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CN115436502B - 一种基于lc-ms/ms技术检测血浆中叶酸及其衍生物浓度的方法 - Google Patents

一种基于lc-ms/ms技术检测血浆中叶酸及其衍生物浓度的方法 Download PDF

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CN115436502B CN202210923639.1A CN202210923639A CN115436502B CN 115436502 B CN115436502 B CN 115436502B CN 202210923639 A CN202210923639 A CN 202210923639A CN 115436502 B CN115436502 B CN 115436502B
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Abstract

本发明公开了一种基于LC‑MS/MS技术检测血浆中叶酸及其衍生物浓度的方法，包括：将叶酸、二氢叶酸、四氢叶酸和5‑甲基四氢叶酸配制混合标准溶液，将混合标准溶液加入到空白血浆中并加入稳定剂，再加入内标工作溶液，涡旋，离心，取上清液与稳定剂混合，进行LC‑MS/MS检测，以待测物与内标峰面积的比值对其浓度做线性回归，得到标准曲线；取待测血浆，加入甲醇，再加入内标工作溶液和稳定剂，涡旋、离心，取上清液与稳定剂混合，进行LC‑MS/MS检测，记录待测物与内标物对应的峰面积，计算峰浓度比，代入标准曲线，得到待测物的浓度。本发明解决了生物样品中叶酸类成分在分析中不稳定的问题，提高了准确性和可靠性。

Description

一种基于LC-MS/MS技术检测血浆中叶酸及其衍生物浓度的 方法
技术领域
本发明涉及一种基于LC-MS/MS(液相色谱-质谱联用)技术检测血浆中不同形式叶酸浓度的方法，具体涉及一种基于LC-MS/MS技术同时测定血浆中叶酸、二氢叶酸、四氢叶酸、5-甲基四氢叶酸浓度的方法。
背景技术
叶酸(也称为维生素B9，Folic acid，FA)是一种水溶性维生素，对于DNA的合成、RNA的转录、从同型半胱氨酸合成蛋氨酸以及参与细胞代谢的各种其他化学反应至关重要。尤其是叶酸对于细胞频繁分裂和生长的时期很重要，在怀孕、哺乳和婴儿期摄入足够的叶酸对于母婴健康和正常生长至关重要。人类无法合成叶酸，并依赖补充来维持其正常水平。叶酸进入机体后，可在二氢叶酸还原酶的作用下转变为二氢叶酸(Dihydrofolic acid，DHFA)，进而转化为四氢叶酸(Tetrahydrofolic acid，THFA)；在丝氨酸羟甲基转移酶的作用下，四氢叶酸可活化为5,10-亚甲基四氢叶酸(5,10-methylenetetrahydrofolic acid，METHF)，该反应是可逆的；在亚甲基四氢叶酸还原酶的作用下，5,10-亚甲基四氢叶酸转化为5-甲基四氢叶酸(5-Methyltetrahydrofolic acid，MTHF)。因此，叶酸是上述化学结构相似的一类化合物的统称。不同形式的叶酸具有各自独特的生物学功能，无论是在临床评估病人的叶酸的状态，还是科研，最好测定不同形式的叶酸化合物，但由于复杂的样品制备过程和还原性叶酸的不稳定性限制了叶酸测定的使用。
液相色谱串联质谱(LC-MS/MS)作为一种高阶的分析方法应用于叶酸的分析，可以比一般的微生物测定或免疫蛋白法更深入地研究不同的叶酸形式。然而准确测量一系列代谢产物依然存在较大的困难，首先叶酸非常不稳定，容易在样品制备过程中损失，此外不同叶酸代谢物之间也可以转化，难以确定测得浓度，与处理前样品中相应叶酸形式的浓度及比例是否一致。
