一步包含自杀基因。自杀基因的表达可由表达至少一种增殖和/或细胞周期再进入因子多肽编码核苷酸的相同或不同启动子调控。自杀基因是允许对细胞进行负选择的基因。在本文所述的方法中，自杀基因用作安全系统，允许通过引入选择剂杀死表达该基因的细胞。这在重组基因引起突变导致细胞生长失控的情况下是期望的。已经鉴定了许多自杀基因系统，包括单纯疱疹病毒胸苷激酶(tk或TK)基因、胞嘧啶脱氨酶基因、水痘-带状疱疹病毒胸苷激酶基因、硝基还原酶基因、大肠杆菌(E.coli)gpt基因和大肠杆菌Deo基因(还参见例如Yazawa K、Fisher W E、Brunicardi F C的：“自杀基因治疗癌症的最新进展(Current progress in suicide gene therapy for cancer)”,《世界外科杂志(World J.Surg.)》(2002)26(7):783-9)。在一个实施例中，自杀基因是TK基因。在一方面，TK基因是野生型TK基因。在其它方面，TK基因是基因的突变形式，例如sr23tk。可以使用更昔洛韦(ganciclovir)杀死表达TK蛋白的细胞。在另一实施例中，编码四环素激活蛋白的核酸和自杀基因由一个启动子调控。
A.核酸载体
1.病毒载体
合适的病毒载体包括但不限于病毒载体(例如基于痘苗病毒的病毒载体；脊髓灰质炎病毒；腺病毒(例如，Li等人,(1994)《调查眼科学与视觉科学(Invest Opthalmol VisSci)》35:2543-2549；Borras等人,(1999)《基因治疗(Gene Ther)》6:515-524；Li和Davidson,(1995)《美国国家科学院院刊》92:7700-7704；Sakamoto等人,(1999)《人类基因治疗(Hum Gene Ther)》5:1088-1097；WO 94/12649；WO 93/03769；WO 93/19191；WO 94/28938；WO 95/11984和WO 95/00655)；腺相关病毒(例如，Ali等人,(1998)《人类基因治疗》9(l):81-86,1998，Flannery等人,(1997)《美国国家科学院院刊》94:6916-6921；Bennett等人,(1997)《调查眼科学与视觉科学》38:2857-2863；Jomary等人,(1997)《基因治疗》4:683-690；Rolling等人,(1999),《人类基因治疗》10:641-648；Ali等人,(1996)《人类分子遗传学(Hum Mol Genet.)》5:591-594；WO 93/09239，Samulski等人,(1989)《病毒学杂志(J.Vir.)》63:3822-3828；Mendelson等人,(1988)《病毒学(Virol.)》166:154-165；和Flotte等人,(1993)《美国国家科学院院刊》90:10613-10617；SV40；单纯疱疹病毒；人类免疫缺陷病毒(例如，Miyoshi等人,(1997)《美国国家科学院院刊》94:10319-10323；Takahashi等人,(1999)《病毒学杂志》73:7812-7816)；逆转录病毒载体(例如，鼠白血病病毒、脾坏死病毒和衍生自逆转录病毒如劳斯肉瘤病毒、哈维肉瘤病毒、禽白血病病毒、慢病毒、人类免疫缺陷病毒、骨髓增生性肉瘤病毒和乳腺肿瘤病毒的载体)；等。许多合适的表达载体是本领域技术人员已知的，并且许多是可商购的。以举例的方式提供了以下载体；对于真核生物细胞：pXTl、pSG5(Stratagene)、pSVK3、pBPV、pMSG、pSVLSV40(法玛西亚(Pharmacia))和pAd(美国生命技术公司(Life Technologies))。然而，可使用任何其它载体，只要其与本公开的细胞相容。
某些病毒通过受体介导的胞吞作用感染细胞或进入细胞并且稳定有效地表达病毒基因的能力使它们成为将外源核酸转移到细胞(例如哺乳动物细胞)中的有吸引力的候选物。病毒载体可以包括控制序列，例如用于表达感兴趣多肽的启动子。尽管许多病毒载体整合到宿主细胞基因组中，但如果需要，可以除去或改变允许此类整合的片段以防止此类整合。此外，在一些实施例中，载体不含有哺乳动物复制起点。下文描述了可用于将编码转录因子的核酸递送至所选择的细胞中的病毒载体的非限制性实例。在一些实施例中，病毒载体衍生自复制缺陷型病毒。
通常，其它有用的病毒载体是基于非细胞病变的真核病毒，其中非基本基因已被感兴趣多肽替换。非细胞病变的病毒包括某些逆转录病毒，其生命周期涉及将基因组病毒RNA逆转录成DNA，随后前病毒整合到宿主细胞DNA中。通常，逆转录病毒是复制缺陷的(例如，能够指导所需转录物的合成，但不能制造感染性颗粒)。此类遗传改变的逆转录病毒表达载体通常用于体内多核苷酸的高效转导。
在一些实施例中，编码重编程因子的多核苷酸可容纳在已被工程改造以表达特异性结合配体的有感染性的病毒中。因此病毒颗粒将特异性结合靶细胞的同源受体并将内容物递送至细胞。在一些实施例中，病毒被修饰以赋予特定的病毒趋性，例如病毒优先感染成纤维细胞、心脏细胞、或更特别地心脏成纤维细胞(CF)。对于AAV，衣壳蛋白可以发生突变以改变病毒载体的趋性。对于慢病毒，可以通过使用不同的包膜蛋白来修饰趋性；这被称为“假型化”。
a.逆转录病毒载体
在一些实施例中，病毒载体是逆转录病毒载体。逆转录病毒可以将它们的基因整合到宿主基因组中，转移大量的外源遗传物质，感染广谱的物种和细胞类型，并且可以包装在特殊的细胞系中(Miller等人,《美国临床肿瘤学杂志(Am.J.Clin.Oncol.)》,15(3):216-221,1992)。在一些实施例中，逆转录病毒载体被改变，使得其不整合到宿主细胞基因组中。
重组逆转录病毒可包含病毒多肽(例如逆转录病毒env)以有助于进入靶细胞。此类病毒多肽在本领域中是公认的，例如，美国专利第5,449,614号。病毒多肽可以是双嗜性病毒多肽，例如双嗜性env，其有助于进入衍生自多个物种的细胞，包括原始宿主物种之外的细胞。病毒多肽可以是异嗜性病毒多肽，其有助于进入原始宿主物种之外的细胞。在一些实施例中，病毒多肽是亲嗜性病毒多肽，例如亲嗜性env，其有助于进入原始宿主物种的细胞。
能够帮助逆转录病毒进入细胞的病毒多肽的实例包括但不限于：MMLV双嗜性env、MMLV亲嗜性env、MMLV异嗜性env、水疱性口炎病毒-g蛋白(VSV-g)、HIV-1env、长臂猿白血病病毒(GALV)env、RD114、FeLV-C、FeLV-B、MLV 10A1 env基因及其变体，包括嵌合体。Yee等人,(1994)《细胞生物学方法(Methods Cell Biol)》,Pt A:99-l 12(VSV-G)；美国专利第5,449,614号。在一些情况下，病毒多肽被遗传修饰以促进表达或增强与受体的结合。
逆转录病毒构建体可衍生自一系列逆转录病毒，例如MMLV、HIV-1、SIV、FIV或本文所述的另一种逆转录病毒。逆转录病毒构建体可以编码特定病毒的多于一个复制周期所需的所有病毒多肽。在一些情况下，通过添加其它因子或其它病毒多肽来提高病毒进入的效率。在其它情况下，由逆转录病毒构建体编码的病毒多肽不支持多于一个的复制周期，例如，美国专利第6,872,528号。在此类情况下，添加其它因子或其它病毒多肽可有助于促进病毒进入。在示范性实施例中，重组逆转录病毒是包含VSV-g多肽但不包含HIV-1env多肽的HIV-1病毒。
逆转录病毒构建体可以包含：启动子、多克隆位点和/或抗性基因。启动子的实例包括但不限于CMV、SV40、EFla、β-肌动蛋白；逆转录病毒LTR启动子和诱导型启动子。逆转录病毒构建体还可以包含包装信号(例如，衍生自MFG载体的包装信号；psi包装信号)。本领域已知的一些逆转录病毒构建体的实例包括但不限于：pMX、pBabeX或其衍生物。Onishi等人,(1996)《实验血液学(perimental Hematology)》,24:324-329。在一些情况下，逆转录病毒构建体是自身灭活慢病毒载体(SIN)载体。Miyoshi等人,(1998)《病毒学杂志》72(10):8150-8157。在一些情况下，逆转录病毒构建体是LL-CG、LS-CG、CL-CG、CS-CG、CLG或MFG。Miyoshi等人,(1998)《病毒学杂志》72(10):8150-8157；Onishi等人,(1996)《实验血液学》,24:324-329；Riviere等人,(1995)《美国国家科学院院刊》,92:6733-6737。
逆转录病毒载体可以通过将核酸(例如，编码感兴趣多肽或RNA的核酸)插入病毒基因组代替一些病毒序列以产生复制缺陷的病毒来构建。为了产生病毒体，构建了含有gag、pol和env基因但没有LTR和包装组分的包装细胞系(Mann等人,《细胞》33:153-159,1983)。当将含有cDNA的重组质粒与逆转录病毒LTR和包装序列一起引入特定细胞系(例如，通过磷酸钙沉淀)时，包装序列允许将重组质粒的RNA转录物包装到病毒颗粒中，然后将其分泌到培养基中(Nicolas和Rubinstein，在载体中：分子克隆载体及其用途概述“In:Vectors:A survey of molecular cloning vectors and their uses”,Rodriguez和Denhardt编辑,Stoneham:Butterworth,第494至513页,1988；Temin,“在：基因转移中In:Gene Transfer”,Kucherlapati(编辑),纽约:Plenum出版社,第149至188页,1986；Mann等人,《细胞》,33:153-159,1983)。然后收集含有重组逆转录病毒的培养基，任选浓缩，并用于基因转移。逆转录病毒载体能够感染多种细胞类型。然而，整合和稳定表达通常涉及宿主细胞的分裂(Paskind等人,《病毒学》,67:242-248,1975)。
b.腺病毒载体
在一些实施例中，病毒载体是腺病毒载体。腺病毒的遗传组织包括约36kb的线性双链DNA病毒，其允许用高达7kb的外源序列取代大部分腺病毒DNA(Grunhaus等人,《病毒学研讨会(Seminar in Virology)》,200(2):535-546,1992)。可以使用腺病毒辅助转染将重编程因子引入细胞。在使用腺病毒偶联系统的细胞系统中已经报道了增加的转染效率(Kelleher和Vos，Biotechniques，17(6)：1110-7,1994；Cotten等人,《美国国家科学院院刊》,美国,89(13):6094-6098,1992；Curiel,《自然免疫学(Nat Immun)》,13(2-3):141-64,1994。)。
c.腺相关病毒(AAV)载体
在一些实施例中，病毒载体是AAV载体。AAV是有吸引力的载体系统，因为它具有高整合频率并且它可以感染非分裂细胞，因此使得其可用于将多核苷酸递送至哺乳动物细胞中，例如在组织培养中(Muzyczka,《微生物学和免疫学最新热点(Curr Top MicrobiolImmunol)》,158:97-129,1992)或体内。美国专利第5,139,941号和第4,797,368号描述了关于rAAV载体的生成和使用的细节，其均通过引用整体并入本文。
AAV是一种复制缺陷型细小病毒，其单链DNA基因组长约4.7kb，包括两个145个核苷酸的反向末端重复序列(ITR)。AAV有多种血清型。AAV血清型基因组的核苷酸序列是已知的。例如，AAV-1的完整基因组在GenBank登录号NC_002077中提供；AAV-2的完整基因组在GenBank登录号NC_001401和Srivastava等人,《病毒学杂志》,45:555-564(1983)中提供；AAV-3的完整基因组在GenBank登录号NC_1829中提供；AAV-4的完整基因组在GenBank登录号NC_001829中提供；AAV-5基因组在GenBank登录号AF085716中提供；AAV-6的完整基因组在GenBank登录号NC_00 1862中提供；AAV-7和AAV-8基因组的至少部分分别在GenBank登录号AX753246和AX753249中提供；AAV-9基因组在Gao等人,《病毒学杂志》,78:6381-6388(2004)中提供；AAV-10基因组在《分子疗法(Mol.Ther.)》,13(1):67-76(2006)中提供。以及AAV-11基因组在《病毒学》,330(2):375-383(2004)中提供.AAV rh.74基因组的序列在美国专利9,434,928中提供，其通过引用并入本文。指导病毒DNA复制(rep)、衣壳化/包装和宿主细胞染色体整合的顺式作用序列含有在AAV ITR中。三种AAV启动子(命名为p5、pl9和p40以表示其相对图谱位置)驱动编码rep和cap基因的两个AAV内部可读框的表达。两个rep启动子(p5和pi 9)与单个AAV内含子(在核苷酸2107和2227)的差异剪接偶联，导致从rep基因产生四个rep蛋白(rep 78、rep 68、rep 52和rep 40)。Rep蛋白具有多种酶特性，其最终负责复制病毒基因组。cap基因由p40启动子表达并且其编码三种衣壳蛋白VP1、VP2和VP3。可替代的剪接和非共有翻译起始位点负责三种相关衣壳蛋白的产生。单个共有多腺苷酸化位点位于AAV基因组的图谱位置95。Muzyczka,“微生物学和免疫学的最新主题(Current Topicsin Microbiology and Immunology)”,158:97-129(1992)中综述了AAV的生命周期和遗传学。
AAV具有独特的特征，使其作为将外源DNA递送至细胞的载体是有吸引力的，例如在基因治疗中。培养细胞的AAV感染是非细胞病变的，并且人类和其它动物的自然感染是静默的和无症状的。此外，AAV感染许多哺乳动物细胞，允许体内靶向许多不同组织的可能性。此外，AAV转导缓慢分裂和不分裂的细胞，并且可以作为转录活性核附加体(染色体外元件)基本上在那些细胞的生命周期内存在。AAV前病毒基因组作为克隆DNA插入质粒中，这使得重组基因组的构建是可行的。此外，因为指导AAV复制和基因组衣壳化的信号含有在AAV基因组的ITR内，基因组内部大约4.3kb的部分或全部(编码复制和结构衣壳蛋白，rep-cap)可能被外源DNA替换。为了生成AAV载体，可以反式提供rep和cap蛋白。AAV的另一重要特征是它是一种极其稳定和强大的病毒。它容易经受用于使腺病毒灭活的条件(在56℃至65℃下数小时)，使得低温保存AAV的重要性降低。AAV甚至可以被冻干。最后，AAV感染的细胞对二次感染没有抗性。
rAAV基因组中的AAV DNA可以来自重组病毒可衍生的任何AAV血清型，包括但不限于AAV血清型AAV-1、AAV-2、AAV-3、AAV-4、AAV-5、AAV-6、AAV-7、AAV-8、AAV-9、AAV-10、AAV-11、AAV-12、AAV-13和AAV rh74。假型化rAAV的生产公开于例如WO01/83692中。也考虑了其它类型的rAAV变体，例如具有衣壳突变的rAAV。各种AAV血清型基因组的核苷酸序列是本领域已知的。本公开的AAV载体包括血清型AAV1、AAV2、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10、AAV39、AAV43、AAV.rh74和AAV.rh8的AAV载体。US 7,105,345；US 15/782,980；US 7,259,151；US 6,962,815；US 7,718,424；US6,984,517；US 7,718,424；US 6,156,303；US 8,524,446；US 7,790,449；US 7,906,111；US9,737,618；美国申请15/433,322；US 7,198,951中提供了说明性AAV载体，其中的每一个以全文引用的方式并入。
在一些实施例中，AAV表达载体被假型化以增强靶向。为了促进成纤维细胞中的基因转移和维持表达，可以使用AAV5、AAV7和AAV8。在一些情况下，AAV2基因组被包装到分别产生假型载体AAV2/5、AAV2/7和AAV2/8的衣壳中，如Balaji等人,《外科研究期刊(J SurgRes.)》2013年9月；184(1):691-698中所描述的。在一些实施例中，AAV9可用于靶向肌成纤维细胞样谱系中的表达，如Piras等人,《基因治疗》23:469–478(2016)中所描述的。在一些实施例中，使用AAV1、AAV6或AAV9，并且在一些实施例中，将AAV工程改造，如Asokari等人,《人类基因治疗》2013年11月；24(11):906–913；Pozsgai等人,《分子疗法》2017年4月5日；25(4):855–869；Kotterman、M.A.和D.V.Schaffer(2014)“工程改造的腺相关病毒用于临床基因治疗(Engineering Adeno-Associated Viruses for Clinical Gene Therapy)”《自然综述遗传学(Nature Reviews Genetics)》,15:445-451；以及Schaffer等人的US20160340393A1中所描述的。在一些实施例中，病毒载体是如US20180066285A1中所描述的被工程改造以增加靶细胞感染性的AAV。
d.慢病毒载体
在一些实施例中，病毒载体是慢病毒载体。慢病毒是复杂的逆转录病毒，除了常见的逆转录病毒基因gag、pol和env外，还含有具有调控或结构功能的其它基因。关于慢病毒载体的信息可在例如Naldini等人,《科学(Science)》272(5259):263-267,1996；Zufferey等人,《自然-生物技术》15(9):871-875,1997；Blomer等人,《病毒学杂志》71(9):6641-6649,1997；美国专利第6,013,516号和第5,994,136号中获得，其中的每一个以全文引用的方式并入。慢病毒的一些实例包括人类免疫缺陷病毒：HIV-1、HIV-2和猿猴免疫缺陷病毒：SIV。慢病毒载体已经通过减弱HIV毒力基因生成，例如基因env、vif、vpr、vpu和nef被删除以使载体具有生物安全性。采用的慢病毒也可以是复制和/或整合缺陷的。
重组慢病毒载体能够感染非分裂细胞，并且可用于体内和离体基因转移和核酸序列的表达。例如，美国专利5,994,136描述了能够感染非分裂细胞的重组慢病毒，其中合适的宿主细胞用两种或更多种携带包装功能的载体转染，即gag、pol和env，以及rev和tat，该专利全文引入本文作为参考。这方面的技术人员可以通过将包膜蛋白与抗体或特定配体连接用于靶向特定细胞类型的受体来靶向重组病毒。例如，靶特异性载体可通过将感兴趣核酸区段(包括调控区域)与编码特定靶细胞类型上受体的配体的另一基因一起插入病毒载体而产生。
慢病毒载体是本领域已知的，参见Naldini等人,(1996和1998)；Zufferey等人,(1997)；Dull等人,1998,美国专利第6,013,516号和第5,994,136号；其通过引用并入本文。一般来说，这些载体是基于质粒或基于病毒的，并且被配置成携带用于掺入外源核酸、用于选择和用于将核酸转移到宿主细胞中的基本序列。在一些情况下，慢病毒载体与一种或多种慢病毒包装质粒同时引入细胞，其可包括但不限于pMD2.G、pRSV-rev、pMDLG-pRRE和pRRL-GOI。将慢病毒载体单独或与慢病毒包装质粒组合引入细胞可导致慢病毒载体被包装成慢病毒颗粒。
2.生产病毒载体的方法
通常，通过将病毒DNA或RNA构建体引入生产者细胞来生产病毒载体。在一些情况下，生产者细胞不表达外源基因。在其它情况下，生产者细胞是“包装细胞”，其包含一种或多种外源基因，例如编码一种或多种gag、pol或env多肽和/或一种或多种逆转录病毒gag、pol或env多肽的基因。逆转录病毒包装细胞可包含编码有助于进入靶细胞的病毒多肽例如VSV-g的基因。在一些情况下，包装细胞包含编码一种或多种慢病毒蛋白，例如gag、pol、env、vpr、vpu、vpx、vif、tat、rev或nef的基因。在一些情况下，包装细胞包含编码腺病毒蛋白例如El A或El B或其它腺病毒蛋白的基因。例如，由包装细胞提供的蛋白质可以是逆转录病毒衍生的蛋白质如gag、pol和env；慢病毒衍生的蛋白质如gag、pol、env、vpr、vpu、vpx、vif、tat、rev和nef；和腺病毒衍生的蛋白质如El A和E1 B。在许多实例中，包装细胞提供衍生自病毒的蛋白质，该病毒不同于衍生自病毒载体的病毒。从包装细胞生产重组病毒的方法及其用途已得到充分确立；参见，例如，美国专利第5,834,256号；第6,910,434号；第5,591,624号；第5,817,491号；第7,070,994号和第6,995,009号。
包装细胞系包括但不限于任何易于转染的细胞系。包装细胞系可基于293T细胞、NIH3T3、COS或HeLa细胞系。包装细胞通常用于包装缺乏至少一种编码病毒包装所需蛋白质的基因的病毒载体质粒。任何可以提供缺乏由这种病毒载体或质粒编码的蛋白质的蛋白质或多肽的细胞都可以用作包装细胞。包装细胞系的实例包括但不限于：铂-E(Plat-E)、铂-A(Plat-A)、BOSC 23(ATCC CRL 11554)和Bing(ATCC CRL 11270)。Morita等人,(2000)《基因治疗》7(12):1063-1066；Onishi等人,(1996)《实验血液学》,24:324-329；美国专利第6,995,009号。商业包装系也是有用的，例如Ampho-Pak 293细胞系、Eco-Pak 2-293细胞系、RetroPack PT67细胞系和Retro-X通用包装系统(均可从Clontech获得)。
3.质粒
病毒载体质粒(或构建体)包含：pMXs、pMxs-IB、pMXs-puro、pMXs-neo(pMXs-IB是携带杀稻瘟素抗性基因而不是pMXs-puro的嘌呤霉素抗性基因的载体)Kimatura等人,(2003)《实验血液学》31:1007-1014；MFG Riviere等人,(1995)《美国国家科学院院刊》,92:6733-6737；pBabePuro；Morgenstern等人(1990)《核酸研究(Nucleic Acids Research)》18:3587-3596；LL-CG、CL-CG、CS-CG、CLG Miyoshi等人,(1998)《病毒学杂志》72:8150-8157等作为逆转录病毒系统，以及pAdexl Kanegae等人,(1995)《核酸研究》23:3816-3821作为腺病毒系统。在示范性实施例中，逆转录病毒构建体包含杀稻瘟菌素(例如pMXs-IB)、嘌呤霉素(例如pMXs-puro、pBabePuro)或新霉素(例如pMXs-neo)。Morgenstern等人,(1990)《核酸研究》18:3587-3596。
在一些实施例中，病毒载体或质粒包含转座子或包含编码重编程因子的多核苷酸的转座元件。通过DNA转座子(如piggyBac和Sleeping Beauty)递送多核苷酸在易用性、递送更大货物的能力、临床速度和生产成本方面具有优势。特别地，piggyBac DNA转座子在提供多核苷酸的长期、高水平和稳定表达以及显著更少的诱变性、非致癌性和完全可逆方面提供了潜在的优势。
4.从引入RNA的直接翻译
