CN113671064B - 一种定量分析血浆中氨来占诺的血药浓度的检测方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种定量分析血浆中氨来占诺的血药浓度的检测方法，所述检测方法是利用从经氨来占诺灌胃处理后的Wistar大鼠眼眶取血后，离心获取血浆，与含内标的乙腈溶液混合后，利用液质联用系统，以液相色谱作为分离系统对所述检测血浆样品进行分离，以质谱作为检测系统对梯度洗脱后的检测血浆样品进行检测，定量分析的离子分别为氨来占诺：m/z 299.2→281.2，内标IS:m/z 259.9→116.1，氨来占诺碰撞能量为19 V，内标碰撞能量为15 V。本发明具有专属性强，灵敏度高，样品预处理简单、快速，分析周期短等优点，适用于血浆中氨来占诺的血药浓度测定和药代动力学研究及组织分布研究。

Description

一种定量分析血浆中氨来占诺的血药浓度的检测方法

技术领域

本发明涉及药物动力学和血药浓度监测应用领域，具体涉及一种定量分析血浆中氨来占诺的血药浓度的检测方法。

背景技术

氨来占诺(又称AA-673)，是一种新型的抗炎和抗过敏药物，在临床上已广泛用于治疗溃疡、哮喘和变应性鼻炎，其结构式如下：

近年来，氨来占诺在治疗非酒精性脂肪肝和肝炎病毒感染所致疾病方面也受到了广泛的关注。有研究者曾使用C¹⁴放射性同位素标记法和薄层色谱分析方法来检测氨来占诺在生物样品中的浓度(T.Hiroshi,Y.Kiyoshi,T.Tsuyoshi,D.Takayoshi,M.Masayoshi,N.Ichiro,T.Shigeharu,Metabolic fate of amoxanox(AA-673),a new antiallergicagent,in rats,mice,guinea pigs and dogs.Pharmacol.Ther.13(1985),4933–4954)，或者使用HPLC-UV方法检测氨来占诺滴眼液滴眼后在大鼠球结膜中氨来占诺的浓度(G.Rankov,K.Sasaki,M.Fukuda,Pharmacodynamics of Amlexanox(AA-673)in normaland anaphylactic rat conjunctiva and its effect on histamine concentration,Ophthalmic Res.22(1990)359–364)。HPLC法检测血浆样品需酸化血浆样品，采用乙酸乙酯提取，吹干溶剂后，流动相复溶。这些检测方法处理样品不仅复杂且灵敏度低，并不有利于氨来占诺的药代动力学的研究和分析。

近年来，液相色谱-串联质谱(LC-MS/MS)方法在生物样品分析中得到了广泛的应用。为了能有效开展氨来占诺在体内的吸收、分布、代谢、排泄有关特征的动物和人体的药代动力学研究，有必要建立一种能够定量分析且灵敏、快速的氨来占诺血药浓度的检测方法。

发明内容

本发明的目的在于提供一种预处理简单、快速、血浆用量少、专属性强、准确度高、重现性好、分析时间短、可得到满意峰形及色谱保留时间的定量分析血浆中氨来占诺的血药浓度的检测方法。

为实现上述发明目的，本发明采用以下技术方案予以实现：

本发明提供了一种定量分析血浆中氨来占诺的血药浓度的检测方法，所述检测方法的具体包括以下步骤：

(1)血浆样品处理：采集给予氨来占诺处理后的血液样本，高速离心获取血浆样品，加入含内标的乙腈溶液，经涡旋混匀、高速离心后取上清液，得到检测血浆样品；

(2)采用液质联用系统进行检测血浆样品测定：以液相色谱作为分离系统对所述检测血浆样品进行分离，流动相采用含甲酸的乙腈-甲酸水的混合液，梯度洗脱；以质谱作为检测系统对梯度洗脱后的检测血浆样品进行检测，采用离子源为ESI离子源，多级反应监测MRM模式进行正离子检测，定量分析的离子分别为氨来占诺：m/z 299.2→281.2，内标IS:m/z 259.9→116.1，氨来占诺碰撞能量为19V，内标碰撞能量为15V。