叶酸是一种人工合成的化合物，与其他形式的叶酸化合物不同，它不存在于自然界，具有很好的稳定性，但需要在机体中被最终还原为6S-5-甲基四氢叶酸被细胞吸收和代谢。自然界中的叶酸是一种两性的不稳定化合物，它们会随着pH值得变化而发生离子形式的变化，特别是四氢叶酸、二氢叶酸、5,10-亚甲基四氢叶酸、5-甲基四氢叶酸都会对pH值极为敏感。由于叶酸可能在分析过程中转化或降解，因此大多数的LC-MS/MS方法侧重于测量更稳定的某些亚型的叶酸。
Nelson等人利用液相色谱串联质谱，首次同时测量血清中的同型半胱氨酸、5-甲基四氢叶酸及叶酸水平。Nandania等人首次描述测量了在生物样品中不同形式的叶酸的测量方法。然而上述方法制备分析样品费时费力，相关的叶酸化合物是叶酸、5-甲基四氢叶酸、四氢叶酸、二氢叶酸、5,10-亚甲基四氢叶酸，上述化合物不稳定和相互转化，冗长的制备过程使得样品制备后的上述成分损失或转化从而影响最终结果的准确。
发明内容
基于上述技术方案的缺陷，本发明的目的在于提供一种准确度高、样品制备和测量所需时间短，能够高通量检测血浆中5-甲基四氢叶酸、四氢叶酸、二氢叶酸、叶酸的LC-MS/MS的检测方法。
为了实现上述目的，本发明提供如下技术方案：
一种基于LC-MS/MS技术检测血浆中叶酸及其衍生物浓度的方法，该方法同时测定血浆中叶酸、二氢叶酸、四氢叶酸、5-甲基四氢叶酸的浓度，包括：
步骤(1)、标准曲线的制备：将叶酸、二氢叶酸、四氢叶酸和5-甲基四氢叶酸配制成不同浓度的混合标准溶液，将混合标准溶液加入到空白血浆中并加入稳定剂，混匀，再加入内标工作溶液，涡旋，离心，取上清液与稳定剂混合，即为标准曲线样品溶液，进样LC-MS/MS系统，按照液相色谱-质谱联用检测条件进行LC-MS/MS检测，记录待测物对应峰面积，以待测物与内标峰面积的比值对其浓度做线性回归，得到相应的标准曲线；
步骤(2)、待测血浆中叶酸、二氢叶酸、四氢叶酸、5-甲基四氢叶酸的测定：取待测血浆，加入甲醇，再加入内标工作溶液和稳定剂，涡旋、离心，取上清液与稳定剂混合；进样LC-MS/MS系统，按照液相色谱-质谱联用检测条件进行LC-MS/MS检测，记录待测物与内标物对应的峰面积，计算峰浓度比，代入标准曲线，计算得到待测物的浓度；
其中，液相色谱-质谱联用检测条件：
液相色谱条件：C18反相色谱柱；流动相A：0.1％甲酸水溶液，流动相B：0.1％甲酸甲醇溶液；洗脱方式：以等度梯度开始洗脱，以95％-98％流动相A洗脱不小于0.5min，然后在不大于1min内提升流动相B比例至100％，100％流动相B持续洗脱不小于3min，再将流动相比例调整为初始梯度；流速：0.400～0.600mL/min；
质谱条件：采用ESI源，负离子MRM模式检测。
所述的稳定剂为二硫苏糖醇(DTT)和抗坏血酸(维生素C，Vc)的混合水溶液，所述的稳定剂中二硫苏糖醇与抗坏血酸浓度均不小于5mg/mL。所述的稳定剂的配制为：分别取适量二硫苏糖醇和适量抗坏血酸，以适量水溶解，配制成混合水溶液作为稳定剂。
所述的内标工作溶液是以苯妥英钠或同位素标记物C13-5-甲基四氢叶酸为内标物，并添加二硫苏糖醇、抗坏血酸，采用甲醇配制的内标溶液。所述的内标工作溶液中，内标物的浓度为60～80μg/mL、二硫苏糖醇的浓度为1mg/mL、抗坏血酸的浓度为1mg/mL。
优选的，所述的液相色谱条件：Agilent Zorbax XDB C18色谱柱，规格50mm×2.1mm,3.5μm；柱温：室温；流动相A：0.1％甲酸水溶液；流动相B：0.1％甲酸甲醇溶液；洗脱方式：以98％流动相A洗脱0.5min，然后再在0.5min内将流动相B比例提升至100％，按100％流动相B洗脱3min，0.1min内将流动相比例调整为初始梯度并持续平衡色谱柱，整个检测时间为5min；流速：0.400mL/min；进样量：5μL。