当一种或多种转基因在所选择的细胞中瞬时表达时，感兴趣基因可以作为RNA分子引入，其在细胞的细胞质中翻译为蛋白质。例如，可以从引入的RNA分子翻译感兴趣蛋白质，该RNA分子具有多肽可读框(ORF)，其侧接含有翻译启动信号(例如，强Kozak翻译启动信号)的5'非翻译区域(UTR)和以寡(dT)序列终止的3'非翻译区域，用于模板化添加多聚A尾。此类RNA分子不具有在大多数表达载体和表达盒中采用的启动子序列。可通过多种技术将RNA分子引入所选择的细胞，包括电穿孔或通过与阳离子载体复合的RNA的胞吞作用。参见，例如，Warren等人,《细胞-干细胞》7:618-30(2010)，其通过引用整体并入本文。
蛋白质翻译可以持续数天，特别是当RNA分子通过掺入修饰的核糖核苷酸而稳定时。例如，掺入5-甲基胞苷(5mC)作为胞苷和/或假尿苷(psi)作为尿苷可以提高引入RNA在体内的半衰期，并导致蛋白质翻译增加。如果需要高水平的表达，或者需要表达几天以上，可以将RNA重复引入所选择的细胞。编码蛋白质的RNA也可以包括5'帽、核定位信号或其组合。
此类RNA分子可以例如通过使用核糖核苷混合物体外转录感兴趣多核苷酸的模板来制备，该核糖核苷混合物包括3'-O-Me-m7G(5')ppp(5')G ARCA帽类似物、三磷酸腺苷和三磷酸鸟苷、三磷酸5-甲基胞苷和三磷酸假尿苷。RNA分子也可以用磷酸酶处理以降低细胞毒性。
微RNA可以从已经引入细胞或细胞群体的表达盒或表达载体中表达。可替代地，可以将微RNA直接引入细胞中，例如在递送载体如脂质体、微泡或外来体中。单个RNA可以包括蛋白质编码序列和微RNA两者。
B.非核酸载体
在某些实施例中，载体包含如Kanasty R,“用于siRNA治疗的递送材料(Deliverymaterials for siRNA therapeutics)”《自然材料(Nat Mater.)》中所述的脂质颗粒。12(11):967-77(2013)，其通过引用并入本文。在一些实施例中，基于脂质的载体是脂质纳米颗粒，其是大小在约1和约100纳米之间的脂质颗粒。
在一些实施例中，基于脂质的载体是脂质或脂质体。脂质体是包含脂质双层的人造球形囊泡。
在一些实施例中，基于脂质的载体是小核酸-脂质颗粒(SNALP)。SNALP包含包封核酸的小的(直径小于200nm)基于脂质的纳米颗粒。在一些实施例中，SNALP可用于递送RNA分子如siRNA。在一些实施例中，SNALP制剂将核酸递送至受试者的特定组织，例如心脏。
在一些实施例中，一种或多种多核苷酸通过聚合物载体递送。在一些实施例中，聚合物载体是聚合物或聚合物体。聚合物涵盖单体的任何长的重复链并且包括例如线性聚合物、支链聚合物，树枝状聚合物和多糖。线性聚合物包含单体的单线，而支链聚合物包括单体的侧链。树枝状聚合物也是支链分子，其围绕分子的核心对称排列。多糖是聚合的碳水化合物分子，并且由连接在一起的长单糖单元组成。聚合物囊泡是由形成囊泡膜的合成两亲共聚物制成的人造囊泡，并且在囊泡膜内可以具有中空或水性核心。
各种基于聚合物的系统可用作施用编码一种或多种重编程因子的DNA或RNA的载体。示范性的聚合物材料包括聚(D,L-乳酸-共-乙醇酸)(PLGA)、聚(己内酯)(PCL)、乙烯乙酸乙烯酯聚合物(EVA)、聚(乳酸)(PLA)、聚(L-乳酸)(PLLA)、聚(乙醇酸)(PGA)、聚(L-乳酸-共-乙醇酸)(PLLGA)、聚(D,L-丙交酯)(PDLA)、聚(L-丙交酯)(PLLA)、PLGA-b-聚(乙二醇)-PLGA(PLGA-bPEG-PLGA)、PLLA-bPEG-PLLA、PLGA-PEG-马来酰亚胺(PLGA-PEG-mal)、聚(D,L-丙交酯-共-己内酯)、聚(D,L-丙交酯-共-己内酯-共-乙交酯)、聚(D,L-丙交酯-共-PEO-共-D,L-丙交酯)、聚(D,L-丙交酯-共-PPO-共-D,L-丙交酯)、聚氰基丙烯酸烷基酯、聚氨酯、聚-L-赖氨酸(PLL)、甲基丙烯酸羟丙酯(HPMA)、聚乙二醇、聚-L-谷氨酸、聚(羟基酸)、聚酸酐、聚原酸酯、聚(酯酰胺)、聚酰胺、聚(酯醚)、聚碳酸酯、聚亚烷基如聚乙烯和聚丙烯、聚亚烷基二醇如聚(乙二醇)(PEG)、聚氧化烯(PEO)、聚对苯二甲酸亚烷基酯如聚(对苯二甲酸乙二醇酯)、聚乙烯醇(PVA)、聚乙烯醚、聚乙烯酯如聚(醋酸乙烯酯)、聚卤乙烯如聚氯乙烯(PVC)、聚乙烯吡咯烷酮、聚硅氧烷、聚苯乙烯(PS)、聚氨酯、衍生纤维素如烷基纤维素、羟烷基纤维素、纤维素醚、纤维素酯、硝基纤维素、羟丙基纤维素、羧甲基纤维素、丙烯酸的聚合物，如聚(甲基(甲基)丙烯酸甲酯)(PMMA)、聚(甲基)丙烯酸酯乙酯、聚(甲基)丙烯酸丁酯、聚(甲基)丙烯酸异丁酯、聚(甲基)丙烯酸己酯、聚(甲基)丙烯酸异癸酯、聚(甲基)丙烯酸月桂酯、聚(甲基)丙烯酸苯酯、聚(丙烯酸甲酯)、聚(丙烯酸异丙酯)、聚(丙烯酸异丁酯)、聚(丙烯酸十八酯)(聚丙烯酸)及其共聚物和混合物、聚对二氧环己酮及其共聚物、聚羟基链烷酸酯、聚丙烯富马酸酯、聚甲醛、泊洛沙姆、聚(原)酯、聚(丁酸)、聚(戊酸)、聚(丙交酯-共-己内酯)、三亚甲基碳酸酯、聚乙烯吡咯烷酮、聚原酸酯、聚磷腈、聚(β-氨基酯)(PBAE)和聚磷酸酯，以及两种或更多种此类聚合物的共混物和/或嵌段共聚物。基于聚合物的体系还可以包括基于环糊精聚合物(CDP)的纳米颗粒，例如CDP-金刚烷(AD)-PEG缀合物和CDP-AD-PEG-转铁蛋白缀合物。
在一些实施例中，基于脂质的载体包含脂质包封系统。脂质包封系统可被设计成驱动所需的组织分布和细胞进入特性，以及提供必需的循环时间和生物降解特征。脂质包封可涉及反胶束和/或进一步包含聚合物基质，例如如US 8,193,334中所述，其通过引用并入本文。在一些实施例中，颗粒包括亲脂性递送化合物以增强颗粒向组织的递送，包括以优先方式。此类化合物公开于US 2013/0158021中，其通过引用整体并入本文。此类化合物通常可以包括亲脂性基团和共轭氨基酸或肽，包括线性或环状肽，并且包括其异构体。在一些实施例中，脂质包封物包含磷脂、胆固醇、聚乙二醇(PEG)-脂质和亲脂性化合物中的一种或多种。
颗粒，无论是脂质或聚合物或两者，可包括可用于增强体内核酸递送特性的附加组分(包括US 8,450,298和US 2012/0251560中所公开的化合物，其均通过引用并入本文)。递送载体可优先在某些组织中累积，从而提供组织靶向作用，但在一些实施例中，递送载体进一步包含至少一种细胞靶向配体或组织靶向配体。在US 2010/0303723和2012/0156135中公开包括示范性靶向配体的功能化粒子，其通过引用整体并入本文。
递送载体可设计为驱动本文公开的递送系统的期望的组织分布和细胞进入特性，以及提供必需的循环时间和生物降解特征。例如，脂质颗粒可采用如US 2011/0009641中所公开的氨基脂质，其通过引用并入本文。
脂质或聚合物颗粒的大小可以在约50nm至约5μm的范围内(例如，平均大小)。在一些实施例中，颗粒在约10nm至约100μm、或约20nm至约50μm、或约50nm至约5μm、或约70nm至约500nm、或约70nm至约200nm、或约50nm至约100nm的范围内。可以选择颗粒以避免被免疫系统快速清除。在某些实施例中，颗粒可以是球形的或非球形的。
C.启动子和增强子
在一些实施例中，编码重编程因子的核酸可以可操作地连接到启动子和/或增强子以促进重编程因子的表达。取决于所使用的宿主/载体系统，许多合适的转录和翻译控制元件中的任一种，包括组成型和诱导型启动子、转录增强子元件、转录终止子等都可用于表达载体中(例如，Bitter等人,(1987)《酶学方法(Methods in Enzymology)》,153:516-544)。
对于每个多核苷酸可以使用分开的启动子和/或增强子。在一些实施例中，相同的启动子和/或增强子用于单个可读框中的两个或更多个多核苷酸。采用该遗传元件配置的载体被称为“多顺反子”。多顺反子载体的实例包含可操作地连接到单个可读框的增强子和启动子，该单个可读框包含通过2A区域连接的两个或更多个多核苷酸，由此可读框的表达导致共翻译地生成多个多肽。2A区被认为通过密码子跳跃介导多种多肽序列的产生；然而，本公开还涉及多顺反子载体，其采用翻译后切割以从相同多核苷酸生成两个或更多个感兴趣基因的多肽。US20040265955A1提供了说明性2A序列、载体和相关方法，其通过引用并入本文。本公开的其它多顺反子载体采用内部启动子、剪接、再启动、内部核糖体进入位点(IRES)、蛋白水解可切割位点(例如融合原)和基因融合。
合适的真核启动子(在真核细胞中有功能的启动子)的非限制性实例包括CMV、CMV立即早期、HSV胸苷激酶、早期和晚期SV40、来自逆转录病毒的长末端重复序列(LTR)和小鼠金属硫蛋白-I。在一些实施例中，将使用能够赋予心脏特异性表达的启动子。合适的心脏特异性启动子的非限制性实例包括结蛋白(Des)、α-肌球蛋白重链(α-MHC)、肌球蛋白轻链2(MLC-2)、心肌肌钙蛋白T(cTnT)和心肌肌钙蛋白C(cTnC)。合适的神经元特异性启动子的非限制性实例包括突触蛋白I(SYN)、钙/钙调蛋白依赖性蛋白激酶II、微管蛋白αI、神经元特异性烯醇化酶和血小板衍生的生长因子β链启动子和通过将巨细胞病毒增强子(E)与那些神经元特异性启动子融合的杂合启动子。
用于驱动表达重编程因子的合适启动子的实例包括但不限于逆转录病毒长末端重复(LTR)元件；组成型启动子，例如CMV、HSV1-TK、SV40、EF-la、β-肌动蛋白、磷酸甘油激酶(PGK)；诱导型启动子，例如含有Tet-操纵子元件的那些；心脏特异性启动子，例如结蛋白(Des)、α-肌球蛋白重链(a-MHC)、肌球蛋白轻链2(MLC-2)、心肌肌钙蛋白T(cTnT)和心肌肌钙蛋白C(cTnC)；神经特异性启动子，例如巢蛋白、神经元核(NeuN)、微管相关蛋白2(MAP2)、βIII微管蛋白、神经元特异性烯醇化酶(NSE)、少突胶质细胞谱系(Oligl/2)和胶质纤维酸性蛋白(GFAP)；和胰腺特异性启动子，例如Pax4、Nkx2.2、Ngn3、胰岛素、胰高血糖素和生长抑素。
在一些实施例中，多核苷酸可操作地连接到细胞类型特异性转录调控元件(TRE)，其中TRE包括启动子和增强子。合适的TRE包括但不限于衍生自以下基因的TRE：肌球蛋白轻链-2、α-肌球蛋白重链、AE3、心肌肌钙蛋白C和心肌肌动蛋白。Franz等人,(1997)《心血管研究(Cardiovasc.Res.)》,35:560-566；Robbins等人,(1995)《美国纽约科学院年刊(Ann.N.Y.Acad.Sci.)》,752:492-505；Linn等人(1995)《循环研究(Circ.Res.)》76:584-591；Parmacek等人,(1994)《细胞生物学》,14:1870-1885；Hunter等人,(1993)《高血压(Hypertension)》,22:608-617；和Sartorelli等人,(1992)《美国国家科学院院刊》USA 89:4047-4051。
启动子可以是与基因或核酸片段天然相关的启动子。类似地，对于RNA(例如微RNA)，启动子可以是与微RNA基因(例如miRNA-302基因)天然相关的启动子。此类天然相关的启动子可以称为“天然启动子”，并且可以通过分离位于编码区段和/或外显子上游的5'非编码序列来获得。类似地，增强子可以是与核酸序列天然相关的增强子。然而，增强子可以位于该序列的下游或上游。
可替代地，通过将编码核酸区段置于重组或异源启动子的控制下将获得某些优点，该启动子是指在其自然环境中通常不与核酸结合的启动子。重组或异源增强子也指在其天然环境中通常不与核酸序列相关的增强子。此类启动子或增强子可以包括其它基因的启动子或增强子，和从任何其它原核、病毒或真核细胞分离的启动子或增强子，和非“天然存在的”启动子或增强子，即含有不同转录调控区域的不同元件，和/或改变表达的突变。除了合成产生启动子和增强子的核酸序列外，还可以使用重组克隆和/或核酸扩增技术(包括PCRTM)结合本文公开的组合物来产生序列(参见美国专利第4,683,202号、美国专利第5,928,906号，均通过引用并入本文)。
采用的启动子可以是组成型的、诱导型的、发育特异性的、组织特异性的和/或在合适的条件下可用于指导核酸片段的高水平表达。例如，启动子可以是组成型启动子，例如CMV启动子、CMV巨细胞病毒立即早期启动子、CAG启动子、EF-1α启动子、HSV1-TK启动子、SV40启动子、β-肌动蛋白启动子、PGK启动子或其组合。可使用的真核启动子的实例包括但不限于组成型启动子，例如病毒启动子如CMV、SV40和RSV启动子，以及可调控启动子，例如诱导型或阻抑型启动子如tet启动子、hsp70启动子和由CRE调控的合成启动子。在一些实施例中，启动子包含CMV早期增强子元件、鸡β-肌动蛋白启动子和SV-40内含子。在一些实施例中，启动子包含CMV早期增强子元件、鸡β-肌动蛋白启动子和CMV内含子。可以采用的启动子的其它实例包括人类EF1α延长因子启动子、CMV巨细胞病毒立即早期启动子、CAG鸡白蛋白启动子、与本文所述的任何病毒载体相关的病毒启动子、或与本文所述的任何启动子同源的启动子(例如，来自另一物种)。可使用的原核启动子的实例包括但不限于SP6、T7、T5、tac、bla、trp、gal、lac或麦芽糖启动子。
在一些实施例中，内部核糖体进入位点(IRES)元件可用于产生多基因或多顺反子信息。IRES元件能够绕过5'-甲基化的Cap依赖性翻译的核糖体扫描并在内部位点开始翻译(Pelletier和Sonenberg,《自然(Nature)》,334(6180):320-325(1988))。已经描述了来自小核糖核酸病毒家族的两个成员(脊髓灰质炎和脑心肌炎)的IRES元件(Pelletier和Sonenberg,《自然》,334(6180):320-325(1988))，以及来自哺乳动物信息的IRES(Macejak和Samow,《自然》,353:90-94(1991))。IRES元件可以连接到异源可读框。多个可读框可以一起转录，每个由IRES分开，产生多顺反子消息。由于IRES元件，每个可读框可被核糖体访问以有效翻译。使用单个启动子/增强子转录单个信息可以有效地表达多个基因(参见美国专利第5,925,565号和第5,935,819号，其通过引用并入本文)。
D.载体递送至细胞
可以通过本领域已知的任何方法将病毒载体引入靶细胞(例如成纤维细胞)，包括但不限于：磷酸钙法、脂质转染法(例如，Feigner等人,(1987)《美国国家科学院院刊》,84:7413-7417)、电穿孔法、显微注射、Fugene转染、核转染等，以及本文所述的任何方法。
程序的实例包括例如由Stadtfeld和Hochedlinger,《自然方法(NatureMethods)》,6(5):329-330(2009)；Yusa等人,《自然方法法》,6:363-369(2009)；Woltjen等人,《自然》,458,766-770(2009年4月9日))描述的那些。此类方法包括但不限于DNA的直接递送，如通过离体转染(例如，Wilson等人,《科学(Science)》,244:1344-1346,1989，Nabel和Baltimore，《自然Nature》,326:711-713,1987)，任选地用Fugene6(Roche)或Lipofectamine(美国英杰生命技术有限公司)；通过注射(例如，美国专利第5,994,624号，第5,981,274号，第5,945,100号，第5,780,448号，第5,736,524号，第5,702,932号，第5,656,610号，第5,589,466号和第5,580,859号，均通过引用并入本文)，包括显微注射(例如，Harland和Weintraub,《细胞生物学杂志》，101:1094-1099,1985；美国专利第5,789,215号，其通过引用整体并入本文)；通过电穿孔(例如美国专利第5,384,253号，通过引用将其全部内容并入本文，Tur-Kaspa等人,《分子和细胞生物学》,6:716-718,1986；Potter等人,《美国国家科学院院刊》,美国,81:7161-7165,1984)；通过磷酸钙沉淀(例如，Graham和Van DerEb,《病毒学》,52:456-467,1973；Chen和Okayama,《分子和细胞生物学》,7(8):2745-2752,1987；Rippe等人,《分子和细胞生物学》,10:689-695,1990)；通过使用DEAE-葡聚糖，随后使用聚乙二醇(例如，Gopal,《分子和细胞生物学》,5:1188-1190,1985)；通过直接声波加载(例如，Fechheimer等人,《美国国家科学院院刊》美国，84:8463-8467,1987)；通过脂质体介导的转染(例如，Nicolau和Sene,《生物化学与生物物理学报(Biochim.Biophys.Acta)》,721:185-190,1982，Fraley等人,《美国国家科学院院刊》,美国,76:3348-3352,1979；Nicolau等人,《酶学方法》,149:157-176,1987，Wong等人,《基因》,10:87-94,1980，Kaneda等人,《科学》,243:375-378,1989，Kato等人,《生物化学(Biol.Chem.)》,266:3361-3364,1991)、受体介导的转染(例如，Wu和Wu,《生物化学》,27:887-892,1988；Wu和Wu，《生物化学杂志》,262:4429-4432,1987)；通过与阳离子载体复合的RNA的胞吞作用(Warren等人,《细胞-干细胞》,7:618-30(2010))；以及此类方法的任意组合。前述参考文献中的每个均通过引用并入本文。
可采用各种技术将本公开的核酸分子引入细胞中，这取决于核酸分子是体外引入还是体内引入宿主中。此类技术包括核酸分子-磷酸钙沉淀物的转染、与DEAE相关的核酸分子的转染、包括感兴趣核酸分子在内的前述病毒的转染或感染、脂质体介导的转染等。其它实例包括：西格玛奥瑞奇集团(Sigma-Aldrich)的N-TERTM纳米颗粒转染体系、通过Polyplus转染的用于昆虫细胞的FectoFlyTM转染试剂、Polysciences公司生产的聚乙烯亚胺“Max”、科斯莫生物技术有限公司(Cosmo Bio Co.)的独特的非病毒转染工具、美国英杰生命技术有限公司(Invitrogen)的LipofectamineTM LTX转染试剂、Stratagene的SatisFectionTM转染试剂、美国英杰生命技术有限公司的LipofectamineTM转染试剂、罗氏应用科学(RocheApplied Science)的
Figure BDA0003920830640000451
HD转染试剂，Polyplus转染的符合GMP的体内-jetPEITM转染试剂，以及Novagen的Insect
Figure BDA0003920830640000452
转染试剂。
IV.治疗组合物
在某些情况下，使用微RNA和ASCL1和MYOCD中的一者或两者进行重编程可以与其它重编程策略结合使用，从而获得更好的结果。在一些实施例中，靶组织或起始细胞表达或被诱导表达OCT4多肽。靶组织或起始细胞可分别用含有一种或多种WNT激动剂、GSK3抑制剂、TGF-β抑制剂、表观遗传修饰剂、腺苷酰环化酶激动剂、OCT4表达激活剂及其任何组合的重编程组合物进行处理或培育。该组合物可以含有至少两种此类试剂，或至少三种此类试剂，或至少四种此类试剂，或至少五种此类试剂，或至少六种此类试剂。例如，该组合物可包括SB431542(ALK4/5/7抑制剂)、CHIR99021(GSK3抑制剂)、parnate(LSD1/KDM1抑制剂，也称为反苯环丙胺)和毛喉素(腺苷酰环化酶激活剂)。
在某些实施例中，通过施用一种或多种抗炎剂，例如抗炎类固醇或非类固醇抗炎药(NSAID)来增强重编程。
用于本发明的抗炎类固醇包括皮质类固醇，特别是具有糖皮质激素活性的那些，例如地塞米松(dexamethasone)和泼尼松(prednisone)。用于本发明的非类固醇抗炎药(NSAID)通常通过阻断引起炎症和疼痛的前列腺素，环加氧酶-1(COX-1)和/或环加氧酶-2(COX-2)的产生而起作用。传统的NSAID通过阻断COX-1和COX-2起作用。COX-2选择性抑制剂仅阻断COX-2酶。在某些实施例中，NSAID是COX-2选择性抑制剂，例如塞来考昔
Figure BDA0003920830640000461
罗非考昔(Vioxx)和伐地考昔(B extra)。在某些实施例中，抗炎剂是NSAID前列腺素抑制剂，例如吡罗昔康(Piroxicam)。
为了制备组合物，产生载体和/或细胞，并且根据需要或期望纯化载体或细胞。载体、细胞和/或其它试剂可以悬浮在药学上可接受的载体中。如果组合物仅含有化合物而不含细胞，则可将组合物冻干。可将这些化合物和细胞调节至适当的浓度，并任选地与其它药剂组合。包含在单位剂量中的给定化合物和/或其它药剂的绝对重量可以在很大范围内变化。本领域技术人员可以优化施用的剂量和次数。
例如，可以施用约102至1010个载体基因组(vg)。在一些实施例中，剂量是至少约102vg、约103vg、约104vg、约105vg、约106vg、约107vg、约108vg、约109vg、约1010vg，或更多个载体基因组。在一些实施例中，剂量是约102vg、约103vg、约104vg、约105vg、约106vg、约107vg、约108vg、约109vg、约1010vg，或更多个载体基因组。
应当理解，用于治疗的载体和细胞的量不仅随所选择的具体载体而变化，而且随施用途径，所治疗病状的性质和患者的年龄和病状而变化。最终，医护人员可以决定合适的剂量。可以将药物组合物与适当比例的每种化合物配制成单一单位剂型，在有或没有细胞的情况下施用。细胞或载体可以分开提供，或者与化合物组合物的液体溶液混合，或者分开施用。
含有化合物和/或重编程细胞的一种或多种合适的单位剂型可以通过多种途径施用，包括肠胃外(包括皮下、静脉内、肌内和腹膜内)、颅内、脊柱内、口服、直肠、皮肤、透皮、胸内、肺内和鼻内(呼吸)途径。
本发明的载体可以制备成许多形式，包括水溶液、悬浮液、片剂、硬或软明胶胶囊和脂质体和其它缓释制剂，如成形的聚合物凝胶。载体的施用通常涉及在水溶液中的肠胃外或局部施用。
液体药物组合物可以是例如水性或油性混悬剂、溶液、乳剂、糖浆剂或酏剂，用于在使用之前用水或其它合适的载体重构的干粉剂的形式。此类液体药物组合物可以含有常规添加剂，例如悬浮剂、乳化剂、非水载体(其可以包括食用油)或防腐剂。
载体可以被配制用于肠胃外施用(例如，通过注射，例如推注或连续输注)，并且可以以单位剂型存在于安瓿、预填充注射器、小体积输注容器或添加有防腐剂的多剂量容器中。药物组合物可以采取在油性或水性载体中的悬浮液、溶液或乳液的形式，并且可以含有配方试剂，例如悬浮剂、稳定剂和/或分散剂。合适的载体包括盐水溶液、磷酸盐缓冲盐水和本领域常用的其它材料。