进一步的，所述步骤(1)中的含内标的乙腈溶液为普萘洛尔乙腈溶液，其浓度为25ng/mL。

进一步的，所述步骤(1)中血液样本采集自给予氨来占诺灌胃处理后的，6-8周龄、体重180±20g的Wistar大鼠，经眼眶静脉丛下取血，取血量为0.3mL。

进一步的，所述步骤(1)中的氨来占诺给药后的全血经肝素钠抗凝，分离后的血浆于-20℃冰箱保存待测，临用前在室温条件下自然解冻即得。

进一步的，所述步骤(1)中血液样本经高速离心机离心后，取100μL的上清液，为血浆样品，并在100μL血浆样品中加入10μL浓度为60％的甲醇水溶液以及200μL普萘洛尔乙腈溶液，涡旋混合30s后，4℃，14000r/min离心10min，取上清液80μL，得到检测血浆样品。

进一步的，所述步骤(2)中的液质联用系统包括三重四极杆液质联用仪和液相色谱仪。

进一步的，所述步骤(2)中的液相色谱的色谱柱为2.0mm×50mm，5μm的CapcellPak C₁₈ MGШ，柱温：30℃；流动相流速为400μL/min；进样量：2μL。

进一步的，所述步骤(2)中流动相配比随时间的变化为：

进一步的，所述氨来占诺于1.630min出峰；内标普萘洛尔于1.348min出峰。

进一步的，所述步骤(2)中质谱的条件为干燥气温度：350℃；干燥气流速：11L/min；雾化器压力：30psi；毛细管电压：4000V(+)；检测方式：MRM模式。

进一步的，所述检测方法对氨来占诺定量分析的线性范围为50-2000ng/mL，最低定量下限为50ng/mL。

综上，本发明提供的一种定量分析血浆中氨来占诺的血药浓度的检测方法，包括以下具体步骤：

(1)取6-8周龄、体重180±20g的体成熟Wistar大鼠，以30mg/kg的用量给予灌胃氨来占诺，经眼眶静脉丛下取血0.3mL，血液样本经高速离心机离心后，取100μL的上清液，得到血浆样品；

在100μL血浆样品中加入10μL浓度为60％的甲醇水溶液以及200μL浓度为25ng/mL的普萘洛尔乙腈溶液，涡旋混合30s后，4℃，14000r/min离心10min，取上清液80μL，得到检测血浆样品，后续以2μL进样分析；

(2)以液相色谱作为分离系统对所述检测血浆样品进行分离，色谱柱采用2.0mm×50mm，5μm的Capcell Pak C₁₈ MGШ，柱温：30℃；流动相采用含甲酸的乙腈-甲酸水的混合液，梯度洗脱，流动相配比随时间的变化为：

流动相流速为400μL/min；进样量：2μL；

氨来占诺于1.630min出峰；内标普萘洛尔于1.348min出峰；

(3)以质谱作为检测系统对梯度洗脱后的检测血浆样品进行检测，采用离子源为ESI离子源，多级反应监测MRM模式进行正离子检测，定量分析的离子分别为氨来占诺：m/z299.2→281.2，内标IS:m/z 259.9→116.1，氨来占诺碰撞能量为19V，内标碰撞能量为15V；

质谱仪的条件为干燥气温度：350℃；干燥气流速：11L/min；雾化器压力：30psi；毛细管电压：4000V(+)；检测方式：MRM模式。

与现有技术相比，本发明的优点和有益效果：

1、本发明的检测过程中测定一份样品仅需0.3mL血浆样本，且进样量仅需2μL，远小于现有技术中的样品用量；

2、血浆样品经乙腈沉淀蛋白，涡旋混合后，离心取上清液直接进样，该预处理方法简单、方便且快速，适用于常规定量分析检测，尤其是适用于大量样品的检测，减少操作步骤和操作时间；