进一步优选的，所述的洗脱方式：0.00-0.50min，2％流动相B；0.50-1.00min，2％-100％流动相B；1.00-4.00min，100％流动相B；4.00-4.01min，100％-2％流动相B；4.01-5.00min，2％流动相B。
优选的，所述的质谱条件：ESI离子化源，负离子扫描的MRM检测模式，气帘气和雾化气均使用氮气，设定值分别为20和10psi；负离子模式下的源喷射电压(IonSprayVoltage)设定为-4500V，叶酸的离子对：m/z为440→311，碰撞能量(CE)为-27eV；二氢叶酸的离子对：m/z为442→176，碰撞能量(CE)为-33eV；四氢叶酸的离子对：m/z为458→286，碰撞能量(CE)为-33eV；5-甲基四氢叶酸的离子对：m/z为458→329，碰撞能量(CE)为-36eV。
步骤(1)中，所述的混合标准溶液的配制：取叶酸、二氢叶酸、四氢叶酸、5-甲基四氢叶酸对照品，以适量DMSO溶解，分别配成浓度为1.00mg/ml的叶酸对照品储备液、浓度为1.00mg/ml的二氢叶酸对照品储备液、浓度为1.00mg/ml的四氢叶酸对照品储备液、浓度为1.00mg/ml的5-甲基四氢叶酸对照品储备液；取上述4种对照品储备液，混合，采用甲醇进行系列稀释，配制成不同浓度的混合标准溶液。
所述的标准曲线样品溶液中二硫苏糖醇和抗坏血酸的浓度不小于0.9mg/mL。
优选的，标准曲线样品溶液的制备方法：取50μL空白血浆，加入5μL混合标准工作溶液，涡旋5～10s，再加入5μL稳定剂，涡旋10s，加入300μL内标工作溶液，涡旋不小于1min，12000rpm离心不少于10min，取上清液，将20μL上清液与80μL稳定剂混匀，使得标准曲线样品溶液中二硫苏糖醇和抗坏血酸的浓度不小于0.9mg/mL。
更优选的，用于制备标准曲线的样品溶液的制备方法：取50μL空白血浆，加入5μL混合标准工作溶液，涡旋5～10s，再加入5μL二硫苏糖醇和抗坏血酸的浓度均为5mg/mL的稳定剂，涡旋10s，加入300μL内标物的浓度为60～80μg/mL、二硫苏糖醇和抗坏血酸的浓度均为1mg/mL的内标工作溶液，涡旋不小于1min，12000rpm离心不少于10min，取上清液，将20μL上清液与80μL二硫苏糖醇和抗坏血酸的浓度均为1mg/mL的稳定剂混匀。
步骤(2)中，优选的，上清液中二硫苏糖醇与抗坏血酸的浓度均不小于0.9mg/mL，上清液中内标物的浓度5～20μg/mL。
优选的，取50μL待测血浆，加入5μL甲醇，涡旋5～10s，再加入5μL二硫苏糖醇和抗坏血酸的浓度均为5mg/mL的稳定剂，涡旋10s，再加入300μL内标物的浓度为60～80μg/mL、二硫苏糖醇和抗坏血酸的浓度均为1mg/mL的内标工作溶液，涡旋不小于1min，12000rpm离心不少于10min，取20μL上清液，与80μL稳定剂混匀，使得样品溶液中二硫苏糖醇和抗坏血酸的浓度不小于0.9mg/mL。
本发明所述的空白血浆是指未引入外源性叶酸的血浆。所述的待测血浆样本是指未引入外源性叶酸或引入外源性叶酸的血浆。
本发明所述的空白血浆或者待测血浆为：取血后，2℃～6℃离心得到的血浆，在不高于-20℃下保存。
本发明的另一个目的是提供本发明所述的方法在测定血浆中叶酸及其衍生物浓度的应用。
与现有技术相比，本发明的有益效果：
色谱分离时间越短，对于LC-MS/MS的检测准确性越有利，而流动相对于样品稳定性的影响也重要，发明人评估了样品处理中叶酸的稳定性，确定了最佳的方法条件。为了最大限度减少血浆中基质化合物的存在并确保方法的选择性，发明人并未选择样品通过固相萃取(SPE)来纯化，而是选择有机溶剂进行蛋白质沉淀，并最大程度简化了沉淀过程。发明人发现二氢叶酸的离子通道下，有关杂质会严重干扰二氢叶酸的含量，通过优化色谱洗脱条件，使得在5min的总检测时间内，内源性物质与目标化合物具有一定的分离度。