组合物还可以含有其它成分，如可用于治疗心脏疾病、病状和损伤的药剂，如抗凝剂(例如(例如达肝素(dalteparin(法安明(fragmin)))、达那肝素(danaparoid(葡糖胺聚糖(orgaran)))、依诺肝素(enoxaparin/lovenox)、肝素(heparin)、亭扎肝素(tinzaparin(亭扎肝素钠(innohep)))和/或华法林(warfarin(香豆素(coumadin))))、抗血小板剂(例如，阿司匹林(aspirin)、噻氯匹定(ticlopidine)、氯吡格雷(clopidogrel)或双嘧达莫(dipyridamole))、血管紧张素转化酶抑制剂(例如，贝那普利(Benazepril(洛汀新(Lotensin)))、卡托普利(Captopri(开搏通(Capoten)))、依那普利(Enalapril/Vasotec)、福辛普利(Fosinopril/Monopril)、赖诺普利(Lisinopril(普利尼韦(Prinivil)、赐瑞(Zestril))、莫昔普利(Moexipril/Univasc)、培哚普利(Perindopril/Aceon)、喹那普利(Quinapril/Accupril)、雷米普利(Ramipril/Altace)，和/或群多普利(Trandolapril/Mavik)、血管紧张素II受体阻滞剂(例如，坎地沙坦(Candesartan/Atacand)、依普罗沙坦(Eprosartan/Teveten)、厄贝沙坦(Irbesartan/Avapro)、氯沙坦(Losartan(科素亚(Cozaar)))、替米沙坦(Telmisartan(Micardis(美卡素)))，和/或缬沙坦(Valsartan/Diovan)、β受体阻滞剂(例如，醋丁洛尔(Acebutolol(醋丁酰心安(Sectral)))、阿替洛尔(Atenolol(天诺敏(Tenormin)))、倍他洛尔(Betaxolol(可络畅(Kerlone)))、比索洛尔/氢氯噻嗪(Bisoprolol/hydrochlorothiazide(Ziac))、比索洛尔(Bisoprolol/Zebeta)、卡替洛尔(Carteolol/Cartrol)、美托洛尔(Metoprolol/Lopressor/Toprol XL)、纳多洛尔(Nadolol/Corgard)、普萘洛尔(Propranolol/Inderal)、索他洛尔(Sotalol/Betapace)，和/或噻吗洛尔(Timolol(马来酸噻吗心安(Blocadren)))、钙通道阻滞剂(例如，氨氯地平(Amlodipine/Norvasc/Lotrel)、苄普地尔(Bepridil/Vascor)、地尔硫卓(Diltiazem/Cardizem、盐酸地尔硫(Tiazac))、非洛地平(Felodipine/Plendil)、硝苯地平(Nifedipine(心痛定(Adalat/Procardia)))、尼莫地平(Nimodipine/Nimotop)、尼索地平(Nisoldipine/Sular)、维拉帕米(Verapamil/Calan/Isoptin/Verelan)、利尿剂(例如，阿米洛利(Amiloride/Midamor)、布美他尼(Bumetanide/Bumex)、氯噻嗪(Chlorothiazide/Diuril)、氯噻酮(Chlorthalidon/Hygroton)、呋塞米(Furosemide/Lasix)、氢氯噻嗪(Hydro-chlorothiazide/Esidrix/Hydrodiuril)、吲达帕胺(Indapamide/Lozol)和/或螺内酯(Spironolactone/Aldactone)、血管扩张剂(例如，硝酸异山梨酯(lsosorbidedinitrate(异山梨醇(slordil)))、奈西立肽(Nesiritide/Natrecor)、肼苯哒嗪(Hydralazine/Apresoline)、硝酸盐和/或米诺地尔(Minoxidil))、他汀类药物(statins)、烟酸、吉非罗齐(gemfibrozil)、安妥明(clofibrate)、地高辛(Digoxin)、洋地黄毒苷(Digitoxin)、拉诺辛(Lanoxin)及其组合。
还可以包括另外的试剂，例如抗菌剂、抗微生物剂、抗病毒剂、生物反应调节剂、生长因子；免疫调节剂、单克隆抗体和/或防腐剂。本发明的组合物也可以与其它形式的治疗结合使用。
本文所述的病毒载体和非病毒载体可以施用于受试者以治疗疾病或病症。此类组合物可以是单剂量、多剂量、以连续或间歇的方式给药，这取决于例如接受者的生理状况，施用目的是响应创伤性损伤还是为了更持续的治疗目的，以及技术人员已知的其它因素。本发明的化合物和组合物的施用可以在预选的时间段内基本上是连续的，或者可以是一系列间隔的剂量。考虑局部和全身施用。在一些实施例中，实现了病毒或非病毒载体的局部递送。在一些实施例中，细胞和/或载体的局部递送用于在心脏内产生细胞群体。在一些实施例中，此类局部群体作为心脏的“起搏细胞”工作。
V.重编程方法
如本文所述，通过向靶组织或细胞施用病毒或非病毒载体，可以在体内将靶细胞(例如，非心肌细胞)重编程为心脏谱系(例如，心肌细胞谱系)。在一些实施例中，靶细胞是成纤维细胞。在一些实施例中，靶细胞是心脏成纤维(CF)细胞。
在一些实施例中，向受试者施用包含编码一种或多种重编程因子的多核苷酸的一种或多种载体，例如ASCL1、MYOCD、MEF2C、TBX5、BAF60C、ESRRG、GATA4、GATA6、HAND2、IRX4、ISLL、MEF2C、MESP1、MESP2、NKX2.5、SRF、TBX20、ZFPM2、miR-133或其任何组合。在一些实施例中，重编程因子选自由ASCL1、MYOCD和选自表1的微RNA或其任何组合组成的组。在具体实施例中，重编程因子是ASCL1和MYOCD(MyA)和选自表1的微RNA。在具体实施例中，重编程因子是ASCL1、MYOCD、MEF2C和TBX5(MyAMT)和选自表1的微RNA。在一些实施例中，重编程因子是GATA4、MEF2C和TBX5(GMT)和选自表1的微RNA。在其它具体实施例中，重编程因子是MYOCD、MEF2C和TBX5(即，MyMT)和选自表1的微RNA。在其它具体实施例中，重编程因子是GATA4、MEF2C、TBX5和MYOCD(即，4F)和选自表1的微RNA。在其它实施例中，重编程因子是GATA4、MEF2C和TBX5、ESRRG、MYOCD、ZFPM2和MESP1(即，7F)和选自表1的微RNA。
在一些实施例中，载体诱导或抑制心肌细胞的更多标记基因的表达，例如TNNT2、ACTN2、ATP2A2、MYH6、RYR2、MYH7、ACTCL、MYBPC3、PIN、MB、LMOD2、MYL2、MY 13、COX6A2、ATP5AL、TTN、TNNI3、PDK4、MYCZ2、CACNALC、SCN5A、MYOCD和NPPA。
VI.治疗方法
本文所述的载体可用于治疗患有心脏疾病或病状的受试者的方法中。“治疗”或“治疗有此需要的病状或受试者”是指(1)采取步骤以获得有益或期望的结果，包括临床结果例如症状减轻；(2)预防疾病，例如，使可能易患该疾病但尚未经历或表现出该疾病症状的患者不出现该疾病的临床症状；(3)抑制疾病，例如，阻止或减少疾病或其临床症状的发展；(4)缓解疾病，例如，使疾病或其临床症状消退；或(5)延缓疾病。出于本发明的目的，有益或期望的临床结果包括但不限于产生诱导心肌细胞和/或促进心肌再生。
需要使用本公开的组合物、细胞和方法进行治疗的受试者包括但不限于患有先天性心脏缺陷的个体、患有退行性肌肉疾病的个体、患有导致缺血性心脏组织的病状的个体(例如患有冠状动脉疾病的个体)等。在一些实例中，一种方法可用于治疗退行性肌肉疾病或病状(例如，家族性心肌病、扩张型心肌病、肥厚型心肌病、限制性心肌病或导致缺血性心肌病的冠状动脉疾病)。在一些实例中，受试者方法可用于治疗患有心脏或心血管疾病或病症的个体，例如心血管疾病、动脉瘤、心绞痛、心律失常、动脉粥样硬化、脑血管意外(中风)、脑血管疾病、先天性心脏病、充血性心力衰竭，心肌炎、瓣膜病冠状动脉、动脉疾病扩张、舒张功能障碍、心内膜炎、高血压(high blood pressure/hypertension)、心肌病、肥厚性心肌病、限制性心肌病、冠状动脉疾病导致的缺血性心肌病、二尖瓣脱垂、心肌梗塞(心脏病发作)或静脉血栓栓塞。
适于使用本公开的组合物、细胞和方法进行治疗的受试者包括患有心脏病状的个体(例如哺乳动物受试者，如人类、非人灵长类、家养哺乳动物、实验非人哺乳动物受试者，如小鼠、大鼠等)，包括但不限于导致缺血性心脏组织的病状(例如患有冠状动脉疾病的个体)等。
在一些实例中，适合治疗的个体患有心脏或心血管疾病或病状，例如心血管疾病、动脉瘤、心绞痛、心律失常、动脉粥样硬化、脑血管意外(中风)、脑血管疾病、先天性心脏病、充血性心力衰竭，心肌炎、瓣膜病冠状动脉、动脉疾病扩张、舒张功能障碍、心内膜炎、高血压(high blood pressure/hypertension)、心肌病、肥厚性心肌病、限制性心肌病、冠状动脉疾病导致的缺血性心肌病、二尖瓣脱垂、心肌梗塞(心脏病发作)或静脉血栓栓塞。在一些实例中，适于用受试者方法治疗的个体包括患有退行性肌肉疾病的个体，该退行性肌肉疾病例如家族性心肌病、扩张型心肌病、肥厚型心肌病、限制性心肌病或冠状动脉疾病导致的缺血性心肌病。
需要使用本公开的组合物、细胞和方法进行治疗的受试者包括但不限于患有先天性心脏缺陷的个体、患有退行性肌肉疾病的个体、患有导致缺血性心脏组织的病状的个体(例如患有冠状动脉疾病的个体)等。在一些实例中，一种方法可用于治疗退行性肌肉疾病或病状(例如，家族性心肌病、扩张型心肌病、肥厚型心肌病、限制性心肌病或导致缺血性心肌病的冠状动脉疾病)。在一些实例中，受试者方法可用于治疗患有心脏或心血管疾病或病症的个体，例如心血管疾病、动脉瘤、心绞痛、心律失常、动脉粥样硬化、脑血管意外(中风)、脑血管疾病、先天性心脏病、充血性心力衰竭，心肌炎、瓣膜病冠状动脉、动脉疾病扩张、舒张功能障碍、心内膜炎、高血压(high blood pressure/hypertension)、心肌病、肥厚性心肌病、限制性心肌病、冠状动脉疾病导致的缺血性心肌病、二尖瓣脱垂、心肌梗塞(心脏病发作)或静脉血栓栓塞。
适于使用本公开的组合物、细胞和方法进行治疗的受试者包括患有心脏病状的个体(例如哺乳动物受试者，如人类、非人灵长类、实验非人哺乳动物受试者，如小鼠、大鼠等)，包括但不限于导致缺血性心脏组织的病状(例如患有冠状动脉疾病的个体)等。在一些实例中，适合治疗的个体患有心脏或心血管疾病或病状，例如心血管疾病、动脉瘤、心绞痛、心律失常、动脉粥样硬化、脑血管意外(中风)、脑血管疾病、先天性心脏病、充血性心力衰竭，心肌炎、瓣膜病冠状动脉、动脉疾病扩张、舒张功能障碍、心内膜炎、高血压(high bloodpressure/hypertension)、心肌病、肥厚性心肌病、限制性心肌病、冠状动脉疾病导致的缺血性心肌病、二尖瓣脱垂、心肌梗塞(心脏病发作)或静脉血栓栓塞。在一些实例中，适于用受试者方法治疗的个体包括患有退行性肌肉疾病的个体，该退行性肌肉疾病例如家族性心肌病、扩张型心肌病、肥厚型心肌病、限制性心肌病或冠状动脉疾病导致的缺血性心肌病。
可使用重编程细胞和/或组合物(含有本文所述的任何化合物，有或没有重编程的细胞)治疗的疾病和病状的实例包括任何心脏病变或心脏功能障碍。可以治疗的疾病和病状包括由于遗传缺陷、身体损伤、环境损害或调节、健康状况不佳、肥胖和其它疾病风险而发生的疾病和病状。
缺血性心肌病是一种由冠状动脉疾病(心脏表面冠状动脉出现动脉粥样硬化变窄或闭塞的疾病)引起的慢性病症。冠状动脉疾病经常导致心脏局部缺血的发作，其中心肌没有足够的富氧血液供应。
非缺血性心肌病通常主要根据临床和病理学特征分为三组：扩张型心肌病、肥厚型心肌病以及限制性和渗透性心肌病。
在另一实施例中，心脏病变是遗传疾病，例如杜氏肌营养不良和Emery Dreiffuss扩张型心肌病。
例如，心脏病变可以选自由充血性心力衰竭、心肌梗塞、心脏局部缺血、心肌炎和心律失常组成的组。在一些实施例中，受试者是糖尿病患者。在一些实施例中，受试者是非糖尿病患者。在一些实施例中，受试者患有糖尿病性心肌病。
对于治疗，可以局部或全身施用重组病毒、非病毒载体和/或药物组合物。可通过注射、导管、可植入装置等引入重编程的细胞群。重组病毒或重编程细胞群体可以在任何生理上可接受的赋形剂或载体中施用而不会对细胞产生不利影响。例如，重组病毒、非病毒载体和/或药物组合物可以静脉内或通过心内途径(例如心外膜或心肌内)施用。将本公开的重组病毒、非病毒载体、心肌细胞和药物组合物(例如，包含载体的组合物)施用于受试者，特别是人类受试者的方法包括将药物组合物(例如，包含病毒载体的组合物)或细胞注射、植入或输注到受试者的靶位点中。注射可包括直接肌肉注射并且输注可包括血管内输注。可将载体或药物组合物插入递送装置中，该递送装置便于通过注射或植入将药物组合物或细胞引入受试者。此类递送装置包括管，例如导管。管可另外包括针，例如注射器，通过该针可将本发明的细胞引入受试者的所需位置。在一些实施例中，药物组合物或细胞通过例如Tang等人描述的微针贴片递送。整合心肌细胞的微针贴片治疗心肌梗塞。《科学进展(Science Advances)》2018年11月28日:第4卷,第11期,eaat9365。
在一些方面，本公开的病毒载体可用于治疗有此需要的受试者。在一些实施例中，可以将重组病毒给予有需要的受试者，其中将重组病毒施用于受试者，这治疗了受试者的心血管疾病。
重组病毒可以局部或全身施用。通过选择合适的衣壳蛋白或通过用来自另一种病毒类型的蛋白对病毒进行假型化，可以将重组病毒工程改造以靶向特定的细胞类型。为了确定病毒颗粒组合物的各种治疗施用方案和剂量的适用性，可以首先在合适的动物模型中测试重组病毒。在一个水平上，评估重组病毒在体内感染靶细胞的能力。还可以评估重组病毒以确定它们是否迁移到靶组织，它们是否在宿主中诱导免疫反应，或确定待施用的重组病毒的适当数量或剂量。取决于待治疗的疾病，重组病毒生成免疫反应可能是期望的或不期望的。通常，如果需要重复施用病毒颗粒，如果病毒颗粒没有免疫原性将是有利的。出于测试目的，可将病毒颗粒组合物施用于免疫缺陷动物(如裸鼠，或通过化学或辐射导致免疫缺陷的动物)。可在感染一段时间之后收获靶组织或细胞，并对其进行评估，以确定该组织或细胞是否已被感染，以及是否在靶组织或细胞中诱导了所需的表型(例如，诱导心肌细胞)。
重组病毒可以通过各种途径施用，包括但不限于直接注射到心脏中或心脏导管插入术中。可替代地，重组病毒可以全身施用，例如通过静脉内输注。当使用直接注射时，可以通过心脏直视手术或微创手术进行。在一些情况下，通过注射或输注将重组病毒递送至心包空间。可以通过多种方法追踪注射或注入的重组病毒。例如，可以很容易地检测到用可检测标记(如绿色荧光蛋白或β-半乳糖苷酶)标记或表达的重组病毒。可以对重组病毒进行工程改造以使靶细胞表达标记蛋白，例如表面表达的蛋白或荧光蛋白。可替代地，重组病毒对靶细胞的感染可以通过其表达的细胞标记物(例如，当将细胞注射到实验动物中时的人类特异性抗原)不被用于测试的动物表达的细胞标记物来检测。靶细胞的存在和表型可以通过荧光显微术(例如，对于绿色荧光蛋白或β-半乳糖苷酶)、免疫组织化学(例如，使用针对人类抗原的抗体)、ELISA(使用针对人类抗原的抗体)，或通过使用引物和杂交条件进行RT-PCR分析来评估，该引物和杂交条件导致扩增对于指示心脏表型的RNA是特异性的。
VIII.试剂盒
本文描述了包括本文描述的任何组合物、化合物和/或药剂的多种试剂盒。该试剂盒可以包括本文所述的任何化合物，混合在一起或单独包装，并且以干燥或水合形式。本文所述的化合物和/或试剂可以分开包装在离散的小瓶、瓶子或其它容器中。可替代地，本文所述的任何化合物和/或试剂可以包装在一起作为单一组合物，或作为可以一起或分开使用的两种或更多种组合物。
载体可以以递送装置的形式提供在任何试剂盒中。可替代地，递送装置可以分开地包括在试剂盒中，并且说明书可以描述在施用于受试者之前如何组装递送装置。
试剂盒可以为前面部分中的组合物或本申请的其它部分提供其它因子，例如本文所述的任何补充因子或药物。
以下非限制性实例说明了开发本发明所涉及的一些实验工作。
实例
实例1
本实例采用了表达两种转基因，心肌蛋白(MYOCD)和ASCL1(统称为“MyA”)的腺相关病毒(AAV)载体。MyA重编程混合物促进心脏成纤维细胞在体内和体外直接重编程为诱导心肌细胞(iCM)(数据未显示)。在该载体中使用的心肌蛋白转基因，称为MyΔ3(SEQ ID NO：16)，具有内部缺失，其减小基因大小而不显著影响基因功能(数据未显示)。
我们设计了一种基于微RNA的系统来抑制MyA在非靶细胞(心肌细胞)中的表达，同时在靶细胞(心脏成纤维细胞)中表达MyA。将测试载体工程改造以在编码MyΔ3-2A-ASCL1转基因的多核苷酸的3'UTR中包括各种所选择的微RNA中的每一种的微RNA结合位点。微RNA结合位点旨在抑制MyA在表达所选择的微RNA的细胞中的表达。下面描述的一些实验使用绿色荧光蛋白(GFP)报道系统代替MyA。
miR-1结合位点
测试了两个miR-1结合位点：miR-1(miR1_4)和3'UTR或人类MYOCD中的天然miR-1结合位点(MymiR1_4)的完全互补体。对于每个结合位点，生成错配阴性对照，其中种子序列(下划线)发生了突变(miR1_4mut、MymiR1_4mut)：
Figure BDA0003920830640000532
在每个载体中，将待测试的结合位点串联四次插入AAV CAG-GFP载体的3'UTR。将载体包装到AAV中并用于感染iPSC-CM。iPSC-CM是诱导形成心肌细胞的多能干细胞，其用于实验中，因为在培养中维持原代心肌细胞是不切实际的。相对于对照构建体GFP-miR1_4mut和GFP-MymiR1_4mut，GFP-miR1_4和GFP-MymiR1_4在iPSC-CM中都被抑制(图2A)。在人类心脏成纤维细胞(hCF)中仍然观察到GFP报道基因的表达(图2B)。miR1_4和GFP-MymiR1_4构建体表达GFP报道基因的水平与其miR-1错配对照大致相同。因此，与CF细胞相比，miR-1微RNA结合位点选择性抑制CM细胞中的转基因表达。
将miR1_4和miR1_4mut序列插入到AAV
Figure BDA0003920830640000533
盒的3'UTR中，以评估结合位点对心肌蛋白和ASCL1(MyA)结合的心肌细胞重编程的影响。通过测量与心肌细胞表型相关的七个基因的表达来确定重编程效率。表5中的数据表明，在用载体转导hCF细胞之后第7天，具有miR-1微RNA结合位点的MyA载体诱导CM表型的表达。
表5
Figure BDA0003920830640000531
测试载体
Figure BDA0003920830640000543
显示比
Figure BDA0003920830640000544
或亲本
Figure BDA0003920830640000545
盒低5至10倍的重编程活性。
接着，将具有一个、两个或三个miR-1结合位点的载体与具有四个miR-1结合位点的载体进行比较。如表6所示，仅具有一个miR-1结合位点的载体
Figure BDA0003920830640000548
表现出比
Figure BDA00039208306400005410
Figure BDA0003920830640000549
更强的效力，但仍然不如亲代
Figure BDA00039208306400005411
载体强。
表6
Figure BDA0003920830640000541
在
Figure BDA0003920830640000547
的3'UTR中的单个miR-1结合位点的种子区域外，生成含有两个(miR1_1mis2)或三个(miR1_1mis3)错配的构建体以减少这些miR-1结合位点的靶向性而不消除它。
Figure BDA0003920830640000546
这些构建体相对于MyΔ3A_miR1_1增加了重编程效力(表7)，而在心肌细胞中抑制转基因表达的效果较差(图3)。
表6
Figure BDA0003920830640000542
Figure BDA0003920830640000551
miR-208a/b结合位点
我们观察到在
Figure BDA0003920830640000553
诱导心肌细胞重编程过程期间，微RNA miR-1和miR-133的表达增加先于miR-208a/b的表达增加(图4)。在iPSC-CM中检测到微RNA miR-208a/b，但在经历长达三周重编程的hCF中未检测到。生成具有完全互补的miR-208b结合位点(208_4)的4X串联阵列的AAV CAG-GFP载体，以及具有种子位点突变(208_4mut)的错配阴性对照载体，并用于感染人类iPSC-CM。GFP-208_4以及GFP-miR1_4抑制转基因表达(图5A)。在hCF中，GFP-208_4和GFP-208_4mut都以相对于GFP-miR1_4和GFP-miR1_4mut更低的水平表达转基因(图5B)。
Figure BDA0003920830640000554
和
Figure BDA0003920830640000555
均能够驱动稳健的重编程，如通过hCF细胞转导之后21天的RNA标记物的表达所评估的(表7和图5C)。
Figure BDA0003920830640000556
和
Figure BDA0003920830640000557
表现出类似的重编程效力。
表7
Figure BDA0003920830640000552
小鼠体内测试
对于体内测试，将
Figure BDA0003920830640000558
包装到具有野生型衣壳序列的AAV5衣壳或AAV5z衣壳，一种具有更高心脏成纤维细胞感染性的变体(数据未显示)，并且使用心肌梗塞(MI)的LAD结扎鼠模型在小鼠中进行测试，其中在损伤时在心外膜进行AAV载体的注射。表8总结了载体设计和剂量。
表8
Figure BDA0003920830640000562
在注射后2、4、6和8周通过超声心动图评估功效。与编码GFP的对照相比，所有三种测试物品均显著保留了心脏功能(射血分数)(图6A)。8周后，三种测试物品显著保留心脏功能(射血分数)，MyA和MyA+miR-208结合位点载体之间的重编程效率没有统计学上的显著差异(图6B)。AAV5：
Figure BDA0003920830640000563
和AAV5：
Figure BDA0003920830640000564
在相同的病毒衣壳AAV5中递送时在MI中相当有效。
如代表性显微照片(图6D)所示，用三色染色的终末疤痕分析和每个心脏横截面纤维化组织百分比的量化显示所有三个治疗组都表现出疤痕面积显著减少(图6C)。
猪体内测试
在猪心肌梗塞(MI)模型中进一步测试该载体。将
Figure BDA0003920830640000565
包装到AAV5z衣壳中并在90分钟球囊闭塞之后28天在心外膜注射到猪心脏的边界区中以引入缺血性损伤。并行地，也给梗塞的猪注射制剂缓冲液，使得每组由十只动物组成。在注射后3周、5周、7周和9周进行超声心动图检查。注射后5周、7周和9周，接受
Figure BDA0003920830640000566
的猪的射血分数相对于对照组有显著改进(图7)。因此，用心肌细胞去靶向重编程混合物的治疗导致心脏性能比给药前基线平均改进10％。
改进的miR-1和miR-208a/b结合位点
