CN115381954B - 一种用于治疗骨肉瘤的联合用药物 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种治疗恶性肿瘤、特别是骨肉瘤的联合用药物，其含有PDE4抑制剂ZL‑n‑91和氯喹磷酸盐。本发明联合用药物可以有效治疗骨肉瘤，效果明显优于PDE4抑制剂ZL‑n‑91和氯喹磷酸盐单独使用，说明二者在配合使用后具有明显增效的作用，抗肿瘤活性强，副作用小，给临床上失去手术指征，无法手术以及放疗、化疗效果差的病人提供了一种新的治疗选择。
Description
技术领域
本申请属于抗肿瘤药物领域，具体地，本申请提供了一种治疗骨肉瘤的联合用药物，其含有PDE4抑制剂ZL-n-91和氯喹磷酸盐。
背景技术
骨肉瘤(Osteosarcoma，OS)是最常见的恶性骨肿瘤之一，世界卫生组织(WHO)将骨肉瘤定义为原发性恶性骨肿瘤，该肿瘤由产生类骨质和不成熟骨的间充质细胞组成。骨肉瘤常好发于生长活跃部位，如股骨下端、胫骨上端、肱骨上端等，其临床表现包括：骨骼或关节疼痛、局部出现肿块、跛行。当病情进一步恶化至全身状况时，表现为发热、不适、体重下降、贫血以致衰竭。在大多数国家，骨肉瘤的年龄标化率(ASR)为0.20-0.35/10万，占骨肿瘤的20-40％，其中在中国，其占比为20％。骨肉瘤高发于青少年，男性发病率略高于女性，在过去三十年里，骨肉瘤患者的总体生存率变化很小，约为70％。但对于出现转移性疾病的患者和那些对初始治疗反应不佳的患者，2-68岁的人5年生存率仅为25％。因此，寻找新的分子靶点对于骨肉瘤患者的早期诊断和靶向治疗具有非常重要的意义。目前骨肉瘤的治疗模式是术前新辅助化疗+手术切除+术后辅助化疗。化疗的药物包括甲氨蝶呤(MTX)、阿霉素(ADM)、顺铂(DDP)、以及异环磷酰胺(IFO)等，但高剂量的化疗药物带来的副作用很大，除脱发、骨髓抑制、粘膜炎、恶心和呕吐等常见并发症外，还会导致心脏毒性、急性和慢性肾毒性、神经毒性、听力损失、不孕症等罕见毒性作用。因此，有必要进行进一步的研究，以确定有效的药物，并开发副作用较小的新的治疗策略来治疗这种致命的疾病。
研究发现，磷酸二酯酶4抑制剂(PDE4i)罗氟司特(Roflumilast)能够显著抑制卵巢癌、肺癌、B细胞淋巴瘤的生长；另有研究发现PDE4i咯利普兰(Rolipram)可抑制人下颌骨OS细胞系HOSM-1的增殖，表明PDE4i具有潜在的抗OS作用。Rolipram是第一个原型PDE4抑制剂，但由于其严重的不良反应并未能第一个上市，在后续的PDE4抑制剂的研究中通常作为阳性对照药来使用。除了Rolipram之外，研究者们进一步开发出新一代PDE4抑制剂，其中Roflumilast、Apremilast和Crisborole连续获批上市。欧盟和美国分别于2010年和2011年批准口服Roflumilast用于治疗严重的COPD和哮喘症状，美国(2014年)批准Apremilast用于活动期银屑病关节炎患者和中至重度斑块型牛皮癣患者，而Crisaborole在美国获得批准(2016年)，用于局部治疗2岁及以上患者的轻中度特应性皮炎。然而，上述PDE4抑制剂的治疗窗口较窄，并且在治疗过程中都伴随着恶心，呕吐等副作用。针对上述副作用已经开发多种新型PDE4选择性抑制剂，如北卡罗来纳大学柯衡明开发的ZL-n-91：
ZL-n-91作为一种新型的选择性PDE4i，比其他PDE家族分子的选择性高数千倍。2008年Ruihong Ma的研究表明ZL-n-91对记忆T辅助细胞(Th)17细胞产生IL-17有抑制作用，而对细胞活力无影响。2010年Hui-Fang Tang等人的研究发现ZL-n-91能够改善吸烟(CS)诱导的雄性Sprague-Dawley大鼠COPD样模型的炎症反应，随后作者又进一步发现ZL-n-91能够用于治疗脂多糖诱导的小鼠急性肺损伤(ALI)。另外，有研究发现ZL-n-91能够抑制前列腺癌细胞PC-3的增殖，但对于其他癌症的疗效，尚无任何实际研究验证。
氯喹磷酸盐，Chloroquine diphosphate salt，CAS号50-63-5，其结构式：