本发明解决了生物样品中叶酸类成分在分析过程中不稳定的问题，提高了分析方法的准确性和可靠性；与现有技术相比，样品消耗量少，灵敏度高，检测通量高，极大的的提高了结果的准确度高，能够真实的反应样品中不同叶酸代谢物的真实情况。
附图说明
图1为叶酸(FA)的MS2产物离子光谱。
图2为二氢叶酸(DHFA)的MS2产物离子光谱。
图3为四氢叶酸(THFA)的MS2产物离子光谱。
图4为5-甲基四氢叶酸(5-MTHF)的MS2产物离子光谱。
图5为小鼠空白血浆中叶酸(FA)、二氢叶酸(DHFA)、四氢叶酸(THFA)、5-甲基四氢叶酸(5-MTHF)、苯妥英钠(IS)的典型色谱图；其中，图5A为小鼠空白血浆中叶酸的典型色谱图，图5B为小鼠空白血浆中二氢叶酸的典型色谱图，图5C为小鼠空白血浆中四氢叶酸的典型色谱图，图5D为小鼠空白血浆中5-甲基四氢叶酸的典型色谱图，图5E为小鼠空白血浆中苯妥英钠的典型色谱图。
图6为添加对照品后小鼠血浆中叶酸(FA)、二氢叶酸(DHFA)、四氢叶酸(THFA)、5-甲基四氢叶酸(5-MTHF)、苯妥英钠(IS)的典型色谱图；其中，图6A为添加对照品后小鼠血浆中叶酸典型色谱图，图6B为添加对照品后小鼠血浆中二氢叶酸典型色谱图，图6C为添加对照品后小鼠血浆中四氢叶酸典型色谱图，图6D为添加对照品后小鼠血浆中5-甲基四氢叶酸典型色谱图，图6E为添加对照品后小鼠血浆中苯妥英钠典型色谱图。
图7为小鼠口服叶酸后的叶酸(FA)、二氢叶酸(DHFA)和5-甲基四氢叶酸(5-MTHF)的血浆浓度-时间曲线(n＝8)。
具体实施方式
本发明实施例的详细描述并非旨在限制要求保护的本发明技术方案的范围，基于本发明实施例，本领域技术人员在没有做出创造性劳动的前提下所获得的实施方案，应属于本发明保护的范围。
仪器和试剂
美国应用生物系统公司液相质谱联用系统API 6500Qtrap(含Agilent 1290液相色谱仪，ESI和APCI接口离子源，Analyst Software 1.6.3色谱工作站)；IKA Vortex2型涡旋振荡器(艾卡(广州)仪器设备有限公司)，3K15型低温高速离心机(Sigma，美国)，KQ-500E型超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司)，DV215CD型电子天平(奥豪斯仪器(上海)有限公司)，CP224C型电子天平(奥豪斯仪器(上海)有限公司)。
对照品信息见表1；选用的负离子内标为苯妥英钠(批号BNV229，纯度99.97％，购于上海毕得医药科技有限公司)；二硫苏糖醇(DTT，纯度99.0％，批号C12084305，购于上海麦克林生化科技有限公司)；抗坏血酸(维生素C，Vc，纯度99.0％，批号M19518023，购于上海麦克林生化科技有限公司)；色谱纯乙腈(购于Fisher公司)；色谱纯甲醇(MeOH，购于Fisher公司)；甲酸(HCOOH，购于Sigma公司)；乙酸(购于Sigma公司)；纯净水(购于杭州娃哈哈有限公司)。
实施例1
根据预实验的稳定性结果，DTT以及抗坏血酸联合使用作为稳定剂，能够更有效降低四氢叶酸降解生成的甲醛。DTT可以消除溶剂中可能出现的甲醛，而游离甲醛会导致四氢叶酸转为5,10-亚甲基四氢叶酸。
对照品储备液的配制：取二氢叶酸、四氢叶酸、5-甲基四氢叶酸对照品适量，精密称定，溶于DMSO中，分别配制成浓度为1.00mg/mL的二氢叶酸对照品储备液、浓度为1.00mg/mL的四氢叶酸对照品储备液、浓度为1.00mg/mL的5-甲基四氢叶酸对照品储备液。
稳定剂的配制：取DTT和Vc对照品适量，精密称定，以适量水溶解，配制成DTT浓度为1.00mg/mL、Vc浓度为1.00mg/mL的混合水溶液。
流动相的配制：流动相的酸性pH值可能会影响叶酸的稳定性，因此配制流动相A＇(水和甲酸的体积比＝100:0.1)、流动相B＇(水和乙酸的体积比＝100:0.1)、流动相C(甲醇和甲酸的体积比＝100:0.1)、流动相D(甲醇和乙酸的体积比＝100:0.1)、流动相E(乙腈和甲酸的体积比＝100:0.1)、流动相F(乙腈和乙酸的体积比＝100:0.1)。