测试了miR-208结合位点的变体，其通过在两个5'核苷酸位置中引入取代来破坏微RNA结合位点中预测的RNA发夹，结果如表9所示。
Figure BDA0003920830640000561
表9
Figure BDA0003920830640000571
测试种子区域之外的另外的序列变体以鉴定将抑制iPSC-CM中的表达的微RNA结合位点，同时允许hCF中的转基因表达，并在重编程3周之后产生高质量的iCM(参见表10)。
表10
Figure BDA0003920830640000572
Figure BDA0003920830640000581
iPSC-CM＝先前分化成心肌细胞的多能干细胞。
hCF＝人类心脏成纤维细胞。
iCM＝用编码MyA的AAV载体处理三周的人类心脏成纤维细胞-即在分化成心肌细胞的过程中。
测试了这些组中的几个miR-208结合位点抑制iPSC-CM中转基因表达的能力(图8)以及与亲本载体相比维持或增加体外重编程能力的能力(表9)。208MED13，基于MED13转录物中天然miR-208靶向位点的插入表现良好，增强重编程效力，同时保留了iPSC-CM抑制。
实例2
该实例采用了表达两种转基因的腺相关病毒(AAV)载体，具有内部缺失的心肌蛋白(MYOCD)和ASCL1
Figure BDA0003920830640000582
加上编码微RNA-133的多核苷酸(即MyA133三因子组合)。该编码miR-133的序列插入到CAG启动子和MYOCD
Figure BDA0003920830640000584
编码序列之间的内含子中。
如表11所示，将miR133添加到
Figure BDA0003920830640000583
中增加了重编程，如通过在用AAV载体以640k的MOI转导之后第21天心肌细胞的RNA表达所评估的。208_4和208MED13微RNA结合位点都保留了载体的重编程有效性，208MED13显示出比208_4更好的结果。
表11
Figure BDA0003920830640000591
在独立衍生的hCF细胞系中使用两种不同的病毒剂量证实了结果，如表12所示。
表12
Figure BDA0003920830640000592
在体外重编程三周之后，miR-133的添加将许多心脏标记物的表达提高了约二倍。随着miR-133a的添加，
Figure BDA0003920830640000593
和
Figure BDA0003920830640000594
盒之间的效力没有差异，表明miR-133a的添加不会导致盒的过早抑制。
在缺血性损伤的大鼠LAD-结扎模型中测试具有208MED13 miR-208微RNA结合位点的
Figure BDA0003920830640000595
和
Figure BDA0003920830640000596
载体。在结扎后两周进行病毒注射，并将治疗动物随机分组，以确保治疗组之间的基线射血分数相等。图9中显示的数据表明，与载体对照(HBSS)(n＝10只大鼠/组)相比，所有测试物品都保持了射血分数。在
Figure BDA0003920830640000597
和
Figure BDA0003920830640000598
之间没有可辨别的显著差异，与miR-133a包括在盒中无关。
材料和方法
原代成人人类成纤维细胞的分离。为了分离成人类心脏成纤维细胞(AHCF)，将成人左心室切碎成小片，并在心脏成纤维细胞消化培养基(10μg/ml Liberase TH，10μg/mlLiberase TM，1单位/ml DNase I，0.01％Polaxomer)中在37℃下消化1小时。消化之后，将细胞通过70μM过滤器过滤到50mL falcon管中。通过在1200×g下旋转5分钟使细胞沉淀，并置于成纤维细胞生长培养基中。每两天替换一次培养基。四天后，将AHCF冷冻或重新铺板用于病毒转导。
细胞重编程。对于体外心脏重编程，将AHCF以5×103/cm2的密度接种到成纤维细胞生长培养基中的培养皿或培养板中(第1天)。细胞铺板一天之后(第0天)，除去成纤维细胞生长培养基并加入病毒培养基。病毒转导之后一天(第1天)，将病毒培养基替换为iCM培养基，iCM培养基由4份Dulbecco改良Eagle培养基(DMEM)和1份
Figure BDA0003920830640000603
培养基199、10％FBS、1％非基本氨基酸、1％青霉素/链霉素构成，每两天一次，直至第4天。在第4天，将培养基更换为75％iCM培养基和25％RPMI和B27。在第7天，将培养基更换为50％iCM和50％RPMI+B27。在第11天，将培养基更换为25％iCM和75％RPMI和B27。在第14天，每天将培养基更换为RPMI和B27和FFV(10ng/ml rhFGF，15ng/ml rhFGF-10和5ng/ml rhVEGF)直至第21天。
免疫细胞化学。对于免疫细胞化学，将细胞在4％多聚甲醛中固定20分钟并用0.1％Triton-X100在室温下透化30分钟。用PBS洗涤细胞三次，然后用1％牛血清白蛋白(BSA)封闭1小时。然后将细胞与小鼠单克隆抗心肌钙蛋白T(cTnT)抗体以1:200稀释(赛默飞世尔科技公司(thermoscientific)，MA5-12960)或与小鼠抗α-辅肌动蛋白抗体以1:200稀释(西格玛，A7811)在1％BSA中培育1小时。用PBS洗涤三次后，然后将细胞与驴抗小鼠Alexa Fluor 594(美国英杰生命技术有限公司，A21203)以1:200稀释在1％BSA中培育1小时。然后使用细胞成像多模式读数器CytationTM 5(BioTek)对细胞进行成像定量。
量化和统计分析。所有数据均表示为具有平均值标准误差(SEM)的平均值，每组n＝2至3。用不成对/双向t检验或单向方差分析(ANOVA)计算P值。使用GraphPad
Figure BDA0003920830640000601
7软件包(GraphPad SoftwareTM)进行统计分析。在进行多次成对比较校正之后，P值<0.05被认为在所有情况下都是显著的。
MI手术、AAV心外膜注射和超声心动图。对9至10周龄的CHARLES
Figure BDA0003920830640000602
CD-1IGS雄性老鼠进行老鼠手术。用2.4％异氟烷/97.6％氧气麻醉老鼠并以仰卧位置于加热垫(37℃)上。用20号静脉内导管对动物进行插管并用小鼠呼吸机(MINIVENTTM，美国哈佛仪器公司(Harvard Apparatus,Inc.))通气。通过用7-0聚丙烯缝线永久性结扎左前降支动脉(LAD)诱导MI。将20ul AAV(共1.2E11 GC)通过具有合并的29号针头(BD)的胰岛素注射器注射到心肌中。基于冠状动脉闭塞之后发白的梗塞区域，沿梗塞区(IZ)和边界区(BZ)之间的边界进行全剂量注射。注射之后，用缝线缝合胸部。所有外科手术均在无菌条件下进行。如上所述生成大鼠梗死，但在LAD结扎后两周进行病毒给药，注射三次30μl，共3E11 GC。使用VISUALSONICSTM
Figure BDA0003920830640000611
3100成像系统对有意识的小鼠进行二维经胸超声心动图评估心脏功能。射血分数(EF)、收缩末期容积(ESV)和舒张末期容积(EDV)被用作心脏收缩功能的指标。所有猪的手术和超声心动图都在马塔温查尔斯河(Charles River，Mattawan)进行。将在观察中的雄性阉割的尤卡坦小型猪球囊闭塞90分钟，然后在闭塞之后28天进行开胸心外膜注射。将测试物品或制剂缓冲液以每次500μl的十次注射递送至边界区中，得到E14 GC的总剂量。
实例3
在人类iPSC衍生的心肌细胞(hiPSC-CM)中评估在内源性miR-208存在下各种形式的去靶向构建体的mRNA和蛋白质稳定性。用含有以下盒的AAV感染hiPSC-CM：
Figure BDA0003920830640000613
Figure BDA0003920830640000614
Figure BDA0003920830640000615
Figure BDA0003920830640000616
Figure BDA0003920830640000617
在转导后4和14天收获细胞。通过qRT-PCR测量MyΔ3A转录物的RNA水平；通过Western免疫印迹评估ASCL1的蛋白质水平。与含有突变的miR-208位点的构建体相比，有效的去靶向导致蛋白质水平降低。
这些相同构建体的mRNA和蛋白质稳定性也响应于不同水平的miR-208来评估。不表达内源性miR-208的HEK293细胞被上面列出的构建体感染。两天后，用不同水平的miR-208a或miR-208b转染它们。在转染后4天收获细胞。通过qRT-PCR测量
Figure BDA0003920830640000618
转录物的RNA水平；通过Western免疫印迹评估ASCL1的蛋白质水平。从这些结果确定每个去靶向构建体的相对剂量反应。
还将在猪模型体内评估来自各种去靶向构建体的表达。在AAV中产生以下七种盒：
Figure BDA0003920830640000612
Figure BDA0003920830640000621
通过在三个离散部位进行开胸心外膜注射，将七种构建体的集合递送至六只健康的约克夏猪的心脏中。每个注射位点用玻璃珠缝合标记，用于尸检时鉴定。在注射后4周(n＝3)或12周(n＝3)对动物实施安乐死。在尸检时收集每个注射位点的活检穿孔用于RNA和DNA分析。比较了在两个时间点对七种载体中的每一种递送的RNA表达与载体基因组。
<110> Tenaya Therapeutics
Tenaya Therapeutics公司
<120> 由心肌细胞表达的微RNA控制的基因载体
<130> TENA-017/01WO 334682-2118
<150> US 62/984,183
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<160> 166
<170> PatentIn 3.5版本
<210> 1
<211> 236
<212> PRT
<213> 智人
<400> 1
Met Glu Ser Ser Ala Lys Met Glu Ser Gly Gly Ala Gly Gln Gln Pro
1 5 10 15
Gln Pro Gln Pro Gln Gln Pro Phe Leu Pro Pro Ala Ala Cys Phe Phe
20 25 30
Ala Thr Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Gln
35 40 45
Ser Ala Gln Gln Gln Gln Gln Gln Gln Gln Gln Gln Gln Gln Ala Pro
50 55 60
Gln Leu Arg Pro Ala Ala Asp Gly Gln Pro Ser Gly Gly Gly His Lys
65 70 75 80
Ser Ala Pro Lys Gln Val Lys Arg Gln Arg Ser Ser Ser Pro Glu Leu
85 90 95
Met Arg Cys Lys Arg Arg Leu Asn Phe Ser Gly Phe Gly Tyr Ser Leu
100 105 110
Pro Gln Gln Gln Pro Ala Ala Val Ala Arg Arg Asn Glu Arg Glu Arg
115 120 125
Asn Arg Val Lys Leu Val Asn Leu Gly Phe Ala Thr Leu Arg Glu His
130 135 140
Val Pro Asn Gly Ala Ala Asn Lys Lys Met Ser Lys Val Glu Thr Leu
145 150 155 160
Arg Ser Ala Val Glu Tyr Ile Arg Ala Leu Gln Gln Leu Leu Asp Glu
165 170 175
His Asp Ala Val Ser Ala Ala Phe Gln Ala Gly Val Leu Ser Pro Thr
180 185 190
Ile Ser Pro Asn Tyr Ser Asn Asp Leu Asn Ser Met Ala Gly Ser Pro
195 200 205
Val Ser Ser Tyr Ser Ser Asp Glu Gly Ser Tyr Asp Pro Leu Ser Pro
210 215 220
Glu Glu Gln Glu Leu Leu Asp Phe Thr Asn Trp Phe
225 230 235
<210> 2
<211> 711
<212> DNA
<213> 智人
<400> 2
atggaaagct ctgccaagat ggagagcggc ggcgccggcc agcagcccca gccgcagccc 60
cagcagccct tcctgccgcc cgcagcctgt ttctttgcca cggccgcagc cgcggcggcc 120
gcagccgccg cagcggcagc gcagagcgcg cagcagcagc agcagcagca gcagcagcag 180
cagcaggcgc cgcagctgag accggcggcc gacggccagc cctcaggggg cggtcacaag 240
tcagcgccca agcaagtcaa gcgacagcgc tcgtcttcgc ccgaactgat gcgctgcaaa 300
cgccggctca acttcagcgg ctttggctac agcctgccgc agcagcagcc ggccgccgtg 360
gcgcgccgca acgagcgcga gcgcaaccgc gtcaagttgg tcaacctggg ctttgccacc 420
cttcgggagc acgtccccaa cggcgcggcc aacaagaaga tgagtaaggt ggagacactg 480
cgctcggcgg tcgagtacat ccgcgcgctg cagcagctgc tggacgagca tgacgcggtg 540
agcgccgcct tccaggcagg cgtcctgtcg cccaccatct cccccaacta ctccaacgac 600
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ccgctcagcc ccgaggagca ggagcttctc gacttcacca actggttctg a 711
<210> 3
<211> 986
<212> PRT
<213> 智人
<400> 3
Met Thr Leu Leu Gly Ser Glu His Ser Leu Leu Ile Arg Ser Lys Phe
1 5 10 15
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20 25 30
Leu Ala Asn Gln Gly Ile Ile Pro Pro Leu Lys Arg Pro Ala Glu Phe
35 40 45
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50 55 60
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65 70 75 80
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85 90 95
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100 105 110
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Gly Leu Ser Pro Asp Gln Thr Arg Ser Glu Asp Pro Gln Asn Ser Ala
165 170 175
Gly Ser Pro Pro Asp Ala Lys Ala Ser Asp Thr Pro Ser Thr Gly Ser
180 185 190
Leu Gly Thr Asn Gln Asp Leu Ala Ser Gly Ser Glu Asn Asp Arg Asn
195 200 205
Asp Ser Ala Ser Gln Pro Ser His Gln Ser Asp Ala Gly Lys Gln Gly
210 215 220
Leu Gly Pro Pro Ser Thr Pro Ile Ala Val His Ala Ala Val Lys Ser
225 230 235 240
Lys Ser Leu Gly Asp Ser Lys Asn Arg His Lys Lys Pro Lys Asp Pro
245 250 255
Lys Pro Lys Val Lys Lys Leu Lys Tyr His Gln Tyr Ile Pro Pro Asp
260 265 270
Gln Lys Ala Glu Lys Ser Pro Pro Pro Met Asp Ser Ala Tyr Ala Arg
275 280 285
Leu Leu Gln Gln Gln Gln Leu Phe Leu Gln Leu Gln Ile Leu Ser Gln
290 295 300
Gln Gln Gln Gln Gln Gln His Arg Phe Ser Tyr Leu Gly Met His Gln
305 310 315 320
Ala Gln Leu Lys Glu Pro Asn Glu Gln Met Val Arg Asn Pro Asn Ser
325 330 335
Ser Ser Thr Pro Leu Ser Asn Thr Pro Leu Ser Pro Val Lys Asn Ser
340 345 350
Phe Ser Gly Gln Thr Gly Val Ser Ser Phe Lys Pro Gly Pro Leu Pro
355 360 365
Pro Asn Leu Asp Asp Leu Lys Val Ser Glu Leu Arg Gln Gln Leu Arg
370 375 380
Ile Arg Gly Leu Pro Val Ser Gly Thr Lys Thr Ala Leu Met Asp Arg
385 390 395 400
Leu Arg Pro Phe Gln Asp Cys Ser Gly Asn Pro Val Pro Asn Phe Gly
405 410 415
Asp Ile Thr Thr Val Thr Phe Pro Val Thr Pro Asn Thr Leu Pro Asn
420 425 430
Tyr Gln Ser Ser Ser Ser Thr Ser Ala Leu Ser Asn Gly Phe Tyr His
435 440 445
Phe Gly Ser Thr Ser Ser Ser Pro Pro Ile Ser Pro Ala Ser Ser Asp
450 455 460
Leu Ser Val Ala Gly Ser Leu Pro Asp Thr Phe Asn Asp Ala Ser Pro
465 470 475 480
Ser Phe Gly Leu His Pro Ser Pro Val His Val Cys Thr Glu Glu Ser
485 490 495
Leu Met Ser Ser Leu Asn Gly Gly Ser Val Pro Ser Glu Leu Asp Gly
500 505 510
Leu Asp Ser Glu Lys Asp Lys Met Leu Val Glu Lys Gln Lys Val Ile
515 520 525
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Leu Arg Met Gln Leu Gln Lys Gln Lys Arg Asn Asn Cys Ser Glu Lys
545 550 555 560
Lys Pro Leu Pro Phe Leu Ala Ala Ser Ile Lys Gln Glu Glu Ala Val
565 570 575
Ser Ser Cys Pro Phe Ala Ser Gln Val Pro Val Lys Arg Gln Ser Ser
580 585 590
Ser Ser Glu Cys His Pro Pro Ala Cys Glu Ala Ala Gln Leu Gln Pro
595 600 605
Leu Gly Asn Ala His Cys Val Glu Ser Ser Asp Gln Thr Asn Val Leu
610 615 620
Ser Ser Thr Phe Leu Ser Pro Gln Cys Ser Pro Gln His Ser Pro Leu
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Gly Ala Val Lys Ser Pro Gln His Ile Ser Leu Pro Pro Ser Pro Asn
645 650 655
Asn Pro His Phe Leu Pro Ser Ser Ser Gly Ala Gln Gly Glu Gly His
660 665 670
Arg Val Ser Ser Pro Ile Ser Ser Gln Val Cys Thr Ala Gln Asn Ser
675 680 685
Gly Ala His Asp Gly His Pro Pro Ser Phe Ser Pro His Ser Ser Ser
690 695 700
Leu His Pro Pro Phe Ser Gly Ala Gln Ala Asp Ser Ser His Gly Ala
705 710 715 720
Gly Gly Asn Pro Cys Pro Lys Ser Pro Cys Val Gln Gln Lys Met Ala
725 730 735
Gly Leu His Ser Ser Asp Lys Val Gly Pro Lys Phe Ser Ile Pro Ser
740 745 750
Pro Thr Phe Ser Lys Ser Ser Ser Ala Ile Ser Glu Val Thr Gln Pro
755 760 765
Pro Ser Tyr Glu Asp Ala Val Lys Gln Gln Met Thr Arg Ser Gln Gln
770 775 780
Met Asp Glu Leu Leu Asp Val Leu Ile Glu Ser Gly Glu Met Pro Ala
785 790 795 800
Asp Ala Arg Glu Asp His Ser Cys Leu Gln Lys Val Pro Lys Ile Pro