3、本发明的检测方法对氨来占诺的线性检测范围为50-2000ng/mL，其完全满足药物在动物和人体体内的动态分析变化的测定；

4、本发明的检测方法选择性强，空白血浆中的内源性物质不干扰药物和内标的测定；样品稳定性好：样品在室温放置6h，-20℃存放20天，反复冻融三次，处理的样品在10℃自动进样盘中放置24h均稳定；样品无稀释效应和基质效应；

5、回收率高，日内和日间的精密度(相对标准偏差，RSD)均小于15％；

6、本发明的检测方法测定时间短，整个色谱分析测定过程为3.2min即可检测到目标药物；特别适用于动物或人体血浆中氨来占诺的血药浓度测定以及药代动力学研究及组织分布的研究。

附图说明

图1是利用本发明的定量分析方法检测的氨来占诺的质谱扫描图。

图2是离子检测(MRM)色谱图，其中图2A是空白血浆的MRM色谱图；

图2B是空白血浆中加入50ng/mL氨来占诺的MRM色谱图；图2C是Wistar大鼠灌胃给予30mg/kg氨来占诺15min后的血浆样品的MRM色谱图。

具体实施方式

下面结合具体实施方式对本发明的技术方案进一步详细说明。

实施例1：定量分析检测血浆中氨来占诺血药浓度的方法

1、仪器与试剂

(1)仪器

安捷伦6460型三重四极杆液质联用仪和1290Infinity II液相色谱仪。

(2)试剂

乙腈：色谱级，99.90％，批号：P1548790，购自上海泰坦科技股份有限公司；甲酸：50mL，批号：182088，购自赛默飞世尔科技(中国)有限公司；普萘洛尔，纯度≥99％(TLC)，购自Sigma-Aldrich，批号：101651290，其他化学试剂均为分析纯。

2、实验过程

(1)血浆样品的预处理：

取6-8周龄、体重180±20g的体成熟Wistar大鼠，给予灌胃氨来占诺(30mg/kg)的处理后，经眼眶静脉丛下取血0.3mL，血液经高速离心机离心后，取100μL的上清液，则为大鼠血浆。

取100μL大鼠血浆样品，加入10μL甲醇水(v_甲醇:v_水＝6:4)溶液，200μL含内标(普萘洛尔)的乙腈溶液(浓度为25ng/mL)，涡旋混合30s后，4℃，14000r/min离心10min，取上清液80μL，进样2μL分析。

(2)LC-MS/MS分析的条件：

A.液相色谱条件

色谱柱：Capcell Pak C₁₈ MGШ填料，2.0mm×50mm，5μm，柱温：30℃；流动相采用含甲酸的乙腈-甲酸水的混合液，梯度洗脱，其中有机相A为含甲酸的水溶液，流动相B为含甲酸的乙腈溶液，流动相配比随时间的变化见表1，

表1：氨来占诺的LC-MS/MS检测流动相条件

氨来占诺：1.630min出峰；内标普萘洛尔：1.348min出峰。

流动相流速为400μL/min；进样量：2μL。

B.质谱条件

采用离子源为ESI离子源，多级反应监测模式(MRM)进行正离子检测，定量分析的离子分别为氨来占诺：m/z 299.2→281.2，内标IS：m/z 259.9→116.1，氨来占诺碰撞能量为19V，内标碰撞能量为15V。

质谱仪的条件为干燥气温度：350℃；干燥气流速：11L/min；雾化器压力：30psi；毛细管电压：4000V(+)；检测方式：MRM模式。

上述的分析条件为典型条件，在实际应用中，可以根据使用仪器的不同特点，对各参数进行适当的调整，以获得最佳的效果。

(3)LC-MS/MS分析结果

氨来占诺的质谱扫描图参见图1，氨来占诺给药后的血浆样品的离子检测(MRM)色谱图参见图2。

实施例2：定量分析检测血浆中氨来占诺血药浓度的方法确证

1.专属性

本发明所述的定量分析方法中待测物和内标的专属性由标准曲线最低浓度点与同法操作的空白血浆进行比对来评价。空白血浆、空白血浆加入50ng/mL氨来占诺、实际血浆样品的色谱图分别见图2A、图2B和图2C。从图中可以看出，空白血浆中的内源性物质不会干扰氨来占诺和内标的测定，说明本发明的定量分析方法对血浆中氨来占诺的测定具有专属性。