取各对照品储备液5μL，加入80μL稳定剂，分别溶于1.5mL流动相中，置于室温(25℃)封闭保存，在0min、60min通过HPLC-MS/MS技术测量含有不稳定的叶酸流动相溶液。
色谱条件，RP-C18色谱柱(100×4.6mm，5μm)，流动相A(0.1％甲酸水溶液)和流动相B(0.1％甲酸乙腈溶液)，洗脱条件为0.00-1.00min(1-10％流动相B)、1.00-3.00min(10％-22％流动相B)、3.00-5.00min(22-28％流动相B)、5.00-6.00min(28％-100％流动相B)、5.50-8.00min(100％流动相B)、8.00-12.00(1％流动相B)，流速：0.4mL/min；进样量10μL。
结果如表2，表明，乙腈与甲醇体系对还原性叶酸的稳定性影响相差不大，四氢叶酸在水-甲酸体系下稳定性略比水-乙酸好，因此色谱流动相体系中的酸优选甲酸。
实施例2样品处理后色谱条件
血清中叶酸存在各种复杂的成分，为了最大限度减少血清中的其他基质化合物的存在以确保方法的选择性，在LC-MS/MS分析之前需要对血清样品进行纯化。目前，一般使用固相萃取柱(SPE)对血清样品进行纯化，乙腈或甲醇和缓冲液作为洗脱剂，得到纯化的血清样品用于LC-MS/MS分析。另一种处理方法是使用有机溶剂(如甲醇或乙腈)进行蛋白质沉淀，然后使用氮气干燥并在流动相中复溶。
由于叶酸不稳定，上述样品处理方法均会增加放置时间，从而导致叶酸损失。因此，本发明采用有机溶剂沉淀法，但不进行干燥复溶，最大程度缩短样品处理时间。为了减少血浆内源性物质对目标成分的干扰，对空白血浆以及含有目标对照品的血浆溶液进行测定，并调整流动相的比例。
血浆采集
小鼠禁食12h，可自由饮水。经眼眶取血约300μL，置于预先装有20μL浓度为250U/mL的肝素钠溶液并烘干的EP管中，立即置于冰上，血样在5000rpm、4℃条件下离心10min，取上清液，即为空白血浆，将其转移至1.5mL离心管中，置于-20℃冰箱保存。
溶液配制
取FA、DHFA、THFA、MTHF对照品适量，精密称定，分别置于1.5mLEP管中，以适量DMSO溶解，分别配制成浓度为1.00mg/mL的叶酸对照品储备液、浓度为1.00mg/mL的二氢叶酸对照品储备液、浓度为1.00mg/mL的四氢叶酸对照品储备液、浓度为1.00mg/mL的5-甲基四氢叶酸对照品储备液。分别取上述对照品储备液适量，混合，加甲醇进行系列稀释，配制成不同浓度的系列混合标准溶液。
取DTT和Vc对照品适量，精密称定，分别以适量水溶解，配制成浓度为10.0mg/mL的DTT标准储备液、浓度为10.0mg/mL的Vc标准储备液。分别精密量取DTT标准储备液和Vc标准储备液适量，混合，加水稀释至DTT和Vc浓度均为1.00mg/mL的混合水溶液(稳定剂C)，和DTT和Vc浓度均为5.00mg/mL的混合水溶液(稳定剂B)。
取苯妥英钠对照品适量，精密称定，以适量DMSO溶解，配制成浓度为1.00mg/mL的笨妥英钠标准储备液。精密量取苯妥英钠标准储备液适量，并加入DTT标准储备液、Vc标准储备液，加甲醇稀释至苯妥因钠浓度为80μg/mL、DTT和Vc浓度均为1mg/mL的苯妥英钠甲醇溶液，即为内标工作溶液。
样品的处理
空白血浆的处理：取50μL小鼠空白血浆，涡旋10s，再加入300μL苯妥因钠浓度为80μg/mL的苯妥英钠甲醇溶液，涡旋1min，经12000rpm离心10min，取上清液20μL，将其与80μL稳定剂C(DTT和Vc混合水溶液，DTT和Vc浓度均为1mg/mL)混匀，取5μL进行LC-MS/MS定量分析。