805 810 815
Arg Ser Ser Arg Ser Pro Thr Ala Val Leu Thr Lys Pro Ser Ala Ser
820 825 830
Phe Glu Gln Ala Ser Ser Gly Ser Gln Ile Pro Phe Asp Pro Tyr Ala
835 840 845
Thr Asp Ser Asp Glu His Leu Glu Val Leu Leu Asn Ser Gln Ser Pro
850 855 860
Leu Gly Lys Met Ser Asp Val Thr Leu Leu Lys Ile Gly Ser Glu Glu
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Pro His Phe Asp Gly Ile Met Asp Gly Phe Ser Gly Lys Ala Ala Glu
885 890 895
Asp Leu Phe Asn Ala His Glu Ile Leu Pro Gly Pro Leu Ser Pro Met
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Pro Pro Asn Ser Thr Pro Gly Phe Ser Ala Leu Thr Thr Ser Ser Pro
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Ser Ile Phe Asn Ile Asp Phe Leu Asp Val Thr Asp Leu Asn Leu Asn
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Ser Ser Met Asp Leu His Leu Gln Gln Trp
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<211> 2961
<212> DNA
<213> 智人
<400> 4
atgacactcc tggggtctga gcattccttg ctgattagga gcaagttcag atcagtttta 60
cagttaagac ttcaacaaag aaggacccag gaacaactgg ctaaccaagg cataatacca 120
ccactgaaac gtccagctga attccatgag caaagaaaac atttggatag tgacaaggct 180
aaaaattccc tgaagcgcaa agccagaaac aggtgcaaca gtgccgactt ggttaatatg 240
cacatactcc aagcttccac tgcagagagg tccattccaa ctgctcagat gaagctgaaa 300
agagcccgac tcgccgatga tctcaatgaa aaaattgctc tacgaccagg gccactggag 360
ctggtggaaa aaaacattct tcctgtggat tctgctgtga aagaggccat aaaaggtaac 420
caggtgagtt tctccaaatc cacggatgct tttgcctttg aagaggacag cagcagcgat 480
gggctttctc cggatcagac tcgaagtgaa gacccccaaa actcagcggg atccccgcca 540
gacgctaaag cctcagatac cccttcgaca ggttctctgg ggacaaacca ggatcttgct 600
tctggctcag aaaatgacag aaatgactca gcctcacagc ccagccacca gtcagatgcg 660
gggaagcagg ggcttggccc ccccagcacc cccatagccg tgcatgctgc tgtaaagtcc 720
aaatccttgg gtgacagtaa gaaccgccac aaaaagccca aggaccccaa gccaaaggtg 780
aagaagctta aatatcacca gtacattccc ccagaccaga aggcagagaa gtcccctcca 840
cctatggact cagcctacgc tcggctgctc cagcaacagc agctgttcct gcagctccaa 900
atcctcagcc agcagcagca gcagcagcaa caccgattca gctacctagg gatgcaccaa 960
gctcagctta aggaaccaaa tgaacagatg gtcagaaatc caaactcttc ttcaacgcca 1020
ctgagcaata cccccttgtc tcctgtcaaa aacagttttt ctggacaaac tggtgtctct 1080
tctttcaaac caggcccact cccacctaac ctggatgatc tgaaggtctc tgaattaaga 1140
caacagcttc gaattcgggg cttgcctgtg tcaggcacca aaacggctct catggaccgg 1200
cttcgaccct tccaggactg ctctggcaac ccagtgccga actttgggga tataacgact 1260
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gcctcctctg acctgtcagt cgctgggtcc ctgccggaca ccttcaatga tgcctccccc 1440
tccttcggcc tgcacccgtc cccagtccac gtgtgcacgg aggaaagtct catgagcagc 1500
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<212> PRT
<213> 智人
<400> 5
Met Gly Arg Lys Lys Ile Gln Ile Thr Arg Ile Met Asp Glu Arg Asn
1 5 10 15
Arg Gln Val Thr Phe Thr Lys Arg Lys Phe Gly Leu Met Lys Lys Ala
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Tyr Glu Leu Ser Val Leu Cys Asp Cys Glu Ile Ala Leu Ile Ile Phe
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Asn Ser Thr Asn Lys Leu Phe Gln Tyr Ala Ser Thr Asp Met Asp Lys
50 55 60
Val Leu Leu Lys Tyr Thr Glu Tyr Asn Glu Pro His Glu Ser Arg Thr
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Asn Ser Asp Ile Val Glu Ala Leu Asn Lys Lys Glu Asn Lys Gly Cys
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Glu Lys Tyr Lys Lys Ile Asn Glu Glu Phe Asp Asn Met Ile Lys Ser
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Ile Pro Val Ser Ser His Asn Ser Leu Val Tyr Ser Asn Pro Val Ser
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Ser Leu Gly Asn Pro Asn Leu Leu Pro Leu Ala His Pro Ser Leu Gln
165 170 175
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Pro Met Asn Leu Gly Met Asn Asn Arg Lys Pro Asp Leu Arg Val Leu
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260 265 270
Asn Asn Ser Gln Ser Ala Gln Ser Leu Ala Thr Pro Val Val Ser Val
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Ala Thr Pro Thr Leu Pro Gly Gln Gly Met Gly Gly Tyr Pro Ser Ala
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Ile Ser Thr Thr Tyr Gly Thr Glu Tyr Ser Leu Ser Ser Ala Asp Leu
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Ser Ser Leu Ser Gly Phe Asn Thr Ala Ser Ala Leu His Leu Gly Ser
325 330 335
Val Thr Gly Trp Gln Gln Gln His Leu His Asn Met Pro Pro Ser Ala
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Leu Ser Gln Leu Gly Ala Cys Thr Ser Thr His Leu Ser Gln Ser Ser
355 360 365
Asn Leu Ser Leu Pro Ser Thr Gln Ser Leu Asn Ile Lys Ser Glu Pro
370 375 380
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His Thr Arg His Glu Ala Gly Arg Ser Pro Val Asp Ser Leu Ser Ser
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<212> DNA
<213> 智人
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<212> PRT
<213> 智人
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Gly Ala Pro Ser Lys Ser Pro Ser Ser Pro Gln Ala Ala Phe Thr Gln
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245 250 255
Lys Lys Leu Lys Tyr His Gln Tyr Ile Pro Pro Asp Gln Lys Ala Glu
260 265 270
Lys Ser Pro Pro Pro Met Asp Ser Ala Tyr Ala Arg Leu Leu Gln Gln
275 280 285
Gln Gln Leu Phe Leu Gln Leu Gln Ile Leu Ser Gln Gln Gln Gln Gln
290 295 300
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<212> PRT
<213> 智人
<400> 11
Glu Val Thr Gln Pro Pro Ser Tyr Glu Asp Ala Val Lys Gln Gln Met
1 5 10 15
Thr Arg Ser Gln Gln Met Asp Glu Leu Leu Asp Val Leu Ile Glu Ser
20 25 30
Gly Glu Met Pro Ala Asp Ala Arg Glu Asp His Ser Cys Leu Gln Lys
35 40 45
Val Pro Lys Ile Pro Arg Ser Ser Arg Ser Pro Thr Ala Val Leu Thr
50 55 60
Lys Pro Ser Ala Ser Phe Glu Gln Ala Ser Ser Gly Ser Gln Ile Pro
65 70 75 80
Phe Asp Pro Tyr Ala Thr Asp Ser Asp Glu His Leu Glu Val Leu Leu
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Asn Ser Gln Ser Pro Leu Gly Lys Met Ser Asp Val Thr Leu Leu Lys
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Gly Lys Ala Ala Glu Asp Leu Phe Asn Ala His Glu Ile Leu Pro Gly
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<212> PRT
<213> 智人
<400> 12
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<212> PRT
<213> 智人
<400> 13
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1 5 10 15
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<210> 14
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 实验室制造-工程改造的MYOCD蛋白
<400> 14
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 实验室制造-工程改造的MYOCD蛋白
<400> 15
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<220>
<223> 实验室制造-工程改造的MYOCD蛋白
<400> 16
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<213> 智人
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<213> 猪捷申病毒-1
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<211> 57
<212> DNA
<213> 猪捷申病毒-1
<400> 22
gctactaact tcagcctgct gaagcaggct ggagacgtgg aggagaaccc tggacct 57
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<211> 19
<212> PRT
<213> 猪捷申病毒-1
<400> 23
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<210> 24
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<212> DNA
<213> 明脉扁刺蛾病毒
<400> 24
gagggcagag gaagtctgct aacatgcggt gacgtcgagg agaatcctgg acct 54
<210> 25
<211> 18
<212> PRT
<213> 明脉扁刺蛾病毒
<400> 25
Glu Gly Arg Gly Ser Leu Leu Thr Cys Gly Asp Val Glu Glu Asn Pro
1 5 10 15
Gly Pro
<210> 26
<211> 60
<212> DNA
<213> 马鼻炎病毒
<400> 26
cagtgtacta attatgctct cttgaaattg gctggagatg ttgagagcaa ccctggacct 60
<210> 27
<211> 20
<212> PRT
<213> 马鼻炎病毒
<400> 27
Gln Cys Thr Asn Tyr Ala Leu Leu Lys Leu Ala Gly Asp Cys Glu Ser
1 5 10 15
Asn Pro Gly Pro
20
<210> 28
<211> 66
<212> DNA
<213> 口蹄疫病毒
<400> 28
gtgaaacaga ctttgaattt tgaccttctc aagttggcgg gagacgtgga gtccaaccct 60
ggacct 66
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<211> 22
<212> PRT
<213> 口蹄疫病毒
<400> 29
Val Lys Gln Thr Leu Asn Phe Asp Leu Leu Lys Leu Ala Gly Asp Val
1 5 10 15
Glu Ser Asn Pro Gly Pro
20
<210> 30
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 实验室制造-接头肽
<400> 30
Gly Gly Ser Gly Gly Ser
1 5
<210> 31
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 实验室制造-接头肽
<400> 31
Gly Ser Ser Gly Gly Ser
1 5
<210> 32
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 实验室制造-接头肽
<400> 32
Gly Gly Ser Gly Ser Ser
1 5
<210> 33
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 实验室制造-接头肽
<400> 33
Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser
1 5
<210> 34
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 实验室制造-接头肽
<400> 34
Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser
1 5 10
<210> 35
<211> 3726
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 实验室制造-合成MYOCD-2A-ASCL1构建体
<400> 35
atgacactcc tggggtctga gcattccttg ctgattagga gcaagttcag atcagtttta 60
cagttaagac ttcaacaaag aaggacccag gaacaactgg ctaaccaagg cataatacca 120
ccactgaaac gtccagctga attccatgag caaagaaaac atttggatag tgacaaggct 180
aaaaattccc tgaagcgcaa agccagaaac aggtgcaaca gtgccgactt ggttaatatg 240
cacatactcc aagcttccac tgcagagagg tccattccaa ctgctcagat gaagctgaaa 300
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gggctttctc cggatcagac tcgaagtgaa gacccccaaa actcagcggg atccccgcca 540
gacgctaaag cctcagatac cccttcgaca ggttctctgg ggacaaacca ggatcttgct 600
tctggctcag aaaatgacag aaatgactca gcctcacagc ccagccacca gtcagatgcg 660
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aagaagctta aatatcacca gtacattccc ccagaccaga aggcagagaa gtcccctcca 840
cctatggact cagcctacgc tcggctgctc cagcaacagc agctgttcct gcagctccaa 900
atcctcagcc agcagcagca gcagcagcaa caccgattca gctacctagg gatgcaccaa 960
gctcagctta aggaaccaaa tgaacagatg gtcagaaatc caaactcttc ttcaacgcca 1020
ctgagcaata cccccttgtc tcctgtcaaa aacagttttt ctggacaaac tggtgtctct 1080
tctttcaaac caggcccact cccacctaac ctggatgatc tgaaggtctc tgaattaaga 1140
caacagcttc gaattcgggg cttgcctgtg tcaggcacca aaacggctct catggaccgg 1200
cttcgaccct tccaggactg ctctggcaac ccagtgccga actttgggga tataacgact 1260
gtcacttttc ctgtcacacc caacacgctg cccaattacc agtcttcctc ttctaccagt 1320
gccctgtcca acggcttcta ccactttggc agcaccagct ccagcccccc gatctcccca 1380
gcctcctctg acctgtcagt cgctgggtcc ctgccggaca ccttcaatga tgcctccccc 1440
tccttcggcc tgcacccgtc cccagtccac gtgtgcacgg aggaaagtct catgagcagc 1500