氯喹是一个经典的抗疟疾药物，近年研究发现，氯喹具有抗肿瘤活性，对肿瘤有多种作用机制，如诱导肿瘤细胞凋亡，抑制自噬等。磷酸氯喹作为一种弱碱性药物，可以选择性进入肿瘤细胞酸性溶酶体，有效抑制肿瘤细胞酸性溶酶体作用而抑制自噬，对pH正常细胞的作用很弱，这也为氯喹更好地作用于肿瘤细胞以及减少正常组织的不良反应打下了良好的微环境基础。研究发现自噬在应激环境中可通过调控能量代谢降低化疗药物的敏感性，促进肿瘤细胞存活。自噬抑制剂氯喹可以有效阻止肿瘤毒性化疗过程中自噬的发生，阻断自噬可以促进肿瘤细胞走向死亡，增加其对化疗药物的敏感性。因此，靶向药物和调控自噬双向干预可能是一种有效的癌症治疗策略。
发明内容
本发明的目的是提供一种用于治疗骨肉瘤的联合用药物，以克服单独使用PDE4抑制剂ZL-n-91治疗浓度过高引起机体不耐受而影响用药效果的问题。本发明利用体外肿瘤细胞培养，通过细胞增殖实验，平板克隆形成实验，细胞凋亡实验，研究ZL-n-91与氯喹的联合作用效果。实验证实：氯喹磷酸盐(CQ)具有协同ZL-n-91抑制骨肉瘤细胞MNNG/HOS、U2OS、Saos-2增殖的能力,并且能够增强ZL-n-91介导的促凋亡作用。
一方面，本申请提供了一种治疗恶性肿瘤的联合用药物，包括PDE4抑制剂和氯喹磷酸盐。
另一方面，本申请提供了PDE4抑制剂和氯喹磷酸盐在制备治疗恶性肿瘤的联合用药物中的应用。
进一步地，所述恶性肿瘤为骨肉瘤。
进一步地，其中PDE4抑制剂为ZL-n-91。
进一步地，所述药物抑制肿瘤细胞增殖。
进一步地，所述药物诱导肿瘤细胞凋亡。
进一步地，所述药物中PDE4抑制剂和氯喹磷酸盐的摩尔比为40:1-5:1。
进一步地，所述药物中PDE4抑制剂和氯喹磷酸盐的摩尔比为20:1-5:1。
进一步地，所述药物中PDE4抑制剂和氯喹磷酸盐的摩尔比为10:1。
进一步的，所述药物中的PDE4抑制剂和氯喹磷酸盐同时给药或分别给药。
进一步的，所述药物为注射剂型。
本申请中所述的氯喹磷酸盐与氯喹、磷酸氯喹啉、磷酸氯喹、磷酸化氯喹啉等可以交换使用。
本申请中所述的PDE4抑制剂包括但不限于茶碱、洛利普兰、罗氟司特、西洛司特、阿普司特、ZL-n-91等已知和研究中的PDE4抑制剂
本申请中所述的骨肉瘤包括各种类型，各种特征的骨肉瘤，包括但不限于传统型骨肉瘤、髓内高分化骨肉瘤、骨旁骨肉瘤、骨膜骨肉瘤、毛细血管扩展骨肉瘤、小细胞型骨肉瘤。
本申请中ZL-n-91和氯喹磷酸盐的剂型和规格可以相同，也可以不同。
本申请中的ZL-n-91和氯喹磷酸盐优选注射剂型，也可以使用口服剂型，具体剂型可以为口服剂型或注射剂型，包括但不限于片剂、胶囊剂、口服液体制剂、丸剂、颗粒剂、散剂、水针剂、油针剂、乳针剂、粉针剂等。
除口服或注射剂型外，其他已知或研究中的剂型如透皮给药、吸雾给药、靶向载体给药剂型也可以根据情况由药剂领域技术人员常规选用并设计剂型。
治疗骨肉瘤时ZL-n-91可以与其他已知或研究中的治疗骨肉瘤的药物联合使用或者制备入同一制剂中，这些药物包括但不限于化疗药和靶向药。
本发明所述的磷酸二酯酶4抑制剂ZL-n-91可直接购买，参考现有文献自行合成或委托合成，例如可以参考文如Ruihong Ma,Bin-yan Yang,Chang-you Wu.A selectivephosphodiesterase 4(PDE4)inhibitor Zl-n-91suppresses IL-17production by humanmemory Th17 cells.International Immunopharmacology,2008,8(10):1408-1417.合成制备。
有益效果：本发明所述的选择性PDE4抑制剂ZL-n-91，可以显著抑制肿瘤细胞的增殖，预示该磷酸二酯酶4抑制剂ZL-n-91有望成为抗骨肉瘤增殖研究的重要靶点；同时，磷酸氯喹具有抑制自噬作用，可增强ZL-n-91对骨肉瘤细胞的杀伤作用，对骨肉瘤的治疗具有很好的应用前景。
附图说明
图1是ZL-n-91和CQ联用对骨肉瘤细胞MNNG/HOS、Saos-2、U2OS的抑制增殖作用图：CQ浓度设为10μM，ZL-n-91浓度设为200μM，药物单用组处理48h，联用组先用CQ预处理2h，再用ZL-n-91处理48h，采用活细胞计数法检测细胞增殖活性。所有数据均用平均值±标准偏差表示。(n＝3)，*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001。