含目标化合物的血浆的处理：取50μL小鼠空白血浆，加入5μL各浓度的混合标准溶液，涡旋10s，再加入5μL稳定剂B(DTT和Vc混合水溶液，DTT和Vc浓度均为5mg/mL)，涡旋10s，再加入300μL苯妥英甲醇溶液(苯妥因钠浓度为80μg/mL，DTT和Vc浓度均为1mg/mL)，涡旋1min，经12000rpm离心10min，取上清液20μL，将其与80μL稳定剂C(DTT和Vc混合水溶液，DTT和Vc浓度均为1mg/mL)混匀，即得标准曲线样品溶液，取5μL进行LC-MS/MS定量分析。
MS检测条件
采用ESI离子化源，负离子扫描的MRM检测模式，气帘气(Curtain Gas)和雾化气(Ion Source Gas 1)均使用氮气，其设定值分别为20和10psi。负离子模式下的源喷射电压(IonSpray Voltage)设定为-4500V，MRM模式下每个通道的滞留时间设定为50ms。具体质谱检测条件参见表3。各个分析物MS图见图1-图4。
色谱条件摸索
色谱柱采用Agilent Zorbax XDB C18色谱柱(50mm×2.1mm，3.5μm)，流动相A为0.1％甲酸-水，流动相B为0.1％甲酸-甲醇，按照初始梯度98％流动相A到20％流动相A进行梯度洗脱，考察上述目标化合物与血浆内源性物质的是否相互影响。由于处理方法简化为甲醇沉淀、取上清液，而未蒸干复溶，减少了叶酸的分解但样品中存在的干扰物质也增加。结果表明血浆中内源性物质主要会干扰DHFA，通过调整色谱流动相洗脱，将内源性干扰成分与DHFA等目标成分分开。
色谱条件选择95％-98％的流动相A洗脱0.5-1min可以将干扰DHFA的大部分杂质优选洗脱出来。优化色谱洗脱时间，确定优化的色谱条件：Agilent Zorbax XDB C18色谱柱(50mm×2.1mm，3.5μm)，流动相A为0.1％甲酸-水，流动相B为0.1％甲酸-甲醇，洗脱条件为0.00-0.50min(2％流动相B)、0.50-1.00min(2％-100％流动相B)、1.00-4.00min(100％流动相B)、4.00-4.01min(100％-2％流动相B)、4.01-5.00min(2％流动相B)，流速：0.4mL/min；进样量5μL；柱温：室温。
在优化的色谱条件下，空白血浆的色谱图见图5，不同目标化合物的色谱图见图6。如图所示，血浆中的内源性物质不干扰4种叶酸的含量测定，并且4种成分和内标苯妥英钠彼此之间互不干扰。
取系列混合标准溶液，按本实施例项下“含目标化合物的血浆的处理”处理后，按照优化的色谱条件进样测定。分别以每种成分与相应内标峰面积的比值对其浓度作线性回归，权重因子为1/x2，得到相应的标准曲线。4种成分的标准曲线、线性范围见表4。
在该方法下，样品的准确度与精确度良好(见表5)，基质效应(Matrix effect)与回收率(Recovery)也符合要求(见表6)。
实施例3叶酸在小鼠体内的代谢研究
LC-MS/MS检测条件
采用ESI离子化源，负离子扫描的MRM检测模式，气帘气(Curtain Gas)和雾化气(Ion Source Gas 1)均使用氮气，其设定值分别为20和10psi。负离子模式下的源喷射电压(IonSpray Voltage)设定为-4500V，MRM模式下每个通道的滞留时间设定为50ms。具体质谱检测条件参见表3。
色谱条件：Agilent Zorbax XDB C18色谱柱(50mm×2.1mm，3.5μm)，流动相A为0.1％甲酸-水，流动相B为0.1％甲酸-甲醇，洗脱条件：0.00-0.50min(2％流动相B)、0.50-1.00min(2％-100％流动相B)、1.00-4.00min(100％流动相B)、4.00-4.01min(100％-2％流动相B)、4.01-5.00min(2％流动相B)，流速：0.4mL/min；进样量5μL。柱温：室温。