ctgaatgggg gctctgttcc ttctgagctg gatgggctgg actccgagaa ggacaagatg 1560
ctggtggaga agcagaaggt gatcaatgaa ctcacctgga aactccagca agagcagagg 1620
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aagccgctgc ctttcctggc tgcctccatc aagcaggaag aggctgtctc cagctgtcct 1740
tttgcatccc aagtacctgt gaaaagacaa agcagcagct cagagtgtca cccaccggct 1800
tgtgaagctg ctcaactcca gcctcttgga aatgctcatt gtgtggagtc ctcagatcaa 1860
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ctgccctcat cctccggggc ccagggagaa gggcacaggg tctcctcgcc catcagcagc 2040
caggtgtgca ctgcacagaa ctcaggagca cacgatggcc atcctccaag cttctctccc 2100
cattcttcca gcctccaccc gcccttctct ggagcccaag cagacagcag tcatggtgcc 2160
gggggaaacc cttgtcccaa aagcccatgt gtacagcaaa agatggctgg tttacactct 2220
tctgataagg tggggccaaa gttttcaatt ccatccccaa ctttttctaa gtcaagttca 2280
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agtccaactg ctgtcctcac caagccctcg gcttcctttg aacaagcctc ttcaggcagc 2520
cagatcccct ttgatcccta tgccaccgac agtgatgagc atcttgaagt cttattaaat 2580
tcccagagcc ccctaggaaa gatgagtgat gtcacccttc taaaaattgg gagcgaagag 2640
cctcactttg atgggataat ggatggattc tctgggaagg ctgcagaaga cctcttcaat 2700
gcacatgaga tcttgccagg ccccctctct ccaatgcaga cacagttttc accctcttct 2760
gtggacagca atgggctgca gttaagcttc actgaatctc cctgggaaac catggagtgg 2820
ctggacctca ctccgccaaa ttccacacca ggctttagcg ccctcaccac cagcagcccc 2880
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ctgatgcgct gcaaacgccg gctcaacttc agcggctttg gctacagcct gccgcagcag 3360
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ctgggctttg ccacccttcg ggagcacgtc cccaacggcg cggccaacaa gaagatgagt 3480
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gagggctctt acgacccgct cagccccgag gagcaggagc ttctcgactt caccaactgg 3720
ttctga 3726
<210> 36
<211> 3744
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 实验室制造-合成MYOCD-2A-MYF6构建体
<400> 36
atgacactcc tggggtctga gcattccttg ctgattagga gcaagttcag atcagtttta 60
cagttaagac ttcaacaaag aaggacccag gaacaactgg ctaaccaagg cataatacca 120
ccactgaaac gtccagctga attccatgag caaagaaaac atttggatag tgacaaggct 180
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cacatactcc aagcttccac tgcagagagg tccattccaa ctgctcagat gaagctgaaa 300
agagcccgac tcgccgatga tctcaatgaa aaaattgctc tacgaccagg cccactggag 360
ctggtggaaa aaaacattct tcctgtggat tctgctgtga aagaggccat aaaaggtaac 420
caggtgagtt tctccaaatc cacggatgct tttgcctttg aagaggacag cagcagcgat 480
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aaatccttgg gtgacagtaa gaaccgccac aaaaagccca aggaccccaa gccaaaggtg 780
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gccctgtcca acggcttcta ccactttggc agcaccagct ccagcccccc gatctcccca 1380
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ctgaatgggg gctctgttcc ttctgagctg gatgggctgg actccgagaa ggacaagatg 1560
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aagccgctgc ctttcctggc tgcctccatc aagcaggaag aggctgtctc cagctgtcct 1740
tttgcatccc aagtacctgt gaaaagacaa agcagcagct cagagtgtca cccaccggct 1800
tgtgaagctg ctcaactcca gcctcttgga aatgctcatt gtgtggagtc ctcagatcaa 1860
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cctcactttg atgggataat ggatggattc tctgggaagg ctgcagaaga cctcttcaat 2700
gcacatgaga tcttgccagg ccccctctct ccaatgcaga cacagttttc accctcttct 2760
gtggacagca atgggctgca gttaagcttc actgaatctc cctgggaaac catggagtgg 2820
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<210> 37
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<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 实验室制造-合成MyΔ3-2A-ASCL1构建体
<400> 37
atgacactcc tggggtctga gcattccttg ctgattagga gcaagttcag atcagtttta 60
cagttaagac ttcaacaaag aaggacccag gaacaactgg ctaaccaagg cataatacca 120
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cacatactcc aagcttccac tgcagagagg tccattccaa ctgctcagat gaagctgaaa 300
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ctggtggaaa aaaacattct tcctgtggat tctgctgtga aagaggccat aaaaggtaac 420
caggtgagtt tctccaaatc cacggatgct tttgcctttg aagaggacag cagcagcgat 480
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gacgctaaag cctcagatac cccttcgaca ggttctctgg ggacaaacca ggatcttgct 600
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aaatccttgg gtgacagtaa gaaccgccac aaaaagccca aggaccccaa gccaaaggtg 780
aagaagctta aatatcacca gtacattccc ccagaccaga aggcagagaa gtcccctcca 840
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cagtgggcca cgaacttctc tctgttaaag caagcaggag acgtggaaga aaaccccggt 2400
cctatggaaa gctctgccaa gatggagagc ggcggcgccg gccagcagcc ccagccgcag 2460
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aagtcagcgc ccaagcaagt caagcgacag cgctcgtctt cgcccgaact gatgcgctgc 2700
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gtggcgcgcc gcaacgagcg cgagcgcaac cgcgtcaagt tggtcaacct gggctttgcc 2820
acccttcggg agcacgtccc caacggcgcg gccaacaaga agatgagtaa ggtggagaca 2880
ctgcgctcgg cggtcgagta catccgcgcg ctgcagcagc tgctggacga gcatgacgcg 2940
gtgagcgccg ccttccaggc aggcgtcctg tcgcccacca tctcccccaa ctactccaac 3000
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<210> 38
<211> 3132
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 实验室制造-合成MyΔ3-2A-MYF6构建体
<400> 38
atgacactcc tggggtctga gcattccttg ctgattagga gcaagttcag atcagtttta 60
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ctggtggaaa aaaacattct tcctgtggat tctgctgtga aagaggccat aaaaggtaac 420
caggtgagtt tctccaaatc cacggatgct tttgcctttg aagaggacag cagcagcgat 480
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gacgctaaag cctcagatac cccttcgaca ggttctctgg ggacaaacca ggatcttgct 600
tctggctcag aaaatgacag aaatgactca gcctcacagc ccagccacca gtcagatgcg 660
gggaagcagg ggcttggccc ccccagcacc cccatagccg tgcatgctgc tgtaaagtcc 720
aaatccttgg gtgacagtaa gaaccgccac aaaaagccca aggaccccaa gccaaaggtg 780
aagaagctta aatatcacca gtacattccc ccagaccaga aggcagagaa gtcccctcca 840
cctatggact cagcctacgc tcggctgctc cagcaacagc agctgttcct gcagctccaa 900
atcctcagcc agcagcagca gcagcagcaa caccgattca gctacctagg gatgcaccaa 960
gctcagctta aggaaccaaa tgaacagatg gtcagaaatc caaactcttc ttcaacgcca 1020
ctgagcaata cccccttgtc tcctgtcaaa aacagttttt ctggacaaac tggtgtctct 1080
tctttcaaac caggcccact cccacctaac ctggatgatc tgaaggtctc tgaattaaga 1140
caacagcttc gaattcgggg cttgcctgtg tcaggcacca aaacggctct catggaccgg 1200
cttcgaccct tccaggactg ctctggcaac ccagtgccga actttgggga tataacgact 1260
gtcacttttc ctgtcacacc caacacgctg cccaattacc agtcttcctc ttctaccagt 1320
gccctgtcca acggcttcta ccactttggc agcaccagct ccagcccccc gatctcccca 1380
gcctcctctg acctgtcagt cgctgggtcc ctgccggaca ccttcaatga tgcctccccc 1440
tccttcggcc tgcacccgtc cccagtccac gtgtgcacgg aggaaagtct catgagcagc 1500
ctgaatgggg gctctgttcc ttctgagctg gatgggctgg actccgagaa ggacaagatg 1560
ctggtggaga agcagaaggt gatcaatgaa ctcacctgga aactccagca agagcagagg 1620
caggtggagg agctgaggat gcagcttcag aagcagaaaa ggaataactg ttcagaggag 1680
gtaacacagc ctccatccta tgaagatgcc gtaaagcagc aaatgacccg gagtcagcag 1740
atggatgaac tcctggacgt gcttattgaa agcggagaaa tgccagcaga cgctagagag 1800
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<213> 人工序列
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<223> 实验室制造-合成ASCL1-2A-MYOCD构建体
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tcttctttca aaccaggccc actcccacct aacctggatg atctgaaggt ctctgaatta 1920
agacaacagc ttcgaattcg gggcttgcct gtgtcaggca ccaaaacggc tctcatggac 1980
cggcttcgac ccttccagga ctgctctggc aacccagtgc cgaactttgg ggatataacg 2040
actgtcactt ttcctgtcac acccaacacg ctgcccaatt accagtcttc ctcttctacc 2100
agtgccctgt ccaacggctt ctaccacttt ggcagcacca gctccagccc cccgatctcc 2160
ccagcctcct ctgacctgtc agtcgctggg tccctgccgg acaccttcaa tgatgcctcc 2220
ccctccttcg gcctgcaccc gtccccagtc cacgtgtgca cggaggaaag tctcatgagc 2280
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<213> 智人
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Met Ser Gly Ser Phe Asp Arg Lys Leu Ser Ser Ile Leu Thr Asp Ile
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Ser Ser Ser Leu Ser Cys His Ala Gly Ser Lys Asp Ser Pro Thr Leu
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Asp Tyr Tyr Ser Gly Gln Pro Tyr Gly Gln Thr Val Asn Pro Tyr Thr
50 55 60
Tyr His His Gln Phe Asn Leu Asn Gly Leu Ala Gly Thr Gly Ala Tyr
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Gln Arg Arg Phe Gln Lys Ala Gln Tyr Leu Ala Leu Pro Glu Arg Ala
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Glu Leu Ala Ala Gln Leu Gly Leu Thr Gln Thr Gln Val Lys Ile Trp
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Val Pro Leu Glu His Ser Pro Asn Asn Ser Asp Ser Met Ala Cys Asn
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Ala Pro Ala Arg Ser Gln Leu Pro Pro Pro Leu Pro Tyr Ser Ala Ser
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Pro Ser Tyr Leu Asp Asp Pro Thr Asn Ser Trp Tyr His Ala Gln Asn
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Leu Ser Gly Pro His Leu Gln Gln Gln Pro Pro Gln Pro Ala Thr Leu
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His His Ala Ser Pro Gly Pro Pro Pro Asn Pro Gly Ala Val Tyr
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Met Met Thr Met Thr Thr Met Ala Asp Gly Leu Glu Gly Gln Asp Ser
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Ser Lys Ser Ala Phe Met Glu Phe Gly Gln Gln Gln Gln Gln Gln Gln
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Gln Gln Gln Gln Gln Gln Gln Gln Gln Gln Gln Gln Pro Pro Pro Pro
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Pro Pro Pro Pro Pro Gln Pro His Ser Gln Gln Ser Ser Pro Ala Met
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Ala Gly Ala His Tyr Pro Leu His Cys Leu His Ser Ala Ala Ala Ala
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Ala Ala Ala Gly Ser His His His His His His Gln His His His His
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Gln Ser Tyr His Asn Ser Ser Ala Ala Ala Gln Thr Arg Gly Asp Asp
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Thr Asp Gln Gln Lys Thr Thr Val Ile Glu Asn Gly Glu Ile Arg Phe
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Asn Gly Lys Gly Lys Lys Ile Arg Lys Pro Arg Thr Ile Tyr Ser Ser