图2是ZL-n-91和CQ联用对骨肉瘤细胞MNNG/HOS、Saos-2、U2OS的相互作用效果图：CQ单用组浓度设为0,2.5,5,10,20μM，ZL-n-91单用组浓度设为0,25,50,100,200μM，联用组药物浓度比例为1:10，设置了4个药物浓度组，即组一(2.5μM CQ+25μM ZL-n-91)、组二(5μMCQ+50μM ZL-n-91)、组三(10μM CQ+100μM ZL-n-91)、组四(20μM CQ+200μMZL-n-91),分别对骨肉瘤细胞MNNG/HOS、Saos-2、U2OS先用CQ预处理2h，再用ZL-n-91处理48h，采用活细胞计数法检测各种细胞的增殖活性。利用CalcuSyn软件分析CQ与ZL-n-91联用的CI值。当CI值均小于1时具有协同作用，CI等于1时有相加作用，CI大于1时有拮抗作用。
图3是ZL-n-91和CQ联用对骨肉瘤细胞MNNG/HOS、Saos-2、U2OS的抑制增殖作用图：取对数生长期细胞以合适浓度接种于六孔板中，待细胞贴壁后加入药物处理。CQ浓度设为10μM，ZL-n-91浓度设为200μM,药物单用组处理48h，联用组先用CQ预处理2h，再用ZL-n-91处理48h，换新鲜培养基。待出现肉眼可见的细胞克隆即终止培养，固定染色观察计数各组细胞克隆形成数目。(n＝3)，*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001。
图4是ZL-n-91和CQ联用对骨肉瘤细胞MNNG/HOS、Saos-2、U2OS的促凋亡作用图：CQ浓度设为10μM，ZL-n-91浓度设为200μM,药物单用组处理48h，联用组先用CQ预处理2h，再用ZL-n-91处理48h，采用流式细胞术检测细胞凋亡情况。所有数据均用平均值±标准偏差表示。(n＝3)，*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001。
具体实施方式
为让本领域的技术人员更加清晰直观的了解本发明，下面将结合附图，对本发明作进一步的说明。
实施例1
活细胞计数法检测ZL-n-91与CQ联用对骨肉瘤细胞增殖的影响
1)取对数生长期的细胞U2OS、Saos-2、MNNG/HOS，制备单细胞悬液。按每孔2ml细胞悬液接种于六孔板中，共分为4组：溶剂对照组(添加同等体积的溶剂EtOH)，CQ组(10μM)、ZL-n-91组(200μM)、CQ+ZL-n-91组，每组3个副孔；
2)待细胞贴壁后，先加入CQ预处理2h，再加入ZL-n-91处理48h；
3)去旧培养基，PBS洗两次后，胰酶消化收集细胞，并计数。
结果如图1所示：CQ与ZL-n-91处理均能抑制骨肉瘤细胞MNNG/HOS、U2OS、Saos-2细胞的增殖，并且二者联合用药细胞活力进一步降低。
实施例2
CQ与ZL-n-91联合作用指数的计算
1)取对数生长期的细胞U2OS、Saos-2、MNNG/HOS，制备单细胞悬液。按每孔2ml细胞悬液接种于六孔板中，每种细胞设置3个组(单用CQ组，单用ZL-n-91组及CQ+ZL-n-91组)，每组3个副孔；
2)CQ工作浓度设为0,2.5,5,10,20μM，ZL-n-91单用组浓度设为0,25,50,100,200μM，联用组药物浓度比例为1:10。
3)待细胞贴壁后，联用组先用CQ预处理2h，再加入ZL-n-91处理48h。
4)去旧培养基，PBS洗两次后，胰酶消化收集细胞，并计数检测细胞活力。将数据输入CalcuSyn软件计算联用指数(Combination Index,CI)。其中当CI值小于1时具有协同作用，等于1时有相加作用，大于1时有拮抗作用。
结果如图2所示：CQ具有协同ZL-n-91抑制骨肉瘤细胞增殖的能力
实验例3
平板克隆形成实验检测ZL-n-91与CQ联用对骨肉瘤细胞克隆形成能力的影响
1)取对数生长期的细胞U2OS、Saos-2、MNNG/HOS，制备单细胞悬液。按每孔2ml细胞悬液接种于六孔板中，共分为4组：溶剂对照组(添加同等体积的溶剂EtOH)，CQ组(10μM)、ZL-n-91组(200μM)、CQ+ZL-n-91组，每组3个副孔；
2)待细胞贴壁后，先加入CQ预处理2h，再加入ZL-n-91处理48h，换新鲜培养基；
3)培养10d后出现肉眼可见的细胞克隆即终止培养，以多聚甲醛溶液固定细胞，进行结晶紫染色，经PBS洗涤后，将≥50个细胞克隆团记为1个细胞克隆，观察计数各组细胞克隆形成数目，结果以细胞克隆形成数目表示。