ICR雄性小鼠80只，体重18-22g，周龄6-8周，设计10个时间点(给药前(0min)，给药后0.25h、0.5h、1、2h、4h、6h、8h、12h、24h)，每个时间点8只。给药前，动物在标准环境下适应2天，试验当天，取叶酸(FA)适量，加水配制成浓度0.212mg/mL的溶液，给药体积为10mL/kg，灌胃给药。
血浆样品的采集
小鼠于给药前禁食12h，可自由饮水。小鼠灌胃给药前(0min)，给药后0.25h、0.5h、1、2h、4h、6h和8h经眼眶取血约300μL，置于预先装有20μL浓度为250U/mL的肝素钠溶液并烘干的EP管中，立即置于冰上，血样在5000rpm、4℃条件下离心10min，取上清液，即为血浆，将其转移至1.5mL离心管中，置于-20℃冰箱保存。
溶液的配制
取FA、DHFA、THFA、MTHF对照品适量，精密称定，分别置于1.5mLEP管中，以适量DMSO溶解，分别配制成浓度为1.00mg/mL的叶酸对照品储备液、浓度为1.00mg/mL的二氢叶酸对照品储备液、浓度为1.00mg/mL的四氢叶酸对照品储备液、浓度为1.00mg/mL的5-甲基四氢叶酸对照品储备液。分别取上述对照品储备液适量，混合，加甲醇进行系列稀释，配制成不同浓度的系列混合标准溶液。
取DTT和Vc对照品适量，精密称定，分别以适量水溶解，配制成浓度为10.0mg/mL的DTT标准储备液、浓度为10.0mg/mL的Vc标准储备液。分别精密量取DTT标准储备液和Vc标准储备液适量，混合，加水稀释至DTT和Vc浓度均为1.00mg/mL的混合水溶液(稳定剂C)，和DTT和Vc浓度均为5.00mg/mL的混合水溶液(稳定剂B)。
取苯妥英钠对照品适量，精密称定，以适量DMSO溶解，配制成浓度为1.00mg/mL的笨妥英钠标准储备液。精密量取苯妥英钠标准储备液适量，并加入DTT标准储备液、Vc标准储备液，加甲醇稀释至苯妥因钠浓度为80μg/mL、DTT和Vc浓度均为1mg/mL的苯妥英钠甲醇溶液。
样品的处理和测定
不同时间点的血浆样品，按照以下方法处理：
取50μL小鼠空白血浆(0min取样的血浆)，加入5μL各浓度的混合标准溶液，涡旋10s，再加入5μL稳定剂B(DTT和Vc混合水溶液，DTT和Vc浓度均为5mg/mL)，涡旋10s，再加入300μL苯妥英钠浓度为80μg/mL的苯妥英钠甲醇溶液(同时含DTT和Vc，DTT和Vc浓度均为1mg/mL)，涡旋1min，经12000rpm离心10min，取上清液20μL，与80μL稳定剂C(DTT和Vc混合水溶液，DTT和Vc浓度均为1mg/mL)混匀，即得标准曲线样品溶液，取5μL进样，进行LC-MS/MS定量分析。分别以每种成分与相应内标峰面积的比值对其浓度作线性回归，得到4种化合物相应的标准曲线。
取50μL小鼠血浆(给药后0.25h、0.5h、1、2h、4h、6h、8h、12h和24h取样的血浆)，加入5μL甲醇，涡旋10s，再加入5μL稳定剂B(DTT和Vc混合水溶液，DTT和Vc浓度均为5mg/mL)，涡旋10s，再加入300μL苯妥英钠浓度为80μg/mL的苯妥英钠甲醇溶液(同时含DTT和Vc，DTT和Vc浓度均为1mg/mL)，涡旋1min，经12000rpm离心10min，取上清液20μL，与80μL稳定剂C(DTT和Vc混合水溶液，DTT和Vc浓度均为1mg/mL)混匀，取5μL进样，进行LC-MS/MS定量分析。记录待测物与内标物对应的峰面积，计算待测物峰面积与内标峰面积比值，将待测物峰面积与内标峰面积比值代入标准曲线，计算待测物的相应浓度。
结果见表7、图7，显示：服用叶酸后，叶酸在体内转化为有活性的二氢叶酸和5-甲基四氢叶酸，叶酸在24小时后才完全代谢完毕。

Claims (4)

1.一种基于LC-MS/MS技术检测血浆中叶酸及其衍生物浓度的方法，其特征在于：该方法同时测定血浆中叶酸、二氢叶酸、四氢叶酸、5-甲基四氢叶酸的浓度，包括：