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225 230 235 240
Ser Ala Ala Leu Ser Pro Arg Ser Pro Ala Leu Pro Pro Val Trp Asp
245 250 255
Val Ser Ala Ser Ala Lys Gly Val Ser Met Pro Pro Asn Ser Tyr Met
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Pro Gly Tyr Ser His Trp Tyr Ser Ser Pro His Gln Asp Thr Met Gln
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Arg Pro Gln Met Met
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Glu Glu Glu Leu Leu Cys Arg Met Ser Asn Lys Asp Arg His Ile Asp
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Ser Ser Cys Ser Ser Phe Ile Lys Thr Glu Pro Ser Ser Pro Ala Ser
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Leu Thr Asp Ser Val Asn His His Ser Pro Gly Gly Ser Ser Asp Ala
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Ser Gly Ser Tyr Ser Ser Thr Met Asn Gly His Gln Asn Gly Leu Asp
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Ser Pro Pro Leu Tyr Pro Ser Ala Pro Ile Leu Gly Gly Ser Gly Pro
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Val Arg Lys Leu Tyr Asp Asp Cys Ser Ser Thr Ile Val Glu Asp Pro
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Gln Thr Lys Cys Glu Tyr Met Leu Asn Ser Met Pro Lys Arg Leu Cys
115 120 125
Leu Val Cys Gly Asp Ile Ala Ser Gly Tyr His Tyr Gly Val Ala Ser
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Cys Glu Ala Cys Lys Ala Phe Phe Lys Arg Thr Ile Gln Gly Asn Ile
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Glu Tyr Ser Cys Pro Ala Thr Asn Glu Cys Glu Ile Thr Lys Arg Arg
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Arg Lys Ser Cys Gln Ala Cys Arg Phe Met Lys Cys Leu Lys Val Gly
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Met Leu Lys Glu Gly Val Arg Leu Asp Arg Val Arg Gly Gly Arg Gln
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Gln Leu Val Gln Pro Ala Lys Lys Pro Tyr Asn Lys Ile Val Ser His
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Leu Leu Val Ala Glu Pro Glu Lys Ile Tyr Ala Met Pro Asp Pro Thr
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Val Pro Asp Ser Asp Ile Lys Ala Leu Thr Thr Leu Cys Asp Leu Ala
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Asp Arg Glu Leu Val Val Ile Ile Gly Trp Ala Lys His Ile Pro Gly
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Phe Ser Thr Leu Ser Leu Ala Asp Gln Met Ser Leu Leu Gln Ser Ala
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Ser Lys Leu Ala Gly Leu Leu Asp Leu Asn Asn Ala Ile Leu Gln Leu
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Val Lys Lys Tyr Lys Ser Met Lys Leu Glu Lys Glu Glu Phe Val Thr
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Leu Lys Ala Ile Ala Leu Ala Asn Ser Asp Ser Met His Ile Glu Asp
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Gly Gly Gln Met Cys Arg Pro His Leu Leu His Ser Pro Gly Leu Pro
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His Asn Pro Trp Thr Val Ser Pro Phe Ser Lys Thr Pro Leu His Pro
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Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Gly Ser Ser Val Ala Ser Leu Thr
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Pro Ala Ser Ser Ser Ala Gly Gly Ser Ala Ala Arg Gly Glu Asp Lys
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Ser Asn Lys Ser Lys Lys Ser Lys Lys Gly Ala Glu Cys Phe Glu Glu
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Leu Ser Lys Cys Met Gln Glu Lys Ser Ser Pro Phe Ser Ala Ala Ala
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Leu Ala Gly His Met Ala Pro Val Gly His Leu Pro Pro Phe Ser His
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tag 1443
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gcctgcggcc tctaccacaa gatgaacggc atcaaccggc cgctcatcaa gcctcagcgc 780
cggctgtccg cctcccgccg agtgggcctc tcctgtgcca actgccagac caccaccacc 840
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aagctccacg gggtccccag gcctcttgca atgcggaaag aggggatcca aaccagaaaa 960
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atcactgcgt aa 1332
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<212> PRT
<213> 智人
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Met Ala Gln Pro Leu Cys Pro Pro Leu Ser Glu Ser Trp Met Leu Ser
1 5 10 15
Ala Ala Trp Gly Pro Thr Arg Arg Pro Pro Pro Ser Asp Lys Asp Cys
20 25 30
Gly Arg Ser Leu Val Ser Ser Pro Asp Ser Trp Gly Ser Thr Pro Ala
35 40 45
Asp Ser Pro Val Ala Ser Pro Ala Arg Pro Gly Thr Leu Arg Asp Pro
50 55 60
Arg Ala Pro Ser Val Gly Arg Arg Gly Ala Arg Ser Ser Arg Leu Gly
65 70 75 80
Ser Gly Gln Arg Gln Ser Ala Ser Glu Arg Glu Lys Leu Arg Met Arg
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Thr Leu Ala Arg Ala Leu His Glu Leu Arg Arg Phe Leu Pro Pro Ser
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Val Ala Pro Ala Gly Gln Ser Leu Thr Lys Ile Glu Thr Leu Arg Leu
115 120 125
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165 170 175
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180 185 190
Ser Ala Val Arg Ala Gly Ala Ser Trp Gly Ser Pro Pro Ala Cys Pro
195 200 205
Gly Ala Arg Ala Ala Pro Glu Pro Arg Asp Pro Pro Ala Leu Phe Ala
210 215 220
Glu Ala Ala Cys Pro Glu Gly Gln Ala Met Glu Pro Ser Pro Pro Ser
225 230 235 240
Pro Leu Leu Pro Gly Asp Val Leu Ala Leu Leu Glu Thr Trp Met Pro
245 250 255
Leu Ser Pro Leu Glu Trp Leu Pro Glu Glu Pro Lys
260 265
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<212> DNA
<213> 智人
<400> 54
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<213> 智人
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Met Met Met Asp Leu Phe Glu Thr Gly Ser Tyr Phe Phe Tyr Leu Asp
1 5 10 15
Gly Glu Asn Val Thr Leu Gln Pro Leu Glu Val Ala Glu Gly Ser Pro
20 25 30
Leu Tyr Pro Gly Ser Asp Gly Thr Leu Ser Pro Cys Gln Asp Gln Met
35 40 45
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65 70 75 80
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85 90 95
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His Ser Arg Gly Leu Val Ile Thr Ala Lys Glu Gly Gly Ala Ser Ile
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Glu Lys
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<223> 实验室制造-合成MYOCD-2A-ASCL1构建体
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Thr Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Gln
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<220>
<223> 实验室制造-合成MYOCD-2A-MYF6构建体
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<220>
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<400> 59
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660 665 670
Val Pro Asn Phe Gly Asp Ile Thr Thr Val Thr Phe Pro Val Thr Pro
675 680 685
Asn Thr Leu Pro Asn Tyr Gln Ser Ser Ser Ser Thr Ser Ala Leu Ser
690 695 700
Asn Gly Phe Tyr His Phe Gly Ser Thr Ser Ser Ser Pro Pro Ile Ser
705 710 715 720
Pro Ala Ser Ser Asp Leu Ser Val Ala Gly Ser Leu Pro Asp Thr Phe
725 730 735
Asn Asp Ala Ser Pro Ser Phe Gly Leu His Pro Ser Pro Val His Val
740 745 750
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755 760 765
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Asn Cys Ser Glu Lys Lys Pro Leu Pro Phe Leu Ala Ala Ser Ile Lys
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<213> 智人
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<213> 智人
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<213> 智人
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<400> 90
acaggaacac tggacttggt gtcagatggg atgagccctg gctctgtttc ctagcagcaa 60
tctgatcttg agctagtcac tgg 83
<210> 91
<211> 76
<212> DNA
<213> 智人
<400> 91
gggagcactg gactaggagt cagaaggtgg agttctgggt gctgttttcc cactcttggg 60
ccctgggcat gttctg 76
<210> 92
<211> 102
<212> DNA
<213> 智人
<400> 92
ggtcctctga ctctcttcgg tgacgggtat tcttgggtgg ataatacgga ttacgttgtt 60
attgcttaag aatacgcgta gtcgaggaga gtaccagcgg ca 102
<210> 93
<211> 118
<212> DNA
<213> 智人
<400> 93
gcaggtgaac tggcaggcca ggaagaggag gaagccctgg aggggctgga ggtgatggat 60
gttttcctcc ggttctcagg gctccacctc tttcgggccg tagagccagg gctggtgc 118
<210> 94
<211> 68
<212> DNA
<213> 智人
<400> 94
ctccggtgcc tactgagctg atatcagttc tcattttaca cactggctca gttcagcagg 60
aacaggag 68
<210> 95
<211> 110
<212> DNA
<213> 智人
<400> 95
gagctgcttg cctccccccg tttttggcaa tggtagaact cacactggtg aggtaacagg 60
atccggtggt tctagacttg ccaactatgg ggcgaggact cagccggcac 110
<210> 96
<211> 68
<212> DNA
<213> 智人
<400> 96
cctctacttt aacatggagg cacttgctgt gacatgacaa aaataagtgc ttccatgttt 60
gagtgtgg 68
<210> 97
<211> 78
<212> DNA
<213> 智人
<400> 97
tggccgattt tggcactagc acatttttgc ttgtgtctct ccgctctgag caatcatgtg 60
cagtgccaat atgggaaa 78
<210> 98
<211> 72
<212> DNA
<213> 智人
<400> 98
agatactgta aacatcctac actctcagct gtggaaagta agaaagctgg gagaaggctg 60
tttactcttt ct 72
<210> 99
<211> 73
<212> DNA
<213> 智人
<400> 99
cctggcactg agaactgaat tccataggct gtgagctcta gcaatgccct gtggactcag 60
ttctggtgcc cgg 73
<210> 100
<211> 22
<212> DNA
<213> 智人
<400> 100
tttggtcccc ttcaaccagc tg 22
<210> 101
<211> 22
<212> DNA
<213> 智人
<400> 101
tttggtcccc ttcaaccagc tg 22
<210> 102
<211> 22
<212> DNA
<213> 智人
<400> 102
tttggtcccc ttcaaccagc ta 22
<210> 103
<211> 23
<212> DNA
<213> 智人
<400> 103
tgtgcaaatc catgcaaaac tga 23
<210> 104
<211> 23
<212> DNA
<213> 智人
<400> 104
tgtgcaaatc catgcaaaac tga 23
<210> 105
<211> 20
<212> DNA
<213> 智人
<400> 105
cctctgggcc cttcctccag 20
<210> 106
<211> 22
<212> DNA
<213> 智人
<400> 106
tggaatgtaa agaagtatgt at 22
<210> 107
<211> 22
<212> DNA
<213> 智人
<400> 107
tggaatgtaa agaagtatgt at 22
<210> 108
<211> 22
<212> DNA
<213> 智人
<400> 108
ttcattcggc tgtccagatg ta 22
<210> 109
<211> 22
<212> DNA
<213> 智人
<400> 109
tattgcactt gtcccggcct gt 22
<210> 110
<211> 23
<212> DNA
<213> 智人
<400> 110
taaagtgctt atagtgcagg tag 23
<210> 111
<211> 23
<212> DNA
<213> 智人
<400> 111
caaagtgctc atagtgcagg tag 23
<210> 112
<211> 22
<212> DNA
<213> 智人
<400> 112
taacactgtc tggtaaagat gg 22
<210> 113
<211> 24
<212> DNA
<213> 智人
<400> 113
ttaatgctaa tcgtgatagg ggtt 24
<210> 114
<211> 23
<212> DNA
<213> 智人
<400> 114
caaagtgctt acagtgcagg tag 23
<210> 115
<211> 22
<212> DNA
<213> 智人
<400> 115
tgaggtagta ggttgtatgg tt 22
<210> 116
<211> 22
<212> DNA
<213> 智人
<400> 116