2.标准曲线

氨来占诺的标准曲线系列溶液由60％甲醇水(v_甲醇：v_水＝6：4)配制：取Wistar大鼠空白血浆，加入氨来占诺溶液，配制成含氨来占诺浓度为50、100、200、500、1000、2000ng/mL的标准血浆。各取100μL大鼠血浆样品按照实施例1中血浆样品预处理的所述步骤操作并进行LC-MS/MS分析，采用加权最小二乘法进行回归分析，得到标准曲线，本实施例中采用了3个批次的血浆样品进行实验。得到的线性回归方程见表2，y表示待测药物与内标的峰面积之比，x表示待测药物浓度。本发明定量分析方法氨来占诺定量测定的线性范围为50-2000ng/mL，最低定量下限为50ng/mL。

表2：氨来占诺在大鼠血浆中的标准曲线(n＝3)

3.提取回收率

按照按标准曲线系列溶液配制方法步骤操作，制备氨来占诺低、中、高三个浓度分别为100，500，2000ng/mL的质控样品，每个浓度进行6个样本分析，记录色谱峰。然后配制最终测定浓度的不含基质的纯样品溶液进行分析，得到相应的峰面积，以二者之比，考察样品的提取回收率。分析与测定的结果见表3，氨来占诺三个浓度的提取回收率分别为112.66％、96.95％和100.73％。

表3：氨来占诺的提取回收率(n＝6)

4.准确度和精密度

按照按标准曲线系列溶液配制方法步骤操作，制备氨来占诺低、中、高三个浓度分别为100，500，2000ng/mL的质控样品，每个浓度进行6个样本分析，连续测定3天，本实施例中采用了3个批次的血浆样品进行实验。本发明定量分析方法的精密度由求得的日内、日间RSD(％)来评价，准确度由实际测得值与理论值的比值来评价。分析结果如表4所示，氨来占诺的日内、日间精密度分别在3.72％-8.20％和4.34％-9.38％，准确度范围为-6.49％-2.40％；均小于±10％，说明本发明的定量分析方法具有良好的精密度和准确度。

表4：血浆样品中氨来占诺LC-MS/MS测定方法的准确度和精密度

5.稳定性

Wsitar大鼠血浆样品稳定性试验是按标准曲线系列溶液配制方法步骤操作，制备氨来占诺两种浓度100ng/mL和2000ng/mL低、高二个质控血浆样品考察。考察条件为：-20℃冰箱放置20天，样品室温下放置6h后提取，样品处理后自动进样器放置24h，反复冻融三次，稳定性结果见表5，氨来占诺的实测值与理论值的偏差在±15％以内，说明本方法具有良好的稳定性。

表5：血浆样品中的氨来占诺的稳定性结果(n＝6)

6.基质效应

取100μL大鼠空白血浆，加入200μL乙腈沉淀蛋白，涡旋离心后取上清液100μL。然后按标准曲线系列溶液配制方法步骤操作，制备氨来占诺低、中、高三个浓度分别为100，500，2000ng/mL的质控样品，每个浓度进行6个样本分析，记录色谱峰。然后配制最终测定浓度的不含基质的纯样品溶液进行分析，得到相应的峰面积，以二者峰面积之比，考察样品的基质效应。分析与测定结果见表6，表明基质效应对样品测定的影响不大。

表6：氨来占诺的基质效应(n＝6)