步骤(1)、标准曲线的制备：将叶酸、二氢叶酸、四氢叶酸和5-甲基四氢叶酸配制成不同浓度的混合标准溶液，将混合标准溶液加入到空白血浆中并加入稳定剂，混匀，再加入内标工作溶液，涡旋，离心，取上清液与稳定剂混合，即为标准曲线样品溶液，进样LC-MS/MS系统，按照液相色谱-质谱联用检测条件进行LC-MS/MS检测，记录待测物对应峰面积，以待测物与内标峰面积的比值对其浓度做线性回归，得到相应的标准曲线；
所述的稳定剂为二硫苏糖醇和抗坏血酸的混合水溶液；
步骤(2)、待测血浆中叶酸、二氢叶酸、四氢叶酸、5-甲基四氢叶酸的测定：取50μL待测血浆，加入5μL甲醇，涡旋5～10s，再加入5μL二硫苏糖醇和抗坏血酸的浓度均为5mg/mL的稳定剂，涡旋10s，再加入300μL内标物的浓度为60～80μg/mL、二硫苏糖醇和抗坏血酸的浓度均为1mg/mL的内标工作溶液，涡旋不小于1min，12000rpm离心不少于10min，取20μL上清液，与80μL稳定剂混匀，使得样品溶液中二硫苏糖醇和抗坏血酸的浓度不小于0.9mg/mL；进样LC-MS/MS系统，按照液相色谱-质谱联用检测条件进行LC-MS/MS检测，记录待测物与内标物对应的峰面积，计算峰浓度比，代入标准曲线，计算得到待测物的浓度；
其中，液相色谱-质谱联用检测条件：
液相色谱条件：Agilent Zorbax XDB C18色谱柱，规格50mm×2.1mm,3.5μm；柱温：室温；流动相A：0.1％甲酸水溶液；流动相B：0.1％甲酸甲醇溶液；洗脱方式：0.00-0.50min，2％流动相B；0.50-1.00min，2％-100％流动相B；1.00-4.00min，100％流动相B；4.00-4.01min，100％-2％流动相B；4.01-5.00min，2％流动相B；流速：0.400mL/min；进样量：5μL；
质谱条件：采用ESI源，负离子MRM模式检测；气帘气和雾化气均使用氮气，设定值分别为20和10psi；负离子模式下的源喷射电压设定为-4500V，叶酸的离子对：m/z为440→311，碰撞能量为-27eV；二氢叶酸的离子对：m/z为442→176，碰撞能量为-33eV；四氢叶酸的离子对：m/z为458→286，碰撞能量为-33eV；5-甲基四氢叶酸的离子对：m/z为458→329，碰撞能量为-36eV；
所述的内标工作溶液是以苯妥英钠或同位素标记物C13-5-甲基四氢叶酸为内标物，并添加二硫苏糖醇、抗坏血酸，采用甲醇配制的内标溶液。
2.根据权利要求1所述的基于LC-MS/MS技术检测血浆中叶酸及其衍生物浓度的方法，其特征在于：所述的内标工作溶液中，内标物的浓度为60～80μg/mL、二硫苏糖醇的浓度为1mg/mL、抗坏血酸的浓度为1mg/mL。
3.根据权利要求1所述的基于LC-MS/MS技术检测血浆中叶酸及其衍生物浓度的方法，其特征在于：步骤(1)中，所述的混合标准溶液的配制：取叶酸、二氢叶酸、四氢叶酸、5-甲基四氢叶酸对照品，以适量DMSO溶解，分别配成浓度为1.00mg/ml的叶酸对照品储备液、浓度为1.00mg/ml的二氢叶酸对照品储备液、浓度为1.00mg/ml的四氢叶酸对照品储备液、浓度为1.00mg/ml的5-甲基四氢叶酸对照品储备液；取上述4种对照品储备液，混合，采用甲醇进行系列稀释，配制成不同浓度的混合标准溶液；
标准曲线样品溶液的制备方法：取50μL空白血浆，加入5μL混合标准工作溶液，涡旋5～10s，再加入5μL稳定剂，涡旋10s，加入300μL内标工作溶液，涡旋不小于1min，12000rpm离心不少于10min，取上清液，将20μL上清液与80μL稳定剂混匀，使得标准曲线样品溶液中二硫苏糖醇和抗坏血酸的浓度不小于0.9mg/mL。
4.权利要求1所述的方法在测定血浆中叶酸及其衍生物浓度的应用。
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