结果如图3所示：CQ可显著增强ZL-n-91对骨肉瘤细胞克隆形成能力的抑制作用。
实验例4
流式细胞术检测Zl-n-91与CQ联用对骨肉瘤细胞凋亡的诱导作用
1)取对数生长期的细胞U2OS、Saos-2、MNNG/HOS，制备单细胞悬液。按每孔2ml细胞悬液接种于六孔板中，共分为4组：溶剂对照组(添加同等体积的溶剂EtOH)，CQ组(10μM)、ZL-n-91组(200μM)、CQ+ZL-n-91组，每组3个副孔；
2)待细胞贴壁后，先加入CQ预处理2h，再加入ZL-n-91处理48h；
3)48h后收获细胞，冷PBS洗涤2次，加入100μl 1*BindingBuffer制备成细胞悬液于流式管中，按试剂盒说明书加入5μl 7AA-D和5μL PE染色，轻柔的涡旋细胞，室温避光孵育15min，再加200u1*BindingBuffer于管中，1h内进行流式细胞检测，FlowJoV10分析软件分析结果。
结果如图4所示：CQ能显著增强ZL-n-91介导的促凋亡作用。
以上研究结果表明，本发明所采用的磷酸二酯酶4抑制剂ZL-n-91与CQ联合作用能抑制骨肉瘤细胞增殖，且效果优于CQ及ZL-n-91单独使用，具有良好的抗肿瘤效果。
上述对实施例的描述是为便于该技术领域的普通技术人员能理解和应用本发明。熟悉本领域技术的人员显然可以容易地对这些实施例做出各种修改，并把在此说明的一般原理应用到其他实施例中而不必经过创造性的劳动。因此，本发明不限于这里的实施例，本领域技术人员根据本发明的揭示，对于本发明做出的改进和修改都应该在本发明的保护范围之内。
Claims (11)
1.PDE4抑制剂和氯喹磷酸盐在制备治疗骨肉瘤的药物中的应用，所述PDE4抑制剂为ZL-n-91；所述药物中PDE4抑制剂摩尔浓度为200μM，氯喹磷酸盐的摩尔浓度为20μM。
2.根据权利要求1所述的应用，其中所述骨肉瘤为传统型骨肉瘤、髓内高分化骨肉瘤、骨旁骨肉瘤、骨膜骨肉瘤、毛细血管扩展骨肉瘤或者小细胞型骨肉瘤。
3.根据权利要求1所述的应用，其中所述药物抑制骨肉瘤细胞增殖。
4.根据权利要求1所述的应用，其中所述药物诱导骨肉瘤细胞凋亡。
5.根据权利要求1所述的应用，其中所述药物为口服剂型。
6.根据权利要求5所述的应用，其中所述药物为片剂、胶囊剂、口服液体制剂、丸剂、颗粒剂或散剂。
7.根据权利要求1所述的应用，其中所述药物为注射剂型。
8.根据权利要求7所述的应用，其中所述药物为水针剂、油针剂、乳针剂或粉针剂。
9.根据权利要求1所述的应用，其中所述药物与其他治疗骨肉瘤的药物联合使用或者包含其他治疗骨肉瘤的药物。
10.根据权利要求9所述的应用，其中其他治疗骨肉瘤的药物为化疗药物。
11.根据权利要求9所述的应用，其中其他治疗骨肉瘤的药物为靶向药物。
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Effective date of registration: 20230925 Address after: 518118 Room 201, building 2, Huahan science and Technology Industrial Park, No. 19, Qiyun West Road, Heping community, Pingshan street, Pingshan District, Shenzhen, Guangdong Applicant after: Shenzhen Hanhui Pharmaceutical Technology Co.,Ltd. Address before: No. 3, Kexue Road, Science City, Guangzhou Hi tech Development Zone, 510000 Guangdong Province Applicant before: GUANGZHOU HUAZHEN PHARMACEUTICAL Co.,Ltd. |
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| GR01 | Patent grant | ||
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