ttcctatgca tatacttctt tg 22
<210> 117
<211> 22
<212> DNA
<213> 智人
<400> 117
taacactgtc tggtaacgat gt 22
<210> 118
<211> 22
<212> DNA
<213> 智人
<400> 118
tggaatgtaa ggaagtgtgt gg 22
<210> 119
<211> 22
<212> DNA
<213> 智人
<400> 119
tgattggtac gtctgtgggt ag 22
<210> 120
<211> 22
<212> DNA
<213> 智人
<400> 120
tgattggtac gtctgtgggt ag 22
<210> 121
<211> 22
<212> DNA
<213> 智人
<400> 121
taaggcacgc ggtgaatgcc aa 22
<210> 122
<211> 22
<212> DNA
<213> 智人
<400> 122
taaggcacgc ggtgaatgcc aa 22
<210> 123
<211> 22
<212> DNA
<213> 智人
<400> 123
actggacttg gagtcagaag gc 22
<210> 124
<211> 19
<212> DNA
<213> 智人
<400> 124
actggacttg gagtcagga 19
<210> 125
<211> 21
<212> DNA
<213> 智人
<400> 125
actggacttg gtgtcagatg g 21
<210> 126
<211> 21
<212> DNA
<213> 智人
<400> 126
actggactag gagtcagaag g 21
<210> 127
<211> 23
<212> DNA
<213> 智人
<400> 127
ttattgctta agaatacgcg tag 23
<210> 128
<211> 23
<212> DNA
<213> 智人
<400> 128
aggaagccct ggaggggctg gag 23
<210> 129
<211> 22
<212> DNA
<213> 智人
<400> 129
tggctcagtt cagcaggaac ag 22
<210> 130
<211> 24
<212> DNA
<213> 智人
<400> 130
tttggcaatg gtagaactca cact 24
<210> 131
<211> 23
<212> DNA
<213> 智人
<400> 131
taagtgcttc catgtttgag tgt 23
<210> 132
<211> 23
<212> DNA
<213> 智人
<400> 132
tttggcacta gcacattttt gct 23
<210> 133
<211> 23
<212> DNA
<213> 智人
<400> 133
tgtaaacatc ctacactctc agc 23
<210> 134
<211> 23
<212> DNA
<213> 智人
<400> 134
tgagaactga attccatagg ctg 23
<210> 135
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> miR-208结合位点
<400> 135
acaaaccttt tgttcgtctt at 22
<210> 136
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> miR-208结合位点miR-208_4
<400> 136
aaaatatatg taatcgtctt aa 22
<210> 137
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> miR-208结合位点
<400> 137
tgaaaccttt tgttcgtctt at 22
<210> 138
<211> 97
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 3'UTR
<400> 138
acaaaccttt tgttcgtctt ataaaacaaa ccttttgttc gtcttataaa acaaaccttt 60
tgttcgtctt ataaaacaaa ccttttgttc gtcttat 97
<210> 139
<211> 47
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 3'UTR
<400> 139
acaaaccttt tgttcgtctt ataaaacaaa ccttttgttc gtcttat 47
<210> 140
<211> 94
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 3'UTR
<400> 140
aaaatatatg taatcgtctt aaaaaaaata tatgtaatcg tcttaaaaaa aatatatgta 60
atcgtcttaa aaaaaatata tgtaatcgtc ttaa 94
<210> 141
<211> 22
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> miR-1结合位点miR1-1/1-2
<400> 141
uauguaugaa gaaauguaag gu 22
<210> 142
<211> 22
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> miR-1结合位点miR1_4
<400> 142
auacauacuu cuuuacauuc ca 22
<210> 143
<211> 22
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> miR-1结合位点miR1_4mut
<400> 143
auacauacuu cuuuacagag ca 22
<210> 144
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> miR-1结合位点MymiR1_4
<400> 144
acgaugucau uuaacauucc g 21
<210> 145
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> miR-1结合位点MymiR1_4mut
<400> 145
acgaugucau uuaacagagc g 21
<210> 146
<211> 22
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> miR-1结合位点miR1_1mis2
<400> 146
auacauaguu guuuacauuc ca 22
<210> 147
<211> 22
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> miR-1结合位点miR1_1mis3
<400> 147
auacauaguu gucuacauuc ca 22
<210> 148
<211> 22
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> miR-208结合位点miR-208b
<400> 148
uguuuggaaa acaagcagaa ua 22
<210> 149
<211> 22
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> miR-208结合位点miR208
<400> 149
acaaaccuuu uguucgucuu au 22
<210> 150
<211> 22
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> miR-208结合位点miR208_melt
<400> 150
ugaaaccuuu uguucgucuu au 22
<210> 151
<211> 22
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> miR-208结合位点miR208_meltmut
<400> 151
ugaaaccuuu uguucgugag au 22
<210> 152
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 微RNA结合位点微RNA结合位点miR1_4
<400> 152
atacatactt ctttacattc ca 22
<210> 153
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 微RNA结合位点miR1_4mut
<400> 153
atacatactt ctttacagag ca 22
<210> 154
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 微RNA结合位点MymiR1_4
<400> 154
acgatgtcat ttaacattcc g 21
<210> 155
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 微RNA结合位点MymiR1_4mut
<400> 155
acgatgtcat ttaacagagc g 21
<210> 156
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 微RNA结合位点miR1_1
<400> 156
atacatactt ctttacattc ca 22
<210> 157
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 微RNA结合位点miR1_2
<400> 157
atacatactt ctttacattc ca 22
<210> 158
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 微RNA结合位点miR1_3
<400> 158
atacatactt ctttacattc ca 22
<210> 159
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 微RNA结合位点miR1_1mis2
<400> 159
atacatagtt gtttacattc ca 22
<210> 160
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 微RNA结合位点miR1_1mis3
<400> 160
atacatagtt gtctacattc ca 22
<210> 161
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 微RNA结合位点miR1_1TB4
<400> 161
aatatgcact gtacattcca 20
<210> 162
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 微RNA结合位点208_4mut
<400> 162
acaaaccttt tgttcgtcga at 22
<210> 163
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 微RNA结合位点208_4mut3
<400> 163
tgaaaccttt tgttcgtgag at 22
<210> 164
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 微RNA结合位点208_moMEL1
<400> 164
tgaaagcttt tgttcgtctt at 22
<210> 165
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 微RNA结合位点208_moMEL2
<400> 165
tgatagcttt tgttcgtctt at 22
<210> 166
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 微RNA结合位点208_chim
<400> 166
atacatactt cgttcgtctt at 22

Claims (68)

1.一种载体，其包含多核苷酸，所述多核苷酸包含编码一种或多种转基因的多核苷酸序列和微RNA的微RNA结合位点，其中所述微RNA结合位点可操作地连接到编码所述一种或多种转基因的所述多核苷酸序列，并且其中与心脏成纤维细胞相比，所述微RNA在心肌细胞或心肌细胞祖细胞中表达水平较高。
2.根据权利要求1所述的载体，其中与心脏成纤维细胞相比，所述微RNA结合位点促进心肌细胞或心肌细胞祖细胞中所述一种或多种转基因的表达的特异性抑制。
3.根据权利要求1或权利要求2所述的载体，其中与所述微RNA在心肌细胞中的表达水平和/或所述微RNA在用心肌细胞重编程因子处理超过约7天的心脏成纤维细胞中的表达水平相比，所述微RNA在心脏成纤维细胞中表达水平较低和/或在用所述心肌细胞重编程因子处理约7天或更短时间的心脏成纤维细胞中表达水平较低。
4.根据权利要求1至3中任一项所述的载体，其中所述微RNA是miR-208。
5.根据权利要求1至3中任一项所述的载体，其中所述微RNA是miR-1。
6.根据权利要求1至3中任一项所述的载体，其中所述微RNA是miR-133。
7.根据权利要求4所述的载体，其中所述微RNA是miR-208a。
8.根据权利要求4所述的载体，其中所述微RNA是miR-208b。
9.根据权利要求8所述的载体，其中所述微RNA是miR-208b-3p。
10.根据权利要求9所述的载体，其中所述微RNA结合位点与ACAAACCTTTTGTTCGTCTTAT(SEQ ID NO：135)共享>70％的同一性，并且在包含序列CGTCTTA的下划线的种子区域中没有错配。
11.根据权利要求9所述的载体，其中所述微RNA结合位点是AAAATATATGTAATCGTCTTAA(SEQ ID NO：136)。
12.根据权利要求9所述的载体，其中所述微RNA结合位点是ACAAACCTTTTGTTCGTCTTAT(SEQ ID NO：135)。
13.根据权利要求9所述的载体，其中所述微RNA结合位点是TGAAACCTTTTGTTCGTCTTAT(SEQ ID NO：137)。
14.根据权利要求1至13中任一项所述的载体，其中所述多核苷酸包含至少两个用于所述微RNA的微RNA结合位点。
15.根据权利要求14所述的载体，其中所述多核苷酸包含至少四个用于所述微RNA的微RNA结合位点。
16.根据权利要求14或权利要求15所述的载体，其中所述多核苷酸包含至多六个用于所述微RNA的微RNA结合位点。
17.根据权利要求16所述的载体，其中所述多核苷酸包含四个用于所述微RNA的微RNA结合位点。
18.根据权利要求1至17中任一项所述的载体，其中所述一种或多种转基因包含一种或多种心肌细胞重编程因子。
19.根据权利要求18所述的载体，其中所述一种或多种心肌细胞重编程因子包含MYOCD、ASCL1、GATA4、MEF2C、TBX5、miR-133和MESP1中的两种或更多种。
20.根据权利要求18所述的载体，其中所述一种或多种心肌细胞重编程因子包含MYOCD、ASCL1、GATA4、MEF2C、TBX5、miR-133和MESP1中的三种或更多种。
21.根据权利要求18所述的载体，其中所述一种或多种心肌细胞重编程因子包含MYOCD和ASCL1。
22.根据权利要求21所述的载体，其中所述多核苷酸序列编码MYOCD-2A-ASCL1蛋白。
23.根据权利要求20至22中任一项所述的载体，其中所述MYOCD包含内部缺失。
24.根据权利要求23所述的载体，其中所述多核苷酸以5′至3′的顺序包含启动子、编码MYOCD和ASCL1的序列、所述微RNA结合位点和多腺苷酸化序列。
25.根据权利要求18至24中任一项所述的载体，其中所述多核苷酸包含编码miR-133的序列。
26.根据权利要求24或权利要求25所述的载体，其中所述多核苷酸包含与SEQ ID NO：138、SEQ ID NO：139或SEQ ID NO：140至少95％相同的序列。
27.根据权利要求1至26中任一项所述的载体，其中所述载体是病毒载体。
28.根据权利要求27所述的载体，其中所述病毒载体是腺相关病毒(AAV)载体。
29.一种将心脏成纤维细胞重编程为心肌细胞的方法，其包含：
a)通过用有效量的诱导心脏成纤维细胞重编程为心肌细胞的组合物处理心脏成纤维细胞并测量所述心脏成纤维细胞中一种或多种微RNA的表达来选择在诱导心肌细胞中特异性表达的微RNA，其中所选择的微RNA仅在预定时间之后在所述心脏成纤维细胞中表达；
b)生成包含多核苷酸的载体，所述多核苷酸包含一个或多个用于所述所选择的微RNA的微RNA结合位点，所述所选择的微RNA可操作地连接到编码一种或多种心肌细胞重编程因子的多核苷酸；以及
c)使心脏成纤维细胞与有效量的所述载体接触。
30.根据权利要求29所述的方法，其中所述微RNA结合位点抑制所述一种或多种心肌细胞重编程因子在心肌细胞细胞中的表达。
31.根据权利要求29或权利要求30所述的方法，其中所述微RNA结合位点抑制所述一种或多种心肌细胞重编程因子在骨骼肌细胞中的表达。
32.根据权利要求29至31中任一项所述的方法，其中所述微RNA结合位点抑制所述一种或多种心肌细胞重编程因子在心肌细胞祖细胞中的表达。
33.根据权利要求29至32中任一项所述的方法，其中所述微RNA是miR-208。
34.根据权利要求29至32中任一项所述的方法，其中所述微RNA是miR-1。
35.根据权利要求29至32中任一项所述的方法，其中所述微RNA是miR-133。
36.根据权利要求33所述的方法，其中所述微RNA是miR-208a。
37.根据权利要求33所述的方法，其中所述微RNA是miR-208b。
38.根据权利要求37所述的方法，其中所述微RNA是miR-208b-3p。
39.根据权利要求38所述的方法，其中所述微RNA结合位点与ACAAACCTTTTGTTCGTCTTAT(SEQ ID NO：135)共享>70％的同一性，并且在包含序列CGTCTTA的下划线的种子区域中没有错配。
40.根据权利要求38所述的方法，其中所述微RNA结合位点是AAAATATATGTAATCGTCTTAA(SEQ ID NO：136)。
41.根据权利要求38所述的方法，其中所述微RNA结合位点是ACAAACCTTTTGTTCGTCTTAT(SEQ ID NO：135)。
42.根据权利要求38所述的方法，其中所述微RNA结合位点是TGAAACCTTTTGTTCGTCTTAT(SEQ ID NO：137)。
43.根据权利要求29至42中任一项所述的方法，其中所述多核苷酸包含至少两个用于所述微RNA的微RNA结合位点。
44.根据权利要求43所述的方法，其中所述多核苷酸包含至少四个用于所述微RNA的微RNA结合位点。
45.根据权利要求43所述的方法，其中所述多核苷酸包含至多六个用于所述微RNA的微RNA结合位点。
46.根据权利要求43所述的方法，其中所述多核苷酸包含四个用于所述微RNA的微RNA结合位点。
47.一种将心脏成纤维细胞重编程为心肌细胞细胞的方法，其包含使所述心脏成纤维细胞与有效量的根据权利要求1至28中任一项所述的载体接触。
48.根据权利要求47所述的方法，其中所述方法诱导至少一种心肌细胞表型标记物在所述心脏成纤维细胞中的表达。
49.根据权利要求48所述的方法，其中至少一种心肌细胞表型标记物是ASCL1、MYOCD、CASQ2、NPPA或TNNT2的信使RNA水平。
50.一种在有此需要的受试者中促进心肌细胞形成的方法，其包含将根据权利要求1至28中任一项所述的载体施用于所述受试者。
51.一种在有此需要的受试者中治疗心力衰竭的方法，其包含将根据权利要求1至28中任一项所述的载体施用于所述受试者。
52.一种在有此需要的受试者中治疗心力衰竭的方法，其包含将AAV载体施用于所述受试者，所述AAV载体包含以5′至3′顺序包含启动子、编码MYOCD和ASCL1的序列、微RNA结合位点和多腺苷酸化序列的多核苷酸，其中所述微RNA结合位点是用于miR-1、miR-133、miR-208a、miR-208b和/或miR-208b-3p的微RNA结合位点。
53.根据权利要求52所述的方法，其中所述微RNA结合位点是用于miR-1的微RNA结合位点。
54.根据权利要求52所述的方法，其中所述微RNA结合位点是用于miR-133的微RNA结合位点。
55.根据权利要求52所述的方法，其中所述微RNA结合位点是用于miR-208a的微RNA结合位点。
56.根据权利要求52所述的方法，其中所述微RNA结合位点是用于miR-208b的微RNA结合位点。
57.根据权利要求52所述的方法，其中所述微RNA结合位点是用于miR-208b-3p的微RNA结合位点。
58.根据权利要求52至57中任一项所述的方法，其中所述多核苷酸包含编码miR-133的序列。
59.根据权利要求52至58中任一项所述的方法，其中所述心力衰竭是由心肌梗塞引起的。
60.根据权利要求52至59中任一项所述的方法，其中所述心力衰竭是射血分数降低的心力衰竭(HFrEF)。
61.根据权利要求52至60中任一项所述的方法，其中与施用之前的所述受试者相比，所述方法增加了所述受试者中的射血分数。
62.根据权利要求52至61中任一项所述的方法，其中与未经治疗的对照受试者相比，所述方法增加了所述受试者的射血分数。
63.根据权利要求52至62中任一项所述的方法，其中所述方法将所述受试者中的射血分数增加至至少约28％、29％、30％、31％或32％。
64.根据权利要求61至64中任一项所述的方法，其中在预定时间之后，任选地在施用所述AAV载体之后八周评估射血分数。
65.根据权利要求52至64中任一项所述的方法，其中与施用之前的所述受试者相比，所述方法减少了所述受试者中的疤痕组织形成。
66.根据权利要求52至65中任一项所述的方法，其中与未经治疗的对照受试者相比，所述方法减少了所述受试者中的疤痕组织形成。
67.根据权利要求65或权利要求66中任一项所述的方法，其中所述方法将所述受试者中的疤痕组织形成减少至至多约10％、11％、12％、13％、14％、15％、16％、17％、18％、19％或20％。
68.根据权利要求65至67中任一项所述的方法，其中在预定时间之后，任选地在施用所述AAV载体之后八周评估疤痕组织形成。
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