7.稀释效应

按标准曲线系列溶液配制方法步骤操作，制备氨来占诺浓度为5000ng/mL和10000ng/mL的质控样品，再采用Wistar大鼠空白血浆对血浆样本进行10倍和30倍稀释，每个稀释倍数进行6个样品的分析，测定最终浓度与理论值进行比较，考察样本的稀释效应。分析结果见表7，氨来占诺的实测值与理论值的偏差在±15％以内，表明稀释效应对样品测定的影响不大。

表7：氨来占诺的稀释效应(n＝6)

以上实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其进行限制；尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的普通技术人员来说，依然可以对前述实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换；而这些修改或替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明所要求保护的技术方案的精神和范围。

Claims (8)

1.一种定量分析血浆中氨来占诺的血药浓度的检测方法，其特征在于，所述检测方法的具体包括以下步骤：

（1）血浆样品处理：采集给予氨来占诺处理后的血液样本，高速离心获取血浆样品，加入含内标的乙腈溶液，经涡旋混匀、高速离心后取上清液，得到检测血浆样品；

（2）采用液质联用系统进行检测血浆样品测定：以液相色谱作为分离系统对所述检测血浆样品进行分离，流动相采用含甲酸的乙腈-甲酸水的混合液，梯度洗脱；以质谱作为检测系统对梯度洗脱后的检测血浆样品进行检测，采用离子源为ESI 离子源，多级反应监测MRM模式进行正离子检测，定量分析的离子分别为氨来占诺：m/z 299.2 → 281.2，内标IS:m/z 259.9→116.1，氨来占诺碰撞能量为19 V，内标碰撞能量为15 V；

所述步骤（2）中流动相的配比随时间的变化为：

时间(min) 甲酸水溶液% 甲酸乙腈溶液% 0.0 90 10 0.5 90 10 1.0 10 90 1.1 5 95 2.0 5 95 2.1 90 10 3.2 90 10

所述步骤（2）中的液相色谱的色谱柱为2.0 mm × 50 mm，5 μm的Capcell Pak C₁₈ MGШ，柱温：30 °C；流动相流速为400 μL/min；进样量：2 μL。

2.根据权利要求1所述的定量分析血浆中氨来占诺的血药浓度的检测方法，其特征在于，所述步骤（1）中的含内标的乙腈溶液为普萘洛尔乙腈溶液，其浓度为25 ng/mL。

3.根据权利要求1所述的定量分析血浆中氨来占诺的血药浓度的检测方法，其特征在于，所述步骤（1）中血液样本采集自给予氨来占诺灌胃处理后的，6-8 周龄、体重180 ± 20g的Wistar大鼠，经眼眶静脉丛下取血，取血量为0.3 mL。

4.根据权利要求2所述的定量分析血浆中氨来占诺的血药浓度的检测方法，其特征在于，所述步骤（1）中血液样本经高速离心机离心后，取100 µL的上清液，为血浆样品，并在100 µL血浆样品中加入10 μL浓度为60%的甲醇水溶液以及200 μL普萘洛尔乙腈溶液，涡旋混合30 s后，4 ºC，14000 r/min离心10 min，取上清液80 μL，得到检测血浆样品。

5.根据权利要求1所述的定量分析血浆中氨来占诺的血药浓度的检测方法，其特征在于，所述步骤（2）中的液质联用系统包括三重四极杆液质联用仪和液相色谱仪。

6.根据权利要求1所述的定量分析血浆中氨来占诺的血药浓度的检测方法，其特征在于，所述氨来占诺于1.630 min出峰；内标普萘洛尔于1.348 min出峰。

7.根据权利要求1所述的定量分析血浆中氨来占诺的血药浓度的检测方法，其特征在于，所述步骤（2）中质谱的条件为干燥气温度：350 ºC；干燥气流速：11 L/min；雾化器压力：30 psi；毛细管电压：4000 V；检测方式：MRM模式。

8.根据权利要求1所述的定量分析血浆中氨来占诺的血药浓度的检测方法，其特征在于，所述检测方法对氨来占诺定量分析的线性范围为50-2000 ng/mL，最低定量下限为50ng/mL。

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